CN113215160A - 一种植物来源启动子、表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物来源启动子、表达载体及应用，涉及基因工程技术领域；本发明公开的植物来源的高表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其是对拟南芥原启动子的碱基进行了更改，在保持原启动子功能的基础上，又能够避免被限制性内切酶切开的问题；本发明创建的表达载体适用于单子叶和双子叶植物，解决了现有载体所采用的Ubiqutin启动子序列太长、不易转化及双子叶植物表达丰度低的问题，也解决了CaMV35S启动子单子叶植物表达丰度偏低以及潜在的安全性问题；本发明创造性的在ccdB毒性蛋白的两端，分别加入多克隆位点，既能够满足限制性内切酶的需要，也能有效的抑制载体的假阳性。

Description

一种植物来源启动子、表达载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种植物来源启动子、表达载体及 应用。

背景技术

近年来，随着经济社会的发展和人民生活水平的提高，大众对粮食产量和品质 的需求越来越高。但我国耕地面积有限，通过扩大种植面积提高产量的方法愈发困 难。选育新的品种、提高单位面积产量是解决粮食供需矛盾最有效的方式。然而， 采用传统方法进行品种选育耗时长、盲目性高、效率低，远不能满足当前农业的需 求。生物技术的快速发展为加快育种速度提供了新的选择，如基因编辑、转基因等。 然而，生物技术在品种选育中的推广和应用，亟需解决的关键问题是作物重要农艺 性状功能基因的解析。

基因功能研究是加快育种效率的前提条件，构建含有目的基因的表达载体是研究基因功能的有效手段。当前基因功能研究中用到的表达载体的启动子几乎都是病 毒来源的CaMV35S，极少数为植物来源的Ubiqutin。病毒来源的CaMV35S启动子可 能具有潜在的安全隐患，而植物来源的Ubiqutin启动子则由于其碱基序列太多， 限制了转基因的应用。

目前常用的载体构建方法有Gateway载体的同源重组法和pCambia载体的酶 切连接方法。Gateway系列载体利用载体上面的attR和attL序列，通过同源重组 酶，将片段插入到载体中，采用毒性蛋白ccdB和相应的抗生素进行筛选；pCambia 系列载体一般是采用限制性内切酶酶切，将载体片段化，然后采用T4连接酶等将 基因片段连接到载体中。上述两种载体系统中的过表达载体，所采用的启动子全为 烟草花叶病毒来源的CaMV35S，存在一定的生物安全风险；即使是植物来源的启动 子，其碱基序列长度太长，且表达丰度不够高，影响基因功能的研究。

目前，尚无植物来源且高水平表达的启动子驱动的过表达载体的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型植物来源启动子、表达载体及应用，以解决上述 现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种植物来源启动子，所述新型植物来源启动子 的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，所述植物来源启动子为与SEQ ID No：7所示的核苷酸序列具有80％ 或80％以上同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。

本发明还提供一种所述的植物来源启动子在制备重组表达载体中的应用。

进一步的，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。

进一步的，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。

本发明还提供一种包含所述的植物来源启动子的重组表达载体。

进一步的，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。

进一步的，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。

本发明还提供一种所述的重组表达载体在植物中启动目的基因表达的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的植物来源的、高表达的启动子是对拟南芥原启动子的碱基进行了更改，在保持原启动子功能的基础上，又能够避免被限制性内切酶切开的问题。

本发明中创建的载体适用于单子叶植物和双子叶植物，解决了现有载体所采用的Ubiqutin启动子序列太长、不易转化以及双子叶植物表达丰度低的问题，也解 决了CaMV35S启动子单子叶植物表达丰度偏低以及潜在安全性问题；同时，由于载 体中含有ccdB毒性蛋白，能够有效地抑制假阳性。

本发明创造性的构建了双多克隆位点，即在ccdB毒性蛋白的两端，分别加入 多克隆位点，既能够满足限制性内切酶的需要，也能有效的抑制载体的假阳性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的 一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为新的人工改造植物来源的启动子电泳；其中，泳道1为DL2000 marker； 泳道2和3分别为启动子的两个片段；泳道4为所述新的人工改造植物来源的启动 子；

