CN110373430A - 一种随机突变的基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种随机突变的基因编辑系统及其应用。本发明的基因编辑系统包括靶向元件和编辑元件，所述靶向元件引导编辑元件对基因进行编辑，其特征在于，所述靶向元件可进行随机突变，从而引导编辑元件对新的靶点序列进行编辑。利用本发明的系统，可以在细胞体内进行随机突变，是一种随机突变的新方法，并且可以高通量构建含量成千上万的随机突变体库，效率高、成本低。

Description

一种随机突变的基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种随机突变的基因编辑系统及其应用。

背景技术

基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9技术，在生物细胞中实现了精准的基因编辑。其技术原理是：通过一段引导RNA(sgRNA或gRNA)与DNA内切酶(如Cas9、Cpf1等)结合形成RNA和蛋白的复合物(简称RNP)，该复合物可以在基因组上搜索与引导RNA上互补的目标序列，从而使得DNA内切酶精准地在该区域对结合的DNA进行剪切。根据不同的DNA内切酶特性，剪切的结果多种多样，可以是平末端或粘性末端的双链DNA断裂(DSB)，也可以是单链DNA断裂(Nick)。生物体的细胞自身对DSB或Nick的修复会导致碱基的插入或删除(Indel)，造成移码突变，致使基因功能丧失，从而实现了对目的基因的精准编辑。此外，如果提供DNA修复模板，该DNA片段就可能被修复整合入DSB或Nick区域，从而实现精准的DNA片段插入或替换。

由于很多生物已经具有明确的基因组信息，利用基因编辑技术，能够在基因组水平上对生物进行大规模基因敲除，从而建立新的突变体库。其技术路线是，针对不同的基因设计并合成数以万计的引导RNA，利用病毒、基因枪、农杆菌等手段将其转入到目标生物细胞中，来获得突变体库。利用该技术路线，在细菌、动物细胞和植物上均成功构建了突变体库。但是，需要合成数以万计的引导RNA是该技术体系的一大弊端。此外，要构建突变体库需要高通量的转化体系。因此，一种能够在生物细胞中产生随机引导RNA的技术，将极大克服这些弊端。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一目的在于提供一种随机突变的基因编辑系统。

一种随机突变的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括靶向元件和编辑元件，所述靶向元件引导编辑元件对基因进行编辑，所述靶向元件可进行随机突变，从而引导编辑元件对新的靶点序列进行编辑。

上述基因编辑系统中，所述靶向元件包括蛋白质、RNA、DNA中的一种或两种的结合，或者所述靶向元件包括不同的蛋白质、不同的RNA或不同的DNA；所述编辑元件为以DNA或碱基为底物的酶。

所述靶向元件可以利用蛋白与DNA的特异性结合来实现，也可以是通过核酸之间的特异性结合(DNA与DNA之间，RNA与DNA之间的，RNA与RNA之间)来实现。所述编辑元件，可以是直接对DNA进行切割的内切酶，也可以是融合在这些内切酶之上的胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶等以碱基为底物的酶或者化合物。

上述基因编辑系统中，所述编辑元件为核酸内切酶；所述靶向元件为两种sgRNA序列：sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA2的部分序列和相应sgRNA1的序列高度重合，使sgRNA1引导核酸内切酶在表达sgRNA2的DNA区域进行基因编辑，从而随机产生新的sgRNA，所述新的sgRNA可以引导核酸内切酶进行基因编辑，从而产生随机突变。

上述基因编辑系统包括CRISPR系统。

上述基因编辑系统中，所述两种sgRNA序列分别包括一个或两个以上相同或不同的序列。

上述基因编辑系统中，所述sgRNA2的部分序列和相应sgRNA1的序列高度重合是指表达sgRNA2的基因序列可以被sgRNA1识别并且被核酸内切酶剪切。

例如，在一实施例中，某一个sgRNA2的序列包括相应sgRNA1的序列和核酸内切酶识别位点(例如，PAM序列)，即sgRNA2部分序列和sgRNA1的靶点序列重合，并且在sgRNA1的靶点序列之后设置核酸内切酶识别位点，使核酸内切酶对sgRNA2基因进行剪切，然后修复后，随机生成新的sgRNA基因，并表达新的sgRNA。

上述基因编辑系统中，所述核酸内切酶为Cas蛋白或Cpf1蛋白。

上述基因编辑系统中，优选的，所述Cas蛋白为Cas9、Cas9n、dCas9或xCas9。

本发明的第二目的在于提供表达上述基因编辑系统的核酸。

本发明的第三目的在于提供表达上述基因编辑系统的载体。

所述载体为单载体或双载体；

所述单载体是指表达上述基因编辑系统的核酸在一个载体上，所述双载体是指表达上述基因编辑系统的核酸在两个载体上，例如，在一实施例中，核酸内切酶和两种sgRNA序列的表达基因分别位于两个载体上。

上述载体为可以表达CRISPR系统的载体，可以为植物载体、动物载体、细菌载体或真菌载体；

上述载体为可选pHEE401E载体质粒、腺病毒载体、pCRISPR载体、pDONR207载体、lentiCRISPR载体、pCMV载体、pU6载体、T1706、pLko载体等。

本发明的第四目的在于提供一种细胞中随机突变的方法，包括步骤如下：将上述核酸或上述载体导入宿主细胞中。

本发明的第五目的在于提供一种突变体库的构建方法，包括步骤如下：将上述核酸或上述载体导入宿主细胞中。

上述方法中，所述宿主为细菌、真菌、植物或动物。

上述方法中，所述宿主细胞为有性生殖生物中的生殖细胞或无性生殖生物中的可分裂细胞并成长为个体的细胞。

上述方法中，所述方法还包括：培养宿主细胞的下一代细胞或个体；

或者进一步地，在宿主的下一代细胞或个体中按上述方法重复地导入上述核酸或上述载体。

例如，在一实施例中，在植物中，将上述核酸或上述载体导入植物卵细胞中，利用卵细胞特异启动子(或其它生殖细胞特异表达启动子)驱动Cas9，组成性表达sgRNA时，sgRNA2引导的核酸内切酶对sgRNA1基因的编辑产生的随机突变将只发生在卵细胞中，随机产生的新的sgRNA也将只在卵细胞中对植物基因组进行编辑，收获的种子即具有不同的编辑事件。一株植物能够产生成千上万粒种子，理论上，大部分种子中将含有新的sgRNA基因，如基因组有匹配序列，则将产生新的突变。

