CN102102095B - 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，产量有限。本发明方法首先将海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中进行恒温培养，将种子液菌种接种于液体培养基中进行培养，制成种子液；然后将种子液进行放大发酵获得发酵液；将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，获得浓缩液，将浓缩液层析纯化并进行洗脱，洗脱液冷冻干燥后获得溶菌酶产品。本发明方法制备的溶菌酶具有安全、广谱、高效等特性。在饲料加工、食品工业、畜牧业、水产养殖等领域有广泛应用前景。本发明方法显著缩短了浓缩时间和生产周期，降低了能耗和生产成本，适合于产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。
背景技术
饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物的耐药性的产生。由于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临重大挑战。面向未来，必须开拓全新路径。溶菌酶是被认为替代抗生素的最有前途的产品。它是一种具有杀菌和免疫功能的无毒蛋白质。它可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其他组织，且本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于饲料加工、医学、食品工业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域；可替代抗生素在饲料中应用，具有庞大的市场。
目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。另一方面，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大，原因在于G+细菌与G-细菌结构差别和细胞壁中肽聚糖含量不同：G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌内壁层为肽聚糖，外面还有一层脂多糖和脂蛋白保护膜，阻止了溶菌酶分子进入内层。杀菌谱太窄，活性较低和不能进行大规模工业化生产制约了溶菌酶应用。因此，面向未来，必须开拓全新路径。
海洋环境独特，其高压、高盐、低营养、低温的特点，这种生命活动的极端环境环境造就了微生物种类及代谢途径特异性，可产生完全不同于陆地微生物的新颖生物活性物质。海洋微生物将是今后获得新的医用、农用抗菌素的重要资源。
近年来，借助于海洋生物高新技术手段，海洋酶研究得到了快速发展而成为各国优先发展的新领域。而就酶蛋白合成的调控而言，海洋微生物生长环境所起的作用是巨大的，从″有实际或潜在用途或价值″的观点看，海洋微生物是一类种类繁多的可再生的遗传基因库，是获取新型酶的重要资源。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。
海洋链霉菌菌株是从近海污泥中分离纯化获得的，该菌株最适生长温度为28～30℃，最适pH值为6～7，最适生长NaCl浓度为3～7％。
本发明方法的具体步骤为：
步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在28～30℃条件下培养96～120小时，选取单菌落作为种子液菌种；
固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、琼脂粉2～3％，余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟，冷却至常温，得到固体培养基。
步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1～3∶100，容器置于转速为140～200转/分钟的摇床中，在28～30℃条件下培养36～48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为108～109cfu/L(colony forming units，指每升发酵液中含有的细菌群落总数)的种子液；
液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟得到液体培养基。
步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1～3∶100，发酵罐中搅拌器的转速为140～200转/分钟，在28～30℃条件下培养60～72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为108～109cfu/L(colony forming units，指每升发酵液中含有的细菌群落总数)。
发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。
步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephadex G-50层析柱中，再用pH值为6.5～7.0、摩尔浓度为0.1～0.5M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0.1～0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Millipore超滤膜。
本发明方法制备的溶菌酶的理化性质如下：分子量为16800道尔顿，等电点为9.2，最适温度为45℃，最适pH值为7，其化学性质非常稳定，pH值在2～11剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在pH值6～8，100℃处理1min，仍保持原酶活性。在碱性环境中对热稳定性较差。其一级结构由136个氨基酸组成，维持其结构的主要作用力为二硫键、氢键和疏水键。
本发明方法制备的溶菌酶具有安全、广谱、高效等特性。在饲料加工、医学、食品工业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域有广泛应用前景。该产自链霉菌的溶菌酶具有高活性(酶活比目前市售的蛋清溶菌高10倍)和比蛋清溶菌酶更宽的抑菌谱(能杀灭蛋清溶菌酶不能杀灭的大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella)等革兰氏阴性菌等革兰氏阴性菌)的特点。
本发明方法用陶瓷膜微滤串连切向超滤浓缩工艺，将分离和浓缩同步进行，显著缩短了浓缩时间和生产周期，降低了能耗和生产成本，提高了酶比活与产出效益，具有传统工艺无法比拟的优势，适合于产业化生产。
具体实施方式
从近海污泥中分离纯化获得海洋链霉菌菌株，该菌株最适生长温度为28～30℃，最适pH值为6～7，最适生长NaCl浓度为3～7％。利用该链霉菌菌株发酵制备溶菌酶。
实施例1
步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在28℃条件下恒温培养120小时，选取单菌落作为种子液菌种。
固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41％、甘油2％、酵母粉0.5％、NaCl4％、MgSO4，0.02％、KNO30.2％、FeSO4.7H2O 0.05％、CuSO40.008％、琼脂粉2％，余量为人工海水；然后用NaOH将基液的pH值调至7.0，最后在121℃条件下灭菌15分钟，冷却至常温，得到固体培养基。
步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1∶100，容器置于转速为140转/分钟的摇床中，在28℃条件下恒温培养48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为108cfu/L的种子液。
液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41％、甘油2％、酵母粉0.5％、NaCl4％、MgSO4，0.02％、KNO30.2％、FeSO4.7H2O 0.05％、CuSO40.008％，余量为人工海水；然后用NaOH将基液的pH值调至7.0，最后在115℃条件下灭菌20分钟得到液体培养基。
步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为3∶100，发酵罐中搅拌器的转速为200转/分钟，在30℃条件下恒温培养60小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为1.5×108cfu/L。发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。
