CN111378051A - Pe-p2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 - Google Patents

Pe-p2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PE‑P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。所述PE‑P2引导编辑系统包括融合蛋白、pegRNA；所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。本发明通过自剪切多肽P2A使得PE‑P1系统中的RT、Cas9n(H840A)和HPT三者融合表达，并将sgRNA骨架替换为了esgRNA骨架，得到PE‑P2引导编辑系统。与PE‑P1引导编辑系统相比，本发明的PE‑P2引导编辑系统不仅可提高编辑靶点的编辑效率，还实现了不可编辑靶点的有效编辑。

Description

PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。
背景技术
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2016年和2017年相继报道的胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器虽可以精确的实现胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)以及腺嘌呤(Adenine，A)到鸟嘌呤(Guanine，G)的转换，且不产生DSB也不引入DNA模板，但无法实现嘌呤和嘧啶之间的颠换，即无法实现A到T的替换、T到A的替换、C到G的替换、G到C的替换、A到C的替换、T到G的替换、C到A的替换、G到T的替换。同时，碱基编辑器只能编辑活性窗口内的C或T，而且当活性窗口内存在多个C或多个T时，容易产生靶标C或T与非靶标C或T共编辑而不能最终得到预期编辑产物。所有这些弊端大大限制了碱基编辑器的实际应用。
2019年，David Liu实验室报道了一种新的基因组编辑技术，即引导编辑技术(Prime editing)，开发了三种引导编辑器(Prime editor，PE)，分别是PE1、PE2和PE3。所有这三种PE均为反转录酶(reverse transcriptase，RT)与Cas9 H840A切口酶(Cas9n(H840A))融合在一起，使用引导编辑技术向导RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)实现基因组编辑。pegRNA除了包含通常的向导RNA(sgRNA)外，还包含一段含有目标碱基突变的RT模板以及引物结合位点(primer binding site，PBS)。实验表明该技术可在动物细胞基因组中实现所有12种碱基替换类型的编辑，打破了传统碱基编辑器的限制，大大提高了碱基编辑范围。
目前，虽然引导编辑技术可以实现所有类型的碱基替换，但仍然存在碱基编辑效率不高，或是部分位点不能被编辑的问题。
发明内容
第一方面，本发明保护一种成套系统。
本发明保护的成套系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；
所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。
上述成套系统中，所述Cas9切刻酶可为Cas9n(H840A)；
所述Cas9切刻酶变体包括来源于细菌的Cas9(如SaCas9、SaCas9-KKH等)，识别不同PAM的Cas9变体(如xCas9、Cas9-NG、Cas9-VQR、Cas9-VRER等)，Cas9高保真酶变体(如HypaCas9、eSpCas9(1.1)、Cas9-HF1等)等。
进一步的，所述Cas9切刻酶为Cas9n(H840A)；所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：
a1)序列1第3013-7113位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述反转录酶可为来源于病毒中的反转录酶，如来源于莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)的反转录酶、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的反转录酶等，也可为来源于细菌中的病毒，如来源于大肠杆菌中的反转录酶等。
进一步的，所述反转录酶为来源于莫洛尼小鼠白血病病毒的反转录酶(M-MLVRT)；所述M-MLV RT为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
更进一步的，所述M-MLV RT的编码基因为b1)或b2)或b3)：
b1)序列1第7213-9243位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。
进一步的，所述自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽(P2A)；所述P2A的氨基酸序列为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
更进一步的，所述P2A的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列5第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；
进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：
d1)序列1第11665-12690位所示的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。
上述成套系统中，所述pegRNA依次由靶点序列(记作靶点序列甲)、sgRNA骨架或esgRNA骨架、RT序列和PBS序列组成。
所述RT序列为靶点序列3’端3个碱基及其后连续的一段基因组序列的反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出cDNA，然后作为修复模板，对基因组DNA进行修复。所述RT序列大小进一步可为8-34bp。
所述PBS序列(引物结合位点序列)为5’端第n个碱基到第17个碱基靶点序列的反向互补序列(1≤n<17)。
所述RT序列和所述PBS序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(Prime editing，PE)中与pegRNA的RT序列和PBS序列相关的设计方法或原理。
所述sgRNA骨架为E1)或E2)或E3)：
E1)将序列1第570-645位中的T替换为U得到的RNA分子；
E2)将E1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
E3)与E1)或E2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
所述esgRNA骨架为F1)或F2)或F3)：
F1)将序列5第10512-10597位中的T替换为U得到的RNA分子；
F2)将F1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。
上述成套系统还可包括如下G1)或G2)：
G1)sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料；
G2)esgRNA或与所述esgRNA相关的生物材料。
所述G1)中，所述sgRNA依次由靶点序列(记作靶点序列乙)和上述sgRNA骨架组成。该sgRNA用于产生非编辑链切口，非编辑链切口位点可以随意选择。所述靶点序列甲与所述靶点序列乙分别位于目标DNA的两条链上，二者可以互补重合或部分互补重合，也可以有一定距离。
所述G2)中，所述esgRNA依次由靶点序列(记作靶点序列丙)和上述esgRNA骨架组成。该esgRNA用于产生非编辑链切口，非编辑链切口位点可以随意选择。所述靶点序列甲与所述靶点序列丙分别位于目标DNA的两条链上，二者可以互补重合或部分互补重合，也可以有一定距离。
上述成套系统的用途具体如下：
S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
第二方面，本发明保护上述成套系统或上述成套系统中的融合蛋白在S1)-S4)任一种中的应用：
S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
第三方面，本发明保护如下T1)-T4)所述的方法：
T1)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；
T2)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述sgRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；所述sgRNA靶向靶点序列乙，用于在非编辑链上产生切口，以提高目标突变的编辑效率。
T3)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；所述esgRNA靶向靶点序列丙，用于在非编辑链上产生切口，以提高目标突变的编辑效率。
T4)生物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照T1)-T3)所述的方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。
上述方法中，所述T1)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因和转录上述pegRNA的DNA分子导入目的植物中。
所述T2)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述sgRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因、转录上述pegRNA的DNA分子和转录上述sgRNA的DNA分子导入目的植物中。
所述T3)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因、转录上述pegRNA的DNA分子和转录上述esgRNA的DNA分子导入目的植物中。
进一步的，所述T3)中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过重组表达载体导入目的植物中。所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子可通过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入目的植物中。
在本发明的具体实施例中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过同一个重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体包括依次由启动子、Cas9n(H840A)的编码基因、反转录酶M-MLV RT的编码基因、自切割寡肽P2A的编码基因、筛选剂抗性蛋白HPT的编码基因和终止子组成的表达盒，依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒和依次由启动子、所述转录pegRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒。
