CN114686454B - Pe-p3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 - Google Patents

Pe-p3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PE‑P3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。所述PE‑P3引导编辑系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述反转录酶融合在所述Cas9切刻酶的N端，且通过自切割寡肽与筛选标记蛋白融合。通过实验证明：与PE‑P2引导编辑系统相比，本发明的PE‑P3引导编辑系统对靶点的编辑效率显著提高。

Description

PE-P3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PE-P3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。
背景技术
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2016年和2017年相继报道的胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器虽可以精确的实现胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)以及腺嘌呤(Adenine，A)到鸟嘌呤(Guanine，G)的转换，且不产生DSB也不引入DNA模板，但无法实现嘌呤和嘧啶之间的颠换，即无法实现A到T的替换、T到A的替换、C到G的替换、G到C的替换、A到C的替换、T到G的替换、C到A的替换、G到T的替换。同时，碱基编辑器只能编辑活性窗口内的C或A，而且当活性窗口内存在多个C或多个A时，容易产生靶标C或A与非靶标C或A共编辑而不能最终得到预期编辑产物。所有这些弊端大大限制了碱基编辑器的实际应用。
2019年，David Liu实验室报道了一种新的基因组编辑技术，即引导编辑技术(Prime editing)，开发了三种引导编辑器(Prime editor，PE)，分别是PE1、PE2和PE3。所有这三种PE均为反转录酶(reverse transcriptase，RT)与Cas9 H840A切口酶(Cas9n(H840A))融合在一起，使用引导编辑技术向导RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)实现基因组编辑。pegRNA除了包含通常的向导RNA(sgRNA)外，还包含一段含有目标碱基突变的RT模板以及引物结合位点(primer binding site，PBS)。实验表明该技术可在动物细胞基因组中实现所有12种碱基替换类型的编辑，打破了传统碱基编辑器的限制，大大提高了碱基编辑范围。目前，在植物中，虽然引导编辑技术可以实现所有类型的碱基替换，但仍然存在碱基编辑效率不高，或是部分位点不能被编辑的问题。
发明内容
第一方面，本发明保护一种成套系统。
本发明保护的成套系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；
所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述反转录酶融合在所述Cas9切刻酶的N端，且通过自切割寡肽与筛选标记蛋白融合。
上述成套系统中，所述融合蛋白为依次由反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、反转录酶和Cas9切刻酶组成的融合蛋白。
上述成套系统中，所述Cas9切刻酶可为Cas9n(H840A)；
所述Cas9切刻酶(Cas9n(H840A))可为现有技术中公知的各种Cas9n或其变体，包括来源于细菌的Cas9n(如SpCas9n、SaCas9n、SaCas9n-KKH等)，识别不同PAM的SpCas9变体切刻酶(如xCas9n、Cas9n-NG、Cas9n-VQR、Cas9n-VRER等)，Cas9高保真酶变体切刻酶(如HypaCas9n、eSpCas9(1.1)n、Cas9-HF1n等)等。
进一步的，所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：
a1)序列1第2293-6393位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述反转录酶可为来源于病毒中的反转录酶，如来源于莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)的反转录酶、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的反转录酶等，也可为来源于细菌中的病毒，如来源于大肠杆菌中的反转录酶等。
进一步的，所述反转录酶为来源于莫洛尼小鼠白血病病毒的反转录酶(M-MLVRT)；所述M-MLV RT为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述M-MLV RT的编码基因为b1)或b2)或b3)：
b1)序列1第6493-8523位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶。
进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：
d1)序列1第8731-9756位所示的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。
进一步的，所述自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽(P2A)；所述P2A的氨基酸序列为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；
C2)将序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述P2A的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列1第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述pegRNA依次由靶点序列(记作靶点序列甲)、esgRNA骨架、RT序列和PBS序列组成。
所述RT序列为靶点序列3’端3个碱基及其后连续的一段基因组序列的反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出cDNA，然后作为修复模板，对基因组DNA进行修复。所述RT序列大小进一步可为8-34bp。
所述PBS序列(引物结合位点序列)为靶点序列5’端第n个碱基到第17个碱基靶点序列的反向互补序列(1≤n<17)。
所述RT序列和所述PBS序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(Prime editing，PE)中与pegRNA的RT序列和PBS序列相关的设计方法或原理。
所述esgRNA骨架为F1)或F2)或F3)：
F1)将序列1第11008-11093位中的T替换为U得到的RNA分子；
F2)将F1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。
上述成套系统还可包括esgRNA或与所述esgRNA相关的生物材料。
所述esgRNA依次由靶点序列(记作靶点序列乙)和上述esgRNA骨架组成。该esgRNA用于产生非编辑链切口，非编辑链切口位点可以随意选择。所述靶点序列甲与所述靶点序列乙分别位于目标DNA的两条链上，二者可以互补重合或部分互补重合，也可以有一定距离。
上述成套系统的用途具体如下：
S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
第二方面，本发明保护上述成套系统或上述成套系统中的融合蛋白的新用途。
本发明保护上述成套系统或上述成套系统中的融合蛋白在如下S1)-S4)任一种中的应用：
S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
第三方面，本发明保护如下T1)-T3)所述的方法：
T1)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑。
T2)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；所述esgRNA靶向靶点序列乙，用于在非编辑链上产生切口，以提高目标突变的编辑效率。
T3)生物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照T1)或T2)所述的方法对生物体或生物细胞的基因组序列进行编辑，获得生物突变体。
上述方法中，所述T1)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因和转录上述pegRNA的DNA分子导入目的植物中。
所述T2)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因、转录上述pegRNA的DNA分子和转录上述esgRNA的DNA分子导入目的植物中。
进一步的，所述T2)中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过重组表达载体导入目的植物中。所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子可通过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入目的植物中。
在本发明的具体实施例中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过同一个重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体包括依次由启动子、反转录酶M-MLV RT的编码基因、Cas9n(H840A)的编码基因、自切割寡肽P2A的编码基因、筛选剂抗性蛋白HPT的编码基因和终止子组成的表达盒，依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒和依次由启动子、所述转录pegRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述基因组序列的编辑包括所述基因组序列的碱基替换(如单碱基替换和多碱基替换)、碱基插入(如单碱基插入和多碱基插入)和碱基删除(如单碱基删除和多碱基删除)。在本发明的具体实施例中，所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述生物体为X1)或X2)或X3)或X4)：
X1)植物或动物；
X2)单子叶植物或双子叶植物；
X3)禾本科植物；
X4)水稻。
所述生物细胞为Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：
Y1)植物细胞或动物细胞；
Y2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；
Y3)禾本科植物细胞；
Y4)水稻细胞。
本发明为了进一步提高PE-P2引导编辑系统的编辑效率，将M-MLV融合在Cas9n(H840A)的N端，同时通过自剪切多肽P2A与筛选剂抗性蛋白融合，提供了PE-P3引导编辑系统。与PE-P2引导编辑系统相比，本发明的PE-P3引导编辑系统对靶点的编辑效率显著提高。
附图说明
图1为引导编辑系统PE-P3和引导编辑系统PE-P2的表达载体的结构示意图。
图2为RT-M模板形式和RT-S模板形式的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
以下实施例中用于扩增目的基因的引物名称和引物序列如下表所示。
以下实施例中，
引导编辑器愈伤编辑效率＝(组1检测到的有全部突变位点的reads数/总reads数×100％+组2检测到的有全部突变位点的reads数/总reads数×100％+组3检测到的有全部突变位点的reads数/总reads数×100％)/3。
引导编辑器T0苗编辑效率＝全部突变位点均发生突变的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。
日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。
恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。
筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。
分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
实施例1、不同引导编辑系统的设计方法
引导编辑系统包括融合蛋白、esgRNA和pegRNA；融合蛋白包括Cas9切刻酶(如Cas9n(H840A))、反转录酶(如M-MLV)、自切割寡肽(如P2A)和筛选标记蛋白(如HPT)；pegRNA依次由esgRNA、逆转录模板序列(RT序列)和引物结合位点序列(PBS序列)组成。
一、针对引导编辑系统中反转录酶与Cas9切刻酶的设计
根据反转录酶与Cas9切刻酶连接方式的不同，共分为如下两种引导编辑系统：现有技术中的引导编辑系统PE-P2和本发明设计的引导编辑系统PE-P3。引导编辑系统PE-P3和引导编辑系统PE-P2的表达载体的结构示意图如图1所示。
引导编辑系统PE-P2的表达载体包括Cas9n(H840A)&M-MLV&Hpt表达盒、esgRNA表达盒和pegRNA表达盒。Cas9n(H840A)&M-MLV&Hpt表达盒中，M-MLV融合在Cas9n(H840A)的C端，同时通过自剪切多肽P2A与筛选剂抗性蛋白融合。
引导编辑系统PE-P3的表达载体包括M-MLV&Cas9n(H840A)&Hpt表达盒、esgRNA表达盒和pegRNA表达盒。M-MLV&Cas9n(H840A)&Hpt表达盒中，M-MLV融合在Cas9n(H840A)的N端，同时通过自剪切多肽P2A与筛选剂抗性蛋白融合。
二、针对引导编辑系统中逆转录模板的设计
在引导编辑系统PE-P2和引导编辑系统PE-P3的基础上，根据逆转录模板(RT模板)中是否引入额外的突变碱基，共分为如下两种逆转录模板形式：RT-S模板形式和RT-M模板形式。以图2中的靶点为例，RT-M模板形式和RT-S模板形式的示意图如图2所示。
