CN105018405A - 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 - Google Patents
一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105018405A CN105018405A CN201510443373.0A CN201510443373A CN105018405A CN 105018405 A CN105018405 A CN 105018405A CN 201510443373 A CN201510443373 A CN 201510443373A CN 105018405 A CN105018405 A CN 105018405A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alanine
- asd
- genetically engineered
- engineered bacterium
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 43
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 41
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 3
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 abstract 2
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 abstract 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- NUFKRGBSZPCGQB-FLBSXDLDSA-N (3s)-3-amino-4-oxo-4-[[(2r)-1-oxo-1-[(2,2,4,4-tetramethylthietan-3-yl)amino]propan-2-yl]amino]butanoic acid;pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C)C(=O)NC1C(C)(C)SC1(C)C.OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C)C(=O)NC1C(C)(C)SC1(C)C NUFKRGBSZPCGQB-FLBSXDLDSA-N 0.000 description 1
- MXZROAOUCUVNHX-UHFFFAOYSA-N 2-Aminopropanol Chemical compound CCC(N)O MXZROAOUCUVNHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004377 Alitame Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019409 alitame Nutrition 0.000 description 1
- 108010009985 alitame Proteins 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004555 blood preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 108010022192 endodeoxyribonuclease NdeI Proteins 0.000 description 1
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- CAOOISJXWZMLBN-PPHPATTJSA-N htn0d03vrz Chemical compound Cl.C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 CAOOISJXWZMLBN-PPHPATTJSA-N 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 235000019614 sour taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株用于生产L-丙氨酸的组成型表达基因工程菌<i>Escherichiacoli</i>CICC11032S，宿主为产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（<i>Escherichiacoli</i>）CICC11022S（等同于CGMCCNo.5450），含有睾丸酮丛毛单胞菌（<i>Comamonas</i><i>testosteroni</i>）CICC11023S（等同于CGMCCNo.6083）的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因。利用构建的工程菌进行全细胞高密度催化，可以高效转化富马酸和氨水生产L-丙氨酸，产量达112.7g/L，生产速率12.5g/(L·h)，转化率93.9%，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株基因工程菌及其应用，尤其涉及一株生产L-丙氨酸的基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-丙氨酸，又名L-α-氨基丙酸（L-Alanine，L-Ala），是生物体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一。随着研究和开发的深入，L-丙氨酸在食品和医药行业得到广泛应用。
食品行业：L-丙氨酸作为添加剂，可明显提高饮料中蛋白质的利用率，同时由于可被细胞直接吸收，饮用后能迅速消除疲劳、振奋精神。L-丙氨酸甜味柔和，甜度为蔗糖的70%，能够提高甜度，可用于改善人工甜味剂味感和有机酸的酸味，使其味道更加自然。L-丙氨酸与谷氨酸钠的复合调味品，可明显改善食品风味。L-丙氨酸是合成甜味剂阿力甜的主要原料，其甜度是蔗糖的2000倍左右，目前已在多个国家和地区获准使用。
医药行业：L-丙氨酸是合成维生素B6和氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星合成前提）的重要中间体，也是营养剂补糖氨基酸营养输液的组分之一。L-丙氨酸也是血液保存剂的主要成分，可提高血液保存期。
目前，广泛使用的L-丙氨酸生产方法为微生物转化法，通过L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧基反应，生产L-丙氨酸，具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等特点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单、易于操作控制，但是该转化过程生产成本相对较高。
L-天冬氨酸微生物转化生产是利用微生物产生的L-天冬氨酸酶，转化底物富马酸和氨水获得的（附图1）。富马酸来源广泛，价格低廉。
本发明在一个工程菌株中实现L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的共表达，以富马酸和氨水为底物生产L-丙氨酸，可以有效降低原料成本，同时在富马酸转化时反应体系中富余的NH3可以与L-天冬氨酸脱羧产生的CO2发生中和反应，产生副产品碳酸铵，进而进一步降低成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的菌株品种，可以同时产生L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化富马酸生产L-丙氨酸，以替代现有L-丙氨酸生产工艺的原料L-天冬氨酸，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一、本发明的基因工程菌株，是以可以产生L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC 11022S（等同于CGMCC No. 5450）作为出发菌株，通过将L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因（如asd基因）导入该菌株并表达，构建而成的重组菌株CICC 11032S。
进一步的，该基因工程菌株构建步骤如下：
(1) 人工合成tac启动子，其序列如SEQ ID NO. 2所示。
(2) 以上述合成的tac启动子为模板，设计引物如下：
tac.f: 5’-TTAACGCGTATCACTGCATAATTCGTG-3’ (划线部分是MluI核酸内切酶酶切位点)；
tac.r: 5’-TTATCTAGATCCACACATTATACGAGC-3’ (划线部分是XbaI核酸内切酶酶切位点)。
(3) 以上述引物进行tac启动子的扩增，并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段和载体pET28a（购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID NO. 3所示），DNA连接酶连接，获得重组质粒，命名为pETPtac。
