CN109722439B - 烟草mlo2、mlo6和mlo12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草Mildew resistance locus O(MLO)基因MLO2，MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法，通过构建含有编辑MLO2，MLO6和MLO12三基因的多顺反子tRNA‑gRNA的编辑失活载体，将MLO2,MLO6和MLO12三基因编辑失活后，烟草表现出对白粉菌明显的抗性，研究结果对于研究植物对真菌的抗病免疫机制和培育抗白粉病的烟草品种有着重要的应用价值。

Description

烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应 用及其方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，还涉及制备抗白粉菌烟草品种的方法。

背景技术

白粉菌可以侵染超过650种的单子叶植物和9000多种双子叶植物，其危害影响极大，不仅对观赏类植物和水果产生了巨大的经济损失，也对许多农作物和经济作物带来了巨大的损失，严重影响了农业生产。目前，白粉病在我国各个地方均有发生，白粉病的危害呈现爆发范围大，侵染性广的特点。我国是当今世界上最大的烟草生产国，烟叶总产量和总销量都占有世界上30％左右。目前烟草税收已经占到我国财政收入的1/10，烟草已成为我国重要的经济植物。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上。而烟草白粉病(Erysiphe cichoracearum DC)是烟草生产上的主要病害之一，俗称“上硝”、“发白”或“下霜”。目前主要还是使用化学农药进行防治，而化学农药的使用，造成了烟叶中农药残留的增加，病害的抗药性增强和再猖獗，影响农业的可持续发展,并危及人类健康、破坏生态平衡。因此，通过选择和培育抗病的的品种是防治白粉病最安全和有效的方法。

目前在许多植物中，已经通过对MLO基因进行基因编辑或RNAi等方法，获得了抗白粉病的植株。而MLO基因的发现，是在1942年Fersileben和Leni在大麦的突变体中发现了完全抗大麦白粉病Blumeriagraminis f.sp.hordei(Bgh)的植株，使得白粉病的防治获得了重大突破。他们利用X射线处理大麦品种Haias，诱导其突变而产生了对Bgh的广谱抗病性，该抗性基因在70年代被遗传学家命名为Mildew resistance locus o(Mlo)。第一个野生大麦MLO 基因在1997年被克隆，为MLO基因功能研究奠定了良好基础。隐性突变的MLO基因赋予了大麦对白粉病的广谱抗病性。在MLO基因功能的研究中，一般认为MLO基因在植物抗病过程中起负调控作用，类似于植物的“感病基因”，任何感病的野生型(Mlo)都可以通过诱变获得对病原菌的广谱抗性。大麦mlo突变体发现已经超过70年，且25年前已经成功的应用于欧洲的农业生产，这表明在农业生产的条件下，MLO基因也表现出持久的抗病能力。目前，单子叶植物大麦和双子叶植物拟南芥都已获得到mlo突变体，它们均具有对白粉病菌的广谱抗性。不同的是，在大麦中MLO单基因的突变就可以表现出对白粉病的完全抗性，而在拟南芥中，共鉴定出15个MLO基因,其中与抗白粉病相关的的有AtMLO2、AtMLO6、 AtMLO12三个同源基因，这三个基因分别表现出对拟南芥白粉菌不同程度的抗性。Atmlo2突变体表现出对白粉病的部分抗性，双突变体Atmlo2与Atmlo6和Atmlo2 与Atmlo12对白粉病抗性增加，三突变体Atmlo2、Atmlo6和Atmlo12表现出对白粉病的完全抗性。

烟草中也存在MLO基因家族，但是烟草MLO同源基因数量众多，哪些基因的功能与对白粉病的抗性相关，目前没有相关研究数据。故对烟草MLO基因进行精准定点失活进而获得抗白粉病烟草育种素材更是未见报道。因此通过基因编辑的方法，在烟草中对NtMLO基因进行敲除，制作抗白粉菌品种的烟草素材，对于烟草抗病育种和理论研究具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用；本发明的目的之二在于提供一种同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA；本发明的目的之三在于提供含有所述多顺反子tRNA-sgRNA的编辑失活载体；本发明的目的之四在于提供所述多顺反子tRNA-sgRNA或所述编辑失活载体在制备抗白粉菌烟草品种中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备抗白粉病烟草品种的方法；本发明的目的之六在于提供由所述方法制得的抗白粉病烟草品种。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，所述MLO2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述MLO6的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述MLO12的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因的方法是设计同时编辑MLO2,MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA。

优选的，所述同时编辑MLO2,MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的靶序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