RT-S模板形式：相对于基因组序列，RT模板中仅含有单个突变碱基，将该单个突变碱基位点记作目标突变位点，即在RT-S模板形式中，仅在目标突变位点引入突变碱基，全部突变位点仅为目标突变位点。
RT-M模板形式：相对于基因组序列，RT模板中在RT-S的基础上引入额外的突变碱基，将该额外的突变碱基位点记作额外突变位点，即在RT-M模板形式中，除了在目标突变位点引入突变碱基外，还在目标突变位点以外的其它位点(额外突变位点)引入额外的突变碱基，全部突变位点由目标突变位点和额外突变位点组成。
实施例2、不同引导编辑系统的表达载体的构建及其对水稻基因组进行碱基编辑的效率对比
一、不同引导编辑系统的表达载体的构建
人工合成如下重组载体，各载体均为环状质粒：
引导编辑系统PE-P2的表达载体共计14个，分别是PE-P2-1，PE-P2-2，PE-P2-3，PE-P2-4，PE-P2-5，PE-P2-6，PE-P2-7，PE-P2-8，PE-P2-9，PE-P2-10，PE-P2-11，PE-P2-12，PE-P2-13，PE-P2-14载体。
引导编辑系统PE-P3的表达载体共计14个，分别是PE-P3-1，PE-P3-2，PE-P3-3，PE-P3-4，PE-P3-5，PE-P3-6，PE-P3-7，PE-P3-8，PE-P3-9，PE-P3-10，PE-P3-11，PE-P3-12，PE-P3-13，PE-P3-14载体。
PE-P2-1重组表达载体的序列为序列表中的序列1。其中，序列1的第102-2073位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第2293-6393为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列1的第6493-8523位为M-MLV RT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列1的第8674-8730位为P2A的编码序列，编码序列5所示的蛋白质；序列1的第8731-9756位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列1的第9763-10017位为Nos终止子序列；序列1的第10026-10491位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第10492-10511位为产生非编码链切口的esgRNA靶点序列，第10512-10597位为产生非编码链切口的esgRNA骨架序列，第10598-10606位为Poly T；序列1的第10607-10987位为OsU3启动子的核苷酸序列，第10988-11007位为pegRNA-01靶点序列，第11008-11093位为pegRNA-01所对应的esgRNA骨架序列，第11094-11120位为pegRNA-01上的RT&PBS序列，第11121-11128位为Poly T；PE-P2-1重组表达载体中的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列，序列见表1。
PE-P2-2重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-02所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-3重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-03所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-4重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-04所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-5重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-05所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-6重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-06所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-06靶点序列和pegRNA-06上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-06所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-06靶点序列和pegRNA-06上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-7重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-07所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-07靶点序列和pegRNA-07上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-07所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-07靶点序列和pegRNA-07上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-8重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-08所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-08靶点序列和pegRNA-08上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-08所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-08靶点序列和pegRNA-08上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-9重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-09所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-09靶点序列和pegRNA-09上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-09所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-09靶点序列和pegRNA-09上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-10重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-10所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-10靶点序列和pegRNA-10上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-10所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-10靶点序列和pegRNA-10上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-11重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-11所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-11靶点序列和pegRNA-11上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-11所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-11靶点序列和pegRNA-11上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-12重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-12所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-12靶点序列和pegRNA-12上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-12所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-12靶点序列和pegRNA-12上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-13重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-13所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-13靶点序列和pegRNA-13上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-13所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-13靶点序列和pegRNA-13上的RT&PBS序列见表1。
PE-P2-14重组表达载体的序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-14所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-14靶点序列和pegRNA-14上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-14所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-14靶点序列和pegRNA-14上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-1重组表达载体的序列为序列表中的序列6。其中，序列6的第102-2073位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第2290-4320位为M-MLV RT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列6的第4420-8520为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列6的第8671-8727位为P2A的编码序列，编码序列5所示的蛋白质；序列6的第8728-9753位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列6的第9760-10014位为Nos终止子序列；序列6的第10023-10488位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第10489-10508位为产生非编码链切口的esgRNA靶点序列，第10509-10594位为产生非编码链切口的esgRNA骨架序列，第10595-10603位为Poly T；序列6的第10604-10984位为OsU3启动子的核苷酸序列，第10985-11004位为pegRNA-01靶点序列，第11005-11090位为pegRNA-01所对应的esgRNA骨架序列，第11091-11117位为pegRNA-01上的RT&PBS序列，第11118-11125位为Poly T；PE-P3-1重组表达载体中的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列，序列见表1。
PE-P3-2重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-02所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-3重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-03所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-4重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-04所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-5重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-05所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-6重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-06所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-06靶点序列和pegRNA-06上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-06所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-06靶点序列和pegRNA-06上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-7重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-07所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-07靶点序列和pegRNA-07上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-07所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-07靶