CN102559538B - 高产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.5450。其摇瓶发酵生物转化酶(L-天冬氨酸酶)活力可达4200U/ml；2吨罐生产规模发酵生物转化酶活力可达4500U/ml，较出发菌株活性提高30％以上；采用高转化活性的游离细胞，直接高效生物转化富马酸生成L-天冬氨酸，富马酸浓度为18.5-20.0％时，20吨罐生产规模生物转化时间比出发菌株时间缩短三分之一，为6-8小时，转化率达97.5％以上，转化效率高于同类水平。

Description

高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其是涉及一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏杆菌及其应用。

背景技术

L-天冬氨酸是一种在食品行业、化工产品中间体和医药行业中应用广泛的氨基酸。

(1)用于合成甜味剂

L-天冬氨酸是合成阿斯巴甜的主要原料。

阿斯巴甜是一种新型的甜味剂，由L-苯丙氨酸先与甲醇酯化后再和L-天冬氨酸缩合酰胺化产生。传统的糖类热量高，易引起心血管病、肥胖症等危害人类健康的疾病，随着人们对糖类物质危害性影响认识的加深，人们把研究的重点放在了寻找新型甜味剂上，阿斯巴甜成为一种被广为推崇的新型健康型甜味剂。阿斯巴甜口味纯正清爽，甜味强烈，类似蔗糖，但甜度约为蔗糖的200倍，没有人造甜味剂常有的苦味，化学味或金属味，对许多食品、饮料风味有明显的增效作用。阿斯巴甜不仅甜度高，口味好，而且热量低，且有很高的安全性。阿斯巴甜要达到与蔗糖相同的甜度，其热量仅为蔗糖的1/200。联合国粮农组织和世界卫生组织对其评价为安全可靠，联合国食品添加剂联席委员会确定其为A(I)级甜味剂，目前已有130多个国家和地区获准使用，广泛应用于9000多种食品、饮料及医药等产品中。国外生产阿斯巴甜的厂家主要是日本的味之素和美国的纽特公司。国内的阿斯巴甜生产厂家主要有溧阳维多生物工程有限公司、南通市常海食品添加剂有限公司、江苏汉光生物工程有限公司。我国人口众多，据统计，目前每年需消耗蔗糖760万吨，糖精35万吨。如果全部用阿斯巴甜代替，则我国每年需用阿斯巴甜约4万吨，需求量特别大。近几年我国阿斯巴甜需求量与生产量成倍增长，作为其主要的合成原材料——L-天冬氨酸的需求也成倍增长。

(2)用于合成L-丙氨酸

L-丙氨酸是以L-天冬氨酸为底物经L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化合成的。L-丙氨酸是一种添加剂，也是生产维生素B6和氨基丙醇的重要原料。另外L-丙氨酸在食品中也有广泛应用，如增加化学调味品的调味效果、改善人工甜味剂口感、改善有机酸的酸味、缩短腌制品腌制时间等都取得良好效果。

(3)合成聚天冬氨酸

以L-天冬氨酸为主要原料可以合成聚天冬氨酸(PASP)，属于生物高分子材料，热聚合成聚天冬氨酸的反应方程式为：

聚天冬氨酸主要用于水处理和表面活性剂。它是一种安全、无毒、环保的高分子有机聚合物。美国试验表明，在特定条件下容易被生物降解，此降解范围达到国际最高标准。因此，聚天冬氨酸获得“总统绿色化学挑战奖”的殊荣。它可以用于工业防腐、阻垢、水处理分散剂、石油回收、清洁剂、香波、个人护理、化妆品、医药原料、高级吸收剂、粘合剂、纸业加工和肥料增效剂、土壤调理剂。近几年随着对全球对环保要求的不断提高，聚天门冬氨酸在各个领域的需求每年呈番翻的增长趋势。

(4)用于合成新药和临床治疗

L-天冬氨酸衍生物已广泛用作抗肿瘤药物，如N-磷酸乙酰-L-天门冬氨酸是一个天冬氨酸转氨甲酚基酶的的过度状况抑制剂，利用这个抑制剂可中断嘧啶核苷酸的合成途径达到抗肿瘤的目的。

