ES2962273T3 - Procedimiento para la transformación automatizada de un paquete de células vegetales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la transformación de células vegetales cultivadas que comprende a) proporcionar un paquete de células vegetales (PCP) de células vegetales cultivadas para transformar, b) poner en contacto dicho PCP con un líquido que comprende un agente transformador durante un período de incubación, c) eliminar dicho líquido que comprende un agente transformador; y, de ese modo, d) transformar dichas células vegetales cultivadas, en donde el líquido que comprende el agente transformador se aplica al PCP en la etapa b) mediante un equipo automatizado, preferiblemente a una velocidad de como máximo 50 μl/s. Además, la presente invención se refiere a células vegetales transformadas, usos y métodos relacionados con las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la transformación automatizada de un paquete de células vegetales

La presente invención se refiere a un procedimiento para la transformación de células vegetales cultivadas que comprende a) proporcionar un paquete de células vegetales (PCP) de células vegetales cultivadas que se van a transformar, b) poner en contacto dicho PCP con un líquido que comprende un agente transformante durante un periodo de incubación, c) retirar dicho líquido que comprende un agente transformante; y, de este modo, d) transformar dichas células vegetales cultivadas, en el que el líquido que comprende el agente transformante se aplica al PCP en el paso b) mediante un equipo automatizado, preferentemente a una tasa de como máximo 50 pl/s. Además, la presente invención se refiere a células vegetales transformadas, usos y procedimientos relacionados con las mismas.

Se han realizado muchos esfuerzos para proporcionar sistemas basados en plantas para la producción recombinante de metabolitos secundarios o proteínas. Los cultivos de células vegetales, así como las plantas intactas, pueden, en principio, utilizarse para tal fin. Para lograr los cambios necesarios en el metabolismo y hacer que las células vegetales produzcan un gen recombinante o un producto del mismo, en principio se pueden utilizar dos procedimientos, a saber, por un lado, proporcionar plantas transgénicas estables o cultivos de células vegetales, o, por otro lado, proporcionar plantas o cultivos de células vegetales transfectados transitoriamente. Para la transformación, por lo general, se pueden utilizar partículas portadoras inertes (por ejemplo, micropartículas hechas de oro, "pistola de genes"), bacterias (en particular, cepas de Agrobacterium tumefaciens), virus (por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco, TMV) o una combinación de estos dos últimos ("magnifección", WO 2002088369 A1).

En general, la transformación transitoria es ventajosa cuando no se requiere una transformación estable y cuando los resultados deben obtenerse rápidamente, ya que no se requiere la selección de células transgénicas ni su cultivo bajo presión selectiva. Esto se aplica aún más a las plantas intactas.

Con el fin de proporcionar constructos óptimos para los transgenes, normalmente se realizan experimentos de preselección para probar un gran número de posibles candidatos y/o condiciones a pequeña escala. En la actualidad, es habitual realizar la preselección inyectando manualmente soluciones de transformación en el material foliar y cosechar y extraer las muestras a mano. Sin embargo, debido a las diferencias en la posición y la edad de las hojas, y también a pequeñas diferencias genotípicas o fenotípicas entre distintas plantas, puede haber fuertes variaciones dentro de un grupo de réplicas, lo que reduce el valor de tales experimentos en términos de transferibilidad y escalabilidad. Además, con un número cada vez mayor de constructos que hay que probar, la carga de trabajo, y por tanto el tiempo y los costes, aumentan drásticamente.

Los paquetes de células vegetales (PCP) ofrecen la posibilidad de realizar experimentos de preselección en cultivos de células vegetales (EP 2623603 A1), con la ventaja de proporcionar una población homogénea de células vegetales, que puede obtenerse, por ejemplo, en cultivo por lotes como se enseña en el documento EP 3136841 A1. Además, en los experimentos con PCP, los parámetros ambientales como la temperatura, el suministro de nutrientes y similares pueden controlarse más fácilmente que en las plantas intactas.