点序列和pegRNA-07上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-8重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-08所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-08靶点序列和pegRNA-08上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-08所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-08靶点序列和pegRNA-08上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-9重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-09所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-09靶点序列和pegRNA-09上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-09所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-09靶点序列和pegRNA-09上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-10重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-10所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-10靶点序列和pegRNA-10上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-10所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-10靶点序列和pegRNA-10上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-11重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-11所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-11靶点序列和pegRNA-11上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-11所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-11靶点序列和pegRNA-11上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-12重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-12所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-12靶点序列和pegRNA-12上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-12所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-12靶点序列和pegRNA-12上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-13重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-13所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-13靶点序列和pegRNA-13上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-13所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-13靶点序列和pegRNA-13上的RT&PBS序列见表1。
PE-P3-14重组表达载体的序列为将PE-P3-1重组表达载体序列中产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT&PBS序列分别替换为pegRNA-14所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-14靶点序列和pegRNA-14上的RT&PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。pegRNA-14所对应的产生非编码链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-14靶点序列和pegRNA-14上的RT&PBS序列见表1。
各载体的pegRNA上的靶点核苷酸序列和RT&PBS序列，以及用于产生非编码链切口的esgRNA靶点序列如表1所示。
表1
二、水稻抗性愈伤以及阳性T0苗的获得
将步骤一构建的PE-P2-1，PE-P2-2，PE-P2-3，PE-P2-4，PE-P2-5，PE-P2-6，PE-P2-7，PE-P2-8，PE-P2-9，PE-P2-10，PE-P2-11，PE-P2-12，PE-P2-13，PE-P2-14，PE-P3-1，PE-P3-2，PE-P3-3，PE-P3-4，PE-P3-5，PE-P3-6，PE-P3-7，PE-P3-8，PE-P3-9，PE-P3-10，PE-P3-11，PE-P3-12，PE-P3-13和PE-P3-14重组表达载体，分别按照如下步骤1-9进行操作：
1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。
2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD600为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD600为0.2，得到农杆菌侵染液。
3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。
4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。
5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。
6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。
7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。
8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。
9、对于PE-P2-1，PE-P2-2，PE-P2-3，PE-P2-4，PE-P2-5，PE-P2-6，PE-P2-7，PE-P2-8，PE-P2-9，PE-P2-10，PE-P2-11，PE-P2-12，PE-P2-13，PE-P2-14重组表达载体，提取所获得的水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-GATCTTGATATACTTGGATGATGGC-3’)和引物R(5’-GGGGTACTTCTCGTGGTAGG-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约753bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约753bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。对于PE-P3-1，PE-P3-2，PE-P3-3，PE-P3-4，PE-P3-5，PE-P3-6，PE-P3-7，PE-P3-8，PE-P3-9，PE-P3-10，PE-P3-11，PE-P3-12，PE-P3-13和PE-P3-14重组表达载体，提取所获得的水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-GATCTTGATATACTTGGATGATGGC-3’)和引物R(5’-ATGACTGTCTCCTTCCTTGCC-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约1220bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约1220bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。
三、结果分析
1、每载体分别随机选取步骤二中步骤7所获得的抗性愈伤24块，提取DNA后，随机混合8块愈伤的DNA，最终获得3份混合DNA，即分为3组。以混合DNA为模板，对于OsALS-1靶点，采用引物对OsALS-1进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；对于OsACC-2靶点，采用引物对OsACC-2进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；对于OsWaxy-1靶点，采用引物对OsWaxy-1进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；对于OsDEP1靶点，采用引物对OsDEP1进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；对于OsALS-2靶点，采用引物对OsALS-2进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。以第一轮PCR产物为模板，将不同的正向和反向条码加入PCR产物末端进行文库构建，形成混合文库，使用Illumina NovaSeq6000高通量测序平台测序，每个混合文库测序数据量2G(北京诺禾致源科技股份有限公司)。测序结果只针对各pegRNA区进行分析，引导编辑器愈伤编辑效率为检测到的有全部突变位点的reads数占总reads数的比例的3组平均值。实验结果见表2。
结果表明，对于靶点OsALS-1的突变(+1G/T)和靶点OsACC-2的突变(+5G/C)，引导编辑器PE-P2的愈伤编辑效率均为0，而引导编辑器PE-P3均能够实现这两个靶点的突变，愈伤编辑效率分别为2.59％和4.41％；对于靶点OsALS-1的突变(+1,+2,+5G/T)和靶点OsACC-2的突变(+3,+5,+12A/G,G/C,T/C)，引导编辑器PE-P2的愈伤编辑效率均较低，分别为4.34％和0.47％，而引导编辑器PE-P3能够提高愈伤编辑效率，分别达10.55％和9.6％；对于靶点OsWaxy-1的突变(+1,+10,+14C/T,T/A,T/C)，引导编辑器PE-P2的愈伤编辑效率为2.21％，而引导编辑器PE-P3的愈伤编辑效率为17.16％。综上可见引导编辑器PE-P3大大提高了愈伤编辑效率。
对于靶点OsALS-1，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+1,+2,+5G/T)和RT-S的模板形式(+1G/T)的愈伤编辑效率分别为4.34％和0％，引导编辑器PE-P3的RT-M模板形式(+1,+2,+5G/T)和RT-S的模板形式(+1G/T)的愈伤编辑效率分别为10.55％和2.59％；对于靶点OsACC-2，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+3,+5,+12A/G,G/C,T/C)和RT-S的模板形式(+5G/C)的愈伤编辑效率分别为0.47％和0％，引导编辑器PE-P3的RT-M模板形式(+3,+5,+12A/G,G/C,T/C)和RT-S的模板形式(+5G/C)的愈伤编辑效率分别为9.6％和4.41％；对于靶点OsWaxy-1，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+1,+10,+14C/T,T/A,T/C)和RT-S的模板形式(+14T/C)的愈伤编辑效率分别为2.21％和0％；对于靶点OsDEP1，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+8,+10,+12,+16A/C,C/A,T/G,T/A)和RT-S的模板形式(+8A/C)的愈伤编辑效率分别为2.58％和1.06％；对于靶点OsALS-2，引导编辑器PE-P3的RT-M模板形式(+2,+5,+9C/A,G/A,C/T)和RT-S的模板形式(+9C/T)的愈伤编辑效率分别为3.86％和0％。综上可见RT-M的RT模板设计形式的愈伤编辑效率均高于RT-S模板形式，大大提高了愈伤编辑效率。
2、每载体分别取步骤一中步骤9所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于OsACC-2靶点，采用引物对OsACC-2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsACC-1靶点，采用引物对OsACC-1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsChalk5靶点，采用引物对OsChalk5进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsDEP1靶点，采用引物对OsDEP1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsALS-2靶点，采用引物对OsALS-2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsWaxy-1靶点，采用引物对OsWaxy-1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。所有PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果只针对各pegRNA区进行分析，分别统计各靶点发生碱基替换的T0苗数，计算得出引导编辑器T0苗编辑效率，结果见表3。