以亮氨酸和酯化的天冬氨酸共聚而成的仿天然皮肤的层状伤口裹敷物，包扎伤口后可以不必再解开而成为皮肤的一部分。

(5)作为合成其他产品的中间体

L-天冬氨酸还可作为中间体合成天冬酰胺、天冬氨酸镁、天冬氨酸钠等系列产品。

天冬氨酸镁，作为新型饲料添加剂，具有改善家禽肉质的功效。

L-天冬氨酸钠是一种氨基酸鲜味剂，是全球用量仅次于谷氨酸钠的第二大氨基酸类鲜味剂，是味精的更新换代产品。能单独使用，也可以与核酸等系列调味品并用。L-天冬氨酸钠是一种无害的安全性调味剂，且具有解除人体疲劳的特殊功效，在发达国家和地区(如日本)正逐步替代味精。据调研，天冬氨酸盐类在饲料领域应用除家禽饲养外，已开发用于宠物食品和生产养殖，市场需求旺盛。

另外，在化工方面，L-天冬氨酸可以作为制造合成树脂的原料。

L-天冬氨酸生产技术主要有化学合成、发酵合成、固定化酶或固定化细胞合成和游离细胞生物转化等方法。

(1)化学合成

应用光学纯的化合物作为起始物合成左旋单体。1986年，法国化学家Kagan HB等首先报道了L-天冬氨酸的不对称合成，此法用光学纯的氨基醇作为起始物，通过光学活性的不饱和环状中间体的氢化，可得到L-天冬氨酸的甲酯，产物的纯度达到98％。其反应机理相当复杂。

(2)发酵合成

L-天冬氨酸的工业化生产始于上世纪七十年代的日本，早期采用传统的微生物发酵法，即以糖类物质为基础原料，通过细胞的新陈代谢来积累产物，再经过适当的提取工艺而制成。由于发酵法生产周期长，副产物多且技术风险大，使产品的生产成本较高限制了产品只能应用于医药领域。

(3)固定化酶或固定化细胞法合成L-天冬氨酸

固定化酶技术是20世纪60年代开始发展起来的一项技术。酶制剂经物理或化学方法包埋、吸附或交联处理，使酶在固相发挥催化作用。

a)L-天冬氨酸酶(E.C.4.3.1.1)

利用E.coli产生的L-天冬氨酸酶(E.C.4.3.1.1)催化富马酸和氨转化为产物L-天冬氨酸，反应式见下：

L-天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶。该酶广泛地存在于各种细菌、酵母与植物中，某些动物组织也有发现，它催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸的反应是可逆的。

来自大肠杆菌的天冬氨酸酶由四个相同亚基构成，每个亚基由477个氨基酸残基组成，分子量为52,200道尔顿，其3D结构见图1所示。

四聚体是天冬氨酸的活性形式，其单体无活性。二聚体结构具有天然活性的45％，从四聚体解聚成二聚体的过程是可逆的。天冬氨酸酶是一种别构酶，其最适pH值为8.0。当pH＞7.5时，该酶的活性绝对依赖二价金属离子和天冬氨酸；当pH＜7.5时，可不需二价金属离子而催化脱氨反应。

在大肠杆菌中，天冬氨酸酶的主要作用是分解L-天冬氨酸为碳源，当培养基中含有葡萄糖时，菌体表达酶能力受到抑制，在这种条件下，即使培养基中含有唯一的氮源L-天冬氨酸，也不会促进酶的表达。另外，酶自身也有调控功能：酶的表达量低时不易形成四聚体，活力下降；该酶被天冬氨酸激活后，天冬氨酸浓度低时酶活也低，不会在天冬氨酸低时将其分解而影响蛋白质的合成。