Además de los PCP, también se han propuesto sistemas de expresión libres de células, incluyendo sistemas que contienen microvesículas del retículo endoplásmico y, en consecuencia, que proporcionan la modificación postraduccional de proteínas (cg. p. ej. WO 2015165583 A l y Buntru et al. (2014), BMC Biotechnol. 14:37.

A pesar de los avances mencionados en los sistemas de preselección, sigue siendo necesario mejorar los medios y procedimientos para llevar a cabo dichas comprobaciones debido a la cantidad de pasos manuales que consumen tiempo y dinero. Es por tanto un objetivo de la presente invención proporcionar medios y procedimientos para cumplir con las necesidades mencionadas, evitando al menos en parte las desventajas del arte previo.

El problema mencionado se resuelve mediante los procedimientos y medios aquí descritos. Las realizaciones preferidas, que pueden llevarse a cabo de forma aislada o en cualquier combinación arbitraria, se enumeran en las reivindicaciones dependientes y se describen en esta memoria descriptiva.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimiento de transformación de células vegetales cultivadas que comprende

a) proporcionar un paquete de células vegetales (PCP) de células vegetales cultivadas para ser transformadas,

b) Poner en contacto dicho PCP con un líquido que contenga un agente transformante durante un periodo de incubación,

c) eliminar dicho líquido que contiene un agente transformador; y, de este modo,

d) transformar dichas células vegetales cultivadas,

en el que el líquido que contiene el agente transformante se aplica al PCP en la etapa b) mediante un equipo automatizado, preferentemente a una tasa de 50 pl/s como máximo, y en el que el PCP obtenida en la etapa a) y el líquido que contiene el agente transformante extraído en la etapa c) se centrifugan a una velocidad comprendida entre 500 x g y 3500 * g

Tal como se utilizan en lo sucesivo, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se utilizan de forma no exclusiva. Por lo tanto, estos términos pueden referirse tanto a una situación en la que, además de la característica introducida por estos términos, no hay ninguna otra característica presente en la entidad descrita en este contexto, como a una situación en la que hay una o más características adicionales presentes. A modo de ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" pueden referirse tanto a una situación en la que, además de B, ningún otro elemento está presente en A (es decir, una situación en la que A consiste única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, uno o más elementos adicionales están presentes en la entidad A, como el elemento C, los elementos C y D o incluso otros elementos.

Además, como se utiliza en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "muy preferentemente", "particularmente", "más particularmente", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se utilizan junto con características opcionales, sin restringir otras posibilidades. Así pues, las características introducidas por estos términos son características opcionales y no pretenden restringir en modo alguno el alcance de las reivindicaciones. La invención puede, como reconocerá el experto, llevarse a cabo utilizando características alternativas. Del mismo modo, las características introducidas por "en una realización de la invención" o expresiones similares pretenden ser características opcionales, sin ninguna restricción con respecto a otras realizaciones de la invención, sin ninguna restricción con respecto al alcance de la invención y sin ninguna restricción con respecto a la posibilidad de combinar las características introducidas de tal manera con otras características opcionales o no opcionales de la invención. Además, si no se indica lo contrario, el término "aproximadamente" se refiere al valor indicado con la precisión técnica comúnmente aceptada en el campo pertinente, preferentemente se refiere al valor indicado ± 20%, más preferentemente ± 10%, más preferentemente ± 5%.

El procedimiento de la presente invención, preferentemente, es un procedimientoin vitro. Además, puede comprender otras etapas además de las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, otros pasos pueden referirse, por ejemplo, al cultivo de células vegetales en condiciones específicas para el paso a), o a la lisis de las células vegetales en el paquete de células vegetales después del paso d). Además, una o varias de dichas etapas pueden realizarse mediante equipos automatizados, tal como se especifica a continuación. Preferentemente, al menos una, más preferentemente al menos dos, incluso más preferentemente las tres etapas a) a c) se realizan mediante equipos automatizados. Lo más preferible es que todas las etapas se realicen mediante equipos automatizados, incluyendo preferentemente las etapas de suministro del líquido que comprende un agente transformador.