结果表明，对于靶点OsACC-2的突变(+5G/C)和靶点OsDEP1的突变(+8A/C)，引导编辑器PE-P2的T0苗编辑效率分别为0％和2.0％，而引导编辑器PE-P3均能够提高这两个靶点的突变，T0苗编辑效率分别为10.0％和8.0％；对于靶点OsACC-1的突变(+2,+5,+10T/A,G/C,A/G)、靶点OsChalk5的突变(+5,+14,+17G/C,T/C,A/T)和靶点OsWaxy-1的突变(+1,+10,+14C/T,T/A,T/C)，引导编辑器PE-P2的T0苗编辑效率均较低，分别为5.4％、1.9％和7.1％，而引导编辑器PE-P3能够提高T0苗编辑效率，分别达8.0％、5.9％和59.2％。综上可见引导编辑器PE-P3大大提高了T0苗编辑效率。
对于靶点OsACC-2，引导编辑器PE-P3的RT-M模板形式(+3,+5,+12A/G,G/C,T/C)和RT-S的模板形式(+5G/C)的T0苗编辑效率分别为32.0％和10.0％；对于靶点OsACC-1，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+2,+5,+10T/A,G/C,A/G)和RT-S模板形式(+10A/G)的T0苗编辑效率分别为5.4％和0％；对于靶点OsChalk5引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+5,+14,+17G/C,T/C,A/T)和RT-S模板形式(+17A/T)的T0苗编辑效率分别为1.9％和0％；对于靶点OsDEP1引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+8,+10,+12,+16A/C,C/A,T/G,T/A)和RT-S模板形式(+8A/C)的T0苗编辑效率分别为2.6％和2.0％；对于靶点OsALS-2引导编辑器PE-P3的RT-M模板形式(+2,+5,+9C/A,G/A,C/T)和RT-S模板形式(+9C/T)的T0苗编辑效率分别为8.0％和0％；对于靶点OsWaxy-1，引导编辑器PE-P2的RT-M模板形式(+1,+10,+14C/T,T/A,T/C)和RT-S的模板形式(+14T/C)的T0苗编辑效率分别为7.1％和0％。综上可见RT-M的RT模板设计形式的T0苗编辑效率均高于RT-S模板形式，大大提高了T0苗编辑效率。
表2
注：RT模板中突变碱基计数：RT模板序列3’端起第1位碱基记为+1。
表3
注：RT模板中突变碱基计数：RT模板序列3’端起第1位碱基记为+1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> PE-P3引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg 60
cggacgtttt taatgtaggt accacctaaa tttccaagct tgtcgtgccc ctctctagag 120
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 180
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 240
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 300
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 360
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 420
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 480
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 540
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 600
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 660
cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 720
cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 780
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 840
gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 900
acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 960
gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 1020
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 1080
cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 1140
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 1200
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 1260
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 1320
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 1380
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 1440
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 1500
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 1560
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 1620
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 1680
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 1740
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 1800
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 1860
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 1920
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 1980
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 2040
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagtacgtaa gcatggacta caaggaccac 2100
gacggggatt acaaagacca cgacatagac tacaaggatg acgatgacaa aatggcaccg 2160
aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg 2220
aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg aagaaaaaaa ggaaggtcgg aatccatggc 2280
gttccagaat tcgacaagaa gtactccatc ggcctcgaca tcggcaccaa cagcgtcggc 2340
tgggcggtga tcaccgacga gtacaaggtc ccgtccaaga agttcaaggt cctgggcaac 2400
accgaccgcc actccatcaa gaagaacctc atcggcgccc tcctcttcga ctccggcgag 2460
acggcggagg cgacccgcct caagcgcacc gcccgccgcc gctacacccg ccgcaagaac 2520
cgcatctgct acctccagga gatcttctcc aacgagatgg cgaaggtcga cgactccttc 2580
ttccaccgcc tcgaggagtc cttcctcgtg gaggaggaca agaagcacga gcgccacccc 2640
atcttcggca acatcgtcga cgaggtcgcc taccacgaga agtaccccac tatctaccac 2700
cttcgtaaga agcttgttga ctctactgat aaggctgatc ttcgtctcat ctaccttgct 2760
ctcgctcaca tgatcaagtt ccgtggtcac ttccttatcg agggtgacct taaccctgat 2820
aactccgacg tggacaagct cttcatccag ctcgtccaga cctacaacca gctcttcgag 2880
gagaacccta tcaacgcttc cggtgtcgac gctaaggcga tcctttccgc taggctctcc 2940
aagtccaggc gtctcgagaa cctcatcgcc cagctccctg gtgagaagaa gaacggtctt 3000
ttcggtaacc tcatcgctct ctccctcggt ctgaccccta acttcaagtc caacttcgac 3060
ctcgctgagg acgctaagct tcagctctcc aaggatacct acgacgatga tctcgacaac 3120
ctcctcgctc agattggaga tcagtacgct gatctcttcc ttgctgctaa gaacctctcc 3180
gatgctatcc tcctttcgga tatccttagg gttaacactg agatcactaa ggctcctctt 3240
tctgcttcca tgatcaagcg ctacgacgag caccaccagg acctcaccct cctcaaggct 3300
cttgttcgtc agcagctccc cgagaagtac aaggagatct tcttcgacca gtccaagaac 3360
ggctacgccg gttacattga cggtggagct agccaggagg agttctacaa gttcatcaag 3420
ccaatccttg agaagatgga tggtactgag gagcttctcg ttaagcttaa ccgtgaggac 3480
ctccttagga agcagaggac tttcgataac ggctctatcc ctcaccagat ccaccttggt 3540
gagcttcacg ccatccttcg taggcaggag gacttctacc ctttcctcaa ggacaaccgt 3600
gagaagatcg agaagatcct tactttccgt attccttact acgttggtcc tcttgctcgt 3660
ggtaactccc gtttcgcttg gatgactagg aagtccgagg agactatcac cccttggaac 3720
ttcgaggagg ttgttgacaa gggtgcttcc gcccagtcct tcatcgagcg catgaccaac 3780
ttcgacaaga acctccccaa cgagaaggtc ctccccaagc actccctcct ctacgagtac 3840
ttcacggtct acaacgagct caccaaggtc aagtacgtca ccgagggtat gcgcaagcct 3900
gccttcctct ccggcgagca gaagaaggct atcgttgacc tcctcttcaa gaccaaccgc 3960
aaggtcaccg tcaagcagct caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg cttcgactcc 4020
gtcgagatca gcggcgttga ggaccgtttc aacgcttctc tcggtaccta ccacgatctc 4080
ctcaagatca tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaacgagga catcctcgag 4140
gacatcgtcc tcactcttac tctcttcgag gatagggaga tgatcgagga gaggctcaag 4200
acttacgctc atctcttcga tgacaaggtt atgaagcagc tcaagcgtcg ccgttacacc 4260
ggttggggta ggctctcccg caagctcatc aacggtatca gggataagca gagcggcaag 4320
actatcctcg acttcctcaa gtctgatggt ttcgctaaca ggaacttcat gcagctcatc 4380
cacgatgact ctcttacctt caaggaggat attcagaagg ctcaggtgtc cggtcagggc 4440
gactctctcc acgagcacat tgctaacctt gctggttccc ctgctatcaa gaagggcatc 4500
cttcagactg ttaaggttgt cgatgagctt gtcaaggtta tgggtcgtca caagcctgag 4560
aacatcgtca tcgagatggc tcgtgagaac cagactaccc agaagggtca gaagaactcg 4620
agggagcgca tgaagaggat tgaggagggt atcaaggagc ttggttctca gatccttaag 4680
gagcaccctg tcgagaacac ccagctccag aacgagaagc tctacctcta ctacctccag 4740
