CN105018405A - 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株用于生产L-丙氨酸的组成型表达基因工程菌<i>Escherichiacoli</i>CICC11032S，宿主为产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（<i>Escherichiacoli</i>）CICC11022S（等同于CGMCCNo.5450），含有睾丸酮丛毛单胞菌（<i>Comamonas</i><i>testosteroni</i>）CICC11023S（等同于CGMCCNo.6083）的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因。利用构建的工程菌进行全细胞高密度催化，可以高效转化富马酸和氨水生产L-丙氨酸，产量达112.7g/L，生产速率12.5g/(L·h)，转化率93.9%，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值。

Description

一株组成型表达基因工程菌及其生产L-丙氨酸的应用

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌及其应用，尤其涉及一株生产L-丙氨酸的基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸，又名L-α-氨基丙酸（L-Alanine，L-Ala），是生物体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一。随着研究和开发的深入，L-丙氨酸在食品和医药行业得到广泛应用。

食品行业：L-丙氨酸作为添加剂，可明显提高饮料中蛋白质的利用率，同时由于可被细胞直接吸收，饮用后能迅速消除疲劳、振奋精神。L-丙氨酸甜味柔和，甜度为蔗糖的70%，能够提高甜度，可用于改善人工甜味剂味感和有机酸的酸味，使其味道更加自然。L-丙氨酸与谷氨酸钠的复合调味品，可明显改善食品风味。L-丙氨酸是合成甜味剂阿力甜的主要原料，其甜度是蔗糖的2000倍左右，目前已在多个国家和地区获准使用。

医药行业：L-丙氨酸是合成维生素B₆和氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星合成前提）的重要中间体，也是营养剂补糖氨基酸营养输液的组分之一。L-丙氨酸也是血液保存剂的主要成分，可提高血液保存期。

目前，广泛使用的L-丙氨酸生产方法为微生物转化法，通过L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧基反应，生产L-丙氨酸，具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等特点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单、易于操作控制，但是该转化过程生产成本相对较高。

L-天冬氨酸微生物转化生产是利用微生物产生的L-天冬氨酸酶，转化底物富马酸和氨水获得的（附图1）。富马酸来源广泛，价格低廉。

本发明在一个工程菌株中实现L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的共表达，以富马酸和氨水为底物生产L-丙氨酸，可以有效降低原料成本，同时在富马酸转化时反应体系中富余的NH₃可以与L-天冬氨酸脱羧产生的CO₂发生中和反应，产生副产品碳酸铵，进而进一步降低成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的菌株品种，可以同时产生L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化富马酸生产L-丙氨酸，以替代现有L-丙氨酸生产工艺的原料L-天冬氨酸，降低生产成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一、本发明的基因工程菌株，是以可以产生L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC 11022S（等同于CGMCC No. 5450）作为出发菌株，通过将L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因（如asd基因）导入该菌株并表达，构建而成的重组菌株CICC 11032S。

进一步的，该基因工程菌株构建步骤如下：

(1) 人工合成tac启动子，其序列如SEQ ID NO. 2所示。

(2) 以上述合成的tac启动子为模板，设计引物如下：

tac.f: 5’-TTAACGCGTATCACTGCATAATTCGTG-3’ (划线部分是MluI核酸内切酶酶切位点)；

tac.r: 5’-TTATCTAGATCCACACATTATACGAGC-3’ (划线部分是XbaI核酸内切酶酶切位点)。

(3) 以上述引物进行tac启动子的扩增，并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段和载体pET28a（购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID NO. 3所示），DNA连接酶连接，获得重组质粒，命名为pETP_tac。

(4) 提取睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）CICC 11023s（等同于CGMCC No. 6083）基因组，以基因组为模板，扩增L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，设计引物如下：

asd.f: 5’- GGCATATGATGAGCAAGGATTATCAG -3’ (划线部分是NdeI核酸内切酶酶切位点)；

asd.r: 5’-ATTCTCGAGTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3’ (划线部分是XhoI核酸内切酶酶切位点)。

(5) 以上述引物进行L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的扩增（其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示），并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段、载体pETP_tac和pETDuet-1（购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID NO. 4所示），DNA连接酶连接，获得重组载体，分别命名为pETP_tac-asd和pETDuet-asd。然后设计引物asd.r(EcoRI) 5'-GTTGAATTCTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3'（划线部分是EcoRI核酸内切酶酶切位点），与tac.f引物共同使用，以pETP_tac-asd为模板，扩增DNA片段P_tac-asd，插入载体pETDuet-asd的MluI和EcoRI酶切位点，替换pETDuet-asd的表达调控基因lacI和启动子T7，构建获得载体pETP_p-asd，故pETP_p-asd可以不需诱导，组成型表达asd基因。将载体pETP_p-asd转化到可以表达L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌E. coli CICC 11022S中，获得工程菌株，命名为E. coli/pETP_p-asd。