Preferentemente, en el procedimiento de la presente invención, los medios y el equipo se esterilizan, sin embargo, más preferentemente, no se toman precauciones especiales para la esterilidad durante la manipulación de la muestra. Así pues, preferentemente, las etapas del procedimiento pueden realizarse en condiciones que garanticen la esterilidad, por ejemplo, en dispositivos de flujo laminar; sin embargo, es preferible utilizar medios y equipos esterilizados como únicas precauciones de esterilidad.

El término "célula vegetal" es conocido por el experto para referirse a cualquier célula de un miembro del reino plantae dentro del dominio eukaryota. Preferentemente, la célula vegetal es una célula de una planta que pertenece a la superfamilia Viridiplantae, preferentemente Tracheophyta, más preferentemente Spermatophytina, más preferentemente plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluidas leguminosas forrajeras o forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimentarios, árboles o arbustos. Preferentemente, la célula vegetal es una célula de una planta seleccionada de la lista que consiste en Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp, Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. (canola, colza, nabina), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp, Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp, Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp, Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp, Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp, Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp, Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp, Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp, Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp, Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp, Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, y Zizania palustris, Ziziphus spp. Más preferentemente, la célula vegetal es una célula de tabaco (Nicotiana tabacum), una célula de zanahoria (Daucus carota) o una célula de trigo (Tricium aestivum). La célula vegetal puede ser una célula procedente o derivada de una planta entera, una parte de una planta, un órgano de una planta o un tejido vegetal. Así, el término incluye, preferentemente, células de y células derivadas de semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos) y flores.

El término "célula vegetal cultivada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula vegetal mantenida como célula única o como agregado celular en un medio de cultivo, incluidos los protoplastos. Preferentemente, la célula vegetal cultivada es una célula vegetal mantenida en cultivo en suspensión. Los procedimientos y medios de cultivo para inducir la formación de callos e iniciar el cultivo en suspensión de células vegetales son conocidos en la técnica. Un medio preferido para el cultivo de células en suspensión es el medio Murashige & Skoog (Murashige & Skoog (1962), Physiologia Plantarum. 3). 473). Preferentemente, al menos una semana, más preferentemente al menos dos semanas, antes de aplicar el procedimiento de transformación aquí descrito, las células se mantienen en cultivo en suspensión discontinuo, más preferentemente en cultivo en suspensión continuo. Los procedimientos preferidos para el cultivo de células vegetales se describen, por ejemplo, en WO 2015/165583 A1. En una realización preferida, las células vegetales se cultivan hasta alcanzar el estado de célula única antes de la transformación. Preferentemente, las células vegetales cultivadas crecen hasta una densidad de masa húmeda de 25 g/l a 200 g/l, preferentemente de 75 g/l a 100 g/l antes de la transformación. El término "densidad de masa húmeda" lo entiende el experto; preferentemente, el término se refiere a la masa de células por volumen de cultivo, determinada centrifugando y pesando la masa de células comprendidas en un volumen definido de medio de cultivo. Preferentemente, las células vegetales cultivadas se concentran hasta una densidad de masa húmeda de 300 g/l como máximo, preferentemente de 200 g/l como máximo, antes de convertirlas en un paquete de células vegetales, preferentemente por filtración al vacío o centrifugación, más preferentemente por sedimentación. Preferentemente, las células vegetales cultivadas se mantienen en un medio que comprende de 10 g/l a 50 g/l de sacarosa, preferentemente de 15 g/l a 35 g/l de sacarosa, más preferentemente aproximadamente 20 g/l de sacarosa, preferentemente durante al menos una semana, más preferentemente al menos dos semanas, antes de aplicar el procedimiento de transformación aquí descrito. También preferentemente, las células vegetales cultivadas se mantienen en un medio que comprende de 1 mM a 10 mM de iones fosfato, preferentemente de 2 mM a 5 mM de iones fosfato, más preferentemente alrededor de 2,7 mM de iones fosfato, preferentemente durante al menos una semana, más preferentemente al menos dos semanas, antes de aplicar el procedimiento de transformación descrito en el presente documento. Preferentemente, para dispensar células vegetales cultivadas para generar un PCP, el medio que contiene las células vegetales se agita, preferentemente por agitación o por agitación, más preferentemente por agitación, más preferentemente por agitación con un agitador magnético.