优选的，所述同时编辑MLO2,MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2、一种同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA，所述多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

3、含有权利要求5所述多顺反子tRNA-sgRNA的编辑失活载体，所述编辑失活载体由多顺反子tRNA-sgRNA连入pORE-Cas9载体Bsa I酶切位点处而得。

4、所述多顺反子tRNA-sgRNA或所述编辑失活载体在制备抗白粉菌烟草品种中的应用。

5、一种制备抗白粉病烟草品种的方法，构建同时敲除MLO2,MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA，然后连入pORE-Cas9载体Bsa I酶切位点处获得编辑失活载体，转化烟草，筛选抗性芽，生根培养，获得T0代转基因植株，自交获得T1代转基因种子，将T1 代转基因种子播种在卡那霉素抗性MS培养基中，获得T1代转基因植株，筛选基因敲除突变植株，即得抗白粉病烟草品种。

优选的，所述同时敲除MLO2,MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

6、由所述方法制得的抗白粉病烟草品种。

本发明的有益效果在于：本发明公开了同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，通过构建含有MLO2、MLO6和MLO12三基因的多顺反子 tRNA-gRNA，然后与载体骨架连接形成编辑失活载体，能够靶向编辑MLO2、MLO6和MLO12 三基因失活，并且MLO2,MLO6和MLO12三基因同时编辑失活后，获得对白粉菌明显抗性的种质资源，对烟草抗白粉菌机制研究有重大意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑载体中tRNA-gRNA核心序列。

图2为MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑载体示意图。

图3为MLO2、MLO6和MLO12等3基因敲除株系突变位点分析。

图4为烟草MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑失活株系染病后叶片白粉菌的定量PCR检测(**P<0.01)。

图5为烟草MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑失活株系染病后叶片白粉菌的孢子量统计(**P<0.01)。

图6为MLO2、MLO6和MLO12等3基因敲除株系白粉病感染表型观察(a和a’表示野生型感染白粉病表型；b和b’表示敲除株系白粉病感染表型)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、烟草MLO2,MLO6,MLO12基因片段的获得

取烟草品种红花大金元的基因组DNA为模板，设计克隆烟草MLO2，MLO6和MLO12 基因的引物，具体引物如下：

NtMLO2-fragment-F：5'-cactgattgacgaaccttattg-3'(SEQ ID NO.1)；

NtMLO6-fragment-F：5'-tgaagagcttatgctacttggat-3'(SEQ ID NO.2)；

NtMLO12-fragment-F：5'-atggaggcaactccgact-3'(SEQ ID NO.3)；

NtMLO2-fragment-R：5'-gtcagcgcatttgtcagttc-3'(SEQ ID NO.4)；

NtMLO6-fragment-R：5'-gccaatgtggtaatacagtagaat-3'(SEQ ID NO.5)；

NtMLO12-fragment-R：5'-ctttggcacgcataagttag-3'(SEQ ID NO.6)；

然后以设计的引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，取5μL PCR产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并对所获片段进行序列测定。

扩增获得MLO2,MLO6和MLO12基因片段，具体序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8 和SEQ ID NO.9所示：

>NtMLO2(SEQ ID NO.7)

tcactgattgacgaaccttattgatttttctttacaactatcacaactctcaacttgattcaattaacaactaaacattattatcgatctttaatattc aaaattcatttaaacactatccattttgctaaaattatattataatcaatccttgataaatatgtatatatatattttaaaaaagatcactcgccgactaaac accgaattaaaaacatttttccactgataaaaatctatgctcgttttctggttataatcttattatgattaattttgagcttacaattttcaagctaacatattg ttatttttatttattttgaagagcttatgctactaggatttatatccctactgttaacagtagggcaagatccaatttcaaatatatgtgtatctgagaag attgcaagtacatggcatccatgtagtaagcaaaaagaagctgaaaagtacaacgtgcctgtagaggctgagggtcatcgccggcgacttctta cggcggctgacgacggtggagttcggcgaattttggcggctgtcggaactgacaaatgcgctgaca

>NtMLO6(SEQ ID NO.8)

tgaagagcttatgctacttggatttatatccctactgctaacagtagggcaagatccaatttcaaatatatgtgtatctgagaagattgcaagt acatggcatccatgtagtaagcaaaaagaagctgaaaagtacaacgtggctaaagaggctgagggtcatcgccggcgacttcttacggctga cgacggtggagttcggcgaagtttggcggctgtgggaactgacaaatgcgctgccaaggcatgtcacttttttttttgcccttttaaaaaaaaatca gttgaaaagaggaaaatttatttgtctgatctttcaatttaataatttcacttcacttatttaatttttaggagtagttaccagttatagttactcttttgaataa atcttattgtgtttaatagaagttaaactcgttaattatttaaactaagtggattattttttcttgttggatttgtttgcagggaaaagtagcatttgtgtctgc tgatggtattcatcaattacatatcttcatttttgtgctggctatttttcacgtattctactgtattaccacattggct