(4) 提取睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）CICC 11023s（等同于CGMCC No. 6083）基因组，以基因组为模板，扩增L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，设计引物如下：
asd.f: 5’- GGCATATGATGAGCAAGGATTATCAG -3’ (划线部分是NdeI核酸内切酶酶切位点)；
asd.r: 5’-ATTCTCGAGTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3’ (划线部分是XhoI核酸内切酶酶切位点)。
(5) 以上述引物进行L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的扩增（其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示），并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段、载体pETPtac和pETDuet-1（购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID NO. 4所示），DNA连接酶连接，获得重组载体，分别命名为pETPtac-asd和pETDuet-asd。然后设计引物asd.r(EcoRI) 5'-GTTGAATTCTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3'（划线部分是EcoRI核酸内切酶酶切位点），与tac.f引物共同使用，以pETPtac-asd为模板，扩增DNA片段Ptac-asd，插入载体pETDuet-asd的MluI和EcoRI酶切位点，替换pETDuet-asd的表达调控基因lacI和启动子T7，构建获得载体pETPp-asd，故pETPp-asd可以不需诱导，组成型表达asd基因。将载体pETPp-asd转化到可以表达L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌E. coli CICC 11022S中，获得工程菌株，命名为E. coli/pETPp-asd。
二、利用本发明的大肠埃希氏菌工程菌生产L-丙氨酸的方法，其特征包括发酵培养基培养工程菌，然后利用发酵液转化富马酸生产L-丙氨酸。
进一步，具体步骤如下：
(1) 菌种活化
将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素和1.5 – 2.0%琼脂的LB培养基平板上，30±1oC培养12±2小时。
(2) 种子培养
无菌条件下，用灭菌后的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，接种发酵培养基，30±1oC摇床培养12±2小时，获得种子液。
其中，上述步骤(1)中所述LB培养基配方为：1 L水中加入酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，115oC灭菌30分钟。
上述步骤(2)中所述发酵培养基配方为：1 L水中加入富马酸10 g，玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 – 7.5。
(3) 发酵培养
将种子液以0.1 – 5.0%接种量接种到发酵培养基中，30±1oC摇床培养12±2小时，获得发酵液。
(4) 底物转化
将富马酸加入转化罐中，以氨水调节pH为7.0 – 8.5。然后将发酵液12000 rpm离心5 min，无菌生理盐水悬浮菌泥，加入转化罐中，调节反应体系细胞密度（OD600）10 – 20，调节温度40 – 50oC，搅拌转速50 – 200 rpm，转化8 – 12小时。
(5) 检测方法
L-天冬氨酸和L-丙氨酸定量测定方法采用高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）柱前衍生方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。
本发明成功实现了将L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因在携带L-天冬氨酸酶基因的E. coli CICC 11022S中的表达，并以此基因工程菌株E. coli/pETPp-asd转化富马酸生产L-丙氨酸，具有原料成本低，生产过程简易，简便高效等特点。
本发明具有的突出特点是：
（1）本发明应用同时表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶和L-天冬氨酸酶的菌株E. coli/pETPp-asd转化富马酸生产L-丙氨酸。
（2）本发明方法成功降低了原料的成本。
（3）本发明方法构建的基因工程菌生产L-丙氨酸的过程简便，易于操作。
（4）本发明的基因工程菌生产L-丙氨酸，产量可达112.7 g/L，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.9%。
附图说明
附图 1 L-天冬氨酸和L-丙氨酸的微生物转化生产过程
附图 2 E. coli/pETPp-asd转化富马酸生产L-丙氨酸示意图
其中，ori：复制起始位点；Ap r ：编码氨苄青霉素抗性基因；asd：L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因；promoter：启动子。
附图 3 E. coli/pETPp-asd全细胞高密度转化富马酸生产L-丙氨酸
■, L-天冬氨酸；●, L-丙氨酸
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。
实施例1. 基因工程菌E. coli/pETPp-asd的构建
(1) 接种活化的E.coli CICC 11022S于LB培养基中37oC 200 rpm振荡培养过夜。
(2) 1%接种量转接E.coli 11022S于新鲜LB培养基中，37oC 200 rpm振荡培养2 – 4 h。
(3) 将培养物转入1.5 mL的无菌离心管中，冰浴30 min，4oC离心，4000 rpm，5 min，弃上清液。
(4) 在菌体沉淀中加入200 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2，冰浴5 min，4oC离心，4000 rpm，5 min，弃上清液。
(5) 在菌体沉淀中加入50 μL预冷的0.1mol/L CaCl2及1 μL载体pETPp-asd，混匀，冰浴20 – 30 min。
(6) 42oC热激30s后迅速冰浴2 – 3 min，加入400 μL新鲜的LB培养基，37oC 160 rmp振荡恢复培养1 h。
(7) 取恢复培养液100 μL，涂布含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板，37oC培养16-18 h，获得基因工程菌株，命名为E. coli/pETPp-asd（附图2）。
实施例2. 菌株E. coli/pETPp-asd的发酵培养
将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素和1.5 – 2.0%琼脂的LB培养基平板上，30±1oC培养12±2小时，获得单菌落。
无菌条件下，用灭菌后的牙签挑取平板上的单菌落，接种发酵培养基，30±1oC摇床培养12±2小时，获得种子液。
将种子液以0.1 – 5%接种量接种到发酵培养基，30±1oC摇床培养12±2小时，获得发酵液。
其中，所述LB培养基配方为：1 L水中加入酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，115oC灭菌30分钟。
所述发酵培养基配方为：1 L水中加入富马酸10 g，玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 – 7.5。
实施例3. E. coli/pETPp-asd全细胞高密度转化生产L-丙氨酸
将富马酸加入转化罐中，加入一定量的水，然后边搅拌边加入氨水，并以pH计测定溶液pH变化情况，待富马酸完全溶解，再以氨水调节pH为7.0 – 8.5，控制富马酸终浓度0.5 – 1.2 摩尔/升。将发酵培养好的E. coli/pETPp-asd菌液离心收集，生理盐水悬浮，加入转化罐中，至菌体密度OD600 = 10 – 20。调节温度40 – 50oC，搅拌转速50 – 200 rpm进行转化。定期取样，高效液相色谱定量检测L-丙氨酸的生产（附图3）。9小时，L-丙氨酸的产量可达112.7 g/L，生产速率12.5 g/(L·h)，转化率93.9%。
序列表
<110> 中国食品发酵工业研究院
<120>一株组成型表达基因工程菌及其生产L-丙氨酸的应用
<141>2015-07-24
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1602
<212>DNA
<213>单胞菌属
<221>asd
<222>(1)…(1602)
<400>1
atgagcaagg attatcagag tctggcgaac ttgagcccgt ttgagctcaa ggatgagttg 60
atcaagatcg cctcgggcga cggaaaccgc ctcatgctca atgcggggcg gggcaatccc 120
