CN109666694B - Scr7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用。实验证明，SCR7可以提高碱基编辑系统编辑效率和扩大碱基编辑系统突变窗口范围，进而获得含有更多突变位点的突变体。本发明具有重要的应用价值。

Description

SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率(即C→T碱基替换效率)。

PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sealamprey)是一种胞苷脱氨酶。在所测试的PmCDA1编辑器中，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNAglycosylase，UDG)催化清除DNA中尿嘧啶(Uracil，U)，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。SpCas9n(D10A)连带着PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成U，通过DNA的修复使得U与A(腺嘌呤，Adenine)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。

为了提高工作效率，降低工作成本，C→T碱基替换效率的提高一直是植物基因组碱基编辑系统的研究方向。此外，已有研究结果表明，SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑系统更偏向于对靶点5’端2-6bp内的C进行替换，如果可以打破这一局限，实现靶点内部更多的C发生替换，即实现拓展碱基替换多样性，则可获得某一基因更丰富的等位突变形式，从而扩展该基因的功能研究和应用。

SCR7(5，6-bis(benzylideneamino)-2-mercapto-pyrimidin-4-ol)是一种连接酶IV抑制剂，其通过与连接酶IV DNA结构域结合影响其与DSBs的结合。

发明内容

本发明的目的是提高碱基编辑系统的编辑效率和/或扩大碱基编辑系统突变窗口范围。

本发明首先保护提高碱基编辑系统编辑效率的方法。

本发明要保护的提高碱基编辑系统编辑效率的方法，具体可为方法A1，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

本发明要保护的提高碱基编辑系统编辑效率的方法，具体可为方法A2，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

本发明还保护扩大碱基编辑系统突变窗口范围的方法。

本发明要保护的扩大碱基编辑系统突变窗口范围的方法，具体可为方法C1，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

本发明要保护的扩大碱基编辑系统突变窗口范围的方法，具体可为方法C2，可包括如下步骤：使受体表达sgRNA、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

所述方法A1和所述方法C1中，“使受体表达sgRNA、Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶”可通过将所述sgRNA的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因和所述胞嘧啶脱氨酶编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。

所述方法A2和所述方法C2中，“使受体表达sgRNA、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂”可通过将所述sgRNA的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶编码基因和所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。

上述任一所述的方法中，还可使受体表达抗潮霉素蛋白(用于筛选)。所述“使受体表达抗潮霉素蛋白”可通过将所述抗潮霉素蛋白的编码基因导入受体实现。具体的，可以跟上述元件放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。

上述任一所述的方法中，所述受体可为植物愈伤组织。

上述任一所述的方法中，“导入植物愈伤组织”可经过侵染、共培养、筛选步骤，得到编辑后的植物愈伤组织。其中在共培养步骤用SCR7处理植物愈伤组织。

上述任一所述的方法中，所述导入受体的过程中，可用SCR7处理受体。所述SCR7处理受体的方式可为：将共培养22±2h的受体置于含SCR7的液相中，28±2℃悬浮培养20±2h。所述液相可为含100-300mg/L(如100-200mg/L、200-300mg/L、100mg/L、200mg/L或300mg/L)特美汀的N6液体培养基。

上述任一所述提高碱基编辑系统编辑效率的方法中，所述SCR7的浓度可为40-80μM(如40-60μM、60-80μM、40μM、60μM或80μM)。

上述任一所述扩大碱基编辑系统突变窗口范围的方法中，所述SCR7的浓度可为40-100μM(如40-60μM、60-80μM、80-100μM、40μM、60μM、80μM或100μM)。

上述任一所述的方法中，所述抗潮霉素蛋白可为潮霉素磷酸转移酶。潮霉素磷酸转移酶的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第10786至11811位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述潮霉素磷酸转移酶的基因可如序列表中序列1自5’末端起第10786至11811位所示。

上述任一所述的方法中，所述Cas9蛋白可为SpCas9n蛋白。SpCas9n蛋白的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第3010至7278位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述SpCas9n蛋白的基因可如序列表中序列1自5’末端起第3010至7278位所示。

上述任一所述的方法中，所述胞嘧啶脱氨酶可为PmCDA1。PmCDA1的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第7570至8193位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述PmCDA1的基因可如序列表中序列1自5’末端起第7570至8193位所示。

上述任一所述的方法中，所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的氨基酸序列可由序列表中序列1自5’末端起第8215至8511位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的基因可如序列表中序列1自5’末端起第8215至8511位所示。

