CN110878322B - 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统。本发明提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，包括第一表达载体和第二表达载体；所述第一表达载体包括Lambda‑Red重组系统蛋白表达元件和Cas9蛋白表达元件，所述Cas9蛋白表达元件包括第一启动子元件和Cas9蛋白框架元件；所述第二表达载体包括sgRNA表达元件，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。本发明提供了一种新的用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，本发明的双质粒系统能够高效且快速地无痕敲除肺炎克雷伯菌染色体上的基因，高效且快速地在肺炎克雷伯菌染色体上进行基因插入。

Description

一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统。

背景技术

肺炎克雷伯菌是一种非常重要的革兰氏阴性人类病原细菌。它能够引起一系列的社区和医院获得性感染，例如重症肺炎、细菌性肝脓肿、泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。肺炎克雷伯菌强大的感染和致病能力主要归因于两个方面。一方面，还有一些肺炎克雷伯菌株具有高毒力和高粘液质表型，可以分泌多种杀伤人体细胞的毒力物质，并且高粘液质还有助于细胞定植和形成生物膜等；另一方面，一些肺炎克雷伯菌株在进化过程中逐渐获得了对包括碳青霉烯类抗生素在内的多种抗生素的抵抗能力，其感染人体后很难找到有效的治疗药物。近年来，随着同时具有碳青霉烯类抗生素抗性和高毒力的肺炎克雷伯菌株的出现，肺炎克雷伯菌感染的治疗变得越发困难。碳青霉烯类抗生素曾被视为应对革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线，寻找新型药物靶标和开发新型抑菌药物迫在眉睫。

新型药物靶标的寻找离不开基因组层面的功能基因筛选和后续的基因功能确认。肺炎克雷伯菌中用于功能基因筛选的技术主要为基于自杀质粒系统的基因敲除方法。这种方法虽然能够在基因组层面实现基因功能的筛选，但筛选过程十分繁琐，需要耗费大量的人力物力。该方法需进行两轮DNA重组交换，分别为同源重组单交换和同源重组双交换，存在耗时长且效率不高等问题，极大地阻碍了肺炎克雷伯菌基因功能研究的进度，因此迫切需要在肺炎克雷伯菌中开发一种高效的基因组编辑系统。

CRISPR-Cas9系统是一种近年来开发的新型基因组编辑系统，具有强大的基因组DNA 切割和编辑能力。该系统最初来源于部分细菌和古生菌的免疫系统，是微生物对抗外源核酸和噬菌体入侵的一种主动防御手段。目前广泛使用的CRISPR-Cas9系统由一种核酸内切酶 Cas9和一种小引导RNA(sgRNA)两部分组成。Cas9核酸内切酶能够与sgRNA结合，通过 sgRNA的5’端的20bp spacer序列与基因组DNA碱基互补配对识别靶向基因，并在特点位点处切割基因组DNA，造成DNA双链断裂。当在含有CRISPR-Cas9系统的细胞中导入来自lambda噬菌体的Red重组系统和人工设计的重组模板时，lambda-Red重组系统能够依靠同源模板，以同源重组的方式快速高效地修复CRISPR-Cas9系统造成的DNA双链断裂，实现靶标基因的定向编辑。

但是，对于CRISPR-Cas9系统的应用还有很大的局限性，需要进一步探索才可以实现高效率的基因组编辑。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，包括第一表达载体和第二表达载体；所述第一表达载体包括Lambda-Red重组系统蛋白表达元件和Cas9蛋白表达元件，所述Cas9蛋白表达元件包括第一启动子元件和Cas9 蛋白框架元件，所述第一启动子元件的序列如SEQ ID NO.32所示，所述Cas9蛋白框架元件的序列如SEQ ID NO.33所示；所述第二表达载体包括sgRNA表达元件，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件，所述第二启动子元件的序列如 SEQ ID NO.30所示，所述sgRNA框架元件的序列如SEQ ID NO.31所示。

在本发明一些实施方式中，所述Lambda-Red重组系统蛋白表达元件包括gam表达元件、 bet表达元件和exo表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述Cas9蛋白表达元件自5’端至3’端依次包括第二启动子元件和Cas9蛋白框架。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体还包括温敏蛋白基因表达元件，优选为 repA101ts表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体还包括第一抗性基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为aprR表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体还包括阻遏蛋白基因表达元件，所述阻遏蛋白基因表达元件包括阻遏蛋白基因启动子表达元件和阻遏蛋白基因框架元件，所述遏蛋白基因启动子表达元件选自ParaC表达元件，所述阻遏蛋白基因框架元件选自araC表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体还包括质粒复制子，所述复制子优选为温度敏感型复制子，更优选为oriR01。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体由pREDIA质粒构建获得。

在本发明一些实施方式中，所述第一表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明一些实施方式中，所述sgRNA表达元件自5’端至3’端依次包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。

在本发明一些实施方式中，所述多克隆位点可以包括一个或多个BsaI酶切位点。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括第二抗性基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为kmR表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括毒性蛋白基因表达元件，优选为肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因表达元件，更优选为sacB表达元件。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体还包括质粒复制子，所述质粒复制子优选为rep (pMB)。

在本发明一些实施方式中，所述第二表达载体由pUC质粒构建获得，优选为pUC57质粒，更优选为pUC57-kan质粒。

在本发明一些实施方式中，所述第二表达载体的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明另一方面提供一种工程菌，包括所述的双质粒系统。

在本发明一些实施方式中，保藏号为CCTCC M 2018528和CCTCC M 2018530的菌株的组合。

本发明另一方面提供所述的双质粒系统、或所述的工程菌在肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途。

本发明另一方面提供一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括所述的双质粒系统。

本发明另一方面提供一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将所述的双质粒系统中的第二表达载体的多克隆位点插入spacer序列，所得质粒转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。

附图说明

图1显示为本发明双质粒系统结构示意图。

图2显示为本发明双质粒系统在肺炎克雷伯菌中实现高效碱基编辑示意图。

具体实施方式

本发明发明人经过大量研究，通过分子生物学操作，将现有的CRISPR-Cas9系统改造为能够适用于肺炎克雷伯菌的基因组编辑系统，将极大简化肺炎克雷伯菌的遗传学操作，加快功能基因的筛选速率，为后续基因功能的生物学研究，药物靶标的的寻找和新型药物的开发打下基础，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，所述表达载体通常用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)基因编辑，所述表达载体包括第一表达载体和第二表达载体；所述第一表达载体包括Lambda-Red重组系统蛋白表达元件和Cas9蛋白表达元件，所述Cas9蛋白表达元件包括第一启动子元件和Cas9蛋白框架元件；所述第二表达载体包括sgRNA表达元件，所述sgRNA表达元件包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体中的Cas9蛋白表达元件自5’端至3’端可以依次包括第二启动子元件和Cas9蛋白框架。在本发明一优选实施方式中，所述第一启动子元件的序列如SEQ ID NO.32所示，所述Cas9蛋白框架元件的序列如SEQ IDNO.33所示。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体是由pREDIA质粒构建获得。本发明所提供的表达载体中，包含了pREDIA质粒系统中至少部分的片段。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体中的Lambda-Red重组系统蛋白表达元件包括gam表达元件、bet表达元件和exo表达元件，还可以包括red重组系统蛋白基因启动子表达元件，自5’端至3’端可以依次包括red重组系统蛋白基因启动子表达元件、gam表达元件、bet表达元件和exo表达元件。在本发明一优选实施方式中，启动子表达元件、gam 表达元件、bet表达元件和exo表达元件的序列详见GenBank登录号MH587687。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体中还可以包括温敏蛋白基因表达元件，所述温敏蛋白基因表达元件通常用于辅助质粒复制子，从而形成温度敏感型复制子，以通过温度变化对完成基因组编辑功能后的质粒进行消除，所述温敏蛋白基因表达元件通常与复制子相配合。在本发明一优选实施方式中，所述温敏蛋白基因表达元件为repA101ts表达元件，其序列详见GenBank登录号MH587687。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体还可以包括复制子，所述复制子通常可以与温敏蛋白基因表达元件相配合，从而形成温度敏感型复制子，以通过温度变化对菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述复制子优选为温度敏感型复制子，更优选为 oriR01，其序列详见GenBank登录号MH587687。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体中还可以包括第一抗性基因表达元件，所述抗性基因表达元件主要用于表达肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因，从而可以使肺炎克雷伯菌株在含有抗性基因的培养条件下培养，以对肺炎克雷伯菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述抗性基因表达元件为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为 aprR表达元件，其序列详见GenBank登录号MH587687。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第一表达载体中还可以包括阻遏蛋白基因表达元件，所述阻遏蛋白基因表达元件主要用于表达阻遏蛋白，从而实现在含有阿拉伯糖的诱导条件下， Lambda-Red重组系统蛋白的短暂表达。所述阻遏蛋白基因表达元件可以包括阻遏蛋白基因启动子表达元件和阻遏蛋白基因框架元件，在本发明一优选实施方式中，所述遏蛋白基因启动子表达元件选自ParaC表达元件，所述阻遏蛋白基因框架元件选自araC表达元件，其序列详见GenBank登录号MH587687。