在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：(1)粮食作物：稻属(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、水稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryza glaberrima)；小麦属(Triticum spp.)，例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.Turgidumssp.durum)；大麦属(Hordeum spp.)，例如大麦(Hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(Hordeum arizonicum)；黑麦(Secale cereale)；燕麦属(Avena spp.)，例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)；稗属(Echinochloa spp.)，例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黑小麦、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、黍子、荞麦属(Fagopyrum spp.)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、沼生菰(Zizaniapalustris)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、稷(Panicum miliaceum)、龙爪稷(Eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(Glycine spp.)，例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)、Soja max)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、豌豆属(Pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、蚕豆属(Vicia)、酸豆(Tamarindus indica)、兵豆(Lens culinaris)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、扁豆属(Lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(Arachis hypogaea)、落花生属(Arachis spp)、胡麻属(Sesamum spp.)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、大豆(soybean)、油菜(Brassicanapus)、芸苔、芝麻、芥菜(Brassicajuncea)、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜(Brassica napus L.)、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(Agave sisalana)、棉属(棉花、海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(Linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(Cannabis sativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(Ziziphus spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、葡萄属(Vitis spp.)、越桔属(Vaccinium spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、苹果属(Malus spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、红仔果(Eugenia unifora)、枇杷(Eriobotrya japonica)、龙眼(Dimocarpus longan)、番木瓜(Carica papaya)、椰子属(Cocos spp.)、阳桃(Averrhoacarambola)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、扁桃(Prunus amygdalus)、芭蕉属(Musa spp.)(香蕉)、鳄梨属(Persea spp.)(鳄梨(Persea americana))、番石榴(Psidium guajava)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄(Oleaeuropaea))、番木瓜(Caricapapaya)、椰子(Cocos nucifera)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、人心果(Manilkara zapota)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、柑桔树(柑桔属物种(Citrus spp.))、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、荔枝(Litchi chinensis)、茶藨子属(Ribes spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、杨梅、柠檬、金橘、榴莲、橙、草莓(straw berry)、蓝莓、哈密瓜、甜瓜、椰枣、胡桃树、樱桃树；(6)根茎类作物：木薯属(Manihot spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、芋(Colocasia esculenta)、榨菜、洋葱、荸荠、油莎草、山药；(7)蔬菜类作物：菠菜属(Spinacia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、苦瓜属(Momordica spp)、欧芹(Petroselinum crispum)、辣椒属(Capsicum spp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、无头甘蓝(kale)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collardgreens)、西葫芦(squash)、冬瓜(Benincasa hispida)、石刁柏(Asparagus officinalis)、旱芹(Apium graveolens)、苋属(Amaranthus spp.)、葱属(Allium spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、南瓜属(Cucurbita spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、萝卜(Rapbanus sativus)、芸苔属(Brassica)物种(例如例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)、卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘蓝、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘蓝、茄科植物(茄子)、甜椒、黄瓜、丝瓜、白菜、油菜、甘蓝、葫芦、韭菜、莲、藕、生菜；(8)花卉作物：小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、美人蕉(Canna indica)、仙人掌属(Opuntia spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、兰花、文殊兰、君子兰、朱顶红、玫瑰、月季、茉莉花、郁金香、樱花、牵牛花、金盏花、荷花、雏菊、康乃馨、矮牵牛花、郁金香、百合、梅花、水仙、迎春、报春、瑞香、山茶、白玉兰、紫玉兰、琼花、君子兰、海棠、牡丹、芍药、丁香、杜鹃、西洋杜鹃、含笑、紫荆、棣棠、锦带花、连翘、云南黄馨、金雀花、仙客来、蝴蝶兰、石斛、风信子、鸢尾、马蹄莲、金盏菊、百枝莲、四季海棠、吊钟海棠、竹节海棠、天竺葵；(9)药用作物：红花(Carthamus tinctorius)、薄荷属(Mentha spp.)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、番红花(Crocus sativus)、枸杞、玉竹、黄精、知母、麦冬、川贝、郁金、砂仁、何首乌、大黄、甘草、黄芪、人参、三七、五加、当归、川芎、北柴胡、曼佗罗、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黄芩、夏枯草、除虫菊、银杏、金鸡纳树、天然橡胶树、苜蓿、胡椒；(10)原料作物：橡胶、蓖麻(Ricinus communis)、油桐、桑、忽布、桦、桤木、漆树；(11)牧草作物：冰草属(Agropyron spp.)、车轴草属(Trifolium spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、虉草(Phalaris arundinacea)、柳枝稷(Panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)、梯牧草(Phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(Carex pediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(Saccharumspp.))、甜菜(Beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(Camellia sinensis)、茶(CamelliaSinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))、可可树(Theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(Ammophila arenaria)、早熟禾属(Poa spp.)(草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(Agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(Agrostis palustris))、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、羊茅属物种(Festucaspp.)(羊茅)、结缕草属物种(Zoysia spp.)(结缕草(Zoysiajaponica))、狗牙根属物种(Cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(Stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(Paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(Axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(Bouteloua var.spp.)(格兰马草)、马唐(Digitariasanguinalis)、香附子(Cyperusrotundus)、短叶水蜈蚣(Kyllingabrevifolia)、阿穆尔莎草(Cyperusamuricus)、加拿大飞蓬(Erigeroncanadensis)、天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)、鸡眼草(Kummerowiastriata)、地锦(Euphorbiahumifusa)、耕地堇菜(Violaarvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(Pinus spp.)、柳属(Salix sp.)、槭树属(Acer spp.)、木槿属(Hibiscus spp.)、桉属(Eucalyptus sp.)、银杏(Ginkgo biloba)、箣竹属(Bambusa sp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、栎属(Quercusspp.)、刺葵属(Phoenix spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、樟属(Cinnamomum spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、银杏、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木；(16)坚果作物：巴西栗(Bertholletia excelsea)、栗属(Castanea spp.)、榛属(Corylus spp.)、山核桃属(Caryaspp.)、核桃属(Juglans spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、Cadaba farinosa、藻类(algae)、Carex elata、观赏植物、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、薯蓣属(Dioscoreaspp.)、蔗茅属(Erianthus sp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、萱草(Hemerocallisfulva)、百脉根属(Lotus spp.)、Luzula sylvatica、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、黑桑(Morus nigra)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Oleaspp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、欧防风(Pastinaca sativa)、接骨木属(Sambucusspp.)、白芥属(Sinapis sp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、香堇(Viola odorata)等。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种新的随机突变的基因编辑系统，所述系统利用CRISPR系统可同时对多个不同位点编辑的特性，设计了两种不同sgRNA，其中一种sgRNA序列与表达另一种sgRNA的DNA区域高度重合，这导致了前者sgRNA会引导核酸内切酶在表达后者sgRNA的DNA区域进行编辑，从而随机产生了新的随机sgRNA。这些新的随机产生的sgRNA一旦与基因组DNA有匹配，就会引导核酸内切酶在这些随机位点上产生突变。利用本发明的系统，可以在细胞体内进行随机突变，是一种随机突变的新方法。

