CN109182372A - 烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用 - Google Patents

烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，属于基因工程技术领域，能够有效调控烟草叶柄与茎间的角度，可有效改善其农艺性状，从而有助于提高烟草的产量和品质。该技术方案包括利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因，通过过量表达所述烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度；利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体而增大烟草叶柄与茎间的角度。本发明能够应用于烟草叶柄与茎间角度的调控中。

Description

烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用。
背景技术
叶柄与茎秆间角度的大小影响到作物对光、气的竞争。叶柄角度小，光合面积不大，群体光合效率降低，导致减产；相反，叶柄角度开合过大，又影响行间距，不利用作物合理密植。因此，叶柄夹角、烟株株形等重要农艺性状最终可影响作物产量。此外，作为重要的经济作物，烟草叶片是其主要收获的器官，合适的叶柄夹角有助于烟株获得理想株形，提高烟草品质、产量，从而能够帮助烟草生物量和经济系数都达到最高水平。因此，如何有效调控影响株形的因素并将其有效利用，这对烟草产量、品质的提高将具有重要指导意义。
发明内容
本发明提出一种烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，能够有效调控烟草叶柄与茎间的角度，可有效改善其农艺性状，从而有助于提高烟草的产量和品质。
为了达到上述目的，本发明烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，包括以下步骤：
利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因，通过过量表达所述烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度；
利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体而增大烟草叶柄与茎间的角度。
作为优选，利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因包括以下步骤：
设计特异克隆烟草NtPED基因的如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ IDNO.2所示第一反向引物；
提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行第一次PCR扩增；
以上述第一次PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用如SEQ ID NO.3所示第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物进行第二次PCR扩增；
将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，并将所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草叶柄调控基因，命名为NtPED-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列。
作为优选，所述引物分别为：
第一正向引物：TACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAAGATTGGGATCT，和
第一反向引物：GTACAAGAAAGCTGGGTCACTACCGCCAGCCGCCGTA；
第二正向引物：GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC，和
第二反向引物：GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC。
作为优选，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的扩增条件为：95℃5min；33个如下循环：95℃30s、58℃30s、72℃1min；72℃10min。
作为优选，利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体包括以下步骤：
根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的位于烟草NtPED基因5’端的基因编辑靶序列，借助如SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.7所示的第三反向引物合成靶序列和第三正向引物的反向互补序列；
将上述所得靶序列和反向互补序列用水溶解为50μM，退火，通过将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，然后转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，具有如SEQ ID NO.8所示序列。
作为优选，所述引物包括：
第三正向引物:GATTGACCACTAGTTCCAGCGGCAG，和
第三反向引物:AAACCTGCCGCTGGAACTAGTGGTC；
其中，第三正向引物中的前4位GATT和第三反向引物中的前4位AAAC为连接接头。
作为优选，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH2O2,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；
将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9的反应体系为：2μL BsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶缓冲液、1μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将上述体系在室温下放置10min。
作为优选，通过过量表达烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度或通过烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体增加烟草叶柄与茎间的角度包括如下步骤：
通过LR反应将所述烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；
通过将所述过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料；或
通过将所述烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。
作为优选，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：
对所述降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：
设计第一鉴定引物，所述第一鉴定引物包括如SEQ ID NO.8所示的第四正向引物和如SEQ ID NO.9所示的第四反向引物；
同时提取烟草叶片和转基因烟草叶片的RNA，并反转录为cDNA；
以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定；
对所述增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：
设计第二鉴定引物，所述第二鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第五正向引物和如SEQ ID NO.11所示的第五反向引物；
提取转基因烟草基因组DNA；
以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定。