图2为合成的含有双多克隆位点ccdB基因片段的电泳结果，其中，泳道1是 DL2000marker，泳道2和3是含有双多克隆位点ccdB基因的片段；

图3为植物来源启动子驱动除草剂基因basta及目的基因片段的PCR结果；其 中，泳道1为DL2000 marker，泳道2为克隆得到的含有同源重组片段的basta基 因，泳道3为驱动basta基因的植物来源启动子，泳道4为启动子连接片段，泳道 5为用于驱动目的基因的启动子片段，泳道6为pCambia3301H经XhoI+HindIII双 酶切后的大片段，泳道7为片段3的环形质粒；

图4为植物来源启动子过表达载体的示意图；

图5为所述植物来源启动子过表达载体通过转基因整合到植物基因组的示意 图；

图6为GRMZM2G125777基因的克隆及载体酶切电泳图；其中，泳道1为GRMZM2G125777CDS区PCR结果，泳道2为本发明专利创建的过表达载体采用EcoRI 酶切电泳图；

图7为基因转化拟南芥，对T0代种子幼苗进行除草剂报告基因筛选结果；

图8为应用例1创建的转基因材料中GRMZM2G125777的表达水平与CaMV35S驱动的GRMZM2G125777转基因材料的表达水平；

图9为野生型拟南芥与转基因拟南芥的生长状况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所 获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体 实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1新型植物来源启动子片段(片段0)的创建

(1)采用2×CTAB方法，提取温室种植5周龄拟南芥叶片。经微量紫外分光 光度计测定，其DNA浓度为1024ng/μL。

(2)以野生型拟南芥DNA为模板，通过PCR分别克隆启动子的两个片段。

片段0的第一部分(大小为154bp，不含adapter)所采用的引物：

SAAS0302 F：ATAGGCAACCGTGGACTTCTTC(SEQ ID NO：1)；

SAAS0305 R：TTACAGGGATAAATTCGAATCAATTCGTATATTGACTAGT(SEQ ID NO：2)。

扩增序列为如下：

ATAGGCAACCGTGGACTTCTTCACTAGCTCATCGAGATAGCAATGCCACTAGCTAATTTCTTACGTTGTATCTTATTTGTTTTACTTTGGGGCATGACATGGTTAAACCCCATCAAAGAGAAAGTGTTTCATCCAC TAGTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAA(SEQ ID NO：3)。

片段0的第二部分(大小为302bp)所采用的引物，其中引入一个错配碱基G， 用以编辑原序列中的EcoRI位点：

SAAS0305 F：ACTAGTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAA(SEQ ID NO：4)；

SAAS0303 R：ttgaggctaggttttagtagtgaag(SEQ ID NO：5)。

扩增序列如下：

ACTAGTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAAATCCTAGTTCTTAGGATGAACTGGTGTAATA AACAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTGGAATCATTCGACCACCTCAATAAACTAAAGCTACCAATTACCACAATATAGTCTTCCATATCCACTTAGATATAAAAGATAAAAGTAAACAAATATTAAATTTCATATG CACGCATAGGAAACTCATGATCTTATCTTTTAAATAGACATCTAGTTTTCTTAGGTTATAAATAGACATTT TGTCCTAGAACTTCTTCACTACTAAAACCTAGCCTCAA(SEQ ID NO：6)。

(3)将上述片段采用生工生物的DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(Order NO.B110092)回收，回收浓度分别为35ng/μL和45ng/μL(具体方法参考其产品说 明书)。

(4)采用touch down PCR方法，将上述2个回收产物连接，创建出一个新的 人工改造植物来源的启动子(片段0)。连接体系与条件如表1所示：

表1连接体系与条件

电泳结果如图1所示，其中，泳道1是DL2000 marker，泳道2和3分别为启 动子的两个片段，泳道4是所述新的人工改造植物来源的启动子(引入突变碱基的 人工启动子)。