>NtMLO12(SEQ ID NO.9)

atggaggcaactccgacttgggcagttgccgcagtttgcttcatcttgctggctatttccattttcattgaacaaattattcatcatcttggag aggtaggtagtaataacttaatttttgggagtttaattctagctagctagttttgtaaaatcagactgctaattaattcattgttcagattttactgctaatat tactgcctaaaagggggtgaaaattttctagatcgatgaattggtattgcatgagatgtgtttgttttgttgatggagacttcatttatttggtttgcagtg gttgttgaaaaaacataaaaagcctctttatgaagcacttgaaaagatcaaagcaggtaaaattaaagtagaattttcttaattttatatttgtatatcgt atatagttgaatgcatgtattgactgacattttaacgtaacagaactgatgttgttgggattcatatcactgctgttgacagtggtgcaaagcccagtgtctaacttatgcgtgccaaag

实施例2、MLO2,MLO6和MLO12三基因编辑靶标序列信息及基因编辑失活载体构建

在扩增出的MLO2基因片段序列(SEQ ID NO.7)中选择“tatccctactgttaacagta”(SEQ ID NO.10)、扩增出的MLO6基因片段序列(SEQ ID NO.8)中选择“caacgtggctaaagaggctg”(SEQ ID NO.11)、扩增出的MLO12基因片段序列(SEQ ID NO.9)中选择“cgcagtttgcttcatcttgc”(SEQ ID NO.12)作为拟编辑的靶位点。参考已发表的通过tRNA介导的多基因编辑的方法(Kabin X,Bastian M,Yinong Y(2015)."Boosting CRISPR/Cas9multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system."Proc Natl Acad Sci U S A 112:3570-3575)，合成MLO2， MLO6和MLO12三基因的多顺反子tRNA-gRNA，具体序列如SEQ ID NO.13和图1所示。用Bsa I酶切MLO2,MLO6和MLO12三基因的多顺反子tRNA-gRNA与pORE-Cas9载体(Gao, J.,G.Wang,S.Ma,X.Xie,X.Wu,X.Zhang,Y.Wu,P.Zhao and Q.Xia(2015). "CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis inNicotiana tabacum."Plant Mol Biol 87(1-2): 99-110.)，回收并且连接酶切产物，用Plasmid-check F和Plasmid-check R PCR检测、测序得到重组载体的阳性克隆质粒，命名为pORE-Cas9-MLO2MLO6MLO12editing，载体序列如 SEQ ID NO.14所示(图2)。

Plasmid-check F：5’-ttaggtttacccgccaata-3’(SEQ ID NO.15)；

Plasmid-check R：5’-gagtagacaagtgtgtcgtgct-3’(SEQ ID NO.16)；

敲除载体质粒提取：用LB/Kana的液体培养基扩大培养测序正确的菌液，参考全式金 Transgen EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(目录号：EM101)提取敲除载体质粒，用于后续烟草叶片的遗传转化。

农杆菌制备：

1)用接种环从LBA4404永久菌中沾取菌液，在YEB固体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L)上划线，置于28℃，倒置暗培养2-3天；

2)挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种于YEB液体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L)中，28℃，220rpm振荡培养过夜；

3)取1mL菌液接种于50mL YEB液体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/ L)中，28℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5-0.6；

4)将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

5)用25mL预冷20mM的CaCl₂溶液轻轻悬浮菌体，冰浴20min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

6)加入2mL 20mM的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞；

7)将感受态细胞分装于无菌的离心管，每管200μL，液氮速冻，-80℃保存。

实施例3、工程菌制备及转基因烟草制备

敲除载体转化农杆菌制备，具体步骤如下：

1)分别吸取≦1μg测序正确的pORE-Cas9-MLO2MLO6MLO12editing重组质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞中(在感受态细胞刚刚溶解时加入)，轻弹混匀，冰浴30min；

2)液氮速冻1min后，立即于37℃水浴热击5min；

3)加入1mL YEB液体培养基，28℃、220rpm培养4-6h(出现絮状物)。

4)4000rpm离心3min，弃掉上清，加入新鲜YEB培养基200μL，用枪头吹打混匀，均匀涂布于YEB固体平板上(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L，Kan终浓度50mg/ L)，28℃，暗培养2-3天。

