CN108148856A - 一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法 - Google Patents

一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法，包括以下步骤：A：目的片段的PCR扩增；B：目的片段的TA克隆和大肠杆菌感受态的转化；C：目的片段从克隆载体中双酶切获得；D：目的片段与植物双元载体的连接；E：重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；F：重组子的鉴定和转化农杆菌感受态。本发明目的片段与植物表达载体快速连接的方法，提供了一种植物功能基因分析中目的基因片段与植物表达载体连接时可大大缩短连接时间且费用较低的连接方法。

Description

一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学基因表达克隆技术领域，特别涉及一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法。
背景技术
植物基因的功能分析研究中，目的基因片段连接到植物表达载体上的操作是必须的。目的基因通过TA克隆，经过序列检测正确后将转移到植物表达载体上。目前植物基因克隆中常用到的商业化的植物表达载体多为pCAMBIA系列，重组子通过农杆菌介导的方法导入植物细胞以验证目的基因的功能。
影响目的基因片段与植物表达载体连接效率的因素有很多：目的基因片段的长度、目的基因片段两段和植物表达载体两段的酶切位点、植物表达载体的大小、目的基因与表达载体摩尔比和连接酶的连接活性等。
T4 DNA Ligase即T4DNA连接酶，是一单链多肽，分子量为68000道尔顿。它可以催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，改催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌和来自噬菌体的T4连接酶。
目前商用的T4 Ligase多是从大肠杆菌中分离获得的。多是催化将具有相同粘性末端的目的片段和载体片段DNA双链中的α-1，4-糖苷键的连接。连接条件为16℃过夜连接，粘性末端的连接可能还需要更长时间。随着科研水平的提高，新的产品层出不穷，市场上也出现一些能快速完成连接的试剂盒。但是在实际操作过程中并没有达到宣传的效果，而且试剂盒的费也非常昂贵，这对科研经费不充足的实验室来说是存在一定的压力。因此针对市场上现有的费用比较低的T4连接酶，改进和优化接条件，达到一种既缩短连接时间，同时又能达到连接效果的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，将植物基因克隆时，基因片段与表达载体连接时对连接条件进行优化，发明了一种可以缩短连接时间，且能够达到将目的片段连接到载体上的操作方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法，包括以下步骤：
A：目的片段的PCR扩增；
B：目的片段的TA克隆和大肠杆菌感受态的转化；
C：目的片段从克隆载体中双酶切获得；
D：目的片段与植物双元载体的连接；
E：重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
F：重组子的鉴定和转化农杆菌感受态。
优选所述植物双元载体为pCAMBIA1300。
优选所述植物双元载体的序列长度为8958bp。
所述目的片段的获取过程中，可以在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
所述在载体的片段获取过程中，可以在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
所述步骤D优选进一步包括：
(1)植物双元载体XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(2)目的片段从克隆载体上XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(3)利用T4连接酶将目的片段与双元载体的连接；
(4)重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
(5)菌落PCR验证。
所述T4连接酶可以为Promega公司生产的连接酶，目的片段和载体片段严格按照其说明书进行添加。
所述插入片段/载体片段的摩尔比率优选为3/1。
所述方法中，优选20μl的连接体系中加入100ng的载体片段。
所述目的片段的添加量可以通过如下计算公式来计算：
目的片段添加的质量＝(100ng目的片段*目的片段碱基个数)/双元载体碱基个数*3/1。
本发明有益效果包括：本发明目的片段与植物表达载体快速连接的方法，提供了植物功能基因分析中目的基因片段与植物表达载体连接时可大大缩短连接时间且费用较低的连接方法。
附图说明
图1为本发明实施例所述EAT1基因扩增产物的电泳检测图；
图2为本发明实施例所述EAT1基因在克隆载体上的双酶切(A)和植物表达载体双酶切(B)；
图3为本发明实施例所述连接产物转化大肠杆菌感受态照片；其中，A图为16℃过夜连接；B图为变温循环连接；
图4为本发明实施例所述目的基因片段的菌落PCR鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。T4连接酶为Promega品牌。
本发明是将植物基因克隆时，基因片段与表达载体连接时对连接条件进行优化，寻找到一种可以缩短连接时间，且能够达到将目的片段连接到载体上的操作方法。
在本发明的一实施例中，提供了一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法，包括以下步骤：
A：目的片段的PCR扩增；
B：目的片段的TA克隆和大肠杆菌感受态的转化；
C：目的片段从克隆载体中双酶切获得；
D：目的片段与植物双元载体的连接；
E：重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
F：重组子的鉴定和转化农杆菌感受态。
优选所述植物双元载体为pCAMBIA1300。
优选所述植物双元载体的序列长度为8958bp。
所述目的片段的获取过程中，可以在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
所述在载体的片段获取过程中，可以在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
所述步骤D优选进一步包括：