在本发明一优选实施方式中，所述第一表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第二表达载体中的Cas9蛋白表达元件自5’端至3’端可以依次包括第二启动子元件、多克隆位点和sgRNA框架元件。在本发明一优选实施方式中，所述第二启动子元件的序列如SEQ ID NO.30所示，所述多克隆位点可以包括一个或多个BsaI酶切位点，所述sgRNA框架元件的序列如SEQ ID NO.31所示。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第二表达载体是由pUC质粒构建获得，优选为pUC57 质粒，更优选为pUC57-kan质粒。本发明所提供的表达载体中，包含了所述质粒系统中至少部分的片段。在本发明一优选实施方式中，所述表达载体还包括质粒复制子，所述质粒复制子优选为rep(pMB)，其序列详见GenBank登录号MH587683。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第二表达载体还包括第二抗性基因表达元件，所述第二抗性基因表达元件主要用于表达肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因，从而可以使肺炎克雷伯菌株在含有抗性基因的培养条件下培养，以对肺炎克雷伯菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述第二抗性基因表达元件为肺炎克雷伯菌株敏感的抗性基因表达元件，更优选为kmR表达元件，其序列详见GenBank登录号MH587683。

本发明所提供的双质粒系统中，所述第二表达载体还包括毒性蛋白基因表达元件，所述毒性蛋白基因表达元件主要用于表达肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因，从而可以使肺炎克雷伯菌株在含有毒性蛋白基因的培养条件下难以存活，以对肺炎克雷伯菌株进行筛选。在本发明一优选实施方式中，所述毒性蛋白基因表达元件为肺炎克雷伯菌株敏感毒性蛋白基因表达元件，优选为蔗糖敏感毒性蛋白基因表达元件，更优选为sacB表达元件，其序列详见 GenBank登录号MH587683。

在本发明一优选实施方式中，所述第二表达载体的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第二方面提供一种工程菌，包括如本发明第一方面所提供的双质粒系统。所述工程菌可以是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。在本发明一优选实施方式中，所述工程菌为保藏号为CCTCC M 2018528和CCTCC M 2018530的菌株的组合。

本发明第三方面提供如本发明第一方面所提供的双质粒系统和/或如本发明第二方面所提供的工程菌在肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途，所述用途可以是(无痕)敲除肺炎克雷伯菌染色体上的基因，所述用途还可以是在肺炎克雷伯菌染色体上进行基因插入。

本发明第四方面提供一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括如本发明第一方面所提供的双质粒系统。

本发明第五方面提供一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将如本发明第一方面所提供的第二表达载体的多克隆位点插入spacer序列，将所得质粒与第一表达载体转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。

本发明所提供的肺炎克雷伯菌的构建方法中，转染所得的菌株的培养可以在修复模板存在的条件下进行，从而实现基因的插入和敲除。所述修复模板可以是单链修复膜版，也可以是双链修复模板，修复模板的构建和选择的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。

本发明提供了一种新的用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，本发明的双质粒系统能够高效且快速地无痕敲除肺炎克雷伯菌染色体上的基因，高效且快速地在肺炎克雷伯菌染色体上进行基因插入。所述技术在肺炎克雷伯菌的生理生化研究、药物靶标筛选、抑菌药物开发和感染治疗等方面具有广阔的应用前景。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pREDIA质粒(购自美国addgene公司，货号：51625)；

pCas9质粒(购自美国addgene公司，货号：42876)；

pUC57-sgRNA质粒(购自金唯智生物科技有限公司，全基因合成)；

pCVD422质粒(购自美国addgene公司，货号：11074)；

pET22b-mCherry质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P2922)；

感受态大肠杆菌DH5alpha菌株(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0808S)；

肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株(购自美国ATCC公司，货号：13883)。

含有pCasKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名： Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.08.07，保藏号为：CCTCC M 2018528。

含有pSGKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名： Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.08.07，保藏号为：CCTCC M 2018530。

各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250；阿泊拉霉素购自美国BioVision公司，货号：B1521-1G；卡那霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：K103024-5g。

实施例1

pCasKP质粒构建：

pCasKP质粒的组成如附图1A所示，其序列为：

TCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTG AGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATACTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCC TCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCG TTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTG GTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAA CGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAA TCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTC AAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTC TTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAG ACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATAT CTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCT CTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGT ATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTT GAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACT AATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAG 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CTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATCCTTGAACAAGGAC AATTAACAGTTAACAAATAAAAACGCAAAAGAAAATGCCGATATTGACTACCGGAAGCA GTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGATTCAGGCTGTCTATGTGTGACTGTTGAGCTG TAACAAGTTGTCTCAGGTGTTCAATTTCATGTTCTAGTTGCTTTGTTTTACTGGTTTCACC TGTTCTATTAGGTGTTACATGCTGTTCATCTGTTACATTGTCGATCTGTTCATGGTGAACA GCTTTAAATGCACCAAAAACTCGTAAAAGCTCTGATGTATCTATCTTTTTTACACCGTTTT CATCTGTGCATATAGCTATACTGATTTCGTCAGACTCACAGTCAAACATGCCGGTCAGTT GGCCTGGTGATGGCGGGATCGTTGTATATTTCTTGACACCTTTTCGGCACCGCCCTAAAA TTCTGCGTCCTCATAATATATGAGGCGATTTATTACGTGTTTACGAAGCAAAAGCTAAAAC CAGGAGCTATTTAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGT CGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGG GAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTG GAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCG GAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGA TAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAAC GTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTAT CTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTAT TTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATC CTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATT TGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGAT TGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAAT GGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATT TTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGA TAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTA TCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCC TATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAG CTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAA ACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAA ACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAG ATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGG GTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATC GTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGC GTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACA AACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAG TATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAA CCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAAT CGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATT TGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGA GGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAA AACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATAC TGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAA AACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATC CATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGG CGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATT TTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGA AAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATT CGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTT AAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTC CAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTAT GATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTC TTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTA AGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGT TTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTG GATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTG ATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTG CTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTA TGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAAT ATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGA GATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTC AAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAA ATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTT GATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATC GAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCT TTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGAC TTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGC TGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTG AATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAA CAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATC AGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCAT ATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTA CGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAA ACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGT CTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGATGGCTGGTTGGCGTA CTGTTGTGGTAAATACCCATATGGACAGTTTTCCCTTTGATATGTAACGGTGAACAGTTGT TCTACTTTTGTTTGTTAGTCTTGATGCTTCACTGATAGATACAAGAGCCATAAGAACC (SEQ ID NO：1)

pCasKP质粒的具体构建方法如下：

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株的基因组，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。以 NCTC9633菌株的基因组为模板PCR扩增得到rpsL基因的启动子，具体序列如下：

TAGCTATACTGATTTCGTCAGACTCACAGTCAAACATGCCGGTCAGTTGGCCTGGTG ATGGCGGGATCGTTGTATATTTCTTGACACCTTTTCGGCACCGCCCTAAAATTCTGCGTCC TCATAATATATGAGGCGATTTATTACGTGTTTACGAAGCAAAAGCTAAAACCAGGAGCTA TTTA(SEQ ID NO.32)；

从pCas9质粒中PCR扩增得到Cas9蛋白基因，具体序列如下：

ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCG GTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACA GACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGA GACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGG AAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGAT GATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCA TGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATAT CCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTG CGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGA GGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACA AACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAA AGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCA GCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTT TCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAAT ATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATC CTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGC TACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTT CCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTAT ATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAA AAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGC AAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCT GCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGA GAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGT GGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATG GAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCAT GACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGC TTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGG AATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTAC TCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAA AAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCT TCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATA ATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGA TAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGT GATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATT GATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCA GATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTA AAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACAT ATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAA GTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATT GAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGC GTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAG CATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAA ATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGA TGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGT CTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGT AGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTC AACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGAT AAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGT GGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATT CGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATC TAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGT TTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCA AGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTC AAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAAC TAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGC GCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACA GGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGC TCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAG CTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAA TCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAA TCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCAT TAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGC TAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGA ATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGA ACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCA AATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTT AGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTAT TCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACA ACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATC CATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQ ID NO.33)；使用NdeI限制性内切酶单酶切pREDIA质粒。

用于PCR扩增的引物序列为：

扩增rpsL基因启动子5’引物序列：

5’-ACCGTTTTCATCTGTGCATATAGCTATACTGATTTCGTCAGACTC-3’(SEQ ID NO： 3)