更进一步的，所述重组表达载体为PE-P2-1载体、PE-P2-2载体、PE-P2-3载体、PE-P2-4载体或PE-P2-5载体。所述PE-P2-1重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-01，所述PE-P2-2重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-02，所述PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-03，所述PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-04，所述PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-05。
所述PE-P2-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列5。所述PE-P2-1重组表达载体中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。
所述PE-P2-2重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。
所述PE-P2-3重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-3重组表达载体中pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-4重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-4重组表达载体中pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-5重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-5重组表达载体中pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述基因组序列的编辑包括所述基因组序列的碱基替换(如单碱基替换和多碱基替换)、碱基插入(如单碱基插入和多碱基插入)和碱基删除(如单碱基删除和多碱基删除)。在本发明的具体实施例中，所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述生物体为X1)或X2)或X3)或X4)：X1)植物或动物；X2)单子叶植物或双子叶植物；X3)禾本科植物；X4)水稻。所述生物细胞为Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：Y1)植物细胞或动物细胞；Y2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；Y3)禾本科植物细胞；Y4)水稻细胞。
本发明通过自剪切多肽(a self-cleavage 2A peptide)P2A使得PE系统中的RT和Cas9n(H840A)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)三者融合表达，且将sgRNA替换为esgRNA，提供了PE-P2引导编辑系统。与PE-P1引导编辑系统相比，本发明的PE-P2引导编辑系统不仅可提高编辑靶点的编辑效率，还实现了不可编辑靶点的编辑。
附图说明
图1为两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的结构示意图。
图2为pegRNA向导的Cas9n(H840A)切割位点示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
引物对OsALS-1由引物OsALS-1-F：5’-gcgcccgattctctatgtc-3’和引物OsALS-1-R：5’-tcctgccatcaccatccag-3’组成，用于扩增靶点OsALS-1。
引物对OsALS-2由引物OsALS-2-F：5’-gtcatcaccaaccacctcttcc-3’和引物OsALS-2-R：5’-gacatagagaatcgggcgc-3’组成，用于扩增靶点OsALS-2。
引物对OsACC由引物OsACC-F：5’-gtgctggacaagtgtggtttc-3’和引物OsACC-R：5’-gatcgtgattcttcccagtcc-3’组成，用于扩增靶点OsACC。
引物对OsDEP1由引物OsDEP1-F：5’-cgtgctctaccaattgctgta-3’和引物OsDEP1-R：5’-atatcttcacggtctattggcg-3’组成，用于扩增靶点OsDEP1。
以下实施例中，
引导编辑器碱基替换效率＝发生目标突变的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。
日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。
恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。
筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。
分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。
实施例1、PE-P2引导编辑系统的表达载体的构建及其在提高碱基编辑效率中的应用
一、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的设计与构建
1、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的设计
两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的结构示意图如图1所示。
引导编辑系统PE-P1的表达载体包括pegRNA表达盒、sgRNA表达盒、由Cas9n(H840A)和M-MLV RT组成的融合蛋白的表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒。
引导编辑系统PE-P2包括pegRNA表达盒、esgRNA表达盒、由Cas9n(H840A)、M-MLVRT、自剪切多肽P2A和筛选剂抗性蛋白组成的融合蛋白的表达盒。
2、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的构建
人工合成如下重组载体，各载体均为环状质粒：
引导编辑系统PE-P1的重组表达载体共计5个，分别是PE-P1-1载体，PE-P1-2载体，PE-P1-3载体，PE-P1-4载体和PE-P1-5载体。
引导编辑系统PE-P2的重组表达载体共计5个，分别是PE-P2-1载体，PE-P2-2载体，PE-P2-3载体，PE-P2-4载体和PE-P2-5载体。
将PE-P1-1重组表达载体和PE-P2-1重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-01，将PE-P1-2重组表达载体和PE-P2-2重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-02，将PE-P1-3重组表达载体和PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-03，将PE-P1-4重组表达载体和PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-04，将PE-P1-5重组表达载体和PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-05。
PE-P1-1重组表达载体的序列为序列表中的序列1。其中，序列1的第84-549位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第550-569位为产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列，第570-645位为产生非编辑链切口的sgRNA骨架序列，第646-654位为Poly T；序列1的第655-1035位为OsU3启动子的核苷酸序列，第1036-1055位为pegRNA-01靶点序列，第1056-1131位为pegRNA-01所对应的sgRNA骨架序列，第1132-1158位为pegRNA-01上的RT序列与PBS序列，第1159-1166位为Poly T；序列1的第1173-2886位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3013-7113位为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列1的第7213-9243位为M-MLV RT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列1的第9397-9591位为35S终止子序列；序列1的第9666-11658位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第11665-12690位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列1的第12717-12932位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。PE-P1-1重组表达载体中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P1-2重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P1-3重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-3重组表达载体中pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P1-4重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-4重组表达载体中pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P1-5重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-5重组表达载体中pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列5。其中，序列5的第102-2073位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第2293-6393为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列5的第6493-8523位为M-MLVRT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列5的第8674-8730位为P2A的编码序列，编码序列6所示的蛋白质；序列5的第8731-9756位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列5的第9763-10017位为Nos终止子序列；序列5的第10026-10491位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第10492-10511位为产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列，第10512-10597位为产生非编辑链切口的esgRNA骨架序列，第10598-10604位为Poly T；序列5的第10605-10985位为OsU3启动子的核苷酸序列，第10986-11005位为pegRNA-01靶点序列，第11006-11091位为pegRNA-01所对应的esgRNA骨架序列，第11092-11118位为pegRNA-01上的RT序列与PBS序列，第11119-11126位为Poly T。PE-P2-1重组表达载体中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-2重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-3重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-4重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。