(2)利用本发明的基因编辑系统可以在体细胞内随机进行突变，并且可以进行不同程度的多种突变。如果利用卵细胞特异启动子驱动核酸内切酶，可以得到大量具有独立突变事件的受精卵或合子，且该过程可以在下一代重复发生，只是设计一种或几种不同的sgRNA基因编辑系统可以构建含量成千上万的随机突变体库，不用设计上千条sgRNA，此种方法效率高、成本低，可以很好的构建突变体库。

附图说明

图1显示了sgRNA1-1和sgRNA2-1表达盒序列；

图2显示了最终载体的表达盒结构；

图3显示了sgRNA1-1区域变化类型；

图4显示了T2代出现白化苗；

图5显示了4株白化苗的PDS3基因均发生了移码突变。

具体实施方式

以下结合实例，对本发明作进一步说明。下面的说明是采用举例的方式，但是本发明的保护范围不应局限于此。

实施例1.设计构建能够自发打靶产成新的sgRNA靶点序列

通过直接基因合成的方法构建分别表达sgRNA1-1和sgRNA2-1的两个表达盒。sgRNA2-1将引导Cas9对表达sgRNA1-1的DNA区域进行编辑，从而产生新的sgRNA序列。其中，sgRNA1-1表达盒序列SEQ ID NO:1和sgRNA2-1表达盒序列SEQ ID NO:2如图1所示。将两个表达盒串联在一起，克隆至pHEE401E载体{参考(1)Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC PlantBiology,2014,14(1):327.(2)Wang Z P,Xing H L,Dong L,et al.Egg cell-specificpromoter-controlled CRISPR/Cas9efficiently generates homozygous mutants formultiple target genes in Arabidopsis in a single generation[J].GenomeBiology,2015,16(1):144.}中，转入农杆菌中，以供通过蘸花法转化拟南芥。其中，最终载体的表达盒结构如图2所示，载体全序列示于SEQ ID NO:3中。

实施例2.对拟南芥进行转化{该部分所用方法和材料，参考(3)Chen Y,Wang Z,NiH,Xu Y,Chen Q*,Jiang L.*2017.CRISPR/Cas9-mediated base-editing systemefficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis.Science ChinaLife Sciences 60,520-523.}

将构建好的载体通过冻融法转化到农杆菌GV3101菌株中之后，将菌液通过划线法涂于YEP固体培养基中(含有卡那霉素和庆大霉素)，在28℃黑暗环境下培养36-48h后，挑取单菌落接种于1ml的已加入卡那霉素和庆大霉素的液体YEB培养基中，振荡培养过夜(28℃200rpm)。此时进行菌落PCR鉴定，并选取其中阳性克隆，加入到50ml锥形瓶中，加入25mlYEP液体培养基(含有卡那霉素和庆大霉素)，在28℃200rpm的条件下震荡培养，直到OD600值升高到0.8-1.0内。取菌液离心沉淀去除上清液，并用相同体积的5％的蔗糖溶液(100ml无菌去离子水加5g蔗糖)重悬菌体，并在菌液中加入SilwetL-77(0.02％)混匀。将适宜的拟南芥花序在菌液中蘸取0.5-1min后，在拟南芥苗上面遮盖黑色不透光塑料袋，创造黑暗条件，放置于22℃温室培养24h后转入光照培养，待种子成熟后收获种子。

实施例3.筛选转基因拟南芥植株{该部分所用方法和材料，参考(3)Chen Y,WangZ,Ni H,Xu Y,Chen Q*,Jiang L.*2017.CRISPR/Cas9-mediated base-editing systemefficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis.Science ChinaLife Sciences 60,520-523.}

收获的拟南芥种子经过消毒后，在含有潮霉素(25mg/L)的MS培养基上筛选转基因植株。提取T1代植株的DNA，针对sgRNA1-1和sgRNA2-1的区域进行PCR扩增并测序。选择没有编辑的T1代植株，收获T2代种子。

实施例4.T2代植株出现了sgRNA序列

提取T2代绿苗的DNA，针对sgRNA1-1和sgRNA2-1区域进行PCR扩增并测序。结果发现sgRNA2-1区域不变，而sgRNA1-1区域由原来的CCTGACCGCCGAACCATGGC变成了多种不同的类型，从而产生了新的sgRNA，如图3所示。

