CN103173486A - 便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用 Download PDF

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CN103173486A
CN103173486A CN2013100793511A CN201310079351A CN103173486A CN 103173486 A CN103173486 A CN 103173486A CN 2013100793511 A CN2013100793511 A CN 2013100793511A CN 201310079351 A CN201310079351 A CN 201310079351A CN 103173486 A CN103173486 A CN 103173486A
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China
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pjwwd
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carrier
primer
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CN2013100793511A
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English (en)
Inventor
季静
王罡
吴疆
刁进进
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Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Abstract

本发明涉及一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。该载体按照如下步骤获得：用PCR的方法从出发表达载体pGreenII0229，pCAMBIA3300-35S-HAK，pGH-X6145G上（购自上海生工），pCAMBIA2300，上克隆1#、2#、3#、4#和5#片段。用NotI和MIUI分别酶切1#和2#片段并连接得到载体pJWWD-12；用Xho I分别酶切pJWWD-12和3#片段并连接得到载体pJWWD-123；用SacI分别酶切载体pJWWD-123和4#片段并连接得到表达载体pJWWD-1234；用Pst I分别酶切pJWWD-1234和5#片段并连接最终得到表达载体本pJWWD-1718。本发明可方便快捷插入目的基因，目的基因可通过TA克隆插入到本载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。

Description

便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法，具体为便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。 
背景技术
20世纪以来，通过转基因技术培育植物新品种，从而提高产量和抗逆性能，被认为是一种对植物定向改造有效的途径。目前，转基因棉花、大豆、玉米、油菜等已经得到了广泛的种植，为农业种植领域带来革命性的改革，也为农业增收带来了新的曙光。 
植物表达载体是外源基因在植物细胞中进行扩增和表达的媒介，所以也称作工程载体。但在科学研究中构建一种高效的植物表达载体并非易事。中间需要经过质粒载体和连接片段的双酶切、纯化、连接、转化、验证等一系列步骤，费时费力。 
鉴于TA克隆载体的连接模式，我们构建了这种便利连接目的基因的新型植物表达载体。在操作过程中只要选用Taq-Plus酶使目的片段的PCR产物末端带有游离的腺嘌呤A就可以直接用来做连接反应，省去了连接片段酶切、回收、纯化等一系列中间步骤，大大提高了我们实验的效率。 
在提高连接效率的基础上，我们还考虑到转基因生物安全性的问题。通常使用的植物表达载体携带有编码抗生素的抗性基因，用于构建载体过程中进行筛选，同时可以在转入植物后对转化植株进行筛选。当转化植株被筛选出来后，这些抗生素抗性基因在基因组中的存在就显得没有意义了，并且它们会随着转基因植物的繁殖而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。 
为了在转基因农作物中得到广泛应用，载体中不能含有抗生素抗性基因，因而用抗除草剂基因（bar）作为转化植株的筛选基因，可以有效避免抗生素抗性基因给人和牲畜健康带来的危害。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，目的基因可通过简单的TA克隆连接入载体，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。 
本发明所提供的植物表达载体按照如下步骤得到：出发的原始表达载体为pGreenII0229，pCAMBIA2300，pCAMBIA3300-35S-HAK，pGH-X6145G上（购自上海生工），分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段，分别含有LB和RB（RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部），且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段（3#片段）；从pGH-X6145G上克隆多克隆位点片段（4#片段）；从pCAMBIA2300（实验室保存）上克隆35S启动子（5#片段）最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD-1718，新构建的载体上作为载体标签的是凝血酶基因和大豆蛋白肽基因。 
其中，所述1#片段序列如序列SEQ ID NO：1所示，所述2#片段序列如序列SEQ ID NO：2所示，所述3#片段序列如序列SEQ ID NO：3所示。 
其中，所述RB序列如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB序列如序列SEQ ID NO：5所示，所述凝血酶基因（thrombin）序列如序列SEQ ID NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因（soybean peptide）序列如序列SEQ ID NO：7所示。连接4#片段测序结果如序列SEQ ID NO：8所示，所述5#片段序列如序列SEQ ID NO：9所示。 
专利中所用pGreenII0229，pCAMBIA3300，pCAMBIA2300均从CAMBIA公司购买，pCAMBIA3300-35S-HAK为本实验室构建（《HAK基因对玉米的遗传转化及其耐盐性研究》），凝血酶基因和大豆蛋白肽为公开的序列，具体可参考文献：Sequence of a human transcript expressed in T-lymphocytes and encoding a fibrinogen-like protein和A novel methionine-rich protein from soybean cotyledon: cloning and characterization of cDNA (accession no. AF005030)。 
本发明所构建的植物表达载体，还可以按照包括如下步骤得到： 
（1）用PCR的方法以载体pGreenII0229为模版克隆1#片段，切胶回收2kb片段；同样以载体pGreenII0229为模版克隆2#片段，切胶回收1600bp片段，这两个片段两段都分别带有Not I和MIU I的酶切位点；
（2）1#和2#片段用Not I和MIU I酶切并回收，连接这两个片段，得到载体pJWWD-12；
（3）以载体pCAMBIA3300-35S-HAK为模版克隆得到3#片段，切胶回收3#片段，两端带有Xho I酶切位点；
（4）用Xho I分别酶切pJWWD-12和3#片段并回收，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWWD-123；
（5）以pGH-X6145G上（购自上海生工）为模版克隆4#片段（其中含有多克隆位点），切胶回收300bp片段；
（6）用Sac I分别酶切载体pJWWD-123和4#片段并回收，连接切开的载体和4#片段，得到载体pJWWD-1234。
（7）以pCAMBIA2300为模版克隆35S启动子（5#片段），切胶回收800bp片段； 
（8）用Pst I分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段并回收，连接切开的载体和5#片段得到载体pJWWD-1718
上述任一所述构建的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用属于本发明的保护范围。
上述任一所述构建的表达载体在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。 
上述任一所述构建的表达载体在大肠杆菌中转化的应用也属于本发明的保护范围。
所述的应用中所述植物为为所有的单子叶和双子叶植物例如：水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵等。 
本发明植物表达载体含有LB、RB、凝血酶基因、大豆蛋白肽基因和bar基因，并且在多克隆位点含有两个Xcm I酶切位点，可以方便地进行TA克隆。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，目的基因可通过简单的TA克隆连接入载体，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。 
  