扩增rpsL基因启动子3’引物序列：

5’-TCTTATCCATTAAATAGCTCCTGGTTTTAGCTTTT-3’(SEQ ID NO：4)

扩增Cas9蛋白基因5’引物序列：

5’-GAGCTATTTAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCT-3’(SEQ ID NO：5)

扩增Cas9蛋白基因3’引物序列：

5’-GGAAAACTGTCCATATGGGTATTTACCACAACAGTACG-3’(SEQ ID NO：6)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述两个DNA片段分别进行扩增，反应体系为：32μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimestarBuffer，1.5μl 5’Primer(10μM)，1.5μl 3’Primer(10μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s， 54℃ 30s，72℃ 4min，共28个循环；最后72℃ 10min。

使用NEB公司的NdeI限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer对pREDIA质粒进行单酶切线性化，反应体系为：24μl ddH₂O，20μl pREDIA(50ng/μl)，1μl NdeI-HF，5μl 10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR 产物和酶切产物分别进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)将上述三个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：3μl NdeI线性化的pREDIA 质粒，2μl rpsL基因启动子片段，3μl Cas9蛋白基因片段，2μl 5×In-FusionEnzyme Premix。反应所使用的5×In-Fusion Enzyme Premix购自TKARA公司，货号：638909。反应条件为50℃ 15min；之后4℃ hold。

将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于30℃培养箱倒置培养。培养24-30h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pCasKP质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的pCasKP质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序确认，经测序确认正确的pCasKP质粒用于后续实验。含有正确pCasKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2018528。

该pCasKP质粒的特征在于能够兼容大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，在这两种细菌中都可以复制传代；在于该质粒带有阿泊拉霉素抗性，能够用于肺炎克雷伯菌株筛选；在于该质粒可以在L-arabinose的诱导下，短暂表达能用于重组修复的lambda-Red重组系统蛋白Gam、Bet 和Exo；在于该质粒可以稳定表达Cas9核酸酶蛋白，进行基因组DNA切割；在于具有温度敏感型复制子oriR101，在30℃时可正常复制，在37℃时不能复制，能够根据温度差异在肺炎克雷伯菌株中完成质粒的消除。

实施例2

pSGKP质粒构建：

pSGKP质粒的组成如附图1B所示，其序列为：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG GTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAG CGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTG AGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCAT CAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGACGCGTAT TGGGATGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATACGGCATCAGAGCAGAT TGTACTGAGAGTGCACCATAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTGTTAACTGTTAATT GTCCTTGTTCAAGGATGCTGTCTTTGACAACAGATGTTTTCTTGCCTTTGATGTTCAGCAGGAAGCTAGGCGCAAACGTTGATTGTTTGTCTGCGTAGAATCCTCTGTTTGTCATATAGC TTGTAATCACGACATTGTTTCCTTTCGCTTGAGGTACAGCGAAGTGTGAGTAAGTAAAG GTTACATCGTTAGGATCAAGATCCATTTTTAACACAAGGCCAGTTTTGTTCAGCGGCTTG TATGGGCCAGTTAAAGAATTAGAAACATAACCAAGCATGTAAATATCGTTAGACGTAATG CCGTCAATCGTCATTTTTGATCCGCGGGAGTCAGTGAACAGATACCATTTGCCGTTCATTTTAAAGACGTTCGCGCGTTCAATTTCATCTGTTACTGTGTTAGATGCAATCAGCGGTTTCA TCACTTTTTTCAGTGTGTAATCATCGTTTAGCTCAATCATACCGAGAGCGCCGTTTGCTAA CTCAGCCGTGCGTTTTTTATCGCTTTGCAGAAGTTTTTGACTTTCTTGACGGAAGAATGA TGTGCTTTTGCCATAGTATGCTTTGTTAAATAAAGATTCTTCGCCTTGGTAGCCATCTTCA GTTCCAGTGTTTGCTTCAAATACTAAGTATTTGTGGCCTTTATCTTCTACGTAGTGAGGAT CTCTCAGCGTATGGTTGTCGCCTGAGCTGTAGTTGCCTTCATCGATGAACTGCTGTACAT TTTGATACGTTTTTCCGTCACCGTCAAAGATTGATTTATAATCCTCTACACCGTTGATGTT CAAAGAGCTGTCTGATGCTGATACGTTAACTTGTGCAGTTGTCAGTGTTTGTTTGCCGTA ATGTTTACCGGAGAAATCAGTGTAGAATAAACGGATTTTTCCGTCAGATGTAAATGTGGC TGAACCTGACCATTCTTGTGTTTGGTCTTTTAGGATAGAATCATTTGCATCGAATTTGTCG CTGTCTTTAAAGACGCGGCCAGCGTTTTTCCAGCTGTCAATAGAAGTTTCGCCGACTTTT TGATAGAACATGTAAATCGATGTGTCATCCGCATTTTTAGGATCTCCGGCTAATGCAAAG ACGATGTGGTAGCCGTGATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCGTTTTGTAATGGCCAGCT GTCCCAAACGTCCAGGCCTTTTGCAGAAGAGATATTTTTAATTGTGGACGAATCGAACTC AGGAACTTGATATTTTTCATTTTTTTGCTGTTCAGGGATTTGCAGCATATCATGGCGTGTA ATATGGGAAATGCCGTATGTTTCCTTATATGGCTTTTGGTTCGTTTCTTTCGCAAACGCTT GAGTTGCGCCTCCTGCCAGCAGTGCGGTAGTAAAGGTTAATACTGTTGCTTGTTTTGCAA ACTTTTTGATGTTCATCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGGTCTGCTTCTT CCAGCCCTCCTGTTTGAAGATGGCAAGTTAGTTACGCACAATAAAAAAAGACCTAAAAT ATGTAAGGGGTGACGCCAAAGTATACACTTTGCCCTTTACACATTTTAGGTCTTGCCTGC TTTATCAGTAACAAACCCGCGCGATTTACTTTTCGACCTCATTCTATTAGACTCTCGTTTG GATTGCAACTGGTCTATTTTCCTCTTTTGTTTGATAGAAAATCATAAAAGGATTTGCAGAC TACGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTATCTGTTTCTTTTCATTCTCTGTATTTTTTATAGTT TCTGTTGCATGGGCATAAAGTTGCAAGCTTGATATCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGT ATAATACTAGTCGAGACCATTGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCAT CCCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCTCGAGCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT TATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGG TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGG CTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGG GGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAA AAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA ATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTC AGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCC CGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTT ATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTG CTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGT ATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGG CAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGG AACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGG TCTGACAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGA TTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGG CAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCA ATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGA GTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCA ACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATT CGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAAC AGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTG AATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCAGGGATCGCAGTGGTGAGTA ACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCG TCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATG TTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGA TTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTT AATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAAT ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAG AAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTA AGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGT C(SEQ ID NO：2)

pCasKP质粒的具体构建方法如下：

(1)在金唯智生物科技有限公司全基因合成sgRNA基因，并克隆到该公司载体库中pUC57-Kan质粒的EcoRV位点处，获得pUC57-sgRNA质粒。pUC57-Kan质粒原始序列参见金唯智生物技术有限公司网站。合成的sgRNA基因序列如下：

其中加粗的部分为J23119启动子序列，具体如下：

TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGT(SEQ ID NO：30)；

添加单下划线的部分为两个BsaI酶切位点；

添加双下划线的部分为sgRNA框架序列，具体如下：

(2)从pCVD422质粒中扩增得到sacB蛋白基因；使用HindIII限制性内切酶单酶切pUC57-sgRNA质粒。

用于PCR扩增的引物序列为：

扩增sacB蛋白基因5’引物序列：

5’-TCGACGGTATCGATACGGCATCAGAGCAGATTGTACT-3’(SEQ ID NO：8)

扩增sacB蛋白基因3’引物序列：

5’-GCTGTCAAGATATCAAGCTTGCAACTTTATGCCCATGCAACA-3’(SEQ ID NO：9)

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，反应体系为：32μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×Primestar Buffer，1.5μl 5’Primer (10μM)，1.5μl 3’Primer(10μM)，0.5μl pCVD422质粒模板(20ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s， 56℃ 30s，72℃ 2min，共28个循环；最后72℃ 10min。

使用NEB公司的HindIII限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer对pUC57-sgRNA质粒进行单酶切线性化，反应体系为：34μl ddH₂O，10μl pUC57-sgRNA质粒(100ng/μl)，1μlHindIII-HF， 5μl 10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR 产物和酶切产物分别进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)将上述两个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：4μl HindIII线性化的pUC57-sgRNA质粒，2μl sacB蛋白基因片段，2μl ddH₂O，2μl 5×In-Fusion EnzymePremix。反应所使用的5×In-Fusion Enzyme Premix购自TKARA公司，货号：638909。反应条件为50℃ 15min；之后4℃ hold。

将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pSGKP质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的pSGKP质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序确认，经测序确认正确的pSGKP质粒用于后续实验。含有正确pSGKP质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2018530。