上述任一所述的方法中，所述sgRNA可根据受体基因组中预期进行碱基编辑的靶基因设计。

上述任一所述的方法中，所述植物可为a1)或a2)或a3)：a1)禾本科植物；a2)水稻；a3)水稻品种日本晴。

本发明还保护X1)或X2)或X3)。

X1)SCR7在提高碱基编辑系统编辑效率中的应用。

X3)SCR7在扩大碱基编辑系统突变窗口范围中的应用。

X3)SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用。

上述任一所述编辑可为C→T碱基替换。

上述任一所述编辑效率可为C→T碱基替换效率。

上述任一所述突变窗口可为C→T突变窗口。

在本发明的一个实施例中，本发明的发明人构建了载体SpCas9n&PmCDA1&UGI。载体SpCas9n&PmCDA1&UGI中的sgRNA根据表1的两个靶点设计。载体SpCas9n&PmCDA1&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列1中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第647至723位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第744至819位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第724至743位为CS651的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至7278位为SpCas9n蛋白的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7570至8193位为PmCDA1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8215至8511位为UGI的核苷酸序列，第8518至8712位为35S终止子的核苷酸序列，第8787至10779位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10786至11811位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11812至12064位为Nos终止子的核苷酸序列。将载体SpCas9n&PmCDA1&UGI导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，然后制备农杆菌侵染液；将水稻品种日本晴的愈伤置于含乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中浸泡，21℃暗培养1天，然后置于含SCR7和200mg/L特美汀的N6液体培养基，28℃悬浮培养20h，最后置于恢复培养基(如含100-300mg/L特美汀的N6固体培养基)上，25-28℃暗培养2天；最后筛选，得到抗性愈伤；统计阳性抗性愈伤中的C→T碱基替换效率和C→T突变窗口。与未经SCR7处理相比，含40-80μM SCR7和200mg/L特美汀的N6液体培养基对两个靶点的C→T碱基替换效率显著增加；含40-100μM SCR7和200mg/L特美汀的N6液体培养基对两个靶点的C→T突变窗口范围均显著拓展，即更多位置的C发生了替换。

上文中，扩大碱基编辑系统突变窗口范围具体可为碱基编辑系统编辑窗口的范围扩大，即更多位置的C替换成T。

由此可见，SCR7可以提高碱基编辑系统编辑效率和扩大碱基编辑系统突变窗口范围，进而获得含有更多突变位点的突变体。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度SCR7处理愈伤后SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的C→T碱基替换效率的部分实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例选择表1中第2列所示的两个靶点进行实验，靶点序列见表1中第3列，对应的靶基因见表1中第1列。

表1

靶基因	靶点名称	靶点序列
			OsCDC48	CS651	gaccagccagcgtctggcgc
OsNRT1.1B	CS652	cggcgacggcgagcaagtgg

引物对651由引物CS651-F：5’-acatcgagatggagaagcgg-3’和引物CS651-R：5’-ccatgctccaatcgatgaatac-3’组成，用于扩增CS651。

引物对652由引物CS652-F：5’-ttacgaactttataactttgtcgg-3’和引物CS652-R：5’-atggaggcgatgaggaagac-3’组成，用于扩增CS652。

实施例1、不同浓度SCR7处理对SpCas9n(D10A)&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的影响

一、基因编辑载体的构建

本发明的发明人构建了载体SpCas9n&PmCDA1&UGI。

载体SpCas9n&PmCDA1&UGI(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列1中，自5’至3’起，第131至467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第647至723位和第820至896位均为pre-tRNA的核苷酸序列，第744至819位和第917至992位均为sgRNA骨架的核苷酸序列，第724至743位为CS651的核苷酸序列，第897至916位为CS652的核苷酸序列，第993至1283位为OsU3终止子的核苷酸序列，第1290至3003位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3010至7278位为SpCas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7570至8193位为PmCDA1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8215至8511位为UGI的核苷酸序列，第8518至8712位为35S终止子的核苷酸序列，第8787至10779位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第10786至11811位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第11812至12064位为Nos终止子的核苷酸序列。

二、在愈伤中进行基因编辑

1、将载体SpCas9n&PmCDA1&UGI导入农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#为AC1030)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种至含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基，28℃、150rpm震荡培养，得到OD_600nm为1.0-2.0的培养菌液；取所述培养菌液，室温、10000rpm离心1min，收集菌体；取所述菌体，用侵染液重悬并稀释至OD_600nm为0.2，得到农杆菌侵染液。

侵染液为将N6液体培养基中的糖分替换为葡萄糖和蔗糖得到；侵染液中，葡萄糖的浓度为10g/L，蔗糖的浓度为20g/L。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到愈伤。