(1)植物双元载体XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(2)目的片段从克隆载体上XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(3)利用T4连接酶将目的片段与双元载体的连接；
(4)重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
(5)菌落PCR验证。
所述T4连接酶可以为Promega公司生产的连接酶，目的片段和载体片段严格按照其说明书进行添加。
所述插入片段/载体片段的摩尔比率优选为3/1。
所述方法中，优选20μl的连接体系中加入100ng的载体片段。
所述目的片段的添加量可以通过如下计算公式来计算：
目的片段添加的质量＝(100ng目的片段*目的片段碱基个数)/双元载体碱基个数*3/1。
在本发明的另一实施例中，我们选取了水稻普通核育性基因EAT1基因。基因的长度为1860bp。植物双元载体我们选择的为pCAMBIA1300(其序列长度为8958bp)。在目的片段和载体片段获取过程中，我们在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。对照组连接条件为16℃连接过夜，实验组我们优化的连接程序，连接体系完全一致、大肠杆菌感受态用统一批次。T4连接酶为Promega品牌，目的片段和载体添加量完全按照其说明书要求的严格执行。
在本发明再一实施例中，具体实验步骤如下：
A：目的片段的PCR扩增，结果如图1所示；
B：目的片段的TA克隆和大肠杆菌感受态的转化；
C：目的片段从克隆载体中双酶切获得，结果如图2所示；
D：目的片段与植物双元载体的连接；
E：重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
F：重组子的鉴定和转化农杆菌感受态。
上述步骤D中详细步骤包括：(1)植物双元载体XbaI和PstI双酶切和胶回收；(2)目的片段从克隆载体上XbaI和PstI双酶切和胶回收；(3)利用T4连接酶将目的片段与双元载体的连接，具体连接组分为表1；(4)重组子转化大肠杆菌DH5α感受态，单菌落生长情况如图3；(5)随机挑选5个单菌落，进行菌落PCR验证，具体结果见图4。
下面是本发明中用到的T4连接酶为Promega公司生产的连接酶，目的片段和载体片段严格按照其说明书进行添加，插入片段/载体片段的摩尔比率为3/1。20μl的连接体系中加入100ng的载体片段，目的片段的添加量我们通过说明书中的计算公式来计算：
表1水稻EAT1基因与植物表达载体连接体系
成分 体积(μl)/质量(ng)
EAT1基因 62ng
pCAMBIA1300载体片段 100ng
Promega T4 Ligase 1μl
10*T4 buffer 2
总体积 20μl
表2目的基因片段与双元载体连接程序
本发明实施例结果
如图1所示，为本发明实施例所述EAT1基因扩增产物的电泳检测图。通过图1，我们可以初步判定获得目的片段；通过后续的测序验证完全正确。完成对其进行TA克隆和后续的分析后，对克隆载体和植物双元载体分别进行XbaI和PstI双酶切。
如图2所示，为本发明实施例所述EAT1基因在克隆载体上的双酶切(A)和植物表达载体双酶切(B)。双酶切结果显示片段大小符合预期结果。
如图3所示，为本发明实施例所述连接产物转化大肠杆菌感受态照片；其中，A图为16℃过夜连接；B图为变温循环连接。从连接产物转化大肠杆菌的单菌落生长密度来看，两种连接条件下的产物转化大肠杆菌情况没有明显差别。
如图4所示，为本发明实施例所述目的基因片段的菌落PCR鉴定图。本实施例随机各挑取5个单菌落进行菌落PCR验证，变温循环连接条件下有1个菌落显示假阳性。
表3目的基因片段与植物表达载体连接转化成功率
后续的测序分析结果显示变温循环连接方式完全能够达到传统的连接方式水平。但从连接时间上来分析，变温循环仅需要2-3个小时，对仪器要求也不高，仅需要借助PCR仪或变温循环仪即可完成。这两种仪器在一般的分子实验室都是常用的仪器。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A：目的片段的PCR扩增；
B：目的片段的TA克隆和大肠杆菌感受态的转化；
C：目的片段从克隆载体中双酶切获得；
D：目的片段与植物双元载体的连接；
E：重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
F：重组子的鉴定和转化农杆菌感受态。
2.根据权利要求1所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述植物双元载体为pCAMBIA1300。
3.根据权利要求1所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述植物双元载体的序列长度为8958bp。
4.根据权利要求1所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述目的片段的获取过程中，在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
5.根据权利要求1所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述在载体的片段获取过程中，在两端分别选择XbaI和PstI酶切位点。
6.根据权利要求1所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述步骤D进一步包括：
(1)植物双元载体XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(2)目的片段从克隆载体上XbaI和PstI双酶切和胶回收；
(3)利用T4连接酶将目的片段与双元载体的连接；
(4)重组子转化大肠杆菌DH5α感受态；
(5)菌落PCR验证。
7.根据权利要求6所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述T4连接酶为Promega公司生产的连接酶，目的片段和载体片段严格按照其说明书进行添加。
8.根据权利要求6所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述插入片段/载体片段的摩尔比率为3/1。
9.根据权利要求6所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述方法中，20μl的连接体系中加入100ng的载体片段。
10.根据权利要求6所述目的片段与植物表达载体快速连接的方法，其特征在于，所述目的片段的添加量通过如下计算公式来计算：
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