新的人工改造植物来源的启动子的核苷酸序列(SEQIDNO：7)：

ATAGGCAACCGTGGACTTCTTCACTAGCTCATCGAGATAGCAATGCCACTAGCTAATTTCTTACGTTGTATCTTATTTGTTTTACTTTGGGGCATGACATGGTTAAACCCCATCAAAGAGAAAGTGTTTCATCCACTA GTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAAATCCTAGTTCTTAGGATGAACTGGTGTAATAAACA GCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTGGAATCATTCGACCACCTCAATAAACTAAAGCTACCAATTACC ACAATATAGTCTTCCATATCCACTTAGATATAAAAGATAAAAGTAAACAAATATTAAATTTCATATGCACG CATAGGAAACTCATGATCTTATCTTTTAAATAGACATCTAGTTTTCTTAGGTTATAAATAGACATTTTGTC CTAGAACTTCTTCACTACTAAAACCTAGCCTCAA。

实施例2含有ccdB蛋白的双多克隆位点片段的创建

以pXSN-HA载体中的ccdB毒性蛋白基因为参考，在该基因起始密码子和终止 密码子的两端分别添加多克隆位点，交由青岛擎科生物进行基因合成，合成的序列 (SEQ IDNO：8)如下(小写字母为添加的多克隆位点序列，下同)： gaattcgagctcggtacccggggatcct ctagactgcagaagcttATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAA AAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGG TGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATC GGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGT GGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAgaattcgagctcggtacccggggatcctctagactgcagaagctt。

实施例3植物来源启动子驱动除草剂抗性基因片段的构建

(1)将pCambia3301H载体采用XhoI和HindIII双酶切，采用异丙醇沉淀方 法回收6908bp的载体骨架片段；

(2)除草剂基因克隆，同时添加adapter，所采用的正向引物为：F— attattatggagaaaCTCGAGTCAAATCTCGGTGAC(SEQ ID NO：9)，反向引物为R-- aaaacctagcctcaaCTCGAGTCTACCATGAGCC(SEQ ID NO：10)，所采用的模板为 pCambia3301H，通过PCR扩增，所获得的片段大小为552bp(SEQ ID NO：11)(结 果如图3所示)。

PCR体系与反应条件如表3所示：

表3 PCR体系与反应条件

SEQ ID NO：11序列如下：

CTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCC GAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCT GTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAG ACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCC GGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCC ACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTG CAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGCTCATGGTAGA CTCGAG。

(3)驱动除草剂基因的启动子的克隆，所采用的正向引物为：F-- catggtagactcgagTTGAGGCTAGGTTTTAGTAGTGAAGA(SEQ ID NO：12)，反向引物为R- -ggggagaggcggtttATAGGCAACCGTGGACTTCTTC(SEQ ID NO：13)，所采用的模板为前 面所述片段0，通过PCR扩增，获得的片段大小为456bp(SEQ ID NO：14)。PCR体 系及方法同步骤2。

SEQ ID NO：14序列如下：

TTGAGGCTAGGTTTTAGTAGTGAAGAAGTTCTAGGACAAAATGTCTATTTATAACCTAAGAAAACTAGATG TCTATTTAAAAGATAAGATCATGAGTTTCCTATGCGTGCATATGAAATTTAATATTTGTTTACTTTTATCTTTTATATCTAAGTGGATATGGAAGACTATATTGTGGTAATTGGTAGCTTTAGTTTATTGAGGTGGTCGAAT GATTCCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGTTTATTACACCAGTTCATCCTAAGAACTAGGATTT ACAGGGATAAATTCGAATCAATTCGTATATTGACTAGTGGATGAAACACTTTCTCTTTGATGGGGTTTAAC CATGTCATGCCCCAAAGTAAAACAAATAAGATACAACGTAAGAAATTAGCTAGTGGCATTGCTATCTCGATGAGCTAGTGAAGAAGTCCACGGTTGCCTAT。

(4)两个启动子之间的连接片段克隆，所采用的正向引物为F— tccacggttgcctatAAACCGCCTCTCCCCGC(SEQ ID NO：15)，反向引物为R— tccacggttgcctatCAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGT(SEQ ID NO：16)，PCR采用的模板 为pCambia3301H，克隆片段大小为222bp(SEQ ID NO：17)。PCR体系及方法同步 骤2。

SEQ ID NO：17：

AAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC GGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTG。