该pSGKP质粒的特征在于能够兼容大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，在这两种细菌中都可以复制传代；在于该质粒带有卡那霉素抗性，能够用于肺炎克雷伯菌株筛选；在于含有两个BsaI 酶切位点，能够用来插入spacer片段；在于含有sacB蔗糖敏感基因，不能在含有5％蔗糖的 LB培养基中存活，能够在在肺炎克雷伯菌株中完成质粒的消除。

实施例3

双质粒系统pCasKP/pSGKP实现肺炎克雷伯菌中高效基因敲除：

使用双质粒系统pCasKP/pSGKP可以在肺炎克雷伯菌中实现对不同基因的高效敲除。实验中选取dhaK基因为例，在肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株中进行基因敲除实验。附图2A为采用双质粒系统pCasKP/pSGKP在肺炎克雷伯菌中进行基因敲除的示意图，并附有dhaK基因敲除的PCR验证和DNA测序结果。

(1)先在目标基因上选定某一NGG(N为任意碱基)序列前面20个碱基的DNA片段(20个碱基被称为spacer，NGG不包含在其中)。该步骤的基本要求：为使spacer片段能插入到pBECKP质粒中，需使用以下模板设计引物：

5’-tagtNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcaaa-5’

在本实验中，选定的dhaK基因的spacer序列为：5’-CGGTACGCTGTTCGTCCATA-3’(SEQ ID NO：10)，具体设计的引物序列如下：

dhaK-spacer-F：tagtCGGTACGCTGTTCGTCCATA(SEQ ID NO：11)

dhaK-spacer-R：aaacTATGGACGAACAGCGTACCG(SEQ ID NO：12)

在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例五的步骤将dhaK_spacer 插入到实施例二得到的pSGKP质粒中，得到pSGKP-dhaK质粒。得到的pSGKP-dhaK质粒质粒送到金唯智生物科技有限公司测序，测序确认正确的质粒用于后续实验。

(2)在dhaK_spacer序列的上下游各选择45bp DNA序列，选择的45bp DNA序列距离dhaK_spacer的距离视所需要敲除的DNA长度而定。本实验所选择的dhaK_spacer上游序列为：

5’-TTGGTAAAGGCATGCTGACCGCCGCGGTTTGTGGCGATCTGTTCG-3’(SEQ ID NO：13)；

下游序列为：

5’-ACCATCGCCACGCAAAACAGTGCGGACATCGTCAACCTGATGGTG-3’(SEQ ID NO：14)。

将上下游各45bp序列合并成一条90nt的DNA单链序列，将其命名为dhaK-ssDNA，并在金唯智生物科技有限公司进行合成。本实验合成的dhaK-ssDNA序列为：

5’-TTGGTAAAGGCATGCTGACCGCCGCGGTTTGTGGCGATCTGTTCGACCATCGCCA CGCAAAACAGTGCGGACATCGTCAACCTGATGGTG-3’(SEQ ID NO：15)

(3)取不低于200ng的pSGKP-dhaK质粒和300μl dhaK-ssDNA(总体积不超过5μl)，混匀后加入到实施例七制备的含pCasKP的肺炎克雷伯菌电感受态细胞中，接着按照实施例八的步骤电转化进肺炎克雷伯菌中。随后100μl复苏菌液涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待菌液被吸收后，于30℃培养箱中倒置培养过夜至细菌单克隆菌落长出。

(4)随机挑取一些细菌单克隆菌落，接种到3ml含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增dhaK基因部分。反应体系为：10μl EstaqMastermix(康为世纪公司)，1μl基因组DNA(30-100ng/μl)，0.5μl dhaK-seq-F(10μM)， 0.5μl dhaK-seq-R(10μM)，8μl ddH₂O。PCR循环如下：95℃ 3min；之后95℃ 30s，54℃ 30s， 72℃ 1min，共28个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，每个样品取2μl PCR产物在 1％琼脂糖凝胶中进行电泳。成功进行基因敲除的单克隆菌株，其PCR产物会比原始菌株的 PCR产物短一些，可在电泳图上显示出来，因此可通过琼脂糖凝胶上PCR产物条带的大小初步判断基因是否被成功敲除。然后PCR产物送至金唯智生物技术公司进行DNA测序，进一步确认基因是否被成功敲除。

本步骤的特征在于进行PCR验证的的引物位于dhaK_spacer上下游各45bp序列的外侧，这样无论基因是否敲除成功，都可以获得不得长度的PCR产物条带。本实验使用的dhaK基因敲除验证引物序列分别为：

dhaK-seq-F：5’-CCGACCATTATTATCGCTGAC-3’(SEQ ID NO：16)

dhaK-seq-R：5’-CGCTGTTGAGATAGGACGCT-3’(SEQ ID NO：17)

其中dhaK-seq-F还作为测序引物。

实验结果显示，本实验随机挑取的20个单菌落中，全部成功敲除了dhaK基因。

(5)对已经确认基因敲除的成功的肺炎克雷伯菌株，若还将进行新一轮的基因组编辑，则可按照实施例九的操作步骤只消除pSGKP质粒而保留pCasKP质粒；若不再进行新一轮的基因组编辑，则可按照实施例十的操作步骤将pCasKP质粒和pSGKP质粒全部消除。

实施例4

双质粒系统pCasKP/pSGKP实现肺炎克雷伯菌中高效基因插入：

使用双质粒系统pCasKP/pSGKP可以在肺炎克雷伯菌中实现对不同基因的高效插入。实验选取fosA基因作为插入位点，以红色荧光蛋白基因mcherry作为插入基因，在肺炎克雷伯菌NCTC9633菌株中进行基因插入实验。附图2B为采用双质粒系统pCasKP/pSGKP在肺炎克雷伯菌中进行基因插入的示意图，并附有将mcherry基因插入fosA基因位点的PCR验证和DNA测序结果。

(1)在fosA基因上选取一个spacer序列，并按照实施例三步骤(1)的要求设计相应的两条spacer引物。本实验选择的fosA基因spacer序列为： 5’-CAGCCAGCTGGCGCCGAGCG-3’(SEQ ID NO：18)，具体设计的引物序列如下：

dhaK-spacer-F：5’-tagtCAGCCAGCTGGCGCCGAGCG-3’(SEQ ID NO：19)

dhaK-spacer-R：5’-aaacCGCTCGGCGCCAGCTGGCTG-3’(SEQ ID NO：20)

在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并按照实施例五的步骤将fosA_spacer 插入到实施例二得到的pSGKP质粒中，得到pSGKP-fosA质粒。

(2)在fosA插入位点的左右两侧各选择45bp DNA序列，用作同源重组模板。本实验所选择的fosA_spacer同源模板左侧序列为：

5’-ATGGCTGCGCCAGTTCATTGTGAATTCACTGGAGGAACAGACATG-3’(SEQ ID NO：21)；

右侧序列为：

5’-TGAAGCTGATTTGCGGACGCGAGGTAACCCGTCGCCCCGGTAAGC-3’(SEQ ID NO：22)。

本实验所设计用于扩增mcherry基因的左侧序列为：5’ -GTGAGCAAGGGCGAGGAGGA-3’(SEQ ID NO：23)，右侧序列为5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO：24)。为了将fosA基因的同源模板序列连接到mcherry基因的两侧，在实验设计时，具体的引物序列分别为：

fosA-mcherry-F：

5’-ATGGCTGCGCCAGTTCATTGTGAATTCACTGGAGGAACAGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGA-3’(SEQ ID NO：25)

fosA-mcherry-R：

5’-GCTTACCGGGGCGACGGGTTACCTCGCGTCCGCAAATCAGCTTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO：26)

以上两条引物在金唯智生物科技有限公司进行合成。

(3)使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对mcherry基因进行扩增，反应体系为：32μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，1.5μl fosA-mcherry-F(10μM)，1.5μl fosA-mcherry-R(10μM)，0.5μl pET22b-mCherry质粒(20ng/μl)， 0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。循环如下：98℃ 30s；之后98℃10s，54℃ 30s，72℃ 1min，共28个循环；最后72℃ 10min。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR 产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)取不低于200ng的pSGKP-fosA质粒和500ng已纯化的mcherry PCR产物(总体积不超过5μl)，混匀后加入到实施例七制备的含pCasKP的肺炎克雷伯菌电感受态细胞中，接着按照实施例八的步骤电转化进肺炎克雷伯菌中。随后100μl复苏菌液涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待菌液被吸收后，于30℃培养箱中倒置培养过夜至细菌单克隆菌落长出。