作为优选，提取转基因烟草基因组DNA之前还包括对转基因烟草进行PCR初步鉴定的步骤，具体如下：
提取转基因烟草的基因组DNA；
设计检测引物CAS9，所述检测引物CAS9包括：
如SEQ ID NO.12所示的第六正向引物:AGTGATAAATTGATAGCTAGG，和
如SEQ ID NO.13所示的第六反向引物:CCTAATCGGTTTATCACGGT；
利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于有效调控烟草叶柄与茎间的角度，有效改善其农艺性状，有助于提高烟草的产量和品质。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的NtPED基因克隆电泳图谱；
图2为本发明实施例所提供的NtPED过量表达载体及基因编辑载体的鉴定，其中，图2A为NtPED基因过量表达的阳性转基因材料的qRT-PCR鉴定；图2B为NtPED基因编辑的阳性转基因材料中CAS9基因检测；图2C为基因编辑的阳性转基因材与野生型序列的比较；
图3为本发明实施例所提供的NtPED基因调控叶柄与茎间夹角的示意图，其中，图3A为不同材料的整体表现；图3B为对不同烟草材料进行叶柄与茎间夹角的测量结果。
具体实施方式
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
NtPED基因的克隆
1、设计能够特异克隆NtPED基因的引物
本步骤中，为了能够通过gateway重组技术将引物连接到过量表达载体上，这里用到的正向和反向引物都具有特异性，可特异性克隆NtPED基因，同时该引物两端加有gateway系统的必须的部分接头，通过下一步巢式PCR扩增可得到含有gateway重组接头的NtPED基因，具体如下：
第一正向引物(NtPED-gateway-F)SEQ ID NO.1:
TACAA AAAAG CAGGC TTCAT GGAGG AAGAT TGGGA TCT；
第一反向引物(NtPED-gateway-R)SEQ ID NO.2:
GTACA AGAAA GCTGG GTCAC TACCG CCAGC CGCCG TA；
2、提取红花大金元(烟草主栽品种)RNA并反转录为cDNA(SEQ ID NO.15所示)，以此为模板，利用第一正向引物和第一反向引物进行第一次PCR扩增，扩增程序为：
步骤1：95℃5min；
步骤2：(95℃30s，58℃30s，72℃1min)33循环；
步骤3:72℃10min；
3、以上述第一轮PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用第二正向引物和第二反向引物进行第二次扩增，扩增程序同第一次PCR扩增程序，所用引物具体如下：(这是gateway系统的通用接头，不具有基因特异性)
第二正向引物(attBF)SEQ ID NO.3:
GTGGG GACAA GTTTG TACAA AAAAG CAGGC TTC；
第二正向引物(attBR)SEQ ID NO.4:
GTGGG GACCA CTTTG TACAA GAAAG CTGGG TC；
4、将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，具体连接反应体系为：
pDonor207载体2μL；PCR产物片段2μL；BP酶12μL；25℃过夜反应；
5、将上述过夜反应后的产物转化入大肠杆菌DH5a中，转化流程参照试剂公司说明进行；
6、测序，并提取测序正确的质粒，命名为NtPED-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列，克隆得到烟草叶柄调控基因，如图1所示。
降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的获得
1、过量表达载体构建
通过LR反应将烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，反应体系为：
NtPED-pDonor207,2μL；pEarlyGate101载体，2μL；LR酶1μL；25℃过夜；
将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；
2、NtPED基因过量表达
将过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。
降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定
设计第一鉴定引物，该引物可特异扩增NtPED基因部分序列，进而进行qRT-PCR检测，所述第一鉴定引物具体如下：
第四正向引物(NtPED-qF)SEQ ID NO.8：
CCGGA ATCAG CCGCC ATA；
第四反向引物(NtPED-qR)SEQ ID NO.9：
CGTCC CTGCT GCTTT CTTGA；
同时提取红花大金元野生型烟草和转基因烟草RNA，并反转录为cDNA；
以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定，如图2A所示。由图2A可知，NtPED基因在转基因材料中表达明显升高，表明已获得的阳性材料是可用的。
实施例2
基因编辑载体的获得
1、根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的基因编辑靶序列，该序列位于烟草NtPED基因5’端，有利于获得基因功能缺失材料，利用如下引物合成靶序列和第三正向引物的反向互补序列，该正向与反向引物退火后可特异获得NtPED基因20bp的用于CRISPR-CAS9基因编辑的target序列，具有特异性，并且这对引物两端含有4碱基接头，这样两个引物退火后形成的target两端含有与基因编辑载体酶切后互补的粘性末端，可以直接进行连接反应，不用对所获得target序列进行酶切，只需要对CRISPR载体酶切即可连接，节约成本，高效省时，上述引物包括：
第三正向引物(TargetF)SEQ ID NO.6：
GATTG ACCAC TAGTT CCAGC GGCAG；
第三反向引物(TargetR)SEQ ID NO.7：
AAACC TGCCG CTGGA ACTAG TGGTC；
2、将上述所得靶序列和反向互补序列用水溶解为50μM，然后退火，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH2O2,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；
3、将退火所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，反应体系为2μLBsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶Buffer、11μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将该体系在室温下放置10min；
4、将上述产物转化进入大肠杆菌DH5a中，测序，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，具有如SEQ ID NO.14所示序列。
增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的获得
将烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。
增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定
1、转基因烟草的PCR初步鉴定
由于已获得的转基因材料中，阳性材料都含有CAS9基因，但并不是所有具有CAS9基因的材料NtPED基因被编辑，因为如果转基因材料中检测不到CAS9基因，那么NtPED基因一定没有被编辑，因此，在鉴定阳性材料中，需要先通过PCR技术鉴定转基因材料中含有CAS9基因的材料，从而筛选到NtPED基因被编辑的阳性植株，具体方法如下：
提取转基因烟草的基因组DNA；
设计检测引物CAS9，该对引物可以有效特异扩增CAS9基因，所述检测引物CAS9包括：
第六正向引物(CAS9-JCF)SEQ ID NO.12：
AGTGA TAAAT TGATA GCTAG G；