aattttctgg caaccacccc gagaagagca tttttccgtc tgggcttgtt cgcggctgcc 180
gagtcggaac tttcgtattc atatatgaac acggtgggcg tgggaggcct ggcaaagatc 240
gagggcatag aagggcgctt cgagcgctat attgccgaga accgcgatca ggaaggcgtg 300
cgctttctcg gtaaatccct gagttatgta cgcgatcagc tgggcttgga tccggccgcc 360
ttcctgcacg agatggtcga cggtattctg ggctgcaatt accccgttcc ccctcggatg 420
ctgaacatca gcgaaaaaat cgtgcgccag tacatcatcc gtgaaatggg ggccgatgca 480
attcccagcg agtccgtgaa cctgtttgcg gtcgaggggg gaacggccgc catggcatac 540
atcttcgaga gcatgaaggt caacggcctc ctcaaggctg gtgacaaggt agccatcggc 600
atgccggttt tcactccgta catagaaatt ccggaactgg cccagtatgc gttggaggag 660
gtggcaatca atgccgaccc ggccctcaac tggcaatatc ctgattccga actagacaag 720
ctcaaggatc cggccatcaa gatcttcttc tgcgtgaacc ccagcaatcc gccatcggta 780
aagatggacg agcgcagcct ggagcgtgtg cgcaagattg tggcagagca tcgaccggat 840
ctgatgatcc tgaccgatga cgtctatggc acgtttgccg atggctttca gtcgctcttt 900
gcgatttgcc cggccaacac tttgttggtc tattcattct ccaaatactt tggtgccact 960
ggctggcgtc tgggtgtcgt ggccgcccat aaggaaaata tcttcgactt ggcattgggc 1020
aggctgcctg agtccgagaa aacagcgctc gatgatcgct atcgttcact gctacccgat 1080
gtgcgttcat tgaaattcct agatcgtctg gttgccgaca gccgcgctgt tgccttgaac 1140
cacacggccg gtctgtccac gccgcagcag gtccagatga ccttgttctc gttgtttgcg 1200
ctcatggacg agagcgacca gtacaagcac acgctcaagc aactgatacg acgtcgtgaa 1260
gcaacgctct atcgcgagtt gggaacgcct ccgcaaagag atgaaaatgc ggtcgattac 1320
tacaccttga ttgacctgca ggacgtgacg tcgaagcttt atggcgaagc gttctcgaaa 1380
tgggcagtca agcagtcctc gaccggcgac atgctgttcc ggattgccga cgaaacaggg 1440
atcgtgctcc tgccgggacg tggctttgga tcggaccgtc catcgggacg cgcctccttg 1500
gccaatctca acgagtatga gtacgcggcc ataggtcgtg cgctgcgaca aatggctgac 1560
gagctgtacg cgcaatacac ccagcaaggg aacaagcgct ga 1602
<210>2
<211>136
<212>DNA
<213>大肠埃希氏菌属
<221>tac
<222>(1)…(136)
<400>2
atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc 60
cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc 120
tcgtataatg tgtgga 136
<210>3
<211>5369
<212>DNA
<213>大肠埃希氏菌属
<221>pET28a
<222>(1)…(5369)
<400>3
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240
tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300
gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360
caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420
ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480
gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540
gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600
ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660
caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720
tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780
agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840
ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900
ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960
gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020
taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080
cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140
cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200
tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260
tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320
gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380
atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440
gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500
ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560
cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620
cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680
cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740
ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860
acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920
gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980
ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040
ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100
tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160
gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220
tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280
cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340
catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400
gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460
catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520
tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580
taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640
atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700
gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760
aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960
gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020
ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080
tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140
gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200
ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260
tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320
attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380
ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440
cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500
gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560
accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620
gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680
tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740
aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800
gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340
cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369
<210> 4
<211>5420
<212>DNA
<213>大肠埃希氏菌属
<221>pETDuet-1
<222>(1)…(5420)
<400>4
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120
ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180
taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240
gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300
tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt 360
ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg 420
cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 480
cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggattggcga 540
atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 600
gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 660
cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 720
atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 780
tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 840
tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 900
tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 960
atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tctggcggca cgatggcatg 1020
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 1080
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1140
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1200
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1260
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1320
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1380
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1440
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1500
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1560
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1620
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1680
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1740
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 1800
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 1860
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 1920
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 1980
ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2040
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt 2100
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 2160
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 2220
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 2280
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 2340
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 2400
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 2460
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 2520
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 2580
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 2640
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 2700
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 2760
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 2820
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 2880
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 2940
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg 3000
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 3060
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 3120
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 3180
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc 3240
gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt 3300
aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact 3360
gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag 3420
aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag 3480
ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc 3540
cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg 3600
cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca 3660
cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg 3720
cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag 3780
cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg 3840
aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga 3900
gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 3960
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 4020
cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc 4080
ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc 4140
ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc 4200
cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc 4260
cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat 4320
ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg 4380
ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac 4440
agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc 4500
cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc 4560
agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc 4620
ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg 4680
caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc 4740
acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc 4800
cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac 4860
gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc 4920
agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata 4980
ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc 5040
cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc 5100
gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt 5160
tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg 5220
ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag 5280
cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc 5340
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga 5400
aattaatacg actcactata 5420
Claims (5)
1.一株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）基因工程菌Escherichia coli CICC 11032S，其含有外源L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因（asd），优选所述asd基因来源于睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）或者其他能够表达相同功能酶的微生物，优选所述asd是以睾丸酮丛毛单胞菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，进一步优选所述asd的序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于所述菌株能够组成型表达所述asd基因，优选所述菌株含有组成型表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的表达载体，进一步优选所述表达载体，其特征在于pETPp-asd含有tac和T7共2个启动子，启动子后均含有asd基因，且不含有阻遏基因lacI。
3.权利要求1 - 2任一项所述基因工程菌在生产L-丙氨酸中的用途。
4.如权利要求3所述用途，包括以下步骤：
使用权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌处理富马酸，得L-丙氨酸；
进一步优选包括如下步骤：
(1) 将权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌活化，获得种子液；
(2) 将上述种子液接入发酵培养基，发酵，得发酵液；
(3) 离心上述发酵液，收集菌体，悬浮菌体，转化富马酸，获得L-丙氨酸。
5.如权利要求4所述用途，包括以下步骤：
(1) 将权利要求1 - 2任一项所述的基因工程菌斜面菌种接种种子培养基， 30 – 40oC，50 – 200 rpm培养8 – 16 h，获得种子液；
(2) 种子液接入发酵培养基，30 – 40oC，50 – 200 rpm培养10 – 20 h，获得发酵液；
(3) 发酵液离心，收集菌体，生理盐水悬浮，转入pH 7.0 – 9.0，0.8 – 1.2摩尔/升富马酸溶液的转化罐中，至菌体浓度10 – 20（OD600），控制温度40 – 50oC，搅拌转速30 – 80 rpm，转化9 – 12 h，获得L-丙氨酸转化液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510443373.0A CN105018405A (zh) | 2015-07-27 | 2015-07-27 | 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510443373.0A CN105018405A (zh) | 2015-07-27 | 2015-07-27 | 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105018405A true CN105018405A (zh) | 2015-11-04 |
Family
ID=54408710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510443373.0A Pending CN105018405A (zh) | 2015-07-27 | 2015-07-27 | 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105018405A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220185769A1 (en) * | 2019-03-20 | 2022-06-16 | Guang An Mojia Biotechnology Co., Ltd. | Methods for preparing beta-alanine, beta-alanine salt and pantothenate |