实施例5.T2代植株出现的新的sgRNA能够引导Cas9对拟南芥基因组进行编辑

对上述收获的T2代种子在含有潮霉素的MS板上进行筛选，出现了大量的白化苗，如表1和图4所示。

表1.T2代出现白化苗

提取T2白化苗的DNA，针对sgRNA1-1和sgRNA2-1区域进行PCR扩增并测序。结果发现sgRNA2-1区域不变，而sgRNA1-1区域由原来的CCTGACCGCCGAACCATGGC变成了CCTGACCGCCGACCATGGC。这一新的sgRNA将引导Cas9切割拟南芥PDS3基因。对白化苗中的PDS3基因扩增测序表明，其PDS3基因在该sgRNA的靶向位点发生了移码突变，导致了PDS3基因功能的丧失，呈现出白化表型。如图5所示，对随机选取的4株白化苗的PDS3基因进行测序，结果表明均发生了移码突变。

同时经过很多测试发现，当需要构建更多含量的随机突变体库时，可以设计几种不同的sgRNA基因编辑系统；或者一种sgRNA基因编辑系统的两种sgRNA序列分别包括一个或两个以上相同或不同的序列，即sgRNA可以为三个以上，如sgRNA1包括sgRNA1-1、sgRNA1-2等等，sgRNA2包括sgRNA2-1、sgRNA2-2等等。另外，将本发明所述技术体系应用于二穗短柄草等模式植物中，或者其他前述的植物，如粮食作物、豆类作物、油料作物、纤维作物、水果类作物、根茎类作物、蔬菜类作物、花卉作物、药用作物、原料作物、牧草作物、糖料作物、饮料作物、草坪植物、树木作物、坚果作物等，也会产生相应的随机突变，在特定筛选压力(除草剂、干旱等非生物胁迫或病虫等生物胁迫)下，有望筛选出抗性突变体，且还可应用于各种动物中，因此具有良好的产业价值。

说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每篇出版物或专利申请被单独、特别地通过引用并入本文一样。

尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改，这样的改变和修改均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 青岛清原化合物有限公司

<120> 一种随机突变的基因编辑系统及其应用

<130> 20190402

<150> 2018103296833

<151> 2018-04-13

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 713

<212> DNA

<213> sgRNA1-1表达盒序列(sgRNA1-1)

<400> 1

cgacttgcct tccgcacaat acatcatttc ttcttagctt tttttcttct tcttcgttca 60

tacagttttt ttttgtttat cagcttacat tttcttgaac cgtagctttc gttttcttct 120

ttttaacttt ccattcggag tttttgtatc ttgtttcata gtttgtccca ggattagaat 180

gattaggcat cgaaccttca agaatttgat tgaataaaac atcttcattc ttaagatatg 240

aagataatct tcaaaaggcc cctgggaatc tgaaagaaga gaagcaggcc catttatatg 300

ggaaagaaca atagtatttc ttatataggc ccatttaagt tgaaaacaat cttcaaaagt 360

cccacatcgc ttagataaga aaacgaagct gagtttatat acagctagag tcgaagtagt 420

gattgcctga ccgccgaacc atggcgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 480

tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttg caaaattttc 540

cagatcgatt tcttcttcct ctgttcttcg gcgttcaatt tctggggttt tctcttcgtt 600

ttctgtaact gaaacctaaa atttgaccta aaaaaaatct caaataatat gattcagtgg 660

ttttgtactt ttcagttagt tgagttttgc agttccgatg agataaacca ata 713

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> sgRNA2-1表达盒序列(sgRNA2-1)

<400> 2

ttaatccaaa ctactgcagc ctgacagaca aatgaggatg caaacaattt taaagtttat 60

ctaacgctag ctgttttgtt tcttctctct ggtgcaccaa cgacggcgtt ttctcaatca 120

taaagaggct tgttttactt aaggccaata atgttgatgg atcgaaagaa gagggctttt 180

aataaacgag cccgtttaag ctgtaaacga tgtcaaaaac atcccacatc gttcagttga 240

aaatagaagc tctgtttata tattggtaga gtcgactaag agattgttgc ctgaccgccg 300

aaccagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 360

aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttg caaaattttc cagatcgatt tcttcttcct 420

ctgttcttcg gcgttcaatt tctggggttt tctcttcgtt ttctgtaact gaaacctaaa 480

atttgaccta aaaaaaatct caaataatat gattcagtgg ttttgtactt ttcagttagt 540

tgagttttgc agttccgatg agataaacca ata 573

<210> 3

<211> 16484

<212> DNA

<213> 载体全序列(pHEE401E+PDS1+2)

<400> 3

gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60

aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 120

agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 180

aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 240

cagtgccaag cttcgacttg ccttccgcac aatacatcat ttcttcttag ctttttttct 300

tcttcttcgt tcatacagtt tttttttgtt tatcagctta cattttcttg aaccgtagct 360

ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt atcttgtttc atagtttgtc 420

ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt gattgaataa aacatcttca 480

ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga atctgaaaga agagaagcag 540

gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata ggcccattta agttgaaaac 600

aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa gctgagttta tatacagcta 660

gagtcgaagt agtgattgcc tgaccgccga accatggcgt tttagagcta gaaatagcaa 720

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 780

ttgcaaaatt ttccagatcg atttcttctt cctctgttct tcggcgttca atttctgggg 840

ttttctcttc gttttctgta actgaaacct aaaatttgac ctaaaaaaaa tctcaaataa 900

tatgattcag tggttttgta cttttcagtt agttgagttt tgcagttccg atgagataaa 960

ccaatattaa tccaaactac tgcagcctga cagacaaatg aggatgcaaa caattttaaa 1020

gtttatctaa cgctagctgt tttgtttctt ctctctggtg caccaacgac ggcgttttct 1080

caatcataaa gaggcttgtt ttacttaagg ccaataatgt tgatggatcg aaagaagagg 1140

gcttttaata aacgagcccg tttaagctgt aaacgatgtc aaaaacatcc cacatcgttc 1200

agttgaaaat agaagctctg tttatatatt ggtagagtcg actaagagat tgttgcctga 1260

ccgccgaacc agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 1320

cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttttgcaaa attttccaga tcgatttctt 1380