4、完成步骤3后，将愈伤置于含100μM乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中浸泡10min，然后先置于铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200mL侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的愈伤，置于液体悬浮培养基(含40μM SCR7的液体悬浮培养基、含80μM SCR7的液体悬浮培养基、含100μM SCR7的液体悬浮培养基或对照液体悬浮培养基)，28℃悬浮培养20h；然后收集愈伤置于恢复培养基(含200mg/L特美汀的N6固体培养基)上，25-28℃暗培养2天。

SCR7母液：用DMSO溶解SCR7获得，浓度为16.7mg/L。

基础液体悬浮培养基：含200mg/L特美汀的N6液体培养基。

含40μM SCR7的液体悬浮培养基为向1L基础液体悬浮培养基中加入0.8mLSCR7母液得到。

含80μM SCR7的液体悬浮培养基为向1L基础液体悬浮培养基中加入1.6mLSCR7母液得到。

含100μM SCR7的液体悬浮培养基为向1L基础液体悬浮培养基中加入2.0mLSCR7母液得到。

对照液体悬浮培养基为向1L基础液体悬浮培养基中加入2mL DMSO得到。

6、取步骤5得到的愈伤，置于筛选培养基(含50mg/L潮霉素的N6固体培养基)，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的愈伤，再次置于筛选培养基(含50mg/L潮霉素的N6固体培养基)，28℃暗培养2周，得到抗性愈伤。

8、分别提取抗性愈伤的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物R(5’-gatgaagagcttatcgacgt-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约1150bp的DNA片段，则相应的抗性愈伤为阳性抗性愈伤；如果PCR扩增产物中不含有约1150bp的DNA片段，则相应的抗性愈伤不为阳性抗性愈伤。

9、分别以步骤8获得的15块阳性抗性愈伤的基因组DNA作为模板，采用引物对651或引物对652进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

10、将步骤9得到的PCR扩增产物进行Sanger测序，然后分析。

分别统计不同浓度SCR7处理后CS651和CS652的C→T碱基替换效率。C→T碱基替换效率＝发生C→T碱基替换的阳性抗性愈伤块数/15×100％。统计结果见图1(SCR7-0mL为对照液体悬浮培养基，SCR7-0.8mL为含40μM SCR7的液体悬浮培养基，SCR7-1.6mL为含80μMSCR7的液体悬浮培养基，SCR7-2.0mL为含100μM SCR7的液体悬浮培养基)。结果表明，与对照(不经SCR7处理)相比，含40μM SCR7的液体悬浮培养基和含80μM SCR7的液体悬浮培养基对CS651和CS652的C→T碱基替换效率均显著提高。

分别统计不同浓度SCR7处理后的CS651和CS652的C→T突变窗口。结果见表2。结果表明，未经SCR7处理的CS651和CS652的C→T突变窗口均为靶点5’端的1-5bp；含40μM SCR7的液体悬浮培养基、含80μM SCR7的液体悬浮培养基和含100μM SCR7的液体悬浮培养基处理的CS651和CS652的C→T突变窗口范围均显著扩展，更多位置的C发生了替换，核苷酸替换多样性大大增加，以CS652靶点为例，扩展到靶点5’端的1-14bp。

表2

注：SCR7-0mL为对照液体悬浮培养基，SCR7-0.8mL为含40μM SCR7的液体悬浮培养基，SCR7-1.6mL为含80μM SCR7的液体悬浮培养基，SCR7-2.0mL为含100μM SCR7的液体悬浮培养基，第一排数字表示靶点各碱基对应的位置，其余数字表示对应的单位点C发生C→T碱基替换的阳性抗性愈伤块数占发生C→T碱基替换的总的阳性抗性愈伤块数的百分比。

<110> 北京市农林科学院

<120> SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18476

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

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gctgaggatg ccaaacttca gttgtctaag gatacctatg atgacgatct tgacaatttg 3960