附图说明
图1为载体pGreenII0229。 
图2为载体pJWW0230中35S-HAK片段。 
图3为载体pJWWD-1234。 
图4为载体pJWWD-1234的1#、2#、3#片段PCR结果。 
图5为载体pJWWD-1234的4#片段测序图。 
图6为载体pCAMBIA2300。 
图7为载体pJWWD-1718。 
图8为载体pJWWD-1718的35S酶切验证图。 
图9为载体pJWWD-1718-EPSPS中EPSPS基因片段PCR验证图。 
图10为转EPSPS基因大豆的PCR验证图。 
图11为载体pJWWD-1718-LYCB中LYCB基因PCR验证如图。 
图12为转LYCB基因玉米的PCR验证图。 
具体实施方式
下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。 
  
实施例1
载体pJWWD-12的构建
    ①以质粒pGreenII0229为模板，以1片段F（正向）引物（SEQ ID NO：10）和1片段R（反向）引物（SEQ ID NO：11）为引物，用pfu酶克隆载体1#片段，单管PCR反应体系为：
pfu buffer（10×） 2.5
Figure 2013100793511100002DEST_PATH_IMAGE001
L
dNTP（2.5mmol/L） 2.0 L
1#F primer 0.5
Figure 430061DEST_PATH_IMAGE001
L
1#R primer 0.5
Figure 209798DEST_PATH_IMAGE001
L
pfu enzymes 0.25
Figure 605007DEST_PATH_IMAGE001
L
pGreenII0229 1.0
Figure 419380DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 18.25
Figure 241842DEST_PATH_IMAGE001
L
一共配制8管，用于切胶回收。反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，4.1min；72℃，10min，30个循环。按照Takara公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收2.0kb大小的片段。
    ②以质粒pGreenII0229为模板，以2片段F引物（SEQ ID NO：12）、2片段R引物（SEQ ID NO：13）为引物，用pfu酶克隆载体2#片段，单管PCR反应体系为： 
pfu buffer（10×） 2.5
Figure 695826DEST_PATH_IMAGE001
L
dNTP（2.5mmol/L） 2.0 L
2#F primer 0.5
Figure 563605DEST_PATH_IMAGE001
L
2#R primer 0.5
Figure 556969DEST_PATH_IMAGE001
L
pfu enzymes 0.25
Figure 311298DEST_PATH_IMAGE001
L
pGreenII0229 1.0
Figure 48310DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 18.25
Figure 509378DEST_PATH_IMAGE001
L
一共配制8管，用于切胶回收。反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，3.2min；72℃，10min，30个循环。按照Takara公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1.6kb大小的片段。
    ③用Not I和MIU I酶切切胶回收的1#和2#片段，并用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒纯化两个片段。反应体系为： 
Buffer O（10×） 20
Figure 939223DEST_PATH_IMAGE001
L
Fermentas Not I 2
Figure 180848DEST_PATH_IMAGE001
L
Fermentas MIU I 2
Figure 455972DEST_PATH_IMAGE001
L
1#片段 30
Figure 99443DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 146 L
 