PE-P2-5重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。
各载体的pegRNA上的靶点序列和RT序列与PBS序列，以及用于产生非编辑链切口的sgRNA或esgRNA靶点序列如表1所示。
表1、编辑靶点的详细信息
Figure BDA0002425527380000091
二、水稻阳性T0苗的获得
将步骤一获得的PE-P1-1载体，PE-P1-2载体，PE-P1-3载体，PE-P1-4载体，PE-P1-5载体，PE-P2-1载体，PE-P2-2载体，PE-P2-3载体，PE-P2-4载体和PE-P2-5载体分别按照如下步骤1-8进行操作：
1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。
2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD600为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD600为0.2，得到农杆菌侵染液。
3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。
4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。
5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。
6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。
7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。
8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。
三、结果分析
1、每载体分别取步骤二所获得的水稻T0苗的基因组DNA作为模板，对于OsALS-1靶点，采用引物对OsALS-1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsALS-2靶点，采用引物对OsALS-2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsACC靶点，采用引物对OsACC进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsDEP1靶点，采用引物对OsDEP1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各pegRNA区进行分析。分别统计各靶点发生目标碱基替换的T0苗数，计算得出引导编辑器碱基替换效率，结果见表2。
结果表明，对所有四个靶点，五种pegRNA设计，引导编辑系统PE-P2的碱基替换效率均较PE-P1高。增效最高高达21.7倍(OsALS-1靶点，pegRNA-04设计)。而且引导编辑系统PE-P1不能对靶点OsACC和OsDEP1进行目标突变的碱基编辑，而引导编辑系统PE-P2能够实现对二者的编辑，且对OsDEP1靶点的编辑效率高达9.1％。相对于引导编辑系统PE-P1，引导编辑系统PE-P2不仅提高了碱基编辑效率，而且对部分不能编辑的靶点实现了有效编辑。
表2、不同类型引导编辑器对水稻内源靶点的编辑效率汇总
Figure BDA0002425527380000101
Figure BDA0002425527380000111
注：紧邻pegRNA向导的Cas9n(H840A)产生的切口位点处的靶点序列的第18位碱基记为+1，下游按照顺序依次计数(图2)。sgRNA切口位置，表示在互补链选择的靶点产生的切口的位置，计数方式同上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19449
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg 60
cggacgtttt taatgtaggt acctggaatc ggcagcaaag gattttttcc tgtagttttc 120
ccacaaccat tttttaccat ccgaatgata ggataggaaa aatatccaag tgaacagtat 180
tcctataaaa ttcccgtaaa aagcctgcaa tccgaatgag ccctgaagtc tgaactagcc 240
ggtcacctgt acaggctatc gagatgccat acaagagacg gtagtaggaa ctaggaagac 300
gatggttgat tcgtcaggcg aaatcgtcgt cctgcagtcg catctatggg cctggacgga 360
ataggggaaa aagttggccg gataggaggg aaaggcccag gtgcttacgt gcgaggtagg 420
cctgggctct cagcacttcg attcgttggc accggggtag gatgcaatag agagcaacgt 480
ttagtaccac ctcgcttagc tagagcaaac tggactgcct tatatgcgcg ggtgctggct 540
tggctgccga tatctcgctc tcacattccg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 600
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttttaggaat 660
ctttaaacat acgaacagat cacttaaagt tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca 720
tgcatggatc ttggaggaat cagatgtgca gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct 780
tctactggtg ctaccagcaa atgctggaag ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg 840
tgtgatgtga aggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg ggccatgaag 900
cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac gacaacaaag 960
actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa aagagttgtg 1020
cagatgatcc gtggcgggta tggtggtgca atggggtttt agagctagaa atagcaagtt 1080
aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caaacctatc 1140
ctccaattgc accaccattt ttttttaagc ttacaaattc gggtcaaggc ggaagccagc 1200
gcgccacccc acgtcagcaa atacggaggc gcggggttga cggcgtcacc cggtcctaac 1260
ggcgaccaac aaaccagcca gaagaaatta cagtaaaaaa aaagtaaatt gcactttgat 1320
ccacctttta ttacctaagt ctcaatttgg atcaccctta aacctatctt ttcaatttgg 1380
gccgggttgt ggtttggact accatgaaca acttttcgtc atgtctaact tccctttcag 1440
caaacatatg aaccatatat agaggagatc ggccgtatac tagagctgat gtgtttaagg 1500
tcgttgattg cacgagaaaa aaaaatccaa atcgcaacaa tagcaaattt atctggttca 1560
aagtgaaaag atatgtttaa aggtagtcca aagtaaaact tatagataat aaaatgtggt 1620
ccaaagcgta attcactcaa aaaaaatcaa cgagacgtgt accaaacgga gacaaacggc 1680
atcttctcga aatttcccaa ccgctcgctc gcccgcctcg tcttcccgga aaccgcggtg 1740
gtttcagcgt ggcggattct ccaagcagac ggagacgtca cggcacggga ctcctcccac 1800
cacccaaccg ccataaatac cagccccctc atctcctctc ctcgcatcag ctccaccccc 1860
gaaaaatttc tccccaatct cgcgaggctc tcgtcgtcga atcgaatcct ctcgcgtcct 1920
caaggtacgc tgcttctcct ctcctcgctt cgtttcgatt cgatttcgga cgggtgaggt 1980
tgttttgttg ctagatccga ttggtggtta gggttgtcga tgtgattatc gtgagatgtt 2040
taggggttgt agatctgatg gttgtgattt gggcacggtt ggttcgatag gtggaatcgt 2100
ggttaggttt tgggattgga tgttggttct gatgattggg gggaattttt acggttagat 2160
gaattgttgg atgattcgat tggggaaatc ggtgtagatc tgttggggaa ttgtggaact 2220
agtcatgcct gagtgattgg tgcgatttgt agcgtgttcc atcttgtagg ccttgttgcg 2280
agcatgttca gatctactgt tccgctcttg attgagttat tggtgccatg ggttggtgca 2340
aacacaggct ttaatatgtt atatctgttt tgtgtttgat gtagatctgt agggtagttc 2400
ttcttagaca tggttcaatt atgtagcttg tgcgtttcga tttgatttca tatgttcaca 2460
gattagataa tgatgaactc ttttaattaa ttgtcaatgg taaataggaa gtcttgtcgc 2520
tatatctgtc ataatgatct catgttacta tctgccagta atttatgcta agaactatat 2580