| CN115678932A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-02-03 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 双酶耦合催化富马酸合成l-丙氨酸的方法 |
| CN118064475A (zh) * | 2024-04-19 | 2024-05-24 | 天津科技大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580864A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-18 | 安徽华恒生物工程有限公司 | 一菌双酶生产光学纯l-丙氨酸的方法 |
| CN102559538A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-07-11 | 烟台恒源生物工程有限公司 | 高产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用 |
| CN102690762A (zh) * | 2012-06-25 | 2012-09-26 | 烟台恒源生物工程有限公司 | 游离细胞法生物转化l-天冬氨酸生产l-丙氨酸的方法 |
-
2015
- 2015-07-27 CN CN201510443373.0A patent/CN105018405A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580864A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-18 | 安徽华恒生物工程有限公司 | 一菌双酶生产光学纯l-丙氨酸的方法 |
| CN102559538A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-07-11 | 烟台恒源生物工程有限公司 | 高产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用 |
| CN102690762A (zh) * | 2012-06-25 | 2012-09-26 | 烟台恒源生物工程有限公司 | 游离细胞法生物转化l-天冬氨酸生产l-丙氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FUJIKI,T. 等: "Pseudomonas dacunhae ATCC 21192 asp operon (aspR, aspT, aspD), complete cds", 《GENBANK DATABASE》 * |
| 刘景晶 等: "用循环式生物反应器酶法生产L-丙氨酸", 《药物生物技术》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220185769A1 (en) * | 2019-03-20 | 2022-06-16 | Guang An Mojia Biotechnology Co., Ltd. | Methods for preparing beta-alanine, beta-alanine salt and pantothenate |
| CN115678932A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-02-03 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 双酶耦合催化富马酸合成l-丙氨酸的方法 |
| CN118064475A (zh) * | 2024-04-19 | 2024-05-24 | 天津科技大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法与应用 |
| CN118064475B (zh) * | 2024-04-19 | 2024-07-09 | 天津科技大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112481233B (zh) | 制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法 | |
| CN110951741A (zh) | 一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统 | |
| KR20230062595A (ko) | 할로겐화된 실로시빈 유도체 및 사용 방법 | |
| CN105018405A (zh) | 一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用 | |
| CN109136251B (zh) | 一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用 | |
| CN112725256B (zh) | 重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法 | |
| CN108315290A (zh) | 一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用 | |
| CN110878322B (zh) | 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统 | |
| CN110577965B (zh) | xCas9n-epBE碱基编辑系统在基因编辑中的应用 | |
| CN110951770B (zh) | 一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用 | |
| CN108456687B (zh) | 基于赖氨酸浓度控制的重组表达质粒、转化子及其应用 | |
| CN111849845B (zh) | 全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制备方法 | |
| US6803230B2 (en) | Phagemid vectors | |
| CN110964678B (zh) | 一种合成法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108728389B (zh) | 一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌及其应用 | |
| CN111607545A (zh) | 一种高产法尼烯的重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN102311954B (zh) | 转基因番木瓜55-1转化事件特异性pcr检测方法 | |
| CN109266686A (zh) | 一种基因组核苷酸定点替换的方法 | |
| CN109666694B (zh) | Scr7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用 | |
| CN113801868B (zh) | 一种檀香烯合酶突变体及其制备方法 | |
| CN114369560A (zh) | 一种提高生物靛蓝产量的方法 | |
| CN116867894A (zh) | 由异丁香酚生物合成香草醛 | |
| KR20240009946A (ko) | 레독스 민감성 cralbp 돌연변이 단백질 | |
| CN109265562B (zh) | 一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用 | |
| CN112608932A (zh) | 一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100015 room 321, 6 building, 24 Jiuxianqiao Road, Chaoyang District, Beijing. Applicant after: China Food Fermentation Industry Research Institute Co., Ltd. Applicant after: Yantai Hengyuan Bioengineering Co., Ltd. Address before: 100015 room 321, 6 building, 24 Jiuxianqiao Road, Chaoyang District, Beijing. Applicant before: China National Academy of Food & Fermentation Industries Applicant before: Yantai Hengyuan Bioengineering Co., Ltd. |
|
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151104 |