Buffer O（10×） 20 L
Fermentas Not I 2
Figure 930761DEST_PATH_IMAGE001
L
Fermentas MIU I 2
Figure 428738DEST_PATH_IMAGE001
L
2#片段 30
Figure 200385DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 146 L
反应条件：37℃，16h。
    ④用北京全式金生物技术有限公司T4 DNA Ligase连接酶切回收的1#和2#片段，并转化DH5α大肠杆菌。反应体系： 
 
1#片段 3
Figure 236791DEST_PATH_IMAGE001
L
2#片段 3
Figure 589275DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase buffer（5×） 2
Figure 531823DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase 1
Figure 969758DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 1
Figure 390375DEST_PATH_IMAGE001
L
反应条件：22℃，30min。转化DH5α大肠杆菌按照说明书转化步骤操作，得到载体pJWWD-12。
验证结果如图4所示，1为Marker III，2为阴性对照，3为1#片段阳性对照，4为载体1#片段PCR结果；5为阴性对照，6为2#片段阳性对照，7为载体2#片段PCR结果。 
实施例2 
载体pJWWD-123的构建
①    以质粒pCAMBIA3300-35S-HAK为模板，以3片段F引物（SEQ ID NO：14）和3片段R引物（SEQ ID NO：15）为引物，用pfu酶克隆载体3#片段，单PCR管反应体系为：
pfu buffer（10×） 2.5
Figure 862945DEST_PATH_IMAGE001
L
dNTP（2.5mmol/L） 2.0
Figure 897766DEST_PATH_IMAGE001
L
3#F primer 0.5
Figure 822996DEST_PATH_IMAGE001
L
3#R primer 0.5
Figure 47304DEST_PATH_IMAGE001
L
pfu enzymes 0.25
Figure 108801DEST_PATH_IMAGE001
L
pJWW0230 1.0
Figure 393152DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 18.25
Figure 805679DEST_PATH_IMAGE001
L
一共配制8管，用于切胶回收。反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2.5min；72℃，10min，30个循环。按照Takara公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收1kb大小的片段。
②    用Xho I分别酶切pJWWD-12和3#片段，并用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒纯化两个片段。反应体系为： 
 