tagaatatca tgttacaatc tgtagtaata tcatgttaca atctgtagtt catctatata 2640
atctattgtg gtaatttctt tttactatct gtgtgaagat tattgccact agttcattct 2700
acttatttct gaagttcagg atacgtgtgc tgttactacc tatctgaata catgtgtgat 2760
gtgcctgtta ctatcttttt gaatacatgt atgttctgtt ggaatatgtt tgctgtttga 2820
tccgttgttg tgtccttaat cttgtgctag ttcttaccct atctgtttgg tgattatttc 2880
ttgcagtacg taatggacta caaggaccac gacggcgact acaaggatca tgacatcgac 2940
tacaaggacg acgacgacaa gatggctcct aagaagaagc ggaaggttgg tattcacggg 3000
gtgcctgcgg ctgacaagaa gtactccatc ggcctcgaca tcggcaccaa cagcgtcggc 3060
tgggcggtga tcaccgacga gtacaaggtc ccgtccaaga agttcaaggt cctgggcaac 3120
accgaccgcc actccatcaa gaagaacctc atcggcgccc tcctcttcga ctccggcgag 3180
acggcggagg cgacccgcct caagcgcacc gcccgccgcc gctacacccg ccgcaagaac 3240
cgcatctgct acctccagga gatcttctcc aacgagatgg cgaaggtcga cgactccttc 3300
ttccaccgcc tcgaggagtc cttcctcgtg gaggaggaca agaagcacga gcgccacccc 3360
atcttcggca acatcgtcga cgaggtcgcc taccacgaga agtaccccac tatctaccac 3420
cttcgtaaga agcttgttga ctctactgat aaggctgatc ttcgtctcat ctaccttgct 3480
ctcgctcaca tgatcaagtt ccgtggtcac ttccttatcg agggtgacct taaccctgat 3540
aactccgacg tggacaagct cttcatccag ctcgtccaga cctacaacca gctcttcgag 3600
gagaacccta tcaacgcttc cggtgtcgac gctaaggcga tcctttccgc taggctctcc 3660
aagtccaggc gtctcgagaa cctcatcgcc cagctccctg gtgagaagaa gaacggtctt 3720
ttcggtaacc tcatcgctct ctccctcggt ctgaccccta acttcaagtc caacttcgac 3780
ctcgctgagg acgctaagct tcagctctcc aaggatacct acgacgatga tctcgacaac 3840
ctcctcgctc agattggaga tcagtacgct gatctcttcc ttgctgctaa gaacctctcc 3900
gatgctatcc tcctttcgga tatccttagg gttaacactg agatcactaa ggctcctctt 3960
tctgcttcca tgatcaagcg ctacgacgag caccaccagg acctcaccct cctcaaggct 4020
cttgttcgtc agcagctccc cgagaagtac aaggagatct tcttcgacca gtccaagaac 4080
ggctacgccg gttacattga cggtggagct agccaggagg agttctacaa gttcatcaag 4140
ccaatccttg agaagatgga tggtactgag gagcttctcg ttaagcttaa ccgtgaggac 4200
ctccttagga agcagaggac tttcgataac ggctctatcc ctcaccagat ccaccttggt 4260
gagcttcacg ccatccttcg taggcaggag gacttctacc ctttcctcaa ggacaaccgt 4320
gagaagatcg agaagatcct tactttccgt attccttact acgttggtcc tcttgctcgt 4380
ggtaactccc gtttcgcttg gatgactagg aagtccgagg agactatcac cccttggaac 4440
ttcgaggagg ttgttgacaa gggtgcttcc gcccagtcct tcatcgagcg catgaccaac 4500
ttcgacaaga acctccccaa cgagaaggtc ctccccaagc actccctcct ctacgagtac 4560
ttcacggtct acaacgagct caccaaggtc aagtacgtca ccgagggtat gcgcaagcct 4620
gccttcctct ccggcgagca gaagaaggct atcgttgacc tcctcttcaa gaccaaccgc 4680
aaggtcaccg tcaagcagct caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg cttcgactcc 4740
gtcgagatca gcggcgttga ggaccgtttc aacgcttctc tcggtaccta ccacgatctc 4800
ctcaagatca tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaacgagga catcctcgag 4860
gacatcgtcc tcactcttac tctcttcgag gatagggaga tgatcgagga gaggctcaag 4920
acttacgctc atctcttcga tgacaaggtt atgaagcagc tcaagcgtcg ccgttacacc 4980
ggttggggta ggctctcccg caagctcatc aacggtatca gggataagca gagcggcaag 5040
actatcctcg acttcctcaa gtctgatggt ttcgctaaca ggaacttcat gcagctcatc 5100
cacgatgact ctcttacctt caaggaggat attcagaagg ctcaggtgtc cggtcagggc 5160
gactctctcc acgagcacat tgctaacctt gctggttccc ctgctatcaa gaagggcatc 5220
cttcagactg ttaaggttgt cgatgagctt gtcaaggtta tgggtcgtca caagcctgag 5280
aacatcgtca tcgagatggc tcgtgagaac cagactaccc agaagggtca gaagaactcg 5340
agggagcgca tgaagaggat tgaggagggt atcaaggagc ttggttctca gatccttaag 5400
gagcaccctg tcgagaacac ccagctccag aacgagaagc tctacctcta ctacctccag 5460
aacggtaggg atatgtacgt tgaccaggag ctcgacatca acaggctttc tgactacgac 5520
gtcgacgcca ttgttcctca gtctttcctt aaggatgact ccatcgacaa caaggtcctc 5580
acgaggtccg acaagaacag gggtaagtcg gacaacgtcc cttccgagga ggttgtcaag 5640
aagatgaaga actactggag gcagcttctc aacgctaagc tcattaccca gaggaagttc 5700
gacaacctca cgaaggctga gaggggtggc ctttccgagc ttgacaaggc tggtttcatc 5760
aagaggcagc ttgttgagac gaggcagatt accaagcacg ttgctcagat cctcgattct 5820
aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtcaa ggtgatcacc 5880
ctcaagtcca agctcgtctc cgacttccgc aaggacttcc agttctacaa ggtccgcgag 5940
atcaacaact accaccacgc tcacgatgct taccttaacg ctgtcgttgg taccgctctt 6000
atcaagaagt accctaagct tgagtccgag ttcgtctacg gtgactacaa ggtctacgac 6060
gttcgtaaga tgatcgccaa gtccgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 6120
ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctcgccaa cggcgagatc 6180
cgcaagcgcc ctcttatcga gacgaacggt gagactggtg agatcgtttg ggacaagggt 6240
cgcgacttcg ctactgttcg caaggtcctt tctatgcctc aggttaacat cgtcaagaag 6300
accgaggtcc agaccggtgg cttctccaag gagtctatcc ttccaaagag aaactcggac 6360
aagctcatcg ctaggaagaa ggattgggac cctaagaagt acggtggttt cgactcccct 6420
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aagtccgtca aggagctcct cggcatcacc atcatggagc gctcctcctt cgagaagaac 6540
ccgatcgact tcctcgaggc caagggctac aaggaggtca agaaggacct catcatcaag 6600
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aagctgaatg tgtacacaga ctccaggtac gcattcgcca cagcacacat ccatggcgag 9000
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aaatctatct ctctctataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttct 9480
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ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct 10080