cttcctctgt tcttcggcgt tcaatttctg gggttttctc ttcgttttct gtaactgaaa 1440

cctaaaattt gacctaaaaa aaatctcaaa taatatgatt cagtggtttt gtacttttca 1500

gttagttgag ttttgcagtt ccgatgagat aaaccaatac catggttata ctagtgaata 1560

aaagcatttg cgtttggttt atcattgcgt ttatacaagg acagagatcc actgagctgg 1620

aatagcttaa aaccattatc agaacaaaat aaaccatttt ttgttaagaa tcagagcata 1680

gtaaacaaca gaaacaacct aagagaggta acttgtccaa gaagatagct aattatatct 1740

attttataaa agttatcata gtttgtaagt cacaaaagat gcaaataaca gagaaactag 1800

gagacttgag aatatacatt cttgtatatt tgtattcgag attgtgaaaa tttgaccata 1860

agtttaaatt cttaaaaaga tatatctgat ctaggtgatg gttatagact gtaattttac 1920

cacatgttta atgatggata gtgacacaca tgacacatcg acaacactat agcatcttat 1980

ttagattaca acatgaaatt tttctgtaat acatgtcttt gtacataatt taaaagtaat 2040

tcctaagaaa tatatttata caaggagttt aaagaaaaca tagcataaag ttcaatgagt 2100

agtaaaaacc atatacagta tatagcataa agttcaatga gtttattaca aaagcattgg 2160

ttcactttct gtaacacgac gttaaacctt cgtctccaat aggagcgcta ctgattcaac 2220

atgccaatat atactaaata cgtttctaca gtcaaatgct ttaacgtttc atgattaagt 2280

gactatttac cgtcaatcct ttcccattcc tcccactaat ccaacttttt aattactctt 2340

aaatcaccac taagctagta acgcctatca tgaattagct ctactaaatc tagcaacctt 2400

tcaaatttgc agtattgcag gtgtctctgt gtctttaaaa tagttgcctt atgatttctt 2460

cggtttcaag atgatcaaat agttatagat ttcatgctca cacatgctca ttagatgtgt 2520

acatacttta cttacccaaa tctattttct cgcaaagatt ttgatggtaa agctgatttg 2580

gttctattga actaaatcaa acgagtttca gactgagtga ttctaatccg gcccattagc 2640

ccctaaacag acccactaat tacgcagctt ttaatagagt aattacacct agtttaccca 2700

ctaaaccact aagcactaat tatctcacaa tctaatgagc ttccctcgta attacttggg 2760

ctttcactct accatttatt tgtaacagtc aagtctctac tgtctctata taaactctct 2820

aaagttaaca cacaattctc atcacaaaca aatcaaccaa agcaacttct actctttctt 2880

ctttcgacct tatcaatctg ttgagaaatc tagatggatt acaaggacca cgacggggat 2940

tacaaggacc acgacattga ttacaaggat gatgatgaca agatggctcc gaagaagaag 3000

aggaaggttg gcatccacgg ggtgccagct gctgacaaga agtactcgat cggcctcgat 3060

attgggacta actctgttgg ctgggccgtg atcaccgacg agtacaaggt gccctcaaag 3120

aagttcaagg tcctgggcaa caccgatcgg cattccatca agaagaatct cattggcgct 3180

ctcctgttcg acagcggcga gacggctgag gctacgcggc tcaagcgcac cgcccgcagg 3240

cggtacacgc gcaggaagaa tcgcatctgc tacctgcagg agattttctc caacgagatg 3300

gcgaaggttg acgattcttt cttccacagg ctggaggagt cattcctcgt ggaggaggat 3360

aagaagcacg agcggcatcc aatcttcggc aacattgtcg acgaggttgc ctaccacgag 3420

aagtacccta cgatctacca tctgcggaag aagctcgtgg actccacaga taaggcggac 3480

ctccgcctga tctacctcgc tctggcccac atgattaagt tcaggggcca tttcctgatc 3540

gagggggatc tcaacccgga caatagcgat gttgacaagc tgttcatcca gctcgtgcag 3600

acgtacaacc agctcttcga ggagaacccc attaatgcgt caggcgtcga cgcgaaggct 3660

atcctgtccg ctaggctctc gaagtctcgg cgcctcgaga acctgatcgc ccagctgccg 3720

ggcgagaaga agaacggcct gttcgggaat ctcattgcgc tcagcctggg gctcacgccc 3780

aacttcaagt cgaatttcga tctcgctgag gacgccaagc tgcagctctc caaggacaca 3840

tacgacgatg acctggataa cctcctggcc cagatcggcg atcagtacgc ggacctgttc 3900

ctcgctgcca agaatctgtc ggacgccatc ctcctgtctg atattctcag ggtgaacacc 3960

gagattacga aggctccgct ctcagcctcc atgatcaagc gctacgacga gcaccatcag 4020

gatctgaccc tcctgaaggc gctggtcagg cagcagctcc ccgagaagta caaggagatc 4080

ttcttcgatc agtcgaagaa cggctacgct gggtacattg acggcggggc ctctcaggag 4140

gagttctaca agttcatcaa gccgattctg gagaagatgg acggcacgga ggagctgctg 4200

gtgaagctca atcgcgagga cctcctgagg aagcagcgga cattcgataa cggcagcatc 4260

ccacaccaga ttcatctcgg ggagctgcac gctatcctga ggaggcagga ggacttctac 4320

cctttcctca aggataaccg cgagaagatc gagaagattc tgactttcag gatcccgtac 4380

tacgtcggcc cactcgctag gggcaactcc cgcttcgctt ggatgacccg caagtcagag 4440

gagacgatca cgccgtggaa cttcgaggag gtggtcgaca agggcgctag cgctcagtcg 4500

ttcatcgaga ggatgacgaa tttcgacaag aacctgccaa atgagaaggt gctccctaag 4560

cactcgctcc tgtacgagta cttcacagtc tacaacgagc tgactaaggt gaagtatgtg 4620

accgagggca tgaggaagcc ggctttcctg tctggggagc agaagaaggc catcgtggac 4680