ctggcacaaa ttggcgacca gtacgcggat ctgttcctcg cagcgaagaa tctgagtgat 4020

gctattctcc tttcggacat actcagggtt aacactgaga tcacaaaagc acctttgagt 4080

gcgtcgatga ttaagcgcta tgatgaacat caccaagacc tcactttgct gaaggccctt 4140

gtgcggcagc aattgccaga gaagtacaaa gaaatcttct ttgaccaatc taagaacgga 4200

tacgctggct atattgatgg aggagcttct caggaggaat tctataagtt tatcaaacct 4260

atacttgaga agatggatgg tacagaggaa ctccttgtta aattgaacag agaagatttg 4320

ctgcgcaagc aacggacctt tgacaacgga tcaattccgc atcagataca cctcggcgag 4380

cttcatgcca tccttcgccg gcaggaagat ttctacccct ttttgaagga caaccgcgag 4440

aagatagaaa aaatccttac gttccggatt ccttactatg tgggtccatt ggcaaggggg 4500

aattcccgct ttgcgtggat gactcggaaa agcgaggaaa ctatcacacc gtggaacttc 4560

gaggaagttg tggacaaggg agcttctgcc caatcattca ttgagaggat gactaacttc 4620

gataagaacc tgccgaacga gaaagttctc cccaagcact ccctccttta cgagtatttc 4680

accgtgtata acgaacttac gaaggttaaa tacgtgactg agggtatgag gaagccagca 4740

ttcttgagcg gggaacaaaa gaaagcgatt gttgatttgc tgtttaaaac taatcgcaag 4800

gtgacagtca agcagctcaa agaggattat ttcaagaaaa ttgaatgttt cgactctgtg 4860

gagatatcag gagtcgaaga taggtttaac gcttcccttg gcacatacca tgacctcctt 4920

aagatcatta aggacaaaga tttcctggat aacgaggaaa atgaggacat cctcgaagat 4980

attgttctta ccttgacgct gtttgaggat cgcgaaatga tcgaggaacg gcttaagacg 5040

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tggggccgtc tgtctagaaa gctcatcaac ggaatacgtg ataaacaaag tggcaagaca 5160

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gagcggatga aaaggattga ggaaggaatc aaggaactgg gctcacagat tctcaaagag 5520

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atgaacacga agtacgacga gaatgataaa ctgatacgtg aagtcaaggt tatcactctt 6000

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gagttgcaga aagggaacga gttggctctg ccttctaagt atgttaactt cctctatctt 6840

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gagctgaagc gcaggggaga gcgccgcgcc tgcttctggg gctacgcggt gaataagccg 7740

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tacctccgcg acaacccagg ccagttcacg atcaattggt actccagctg gtccccttgc 7860

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cgcgcctggt ggatcgtccg cctaggctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc 8820

tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca 8880

cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa 8940

taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag 9000

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tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat 9120

ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt 9180

ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt 9240

agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa 9300

acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat 9360

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cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc 9480

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tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata 10080

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gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg 10200

gtggatttat taattttgga tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg 10260

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tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta 10440

attttggaac tgtatgtgtg tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga 10500

aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat 10560

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agtatgtttt ataattattt tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta 10680

tatgtggatt tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt 10740

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tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg 10980

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agcctgacct attgcatctc ccgccgttca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa 11100

accgaactgc ccgctgttct acaaccggtc gcggaggcta tggatgcgat cgctgcggcc 11160

gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact 11220

acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg 11280

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caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag 11520

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cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc 13320

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agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat 14400

gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa 14460

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gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta 15300

catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga 15360

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ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg 16020

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cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc 16320

agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 16380

gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 16440

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 16500

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 16560

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 16620

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 16680

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 16740

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 16800

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 16860

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atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 16980

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aaactcacgt taagggattt tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa 17280

aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa aaaatagctc 17340

gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg caatgtcata 17400

ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag ccacttactt tgccatcttt 17460

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gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga 17760

gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa 17820

gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt ccttttcccg 17880

ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc 17940

attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca 18000

gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag ccatttatta 18060

tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg 18120

aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca 18180

aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg 18240

tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 18300

atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 18360

gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc 18420

ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggct 18476

Claims (3)

1.扩大碱基编辑系统突变窗口范围的方法，所述方法包括如下步骤：使受体表达sgRNA、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑；所述使受体表达sgRNA、Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂通过将所述sgRNA的编码基因、所述Cas9蛋白的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶编码基因和所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的编码基因导入受体实现；

所述Cas9蛋白为SpCas9n蛋白；所述SpCas9n蛋白的氨基酸序列由序列表中序列1自5’末端起第3010至7278位所示的核苷酸序列翻译而成；

所述胞嘧啶脱氨酶为PmCDA1；所述PmCDA1的氨基酸序列由序列表中序列1自5’末端起第7570至8193位所示的核苷酸序列翻译而成；

所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂的氨基酸序列由序列表中序列1自5’末端起第8215至8511位所示的核苷酸序列翻译而成；

所述受体为植物愈伤组织；

所述导入受体的过程中，用SCR7处理受体；所述SCR7的浓度为40-100μM；

所述突变窗口为C→T突变窗口。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SCR7处理受体的方式为：将共培养22±2h的受体置于含SCR7的液相中，28±2℃悬浮培养20±2h。

3.SCR7在扩大SpCas9n&PmCDA1&UGI碱基编辑系统突变窗口范围中的应用；

所述SpCas9n&PmCDA1&UGI碱基编辑系统包含载体SpCas9n&PmCDA1&UGI；所述载体SpCas9n&PmCDA1&UGI的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述突变窗口为C→T突变窗口。

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