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tgcgatgagt aaataaacaa atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa 14520
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tggctggct 19449
<210> 2
<211> 1367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
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465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
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515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
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545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
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Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
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Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
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740 745 750
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Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
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Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
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Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
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Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
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Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asn Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
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Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
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Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
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Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
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450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro
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Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu
485 490 495
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
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Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
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Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
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Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
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Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
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Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
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<213> Artificial Sequence
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taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 660
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cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 1140
agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 1200
cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 1260
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gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 2040
tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagtacgtaa gcatggacta caaggaccac 2100
gacggggatt acaaagacca cgacatagac tacaaggatg acgatgacaa aatggcaccg 2160
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aagaaaaaaa ggaaggtcgg cggctccccg aagaaaaaaa ggaaggtcgg aatccatggc 2280
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cgcatctgct acctccagga gatcttctcc aacgagatgg cgaaggtcga cgactccttc 2580
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ctcctcgctc agattggaga tcagtacgct gatctcttcc ttgctgctaa gaacctctcc 3180
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ctcaagatca tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaacgagga catcctcgag 4140
gacatcgtcc tcactcttac tctcttcgag gatagggaga tgatcgagga gaggctcaag 4200
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aacggtaggg atatgtacgt tgaccaggag ctcgacatca acaggctttc tgactacgac 4800
gtcgacgcca ttgttcctca gtctttcctt aaggatgact ccatcgacaa caaggtcctc 4860
acgaggtccg acaagaacag gggtaagtcg gacaacgtcc cttccgagga ggttgtcaag 4920
aagatgaaga actactggag gcagcttctc aacgctaagc tcattaccca gaggaagttc 4980
gacaacctca cgaaggctga gaggggtggc ctttccgagc ttgacaaggc tggtttcatc 5040
aagaggcagc ttgttgagac gaggcagatt accaagcacg ttgctcagat cctcgattct 5100
aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtcaa ggtgatcacc 5160
ctcaagtcca agctcgtctc cgacttccgc aaggacttcc agttctacaa ggtccgcgag 5220
atcaacaact accaccacgc tcacgatgct taccttaacg ctgtcgttgg taccgctctt 5280
atcaagaagt accctaagct tgagtccgag ttcgtctacg gtgactacaa ggtctacgac 5340
gttcgtaaga tgatcgccaa gtccgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 5400
ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctcgccaa cggcgagatc 5460
cgcaagcgcc ctcttatcga gacgaacggt gagactggtg agatcgtttg ggacaagggt 5520
cgcgacttcg ctactgttcg caaggtcctt tctatgcctc aggttaacat cgtcaagaag 5580
accgaggtcc agaccggtgg cttctccaag gagtctatcc ttccaaagag aaactcggac 5640
aagctcatcg ctaggaagaa ggattgggac cctaagaagt acggtggttt cgactcccct 5700
actgtcgcct actccgtcct cgtggtcgcc aaggtggaga agggtaagtc gaagaagctc 5760
aagtccgtca aggagctcct cggcatcacc atcatggagc gctcctcctt cgagaagaac 5820