ctcctgttca agaccaaccg gaaggtcacg gttaagcagc tcaaggagga ctacttcaag 4740

aagattgagt gcttcgattc ggtcgagatc tctggcgttg aggaccgctt caacgcctcc 4800

ctggggacct accacgatct cctgaagatc attaaggata aggacttcct ggacaacgag 4860

gagaatgagg atatcctcga ggacattgtg ctgacactca ctctgttcga ggaccgggag 4920

atgatcgagg agcgcctgaa gacttacgcc catctcttcg atgacaaggt catgaagcag 4980

ctcaagagga ggaggtacac cggctggggg aggctgagca ggaagctcat caacggcatt 5040

cgggacaagc agtccgggaa gacgatcctc gacttcctga agagcgatgg cttcgcgaac 5100

cgcaatttca tgcagctgat tcacgatgac agcctcacat tcaaggagga tatccagaag 5160

gctcaggtga gcggccaggg ggactcgctg cacgagcata tcgcgaacct cgctggctcg 5220

ccagctatca agaaggggat tctgcagacc gtgaaggttg tggacgagct ggtgaaggtc 5280

atgggcaggc acaagcctga gaacatcgtc attgagatgg cccgggagaa tcagaccacg 5340

cagaagggcc agaagaactc acgcgagagg atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag 5400

ctggggtccc agatcctcaa ggagcacccg gtggagaaca cgcagctgca gaatgagaag 5460

ctctacctgt actacctcca gaatggccgc gatatgtatg tggaccagga gctggatatt 5520

aacaggctca gcgattacga cgtcgatcat atcgttccac agtcattcct gaaggatgac 5580

tccattgaca acaaggtcct caccaggtcg gacaagaacc ggggcaagtc tgataatgtt 5640

ccttcagagg aggtcgttaa gaagatgaag aactactggc gccagctcct gaatgccaag 5700

ctgatcacgc agcggaagtt cgataacctc acaaaggctg agaggggcgg gctctctgag 5760

ctggacaagg cgggcttcat caagaggcag ctggtcgaga cacggcagat cactaagcac 5820

gttgcgcaga ttctcgactc acggatgaac actaagtacg atgagaatga caagctgatc 5880

cgcgaggtga aggtcatcac cctgaagtca aagctcgtct ccgacttcag gaaggatttc 5940

cagttctaca aggttcggga gatcaacaat taccaccatg cccatgacgc gtacctgaac 6000

gcggtggtcg gcacagctct gatcaagaag tacccaaagc tcgagagcga gttcgtgtac 6060

ggggactaca aggtttacga tgtgaggaag atgatcgcca agtcggagca ggagattggc 6120

aaggctaccg ccaagtactt cttctactct aacattatga atttcttcaa gacagagatc 6180

actctggcca atggcgagat ccggaagcgc cccctcatcg agacgaacgg cgagacgggg 6240

gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc gcgaccgtca ggaaggttct ctccatgcca 6300

caagtgaata tcgtcaagaa gacagaggtc cagactggcg ggttctctaa ggagtcaatt 6360

ctgcctaagc ggaacagcga caagctcatc gcccgcaaga aggactggga tccgaagaag 6420

tacggcgggt tcgacagccc cactgtggcc tactcggtcc tggttgtggc gaaggttgag 6480

aagggcaagt ccaagaagct caagagcgtg aaggagctgc tggggatcac gattatggag 6540

cgctccagct tcgagaagaa cccgatcgat ttcctggagg cgaagggcta caaggaggtg 6600

aagaaggacc tgatcattaa gctccccaag tactcactct tcgagctgga gaacggcagg 6660

aagcggatgc tggcttccgc tggcgagctg cagaagggga acgagctggc tctgccgtcc 6720

aagtatgtga acttcctcta cctggcctcc cactacgaga agctcaaggg cagccccgag 6780

gacaacgagc agaagcagct gttcgtcgag cagcacaagc attacctcga cgagatcatt 6840

gagcagattt ccgagttctc caagcgcgtg atcctggccg acgcgaatct ggataaggtc 6900

ctctccgcgt acaacaagca ccgcgacaag ccaatcaggg agcaggctga gaatatcatt 6960

catctcttca ccctgacgaa cctcggcgcc cctgctgctt tcaagtactt cgacacaact 7020

atcgatcgca agaggtacac aagcactaag gaggtcctgg acgcgaccct catccaccag 7080

tcgattaccg gcctctacga gacgcgcatc gacctgtctc agctcggggg cgacaagcgg 7140

ccagcggcga cgaagaaggc ggggcaggcg aagaagaaga agtgagctca gagctttcgt 7200

tcgtatcatc ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca ttgcgcacac 7260

accagaatcc tactgagttt gagtattatg gcattgggaa aactgttttt cttgtaccat 7320

ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa ctgtgaaatg 7380

gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt tgttcattct caaattaata 7440

ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga aattataaga gatatgcaaa 7500

cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa gttaatatga 7560

ggagtaaaac acttgtagtt gtaccattat gcttattcac taggcaacaa atatattttc 7620

agacctagaa aagctgcaaa tgttactgaa tacaagtatg tcctcttgtg ttttagacat 7680

ttatgaactt tcctttatgt aattttccag aatccttgtc agattctaat cattgcttta 7740

taattatagt tatactcatg gatttgtagt tgagtatgaa aatatttttt aatgcatttt 7800

atgacttgcc aattgattga caacgaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga 7860