b)研究情况

比较具有代表的是日本大阪田边制药公司将大肠杆菌固定在聚丙烯酰胺凝胶上，实现了由富马酸转化为L-天冬氨酸的工业化生产。

国内如孟广震先生利用琼脂凝胶和聚丙烯酰胺固定化天冬氨酸酶合成天冬氨酸；冉英才、居乃琥、杨廉婉用聚乙烯醇固定化天冬氨酸酶合成L-天冬氨酸。

c)优缺点

虽然固定化酶具有可重复利用、易于纯化和利用率高等优点，但是其缺点同样明显，如生物酶的价格较高、生产周期较长、设备投资大等。

固定化细胞法的半衰期较短(半个月左右)且固定化操作较复杂。

(4)游离细胞生物转化

游离细胞生物转化是指发酵培养特定菌种，待菌种培养至适合转化阶段，添加底物，通过细胞体系内存在的单酶或酶系生物催化底物，使其转化为目的产物。

发明内容

本发明所解决的技术问题首先是提供一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌，其经过诱变得到，已在相关机构保藏。

本发明的另一个目的是提供上述大肠埃希氏菌用于生物转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法。利用此方法生物转化生产L-天冬氨酸，可以简化生产工艺，缩短转化时间，提高转化率，以降低生产成本。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.5450。

进一步，本发明提供一种利用大肠埃希氏菌产生的L-天冬氨酸酶催化富马酸和氨转化为L-天冬氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)活化培养上述大肠埃希氏菌，制备一级种子液；

(2)步骤(1)的一级种子液接入发酵罐中，培养制备二级种子液；

(3)制备富马酸浓度为18.5-20.0％的底物溶液，同时加入液氨，再向底物溶液中加入步骤(2)的二级种子液，生物转化制备L-天冬氨酸。

上述方法，其中所述步骤(1)、(2)和(3)在温度35-39℃的条件下进行，优选温度在37℃的条件下进行。

上述方法，其中所述步骤(2)中一级种子液的接种量为体积比的8-12％，优选接种量为10％。

上述方法，其中所述步骤(3)中二级种子液的加入量为体积比的8-10％，优选加入量为10％。

上述方法，其中所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括测定二级种子液中L-天冬氨酸酶活性的步骤。根据测定，优选二级种子液中L-天冬氨酸酶的活性为4000U/ml-4500U/ml的种子液进行下一步的生物转化。

本发明方法中涉及的大肠埃希氏菌的保藏、活化、种子液培养、生物转化等技术是生物转化领域的常规技术，种子液培养可以采用实验室中使用的摇瓶进行小试，也可以采用工业生产中应用的发酵罐进行中试等；所采用的培养基为适合大肠埃希氏菌CGMCC No.5450生长的含适量碳源、氮源以及矿物质的常规发酵培养基，培养基中含有的物质包括但不限于蛋白胨、牛肉膏、玉米浆干粉、酵母粉、水解棉籽蛋白等。

本发明提供的大肠埃希氏菌CGMCC No.5450，摇瓶发酵生物转化酶(L-天冬氨酸酶)活力可达4200U/ml；2吨罐生产规模发酵生物转化酶活力可达4500U/ml，较出发菌株活性提高30％以上；采用高转化活性的游离细胞，直接高效生物转化富马酸生成L-天冬氨酸，富马酸浓度为18.5-20.0％时，20吨罐生产规模生物转化时间比出发菌株时间缩短三分之一，为6-8小时，转化率达97.5％以上，转化效率高于同类水平。

微生物保藏信息

大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)CGMCC No.5450

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏时间：2011年11月8日

附图说明

图1是来自大肠杆菌的天冬氨酸酶的3D结构图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

实施例1：菌种选育

①菌种保藏

将菌种接至到保藏斜面培养基上，37℃±1℃培养24小时，4℃保藏，每2-3个月传代一次。

②菌种活化

取斜面保藏菌种一环，转接至生产斜面，37℃±1℃培养15-20小时。

③菌种诱变

将出发菌株大肠埃希氏菌HY的平板分离单菌落培养物转接到生产液体培养基中，于37℃下培养15-20小时。取旺盛生长的培养物5ml，于4000rpm下离心15分钟，倾倒掉上清液，用生理盐水洗涤沉淀细胞2-3次后，用50ml的pH7.0的磷酸缓冲溶液悬浮细菌沉淀，稀释至约10⁷细胞/ml，备用。