(5)随机挑取一些细菌单克隆菌落，接种到3ml含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增dhaK基因部分。反应体系为：10μl EstaqMastermix(康为世纪公司)，1μl基因组DNA(30-100ng/μl)，0.5μl fosA-seq-F(10μM)， 0.5μl fosA-seq-R(10μM)，8μl ddH₂O。PCR循环如下：95℃ 3min；之后95℃ 30s，54℃ 30s， 72℃ 1min，共28个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，每个样品取2μl PCR产物在 1％琼脂糖凝胶中进行电泳。成功进行基因插入的单克隆菌株，其PCR产物会比原始菌株的 PCR产物长一些，可在电泳图上显示出来，因此可通过琼脂糖凝胶上PCR产物条带的大小初步判断是否成功完成基因插入。然后PCR产物送至金唯智生物技术公司进行DNA测序，进一步确认基因插入是否成功。

本步骤的特征在于进行PCR验证的的引物位于fosA同源模板序列的外侧，这样无论基因是否插入成功，都可以获得不得长度的PCR产物条带。本实验使用的mcherry基因插入fosA 位点验证引物序列分别为：

fosA-mcherry-LF：5’-AAGGGTTGAGTCTGGAAACG-3’(SEQ ID NO：27)

fosA-mcherry-LR：5’-GGTGAAGGTGGCAATGGAAT-3’(SEQ ID NO：28)

其中fosA-mcherry-LF以及位于mcherry基因内的mcherry-seq-F引物作为测序引物。 mcherry-seq-F的序列(SEQ ID NO：29)为：5’-ACTACGACGCTGAGGTCAAG-3’。

实验结果显示，本实验随机挑取的10个单菌落中，9个成功在fosA位点处插入了mcherry 基因。

(6)对已经确认基因插入的成功的肺炎克雷伯菌株，若还将进行新一轮的基因组编辑，则可按照实施例九的操作步骤只消除pSGKP质粒而保留pCasKP质粒；若不再进行新一轮的基因组编辑，则可按照实施例十的操作步骤将pCasKP质粒和pSGKP质粒全部消除。

实施例5

将spacer片段插入pSGKP质粒：

为了使pSGKP质粒表达的sgRNA能够定位到基因组的靶位点处，需要将靶位点的spacer 序列插入到sgRNA基因中，其插入方法如下：

(1)首先在目标基因上选定某一NGG(N代表A/T/G/C任意碱基)序列前的20个碱基序列(这20个碱基序列称为spacer，NGG不包含在其中，spacer序列的GC比例控制在 20～80％)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入pSGKP质粒，需要在spacer序列正义链5’端加上tagt接头，同时在spacer序列反义链5’端加上aaac接头。将上述带接头的spacer 正义链和反义链序列在金唯智生物科技有限公司分别合成为两条引物。

(2)将设计合成的两条spacer引物进行磷酸化并以碱基互补配对方式退火成双链DNA，具体反应体系如下：5μl spacer 5’primer(100μM)，5μl spacer 3’primer(100μM),1μl T4 polynucleotide kinase(NEB公司)，5μl 10×T4DNA ligase Buffer(NEB公司)，34μlddH₂O。反应条件如下：37℃温育1h，然后加热到95℃温育3min，再以每10s降温0.5℃的速度缓慢降温到25℃。上述反应过程在PCR仪中进行。反应结束后使用ddH₂O稀释100倍，用于后续反应。

(3)使用NEB公司的BsaI限制性内切酶和10×Cutsmart Buffer将环状的pSGKP质粒切割为线性化质粒，反应体系为：34μl ddH₂O，10μl pSGKP(100ng/μl)，1μl BsaI-HF，5μl10×Cutsmart Buffer。体系配置完成后进行酶切反应，反应条件为：37℃ 1h。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行回收。产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将步骤(2)中获得的双链DNA插入到步骤(3)获得的BsaI线性化pSGKP质粒中，反应体系为：1μl上述100倍稀释的磷酸化双链DNA，1μl上述BsaI线性化的pSGKP 质粒，1μl10×T4DNAligase Buffer(NEB公司)，0.5μl T4DNA ligase(NEB公司)，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。将该反应体系置于16℃连接过夜。

(5)将上述10μl反应产物转化到大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞中，并涂布在含有 50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，待转化液被固体培养基吸收后转置于37℃培养箱倒置培养。培养14-16h后，将固体培养基上长出的转化子菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。抽提的质粒送金唯智生物科技有限公司进行测序，经测序确认插入正确spacer的pSGKP质粒用于后续实验。

实施例6

野生型肺炎克雷伯菌电感受态细胞的制备：

将甘油管保藏的肺炎克雷伯菌菌株在LB固体培养基划线，在恒温培养箱中30℃倒置培养过夜。在LB固体培养基上挑取一个新鲜的单克隆菌落，接种到5ml LB液体培养基中，在 30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天取其中1ml菌液接种到100ml LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速继续振荡培养。当菌液的OD₆₀₀达到约0.7时，将菌液置于冰上冰浴20min。然后在预冷的4℃离心机中以7200g的转速离心5min收集菌体，弃去培养基上清，将离心管底部的菌体沉淀用20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用 0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用 20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清后用500μl预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。将得到的重悬菌液以50μl等份分装到无菌EP管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。

实施例7

含pCasKP质粒的肺炎克雷伯菌电感受态细胞的制备：

挑一个实施例六得到的含pCasKP质粒的肺炎克雷伯菌单克隆菌落接种至5ml含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天取其中1ml菌液接种到100ml含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速继续振荡培养。当菌液的OD₆₀₀达到0.15-0.2时，加入1ml无菌的20％w/v阿拉伯糖溶液，用于诱导lambda-Red重组蛋白表达。继续振荡培养2h后，将菌液置于冰上冰浴20min。然后在预冷的4℃离心机中以7200g的转速离心5min收集菌体，弃去培养基上清，将离心管底部的菌体沉淀用20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。以同样的离心转速离心，弃去上清后用1ml预冷的10％v/v甘油溶液(已用0.22μm滤膜过滤除菌)重悬。将得到的重悬菌液以50μl等份分装到无菌EP管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。

实施例8

将质粒和重组模板电转化进肺炎克雷伯菌电感受态细胞：

取一管实施例六或实施例七制备的肺炎克雷伯菌电感受态细胞，在冰上放置3-5min，待其融化后加入一定量的质粒或质粒和重组模板混合物(总体积不超过5μl)，轻轻混匀。使用移液枪将混匀后的细菌质粒混合物转入预冷的2mm电转杯(Bio_Rad公司)，并在冰上静置 5min。擦净电转杯外壁的冷凝水，在GenePulser Xcell电击仪(Bio_Rad公司)中进行电击。电击参数为：2.5kV，200Ω，25μF，正常的电击时间为4.8-5.3ms之间。电击后立即加入1ml LB培养液洗出电击后的细胞，转入无菌的EP管中，在30℃摇床中以200rpm/min的转速复苏培养1.5h。取100μl复苏液涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基上，待菌液被吸收后，于30℃培养箱中倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌才能在培养基上生长。

实施例9

肺炎克雷伯菌中pSGKP质粒的消除：

完成一轮基因组编辑后，若还需要进行新一轮的基因组编辑，则需要消除掉带有原spacer 的PSGKP质粒，同时保留pCasKP质粒。为达到此目的，可按下列步骤进行操作：

在已经确认基因编辑的成功的肺炎克雷伯菌株中挑取一个单克隆菌落，接种到5ml含有 50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天用无菌接种环沾取菌液在含有50μg/ml阿泊拉霉素和5％w/v蔗糖的LB固体培养基平板上划线，并在30℃恒温培养箱中倒置培养过夜。由于pSGKP质粒上带有蔗糖敏感基因sacB，它表达的分泌型蔗糖果聚糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成有毒的高分子量的果聚糖，造成细胞死亡。只有那些pSGKP质粒被消除，并且仍保留携带阿泊拉霉素抗性基因的pCasKP质粒的细菌才能在含有阿泊拉霉素和蔗糖的培养基上存活下来。

为确认PSGKP质粒的消除和pCasKP质粒的保留，从上述含有阿泊拉霉素和蔗糖的固体平板上随机挑取一些单克隆菌落，分别在仅含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB固体培养基平板，以及含50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上划线。在30℃恒温培养箱倒置培养过夜后，能在仅含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB固体培养基平板上生长，但不能在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上生长的菌落，即为消除了PSGKP质粒且保留了pCasKP质粒的菌落，对其进行培养与保种。

实施例10

肺炎克雷伯菌中pCasKP质粒和pSGKP质粒的同时消除：

已完成所有需要的基因组编辑后，不再需要进行新一轮的基因组编辑，则需要将pCasKP 质粒和pSGKP质粒都消除掉。为达到此此目的，可按下列步骤进行操作：

在已经确认基因编辑的成功的肺炎克雷伯菌株中挑取一个单克隆菌落，接种到5ml不含抗生素的LB液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm/min的转速振荡培养过夜。第二天用无菌接种环沾取菌液在含有5％w/v蔗糖的LB固体培养基平板上划线，并在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。由于pCasKP质粒上含有温度敏感型复制子oriR101，使得该质粒在37℃时无法复制，从而在细菌中消除。由于pSGKP质粒上带有蔗糖敏感基因sacB，它表达的分泌型蔗糖果聚糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成有毒的高分子量的果聚糖，造成细胞死亡。只有那些pCasKP质粒和pSGKP质粒都被消除的细菌，才能在37℃、含有蔗糖的培养基上存活下来。