(5)正向启动子的克隆，所采用的正向引物为F— catgattacgaattgATAGGCAACCGTGGACTTCTTC(SEQ ID NO：18)，反向引物为R— accgagctcgaattcTTGAGGCTAGGTTTTAGTAGTGAAGA(SEQ ID NO：19)，所采用的模板 为片段0，PCR目的片段大小为456bp(SEQ ID NO：20)。PCR体系及方法同步骤 2)。

SEQ ID NO：20：

ATAGGCAACCGTGGACTTCTTCACTAGCTCATCGAGATAGCAATGCCACTAGCTAATTTCTTACGTTGTAT CTTATTTGTTTTACTTTGGGGCATGACATGGTTAAACCCCATCAAAGAGAAAGTGTTTCATCCACTAGTCAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAAATCCTAGTTCTTAGGATGAACTGGTGTAATAAACAGCAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTGGAATCATTCGACCACCTCAATAAACTAAAGCTACCAATTACCACAA TATAGTCTTCCATATCCACTTAGATATAAAAGATAAAAGTAAACAAATATTAAATTTCATATGCACGCATA GGAAACTCATGATCTTATCTTTTAAATAGACATCTAGTTTTCTTAGGTTATAAATAGACATTTTGTCCTAGAACTTCTTCACTACTAAAACCTAGCCTCAA。

(6)采用基因片段同源重组的方法，将上述6个片段连接成环形质粒。具体 体系如下：

表4体系

(7)将反应完成的体系，采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞dB3.1，孵育1 小时后，涂布于硫酸卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养18小时。

(8)挑取单克隆，接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床，220rpm，培养18小时，提取质粒。保存菌液，提取质粒，完成植物来源启动子过 表达载体的构建，所述植物来源启动子过表达载体的示意图如图4所示，核苷酸序 列如SEQ ID NO：21所示。所述植物来源启动子过表达载体能够通过转基因整合到 植物基因组，示意图如图5所示。

SEQ ID NO：21

CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTGATAGGCAACCGTGGACT TCTTCACTAGCTCATCGAGATAGCAATGCCACTAGCTAATTTCTTACGTTGTATCTTATTTG TTTTACTTTGGGGCATGACATGGTTAAACCCCATCAAAGAGAAAGTGTTTCATCCACTAGT CAATATACGAATTGATTCGAATTTATCCCTGTAAATCCTAGTTCTTAGGATGAACTGGTGTA ATAAACAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTGGAATCATTCGACCACCTCAATAA ACTAAAGCTACCAATTACCACAATATAGTCTTCCATATCCACTTAGATATAAAAGATAAAAG TAAACAAATATTAAATTTCATATGCACGCATAGGAAACTCATGATCTTATCTTTTAAATAGA CATCTAGTTTTCTTAGGTTATAAATAGACATTTTGTCCTAGAACTTCTTCACTACTAAAACC TAGCCTCAAGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGACTGCAGAAGCTTATGCAG TTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTG ATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGT CAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCA TGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATC TCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAG AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGACTGCAGAAGCTTTACAACCACGTGCACC ACCACCACCACCACTGAGTTAACGTGTGAATTACAGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGAT CGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGA TTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAA AACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG ATCGGGAATTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAA GAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCAT TTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCT CCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACAT GTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCT TGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACC AGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCC GAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCT ACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCG ACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCA GAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGG CATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGC CAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGC ACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTT GGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCAC CGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGG CGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAG GACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTG TTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCT GATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCG TCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATG ATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTA ACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAA CTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGG GCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGA CCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGG CGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGC CAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTG AGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACG CGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCC CGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGA ATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAAT CAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAA GTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGA AGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGC AGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGA GGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGG AGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCA CTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACA AATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCC AGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGAT CGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCC GCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCG CGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGC TGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGG CCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCG AATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCA CACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGA CCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGA AGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTAC AAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTG GATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATT ACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGG CAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAG AGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGT ACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAAC CTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATT GCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGG GAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACA TTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCG CCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTC TGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCC TACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCC TACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGG CGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGAC ACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAA GCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGA GAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCA GGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAG CGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAG GAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAG TCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCC TTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCA GCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAA GTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAA GCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTG GTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG AAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAG GGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTT TCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCC GATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCC GCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCT CCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCA TACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGG CCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAG GGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATA ATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCAC TCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCA GCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTA TACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTA GCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTC CGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATAC CCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCT TAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCG ACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAAT CAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCT TCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGAC GCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTC GGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG ACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGG GGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTA TTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCT ATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGT CAAATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCG CGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATG ACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG CGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCG TCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGC CGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTC CACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGG TTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGG GCGTCGTTCTGGGCTCATGGTAGACTCGAGTTGAGGCTAGGTTTTAGTAGTGAAGAAGTT CTAGGACAAAATGTCTATTTATAACCTAAGAAAACTAGATGTCTATTTAAAAGATAAGATC ATGAGTTTCCTATGCGTGCATATGAAATTTAATATTTGTTTACTTTTATCTTTTATATCTAAGT GGATATGGAAGACTATATTGTGGTAATTGGTAGCTTTAGTTTATTGAGGTGGTCGAATGATT CCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGTTTATTACACCAGTTCATCCTAAGAACTAGG ATTTACAGGGATAAATTCGAATCAATTCGTATATTGACTAGTGGATGAAACACTTTCTCTTT GATGGGGTTTAACCATGTCATGCCCCAAAGTAAAACAAATAAGATACAACGTAAGAAATT AGCTAGTGGCATTGCTATCTCGATGAGCTAGTGAAGAAGTCCACGGTTGCCTATAAACCG CCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG AAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCAC。

