CN109182372B - 烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，属于基因工程技术领域，能够有效调控烟草叶柄与茎间的角度，可有效改善其农艺性状，从而有助于提高烟草的产量和品质。该技术方案包括利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因，通过过量表达所述烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度；利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体而增大烟草叶柄与茎间的角度。本发明能够应用于烟草叶柄与茎间角度的调控中。

Description

烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用。

背景技术

叶柄与茎秆间角度的大小影响到作物对光、气的竞争。叶柄角度小，光合面积不大，群体光合效率降低，导致减产；相反，叶柄角度开合过大，又影响行间距，不利用作物合理密植。因此，叶柄夹角、烟株株形等重要农艺性状最终可影响作物产量。此外，作为重要的经济作物，烟草叶片是其主要收获的器官，合适的叶柄夹角有助于烟株获得理想株形，提高烟草品质、产量，从而能够帮助烟草生物量和经济系数都达到最高水平。因此，如何有效调控影响株形的因素并将其有效利用，这对烟草产量、品质的提高将具有重要指导意义。

发明内容

本发明提出一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，能够有效调控烟草叶柄与茎间的角度，可有效改善其农艺性状，从而有助于提高烟草的产量和品质。

为了达到上述目的，本发明烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，包括以下步骤：

利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因，通过过量表达所述烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度；

利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体而增大烟草叶柄与茎间的角度。

作为优选，利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因包括以下步骤：

设计特异克隆烟草NtPED基因的如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ IDNO.2所示第一反向引物；

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行第一次PCR扩增；

以上述第一次PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用如SEQ ID NO.3所示第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物进行第二次PCR扩增；

将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，并将所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草叶柄调控基因，命名为NtPED-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列。

作为优选，所述引物分别为：

第一正向引物：TACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAAGATTGGGATCT，和

第一反向引物：GTACAAGAAAGCTGGGTCACTACCGCCAGCCGCCGTA；

第二正向引物：GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC，和

第二反向引物：GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC。

作为优选，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的扩增条件为：95℃5min；33个如下循环：95℃30s、58℃30s、72℃1min；72℃10min。

作为优选，利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体包括以下步骤：

根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的位于烟草NtPED基因5’端的基因编辑靶序列，借助如SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.7所示的第三反向引物合成靶序列和第三正向引物的反向互补序列；

将上述所得靶序列和反向互补序列用水溶解为50μM，退火，通过将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，然后转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，具有如SEQ ID NO.8所示序列。

作为优选，所述引物包括：

第三正向引物:GATTGACCACTAGTTCCAGCGGCAG，和

第三反向引物:AAACCTGCCGCTGGAACTAGTGGTC；

其中，第三正向引物中的前4位GATT和第三反向引物中的前4位AAAC为连接接头。

作为优选，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH₂O₂,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；

将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9的反应体系为：2μL BsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶缓冲液、1μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将上述体系在室温下放置10min。

作为优选，通过过量表达烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度或通过烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体增加烟草叶柄与茎间的角度包括如下步骤：

通过LR反应将所述烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；

通过将所述过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料；或

通过将所述烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。

作为优选，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：

对所述降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：

设计第一鉴定引物，所述第一鉴定引物包括如SEQ ID NO.8所示的第四正向引物和如SEQ ID NO.9所示的第四反向引物；

同时提取烟草叶片和转基因烟草叶片的RNA，并反转录为cDNA；

以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定；

对所述增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：

设计第二鉴定引物，所述第二鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第五正向引物和如SEQ ID NO.11所示的第五反向引物；

提取转基因烟草基因组DNA；

以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定。

作为优选，提取转基因烟草基因组DNA之前还包括对转基因烟草进行PCR初步鉴定的步骤，具体如下：

提取转基因烟草的基因组DNA；

设计检测引物CAS9，所述检测引物CAS9包括：

如SEQ ID NO.12所示的第六正向引物:AGTGATAAATTGATAGCTAGG，和

如SEQ ID NO.13所示的第六反向引物:CCTAATCGGTTTATCACGGT；

利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于有效调控烟草叶柄与茎间的角度，有效改善其农艺性状，有助于提高烟草的产量和品质。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的NtPED基因克隆电泳图谱；