Green Buffer（10×） 20
Figure 771361DEST_PATH_IMAGE001
L
FastDigest Xho I 2
Figure 952943DEST_PATH_IMAGE001
L
pJWWD-12 30
Figure 142616DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 148
Figure 42439DEST_PATH_IMAGE001
L
Green Buffer（10×） 20
Figure 608550DEST_PATH_IMAGE001
L
FastDigest Xho I 2
Figure 910218DEST_PATH_IMAGE001
L
3#片段 30
Figure 962137DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 148 L
反应条件：200
Figure 284770DEST_PATH_IMAGE001
L体系，37℃，30min，切胶回收。
③    北京全式金生物技术有限公司T4 DNA Ligase连接pJWWD-12和3#片段并转化DH5α大肠杆菌。反应体系： 
pJWWD-12 1
Figure 719058DEST_PATH_IMAGE001
L
3#片段 5 L
T4 DNA Ligase buffer（5×） 2
Figure 406708DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase 1
Figure 953227DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 1 L
反应条件：22℃，30min。转化DH5α大肠杆菌按照说明书转化步骤操作，得到载体pJWWD-123。
验证结果如图4所示，8为阴性对照，9为3#片段阳性对照，10为载体3#片段PCR结果。 
实施例3 
       载体pJWWD-1234的构建
①    以质粒pGH-X6145G为模板，以4片段F引物（SEQ ID NO：16）和4片段R引物（SEQ ID NO：17）为引物，用pfu酶克隆载体4#片段，单PCR管反应体系为：
pfu buffer（10×） 2.5
Figure 137401DEST_PATH_IMAGE001
L
dNTP（2.5mmol/L） 2.0
Figure 105357DEST_PATH_IMAGE001
L
4#F primer 0.5
Figure 201489DEST_PATH_IMAGE001
L
4#R primer 0.5 L
pfu enzymes 0.25
Figure 778281DEST_PATH_IMAGE001
L
pGH-X6145G 1.0
Figure 104089DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 18.25 L
一共配制8管，用于切胶回收。反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，10min，30个循环。按照Takara公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收0.3kb大小的片段。
②    用Sac I分别酶切载体pJWWD-123和4#片段，并用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒纯化两个片段。反应体系为： 
Green Buffer（10×） 20
Figure 937232DEST_PATH_IMAGE001
L
FastDigest Sac I 2 L
pJWWD-123 30 L
ddH2O 148
Figure 302989DEST_PATH_IMAGE001
L
Green Buffer（10×） 20 L
FastDigest Sac I 2
Figure 133859DEST_PATH_IMAGE001
L
4#片段 30
Figure 614519DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 148
Figure 906960DEST_PATH_IMAGE001
L
反应条件：200
Figure 261734DEST_PATH_IMAGE001
L体系，37℃，30min，切胶回收。
③    北京全式金生物技术有限公司T4 DNA Ligase连接pJWWD-123和4#片段，并转化DH5α大肠杆菌。反应体系： 
pJWWD-123 1
Figure 764057DEST_PATH_IMAGE001
L
4#片段 5
Figure 458344DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase buffer（5×） 2
Figure 798320DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase 1
Figure 843637DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 1 L
反应条件：22℃，30min。转化DH5α大肠杆菌按照说明书转化步骤操作，得到载体pJWWD-1234，验证结果如图5所示。
实施例4 
载体pJWWD-1718的构建
①    以质粒pCAMBIA2300为模版，以5#片段上游引物（SEQ ID NO：18）和5#片段下游引物（SEQ ID NO：19）为引物，用pfu酶克隆35S（5#片段），单管PCR反应体系为：
pfu buffer（10×） 2.5 L
dNTP（2.5mmol/L） 2.0
Figure 875681DEST_PATH_IMAGE001
L
5#F primer 0.5
Figure 142714DEST_PATH_IMAGE001
L
5#R primer 0.5
Figure 341614DEST_PATH_IMAGE001
L
pfu enzymes 0.25
Figure 948176DEST_PATH_IMAGE001
L
pCAMBIA2300 1.0
Figure 207119DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 18.25
Figure 961448DEST_PATH_IMAGE001
L
一共配制8管，用于切胶回收。反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2.5min；72℃，10min，30个循环。按照Takara公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收0.8kb大小的片段。
②    用Pst I分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段，并用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒纯化两个片段。反应体系为： 
Green Buffer（10×） 20
Figure 698460DEST_PATH_IMAGE001
L
FastDigest Pst I 2
Figure 221846DEST_PATH_IMAGE001
L
pJWWD-1234 30
Figure 651690DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 148 L
Green Buffer（10×） 20
Figure 89810DEST_PATH_IMAGE001
L
FastDigest Pst I 2
Figure 733281DEST_PATH_IMAGE001