构建的植物来源启动子过表达载体中含有6种常见的限制性内切酶位点EcoRI、SacI、BamHI、XbaI、PstI和HindIII。植物来源启动子过表达载体的使用方法为：

(1)T4 DNA连接酶连接方法：采用其中的任意1种或2种限制性内切酶对载 体酶切，形成黏性末端，将载体线性化；同时在目的基因的两端分别加上对应的限 制性内切酶位点，将产物采用相同的限制性内切酶酶切，形成黏性末端；将两个含 有黏性末端的片段采用T4 DNA连接酶连接即可。

(2)同源重组酶连接方法：采用其中的任意1种或2种限制性内切酶对载体 酶切，形成黏性末端，将载体线性化；在目的基因的两端加上15-20bp的adapter； 通过同源重组酶将上述两个片段连接在一起即可。

应用例1

(1)在玉米中克隆GRMZM2G125777的CDS，所采用的正向引物为：5'- TAGCCTCAACTCGAGATGGTGTTCCGGAAAGGCC-3'(SEQ ID NO：22)，反向引物为5'- CGGGTACCGAGCTCGTTTTTTAACTTGGGTTTTCTTCAAA-3'(SEQ ID NO：23)，PCR采用的模 板为玉米B73自交系叶片提取的RNA(提取方法采用的是Trizol试剂盒)。经PCR 扩增，获得了2595bp的基因片段。

(2)将本发明的载体采用EcoRI进行单酶切，采用异丙醇沉淀方法回收大片 段。GRMZM2G125777基因的克隆及载体酶切电泳图如图6所示。

(3)采用全式金生物的2×Seamless cloning Master Mix同源重组酶，将上 述两个片段在50℃条件下反应50分钟(体系如表7所示)，转化大肠杆菌DH5α， 涂布于含有硫酸卡那霉素的培养基上，37℃培养16小时；挑取单克隆于液体LB培 养基中，在37℃摇床培养16小时，提取质粒，完成载体构建。

表7体系与方法

(4)将上述质粒转化土壤农杆菌GV3101。具体步骤如下，从-80℃超低温冰箱 取出农杆菌感受态细胞GV3101，冰上融化，加2.5μl质粒，冰浴30min。液氮速 冻5min，37℃水浴5min。加800μl YEP(无抗性)，28℃，200rpm震荡3h。将 菌液涂布至YEP固体培养基(卡那与利福平抗性)。28℃倒置培养2-3天。挑单克 隆菌落于5ml液体YEP培养基(卡那与利福平抗性)中，28℃震荡培养16h，PCR 鉴定阳性菌落并保存菌液。