aacggtaggg atatgtacgt tgaccaggag ctcgacatca acaggctttc tgactacgac 4800
gtcgacgcca ttgttcctca gtctttcctt aaggatgact ccatcgacaa caaggtcctc 4860
acgaggtccg acaagaacag gggtaagtcg gacaacgtcc cttccgagga ggttgtcaag 4920
aagatgaaga actactggag gcagcttctc aacgctaagc tcattaccca gaggaagttc 4980
gacaacctca cgaaggctga gaggggtggc ctttccgagc ttgacaaggc tggtttcatc 5040
aagaggcagc ttgttgagac gaggcagatt accaagcacg ttgctcagat cctcgattct 5100
aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtcaa ggtgatcacc 5160
ctcaagtcca agctcgtctc cgacttccgc aaggacttcc agttctacaa ggtccgcgag 5220
atcaacaact accaccacgc tcacgatgct taccttaacg ctgtcgttgg taccgctctt 5280
atcaagaagt accctaagct tgagtccgag ttcgtctacg gtgactacaa ggtctacgac 5340
gttcgtaaga tgatcgccaa gtccgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 5400
ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctcgccaa cggcgagatc 5460
cgcaagcgcc ctcttatcga gacgaacggt gagactggtg agatcgtttg ggacaagggt 5520
cgcgacttcg ctactgttcg caaggtcctt tctatgcctc aggttaacat cgtcaagaag 5580
accgaggtcc agaccggtgg cttctccaag gagtctatcc ttccaaagag aaactcggac 5640
aagctcatcg ctaggaagaa ggattgggac cctaagaagt acggtggttt cgactcccct 5700
actgtcgcct actccgtcct cgtggtcgcc aaggtggaga agggtaagtc gaagaagctc 5760
aagtccgtca aggagctcct cggcatcacc atcatggagc gctcctcctt cgagaagaac 5820
ccgatcgact tcctcgaggc caagggctac aaggaggtca agaaggacct catcatcaag 5880
ctccccaagt actctctttt cgagctcgag aacggtcgta agaggatgct ggcttccgct 5940
ggtgagctcc agaagggtaa cgagcttgct cttccttcca agtacgtgaa cttcctctac 6000
ctcgcctccc actacgagaa gctcaagggt tcccctgagg ataacgagca gaagcagctc 6060
ttcgtggagc agcacaagca ctacctcgac gagatcatcg agcagatctc cgagttctcc 6120
aagcgcgtca tcctcgctga cgctaacctc gacaaggtcc tctccgccta caacaagcac 6180
cgcgacaagc ccatccgcga gcaggccgag aacatcatcc acctcttcac gctcacgaac 6240
ctcggcgccc ctgctgcttt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa gcgttacacg 6300
tccaccaagg aggttctcga cgctactctc atccaccagt ccatcaccgg tctttacgag 6360
actcgtatcg acctttccca gcttggtggt gatagcggtg gctccagcgg tggtagcagc 6420
ggtagcgaaa ctccagggac ctcggaatcg gcgactccag aatccagtgg gggtagcagc 6480
ggcggatcca gcaccctcaa tatcgaggac gagtacaggc tgcatgagac atccaaggag 6540
ccggacgtgt cactcggctc tacatggctg agcgatttcc cacaggcctg ggcggagaca 6600
ggcggcatgg gcctcgcggt caggcaggcg ccgctcatca ttccactgaa ggcgacctcc 6660
acaccggtca gcatcaagca gtacccaatg tcacaggagg cacggctcgg catcaagcca 6720
cacattcaga ggctcctgga ccagggcatt ctggtccctt gccagagccc gtggaacacc 6780
cctctcctgc cggtgaagaa gcctggcaca aatgactaca ggccggtcca ggatctcagg 6840
gaggtgaaca agcgcgtcga ggatatccat ccgaccgtgc cgaacccata caatctcctg 6900
tcaggcctcc cgccatctca ccagtggtac accgtcctcg acctgaagga tgcgttcttc 6960
tgcctcaggc tgcatccaac aagccagcct ctcttcgcct tcgagtggcg cgatccagag 7020
atgggcattt caggccagct cacctggaca cggctgccac agggcttcaa gaactctcct 7080
accctcttca atgaggcgct ccatcgggac ctggccgatt tcaggatcca gcaccctgac 7140
ctcattctcc tgcagtacgt ggacgatctc ctgctcgccg cgacatcaga gctggattgc 7200
cagcagggca ccagggccct gctccagaca ctcggcaatc tgggctaccg ggcctctgcg 7260
aagaaggccc agatctgcca gaagcaggtg aagtacctcg gctacctgct caaggaggga 7320
cagaggtggc tgacagaggc aaggaaggag acagtcatgg gccagcctac cccgaagaca 7380
cctcggcagc tcagggagtt cctgggcaag gccggattct gcaggctctt cattccagga 7440
ttcgcggaga tggcggcgcc actctaccct ctgaccaagc cgggcacact gttcaactgg 7500
ggcccagacc agcagaaggc gtaccaggag attaagcagg cactgctcac agcacctgcg 7560
ctcggcctgc cggacctcac aaagccattc gagctgttcg tggatgagaa gcagggctac 7620
gcgaagggag tcctgacaca gaagctggga ccatggaggc gcccagtggc ctacctctca 7680
aagaagctcg acccagtggc ggccggatgg cctccgtgcc tgaggatggt ggcggccatt 7740
gccgtcctca ccaaggatgc cggcaagctg acaatgggcc agcctctcgt gattctggcg 7800
ccgcatgcgg tggaggccct ggtcaagcag ccacctgata ggtggctgtc caacgcgcgc 7860
atgacccact accaggccct gctcctggac acagataggg tccagttcgg accagtggtg 7920
gcactcaatc ctgccacact gctgccactc cctgaggagg gcctgcagca taactgcctc 7980
gatattctgg cggaggccca tggcacccgg ccagacctca cagatcagcc gctgccagac 8040
gccgatcaca cctggtacac agatggctca tctctcctgc aggagggcca gaggaaggcc 8100
ggagcagccg tgaccacaga gacagaggtc atctgggcaa aggccctccc agcgggcacc 8160
tcagcacaga gggccgagct cattgcactg acacaggcgc tcaagatggc cgagggcaag 8220
aagctgaatg tgtacacaga ctccaggtac gcattcgcca cagcacacat ccatggcgag 8280
atttacaggc ggaggggatg gctcacatca gagggaaagg agatcaagaa caaggatgag 8340
attctcgcgc tcctgaaggc cctcttcctg cctaagcgcc tgtcaatcat tcactgccca 8400
ggacatcaga agggacactc agccgaggca aggggaaata ggatggcaga ccaggcggcc 8460
aggaaggcag cgatcaccga gacaccagat acctccacac tcctgattga gaactccagc 8520
cctgacgatg acaaaatggc accgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 8580
aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 8640
aaaaggaagg tcggaatcca tggcggatca ggagccacca acttctccct cctcaagcag 8700
gccggcgacg tggaggagaa cccgggccca atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct 8760
gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag 8820
ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta 8880
aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc 8940
gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc 9000
atctcccgcc gttcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct 9060
gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg 9120
agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc 9180
atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc 9240
agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa 9300
gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc 9360
ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc 9420
aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag 9480
cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt 9540
cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag 9600
ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc 9660
cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac 9720
cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagacta gttcccgatc gttcaaacat 9780
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 9840
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 9900
gaggtgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 9960
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagacct 10020
gcaggtggaa tcggcagcaa aggatttttt cctgtagttt tcccacaacc attttttacc 10080
atccgaatga taggatagga aaaatatcca agtgaacagt attcctataa aattcccgta 10140
aaaagcctgc aatccgaatg agccctgaag tctgaactag ccggtcacct gtacaggcta 10200