L
5#片段 30
Figure 68448DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 148
Figure 797369DEST_PATH_IMAGE001
L
反应条件：200   
Figure 876184DEST_PATH_IMAGE002
L体系，37℃，30min，切胶回收。
③    北京全式金生物技术有限公司T4 DNA Ligase连接pJWWD-1234和5#片段，并转化DH5α大肠杆菌。反应体系： 
pJWW-1234 1
Figure 311844DEST_PATH_IMAGE001
L
5#片段 5
Figure 817912DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase buffer（5×） 2
Figure 34130DEST_PATH_IMAGE001
L
T4 DNA Ligase 1
Figure 916635DEST_PATH_IMAGE001
L
ddH2O 1
Figure 269119DEST_PATH_IMAGE001
L
反应条件：22℃，30min。转化DH5α大肠杆菌按照说明书转化步骤操作，得到载体pJWWD-1718。35S启动子酶切验证结果如图8所示。
植物表达载体pJWWD-1718在双子叶植物大豆遗传转化中的应用 
Figure DEST_PATH_IMAGE003
植物表达载体pJWWD-1718-EPSPS的构建。EPSPS（莽草酸-3-磷酸在5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶）基因从pSOY12（浙江大学寿惠霞老师惠赠，专利号201110303049.0）中获得。EPSPS基因用Taq plus酶克隆得到两段带有游离腺嘌呤A的片段，利用TA克隆的连接模式连接入载体pJWWD-1718，送华大基因测序确定基因连接的正反向。载体pJWWD-1718-EPSPS中EPSPS基因片段PCR验证如图9所示。
通过优化的大豆子叶节植株再生及农杆菌介导EPSPS基因遗传转化体系，经草甘膦筛选获得的再生植株，对抗性植株提取其叶片总DNA，进行PCR扩增验证，引物为EPSPS上游引物（SEQ ID NO：20）和EPSPS下游引物（SEQ ID NO：21），结果如图10所示。 
M：DNA分子质量标准Ⅲ；1：阳性对照（质粒）；2：阴性对照（未转化植株）；3-9：抗性植株。 
实施例5 
植物表达载体pJWWD-1718在单子叶植物玉米遗传转化中的应用
Figure 897153DEST_PATH_IMAGE003
植物表达载体pJWWD-1718-LYCB的构建。LYCB（番茄红素β环化酶）基因克隆：以RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，German）试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据根据转录组Unigene序列中番茄红素β-环化酶基因的核苷酸序列设计上游引物，如序列表中SEQ ID NO.22所示的序列。利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0 （TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：以Total RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如下：
RNA:                                   2μl
3' RACE Adaptor:                         1μl
5×M-MLV Buffer:                        2μl
dNTP Mixture：                          1μl
RNase Inhibitor：                       0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV：           0.25μl
RNase Free dH2O：                       3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
由SEQ ID NO.22所示的上游引物，和由SEQ ID NO.23所示的下游引物，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下： 
1st PCR产物：                           2μl
dNTP Mixture：                          8μl
上有引物：                              2μl
下游引物：                              2μl
10×LA PCR Buffer II：                  4μl
MgCl2：                                3μl
TaKaRa LA Taq：                       0.25μl
dH2O：                               28.75μl
反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min30sec；72℃，10min，30个循环。
中间载体pBS-T-LmLycB的构建过程 
将SEQ ID NO.1所示的LmLycB基因与pBS-T载体连接，反应体系如下：
目的PCR片段：                         3μl
pBS-T载体：                            1μl
2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer：       5μl
T4 DNA Ligase：                         1μl
反应条件：23℃，10min。连接产物转化E-Coli. TOP10，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行PCR（反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；54℃，30sec；72℃，2min30sec；72℃，10min，30个循环。）得到1800bp产物，提取质粒分别经BamHI和PstI双酶切：37℃，16hrs，酶切(15 μl质粒DNA, 3 μl R buffer，0.5 μlBamHI外切酶，0.5 μl PstI外切酶，13 μl ddH2O)得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体构建正确。LYCB基因用Taq plus酶克隆得到两段带有游离腺嘌呤A的片段，利用TA克隆的连接模式连接入载体pJWWD-1718，送华大基因测序确定基因连接的正反向。载体pJWWD-1718-LYCB中LYCB基因PCR验证如图11所示。M：DNA分子质量标准Ⅲ；1：空载体对照；2：带有LYCB的载体PCR。
Figure 335088DEST_PATH_IMAGE004
通过农杆菌介导法将LYCB基因转化玉米茎尖分生组织，经PPT（草铵膦）筛选获得的再生植株，对抗性植株提取其叶片总DNA，进行PCR扩增验证，引物为LYCB上游引物（SEQ ID NO：22）和LYCB下游引物（SEQ ID NO：23），结果如图12所示。M. Marker Ⅲ；1. 非转基因对照； 2. 质粒阳性对照； 3-10.转基因植株。 
序列表
 