向装有上述菌悬液的试管中加入亚硝基胍丙酮溶液，使最终浓度达到200μg/ml，混合均匀后在37℃下保温30分钟，离心，除去上清液，用相同的磷酸缓冲溶液洗涤2-3次，洗涤后的细胞悬液适当稀释后涂布于保藏培养基平板上，于37℃培养箱中培养24小时后，随机挑取200个单菌落进行生物转化酶活力测定试验。

④菌种发酵试验

将挑出的单菌落转接生产斜面，37℃培养24小时后，挑取一环转接至装有50ml摇瓶培养基的250ml三角瓶中，于37℃、90rpm条件下培养12小时后测发酵液中生物转化酶活力。

选取L-天冬氨酸酶活较高的5株菌种重复进行菌种发酵实验，测定发酵液的OD值、pH值、生物转化酶活、转化率等。(测定方法详见实施例2)

⑤一级种子培养

取活化好的菌种一环，接种于摇瓶培养基中(1000ml三角瓶，装液量为250ml，20瓶)。摇床培养条件为：转速为90rpm，37℃±1℃培养12h。

⑥2吨种子罐培养

将20瓶种子培养液在无菌条件下合并成5L种子液，接入到2吨发酵罐中，装液量1.8m³进行培养，37℃±1℃培养约12h，测定大肠杆菌的OD值和pH值的变化。

经过反复诱变选育后，选育得到一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌HY-05C，其摇瓶发酵生物转化酶(L-天冬氨酸酶)活力可达4200U/ml；2吨罐生产规模发酵生物转化酶活力可达4500U/ml；将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5450。

实施例2：测定方法

①生物转化酶(L-天冬氨酸酶)活力测定方法：

酶活定义：在45℃，pH值7.5条件下，每小时转化1微摩尔富马酸底物的酶量为一个酶活力单位U。

将16％的富马酸溶液250ml装入三角瓶中，加入发酵液20ml，再加入2ml 2％硫酸镁溶液，摇匀。将三角瓶放入45℃的水浴锅中，进行转化，并在0h、1h分别取样检测。

取1∶10的H₂SO₄溶液35ml放入250ml三角瓶中，再吸入0.2ml转化液加入其中，加热至75-80℃，用0.02M KMnO₄溶液滴定至微红，半分钟内不褪色，即为终点。读取消耗的KMnO₄体积毫升数，0h样品消耗体积记为V_空，反应1h终点消耗体积记为V_样，按以下公式计算生物转化酶活力：

富马酸与KMnO₄化学反应：

C₄H₄O₄+2KMnO₄+3H₂SO₄→HCOOH+3CO₂+K₂SO₄+2MnSO₄+4H₂O

1ml 0.02mol/L KmnO4～1.16mg富马酸

5C₄H₄O₄+4KMnO₄+6H₂8O₄→5C₄H₄O₆(酒石酸)+2K₂SO₄+4MnSO₄+6H₂O

1ml 0.02mol/L KmnO4～2.9mg富马酸

取(1.16+2.9)/2≈2mg富马酸

注：116-富马酸的分子量；

2-每消耗1mL0.02M高锰酸钾相当于2mg富马酸；

272-反应总体积272mL；

20-加入20mL发酵液；

1-反应时间1小时；

0.2-取0.2mL反应液进行测定。

②发酵液OD值测定方法

使用581-S光电比色计，用纯水作为空白溶液，在600nm处调透光率100％。测定样品液的吸光度即为OD值。

③发酵液pH值测定方法

用pH试纸测定pH值。

④发酵液生物转化活性测定方法(以转化率表示)

将16％的富马酸溶液250ml装入三角瓶中，加入发酵液20ml，再加入2ml 2％硫酸镁溶液，摇匀。将三角瓶放入45℃的水浴锅中，进行转化，并在0h、2h、4h分别取转化样待测。