第六反向引物(CAS9-JCR)SEQ ID NO.13:
CCTAA TCGGT TTATC ACGGT；
利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定，如图2B所示。由图2B可知，已获得了含有CAS9基因的转基因材料，为下一步筛选获得NtPED基因被编辑的植株提供了材料。
2、增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定
设计第二鉴定引物，该引物可特异性的从烟草基因组中扩增NtPED序列，扩增的序列包含了本实施例例中CRISPR编辑的target序列，进而鉴定NtPED基因被编辑情况，所述第二鉴定引物包括：
第五正向引物(NtPED-jcF)SEQ ID NO.10：
ATGGA GGAAG ATTGG GATCT；
第五反向引物(NtPED-jcR)SEQ ID NO.11：
TTAGC TGATT AAACT GCT；
提取转基因烟草基因组DNA；
以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定，如图2C所示。由图2C可知，获得了NtPED基因被编辑材料，可为下一步进行表型鉴定奠定基础。
性能测试
测试方法：(1)通过整体观察表型分析，获得转基因材料与野生型间的差别，从整体上进行拍照记录；(2)进行叶柄与茎间夹角测量，将细铁丝折出角度，使两边分别与叶柄与茎杆平行对齐，测量细铁丝所形成的角度，记录。
结论：生长86天后不同类型烟草的整体表现不同，如图3A和3B所示，NtPED基因过量表达后，与野生型相比较，烟草表现为叶片整体紧凑，叶柄与茎间夹角变小；而NtPED基因功能缺失的基因编辑材料则表现为整体舒展，叶柄与茎间夹角变大；角度测量结果与表型相吻合。
序列表
<110> 中国农业科学院烟草研究所
<120> 烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaaaaaag caggcttcat ggaggaagat tgggatct 38
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtacaagaaa gctgggtcac taccgccagc cgccgta 37
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32
<210> 5
<211> 4321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgctagcc aggaagagtt 60
tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttagtttg atgcctggca 120
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tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 1800
gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 1860
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca 1920
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 1980
gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 2040
tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 2100
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cgggatcgtc accgtaatct gcttgcacgt agatcacata agcaccaagc gcgttggcct 2400
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t 4321
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attttactat tttttataaa ataaaaggga gaaaatggct atttaaatac tagcctattt 11040
tatttcaatt ttagcttaaa atcagcccca attagcccca atttcaaatt caaatggtcc 11100
agcccaattc ctaaataacc cacccctaac ccgcccggtt tccccttttg atccatgcag 11160
tcaacgccca gaatttccct atataatttt ttaattccca aacaccccta actctatccc 11220
atttctcacc aaccgccaca tagatctatc ctcttatctc tcaaactctc tcgaaccttc 11280
ccctaaccct agcagcctct catcatcctc acctcaaaac ccaccggggc cggccatgat 11340
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 11400
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 11460
ggggaggccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aacttcaaga 11520
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 11580
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 11640
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 11700
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 11760
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 11820
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 11880
ggatctcgtc gtgactcatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 11940
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 12000
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 12060
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 12120
gttcttctga ggcgcgcc 12138
<210> 15
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggaggaag attgggatct acatgcggtg gtcagaagct gcaccgccgc taactctgcc 60
accaccacca ccactagttc cagcggcagc ggcagcgcca ccatttcttc ttgcaacttc 120
caaccaagac tagatgatag taactctttt tcctttcaag atctctactt tgacccaaga 180
tttacaacac aaaatactgc ttttgaagaa ttgcatgagc tttgcaagcc tttctttaac 240
gaatctctgt tacaaaaatc gcccttaatt tcaccacaga gattattaca agatctacca 300
ttacaacaac agcagtttaa tcagctaaat acaaaactaa ttcagcccat caaacgaccc 360
ttgtcatcag taaatggtgc tgctttacat actcaaagcc cgagaagcaa aagaaggaag 420