图2为本发明实施例所提供的NtPED过量表达载体及基因编辑载体的鉴定，其中，图2A为NtPED基因过量表达的阳性转基因材料的qRT-PCR鉴定；图2B为NtPED基因编辑的阳性转基因材料中CAS9基因检测；图2C为基因编辑的阳性转基因材与野生型序列的比较；

图3为本发明实施例所提供的NtPED基因调控叶柄与茎间夹角的示意图，其中，图3A为不同材料的整体表现；图3B为对不同烟草材料进行叶柄与茎间夹角的测量结果。

具体实施方式

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

NtPED基因的克隆

1、设计能够特异克隆NtPED基因的引物

本步骤中，为了能够通过gateway重组技术将引物连接到过量表达载体上，这里用到的正向和反向引物都具有特异性，可特异性克隆NtPED基因，同时该引物两端加有gateway系统的必须的部分接头，通过下一步巢式PCR扩增可得到含有gateway重组接头的NtPED基因，具体如下：

第一正向引物(NtPED-gateway-F)SEQ ID NO.1:

TACAA AAAAG CAGGC TTCAT GGAGG AAGAT TGGGA TCT；

第一反向引物(NtPED-gateway-R)SEQ ID NO.2:

GTACA AGAAA GCTGG GTCAC TACCG CCAGC CGCCG TA；

2、提取红花大金元(烟草主栽品种)RNA并反转录为cDNA(SEQ ID NO.15所示)，以此为模板，利用第一正向引物和第一反向引物进行第一次PCR扩增，扩增程序为：

步骤1：95℃5min；

步骤2：(95℃30s，58℃30s，72℃1min)33循环；

步骤3:72℃10min；

3、以上述第一轮PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用第二正向引物和第二反向引物进行第二次扩增，扩增程序同第一次PCR扩增程序，所用引物具体如下：(这是gateway系统的通用接头，不具有基因特异性)

第二正向引物(attBF)SEQ ID NO.3:

GTGGG GACAA GTTTG TACAA AAAAG CAGGC TTC；

第二正向引物(attBR)SEQ ID NO.4:

GTGGG GACCA CTTTG TACAA GAAAG CTGGG TC；

4、将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，具体连接反应体系为：

pDonor207载体2μL；PCR产物片段2μL；BP酶12μL；25℃过夜反应；

5、将上述过夜反应后的产物转化入大肠杆菌DH5a中，转化流程参照试剂公司说明进行；

6、测序，并提取测序正确的质粒，命名为NtPED-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列，克隆得到烟草叶柄调控基因，如图1所示。

降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的获得

1、过量表达载体构建

通过LR反应将烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，反应体系为：

NtPED-pDonor207,2μL；pEarlyGate101载体，2μL；LR酶1μL；25℃过夜；

将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；

2、NtPED基因过量表达

将过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。

降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定

设计第一鉴定引物，该引物可特异扩增NtPED基因部分序列，进而进行qRT-PCR检测，所述第一鉴定引物具体如下：

第四正向引物(NtPED-qF)SEQ ID NO.8：

CCGGA ATCAG CCGCC ATA；

第四反向引物(NtPED-qR)SEQ ID NO.9：

CGTCC CTGCT GCTTT CTTGA；

同时提取红花大金元野生型烟草和转基因烟草RNA，并反转录为cDNA；

以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定，如图2A所示。由图2A可知，NtPED基因在转基因材料中表达明显升高，表明已获得的阳性材料是可用的。

实施例2

基因编辑载体的获得

1、根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的基因编辑靶序列，该序列位于烟草NtPED基因5’端，有利于获得基因功能缺失材料，利用如下引物合成靶序列和第三正向引物的反向互补序列，该正向与反向引物退火后可特异获得NtPED基因20bp的用于CRISPR-CAS9基因编辑的target序列，具有特异性，并且这对引物两端含有4碱基接头，这样两个引物退火后形成的target两端含有与基因编辑载体酶切后互补的粘性末端，可以直接进行连接反应，不用对所获得target序列进行酶切，只需要对CRISPR载体酶切即可连接，节约成本，高效省时，上述引物包括：