农杆菌阳性转化子筛选：分别以Plasmid-check F/R引物对农杆菌阳性转化菌进行菌液 PCR鉴定。

叶盘法转化烟草：

1)农杆菌准备

将测序成功的敲除阳性农杆菌转化菌按照1：50的比例接种于50mL的YEB液体培养基 (利福平、链霉素、卡那霉素的终浓度均为50mg/L)中，28℃、220rpm黑暗震荡培养25-36小时，待菌液OD值达到0.5-0.6，使用50mL无菌离心管收集菌液，3500rpm，5℃离心15 min，弃上清，用30mL MS液体培养液(含有终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮)重悬菌体， 28℃静置1-2小时。

2)叶盘预培养

以生长两个月红花大金元叶片组织为实验材料，用直径约0.5cm的打孔器获取植物叶盘，于预培养培养基MS1(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA)上，28℃黑暗培养3天。

3)农杆菌浸染

将预培养3天的烟草叶盘侵染于重悬的农杆菌液体中，充分浸染10分钟，然后将叶盘置于灭菌的滤纸上，吸干表面的菌液，将叶盘置于MS1(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA)培养基上，28℃黑暗培养3天。

4)抗性筛选

将共培养3天的烟草叶盘，用含有500mg/L的羧苄青霉素洗涤3-5次，再用滤纸吸干叶盘表面的水，将叶盘置于筛选培养基MS2(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+250mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素)上，28℃光照16小时，黑暗8小时筛选培养，10-15天更换一次培养基。

5)生根培养

待筛选培养的愈伤组织长出小芽1厘米左右时，将其剪下，转移至含卡那霉素的生根培养基MS上培养，待小芽生根并根系发育完全之后，洗去根部培养基，将植株置于自来水炼苗3-5天，直至长出新的根后，将植株移至土壤中，温室中生长。

6)T1代转基因植株获得

T0代转基因植株在温室中套袋自交收种子，获得T1代转基因种子，将其播种在卡那霉素抗性MS培养基中，获得T1代转基因植株，用于后续基因敲除的突变植株的筛选。

红花大金元T1代转基因敲除烟草的鉴定：提取T1代转基因幼苗的叶片基因组DNA，PCR检测基因组中是否含有Cas9基因序列，检测敲除载体是否已经插入转基因植株基因组中。Cas9检测引物为Cas9F:5’-cattgcgttgtcactcgg-3’(SEQ ID NO.17)，Cas9R: 5’-tgcgtagccattcttgga-3’(SEQ ID NO.18)。以T1代转基因幼苗叶片基因组DNA为模板，分别扩增MLO2、MLO6和MLO12序列。PCR产物送测序公司测序，测序引物为扩增MLO2、 MLO6和MLO12片段的上游引物。通过测序筛选基因敲除的突变体植株，检测靶位点处碱基的突变形式，鉴定得到烟草MLO2、MLO6和MLO12三基因同时突变植株，其中NtMLO2基因是一个碱基的缺失，NtMLO6基因这是两个碱基的缺失，而NtMLO12则是胸腺嘧啶(T) 到胞嘧啶(C)的碱基替换(图3)。

实施例4、转基因烟草分析

1)红花大金元敲除植株的抗菌检测分析

(1)叶片菌含量的定量检测分析

菌含量检测分析参考已报道的方法(Pfaffl MW(2001)A new mathematicalmodel for relative quantification in real-time RT-PCR.Nucleic Acids Research29:e45)。白粉菌侵染七天后，分别取材等面积的野生型和突变株叶片，马上放入-80℃保存备用。分别提取野生型和突变株的基因组，使用G1-F 5’ccaaagacccaacctaac 3’(SEQ IDNO.19),G1-R 5’cgatgccagagccaagag 3’ (SEQ ID NO.20)进行扩增定量检测菌含量。烟草EF-1a基因作为内参基因，NtEF1a-F： 5’gcattgcttgctttcaccctt3’(SEQ ID NO.21),NtEF1a-R：5’aacctccttcacgatttcatcatacc 3’(SEQ ID NO.22)。叶片中白粉菌的相对定量使用2^–△△Ct的方法计算，结果如图4所示。结果显示，烟草MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑失活株系染病白粉菌基因表达量显著降低。