El término "paquete de células vegetales" (o "PCP") es conocido por el experto, por ejemplo de EP 2623603 A1para referirse a un paquete compactado de células vegetales, por ejemplo, un gránulo de células vegetales. La PCP se obtiene centrifugando las células cultivadas a una tasa de 500 g a 3500 g, preferentemente de 1500 g a 2000 g, en la que dicha centrifugación se realiza durante al menos 15 s, preferentemente al menos 30 s. Más preferentemente, dicha centrifugación se realiza durante 15 s a 10 min, preferentemente de 30 s a 1 min. Preferentemente, tras el centrifugado, se elimina el sobrenadante. Más preferentemente, el PCP se obtiene centrifugando células vegetales cultivadas sobre un soporte poroso; preferentemente, el soporte poroso comprende o es un filtro, más preferentemente, el soporte poroso es una placa filtrante, más preferentemente una placa filtrante multipocillos. Las placas filtrantes multipocillo son, en principio, conocidas por el experto y están disponibles comercialmente en diversos formatos. Preferentemente, el soporte poroso tiene poros con un diámetro medio de 1 pm a 200 pm, preferentemente de 30 pm a 40 pm. Preferentemente, el PCP es un paquete compactado de células vegetales, más preferentemente con una densidad de masa de 0,1 g/cm3 a 0,9 g/cm3, más preferentemente de 0,4 g/cm3 a 0,6 g/cm3. Preferentemente, la generación de el PCP está totalmente automatizada, es decir, preferentemente, los pasos de pipetear un volumen apropiado de células vegetales cultivadas, preferentemente que tengan una densidad de masa húmeda preajustada, en un recipiente apropiado, preferentemente una placa de filtro multipocillo, y la centrifugación de la placa de filtro multipocillo se realizan mediante un equipo automatizado, preferentemente sin ninguna interacción por parte del usuario. Preferentemente, el PCP se suministra en una placa multipocillos (multicluster) que, preferentemente, aloja como máximo 0,5 ml de líquido por pocillo, preferentemente como máximo 0,25 ml por pocillo.

Preferentemente, para proporcionar un paquete de células vegetales, se centrifuga una cantidad adecuada de masa celular sobre un soporte poroso, preferentemente un filtro. El término "cantidad adecuada de masa celular" es entendido por el experto y dependerá esencialmente de la masa de células requerida para los pasos posteriores y del espacio proporcionado por el recipiente seleccionado para el mantenimiento de el PCP Así, por ejemplo, para un solo pocillo de una placa de 96 pocillos, puede utilizarse preferentemente una masa celular de 50 mg a 100 mg, más preferentemente de aproximadamente 65 mg. Preferentemente, al proporcionar un PCP, se incluye un medio de solidificación. El término "medios de solidificación", tal como se utiliza en el presente documento, incluye todos los medios adecuados para mejorar la estabilidad general de un PCP. Así, el medio de solidificación puede ser un medio de solidificación flexible o un medio de solidificación no flexible. Un medio de solidificación flexible es preferentemente un medio que impide que los agregados celulares del PCP se desacoplen incorporándose a la estructura del PCP; así, preferentemente, el medio de solidificación flexible es un compuesto fibroso, más preferentemente es un compuesto fibroso que comprende o consiste en fibras de celulosa. Un medio de solidificación no flexible es preferentemente un medio que impide que los agregados celulares de el PCP se desacoplen proporcionando un andamiaje para la estructura de el PCP. Así, preferentemente, el medio de solidificación no flexible es un compuesto rígido o semirrígido que proporciona soporte externo y/o interno al PCP; en consecuencia, el medio de solidificación no flexible puede añadirse a un soporte poroso antes de aplicar las células cultivadas, o puede formar parte del soporte poroso.