为确认pCasKP质粒和pSGKP质粒都被消除，从上述37℃、含有蔗糖的固体平板上随机挑取一些单克隆菌落，分别在仅含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB固体培养基平板，仅含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板，以及不含抗生素的LB固体培养基平板上划线。在30℃恒温培养箱倒置培养过夜后，仅能在不含抗生素的LB固体培养基平板上生长的菌落，即为同时消除了pCasKP质粒和pSGKP质粒的菌落，对其进行培养与保种。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

保藏日期：2018年08月07日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏单位地址：中国武汉武汉大学

保藏编号：CCTCC NO：M 2018528

分类命名：Escherichia coli DH5α-pCasKP大肠杆菌DH5α-pCasKP

保藏日期：2018年08月07日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏单位地址：中国武汉武汉大学

保藏编号：CCTCC NO：M 2018530

分类命名：Escherichia coli DH5α-pSGKP大肠杆菌DH5α-pSGKP

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg gttcgttgtt tttgcgtgag 60

ccatgagaac gaaccattga gatcatactt actttgcatg tcactcaaaa attttgcctc 120

aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa agcatcgtgt agtgtttttc ttagtccgtt 180

acgtaggtag gaatctgatg taatggttgt tggtattttg tcaccattca tttttatctg 240

gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct agttcaactt ggaaaatcaa 300

cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac caccaatttc atattgctgt aagtgtttaa 360

atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt ttaaactcat ggtagttatt 420

ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc aaggctaatc tctatatttg ccttgtgagt 480

tttcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc ctcatagagt atttgttttc 540

aaaagactta acatgttcca gattatattt tatgaatttt tttaactgga aaagataagg 600

caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa tttttcgctt gagaacttgg catagtttgt 660

ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg atttccacag ttctcgtcat 720

cagctctctg gttgctttag ctaatacacc ataagcattt tccctactga tgttcatcat 780

ctgagcgtat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct ttccttgtag ggttttcaat 840

cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg gtttcatgct ccgttaagtc 900

atagcgacta atcgctagtt catttgcttt gaaaacaact aattcagaca tacatctcaa 960

ttggtctagg tgattttaat cactatacca attgagatgg gctagtcaat gataattact 1020

agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctggaaaact 1080

tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta 1140

tattcaagtg gttataattt atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga 1200

tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc 1260

gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag accttaaaac cctaaaggct taagtagcac 1320

cctcgcaagc tcggttgcgg ccgcaatcgg gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg 1380

accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct 1440

ctggcagtga atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa 1500

ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg 1560

ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc 1620

tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc 1680

agcggtatca tcaacaggct tacccgtctt actgtcgggg atcgacgctc tcccttatgc 1740

gactcctgca cctttcgtct tcgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata 1800

aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg 1860

agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc 1920

gggcgtattt tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa 1980

aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc 2040

atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctgggtc atccaccgga 2100

tcaattcccc tgctcgcgca ggctgggtgc caagctctcg ggtaacatca aggcccgatc 2160

cttggagccc ttgccctccc gcacgatgat cgtgccgtga tcgaaatcca gatccttgac 2220

ccgcagttgc aaaccctcac tgatccggct cacggtaact gatgccgtat ttgcagtacc 2280

agcgtacggc ccacagaatg atgtcacgct gaaaatgccg gcctttgaat gggttcatgt 2340

gcagctccat cagcaaaagg ggatgataag tttatcacca ccgactattt gcaacagtgc 2400

cgttgatcgt gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg agtgcaatgt cgtgcaatac 2460

gaatggcgaa aagccgagct catcggtcag cttctcaacc ttggggttac ccccggcggt 2520

gtgctgctgg tccacagctc cttccgtagc gtccggcccc tcgaagatgg gccacttgga 2580

ctgatcgagg ccctgcgtgc tgcgctgggt ccgggaggga cgctcgtcat gccctcgtgg 2640

tcaggtctgg acgacgagcc gttcgatcct gccacgtcgc ccgttacacc ggaccttgga 2700

gttgtctctg acacattctg gcgcctgcca aatgtaaagc gcagcgccca tccatttgcc 2760

tttgcggcag cggggccaca ggcagagcag atcatctctg atccattgcc cctgccacct 2820

cactcgcctg caagcccggt cgcccgtgtc catgaactcg atgggcaggt acttctcctc 2880

ggcgtgggac acgatgccaa cacgacgctg catcttgccg agttgatggc aaaggttccc 2940

tatggggtgc cgagacactg caccattctt caggatggca agttggtacg cgtcgattat 3000

ctcgagaatg accactgctg tgagcgcttt gccttggcgg acaggtggct caaggagaag 3060

agccttcaga aggaaggtcc agtcggtcat gcctttgctc ggttgatccg ctcccgcgac 3120

attgtggcga cagccctggg tcaactgggc cgagatccgt tgatcttcct gcatccgcca 3180

gaggcgggat gcgaagaatg cgatgccgct cgccagtcga ttggctgagc tcatgagcgg 3240

agaacgagat gacgttggag gggcaaggtc gcgctgattg ctggggcaac acgtgaaagg 3300

cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacggta cccggggatc ctctagagtc 3360