(2)叶片白粉菌孢子量计数

白粉菌侵染7天后，分别取材野生型和突变株叶片。放入无菌离心管内，加入2mL的无菌水，然后以最大转速离心3-5分钟，收集孢子。分别吸取10uL的菌液，加入到血球计数板上计数，结果使用三次的平均值，结果如图5所示。结果显示，烟草MLO2、MLO6和MLO12 三基因编辑失活株系染病白粉菌孢子量降低。

(3)宏观拍照观察

分别侵染7天后，对叶片进行拍照对比，结果如图6所示。结果显示，烟草MLO2、MLO6和MLO12三基因编辑失活株侵染7天后叶片未出现白粉菌感染现象。表明MLO2, MLO6和MLO12三基因同时编辑失活后，可获得对白粉菌明显抗性的种质资源，素材制备及抗白粉菌机制研究有重大意义。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactgattga cgaaccttat tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagagctt atgctacttg gat 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaggcaa ctccgact 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcagcgcat ttgtcagttc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaatgtgg taatacagta gaat 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctttggcacg cataagttag 20

<210> 7

<211> 568

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 7

tcactgattg acgaacctta ttgatttttc tttacaacta tcacaactct caacttgatt 60

caattaacaa ctaaacatta ttatcgatct ttaatattca aaattcattt aaacactatc 120

cattttgcta aaattatatt ataatcaatc cttgataaat atgtatatat atattttaaa 180

aaagatcact cgccgactaa acaccgaatt aaaaacattt ttccactgat aaaaatctat 240

gctcgttttc tggttataat cttattatga ttaattttga gcttacaatt ttcaagctaa 300

catattgtta tttttattta ttttgaagag cttatgctac taggatttat atccctactg 360

ttaacagtag ggcaagatcc aatttcaaat atatgtgtat ctgagaagat tgcaagtaca 420

tggcatccat gtagtaagca aaaagaagct gaaaagtaca acgtgcctgt agaggctgag 480

ggtcatcgcc ggcgacttct tacggcggct gacgacggtg gagttcggcg aattttggcg 540

gctgtcggaa ctgacaaatg cgctgaca 568

<210> 8

<211> 573

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 8

tgaagagctt atgctacttg gatttatatc cctactgcta acagtagggc aagatccaat 60

ttcaaatata tgtgtatctg agaagattgc aagtacatgg catccatgta gtaagcaaaa 120

agaagctgaa aagtacaacg tggctaaaga ggctgagggt catcgccggc gacttcttac 180

ggctgacgac ggtggagttc ggcgaagttt ggcggctgtg ggaactgaca aatgcgctgc 240

caaggcatgt cacttttttt tttgcccttt taaaaaaaaa tcagttgaaa agaggaaaat 300

ttatttgtct gatctttcaa tttaataatt tcacttcact tatttaattt ttaggagtag 360

ttaccagtta tagttactct tttgaataaa tcttattgtg tttaatagaa gttaaactcg 420

ttaattattt aaactaagtg gattattttt tcttgttgga tttgtttgca gggaaaagta 480

gcatttgtgt ctgctgatgg tattcatcaa ttacatatct tcatttttgt gctggctatt 540

tttcacgtat tctactgtat taccacattg gct 573

<210> 9

<211> 521

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 9

atggaggcaa ctccgacttg ggcagttgcc gcagtttgct tcatcttgct ggctatttcc 60

attttcattg aacaaattat tcatcatctt ggagaggtag gtagtaataa cttaattttt 120

gggagtttaa ttctagctag ctagttttgt aaaatcagac tgctaattaa ttcattgttc 180

agattttact gctaatatta ctgcctaaaa gggggtgaaa attttctaga tcgatgaatt 240

ggtattgcat gagatgtgtt tgttttgttg atggagactt catttatttg gtttgcagtg 300

gttgttgaaa aaacataaaa agcctcttta tgaagcactt gaaaagatca aagcaggtaa 360

aattaaagta gaattttctt aattttatat ttgtatatcg tatatagttg aatgcatgta 420

ttgactgaca ttttaacgta acagaactga tgttgttggg attcatatca ctgctgttga 480

cagtggtgca aagcccagtg tctaacttat gcgtgccaaa g 521

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tatccctact gttaacagta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caacgtggct aaagaggctg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcagtttgc ttcatcttgc 20