Para mayor claridad, el término "cultivo de células vegetales" se utiliza en el presente documento para un cultivo de células vegetales en cultivo en suspensión típico para células vegetales o que se proporcionan como protoplastos, mientras que el término "paquete de células vegetales" se utiliza para el paquete condensado de células vegetales proporcionado como se describe. Como comprenderá el experto, tanto un cultivo de células vegetales como un PCP contendrán células vegetales cultivadas, y la diferencia entre un cultivo de células vegetales y un PCP radica, preferentemente, en el volumen de líquido extracelular libre restante (es decir, preferentemente, medio de crecimiento), que es bajo en un PCP, de modo que las células y los agregados celulares en un PCP están esencialmente fijos en sus posiciones relativas. Como se apreciará, el contacto de dicho PCP con un líquido que comprende un agente transformante comprende la aplicación de un volumen de dicho líquido tan bajo como para no distorsionar la estructura del PCP. Así, preferentemente, el procedimiento de la presente invención comprende mantener las células vegetales cultivadas como PCP durante todo el proceso de transformación.

El término "transformación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la introducción de un polinucleótido, preferentemente heterólogo, en una célula vegetal. El polinucleótido introducido puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula vegetal y/o en un plástido y/o en una mitocondria de la misma. Opcionalmente, el polinucleótido puede comprender un ARN guía que desencadena la acción específica de un complejo proteico CRISPR/Cas. Preferentemente, el polinucleótido introducido no está integrado de forma estable, por lo que, preferentemente, la transformación es una transformación transitoria. Más preferentemente, la transformación es una transformación nuclear transitoria.

El término "polinucleótido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico lineal o circular. El polinucleótido de la presente invención se proporcionará, preferentemente, como polinucleótido aislado (es decir, aislado de su contexto natural), en forma modificada genéticamente, o comprendido en un vector como se especifica a continuación. El término abarca el ADN y el ARN, preferentemente el polinucleótido es ADN; también, el término comprende polinucleótidos de cadena simple así como de cadena doble. Además, también se incluyen polinucleótidos modificados químicamente, incluidos polinucleótidos modificados de forma natural, como polinucleótidos glicosilados o metilados, o derivados modificados artificialmente, como polinucleótidos biotinilados. Preferentemente, el polinucleótido es un polinucleótido heterólogo, es decir, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en la célula vegetal transformada. Más preferentemente, el polinucleótido codifica un gen de interés, por ejemplo, una secuencia expresable que codifica un polipéptido de interés.

El polinucleótido de la presente invención puede estar comprendido en un vector. El término "vector" engloba preferentemente los vectores plasmídicos y víricos, así como los cromosomas artificiales, como los cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Además, el término también se refiere a los constructos dirigidos que permiten la integración aleatoria o dirigida edl constructo dirigido en el ADN genómico, plastidial y/o mitocondrial. Dichos constructos diana, preferentemente, comprenden ADN de longitud suficiente para la recombinación homóloga o heteróloga. El vector que engloba el polinucleótido de la presente invención, preferentemente, comprende además marcadores seleccionables para la propagación y/o selección en una célula bacteriana y/o vegetal.