第三正向引物(TargetF)SEQ ID NO.6：

GATTG ACCAC TAGTT CCAGC GGCAG；

第三反向引物(TargetR)SEQ ID NO.7：

AAACC TGCCG CTGGA ACTAG TGGTC；

2、将上述所得靶序列和反向互补序列用水溶解为50μM，然后退火，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH₂O₂,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；

3、将退火所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，反应体系为2μLBsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶Buffer、11μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将该体系在室温下放置10min；

4、将上述产物转化进入大肠杆菌DH5a中，测序，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，具有如SEQ ID NO.14所示序列。

增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的获得

将烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。

增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定

1、转基因烟草的PCR初步鉴定

由于已获得的转基因材料中，阳性材料都含有CAS9基因，但并不是所有具有CAS9基因的材料NtPED基因被编辑，因为如果转基因材料中检测不到CAS9基因，那么NtPED基因一定没有被编辑，因此，在鉴定阳性材料中，需要先通过PCR技术鉴定转基因材料中含有CAS9基因的材料，从而筛选到NtPED基因被编辑的阳性植株，具体方法如下：

提取转基因烟草的基因组DNA；

设计检测引物CAS9，该对引物可以有效特异扩增CAS9基因，所述检测引物CAS9包括：

第六正向引物(CAS9-JCF)SEQ ID NO.12：

AGTGA TAAAT TGATA GCTAG G；

第六反向引物(CAS9-JCR)SEQ ID NO.13:

CCTAA TCGGT TTATC ACGGT；

利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定，如图2B所示。由图2B可知，已获得了含有CAS9基因的转基因材料，为下一步筛选获得NtPED基因被编辑的植株提供了材料。

2、增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定

设计第二鉴定引物，该引物可特异性的从烟草基因组中扩增NtPED序列，扩增的序列包含了本实施例例中CRISPR编辑的target序列，进而鉴定NtPED基因被编辑情况，所述第二鉴定引物包括：

第五正向引物(NtPED-jcF)SEQ ID NO.10：

ATGGA GGAAG ATTGG GATCT；

第五反向引物(NtPED-jcR)SEQ ID NO.11：

TTAGC TGATT AAACT GCT；

提取转基因烟草基因组DNA；

以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定，如图2C所示。由图2C可知，获得了NtPED基因被编辑材料，可为下一步进行表型鉴定奠定基础。

性能测试

测试方法：(1)通过整体观察表型分析，获得转基因材料与野生型间的差别，从整体上进行拍照记录；(2)进行叶柄与茎间夹角测量，将细铁丝折出角度，使两边分别与叶柄与茎杆平行对齐，测量细铁丝所形成的角度，记录。

结论：生长86天后不同类型烟草的整体表现不同，如图3A和3B所示，NtPED基因过量表达后，与野生型相比较，烟草表现为叶片整体紧凑，叶柄与茎间夹角变小；而NtPED基因功能缺失的基因编辑材料则表现为整体舒展，叶柄与茎间夹角变大；角度测量结果与表型相吻合。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacaaaaaag caggcttcat ggaggaagat tgggatct 38

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacaagaaa gctgggtcac taccgccagc cgccgta 37

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32

<210> 5

<211> 4321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgctagcc aggaagagtt 60

tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttagtttg atgcctggca 120

gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcacaac gttcaaatcc 180

gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga 240

aaggcccagt cttccgactg agcctttcgt tttatttgat gcctggcagt tccctactct 300

cgcgttaacg ctagcatgga tctcgggccc caaataatga ttttattttg actgatagtg 360

acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa tgctttttta taatgccaag tttgtacaaa 420