<110>  天津大学
<120>  便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用
<130>  20130113
<160>  23   
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  2016
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(2016)
<400>  1
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc      60
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa    120
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgaag gccttgacag gatatattgg cgggtaaact   180
aagtcgctgt atgtgtttgt ttgagatctg atctcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg      240
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg    300
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat   360
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta      420
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct      480
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc     540
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa     600
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg   660
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag    720
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aagaagagtt ggtagctctt      780
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta     840
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc     900
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca     960
 
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgtgtaac     1020
attggtctag tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat    1080
caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac   1140
cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa  1200
catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac   1260
catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagttt atgcatttct ttccagactt   1320
gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat   1380
tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac   1440
aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac  1500
ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt ccctgggatc gcagtggtga    1560
gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt   1620
ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacaac attggcaacg ctacctttgc    1680
catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcggtag attgtcgcac   1740
ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg    1800
aatttaatcg cggccttgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg    1860
tattactgtt tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg         1920
caatgtaaca tcagagattt tgagacacaa cgtggctttg ttgaataaat cgaacttttg     1980
ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc ccgaca                         2016
 
<210>  2
<211>  1557
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(1557)
<400>  2
catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg cgatccccat     60
ccaacagccc gccgtcgagc gggctttttt atccccggaa gcctgtggat agagggtagt    120
tatccacgtg aaaccgctaa tgccccgcaa agccttgatt cacggggctt tccggcccgc    180
tccaaaaact atccacgtga aatcgctaat cagggtacgt gaaatcgcta atcggagtac    240
gtgaaatcgc taataaggtc acgtgaaatc gctaatcaaa aaggcacgtg agaacgctaa    300
tagccctttc agatcaacag cttgcaaaca cccctcgctc cggcaagtag ttacagcaag    360
tagtatgttc aattagcttt tcaattatga atatatatat caattattgg tcgcccttgg    420
cttgtggaca atgcgctacg cgcaccggct ccgcccgtgg acaaccgcaa gcggttgccc   480
accgtcgagc gccagcgcct ttgcccacaa cccggcggcc ggccgcaaca gatcgtttta   540
taaatttttt tttttgaaaa agaaaaagcc cgaaaggcgg caacctctcg ggcttctgga    600
tttccgatcc ccggaattag aagatcttgg caggatatat tgtggtgtaa cgttatcagc    660
ttgcatgccg gtcgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt    720
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcaaa    780
aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat    840
tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac    900
tttattgcca aatgtttgaa cgatctgctt gactctaggg gtcatcagat ttcggtgacg    960
ggcaggaccg gacggggcgg caccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca   1020
tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cacggggggc atatccgagc   1080
gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg   1140
aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc   1200
cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt   1260
gccttccagg gacccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc   1320
cagggatagc gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc   1380
tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctgg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc   1440
ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta   1500
gatccccctc gatcgagttg agagtgaata tgagactcta attggatacc gagggga      1557
 
<210>  3
<211>  1179
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(1179)
<400>  3
gtgggaaaga cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca     60
 
aaccgccgag ctcccaagct tcccatggcg ccatgtcatg agtggggtac cccgcggact    120
agtgaatcgg gcccgggctg cagtctagag gatccctggt gccgcgcggc agcgagctcg    180
aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc    240
ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac    300
atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac    360
atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg    420
gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga    480
aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc    540
tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc    600
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc    660
ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact    720
ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa    780
gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa    840
ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa gcgactagaa    900
tagtaaattg taatgttgtt tgttgtttgt tttgttgtgg tattgttgta aaaataccgg    960
agtcctctcc aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa gggtcttgcg aaggatagtg   1020
ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat caatccactt gctttgaaga   1080
cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg   1140
accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcc                      1179
 
<210>  4
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(25)
<400>  4
gacaggatat attggcgggt aaact                                           25
 
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(25)
<400>  5
ggcaggatat attgtggtgt aacgt                                           25
 
<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(18)
<400>  6
gctgccgcgc ggcaccag                                                   18
 
<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(18)
<400>  7
cctcgggcgc tggcaatg                                                   18
 
