JP2023123564A - 植物細胞パックの自動化された形質転換のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a) 形質転換されるべき培養植物細胞の植物細胞パッケージ(PCP)を提供すること、
b) 前記PCPを一定のインキュベーション時間の間、形質転換作用物質を含有する液体と接触させること、
c) 前記の形質転換作用物質を含有する液体を除去すること;ならびにそれによって、
d) 前記培養植物細胞を形質転換すること、
を含んでおり、
この形質転換作用物質を含有する液体は、ステップb)において、自動化された装置によって最大50μl/sの流量でPCPに適用される。
体の入っているマルチウェルプレートと同数の穴を有するマルチウェルプレートに集められるが、この場合、残渣のない細胞溶解物を集めるために使用されるプレートは、遠心分離の前に多孔性担体を有するプレートの下方に配置された。好ましくは1ステップ、より好ましくは全ステップが自動化された装置を用いて行われる。
a) 本発明の培養植物細胞の形質転換のための方法にしたがって得られたPCPを提供すること、ならびにさらに
b) 形質転換が生じるのに適した条件下でPCPをインキュベートするステップ、
c) PCPに含まれる植物細胞を溶解するステップ、およびそれによって
d) 形質転換された植物細胞の溶解物を提供するステップ
を含む。
a) ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳に必要とされる細胞成分を含有する、無細胞抽出物を提供すること
b) 発現可能な核酸配列を含むヌクレオチドと、ステップa)の無細胞抽出物を接触させること、ならびに、それによって
c) 前記核酸配列の転写を引き起こし、さらに場合によっては、翻訳を引き起こすこと
を含む。
1. a) 形質転換されるべき培養植物細胞の植物細胞パッケージ(PCP)を提供すること、b) 前記PCPを、形質転換作用物質を含有する液体と、(ある)インキュベーション時間の間、接触させること、
c) 前記の形質転換作用物質を含有する液体を除去すること;ならびに、それによって
d) 前記培養植物細胞を形質転換すること、
を含む、培養植物細胞を形質転換するための方法であって、
ステップb) において、形質転換作用物質を含有する液体が自動化された装置によって、好ましくは最大50μl/sの速度で、PCPに適用される、前記方法。
b) 形質転換が生じるのに適した条件下でPCPをインキュベートすること、
c) PCPに含まれる植物細胞を溶解すること、および、それによって
d) 形質転換された植物細胞の溶解物を提供すること、
を含む、形質転換された植物細胞の溶解物を提供するための方法。
b) 発現可能な核酸配列を含有するポリヌクレオチドと、ステップa)の無細胞抽出物を接触させること、ならびにそれによって
c) 前記核酸配列の転写、および、必要に応じて翻訳を引き起こすこと
を含む、無細胞系においてin vitroで、少なくとも1つの核酸配列の転写、および、必要に応じて、翻訳を引き起こすための方法。
すべてのピペット操作ステップおよびプレートの移動は、自動化されたピペット操作ステーションJANUS G3 (PerkinElmer)によって行われた。移すべき容量に応じて、適当な使い捨てチップおよびピペッティングパラメーターを選択した。制御および周辺機器間のデータ交換は、JANUS WinPREPソフトウェア (Version 5.1)によって提供された。体積計算は、ユーザー提供スクリプトによって行われた。
植物発現ベクターpTRAc-rfp-H、pTRAc-rfp-ERH、pTRAc-rfp-AHまたはpTRAc-TPrfp-Hのうち1つを保有し、これらのベクターがすべてpTRA(Sack et al. (2015), Plant Biotechnol. J. 13: 1094)に基づくものである、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)GV3101(pMP90RK)細胞を、96ウェル ”Deep-Well“ マルチクラスタープレートにおいてウェル当り500μlのPAM培地(ソイペプトン20 g/l;酵母エキス0.5 g/l;フルクトース5 g/l;硫酸マグネシウム(MgSO4) 1 g/l、pH 7.0;カルベニシリン(50 mg/l)およびカナマイシン(25 mg/l)を添加)中で、28℃にて、2 mmの振幅を有する一体型ロータリーシェーカー上で1000 rpmとして、OD600 が6.0となるまで増殖させた。細菌細胞は、188gにて4分間でペレットとし、上清を捨てた。ペレットを、1000 rpmおよび振幅2 mmにて8分間、200μl滅菌浸潤バッファー(ショ糖50 g/l;グルコース一水和物2 g/l;0.5 g/l Ferty 2 MEGA (Planta Duengemittel GmbH);200μM アセトシリンゴン;pH 5.6)中で再懸濁した。1:20希釈物のOD600を一体型プレートリーダーによって96ウェルプレートにおいて測定し、それぞれのウェル中のすべての細菌懸濁液を、OD600 0.4に標準化して、新たな96ウェルプレートに入れた。