aaagcaggct aaatggagga agattgggat ctacatgcgg tggtcagaag ctgcaccgcc 480

gctaactctg ccaccaccac caccactagt tccagcggca gcggcagcgc caccatttct 540

tcttgcaact tccaaccaag actagatgat agtaactctt tttcctttca agatctctac 600

tttgacccaa gatttacaac acaaaatact gcttttgaag aattgcatga gctttgcaag 660

cctttcttta acgaatctct gttacaaaaa tcgcccttaa tttcaccaca gagattatta 720

caagatctac cattacaaca acagcagttt aatcagctaa atacaaaact aattcagccc 780

atcaaacgac ccttgtcatc agtaaatggt gctgctttac atactcaaag cccgagaagc 840

aaaagaagga agaaccaaat gaagaaagta tgccaagtag ctgctgatgc tttatcttct 900

gatatgtggt cttggagaaa atatgggcaa aaacccatta aaggttcccc atacccaagg 960

ggatattaca aatgtagcac ttcaaaaggg tgtttggccc gaaaacaagt ggagcgaaat 1020

agatccgacc cgaatatgtt catcatcacc tatacagccg agcacaatca tcctatgccc 1080

acacacagaa attccttagc cggaatcagc cgccataaca aagagacgaa ttcaaacaaa 1140

accactagct catcgccggt atcttcgccg gtgaccaact cgccggcgct ggaaaatcaa 1200

gaaagcagca gggacgagaa agaagacatt tttgaagacg aaaatgatga tttctttgag 1260

ggtttggaag aattggaaag tccggctgcc ggggatagct tgccggagaa ttttccgggg 1320

actttgcagt ttccttggct ggtgaataac gccgcaacta cggcggctgg cggtagttga 1380

aacccagctt tcttgtacaa agtgggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc 1440

aacgaacagg tcactatcag tcaaaataaa atcattattt gccatccagc tgcagctctg 1500

gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac 1560

aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg 1620

ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 1680

ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg ggaagcccga 1740

tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 1800

gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 1860

ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca 1920

ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 1980

gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 2040

tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 2100

cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 2160

ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 2220

ggggaaatta ggccgggaag ccgatctcgg cttgaacgaa ttgttaggtg gcggtacttg 2280

ggtcgatatc aaagtgcatc acttcttccc gtatgcccaa ctttgtatag agagccactg 2340

cgggatcgtc accgtaatct gcttgcacgt agatcacata agcaccaagc gcgttggcct 2400

catgcttgag gagattgatg agcgcggtgg caatgccctg cctccggtgc tcgccggaga 2460

ctgcgagatc atagatatag atctcactac gcggctgctc aaacctgggc agaacgtaag 2520

ccgcgagagc gccaacaacc gcttcttggt cgaaggcagc aagcgcgatg aatgtcttac 2580

tacggagcaa gttcccgagg taatcggagt ccggctgatg ttgggagtag gtggctacgt 2640

ctccgaactc acgaccgaaa agatcaagag cagcccgcat ggatttgact tggtcagggc 2700

cgagcctaca tgtgcgaatg atgcccatac ttgagccacc taactttgtt ttagggcgac 2760

tgccctgctg cgtaacatcg ttgctgctgc gtaacatcgt tgctgctcca taacatcaaa 2820

catcgaccca cggcgtaacg cgcttgctgc ttggatgccc gaggcataga ctgtacaaaa 2880

aaacagtcat aacaagccat gaaaaccgcc actgcgccgt taccaccgct gcgttcggtc 2940

aaggttctgg accagttgcg tgagcgcata cgctacttgc attacagttt acgaaccgaa 3000

caggcttatg tcaactgggt tcgtgccttc atccgtttcc acggtgtgcg tcacccggca 3060

accttgggca gcagcgaagt cgaggcattt ctgtcctggc tggcgaacga gcgcaaggtt 3120

tcggtctcca cgcatcgtca ggcattggcg gccttgctgt tcttctacgg caaggtgctg 3180

tgcacggatc tgccctggct tcaggagatc ggaagacctc ggccgtcgcg gcgcttgccg 3240

gtggtgctga ccccggatga agtggttcgc atcctcggtt ttctggaagg cgagcatcgt 3300

ttgttcgccc aggactctag ctatagttct agtggttggc tactaatagg ttgtattgat 3360

gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 3420

ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 3480

gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt 3540

aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgc aagctcatga 3600

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 3660

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 3720

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 3780

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 3840

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 3900

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 3960

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4020

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4080

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4140

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4200

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 4260

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4320

t 4321

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gattgaccac tagttccagc ggcag 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacctgccg ctggaactag tggtc 25