(5)侵染拟南芥。取含有重组载体的农杆菌液200μl,接种于20mlYEP液体 培养基(卡那与利福平抗性)。2℃震荡培养至OD600＝0.8-1。6000rpm离心10min， 收集菌体。5％(m/v)蔗糖溶液重悬沉淀，再次离心收集菌体。弃上清，用5％(m/v) 蔗糖溶液(含0.05％Silwet L-77)溶解沉淀至OD＝0.6-0.8，用作浸染液。吸取浸 染液，滴至拟南芥花骨朵，重复一次，过夜黑暗处理。去袋培养至成熟收种子。

(6)Basta筛选转基因阳性植株，用0.1％Basta溶液喷洒T1代转基因拟南芥 材料，存活下来的即为阳性转基因材料。喷洒T3代转基因材料，无分离者即为纯 合转基因材料。基因转化拟南芥，对T0代种子幼苗进行除草剂报告基因筛选结果 如图7所示。

(7)通过定量PCR检测CaMV35S驱动的GRMZM2G125777转基因材料(山东大 学馈赠)与本实例中的创建的转基因材料中GRMZM2G125777的表达水平。发现其表 达水平约为CaMV35S驱动的2倍左右，拟南芥的抗倒性明显增强。转基因的拟南芥 茎秆强度高，能够直立生长，野生型拟南芥茎秆强度弱，不能够完全直立生长(图 9)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术 方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 山东省农业科学院

<120> 一种植物来源启动子、表达载体及应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataggcaacc gtggacttct tc 22

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacagggat aaattcgaat caattcgtat attgactagt 40

<210> 3

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataggcaacc gtggacttct tcactagctc atcgagatag caatgccact agctaatttc 60

ttacgttgta tcttatttgt tttactttgg ggcatgacat ggttaaaccc catcaaagag 120

aaagtgtttc atccactagt caatatacga attgattcga atttatccct gtaa 174

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actagtcaat atacgaattg attcgaattt atccctgtaa 40

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgaggctag gttttagtag tgaag 25

<210> 6

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actagtcaat atacgaattg attcgaattt atccctgtaa atcctagttc ttaggatgaa 60

ctggtgtaat aaacagcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tctggaatca ttcgaccacc 120

tcaataaact aaagctacca attaccacaa tatagtcttc catatccact tagatataaa 180

agataaaagt aaacaaatat taaatttcat atgcacgcat aggaaactca tgatcttatc 240

ttttaaatag acatctagtt ttcttaggtt ataaatagac attttgtcct agaacttctt 300

cactactaaa acctagcctc aa 322

<210> 7

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataggcaacc gtggacttct tcactagctc atcgagatag caatgccact agctaatttc 60

ttacgttgta tcttatttgt tttactttgg ggcatgacat ggttaaaccc catcaaagag 120

aaagtgtttc atccactagt caatatacga attgattcga atttatccct gtaaatccta 180

gttcttagga tgaactggtg taataaacag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatctgga 240

atcattcgac cacctcaata aactaaagct accaattacc acaatatagt cttccatatc 300

cacttagata taaaagataa aagtaaacaa atattaaatt tcatatgcac gcataggaaa 360

ctcatgatct tatcttttaa atagacatct agttttctta ggttataaat agacattttg 420

tcctagaact tcttcactac taaaacctag cctcaa 456

<210> 8

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct agactgcaga agcttatgca gtttaaggtt 60

tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt 120

gacacgcccg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa 180

gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc 240

accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac 300

cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata agaattcgag 360

ctcggtaccc ggggatcctc tagactgcag aagctt 396

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attattatgg agaaactcga gtcaaatctc ggtgac 36

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaacctagc ctcaactcga gtctaccatg agcc 34

<210> 11

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcgagtcaa atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc 60

cagctgccag aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat 120

gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc 180

gatgacagcg accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta 240

gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc 300

cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc 360

gccgtccacc tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt 420

ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg 480

gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg 540

gcgtcgttct gggctcatgg tagactcgag 570

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catggtagac tcgagttgag gctaggtttt agtagtgaag a 41

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggagaggc ggtttatagg caaccgtgga cttcttc 37