タバコ(Nicotiana tabacum)BY-2は、80 g/lの湿質量密度に達するまで、26℃にて、ムラシゲ・スクーグ培地(ショ糖20 g/l;MS塩類(最小限の有機物、Fa. Duchefa)4,3 g/l;KH2PO4 200 mg/l;ミオイノシトール100 mg/l;塩酸チアミン1 mg/l;2,4-ジクロロフェノキシ酢酸0.2 mg/l、pH 5.0)中で連続培養にて増殖させた。2 lの培養物を取り出して、約45分間沈降させておき、培地をデカントすることによって、湿質量密度200 g/l ± 5%まで濃縮した。
実施例3のPCPに、それぞれ90μlの標準化されたアグロバクテリウム懸濁液を滴下して添加し、続いて22℃にて60分間インキュベートした。その後、プレートは装置内の遠心機に再度搭載され、1800 x gで1分間遠心分離して浸潤溶液を除去した。
浸潤させたPCPを有するフィルタープレートは、1ウェル”Deep-Well“リザーバー上で80%の相対湿度で26℃にて72時間、裏返してインキュベートした。リザーバーは150 ml H2Oで満たされ、160 cm3の空きスペースを有した;フィルタープレートとリザーバーの間の接合部は気密シールされた。
インキュベーション後、PCPを含有するフィルタープレートは、一体型プレートリーダーに移され、PCP中のDsRedタンパク質を直接測定した(励起:559 nm;発光585 nm)。その後、フィルタープレートを、あらかじめ作られた隔壁開口部を有するSilicone/PTFEマット(Webseal mat M115, Fa. Thermo Scientific)でシールし、200μlの抽出バッファー(ドデシル硫酸ナトリウム1 g/l;エチレンジアミン四酢酸(EDTA) 50 mM; pH 8.0)を各ウェルに添加した。
連続培養されたBY-2細胞を、フレッシュな生物量が200 g/lとなるまで濃縮し、細胞懸濁液300μlを滅菌Agroprep Advance PP/PE 30-40μmフィルタープレート(Pall GmbH, Dreieich, Germany)に移した。余分な培地を、1800 rcfで1分間の遠心分離によって、またはChromabond Vacuum Manifold(Macherey-Nagel, Dueren, Germany)上で約10秒間800 mbarの減圧を適用することによって除去した。
(付記)
(付記1)
培養植物細胞を形質転換するための方法であって、その方法が
a) 形質転換されるべき培養植物細胞の植物細胞パッケージ(PCP)を提供すること、
b) 前記PCPを、形質転換作用物質を含有する液体と、インキュベーション時間の間、接触させること、
c) 前記の形質転換作用物質を含有する液体を除去すること;ならびに、それによって
d) 前記培養植物細胞を形質転換すること、
を含み、ステップb) において、形質転換作用物質を含有する液体が自動化された装置によって、好ましくは最大50μl/sの速度で、PCPに適用される、前記方法。
(付記2)
前記の植物細胞パッケージの提供が、適当量の細胞集団を多孔性担体、好ましくはフィルター上に遠心分離することを含む、付記1に記載の方法。
(付記3)
前記多孔性担体が、マルチウェルフィルタープレートであり、該マルチウェルフィルタープレートが好ましくは平均孔径30μm~40μmの孔を有する、付記1または2に記載の方法。
(付記4)
前記PCPが、植物細胞のぎっしり詰まったパッケージであり、該植物細胞のぎっしり詰まったパッケージが好ましくは、0.1 g/cm3 ~0.9 g/cm3、好ましくは0.4 g/cm3 ~0.6 g/cm3の質量密度を有する、付記1~3のいずれか1項に記載の方法。
(付記5)
前記方法が、前記培養植物細胞の固形化手段を追加することを含む、付記1~4のいずれか1項に記載の方法。
(付記6)
前記細胞が、ステップa)の前に、10 g/l~50 g/lのショ糖、好ましくは15 g/l~35 g/lのショ糖、より好ましくは約20 g/lのショ糖を含有する培地中で培養される、付記1~5のいずれか1項に記載の方法。
(付記7)
前記細胞が、ステップa)の前に、1 mM~10 mMのリン酸イオン、好ましくは2 mM~5 mMのリン酸イオン、より好ましくは約2.7 mMのリン酸イオンを含有する培地中で培養される、付記1~6のいずれか1項に記載の方法。
(付記8)
前記の形質転換作用物質が、単離された組換えポリヌクレオチド、組換え植物ウイルス、および組換え細菌からなる一群から選択され、好ましくは組換え細菌である、付記1~7のいずれか1項に記載の方法。
(付記9)