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 7920

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 7980

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 8040

ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact 8100

ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa 8160

gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa 8220

ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta 8280

tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca 8340

tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgataaca 8400

tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 8460

aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt 8520

gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat 8580

gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca 8640

aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 8700

caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact 8760

atccttcgca agaccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacacgctg 8820

aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctcgagc tttcgcagat cccggggggc 8880

aatgagatat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa 8940

agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca 9000

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct 9060

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc 9120

ttgacattgg ggagtttagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg 9180

tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctacaaccg gtcgcggagg 9240

ctatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac 9300

cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc 9360

atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc 9420

tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg 9480

atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga 9540

gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt 9600

ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag 9660

gatcgccacg actccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct 9720

tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc 9780

gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga 9840

ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga 9900

gggcaaagaa atagagtaga tgccgaccgg atctgtcgat cgacaagctc gagtttctcc 9960

ataataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca 10020

tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa 10080

taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaat 10140

tcggcgttaa ttcagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc 10200

aatttgttta caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag 10260

ctcggcacaa aatcaccact cgatacaggc agcccatcag tccgggacgg cgtcagcggg 10320

agagccgttg taaggcggca gactttgctc atgttaccga tgctattcgg aagaacggca 10380

actaagctgc cgggtttgaa acacggatga tctcgcggag ggtagcatgt tgattgtaac 10440

gatgacagag cgttgctgcc tgtgatcacc gcggtttcaa aatcggctcc gtcgatacta 10500

tgttatacgc caactttgaa aacaactttg aaaaagctgt tttctggtat ttaaggtttt 10560

agaatgcaag gaacagtgaa ttggagttcg tcttgttata attagcttct tggggtatct 10620

ttaaatactg tagaaaagag gaaggaaata ataaatggct aaaatgagaa tatcaccgga 10680

attgaaaaaa ctgatcgaaa aataccgctg cgtaaaagat acggaaggaa tgtctcctgc 10740

taaggtatat aagctggtgg gagaaaatga aaacctatat ttaaaaatga cggacagccg 10800

gtataaaggg accacctatg atgtggaacg ggaaaaggac atgatgctat ggctggaagg 10860

aaagctgcct gttccaaagg tcctgcactt tgaacggcat gatggctgga gcaatctgct 10920

catgagtgag gccgatggcg tcctttgctc ggaagagtat gaagatgaac aaagccctga 10980

aaagattatc gagctgtatg cggagtgcat caggctcttt cactccatcg acatatcgga 11040

ttgtccctat acgaatagct tagacagccg cttagccgaa ttggattact tactgaataa 11100

cgatctggcc gatgtggatt gcgaaaactg ggaagaagac actccattta aagatccgcg 11160

cgagctgtat gattttttaa agacggaaaa gcccgaagag gaacttgtct tttcccacgg 11220

cgacctggga gacagcaaca tctttgtgaa agatggcaaa gtaagtggct ttattgatct 11280

tgggagaagc ggcagggcgg acaagtggta tgacattgcc ttctgcgtcc ggtcgatcag 11340

ggaggatatc ggggaagaac agtatgtcga gctatttttt gacttactgg ggatcaagcc 11400

tgattgggag aaaataaaat attatatttt actggatgaa ttgttttagt acctagaatg 11460

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gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 11580

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 11640

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 11700

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gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 11820

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 11880

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 11940

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 12000

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 12060

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 12120

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agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 12300

ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 12360

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg 12420

ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 12480

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 12540

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gggtgccttg 12600

atgtgggcgc cggcggtcga gtggcgacgg cgcggcttgt ccgcgccctg gtagattgcc 12660

tggccgtagg ccagccattt ttgagcggcc agcggccgcg ataggccgac gcgaagcggc 12720

ggggcgtagg gagcgcagcg accgaagggt aggcgctttt tgcagctctt cggctgtgcg 12780

ctggccagac agttatgcac aggccaggcg ggttttaaga gttttaataa gttttaaaga 12840

gttttaggcg gaaaaatcgc cttttttctc ttttatatca gtcacttaca tgtgtgaccg 12900

gttcccaatg tacggctttg ggttcccaat gtacgggttc cggttcccaa tgtacggctt 12960

tgggttccca atgtacgtgc tatccacagg aaacagacct tttcgacctt tttcccctgc 13020

tagggcaatt tgccctagca tctgctccgt acattaggaa ccggcggatg cttcgccctc 13080

gatcaggttg cggtagcgca tgactaggat cgggccagcc tgccccgcct cctccttcaa 13140

atcgtactcc ggcaggtcat ttgacccgat cagcttgcgc acggtgaaac agaacttctt 13200

gaactctccg gcgctgccac tgcgttcgta gatcgtcttg aacaaccatc tggcttctgc 13260

cttgcctgcg gcgcggcgtg ccaggcggta gagaaaacgg ccgatgccgg gatcgatcaa 13320

aaagtaatcg gggtgaaccg tcagcacgtc cgggttcttg ccttctgtga tctcgcggta 13380

catccaatca gctagctcga tctcgatgta ctccggccgc ccggtttcgc tctttacgat 13440

cttgtagcgg ctaatcaagg cttcaccctc ggataccgtc accaggcggc cgttcttggc 13500

cttcttcgta cgctgcatgg caacgtgcgt ggtgtttaac cgaatgcagg tttctaccag 13560

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ggttagatgg gaaaccgcca tcagtaccag gtcgtaatcc cacacactgg ccatgccggc 13740