ccgatcgact tcctcgaggc caagggctac aaggaggtca agaaggacct catcatcaag 5880
ctccccaagt actctctttt cgagctcgag aacggtcgta agaggatgct ggcttccgct 5940
ggtgagctcc agaagggtaa cgagcttgct cttccttcca agtacgtgaa cttcctctac 6000
ctcgcctccc actacgagaa gctcaagggt tcccctgagg ataacgagca gaagcagctc 6060
ttcgtggagc agcacaagca ctacctcgac gagatcatcg agcagatctc cgagttctcc 6120
aagcgcgtca tcctcgctga cgctaacctc gacaaggtcc tctccgccta caacaagcac 6180
cgcgacaagc ccatccgcga gcaggccgag aacatcatcc acctcttcac gctcacgaac 6240
ctcggcgccc ctgctgcttt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa gcgttacacg 6300
tccaccaagg aggttctcga cgctactctc atccaccagt ccatcaccgg tctttacgag 6360
actcgtatcg acctttccca gcttggtggt gatagcggtg gctccagcgg tggtagcagc 6420
ggtagcgaaa ctccagggac ctcggaatcg gcgactccag aatccagtgg gggtagcagc 6480
ggcggatcca gcaccctcaa tatcgaggac gagtacaggc tgcatgagac atccaaggag 6540
ccggacgtgt cactcggctc tacatggctg agcgatttcc cacaggcctg ggcggagaca 6600
ggcggcatgg gcctcgcggt caggcaggcg ccgctcatca ttccactgaa ggcgacctcc 6660
acaccggtca gcatcaagca gtacccaatg tcacaggagg cacggctcgg catcaagcca 6720
cacattcaga ggctcctgga ccagggcatt ctggtccctt gccagagccc gtggaacacc 6780
cctctcctgc cggtgaagaa gcctggcaca aatgactaca ggccggtcca ggatctcagg 6840
gaggtgaaca agcgcgtcga ggatatccat ccgaccgtgc cgaacccata caatctcctg 6900
tcaggcctcc cgccatctca ccagtggtac accgtcctcg acctgaagga tgcgttcttc 6960
tgcctcaggc tgcatccaac aagccagcct ctcttcgcct tcgagtggcg cgatccagag 7020
atgggcattt caggccagct cacctggaca cggctgccac agggcttcaa gaactctcct 7080
accctcttca atgaggcgct ccatcgggac ctggccgatt tcaggatcca gcaccctgac 7140
ctcattctcc tgcagtacgt ggacgatctc ctgctcgccg cgacatcaga gctggattgc 7200
cagcagggca ccagggccct gctccagaca ctcggcaatc tgggctaccg ggcctctgcg 7260
aagaaggccc agatctgcca gaagcaggtg aagtacctcg gctacctgct caaggaggga 7320
cagaggtggc tgacagaggc aaggaaggag acagtcatgg gccagcctac cccgaagaca 7380
cctcggcagc tcagggagtt cctgggcaag gccggattct gcaggctctt cattccagga 7440
ttcgcggaga tggcggcgcc actctaccct ctgaccaagc cgggcacact gttcaactgg 7500
ggcccagacc agcagaaggc gtaccaggag attaagcagg cactgctcac agcacctgcg 7560
ctcggcctgc cggacctcac aaagccattc gagctgttcg tggatgagaa gcagggctac 7620
gcgaagggag tcctgacaca gaagctggga ccatggaggc gcccagtggc ctacctctca 7680
aagaagctcg acccagtggc ggccggatgg cctccgtgcc tgaggatggt ggcggccatt 7740
gccgtcctca ccaaggatgc cggcaagctg acaatgggcc agcctctcgt gattctggcg 7800
ccgcatgcgg tggaggccct ggtcaagcag ccacctgata ggtggctgtc caacgcgcgc 7860
atgacccact accaggccct gctcctggac acagataggg tccagttcgg accagtggtg 7920
gcactcaatc ctgccacact gctgccactc cctgaggagg gcctgcagca taactgcctc 7980
gatattctgg cggaggccca tggcacccgg ccagacctca cagatcagcc gctgccagac 8040
gccgatcaca cctggtacac agatggctca tctctcctgc aggagggcca gaggaaggcc 8100
ggagcagccg tgaccacaga gacagaggtc atctgggcaa aggccctccc agcgggcacc 8160
tcagcacaga gggccgagct cattgcactg acacaggcgc tcaagatggc cgagggcaag 8220
aagctgaatg tgtacacaga ctccaggtac gcattcgcca cagcacacat ccatggcgag 8280
atttacaggc ggaggggatg gctcacatca gagggaaagg agatcaagaa caaggatgag 8340
attctcgcgc tcctgaaggc cctcttcctg cctaagcgcc tgtcaatcat tcactgccca 8400
ggacatcaga agggacactc agccgaggca aggggaaata ggatggcaga ccaggcggcc 8460
aggaaggcag cgatcaccga gacaccagat acctccacac tcctgattga gaactccagc 8520
cctgacgatg acaaaatggc accgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 8580
aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 8640
aaaaggaagg tcggaatcca tggcggatca ggagccacca acttctccct cctcaagcag 8700
gccggcgacg tggaggagaa cccgggccca atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct 8760
gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag 8820
ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta 8880
aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc 8940
gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc 9000
atctcccgcc gttcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct 9060
gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg 9120
agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc 9180
atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc 9240
agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa 9300
gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc 9360
ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc 9420
aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag 9480
cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt 9540
cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag 9600
ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc 9660
cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac 9720
cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagacta gttcccgatc gttcaaacat 9780
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 9840
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 9900
gaggtgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 9960
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagacct 10020
gcaggtggaa tcggcagcaa aggatttttt cctgtagttt tcccacaacc attttttacc 10080
atccgaatga taggatagga aaaatatcca agtgaacagt attcctataa aattcccgta 10140
aaaagcctgc aatccgaatg agccctgaag tctgaactag ccggtcacct gtacaggcta 10200
tcgagatgcc atacaagaga cggtagtagg aactaggaag acgatggttg attcgtcagg 10260
cgaaatcgtc gtcctgcagt cgcatctatg ggcctggacg gaatagggga aaaagttggc 10320