前記の組換え細菌が、リゾビウム(Rhizobiaceae)科、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、Agrobacterium radiobacter、もしくはRhizobium radiobacterの細菌であって、より好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) GV3101株、もっとも好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) GV3101: pMP90RK株の細菌である、付記1~8のいずれか1項に記載の方法。
(付記10)
前記の形質転換作用物質を含有する液体が、自動化された方法によって提供され、好ましくは、前記アグロバクテリウム細菌の培養から始まる全ステップを含んでなる、完全に自動化された方法によって提供される、付記1~10のいずれか1項に記載の方法。
(付記11)
前記の形質転換が一過性形質転換である、付記1~10のいずれか1項に記載の方法。
(付記12)
前記方法が完全に自動化された方法である、付記1~11のいずれか1項に記載の方法。
(付記13)
付記1~12のいずれか1項に記載の方法によって得られた、または得られうる、形質転換された植物細胞。
(付記14)
付記1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られた、または得られうる、形質転換された植物細胞の、ハイスループットスクリーニングのための使用。
(付記15)
形質転換された植物細胞の溶解物を提供するための方法であって、その方法が
a) 付記1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られたPCPを提供すること、ならびに、追加のステップである
b) 形質転換が生じるのに適した条件下でPCPをインキュベートすること、
c) PCPに含まれる植物細胞を溶解すること、および、それによって
d) 形質転換された植物細胞の溶解物を提供すること、
を含む、前記方法。
(付記16)
無細胞系においてin vitroで、少なくとも1つの核酸配列の転写、および、必要に応じて、翻訳を引き起こすための方法であって、その方法が
a) ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳のために必要とされる細胞成分を含有する、無細胞抽出物を提供すること
b) 発現可能な核酸配列を含有するポリヌクレオチドと、ステップa)の無細胞抽出物を接触させること、ならびにそれによって
c) 前記核酸配列の転写、および、必要に応じて、翻訳を引き起こすこと
を含み、
前記無細胞抽出物が付記1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られた植物細胞からえられ、または前記無細胞抽出物が付記13に記載の形質転換された植物細胞の溶解物である、前記方法。
(付記17)
前記方法が、前記無細胞抽出物を、異種RNAポリメラーゼ、好ましくはT7 RNAポリメラーゼと接触させることを含む;ならびに/または、前記無細胞抽出物を、異種RNAポリメラーゼ、好ましくはT7 RNAポリメラーゼをコードする発現可能な遺伝子を含有するポリヌクレオチドと接触させることを含む、付記16に記載の方法。
(付記18)
前記植物細胞が、単子葉もしくは双子葉植物から選択される細胞であり、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、ニンジン(Daucus carota)、またはコムギ(Tricium aestivum)から選択される細胞である、付記1~17のいずれか1項に記載の主題。
Claims (18)
- 培養植物細胞を形質転換するための方法であって、その方法が
a) 形質転換されるべき培養植物細胞の植物細胞パッケージ(PCP)を提供すること、
b) 前記PCPを、形質転換作用物質を含有する液体と、インキュベーション時間の間、接触させること、
c) 前記の形質転換作用物質を含有する液体を除去すること;ならびに、それによって
d) 前記培養植物細胞を形質転換すること、
を含み、ステップb) において、形質転換作用物質を含有する液体が自動化された装置によって、好ましくは最大50μl/sの速度で、PCPに適用される、前記方法。 - 前記の植物細胞パッケージの提供が、適当量の細胞集団を多孔性担体、好ましくはフィルター上に遠心分離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多孔性担体が、マルチウェルフィルタープレートであり、該マルチウェルフィルタープレートが好ましくは平均孔径30μm~40μmの孔を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記PCPが、植物細胞のぎっしり詰まったパッケージであり、該植物細胞のぎっしり詰まったパッケージが好ましくは、0.1 g/cm3 ~0.9 g/cm3、好ましくは0.4 g/cm3 ~0.6 g/cm3の質量密度を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記培養植物細胞の固形化手段を追加することを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、ステップa)の前に、10 