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggaatcag ccgccata 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtccctgct gctttcttga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaggaag attgggatct 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttagctgatt aaactgct 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtgataaat tgatagctag g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctaatcggt ttatcacggt 20

<210> 14

<211> 12138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300

gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420

ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 480

caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540

ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600

agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660

tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720

tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780

tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840

taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900

ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960

ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020

gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080

gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140

tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200

tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260

taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320

ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380

atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440

gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500

ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560

gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620

caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680

aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740

catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800

actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860

agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920

ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980

tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040

gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100

gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160

cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220

agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280

tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340

ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400

aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460

atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520

aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580

ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640

ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700

aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760

agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820

tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880

cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940

cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000

aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060

ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120

tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180

aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240

acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300

cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360

cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420

atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg 3480

gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540

tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac 3600

gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct ttactgagat 3660

cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4500

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttggatctc ctgtggttgg 4560

catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620

ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740

aaaacgggcg ccccgcggaa tgcttagctt tcgttttctt ctttttaact ttccattcgg 4800

agtttttgta tcttgtttca tagtttgtcc caggattaga atgattaggc atcgaacctt 4860

caagaatttg attgaataaa acatcttcat tcttaagata tgaagataat cttcaaaagg 4920

cccctgggaa tctgaaagaa gagaagcagg cccatttata tgggaaagaa caatagtatt 4980

tcttatatag gcccatttaa gttgaaaaca atcttcaaaa gtcccacatc gcttagataa 5040

gaaaacgaag ctgagtttat atacagctag agtcgaagta gtgattgacc actagttcca 5100

gcggcaggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 5160

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc 5220

tctgttcttc ggcgttcaat ttctgggttt ttctcttcgt tttctggcta gcgtttaaac 5280

ttaagctgat ccactagtcc tgcaggtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc 5340

caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag 5400

ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa 5460

gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat 5520

cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 5580

cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat 5640

ggtggagcac gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca 5700

aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 5760

cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 5820

ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 5880

agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 5940

aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 6000

tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacctcgac 6060

ctcaacacaa catatacaaa acaaacgaat ctcaagcaat caagcattct acttctattg 6120

cagcaattta aatcatttct tttaaagcaa aagcaatttt ctgaaaattt tcaccattta 6180

cgaacgatag aattcgccat ggccccaaag aaaaagagaa aggttgatta caaagaccac 6240

gacggagact acaaagacca cgacattgat tataaagatg atgatgataa aggaacgatg 6300

gacaaaaagt atagcatcgg tctggatatt ggaactaact ccgtcggctg ggctgtaatc 6360

accgacgaat acaaggtccc gtcaaaaaag ttcaaggtat tgggtaacac agatcgtcac 6420

tctatcaaaa agaatctcat tggagctctg ttgttcgaca gcggcgaaac agctgaggcc 6480

actagactga agcgcaccgc cagacgccgt tacacgagga gaaagaacag aatctgctac 6540

ttgcaagaaa tattctcaaa cgagatggcc aaagtggacg attcgttctt tcataggtta 6600

gaagagagtt tccttgttga agaggataaa aagcacgaaa gacatccgat atttggaaac 6660

atcgtggacg aagttgctta tcacgagaag taccccacga tctatcatct gcgtaaaaag 6720

ttggtggact cgacagataa ggccgacctc aggttaatat accttgcact ggcgcacatg 6780

atcaaattca gaggccattt tctgattgaa ggtgacctga accctgacaa tagtgatgtg 6840

gacaaactct tcattcaatt agttcagacc tacaatcaac tgtttgaaga gaaccctatc 6900

aacgcttcag gagttgacgc taaggccatc cttagtgcga gactgagcaa atcccgccgt 6960

ctcgaaaact taatcgcaca gttgcctgga gagaaaaaga acggtttgtt cggaaatctc 7020

attgcgttgt cactcggact cacgccaaac ttcaagtcta acttcgattt ggcagaagac 7080

gcgaaactgc aactgagcaa agacacatat gacgatgacc tcgataacct cttagctcag 7140

atcggcgatc aatacgccga cttgttcctc gctgccaaaa atctgtcgga cgctatactt 7200

ctgagtgata tcttgcgcgt caacacagaa attactaagg ctcctctgtc ggccagtatg 7260

ataaaacgct atgacgaaca ccatcaggat ttgacattgc tcaaagccct cgtgcgtcaa 7320

cagctcccag aaaagtacaa ggagattttc tttgatcagt ccaagaatgg ctacgcaggt 7380

tatatagacg gtggagcgtc gcaagaagag ttctacaagt tcatcaagcc aatattagaa 7440

aagatggacg gcacggaaga gttacttgtt aagctgaatc gtgaggacct gttgcgtaaa 7500

cagaggacat tcgataacgg atcaattccg caccaaatac atcttggcga actgcacgct 7560

atcctcagga gacaagagga cttctacccc tttttaaagg ataaccgtga aaagatcgag 7620

aaaatcctga ctttcaggat tccttactat gtcggcccac tggctcgtgg taatagcagg 7680

tttgcctgga tgaccaggaa gtccgaagag acaattactc cgtggaactt cgaagaggtg 7740

gttgataaag gagcatcagc gcagtctttc atagaacgca tgacaaattt tgacaagaac 7800

ttaccgaatg agaaggtcct tcccaaacac tcactcctct acgaatactt cacagtatac 7860

aacgagctca ctaaagtcaa gtacgtaacc gagggtatgc gcaaacccgc tttcctgtct 7920

ggagagcaga aaaaggccat cgtggacctt ctgttcaaga caaaccgtaa ggtcactgta 7980

aagcaactca aggaagacta cttcaaaaag atagagtgtt tcgattcagt ggaaatctct 8040

ggcgttgagg acagatttaa cgcttccttg ggtacttacc acgatttgct caagatcatt 8100

aaagataagg acttcctcga caacgaagag aacgaagata tcttagagga catagttctc 8160

acccttacgc tgtttgaaga tagagagatg attgaagagc gcctgaagac ttatgctcat 8220

ttgttcgatg acaaagtcat gaagcaactg aaacgccgta ggtacaccgg ctggggtaga 8280

ttatcgcgca aacttattaa tggtataagg gacaagcagt cgggaaaaac gatattggac 8340

tttctcaaga gtgatggttt cgccaacaga aattttatgc aactcataca cgatgacagc 8400

ttaacattca aggaagatat ccaaaaagca caggtgtcgg gacagggcga cagtttgcac 8460

gaacatattg ctaacctcgc cggctccccg gcgataaaaa agggtatcct tcagactgtg 8520

aaagtcgtag atgaactggt gaaggttatg ggtcgtcata aacccgagaa catagttatc 8580

gaaatggcta gggagaatca aacaactcag aagggacaga aaaactcaag agaacgcatg 8640

aagcgcattg aagagggtat caaagagctt ggcagtcaaa tcctgaagga acaccctgtc 8700

gagaacacgc aacttcagaa cgaaaaattg tacctctact atctgcagaa tggtagagat 8760

atgtacgtag accaagaatt ggatattaac cgcctctcag attacgacgt ggatcatata 8820