<210> 14

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgaggctag gttttagtag tgaagaagtt ctaggacaaa atgtctattt ataacctaag 60

aaaactagat gtctatttaa aagataagat catgagtttc ctatgcgtgc atatgaaatt 120

taatatttgt ttacttttat cttttatatc taagtggata tggaagacta tattgtggta 180

attggtagct ttagtttatt gaggtggtcg aatgattcca gatttttttt tttttttttt 240

tttttgctgt ttattacacc agttcatcct aagaactagg atttacaggg ataaattcga 300

atcaattcgt atattgacta gtggatgaaa cactttctct ttgatggggt ttaaccatgt 360

catgccccaa agtaaaacaa ataagataca acgtaagaaa ttagctagtg gcattgctat 420

ctcgatgagc tagtgaagaa gtccacggtt gcctat 456

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tccacggttg cctataaacc gcctctcccc gc 32

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccacggttg cctatcaatt cgtaatcatg gtcatagctg t 41

<210> 17

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 60

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 120

ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 180

caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tg 222

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

catgattacg aattgatagg caaccgtgga cttcttc 37

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accgagctcg aattcttgag gctaggtttt agtagtgaag a 41

<210> 20

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ataggcaacc gtggacttct tcactagctc atcgagatag caatgccact agctaatttc 60

ttacgttgta tcttatttgt tttactttgg ggcatgacat ggttaaaccc catcaaagag 120

aaagtgtttc atccactagt caatatacga attgattcga atttatccct gtaaatccta 180

gttcttagga tgaactggtg taataaacag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatctgga 240

atcattcgac cacctcaata aactaaagct accaattacc acaatatagt cttccatatc 300

cacttagata taaaagataa aagtaaacaa atattaaatt tcatatgcac gcataggaaa 360

ctcatgatct tatcttttaa atagacatct agttttctta ggttataaat agacattttg 420

tcctagaact tcttcactac taaaacctag cctcaa 456

<210> 21

<211> 9002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 60

aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt gataggcaac cgtggacttc 120

ttcactagct catcgagata gcaatgccac tagctaattt cttacgttgt atcttatttg 180

ttttactttg gggcatgaca tggttaaacc ccatcaaaga gaaagtgttt catccactag 240

tcaatatacg aattgattcg aatttatccc tgtaaatcct agttcttagg atgaactggt 300

gtaataaaca gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatctgg aatcattcga ccacctcaat 360

aaactaaagc taccaattac cacaatatag tcttccatat ccacttagat ataaaagata 420

aaagtaaaca aatattaaat ttcatatgca cgcataggaa actcatgatc ttatctttta 480

aatagacatc tagttttctt aggttataaa tagacatttt gtcctagaac ttcttcacta 540

ctaaaaccta gcctcaagaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga ctgcagaagc 600

ttatgcagtt taaggtttac acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg 660

tacagagtga tattattgac acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac 720

gtctgctgtc agataaagtc tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa 780

gctggcgcat gatgaccacc gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag 840

tggctgatct cagccaccgc gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg 900

gaatataaga attcgagctc ggtacccggg gatcctctag actgcagaag ctttacaacc 960

acgtgcacca ccaccaccac cactgagtta acgtgtgaat tacaggtgac cagctcgaat 1020

ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt 1080

cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg 1140

taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt 1200

taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg 1260

tcatctatgt tactagatcg ggaattaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg 1320

taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataacggata tttaaaaggg cgtgaaaagg 1380

tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag 1440

tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc 1500

gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc 1560

cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata aagtagaata cttgcgacta 1620

gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg 1680

cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg 1740

caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag 1800

gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg accaggctag accgcctggc 1860

ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct 1920

gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac caccacgccg gccggccgca tggtgttgac 1980

cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg 2040

gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc 2100

acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc 2160

tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca cttgagcgca gcgaggaagt 2220

gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag gacgcattga ccgaggccga 2280

cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac 2340

ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg 2400

tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt 2460

ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc 2520

cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg 2580

tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg 2640

tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc 2700

tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg 2760

attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga 2820

ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc 2880

aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc 2940

agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca 3000

ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca 3060

cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt 3120

cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg 3180

aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat 3240

caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag 3300

tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac 3360

gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat 3420

gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct 3480

accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg 3540

gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa 3600

cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa 3660

cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc 3720

gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa 3780

cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc 3840

aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc 3900

gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc 3960

agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg 4020

atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc 4080

agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac 4140

cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac 4200

gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc 4260

tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc 4320

cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc 4380

gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc 4440

acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc 4500

ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga 4560

tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt 4620

ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag 4680

gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca 4740

tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa 4800

ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 4860

gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg 4920

taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt 4980

attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa 5040

gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt 5100

cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca 5160

gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg 5220

cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 5280

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 5340

tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 5400

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 5460

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 5520

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 5580

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 5640

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 5700

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 5760

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 5820

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 5880

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 5940

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6000

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6060

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6120

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6180

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6240

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6300

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgca ttctaggtac 6360

taaaacaatt catccagtaa aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc 6420

agtaagtcaa aaaatagctc gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg 6480

acgcagaagg caatgtcata ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag 6540

ccacttactt tgccatcttt cacaaagatg ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag 6600

acaagttcct cttcgggctt ttccgtcttt aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta 6660

aatggagtgt cttcttccca gttttcgcaa tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag 6720

taatccaatt cggctaagcg gctgtctaag ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg 6780

atggagtgaa agagcctgat gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt 6840

tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc 6900

cagccatcat gccgttcaaa gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat 6960

agcatcatgt ccttttcccg ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc 7020

atttttaaat ataggttttc attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt 7080

ccttccgtat cttttacgca gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt 7140

ctcattttag ccatttatta tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag 7200

aagctaatta taacaagacg aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat 7260

accagaaaac agctttttca aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg 7320

agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac 7380

atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc 7440

gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc 7500

gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg 7560

gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca 7620

acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg 7680

gatctggatt ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta 7740

ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc 7800

tataggaacc ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga 7860

gtcaaatctc ggtgacgggc aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct 7920

gccagaaacc cacgtcatgc cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc 7980

ggggggcata tccgagcgcc tcgtgcatgc gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga 8040

cagcgaccac gctcttgaag ccctgtgcct ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg 8100

tggagcccag tcccgtccgc tggtggcggg gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc 8160

agtcgtaggc gttgcgtgcc ttccaggggc ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt 8220

ccacctcggc gacgagccag ggatagcgct cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact 8280

cctgcggttc ctgcggctcg gtacggaagt tgaccgtgct tgtctcgatg tagtggttga 8340

cgatggtgca gaccgccggc atgtccgcct cggtggcacg gcggatgtcg gccgggcgtc 8400

gttctgggct catggtagac tcgagttgag gctaggtttt agtagtgaag aagttctagg 8460

acaaaatgtc tatttataac ctaagaaaac tagatgtcta tttaaaagat aagatcatga 8520

gtttcctatg cgtgcatatg aaatttaata tttgtttact tttatctttt atatctaagt 8580

ggatatggaa gactatattg tggtaattgg tagctttagt ttattgaggt ggtcgaatga 8640

ttccagattt tttttttttt tttttttttt gctgtttatt acaccagttc atcctaagaa 8700

ctaggattta cagggataaa ttcgaatcaa ttcgtatatt gactagtgga tgaaacactt 8760

tctctttgat ggggtttaac catgtcatgc cccaaagtaa aacaaataag atacaacgta 8820

agaaattagc tagtggcatt gctatctcga tgagctagtg aagaagtcca cggttgccta 8880

taaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 8940

cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 9000

ac 9002

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tagcctcaac tcgagatggt gttccggaaa ggcc 34

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgggtaccga gctcgttttt taacttgggt tttcttcaaa 40

Claims (9)

1.一种植物来源启动子，其特征在于，所述植物来源启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。

2.根据权利要求1所述的植物来源启动子，其特征在于，所述植物来源启动子为与SEQID No：7所示的核苷酸序列具有80％或80％以上同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。

3.一种如权利要求1或2所述的植物来源启动子在制备重组表达载体中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。

6.一种包含权利要求1或2所述的植物来源启动子的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有ccdB毒性蛋白。

8.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有驱动除草剂基因的启动子。

9.一种如权利要求6所述的重组表达载体在植物中启动目的基因表达的应用。

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