cggataggag ggaaaggccc aggtgcttac gtgcgaggta ggcctgggct ctcagcactt 10380
cgattcgttg gcaccggggt aggatgcaat agagagcaac gtttagtacc acctcgctta 10440
gctagagcaa actggactgc cttatatgcg cgggtgctgg cttggctgcc gatatctcgc 10500
tctcacattc cgtttcagag ctatgctgga aacagcatag caagttgaaa taaggctagt 10560
ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttaggaat ctttaaacat 10620
acgaacagat cacttaaagt tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca tgcatggatc 10680
ttggaggaat cagatgtgca gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct tctactggtg 10740
ctaccagcaa atgctggaag ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg tgtgatgtga 10800
aggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg ggccatgaag cctttcagga 10860
catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac gacaacaaag actagtatta 10920
gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa aagagttgtg cagatgatcc 10980
gtggcgggta tggtggtgca atggggtttc agagctatgc tggaaacagc atagcaagtt 11040
gaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caaacctatc 11100
ctccaattgc accaccattt ttttttggca tgcaagcttg gcactggccg tcgttttaca 11160
acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 11220
tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 11280
cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct 11340
tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag 11400
cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt 11460
gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc 11520
cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg 11580
tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt 11640
gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc 11700
atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag 11760
gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag 11820
aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc 11880
cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta 11940
ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg 12000
tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc 12060
gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc 12120
cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc 12180
gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat 12240
cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg 12300
cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag 12360
aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt 12420
tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg 12480
cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg 12540
cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat 12600
gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa 12660
ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg 12720
gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga 12780
tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga 12840
agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc 12900
catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt 12960
gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat 13020
atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag 13080
gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt 13140
tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt 13200
gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga 13260
cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa 13320
tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca 13380
cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc 13440
aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc 13500
aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa 13560
tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca 13620
accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt 13680
aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc 13740
ggcgtgacgg tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc 13800
tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac 13860
gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc 13920
cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt 13980
tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg 14040
ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag 14100
acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc 14160
tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg 14220
gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc 14280
gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca 14340
cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg 14400
agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt 14460
acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg 14520
acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct 14580
accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct 14640
acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga 14700
tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga 14760
tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta 14820
cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa gttctctttc 14880
ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca 14940
ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag 15000
agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc 15060
gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta 15120
cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg 15180
gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc 15240
cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat 15300
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 15360
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 15420
gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 15480
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 15540
ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 15600
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 15660
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 15720
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 15780
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 15840
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 15900
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 15960
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 16020
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 16080
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 16140
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 16200
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 16260
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 16320
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 16380
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta 16440
aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct 16500
cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat 16560
accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt 16620
tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct 16680
tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc 16740
agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc 16800
ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga 16860
tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg 16920
agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa 16980
agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc 17040
gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt 17100
cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc 17160
agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt 17220
atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac 17280
gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc 17340
aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg 17400
gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat 17460
catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg 17520
agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg 17580
cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggct 17637
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro

Claims (10)

1.成套系统，其包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；
所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9切刻酶为Cas9n(H840A)；
和/或，所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：
a1)序列1第3013-7113位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述反转录酶为M-MLV RT；
和/或，所述M-MLV RT为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述M-MLV RT的编码基因为b1)或b2)或b3)：
b1)序列1第7213-9243位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的成套系统，其特征在于：所述自切割寡肽为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽；
和/或，所述来源于病毒基因组的2A自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽；
和/或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列5第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的cDNA分子或DNA分子。
5.根据权利要求1-4任一所述的成套系统，其特征在于：所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；
和/或，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：
d1)序列1第11665-12690位所示的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。
6.根据权利要求1-5任一所述的成套系统，其特征在于：所述pegRNA依次由靶点序列、sgRNA骨架或esgRNA骨架、RT序列和PBS序列组成；
和/或，所述sgRNA骨架为E1)或E2)或E3)：
E1)将序列1第570-645位中的T替换为U得到的RNA分子；
E2)将E1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
E3)与E1)或E2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
和/或，所述esgRNA骨架为F1)或F2)或F3)：
F1)将序列5第10512-10597位中的T替换为U得到的RNA分子；
F2)将F1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
和/或，所述成套系统还包括如下G1)或G2)：
G1)sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料；
G2)esgRNA或与所述esgRNA相关的生物材料。
7.权利要求1-6任一所述的成套系统和/或权利要求1中所述的融合蛋白在S1)-S4)任一种中的应用：
S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；
S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
8.T1)-T4)任一所述的方法：
T1)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达权利要求1中所述的融合蛋白和权利要求1中所述的pegRNA；
T2)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达权利要求1中所述的融合蛋白、权利要求1中所述的pegRNA和权利要求6中所述的sgRNA；
T3)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达权利要求1中所述的融合蛋白、权利要求1中所述的pegRNA和权利要求6中所述的esgRNA；
T4)生物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照T1)-T3)所述的方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。
9.根据权利要求1-6任一所述的成套系统或权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。
10.根据权利要求1-6任一所述的成套系统或权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述生物体为X1)或X2)或X3)或X4)：
X1)植物或动物；
X2)单子叶植物或双子叶植物；
X3)禾本科植物；
X4)水稻；
和/或，所述生物细胞为Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：
Y1)植物细胞或动物细胞；
Y2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；
Y3)禾本科植物细胞；
Y4)水稻细胞。
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