Más preferentemente, en el vector de la invención el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en una célula vegetal o fracciones aisladas de la misma. Así, preferentemente, el vector es un vector de expresión, más preferentemente un vector de expresión transitoria. La expresión de un polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferentemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferentemente vegetales, son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y la traducción y, opcionalmente, señales poli-A que aseguran la terminación de la traducción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y translacionales. Además, pueden utilizarse secuencias de control de expresión inducibles en un vector de expresión comprendido en la presente invención. Dichos vectores inducibles pueden comprender secuencias operadoras tet (tetraciclina) o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Las secuencias de control de expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. También se describen vectores preferidos en WO 2002/088369 A1 y las referencias allí citadas.

El término "ooner en contacto", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proximidad o mezcla de dos compuestos para permitir que interactúen.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente transformante" se refiere a cualquier compuesto o mezcla de compuestos adecuados para causar la transformación de una célula, preferentemente una célula vegetal. Los agentes transformadores para la transformación de células vegetales son, en principio, conocidos en la técnica. El experto también es consciente de que la idoneidad de un agente transformante específico puede depender de la especie, el tipo y el estado de una célula vegetal que se vaya a transformar, así como de otros factores. Así, en el caso de que la célula vegetal cultivada sea un protoplasto, el agente transformante, preferentemente, es un polinucleótido aislado o un vector como los especificados anteriormente, preferentemente mezclado con un compuesto químico que potencie la transformación, por ejemplo, la polietilenimina. Las células vegetales cultivadas, preferentemente, se transforman mediante un vector viral y/o bacteriano, por un procedimiento de pistola génica, o similar. Preferentemente, el agente transformante es un virus vegetal, más preferentemente un virus vegetal recombinante que infecta la célula vegetal que se va a transformar, más preferentemente es un miembro recombinante de una de las familias de virus Virgaviridae, Potyviridae y Geminiviridae, más preferentemente es el virus del mosaico del tabaco, el virus del grabado del tabaco o el virus de las estrías del maíz. Más preferentemente, el agente transformante es una bacteria, preferentemente recombinante, preferentemente de la familia Rhizobiaceae, más preferentemente del género Agrobacterium, aún más preferentemente es Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, o Rhizobium radiobacter, más preferentemente es Agrobacterium tumefaciens. Preferentemente, el Agrobacterium tumefaciens es Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101, más preferentemente Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 que comprende el plásmido pMP90RK (Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90RK). Como comprenderá el experto, pueden utilizarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para construir agentes transformadores recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y (1994).

El término "líquido que comprende un agente transformador", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier líquido compatible con la aplicación a un PCP y con el agente transformador, que comprende el agente transformador tal como se especifica a continuación. Preferentemente, el líquido es un líquido acuoso, más preferentemente es agua, aún más preferentemente es un tampón. En caso de que el agente transformador sea una bacteria, por ejemplo una Agrobacterium, preferentemente, el líquido es un tampón acuoso, más preferentemente es un tampón que comprende sacarosa, glucosa, minerales esenciales y/o acetosiringona, más preferentemente es un tampón que comprende sacarosa a una concentración de aproximadamente 50 g/l, glucosa a una concentración de aproximadamente 2 g/l, fertilizante vegetal estándar (por ejemplo, Ferty 2 MEGA (Planta Düngemittel GmbH) y acetosiringona a una concentración de aproximadamente 200 pM, y que tiene un pH de aproximadamente 0,5 pM.p. ej. Ferty 2 MEGA (Planta Düngemittel GmbH)) a una concentración de aproximadamente 0,5 g/l, y acetosiringona a una concentración de aproximadamente 200 pM y con un pH de aproximadamente 5,6. Preferentemente, el líquido que comprende el agente transformante es una solución como la especificada anteriormente que comprende bacterias recombinantes, preferentemente bacterias Agrobacterium, a una densidad óptica medida a 600 nm (OD600) de 0,1 a 1,5, preferentemente de 0,2 a 1,0, más preferentemente de 0,3 a 0,7, más preferentemente de aproximadamente 0,5.