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cttcctaatc gacggcgcac cggctgccgg cggttgccgg gattctttgc ggattcgatc 13980

agcggccgct tgccacgatt caccggggcg tgcttctgcc tcgatgcgtt gccgctgggc 14040

ggcctgcgcg gccttcaact tctccaccag gtcatcaccc agcgccgcgc cgatttgtac 14100

cgggccggat ggtttgcgac cgctcacgcc gattcctcgg gcttgggggt tccagtgcca 14160

ttgcagggcc ggcagacaac ccagccgctt acgcctggcc aaccgcccgt tcctccacac 14220

atggggcatt ccacggcgtc ggtgcctggt tgttcttgat tttccatgcc gcctccttta 14280

gccgctaaaa ttcatctact catttattca tttgctcatt tactctggta gctgcgcgat 14340

gtattcagat agcagctcgg taatggtctt gccttggcgt accgcgtaca tcttcagctt 14400

ggtgtgatcc tccgccggca actgaaagtt gacccgcttc atggctggcg tgtctgccag 14460

gctggccaac gttgcagcct tgctgctgcg tgcgctcgga cggccggcac ttagcgtgtt 14520

tgtgcttttg ctcattttct ctttacctca ttaactcaaa tgagttttga tttaatttca 14580

gcggccagcg cctggacctc gcgggcagcg tcgccctcgg gttctgattc aagaacggtt 14640

gtgccggcgg cggcagtgcc tgggtagctc acgcgctgcg tgatacggga ctcaagaatg 14700

ggcagctcgt acccggccag cgcctcggca acctcaccgc cgatgcgcgt gcctttgatc 14760

gcccgcgaca cgacaaaggc cgcttgtagc cttccatccg tgacctcaat gcgctgctta 14820

accagctcca ccaggtcggc ggtggcccat atgtcgtaag ggcttggctg caccggaatc 14880

agcacgaagt cggctgcctt gatcgcggac acagccaagt ccgccgcctg gggcgctccg 14940

tcgatcacta cgaagtcgcg ccggccgatg gccttcacgt cgcggtcaat cgtcgggcgg 15000

tcgatgccga caacggttag cggttgatct tcccgcacgg ccgcccaatc gcgggcactg 15060

ccctggggat cggaatcgac taacagaaca tcggccccgg cgagttgcag ggcgcgggct 15120

agatgggttg cgatggtcgt cttgcctgac ccgcctttct ggttaagtac agcgataacc 15180

ttcatgcgtt ccccttgcgt atttgtttat ttactcatcg catcatatac gcagcgaccg 15240

catgacgcaa gctgttttac tcaaatacac atcacctttt tagacggcgg cgctcggttt 15300

cttcagcggc caagctggcc ggccaggccg ccagcttggc atcagacaaa ccggccagga 15360

tttcatgcag ccgcacggtt gagacgtgcg cgggcggctc gaacacgtac ccggccgcga 15420

tcatctccgc ctcgatctct tcggtaatga aaaacggttc gtcctggccg tcctggtgcg 15480

gtttcatgct tgttcctctt ggcgttcatt ctcggcggcc gccagggcgt cggcctcggt 15540

caatgcgtcc tcacggaagg caccgcgccg cctggcctcg gtgggcgtca cttcctcgct 15600

gcgctcaagt gcgcggtaca gggtcgagcg atgcacgcca agcagtgcag ccgcctcttt 15660

cacggtgcgg ccttcctggt cgatcagctc gcgggcgtgc gcgatctgtg ccggggtgag 15720

ggtagggcgg gggccaaact tcacgcctcg ggccttggcg gcctcgcgcc cgctccgggt 15780

gcggtcgatg attagggaac gctcgaactc ggcaatgccg gcgaacacgg tcaacaccat 15840

gcggccggcc ggcgtggtgg tgtcggccca cggctctgcc aggctacgca ggcccgcgcc 15900

ggcctcctgg atgcgctcgg caatgtccag taggtcgcgg gtgctgcggg ccaggcggtc 15960

tagcctggtc actgtcacaa cgtcgccagg gcgtaggtgg tcaagcatcc tggccagctc 16020

cgggcggtcg cgcctggtgc cggtgatctt ctcggaaaac agcttggtgc agccggccgc 16080

gtgcagttcg gcccgttggt tggtcaagtc ctggtcgtcg gtgctgacgc gggcatagcc 16140

cagcaggcca gcggcggcgc tcttgttcat ggcgtaatgt ctccggttct agtcgcaagt 16200

attctacttt atgcgactaa aacacgcgac aagaaaacgc caggaaaagg gcagggcggc 16260

agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg gctgcactga 16320

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aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 16440

ccttttaaat atccgttatt ctaataaacg ctcttttctc ttag 16484

Claims (10)

1.一种随机突变的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括靶向元件和编辑元件，所述靶向元件引导编辑元件对基因进行编辑，其特征在于，所述靶向元件可进行随机突变，从而引导编辑元件对新的靶点序列进行编辑。

2.根据权利要求1的基因编辑系统，其特征在于，所述靶向元件包括蛋白质、RNA、DNA中的一种或两种的结合，或者所述靶向元件包括不同的蛋白质、不同的RNA或不同的DNA；所述编辑元件为以DNA或DNA的碱基为底物的酶。

3.根据权利要求1或2的基因编辑系统，其特征在于，所述编辑元件为核酸内切酶；所述靶向元件为两种sgRNA序列：sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA2的部分序列和相应sgRNA1的序列高度重合，使sgRNA1引导核酸内切酶在表达sgRNA2的DNA区域进行基因编辑，从而随机产生新的sgRNA，所述新的sgRNA可以引导核酸内切酶进行基因编辑，从而产生随机突变；优选地，所述基因编辑系统包括CRISPR系统；优选地，所述两种sgRNA序列分别包括一个或两个以上相同或不同的序列。

4.根据权利要求3的基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA2的部分序列和相应sgRNA1的序列高度重合是指表达sgRNA2的基因序列可以被sgRNA1识别并且被核酸内切酶剪切。

5.根据权利要求3或4的基因编辑系统，其特征在于，所述核酸内切酶为Cas蛋白或Cpf1蛋白，其中，所述Cas蛋白，优选为Cas9、Cas9n、dCas9或xCas9。

6.表达权利要求1-5任一项所述基因编辑系统的核酸。

7.表达权利要求1-5任一项所述基因编辑系统的载体。

8.一种细胞中随机突变的方法，其特征在于，包括步骤如下：

将权利要求6所述核酸或权利要求7所述的载体导入宿主细胞中，培养宿主。

9.一种突变体库的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：

将权利要求6所述核酸或权利要求7所述的载体导入宿主细胞中，培养宿主。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为有性生殖生物中的生殖细胞或无性生殖生物中的可分裂并能成长为个体的细胞。