g/l~50 g/lのショ糖、好ましくは15 g/l~35 g/lのショ糖、より好ましくは約20 g/lのショ糖を含有する培地中で培養される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、ステップa)の前に、1 mM~10 mMのリン酸イオン、好ましくは2 mM~5 mMのリン酸イオン、より好ましくは約2.7 mMのリン酸イオンを含有する培地中で培養される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の形質転換作用物質が、単離された組換えポリヌクレオチド、組換え植物ウイルス、および組換え細菌からなる一群から選択され、好ましくは組換え細菌である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の組換え細菌が、リゾビウム(Rhizobiaceae)科、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、Agrobacterium radiobacter、もしくはRhizobium radiobacterの細菌であって、より好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) GV3101株、もっとも好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) GV3101: pMP90RK株の細菌である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の形質転換作用物質を含有する液体が、自動化された方法によって提供され、好ましくは、前記アグロバクテリウム細菌の培養から始まる全ステップを含んでなる、完全に自動化された方法によって提供される、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の形質転換が一過性形質転換である、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が完全に自動化された方法である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の方法によって得られた、または得られうる、形質転換された植物細胞。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られた、または得られうる、形質転換された植物細胞の、ハイスループットスクリーニングのための使用。
- 形質転換された植物細胞の溶解物を提供するための方法であって、その方法が
a) 請求項1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られたPCPを提供すること、ならびに、追加のステップである
b) 形質転換が生じるのに適した条件下でPCPをインキュベートすること、
c) PCPに含まれる植物細胞を溶解すること、および、それによって
d) 形質転換された植物細胞の溶解物を提供すること、
を含む、前記方法。 - 無細胞系においてin vitroで、少なくとも1つの核酸配列の転写、および、必要に応じて、翻訳を引き起こすための方法であって、その方法が
a) ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳のために必要とされる細胞成分を含有する、無細胞抽出物を提供すること
b) 発現可能な核酸配列を含有するポリヌクレオチドと、ステップa)の無細胞抽出物を接触させること、ならびにそれによって
c) 前記核酸配列の転写、および、必要に応じて、翻訳を引き起こすこと
を含み、
前記無細胞抽出物が請求項1~12のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られた植物細胞からえられ、または前記無細胞抽出物が請求項13に記載の形質転換された植物細胞の溶解物である、前記方法。 - 前記方法が、前記無細胞抽出物を、異種RNAポリメラーゼ、好ましくはT7 RNAポリメラーゼと接触させることを含む;ならびに/または、前記無細胞抽出物を、異種RNAポリメラーゼ、好ましくはT7 RNAポリメラーゼをコードする発現可能な遺伝子を含有するポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記植物細胞が、単子葉もしくは双子葉植物から選択される細胞であり、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、ニンジン(Daucus carota)、またはコムギ(Tricium aestivum)から選択される細胞である、請求項1~17のいずれか1項に記載の主題。
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