gacctgcata atgtgcctgt caaatggacg aagcagggat tctgcaaacc ctatgctact 3420

ccgtcaagcc gtcaattgtc tgattcgtta ccaattatga caacttgacg gctacatcat 3480

tcactttttc ttcacaaccg gcacggaact cgctcgggct ggccccggtg cattttttaa 3540

atacccgcga gaaatagagt tgatcgtcaa aaccaacatt gcgaccgacg gtggcgatag 3600

gcatccgggt ggtgctcaaa agcagcttcg cctggctgat acgttggtcc tcgcgccagc 3660

ttaagacgct aatccctaac tgctggcgga aaagatgtga cagacgcgac ggcgacaagc 3720

aaacatgctg tgcgacgctg gcgatatcaa aattgctgtc tgccaggtga tcgctgatgt 3780

actgacaagc ctcgcgtacc cgattatcca tcggtggatg gagcgactcg ttaatcgctt 3840

ccatgcgccg cagtaacaat tgctcaagca gatttatcgc cagcagctcc gaatagcgcc 3900

cttccccttg cccggcgtta atgatttgcc caaacaggtc gctgaaatgc ggctggtgcg 3960

cttcatccgg gcgaaagaac cccgtattgg caaatattga cggccagtta agccattcat 4020

gccagtaggc gcgcggacga aagtaaaccc actggtgata ccattcgcga gcctccggat 4080

gacgaccgta gtgatgaatc tctcctggcg ggaacagcaa aatatcaccc ggtcggcaaa 4140

caaattctcg tccctgattt ttcaccaccc cctgaccgcg aatggtgaga ttgagaatat 4200

aacctttcat tcccagcggt cggtcgataa aaaaatcgag ataaccgttg gcctcaatcg 4260

gcgttaaacc cgccaccaga tgggcattaa acgagtatcc cggcagcagg ggatcatttt 4320

gcgcttcagc catacttttc atactcccgc cattcagaga agaaaccaat tgtccatatt 4380

gcatcagaca ttgccgtcac tgcgtctttt actggctctt ctcgctaacc aaaccggtaa 4440

ccccgcttat taaaagcatt ctgtaacaaa gcgggaccaa agccatgaca aaaacgcgta 4500

acaaaagtgt ctataatcac ggcagaaaag tccacattga ttatttgcac ggcgtcacac 4560

tttgctatgc catagcattt ttatccataa gattagcgga tcctacctga cgctttttat 4620

cgcaactctc tactgtttct ccatacccgt ttttttgggc tagcgaaaag atgtttcgtg 4680

aagccgtcga cgcttataaa aaatggatat taatactgaa actgagatca agcaaaagca 4740

ttcactaacc ccctttcctg ttttcctaat cagcccggca tttcgcgggc gatattttca 4800

cagctatttc aggagttcag ccatgaacgc ttattacatt caggatcgtc ttgaggctca 4860

gagctgggcg cgtcactacc agcagctcgc ccgtgaagag aaagaggcag aactggcaga 4920

cgacatggaa aaaggcctgc cccagcacct gtttgaatcg ctatgcatcg atcatttgca 4980

acgccacggg gccagcaaaa aatccattac ccgtgcgttt gatgacgatg ttgagtttca 5040

ggagcgcatg gcagaacaca tccggtacat ggttgaaacc attgctcacc accaggttga 5100

tattgattca gaggtataaa acgaatgagt actgcactcg caacgctggc tgggaagctg 5160

gctgaacgtg tcggcatgga ttctgtcgac ccacaggaac tgatcaccac tcttcgccag 5220

acggcattta aaggtgatgc cagcgatgcg cagttcatcg cattactgat cgttgccaac 5280

cagtacggcc ttaatccgtg gacgaaagaa atttacgcct ttcctgataa gcagaatggc 5340

atcgttccgg tggtgggcgt tgatggctgg tcccgcatca tcaatgaaaa ccagcagttt 5400

gatggcatgg actttgagca ggacaatgaa tcctgtacat gccggattta ccgcaaggac 5460

cgtaatcatc cgatctgcgt taccgaatgg atggatgaat gccgccgcga accattcaaa 5520

actcgcgaag gcagagaaat cacggggccg tggcagtcgc atcccaaacg gatgttacgt 5580

cataaagcca tgattcagtg tgcccgtctg gccttcggat ttgctggtat ctatgacaag 5640

gatgaagccg agcgcattgt cgaaaatact gcatacactg cagaacgtca gccggaacgc 5700

gacatcactc cggttaacga tgaaaccatg caggagatta acactctgct gatcgccctg 5760

gataaaacat gggatgacga cttattgccg ctctgttccc agatatttcg ccgcgacatt 5820

cgtgcatcgt cagaactgac acaggccgaa gcagtaaaag ctcttggatt cctgaaacag 5880

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tcgatgtgag agctgtcgaa cagggggatg atgcgtggca caaattacgg ctcggcgtca 6000

tcaccgcttc agaagttcac aacgtgatag caaaaccccg ctccggaaag aagtggcctg 6060

acatgaaaat gtcctacttc cacaccctgc ttgctgaggt ttgcaccggt gtggctccgg 6120

aagttaacgc taaagcactg gcctggggaa aacagtacga gaacgacgcc agaaccctgt 6180

ttgaattcac ttccggcgtg aatgttactg aatccccgat catctatcgc gacgaaagta 6240

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gcccgtttac ctcccgggat ttcatgaagt tccggctcgg tggtttcgag gccataaagt 6360

cagcttacat ggcccaggtg cagtacagca tgtgggtgac gcgaaaaaat gcctggtact 6420

ttgccaacta tgacccgcgt atgaagcgtg aaggcctgca ttatgtcgtg attgagcggg 6480

atgaaaagta catggcgagt tttgacgaga tcgtgccgga gttcatcgaa aaaatggacg 6540

aggcactggc tgaaattggt tttgtatttg gggagcaatg gcgatgacgc atcctcacga 6600

taataagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa gacagcatcc 6660

ttgaacaagg acaattaaca gttaacaaat aaaaacgcaa aagaaaatgc cgatattgac 6720

taccggaagc agtgtgaccg tgtgcttctc aaatgcctga ttcaggctgt ctatgtgtga 6780

ctgttgagct gtaacaagtt gtctcaggtg ttcaatttca tgttctagtt gctttgtttt 6840

actggtttca cctgttctat taggtgttac atgctgttca tctgttacat tgtcgatctg 6900

ttcatggtga acagctttaa atgcaccaaa aactcgtaaa agctctgatg tatctatctt 6960

ttttacaccg ttttcatctg tgcatatagc tatactgatt tcgtcagact cacagtcaaa 7020

catgccggtc agttggcctg gtgatggcgg gatcgttgta tatttcttga caccttttcg 7080

gcaccgccct aaaattctgc gtcctcataa tatatgaggc gatttattac gtgtttacga 7140

agcaaaagct aaaaccagga gctatttaat ggataagaaa tactcaatag gcttagatat 7200

cggcacaaat agcgtcggat gggcggtgat cactgatgaa tataaggttc cgtctaaaaa 7260

gttcaaggtt ctgggaaata cagaccgcca cagtatcaaa aaaaatctta taggggctct 7320

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gtatacacgt cggaagaatc gtatttgtta tctacaggag attttttcaa atgagatggc 7440

gaaagtagat gatagtttct ttcatcgact tgaagagtct tttttggtgg aagaagacaa 7500

gaagcatgaa cgtcatccta tttttggaaa tatagtagat gaagttgctt atcatgagaa 7560

atatccaact atctatcatc tgcgaaaaaa attggtagat tctactgata aagcggattt 7620

gcgcttaatc tatttggcct tagcgcatat gattaagttt cgtggtcatt ttttgattga 7680

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ctacaatcaa ttatttgaag aaaaccctat taacgcaagt ggagtagatg ctaaagcgat 7800

tctttctgca cgattgagta aatcaagacg attagaaaat ctcattgctc agctccccgg 7860

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ttttaaatca aattttgatt tggcagaaga tgctaaatta cagctttcaa aagatactta 7980

cgatgatgat ttagataatt tattggcgca aattggagat caatatgctg atttgttttt 8040

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aataactaag gctcccctat cagcttcaat gattaaacgc tacgatgaac atcatcaaga 8160

cttgactctt ttaaaagctt tagttcgaca acaacttcca gaaaagtata aagaaatctt 8220

ttttgatcaa tcaaaaaacg gatatgcagg ttatattgat gggggagcta gccaagaaga 8280

attttataaa tttatcaaac caattttaga aaaaatggat ggtactgagg aattattggt 8340

gaaactaaat cgtgaagatt tgctgcgcaa gcaacggacc tttgacaacg gctctattcc 8400

ccatcaaatt cacttgggtg agctgcatgc tattttgaga agacaagaag acttttatcc 8460

atttttaaaa gacaatcgtg agaagattga aaaaatcttg acttttcgaa ttccttatta 8520

tgttggtcca ttggcgcgtg gcaatagtcg ttttgcatgg atgactcgga agtctgaaga 8580

aacaattacc ccatggaatt ttgaagaagt tgtcgataaa ggtgcttcag ctcaatcatt 8640

tattgaacgc atgacaaact ttgataaaaa tcttccaaat gaaaaagtac taccaaaaca 8700

tagtttgctt tatgagtatt ttacggttta taacgaattg acaaaggtca aatatgttac 8760

tgaaggaatg cgaaaaccag catttctttc aggtgaacag aagaaagcca ttgttgattt 8820

actcttcaaa acaaatcgaa aagtaaccgt taagcaatta aaagaagatt atttcaaaaa 8880

aatagaatgt tttgatagtg ttgaaatttc aggagttgaa gatagattta atgcttcatt 8940

aggtacctac catgatttgc taaaaattat taaagataaa gattttttgg ataatgaaga 9000

aaatgaagat atcttagagg atattgtttt aacattgacc ttatttgaag atagggagat 9060

gattgaggaa agacttaaaa catatgctca cctctttgat gataaggtga tgaaacagct 9120

taaacgtcgc cgttatactg gttggggacg tttgtctcga aaattgatta atggtattag 9180

ggataagcaa tctggcaaaa caatattaga ttttttgaaa tcagatggtt ttgccaatcg 9240

caattttatg cagctgatcc atgatgatag tttgacattt aaagaagaca ttcaaaaagc 9300

acaagtgtct ggacaaggcg atagtttaca tgaacatatt gcaaatttag ctggtagccc 9360

tgctattaaa aaaggtattt tacagactgt aaaagttgtt gatgaattgg tcaaagtaat 9420

ggggcggcat aagccagaaa atatcgttat tgaaatggca cgtgaaaatc agacaactca 9480

aaagggccag aaaaattcgc gagagcgtat gaaacgaatc gaagaaggta tcaaagaatt 9540

aggaagtcag attcttaaag agcatcctgt tgaaaatact caattgcaaa atgaaaagct 9600

ctatctctat tatctccaaa atggaagaga catgtatgtg gaccaagaat tagatattaa 9660

tcgtttaagt gattatgatg tcgatcacat tgttccacaa agtttcctta aagacgattc 9720

aatagacaat aaggtcttaa cgcgttctga taaaaatcgt ggtaaatcgg ataacgttcc 9780

aagtgaagaa gtagtcaaaa agatgaaaaa ctattggaga caacttctaa acgccaagtt 9840

aatcactcaa cgtaagtttg ataatttaac gaaagctgaa cgtggaggtt tgagtgaact 9900

tgataaagct ggttttatca aacgccaatt ggttgaaact cgccaaatca ctaagcatgt 9960

ggcacaaatt ttggatagtc gcatgaatac taaatacgat gaaaatgata aacttattcg 10020

agaggttaaa gtgattacct taaaatctaa attagtttct gacttccgaa aagatttcca 10080

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cgtcgttgga actgctttga ttaagaaata tccaaaactt gaatcggagt ttgtctatgg 10200