<210> 13

<211> 469

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtctcagat tgaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 60

agacccgggt tcgattcccg gctggtgcag tatccctact gttaacagta gttttagagc 120

tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 180

cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 240

gggttcgatt cccggctggt gcagcaacgt ggctaaagag gctggtttta gagctagaaa 300

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 360

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 420

gattcccggc tggtgcagcg cagtttgctt catcttgcgt ttagagacc 469

<210> 14

<211> 12572

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300

gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420

ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 480

caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540

ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600

agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660

tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720

tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780

tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840

taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900

ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960

ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020

gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080

gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140

tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200

tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260

taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320

ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380

atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440

gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500

ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560

gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620

caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680

aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740

catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800

actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860

agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920

ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980

tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040

gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100

gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160

cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220

agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280

tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340

ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400

aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460

atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520

aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580

ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640

ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700

aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760

agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820

tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880

cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940

cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000

aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060

ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120

tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180

aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240

acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300

cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360

cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420

atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg 3480

gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540

tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac 3600

gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct ttactgagat 3660

cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4500

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttggatctc ctgtggttgg 4560

catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620

ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740

aaaacgggcg ccccgcggaa tgcttagctt tcgttttctt ctttttaact ttccattcgg 4800

agtttttgta tcttgtttca tagtttgtcc caggattaga atgattaggc atcgaacctt 4860

caagaatttg attgaataaa acatcttcat tcttaagata tgaagataat cttcaaaagg 4920

cccctgggaa tctgaaagaa gagaagcagg cccatttata tgggaaagaa caatagtatt 4980

tcttatatag gcccatttaa gttgaaaaca atcttcaaaa gtcccacatc gcttagataa 5040

gaaaacgaag ctgagtttat atacagctag agtcgaagta gtgattgatt gaacaaagca 5100

ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca gacccgggtt cgattcccgg 5160

ctggtgcagt atccctactg ttaacagtag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 5220

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg 5280

gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg 5340

cagcaacgtg gctaaagagg ctggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 5400

gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag 5460

tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcagcgc 5520

agtttgcttc atcttgcgtt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 5580

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttgcaaaa ttttccagat 5640

cgatttcttc ttcctctgtt cttcggcgtt caatttctgg gtttttctct tcgttttctg 5700

gctagcgttt aaacttaagc tgatccacta gtcctgcagg tcaacatggt ggagcacgac 5760

acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag 5820

acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 5880

cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 5940

aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 6000

cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 6060

tgatgtgata acatggtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat caaagataca 6120

gtctcagaag accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc cggaaacctc 6180

ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga aaaggaaggt 6240

ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga tgcctctgcc 6300

gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt 6360

ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac 6420

gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 6480

gagaggacct cgacctcaac acaacatata caaaacaaac gaatctcaag caatcaagca 6540

ttctacttct attgcagcaa tttaaatcat ttcttttaaa gcaaaagcaa ttttctgaaa 6600

attttcacca tttacgaacg atagaattcg ccatggcccc aaagaaaaag agaaaggttg 6660

attacaaaga ccacgacgga gactacaaag accacgacat tgattataaa gatgatgatg 6720

ataaaggaac gatggacaaa aagtatagca tcggtctgga tattggaact aactccgtcg 6780

gctgggctgt aatcaccgac gaatacaagg tcccgtcaaa aaagttcaag gtattgggta 6840

acacagatcg tcactctatc aaaaagaatc tcattggagc tctgttgttc gacagcggcg 6900

aaacagctga ggccactaga ctgaagcgca ccgccagacg ccgttacacg aggagaaaga 6960

acagaatctg ctacttgcaa gaaatattct caaacgagat ggccaaagtg gacgattcgt 7020

tctttcatag gttagaagag agtttccttg ttgaagagga taaaaagcac gaaagacatc 7080

cgatatttgg aaacatcgtg gacgaagttg cttatcacga gaagtacccc acgatctatc 7140

atctgcgtaa aaagttggtg gactcgacag ataaggccga cctcaggtta atataccttg 7200

cactggcgca catgatcaaa ttcagaggcc attttctgat tgaaggtgac ctgaaccctg 7260

acaatagtga tgtggacaaa ctcttcattc aattagttca gacctacaat caactgtttg 7320

aagagaaccc tatcaacgct tcaggagttg acgctaaggc catccttagt gcgagactga 7380

gcaaatcccg ccgtctcgaa aacttaatcg cacagttgcc tggagagaaa aagaacggtt 7440

tgttcggaaa tctcattgcg ttgtcactcg gactcacgcc aaacttcaag tctaacttcg 7500

atttggcaga agacgcgaaa ctgcaactga gcaaagacac atatgacgat gacctcgata 7560

acctcttagc tcagatcggc gatcaatacg ccgacttgtt cctcgctgcc aaaaatctgt 7620

cggacgctat acttctgagt gatatcttgc gcgtcaacac agaaattact aaggctcctc 7680

tgtcggccag tatgataaaa cgctatgacg aacaccatca ggatttgaca ttgctcaaag 7740

ccctcgtgcg tcaacagctc ccagaaaagt acaaggagat tttctttgat cagtccaaga 7800

atggctacgc aggttatata gacggtggag cgtcgcaaga agagttctac aagttcatca 7860

agccaatatt agaaaagatg gacggcacgg aagagttact tgttaagctg aatcgtgagg 7920

acctgttgcg taaacagagg acattcgata acggatcaat tccgcaccaa atacatcttg 7980

gcgaactgca cgctatcctc aggagacaag aggacttcta ccccttttta aaggataacc 8040

gtgaaaagat cgagaaaatc ctgactttca ggattcctta ctatgtcggc ccactggctc 8100

gtggtaatag caggtttgcc tggatgacca ggaagtccga agagacaatt actccgtgga 8160

acttcgaaga ggtggttgat aaaggagcat cagcgcagtc tttcatagaa cgcatgacaa 8220

attttgacaa gaacttaccg aatgagaagg tccttcccaa acactcactc ctctacgaat 8280

acttcacagt atacaacgag ctcactaaag tcaagtacgt aaccgagggt atgcgcaaac 8340

ccgctttcct gtctggagag cagaaaaagg ccatcgtgga ccttctgttc aagacaaacc 8400

gtaaggtcac tgtaaagcaa ctcaaggaag actacttcaa aaagatagag tgtttcgatt 8460

cagtggaaat ctctggcgtt gaggacagat ttaacgcttc cttgggtact taccacgatt 8520

tgctcaagat cattaaagat aaggacttcc tcgacaacga agagaacgaa gatatcttag 8580

aggacatagt tctcaccctt acgctgtttg aagatagaga gatgattgaa gagcgcctga 8640

agacttatgc tcatttgttc gatgacaaag tcatgaagca actgaaacgc cgtaggtaca 8700

ccggctgggg tagattatcg cgcaaactta ttaatggtat aagggacaag cagtcgggaa 8760

aaacgatatt ggactttctc aagagtgatg gtttcgccaa cagaaatttt atgcaactca 8820

tacacgatga cagcttaaca ttcaaggaag atatccaaaa agcacaggtg tcgggacagg 8880

gcgacagttt gcacgaacat attgctaacc tcgccggctc cccggcgata aaaaagggta 8940

tccttcagac tgtgaaagtc gtagatgaac tggtgaaggt tatgggtcgt cataaacccg 9000

agaacatagt tatcgaaatg gctagggaga atcaaacaac tcagaaggga cagaaaaact 9060

caagagaacg catgaagcgc attgaagagg gtatcaaaga gcttggcagt caaatcctga 9120

aggaacaccc tgtcgagaac acgcaacttc agaacgaaaa attgtacctc tactatctgc 9180

agaatggtag agatatgtac gtagaccaag aattggatat taaccgcctc tcagattacg 9240

acgtggatca tatagttccg cagtcattct tgaaggatga ctctatcgac aacaaagtcc 9300

tcacaagatc agacaagaac cgcggaaaat cagataatgt accctctgaa gaggtggtta 9360

aaaagatgaa aaactactgg agacagttac ttaacgctaa gttgatcacg caaagaaagt 9420

tcgataacct cacaaaggct gaacgcggcg gtttaagcga gcttgacaag gccggtttca 9480

taaaacgtca gttagtcgaa accaggcaaa ttacgaaaca cgtagcccaa atattggatt 9540

cccgcatgaa cactaaatac gatgaaaatg acaagctcat ccgtgaggtc aaagtaatta 9600

ccctgaaaag caagttggtg tccgacttca gaaaggattt ccagttctac aaagttcgcg 9660

aaatcaacaa ctaccaccat gcacatgacg cttacctgaa cgcagtcgta ggcactgcgt 9720

taattaaaaa gtaccctaaa ctggaatctg agttcgtgta cggtgactat aaagtgtacg 9780

atgttagaaa gatgatcgct aaaagcgaac aggagattgg aaaggctacc gccaagtatt 9840

tcttttactc caacatcatg aatttcttta agaccgaaat cacgttagca aatggcgaga 9900

tacgtaaaag gccacttatc gaaacaaacg gagaaactgg cgagatagtg tgggacaagg 9960

gtagagattt tgccactgtc cgcaaagtac tgtcgatgcc gcaagtgaat atcgttaaaa 10020

agaccgaagt tcaaacggga ggcttcagca aagagtccat cctgcccaag cgtaacagtg 10080