二、利用本发明的大肠埃希氏菌工程菌生产L-丙氨酸的方法，其特征包括发酵培养基培养工程菌，然后利用发酵液转化富马酸生产L-丙氨酸。

进一步，具体步骤如下：

(1) 菌种活化

将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素和1.5 – 2.0%琼脂的LB培养基平板上，30±1^oC培养12±2小时。

(2) 种子培养

无菌条件下，用灭菌后的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，接种发酵培养基，30±1^oC摇床培养12±2小时，获得种子液。

其中，上述步骤(1)中所述LB培养基配方为：1 L水中加入酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，115^oC灭菌30分钟。

上述步骤(2)中所述发酵培养基配方为：1 L水中加入富马酸10 g，玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 – 7.5。

(3) 发酵培养

将种子液以0.1 – 5.0%接种量接种到发酵培养基中，30±1^oC摇床培养12±2小时，获得发酵液。

(4) 底物转化

将富马酸加入转化罐中，以氨水调节pH为7.0 – 8.5。然后将发酵液12000 rpm离心5 min，无菌生理盐水悬浮菌泥，加入转化罐中，调节反应体系细胞密度（OD₆₀₀）10 – 20，调节温度40 – 50^oC，搅拌转速50 – 200 rpm，转化8 – 12小时。

(5) 检测方法

L-天冬氨酸和L-丙氨酸定量测定方法采用高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）柱前衍生方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。

本发明成功实现了将L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因在携带L-天冬氨酸酶基因的E. coli CICC 11022S中的表达，并以此基因工程菌株E. coli/pETP_p-asd转化富马酸生产L-丙氨酸，具有原料成本低，生产过程简易，简便高效等特点。

本发明具有的突出特点是：

（1）本发明应用同时表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶和L-天冬氨酸酶的菌株E. coli/pETP_p-asd转化富马酸生产L-丙氨酸。

（2）本发明方法成功降低了原料的成本。

（3）本发明方法构建的基因工程菌生产L-丙氨酸的过程简便，易于操作。

（4）本发明的基因工程菌生产L-丙氨酸，产量可达112.7 g/L，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.9%。

附图说明

附图 1  L-天冬氨酸和L-丙氨酸的微生物转化生产过程

附图 2  E. coli/pETPp-asd转化富马酸生产L-丙氨酸示意图

其中，ori：复制起始位点；Ap ^r ：编码氨苄青霉素抗性基因；asd：L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因；promoter：启动子。

附图 3  E. coli/pETPp-asd全细胞高密度转化富马酸生产L-丙氨酸

■, L-天冬氨酸；●, L-丙氨酸

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。

实施例1. 基因工程菌E. coli/pETP_p-asd的构建

(1) 接种活化的E.coli CICC 11022S于LB培养基中37^oC 200 rpm振荡培养过夜。

(2) 1%接种量转接E.coli 11022S于新鲜LB培养基中，37^oC 200 rpm振荡培养2 – 4 h。

(3) 将培养物转入1.5 mL的无菌离心管中，冰浴30 min，4^oC离心，4000 rpm，5 min，弃上清液。

(4) 在菌体沉淀中加入200 μL预冷的0.1 mol/L CaCl₂，冰浴5 min，4^oC离心，4000 rpm，5 min，弃上清液。

(5) 在菌体沉淀中加入50 μL预冷的0.1mol/L CaCl₂及1 μL载体pETPp-asd，混匀，冰浴20 – 30 min。

(6) 42^oC热激30s后迅速冰浴2 – 3 min，加入400 μL新鲜的LB培养基，37^oC 160 rmp振荡恢复培养1 h。

(7) 取恢复培养液100 μL，涂布含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板，37^oC培养16-18 h，获得基因工程菌株，命名为E. coli/pETP_p-asd（附图2）。

实施例2. 菌株E. coli/pETP_p-asd的发酵培养

将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素和1.5 – 2.0%琼脂的LB培养基平板上，30±1^oC培养12±2小时，获得单菌落。

无菌条件下，用灭菌后的牙签挑取平板上的单菌落，接种发酵培养基，30±1^oC摇床培养12±2小时，获得种子液。

将种子液以0.1 – 5%接种量接种到发酵培养基，30±1^oC摇床培养12±2小时，获得发酵液。

其中，所述LB培养基配方为：1 L水中加入酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，115^oC灭菌30分钟。

所述发酵培养基配方为：1 L水中加入富马酸10 g，玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 – 7.5。