步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephadex G-50层析柱中，再用pH值为6.5、摩尔浓度为0.1M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0.1ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Millipore超滤膜。
实施例2
步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在30℃条件下恒温培养96小时，选取单菌落作为种子液菌种；
固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO42％、甘油3％、酵母粉0.1％、NaCl 3％、MgSO4，0.01％、KH2PO40.3％、FeSO4.7H2O 0.01％、CuSO40.01％、琼脂粉3％，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6.5，最后在115℃条件下灭菌20分钟，冷却至常温，得到固体培养基。
步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为3∶100，容器置于转速为200转/分钟的摇床中，在30℃条件下恒温培养36小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为109cfu/L的种子液。
液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO42％、甘油3％、酵母粉0.1％、NaCl 3％、MgSO4，0.01％、KH2PO40.3％、FeSO4.7H2O 0.01％、CuSO40.01％、琼脂粉3％，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6.5，最后在121℃条件下灭菌15分钟得到液体培养基。
步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1∶100，发酵罐中搅拌器的转速为140转/分钟，在28℃条件下恒温培养72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为108cfu/L。发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。
步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephadex G-50层析柱中，再用pH值为7.0、摩尔浓度为0.3M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0.2ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Millipore超滤膜。
实施例3
步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在29℃条件下恒温培养100小时，选取单菌落作为种子液菌种；
固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41.5％、甘油4％、酵母粉0.3％、NaCl 3.5％、MgSO4，0.05％、KH2PO40.5％、KNO30.1％、FeSO4.7H2O 0.1％、CuSO40.002％、琼脂粉2.5％，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6.8，最后在118℃条件下灭菌18分钟，冷却至常温，得到固体培养基。
步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1∶50，容器置于转速为160转/分钟的摇床中，在29℃条件下恒温培养40小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为1.5×108cfu/L的种子液。
液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41.5％、甘油4％、酵母粉0.3％、NaCl 3.5％、MgSO4，0.05％、KH2PO40.5％、KNO30.1％、FeSO4.7H2O 0.1％、CuSO40.002％、琼脂粉2.5％，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6.8，最后在118℃条件下灭菌18分钟得到液体培养基。
步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1∶50，发酵罐中搅拌器的转速为160转/分钟，在29℃条件下恒温培养66小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为109cfu/L。发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。
步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephadex G-50层析柱中，再用pH值为6.8、摩尔浓度为0.5M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Millipore超滤膜。
本发明方法制备的溶菌酶与现有相关产品优势性能比较如下表：
| 指标 | 本发明溶菌酶 | 常用抗生素 | 中药 | 蛋清溶菌酶 |
| 防治率 | 93％以上 | 40-90％ | 70～80％ | 40～43％ |
| 安全性 | 高，无毒 | 低，有毒 | 低，有毒 | 高，无毒 |
| 残留 | 无 | 有 | 有 | 无 |
| 抗菌谱 | 广 | 广 | 广 | 单一 |
| 耐药性 | 无 | 有 | 无 | 无 |
| 复发率 | 5％以下 | 30～34％ | 10～15％ | 10～12％ |
Claims (1)
1.一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法，其特征在于该方法具体步骤为：
步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在28～30℃条件下培养96～120小时，选取单菌落作为种子液菌种；
固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、琼脂粉2～3％，余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟，冷却至常温，得到固体培养基；
步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1～3∶100，容器置于转速为140～200转/分钟的摇床中，在28～30℃条件下培养36～48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为108～109cfu/L的种子液；
液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟得到液体培养基；
步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1～3∶100，发酵罐中搅拌器的转速为140～200转/分钟，在28～30℃条件下培养60～72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为108～109cfu/L；发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同；
步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephadex G-50层析柱中，再用pH值为6.5～7.0、摩尔浓度为0.1～0.5M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0.1～0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。
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