ataaattgat agctaggaaa aaggactggg atcctaaaaa gtatggtgga ttcgacagcc 10140

caactgtcgc atactccgta ttggtggttg cgaaagtcga aaaaggaaag agcaaaaagc 10200

tcaagtccgt aaaagagctg ttgggcatta ccataatgga aagatcatct ttcgagaaga 10260

atcctatcga ttttctggaa gccaagggat ataaagaggt caaaaaggac ctcataatca 10320

agttaccaaa atacagtctg ttcgaattgg agaacggcag aaaacgcatg cttgcatcag 10380

cgggtgaact gcaaaaggga aatgagttag cacttccttc taaatacgtc aacttcctgt 10440

atttggcgtc acactacgaa aaactgaagg gctctccaga agataacgag caaaagcagt 10500

tatttgtgga acagcacaaa cattaccttg acgaaattat agagcaaatc tcggagttca 10560

gtaagagagt gattttggct gacgccaatc ttgataaagt tctgtctgct tacaacaagc 10620

accgtgataa accgattagg gaacaggccg agaacatcat acatctcttc acactcacta 10680

accttggtgc acccgcagcg ttcaaatatt ttgacaccac gatagatcgt aagaggtaca 10740

ccagcacgaa agaagttttg gacgcgacac tcatccatca atcaatcacg ggcctgtacg 10800

aaaccagaat cgacctgtcc cagctcggtg gcgaccccaa gaagaagaga aaggtgtagc 10860

ggccgcatcg atactgcagg agctcggtac cttttactag tgatatccct gtgtgaaatt 10920

gttatccgct acgcgtgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 10980

tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 11040

aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 11100

attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 11160

gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcc catgggaagt tcctattccg aagttcctat 11220

tctctgaaaa gtataggaac ttcagcgatc gcagacgtcg ggatcttctg caagcatctc 11280

tatttcctga aggtctaacc tcgaagattt aagatttaat tacgtttata attacaaaat 11340

tgattctagt atctttaatt taatgcttat acattattaa ttaatttagt actttcaatt 11400

tgttttcaga aattatttta ctatttttta taaaataaaa gggagaaaat ggctatttaa 11460

atactagcct attttatttc aattttagct taaaatcagc cccaattagc cccaatttca 11520

aattcaaatg gtccagccca attcctaaat aacccacccc taacccgccc ggtttcccct 11580

tttgatccat gcagtcaacg cccagaattt ccctatataa ttttttaatt cccaaacacc 11640

cctaactcta tcccatttct caccaaccgc cacatagatc tatcctctta tctctcaaac 11700

tctctcgaac cttcccctaa ccctagcagc ctctcatcat cctcacctca aaacccaccg 11760

gggccggcca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 11820

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 11880

cggctgtcag cgcaggggag gccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 11940

aatgaacttc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 12000

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 12060

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 12120

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 12180

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 12240

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 12300

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgact catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 12360

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 12420

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 12480

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 12540

cgccttcttg acgagttctt ctgaggcgcg cc 12572

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaggtttac ccgccaata 19

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagtagacaa gtgtgtcgtg ct 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cattgcgttg tcactcgg 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgcgtagcca ttcttgga 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccaaagaccc aacctaac 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgatgccaga gccaagag 18

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcattgcttg ctttcaccct t 21

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aacctccttc acgatttcat catacc 26

Claims (6)

1.同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，其特征在于：所述MLO2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述MLO6的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述MLO12的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述同时编辑MLO2, MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的靶序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述同时编辑MLO2, MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

3.一种同时敲低烟草MLO2、MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA，其特征在于：所述多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

4.含有权利要求3所述多顺反子tRNA-sgRNA的编辑失活载体，其特征在于：所述编辑失活载体由多顺反子tRNA-sgRNA连入pORE-Cas9载体Bsa I酶切位点处而得。

5.权利要求3所述多顺反子tRNA-sgRNA或权利要求4所述编辑失活载体在制备抗白粉菌烟草品种中的应用。

6.一种制备抗白粉病烟草品种的方法，其特征在于：构建同时敲除MLO2, MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA，然后连入pORE-Cas9载体Bsa I酶切位点处获得编辑失活载体，转化烟草，筛选抗性芽，生根培养，获得T0代转基因植株，自交获得T1代转基因种子，将T1代转基因种子播种在卡那霉素抗性MS培养基中，获得T1代转基因植株，筛选基因敲除突变植株，即得抗白粉病烟草品种；所述同时编辑MLO2, MLO6和MLO12基因的多顺反子tRNA-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

Images