aaccaaatga agaaagtatg ccaagtagct gctgatgctt tatcttctga tatgtggtct 480
tggagaaaat atgggcaaaa acccattaaa ggttccccat acccaagggg atattacaaa 540
tgtagcactt caaaagggtg tttggcccga aaacaagtgg agcgaaatag atccgacccg 600
aatatgttca tcatcaccta tacagccgag cacaatcatc ctatgcccac acacagaaat 660
tccttagccg gaatcagccg ccataacaaa gagacgaatt caaacaaaac cactagctca 720
tcgccggtat cttcgccggt gaccaactcg ccggcgctgg aaaatcaaga aagcagcagg 780
gacgagaaag aagacatttt tgaagacgaa aatgatgatt tctttgaggg tttggaagaa 840
ttggaaagtc cggctgccgg ggatagcttg ccggagaatt ttccggggac tttgcagttt 900
ccttggctgg tgaataacgc cgcaactacg gcggctggcg gtagttga 948

Claims (10)

1.烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因，通过过量表达所述烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度；
利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体而增大烟草叶柄与茎间的角度。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用烟草NtPED基因克隆得到烟草叶柄调控基因包括以下步骤：
设计特异克隆烟草NtPED基因的如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.2所示第一反向引物；
提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行第一次PCR扩增；
以上述第一次PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用如SEQ ID NO.3所示第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物进行第二次PCR扩增；
将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，并将所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草叶柄调控基因，命名为NtPED-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物分别为：
第一正向引物：TACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAAGATTGGGATCT，和
第一反向引物：GTACAAGAAAGCTGGGTCACTACCGCCAGCCGCCGTA；
第二正向引物：GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC，和
第二反向引物：GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的扩增条件为：95℃5mi n；33个如下循环：95℃30s、58℃30s、72℃1mi n；72℃10mi n。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因编辑技术获得烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体包括以下步骤：
根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的位于烟草NtPED基因5’端的基因编辑靶序列，借助如SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.7所示的第三反向引物合成靶序列和第三正向引物的反向互补序列；
将上述所得靶序列和反向互补序列用水溶解为50μM，退火，通过将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，然后转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，具有如SEQ ID NO.8所示序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物包括：
第三正向引物:GATTGACCACTAGTTCCAGCGGCAG，和
第三反向引物:AAACCTGCCGCTGGAACTAGTGGTC；
其中，第三正向引物中的前4位GATT和第三反向引物中的前4位AAAC为连接接头。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH2O2,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10mi n后，立刻于室温中自然冷却；
将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9的反应体系为：2μL Bsa I酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶缓冲液、1μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将上述体系在室温下放置10mi n。
8.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，通过过量表达烟草叶柄调控基因降低烟草叶柄与茎间的角度或通过烟草NtPED基因的功能缺失的基因编辑载体增加烟草叶柄与茎间的角度包括如下步骤：
通过LR反应将所述烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；
通过将所述过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料；或
通过将所述烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：
对所述降低烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：
设计第一鉴定引物，所述第一鉴定引物包括如SEQ ID NO.8所示的第四正向引物和如SEQ ID NO.9所示的第四反向引物；
同时提取烟草叶片和转基因烟草叶片的RNA，并反转录为cDNA；
以上述所得cDNA为模板，利用第四正向引物和第四反向引物进行qRT-PCR鉴定；
对所述增大烟草叶柄与茎间角度的阳性转基因材料的鉴定包括：
设计第二鉴定引物，所述第二鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第五正向引物和如SEQ ID NO.11所示的第五反向引物；
提取转基因烟草基因组DNA；
以上述所得DNA为模板，利用第五正向引物和第五反向引物进行PCR扩增，扩增产物连接至pBlunt-T载体，挑取单克隆鉴定。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，提取转基因烟草基因组DNA之前还包括对转基因烟草进行PCR初步鉴定的步骤，具体如下：
提取转基因烟草的基因组DNA；
设计检测引物CAS9，所述检测引物CAS9包括：
如SEQ ID NO.12所示的第六正向引物:AGTGATAAATTGATAGCTAGG，和
如SEQ ID NO.13所示的第六反向引物:CCTAATCGGTTTATCACGGT；
利用所述检测引物CAS9对转基因烟草进行PCR初步鉴定。
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