取1∶10的H₂SO₄溶液35ml放入250ml三角瓶中，再吸入0.2ml转化液加入其中，加热至75-80℃，用0.02M KMnO₄溶液滴定至微红，半分钟不褪色，即为终点，读取消耗的KMnO₄体积毫升。0h所测体积记为V₀，2h所测体积数V₁，以此类推V₂、V₃等。

实施例3：生物转化制备L-天冬氨酸

采用实施例1的大肠埃希氏菌产生的L-天冬氨酸酶催化富马酸和氨转化为L-天冬氨酸，包括以下步骤：

①摇瓶种子液培养

取活化好的实施例1的大肠埃希氏菌菌种一环，接种于摇瓶培养基中(1000ml三角瓶，装液量为250ml，20瓶)。摇床培养条件为：转速为90rpm，37℃±1℃培养12h。按实施例2的方法测定一级种子液中生物转化酶活力达4200U/ml；

②2吨种子罐培养

将20瓶种子培养液在无菌条件下合并成5L种子液，接入到2吨发酵罐中，装液量1.8m³进行培养，37℃±1℃培养约12h，测定大肠杆菌的OD值和pH值的变化。按实施例2的方法测定二级种子液中生物转化酶活力达4500U/ml；

③将培养的2吨二级种子液，转入20m³转化罐中，直接转化富马酸溶液。所述富马酸溶液是在配料槽中加入富马酸、水、液氨，制备好的溶液转入转化罐中待用。在富马酸浓度为20.0％时，20m³罐规模生物转化时间缩短至6小时，转化率可以稳定在97.5％以上。

实施例4：L-天冬氨酸生产提取

①升温灭酶

转化率达到98％后，向转化罐经盘管通入蒸气，使转化液升温至80℃。

②脱色、过滤

向转化液中投入约0.1％的活性炭，搅拌30分钟，静止30分钟。打开料液泵，将料液泵至过滤机进行过滤，循环过滤，直至滤液透光度符合要求，再将滤液打到结晶罐中。

③结晶

打开搅拌，向结晶罐盘管中通入蒸气，将温度升温至75℃-80℃；缓慢流加浓硫酸，调pH至2.8-3.0。

④离心、洗晶及干燥

经盘管通入冷水，降温至约35℃，三足离心机离心得到晶体，再喷水洗晶至硫酸根符合要求，湿晶经振动干燥床干燥。

本发明利用自主选育出的一株发酵性能优良、生物转化酶活性高的大肠埃希氏杆菌CGMCC No.5450，进行了摇瓶培养及2m³种子罐发酵条件的优化，应用于L-天冬氨酸生产得到了很好效果。具体结果如下：

①生产菌株摇瓶发酵生物转化酶活力达4200U/ml；

②经2m³种子罐生产规模的发酵实验验证其生物转化酶活力达4500U/ml；

③2m³罐发酵液直接高效生物转化富马酸生成L-天冬氨酸，在富马酸浓度为18.5-20.0％时，20m³罐规模生物转化时间缩短至6-8小时，转化率可以稳定在97.5％以上；

④经过一年多的生产实践，在每月投料500-1000吨富马酸的生产规模，L-天冬氨酸的平均收得率可达99％以上；L-天冬氨酸产品符合国家行业标准QB 1118-91。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（Escherichia.coli），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.5450。

2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌在生物转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的大肠埃希氏菌产生的L-天冬氨酸酶催化富马酸和氨转化为L-天冬氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）活化培养权利要求1所述的大肠埃希氏菌，制备一级种子液；

（2）步骤（1）的一级种子液接入发酵罐中，培养制备二级种子液；

（3）制备富马酸浓度为18.5-20.0%的底物溶液，同时加入液氨，再向底物溶液中加入步骤（2）的二级种子液，生物转化制备L-天冬氨酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）和（3）在温度35-39℃的条件下进行。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中一级种子液的接种量为体积比的8-12%。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中二级种子液的加入量为体积比的8-10%。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括测定二级种子液中L-天冬氨酸酶活性的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述二级种子液中L-天冬氨酸酶的活性为4000U/ml-4500U/ml。

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