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acttgcaaat ggagagattc gcaaacgccc tctaatcgaa actaatgggg aaactggaga 10380

aattgtctgg gataaagggc gagattttgc cacagtgcgc aaagtattgt ccatgcccca 10440

agtcaatatt gtcaagaaaa cagaagtaca gacaggcgga ttctccaagg agtcaatttt 10500

accaaaaaga aattcggaca agcttattgc tcgtaaaaaa gactgggatc caaaaaaata 10560

tggtggtttt gatagtccaa cggtagctta ttcagtccta gtggttgcta aggtggaaaa 10620

agggaaatcg aagaagttaa aatccgttaa agagttacta gggatcacaa ttatggaaag 10680

aagttccttt gaaaaaaatc cgattgactt tttagaagct aaaggatata aggaagttaa 10740

aaaagactta atcattaaac tacctaaata tagtcttttt gagttagaaa acggtcgtaa 10800

acggatgctg gctagtgccg gagaattaca aaaaggaaat gagctggctc tgccaagcaa 10860

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gcaaatcagt gaattttcta agcgtgttat tttagcagat gccaatttag ataaagttct 11040

tagtgcatat aacaaacata gagacaaacc aatacgtgaa caagcagaaa atattattca 11100

tttatttacg ttgacgaatc ttggagctcc cgctgctttt aaatattttg atacaacaat 11160

tgatcgtaaa cgatatacgt ctacaaaaga agttttagat gccactctta tccatcaatc 11220

catcactggt ctttatgaaa cacgcattga tttgagtcag ctaggaggtg actgatggct 11280

ggttggcgta ctgttgtggt aaatacccat atggacagtt ttccctttga tatgtaacgg 11340

tgaacagttg ttctactttt gtttgttagt cttgatgctt cactgataga tacaagagcc 11400

ataagaacc 11409

<210> 2

<211> 4729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggtac 420

cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga tacggcatca gagcagattg tactgagagt 480

gcaccataat cggcattttc ttttgcgttt ttatttgtta actgttaatt gtccttgttc 540

aaggatgctg tctttgacaa cagatgtttt cttgcctttg atgttcagca ggaagctagg 600

cgcaaacgtt gattgtttgt ctgcgtagaa tcctctgttt gtcatatagc ttgtaatcac 660

gacattgttt cctttcgctt gaggtacagc gaagtgtgag taagtaaagg ttacatcgtt 720

aggatcaaga tccattttta acacaaggcc agttttgttc agcggcttgt atgggccagt 780

taaagaatta gaaacataac caagcatgta aatatcgtta gacgtaatgc cgtcaatcgt 840

catttttgat ccgcgggagt cagtgaacag ataccatttg ccgttcattt taaagacgtt 900

cgcgcgttca atttcatctg ttactgtgtt agatgcaatc agcggtttca tcactttttt 960

cagtgtgtaa tcatcgttta gctcaatcat accgagagcg ccgtttgcta actcagccgt 1020

gcgtttttta tcgctttgca gaagtttttg actttcttga cggaagaatg atgtgctttt 1080

gccatagtat gctttgttaa ataaagattc ttcgccttgg tagccatctt cagttccagt 1140

gtttgcttca aatactaagt atttgtggcc tttatcttct acgtagtgag gatctctcag 1200

cgtatggttg tcgcctgagc tgtagttgcc ttcatcgatg aactgctgta cattttgata 1260

cgtttttccg tcaccgtcaa agattgattt ataatcctct acaccgttga tgttcaaaga 1320

gctgtctgat gctgatacgt taacttgtgc agttgtcagt gtttgtttgc cgtaatgttt 1380

accggagaaa tcagtgtaga ataaacggat ttttccgtca gatgtaaatg tggctgaacc 1440

tgaccattct tgtgtttggt cttttaggat agaatcattt gcatcgaatt tgtcgctgtc 1500

tttaaagacg cggccagcgt ttttccagct gtcaatagaa gtttcgccga ctttttgata 1560

gaacatgtaa atcgatgtgt catccgcatt tttaggatct ccggctaatg caaagacgat 1620

gtggtagccg tgatagtttg cgacagtgcc gtcagcgttt tgtaatggcc agctgtccca 1680

aacgtccagg ccttttgcag aagagatatt tttaattgtg gacgaatcga actcaggaac 1740

ttgatatttt tcattttttt gctgttcagg gatttgcagc atatcatggc gtgtaatatg 1800

ggaaatgccg tatgtttcct tatatggctt ttggttcgtt tctttcgcaa acgcttgagt 1860

tgcgcctcct gccagcagtg cggtagtaaa ggttaatact gttgcttgtt ttgcaaactt 1920

tttgatgttc atcgttcatg tctccttttt tatgtactgt gttagcggtc tgcttcttcc 1980

agccctcctg tttgaagatg gcaagttagt tacgcacaat aaaaaaagac ctaaaatatg 2040

taaggggtga cgccaaagta tacactttgc cctttacaca ttttaggtct tgcctgcttt 2100

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acgggcctaa agaactaaaa aatctatctg tttcttttca ttctctgtat tttttatagt 2280

ttctgttgca tgggcataaa gttgcaagct tgatatcttg acagctagct cagtcctagg 2340

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aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgatatcga 2460

attcctgcag cccgggggat ccactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcat 2520

cccaatggcg cgccgagctt ggctcgagca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 2580

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 2640

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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 3000

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 3060

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gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 3360

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 3420

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 3480

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 3540

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 3600

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 3660

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttagaaa 3720

aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat 3780

ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg 3840

gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat 3900

ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc 3960

ggtgagaatg gcaaaagttt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta 4020

cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga 4080

gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac 4140

cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct 4200

aatacctgga atgctgtttt cccagggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga 4260

gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg 4320

accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct 4380

ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg 4440

cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctagag 4500

caagacgttt cccgttgaat atggctcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 4560

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 4620

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 4680

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 4729

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accgttttca tctgtgcata tagctatact gatttcgtca gactc 45

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcttatccat taaatagctc ctggttttag ctttt 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctattta atggataaga aatactcaat aggct 35

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaaaactgt ccatatgggt atttaccaca acagtacg 38

<210> 7

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatctt gacagctagc 60

tcagtcctag gtataatact agtcgagacc attggtctca gttttagagc tagaaatagc 120

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 180

tttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc cgccaccgcg 240

gtggagctc 249

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgacggtat cgatacggca tcagagcaga ttgtact 37

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgtcaaga tatcaagctt gcaactttat gcccatgcaa ca 42

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggtacgctg ttcgtccata 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagtcggtac gctgttcgtc cata 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaactatgga cgaacagcgt accg 24

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttggtaaagg catgctgacc gccgcggttt gtggcgatct gttcg 45

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accatcgcca cgcaaaacag tgcggacatc gtcaacctga tggtg 45

<210> 15

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttggtaaagg catgctgacc gccgcggttt gtggcgatct gttcgaccat cgccacgcaa 60

aacagtgcgg acatcgtcaa cctgatggtg 90

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgaccatta ttatcgctga c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgctgttgag ataggacgct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagccagctg gcgccgagcg 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tagtcagcca gctggcgccg agcg 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaaccgctcg gcgccagctg gctg 24

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggctgcgc cagttcattg tgaattcact ggaggaacag acatg 45

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgaagctgat ttgcggacgc gaggtaaccc gtcgccccgg taagc 45

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtgagcaagg gcgaggagga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cttgtacagc tcgtccatgc 20

<210> 25

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atggctgcgc cagttcattg tgaattcact ggaggaacag acatggtgag caagggcgag 60

gagga 65

<210> 26

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcttaccggg gcgacgggtt acctcgcgtc cgcaaatcag cttcacttgt acagctcgtc 60

catgc 65

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aagggttgag tctggaaacg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggtgaaggtg gcaatggaat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

actacgacgc tgaggtcaag 20

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt 35

<210> 31

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210> 32

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tagctatact gatttcgtca gactcacagt caaacatgcc ggtcagttgg cctggtgatg 60

gcgggatcgt tgtatatttc ttgacacctt ttcggcaccg ccctaaaatt ctgcgtcctc 120

ataatatatg aggcgattta ttacgtgttt acgaagcaaa agctaaaacc aggagctatt 180

ta 182

<210> 33

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107

Claims (6)

1.一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的双质粒系统，包括第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体的序列如SEQ ID NO. 1所示，所述第二表达载体的序列如SEQ IDNO. 2所示。

2.一种工程菌，包括如权利要求1所述的双质粒系统。

3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，保藏号为CCTCC M 2018528和CCTCC M2018530的菌株的组合。

4.如权利要求1所述的双质粒系统、或如权利要求2-3任一所述的工程菌在以非疾病诊断和治疗为目的的肺炎克雷伯菌的基因编辑中的用途。

5.一种肺炎克雷伯菌构建试剂盒，包括如权利要求1所述的双质粒系统。

6.一种肺炎克雷伯菌的构建方法，包括：将如权利要求1所述的双质粒系统中的第二表达载体的多克隆位点插入spacer序列，所得质粒转染肺炎克雷伯菌，培养、筛选。

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