gttccgcagt cattcttgaa ggatgactct atcgacaaca aagtcctcac aagatcagac 8880

aagaaccgcg gaaaatcaga taatgtaccc tctgaagagg tggttaaaaa gatgaaaaac 8940

tactggagac agttacttaa cgctaagttg atcacgcaaa gaaagttcga taacctcaca 9000

aaggctgaac gcggcggttt aagcgagctt gacaaggccg gtttcataaa acgtcagtta 9060

gtcgaaacca ggcaaattac gaaacacgta gcccaaatat tggattcccg catgaacact 9120

aaatacgatg aaaatgacaa gctcatccgt gaggtcaaag taattaccct gaaaagcaag 9180

ttggtgtccg acttcagaaa ggatttccag ttctacaaag ttcgcgaaat caacaactac 9240

caccatgcac atgacgctta cctgaacgca gtcgtaggca ctgcgttaat taaaaagtac 9300

cctaaactgg aatctgagtt cgtgtacggt gactataaag tgtacgatgt tagaaagatg 9360

atcgctaaaa gcgaacagga gattggaaag gctaccgcca agtatttctt ttactccaac 9420

atcatgaatt tctttaagac cgaaatcacg ttagcaaatg gcgagatacg taaaaggcca 9480

cttatcgaaa caaacggaga aactggcgag atagtgtggg acaagggtag agattttgcc 9540

actgtccgca aagtactgtc gatgccgcaa gtgaatatcg ttaaaaagac cgaagttcaa 9600

acgggaggct tcagcaaaga gtccatcctg cccaagcgta acagtgataa attgatagct 9660

aggaaaaagg actgggatcc taaaaagtat ggtggattcg acagcccaac tgtcgcatac 9720

tccgtattgg tggttgcgaa agtcgaaaaa ggaaagagca aaaagctcaa gtccgtaaaa 9780

gagctgttgg gcattaccat aatggaaaga tcatctttcg agaagaatcc tatcgatttt 9840

ctggaagcca agggatataa agaggtcaaa aaggacctca taatcaagtt accaaaatac 9900

agtctgttcg aattggagaa cggcagaaaa cgcatgcttg catcagcggg tgaactgcaa 9960

aagggaaatg agttagcact tccttctaaa tacgtcaact tcctgtattt ggcgtcacac 10020

tacgaaaaac tgaagggctc tccagaagat aacgagcaaa agcagttatt tgtggaacag 10080

cacaaacatt accttgacga aattatagag caaatctcgg agttcagtaa gagagtgatt 10140

ttggctgacg ccaatcttga taaagttctg tctgcttaca acaagcaccg tgataaaccg 10200

attagggaac aggccgagaa catcatacat ctcttcacac tcactaacct tggtgcaccc 10260

gcagcgttca aatattttga caccacgata gatcgtaaga ggtacaccag cacgaaagaa 10320

gttttggacg cgacactcat ccatcaatca atcacgggcc tgtacgaaac cagaatcgac 10380

ctgtcccagc tcggtggcga ccccaagaag aagagaaagg tgtagcggcc gcatcgatac 10440

tgcaggagct cggtaccttt tactagtgat atccctgtgt gaaattgtta tccgctacgc 10500

gtgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 10560

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 10620

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 10680

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 10740

ctatgttact agatcccatg ggaagttcct attccgaagt tcctattctc tgaaaagtat 10800

aggaacttca gcgatcgcag acgtcgggat cttctgcaag catctctatt tcctgaaggt 10860

ctaacctcga agatttaaga tttaattacg tttataatta caaaattgat tctagtatct 10920

ttaatttaat gcttatacat tattaattaa tttagtactt tcaatttgtt ttcagaaatt 10980

attttactat tttttataaa ataaaaggga gaaaatggct atttaaatac tagcctattt 11040

tatttcaatt ttagcttaaa atcagcccca attagcccca atttcaaatt caaatggtcc 11100

agcccaattc ctaaataacc cacccctaac ccgcccggtt tccccttttg atccatgcag 11160

tcaacgccca gaatttccct atataatttt ttaattccca aacaccccta actctatccc 11220

atttctcacc aaccgccaca tagatctatc ctcttatctc tcaaactctc tcgaaccttc 11280

ccctaaccct agcagcctct catcatcctc acctcaaaac ccaccggggc cggccatgat 11340

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 11400

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 11460

ggggaggccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aacttcaaga 11520

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 11580

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 11640

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 11700

gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 11760

gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 11820

tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 11880

ggatctcgtc gtgactcatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 11940

cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 12000

gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 12060

gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 12120

gttcttctga ggcgcgcc 12138

<210> 15

<211> 948

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggaggaag attgggatct acatgcggtg gtcagaagct gcaccgccgc taactctgcc 60