<210>  8
<211>  891
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(891)
<400>  8
gtgggaaaga cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca     60
aaccgccgag ctcccaagct tcccatggcg ccatgtcatg agtggggtac cccgcggact    120
agtgaatcgg gcccgggctg cagtctagag gatccctggt gccgcgcggc agcgagctcg    180
aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc       240
ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac       300
atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac      360
atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg    420
gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga      480
aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc    540
tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc      600
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc   660
ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact    720
ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa    780
gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa    840
ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa g             891
 
<210>  9
<211>  770
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(770)
<400>  9
agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa     60
cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt    120
cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt    180
 
ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt    240
gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta    300
ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata    360
ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat    420
tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc acatcaatcc acttgctttg    480
aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt    540
tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc    600
atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc    660
aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt    720
ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg               770
 
<210>  10
<211>  41
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(41)
<400>  10
ataagaatgc ggccgccgag ctcggcggtt tgcgtattgg g                         41
 
 
<210>  11
<211>  44
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(44)
<400>  11
cgacgcgtcc tcgggcgctg gcaatgtgtc gggaagatgc gtga                      44
 
<210>  12
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(26)
<400>  12
cgacgcgtca tcaaccgtgg ctccct                                          26
 
<210>  13
<211>  43
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(43)
<400>  13
ataagaatgc ggccgcccgc tcgagtcccc tcggtatcca att                       43
 
<210>  14
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(28)
<400>  14
ccgctcgagg aagaacttga ccgagggg                                        28
 
<210>  15
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(27)
<400>  15
ccgctcgaga gtggttgacg atggtgc                                         27
 
<210>  16
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(18)
<400>  16
agggttttcc cagtcacg                                                   18
 
<210>  17
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(21)
<400>  17
gagcggataa caatttcaca c                                               21
 
<210>  18
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(30)
<400>  18
aaaactgcag agagatagat ttgtagagag                                      30
 
<210>  19
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(30)
<400>  19
aaaactgcag cgacactctc gtctactcca                                      30
 
<210>  20
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(19)
<400>  20
gctggccatc gacgagttc                                                  19
 
<210>  21
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(19)
<400>  21
ggccaggaag ttcgggaag                                                  19
 
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(20)
<400>  22
atggatactt tgttgaaaac                                                 20
 
<210>  23
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(20)
<400>  23
ttattctgaa tcctgtaaca                                                 20
。
 

Claims (7)

1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段，分别含有LB和RB，且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段；从pGH-X6145G上克隆多克隆位点片段为4#片段；从pCAMBIA2300上克隆35S片段，最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD-1718；
其中，RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；
其中，所述1#片段如序列SEQ ID NO：1所示，所述2#片段如序列SEQ ID NO：2所示，所述3#片段如序列SEQ ID NO：3所示，5#片段如序列SEQ ID NO：9所示；
其中，所述RB如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB如序列SEQ ID NO：5所示，所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO：7所示。
2.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：
（1）用1#F引物和1#R引物克隆pGreenII0229的1#片段，两端分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收2kb片段；用2#F引物和2#R引物克隆pGreenII0229的2#片段，两端也分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收1600b片段；
（2）用Not I和MIU I酶切回收的1#和2#片段，连接这两个片段，得到载体pJWWD-12；
（3）用3#F引物和3#R引物克隆pCAMBIA3300-35S-HAK上的3#片段，切胶回收3#片段，两端带有Xho I酶切位点；
（4）用Xho I分别酶切pJWW-12和3#片段，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWWD-123；
（5）用4#F引物和4#R引物从pGH-X6145G克隆4#片段，其中含有多克隆位点，切胶回收300bp片段；
（6）用Sac I分别酶切载体pJWWD-123和4#片段，连接切开的载体和4#片段，得到载体pJWWD-1234；
（7）从pCAMBIA2300上克隆35S启动子（5#片段），切胶回收800bp片段；
（8）用Pst I分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段并回收，连接切开的载体和5#片段得到载体pJWWD-1718。
3.权利要求1或2所述的表达载体在大肠杆菌转化中的应用。
4.权利要求1或2所述的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶和双子叶植物，包括：水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。
6.权利要求1或2所述表达载体在植物育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的植物为单子叶和双子叶植物，包括：水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。
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