tcgagatgcc atacaagaga cggtagtagg aactaggaag acgatggttg attcgtcagg 10260
cgaaatcgtc gtcctgcagt cgcatctatg ggcctggacg gaatagggga aaaagttggc 10320
cggataggag ggaaaggccc aggtgcttac gtgcgaggta ggcctgggct ctcagcactt 10380
cgattcgttg gcaccggggt aggatgcaat agagagcaac gtttagtacc acctcgctta 10440
gctagagcaa actggactgc cttatatgcg cgggtgctgg cttggctgcc gatatctcgc 10500
tctcacattc cgtttcagag ctatgctgga aacagcatag caagttgaaa taaggctagt 10560
ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttttagga atctttaaac 10620
atacgaacag atcacttaaa gttcttctga agcaacttaa agttatcagg catgcatgga 10680
tcttggagga atcagatgtg cagtcaggga ccatagcaca agacaggcgt cttctactgg 10740
tgctaccagc aaatgctgga agccgggaac actgggtacg ttggaaacca cgtgtgatgt 10800
gaaggagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag 10860
gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat 10920
tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctggttt aaaagagttg tgcagatgat 10980
ccgtggcggg tatggtggtg caatggggtt tcagagctat gctggaaaca gcatagcaag 11040
ttgaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaaaccta 11100
tcctccaatt gcaccaccat ttttttttgg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta 11160
caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 11220
cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 11280
cgcagcctga atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc 11340
cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag 11400
agcgtttatt agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat 11460
ttgtatgtgc atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc 11520
tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca 11580
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<213> Artificial Sequence
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Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
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Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
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210 215 220
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Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
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Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
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355 360 365
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485 490 495
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835 840 845
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850 855 860
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Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
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Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
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Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
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115 120 125
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130 135 140
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Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
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Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
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Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys
625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile
660 665 670
Glu Asn Ser Ser Pro
675
<210> 4
<211> 341
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ser Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Lys
340
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg 60
cggacgtttt taatgtaggt accacctaaa tttccaagct tgtcgtgccc ctctctagag 120
ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 180
gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 240
taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 300
catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 360
tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 420
ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 480
acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 540
ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 600
taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 660
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cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 780
agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 840
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gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 1020
accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 1080
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agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 1200
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 1260
ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 1320
ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 1380
gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 1440
gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 1500
ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 1560
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 1620
atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 1680
attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 1740
gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 1800
gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 1860
tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 1920
ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 1980
gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 2040
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagtacgtaa gcatggacta caaggaccac 2100
gacggggatt acaaagacca cgacatagac tacaaggatg acgatgacaa aatggcaccg 2160
aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg 2220
aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg aagaaaaaaa ggaaggtcgg aatccatggc 2280
gttccagaaa ccctcaatat cgaggacgag tacaggctgc atgagacatc caaggagccg 2340
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ggcatgggcc tcgcggtcag gcaggcgccg ctcatcattc cactgaaggc gacctccaca 2460
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attcagaggc tcctggacca gggcattctg gtcccttgcc agagcccgtg gaacacccct 2580
ctcctgccgg tgaagaagcc tggcacaaat gactacaggc cggtccagga tctcagggag 2640
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ctcaggctgc atccaacaag ccagcctctc ttcgccttcg agtggcgcga tccagagatg 2820
ggcatttcag gccagctcac ctggacacgg ctgccacagg gcttcaagaa ctctcctacc 2880
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aggtggctga cagaggcaag gaaggagaca gtcatgggcc agcctacccc gaagacacct 3180