实施例3. E. coli/pETP_p-asd全细胞高密度转化生产L-丙氨酸

将富马酸加入转化罐中，加入一定量的水，然后边搅拌边加入氨水，并以pH计测定溶液pH变化情况，待富马酸完全溶解，再以氨水调节pH为7.0 – 8.5，控制富马酸终浓度0.5 – 1.2 摩尔/升。将发酵培养好的E. coli/pETP_p-asd菌液离心收集，生理盐水悬浮，加入转化罐中，至菌体密度OD₆₀₀ = 10 – 20。调节温度40 – 50^oC，搅拌转速50 – 200 rpm进行转化。定期取样，高效液相色谱定量检测L-丙氨酸的生产（附图3）。9小时，L-丙氨酸的产量可达112.7 g/L，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.9%。

序列表

<110> 中国食品发酵工业研究院

<120>一株组成型表达基因工程菌及其生产L-丙氨酸的应用

<141>2015-07-24

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<170>PatentIn version 3.5

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<211>1602

<212>DNA

<213>单胞菌属

<221>asd

<222>(1)…(1602)

 

<400>1

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<210>2

<211>136

<212>DNA

<213>大肠埃希氏菌属

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<210>3

<211>5369

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<222>(1)…(5369)

 

<400>3

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gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat      4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg      4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt      4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg      4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct      4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga      4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc      4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg      4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct      4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca      4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga      4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac      4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata      4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg      4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc      5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa      5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt      5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac      5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta      5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg      5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca                                               5369

 

<210> 4

<211>5420

<212>DNA

<213>大肠埃希氏菌属

<221>pETDuet-1

<222>(1)…(5420)

 

<400>4

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag        60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag       120

ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag       180

taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt       240

gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata       300

tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt       360

ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg       420

cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg       480

cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggattggcga       540

atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt       600

gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct       660

cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg       720

atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag       780

tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa       840

tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga       900

tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa       960

atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tctggcggca cgatggcatg      1020

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca      1080

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca      1140

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag      1200

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac      1260

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc      1320

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct      1380

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc      1440

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg      1500

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc      1560

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat      1620

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag      1680

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat      1740

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg      1800

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca      1860

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga      1920

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc      1980

ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat      2040

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt      2100

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt      2160

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt      2220

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc      2280

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg      2340

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg      2400

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt      2460

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac      2520

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg      2580

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg      2640

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat      2700

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt      2760

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg      2820

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa      2880

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc      2940

tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg      3000

ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg      3060

gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg      3120

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca      3180

ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc      3240

gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt      3300

aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact      3360

gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag      3420

aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag      3480

ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc      3540

cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg      3600

cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca      3660

cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg      3720

cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag      3780

cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg      3840

aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga      3900

gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg      3960

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg      4020

cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc      4080

ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc      4140

ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc      4200

cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc      4260

cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat      4320

ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg      4380

ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac      4440

agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc      4500

cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc      4560

agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc      4620

ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg      4680

caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc      4740

acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc      4800

cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac      4860

gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc      4920

agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata      4980

ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc      5040

cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc      5100

gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt      5160

tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg      5220

ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag      5280

cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc      5340

cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga      5400

aattaatacg actcactata                                                           5420

 

Claims (5)

1.一株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）基因工程菌Escherichia coli CICC 11032S，其含有外源L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因（asd），优选所述asd基因来源于睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）或者其他能够表达相同功能酶的微生物，优选所述asd是以睾丸酮丛毛单胞菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，进一步优选所述asd的序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于所述菌株能够组成型表达所述asd基因，优选所述菌株含有组成型表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的表达载体，进一步优选所述表达载体，其特征在于pETPp-asd含有tac和T7共2个启动子，启动子后均含有asd基因，且不含有阻遏基因lacI。

3.权利要求1 - 2任一项所述基因工程菌在生产L-丙氨酸中的用途。

4.如权利要求3所述用途，包括以下步骤：

使用权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌处理富马酸，得L-丙氨酸；

进一步优选包括如下步骤：

(1) 将权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌活化，获得种子液；

(2) 将上述种子液接入发酵培养基，发酵，得发酵液；

(3) 离心上述发酵液，收集菌体，悬浮菌体，转化富马酸，获得L-丙氨酸。

5.如权利要求4所述用途，包括以下步骤：

(1) 将权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌斜面菌种接种种子培养基， 30 – 40^oC，50 – 200 rpm培养8 – 16 h，获得种子液；

(2) 种子液接入发酵培养基，30 – 40^oC，50 – 200 rpm培养10 – 20 h，获得发酵液；

(3) 发酵液离心，收集菌体，生理盐水悬浮，转入pH 7.0 – 9.0，0.8 – 1.2摩尔/升富马酸溶液的转化罐中，至菌体浓度10 – 20（OD₆₀₀），控制温度40 – 50^oC，搅拌转速30 – 80 rpm，转化9 – 12 h，获得L-丙氨酸转化液。