accaccacca ccactagttc cagcggcagc ggcagcgcca ccatttcttc ttgcaacttc 120

caaccaagac tagatgatag taactctttt tcctttcaag atctctactt tgacccaaga 180

tttacaacac aaaatactgc ttttgaagaa ttgcatgagc tttgcaagcc tttctttaac 240

gaatctctgt tacaaaaatc gcccttaatt tcaccacaga gattattaca agatctacca 300

ttacaacaac agcagtttaa tcagctaaat acaaaactaa ttcagcccat caaacgaccc 360

ttgtcatcag taaatggtgc tgctttacat actcaaagcc cgagaagcaa aagaaggaag 420

aaccaaatga agaaagtatg ccaagtagct gctgatgctt tatcttctga tatgtggtct 480

tggagaaaat atgggcaaaa acccattaaa ggttccccat acccaagggg atattacaaa 540

tgtagcactt caaaagggtg tttggcccga aaacaagtgg agcgaaatag atccgacccg 600

aatatgttca tcatcaccta tacagccgag cacaatcatc ctatgcccac acacagaaat 660

tccttagccg gaatcagccg ccataacaaa gagacgaatt caaacaaaac cactagctca 720

tcgccggtat cttcgccggt gaccaactcg ccggcgctgg aaaatcaaga aagcagcagg 780

gacgagaaag aagacatttt tgaagacgaa aatgatgatt tctttgaggg tttggaagaa 840

ttggaaagtc cggctgccgg ggatagcttg ccggagaatt ttccggggac tttgcagttt 900

ccttggctgg tgaataacgc cgcaactacg gcggctggcg gtagttga 948

Claims (8)

1.烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

克隆得到烟草NtPED基因，通过过量表达NtPED基因降低烟草叶柄与茎间的角度；或

利用基因编辑技术使烟草NtPED基因的功能缺失，而增大烟草叶柄与茎间的角度；

所述NtPED基因的序列如SEQ ID NO.15所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，克隆得到烟草NtPED基因的步骤包括：

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和SEQ ID NO.2所示的第一反向引物进行第一次PCR扩增；

以上述第一次PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和SEQ ID NO.4所示的第二反向引物进行第二次PCR扩增；

将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，并将所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得含有烟草叶柄调控基因NtPED的载体，命名为NtPED-pDonor207，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的扩增条件为：95℃5min；33个如下循环：95℃30s、58℃30s、72℃1min；72℃10min。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因编辑技术使烟草NtPED基因的功能缺失的步骤包括：

根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的位于烟草NtPED基因5’端的基因编辑靶序列，将SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和SEQ ID NO.7所示的第三反向引物退火后获得用于CRISPR-CAS9基因编辑的靶序列，将退火产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，然后转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，其序列如SEQ ID NO.14所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH₂O₂,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；

将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9的反应体系为：2μL BsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶缓冲液、1μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将上述体系在室温下放置10min。

6.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，通过过量表达NtPED基因降低烟草叶柄与茎间的角度或通过使烟草NtPED基因的功能缺失而增加烟草叶柄与茎间的角度的步骤包括：

通过LR反应将所述烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；

通过将所述过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得烟草叶柄与茎间角度降低的阳性转基因材料；或

通过将使烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得烟草叶柄与茎间角度增大的阳性转基因材料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：

对所述烟草叶柄与茎间角度降低的阳性转基因材料的鉴定包括：

设计第一鉴定引物，所述第一鉴定引物包括如SEQ ID NO.8所示的第四正向引物和如SEQ ID NO.9所示的第四反向引物；

同时提取烟草叶片和转基因烟草叶片的RNA，并反转录为cDNA；

以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定；

对所述烟草叶柄与茎间角度增大的阳性转基因材料的鉴定包括：

设计第二鉴定引物，所述第二鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第五正向引物和如SEQ ID NO.11所示的第五反向引物；

提取转基因烟草基因组DNA；

以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，提取转基因烟草基因组DNA之前还包括对转基因烟草进行PCR初步鉴定的步骤，具体如下：

提取转基因烟草的基因组DNA；

设计检测引物CAS9，所述检测引物CAS9包括：

如SEQ ID NO.12所示的第六正向引物:AGTGATAAATTGATAGCTAGG，和

如SEQ ID NO.13所示的第六反向引物:CCTAATCGGTTTATCACGGT；

利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定。

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