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ccagaccagc agaaggcgta ccaggagatt aagcaggcac tgctcacagc acctgcgctc 3360
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aagggagtcc tgacacagaa gctgggacca tggaggcgcc cagtggccta cctctcaaag 3480
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catgcggtgg aggccctggt caagcagcca cctgataggt ggctgtccaa cgcgcgcatg 3660
acccactacc aggccctgct cctggacaca gatagggtcc agttcggacc agtggtggca 3720
ctcaatcctg ccacactgct gccactccct gaggagggcc tgcagcataa ctgcctcgat 3780
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gatcacacct ggtacacaga tggctcatct ctcctgcagg agggccagag gaaggccgga 3900
gcagccgtga ccacagagac agaggtcatc tgggcaaagg ccctcccagc gggcacctca 3960
gcacagaggg ccgagctcat tgcactgaca caggcgctca agatggccga gggcaagaag 4020
ctgaatgtgt acacagactc caggtacgca ttcgccacag cacacatcca tggcgagatt 4080
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ctcgcgctcc tgaaggccct cttcctgcct aagcgcctgt caatcattca ctgcccagga 4200
catcagaagg gacactcagc cgaggcaagg ggaaatagga tggcagacca ggcggccagg 4260
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agcggtggct ccagcggtgg tagcagcggt agcgaaactc cagggacctc ggaatcggcg 4380
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ctcgacatcg gcaccaacag cgtcggctgg gcggtgatca ccgacgagta caaggtcccg 4500
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cgccgccgct acacccgccg caagaaccgc atctgctacc tccaggagat cttctccaac 4680
gagatggcga aggtcgacga ctccttcttc caccgcctcg aggagtcctt cctcgtggag 4740
gaggacaaga agcacgagcg ccaccccatc ttcggcaaca tcgtcgacga ggtcgcctac 4800
cacgagaagt accccactat ctaccacctt cgtaagaagc ttgttgactc tactgataag 4860
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cttatcgagg gtgaccttaa ccctgataac tccgacgtgg acaagctctt catccagctc 4980
gtccagacct acaaccagct cttcgaggag aaccctatca acgcttccgg tgtcgacgct 5040
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ctccctggtg agaagaagaa cggtcttttc ggtaacctca tcgctctctc cctcggtctg 5160
acccctaact tcaagtccaa cttcgacctc gctgaggacg ctaagcttca gctctccaag 5220
gatacctacg acgatgatct cgacaacctc ctcgctcaga ttggagatca gtacgctgat 5280
ctcttccttg ctgctaagaa cctctccgat gctatcctcc tttcggatat ccttagggtt 5340
aacactgaga tcactaaggc tcctctttct gcttccatga tcaagcgcta cgacgagcac 5400
caccaggacc tcaccctcct caaggctctt gttcgtcagc agctccccga gaagtacaag 5460
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caggaggagt tctacaagtt catcaagcca atccttgaga agatggatgg tactgaggag 5580
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tctatccctc accagatcca ccttggtgag cttcacgcca tccttcgtag gcaggaggac 5700
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aaggagcttg gttctcagat ccttaaggag caccctgtcg agaacaccca gctccagaac 6840
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gacatcaaca ggctttctga ctacgacgtc gacgccattg ttcctcagtc tttccttaag 6960
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gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc 9300
cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata 9360
acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 9420
atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg 9480
aggcatccgg agcttgcagg atcgccacga ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt 9540
gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt 9600
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gtgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 9960
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ggtggaatcg gcagcaaagg attttttcct gtagttttcc cacaaccatt ttttaccatc 10080
cgaatgatag gataggaaaa atatccaagt gaacagtatt cctataaaat tcccgtaaaa 10140
agcctgcaat ccgaatgagc cctgaagtct gaactagccg gtcacctgta caggctatcg 10200
agatgccata caagagacgg tagtaggaac taggaagacg atggttgatt cgtcaggcga 10260
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ttcgttggca ccggggtagg atgcaataga gagcaacgtt tagtaccacc tcgcttagct 10440
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cacattccgt ttcagagcta tgctggaaac agcatagcaa gttgaaataa ggctagtccg 10560
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tttaggaatc tttaaacata 10620
cgaacagatc acttaaagtt cttctgaagc aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct 10680
tggaggaatc agatgtgcag tcagggacca tagcacaaga caggcgtctt ctactggtgc 10740
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tccaattgca ccaccatttt tttttggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa 11160
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agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt 11340
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gtttattaga ataacggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg 11460
tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc caacccctcc 11520
gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc gtcttctgaa aacgacatgt 11580
cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc cttttcctgg cgttttcttg 11640
tcgcgtgttt tagtcgcata aagtagaata cttgcgacta gaaccggaga cattacgcca 11700
tgaacaagag cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg cgtcagcacc gacgaccagg 11760
acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg caccaagctg ttttccgaga 11820
agatcaccgg caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag gatgcttgac cacctacgcc 11880
ctggcgacgt tgtgacagtg accaggctag accgcctggc ccgcagcacc cgcgacctac 11940
tggacattgc cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg gcagagccgt 12000
gggccgacac caccacgccg gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg 12060
agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc 12120
gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg 12180
agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc 12240
gctcgaccct gtaccgcgca cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc 12300
ggcgcggtgc cttccgtgag gacgcattga ccgaggccga cgccctggcg gccgccgaga 12360
atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac ggccaggacg aaccgttttt 12420
cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc 12480
gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc 12540
ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg 12600
tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg tatatgatgc gatgagtaaa 12660
taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg tacttaacca gaaaggcggg 12720
tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc tgcaactcgc cggggccgat 12780
gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg attgggcggc cgtgcgggaa 12840
gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga ttgaccgcga cgtgaaggcc 12900
atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg 12960
tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc ttacgacata 13020
tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg 13080
ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt 13140
gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt cccgtatcac gcagcgcgtg 13200
agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac 13260
gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat caaaactcat ttgagttaat 13320
gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac 13380
gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca 13440
actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca 13500
agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat 13560
gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa 13620
ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta 13680
agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg 13740
gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct 13800
ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg 13860
ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc 13920
ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt 13980
cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt 14040
tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga 14100
cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct 14160
ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg 14220
agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg 14280
agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac 14340
gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga 14400
gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta 14460
catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga 14520
cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta 14580
ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta 14640
cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat 14700
cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat 14760
cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac 14820
ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag ttctctttcc 14880
tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat 14940
tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga 15000
gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg 15060
cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac 15120
ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg 15180
ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc 15240
gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg 15300
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 15360
atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg 15420
cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc 15480
agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 15540
gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 15600
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 15660
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 15720
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 15780
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 15840
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 15900
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 15960
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 16020
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 16080
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 16140
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 16200
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 16260
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 16320
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 16380
aaactcacgt taagggattt tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa 16440
aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa aaaatagctc 16500
gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg caatgtcata 16560
ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag ccacttactt tgccatcttt 16620
cacaaagatg ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag acaagttcct cttcgggctt 16680
ttccgtcttt aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta aatggagtgt cttcttccca 16740
gttttcgcaa tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag taatccaatt cggctaagcg 16800
gctgtctaag ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa agagcctgat 16860
gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga 16920
gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa 16980
gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt ccttttcccg 17040
ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc 17100
attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca 17160
gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag ccatttatta 17220
tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg 17280
aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca 17340
aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg 17400
tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 17460
atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 17520
gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc 17580
ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggct 17636

Claims (8)

1.成套系统在如下S1）-S4）任一种中的应用：
S1）植物或植物细胞基因组序列的编辑；
S2）制备植物或植物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3）提高植物或植物细胞基因组序列的编辑效率；
S4）制备提高植物或植物细胞基因组序列的编辑效率的产品；
所述成套系统包括融合蛋白和pegRNA；
所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述反转录酶融合在所述Cas9切刻酶的N端，且通过自切割寡肽与筛选标记蛋白融合；
所述Cas9切刻酶为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
所述反转录酶为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
所述自切割寡肽为氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；
所述pegRNA依次由靶点序列、esgRNA骨架、RT序列和PBS序列组成；所述esgRNA骨架为将序列1第11008-11093位中的T替换为U得到的RNA分子；
所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Cas9切刻酶的编码基因为序列1第2293-6393位所示的DNA分子。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述反转录酶的编码基因为序列1第6493-8523位所示的DNA分子。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述筛选标记蛋白为潮霉素磷酸转移酶；所述潮霉素磷酸转移酶为氨基酸序列是序列4所示的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为序列1第8731-9756位所示的DNA分子。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述自切割寡肽的编码基因为序列1第8674-8730位所示的DNA分子。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述成套系统还包括esgRNA。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。
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