En una realización preferida, el procedimiento para la transformación de células vegetales cultivadas comprende un paso o varios pasos de generación automatizada de un líquido que comprende un agente transformante. Así, preferentemente, la etapa de ajuste de la densidad del agente transformante, en particular el ajuste de la densidad de las bacterias transformantes, se realiza mediante un equipo automatizado. Más preferentemente, además, los pasos precedentes de recolección de bacterias transformantes, resuspensión de las mismas y determinación de la densidad también se realizan mediante equipos automatizados. Preferentemente, en tal caso, las bacterias se cultivan en una placa multipocillos (multicluster) que tenga el mismo número de pocillos que la placa utilizada para generar los PCP. Además, preferentemente, dichas bacterias se peletizan después del crecimiento mediante centrifugación a una tasa de 1000 x g a 3000 x g, preferentemente de 1300 x g a 2300 x g, más preferentemente a aproximadamente 1800 x g. En una realización preferida, dichas bacterias se separan después del crecimiento mediante centrifugación a una tasa de 500 x g a 4000 x g, preferentemente de 1300 x g a 3000 x g, más preferentemente a aproximadamente 2400 x g. Además, preferentemente, dichas bacterias se resuspenden añadiendo una cantidad adecuada de tampón y rotando la placa de múltiples pocillos (multiclúster) durante al menos 5 minutos. También, preferentemente, la densidad de dichas bacterias resuspendidas, preferentemente, se determina mediante un lector de placas automatizado y las diluciones potencialmente necesarias se calculan y aplican automáticamente. Aún más preferentemente, la etapa precedente de cultivo de dichas bacterias transformantes también se realiza mediante equipos automatizados. Así, en el caso de que el agente transformante sea una bacteria, lo más preferible es que el líquido que contiene el agente transformante se suministre mediante un procedimiento automatizado, preferentemente un procedimiento totalmente automatizado que comprenda todas las etapas a partir del cultivo de dicha bacteria. Las condiciones preferidas para preparar una solución que contenga bacterias Agrobacterium como agente transformante en un formato de 96 pocillos se describen en los Ejemplos.

De acuerdo con la presente invención, el líquido que comprende el agente transformador se aplica al PCP en el paso b) mediante un equipo automatizado. Preferentemente, el líquido que contiene el agente transformador se aplica al PCP mediante un dispensador automático, preferentemente con una tasa de dispensación ajustable. Preferentemente, la tasa de aplicación del líquido que contiene el agente transformante sobre el PCP es como máximo de 50 pl/s, preferentemente si se utiliza un dispensador de apertura única. Más preferentemente, la mencionada tasa de dispensación es de 1 |jl/s a 50 |jl/s, incluso más preferentemente es de 10 |jl/s a 50 |jl/s. Preferentemente, el equipo automatizado utilizado para la dispensación de acuerdo con la presente invención está equipado con puntas de pipeta estériles. Preferentemente, en la etapa de aplicación del líquido que contiene el agente transformador al PCP, la salida del equipo automatizado se acerca al PCP. Preferentemente, por "proximidad" en el contexto mencionado se entiende una distancia inferior al diámetro de una gota media de líquido que contiene el agente de transformación que se forma en la salida del equipo automatizado. Así, preferentemente, en la etapa de aplicación del líquido que comprende el agente transformante al PCP, la distancia entre la superficie de el PCP y la salida del dispensador es inferior a 5 mm, preferentemente inferior a 4 mm. Más preferentemente, en la etapa de aplicación del líquido que comprende el agente transformante al PCP, la distancia entre la superficie del PCP y la salida del dispensador es de 0,5 mm a 5 mm, aún más preferentemente de 1 mm a 4 mm. Preferentemente, de 0,5 ml a 2 ml de líquido que comprende el agente transformante se aplican por g de PCP, preferentemente en el que de 1 ml a 2 ml de líquido que comprende el agente transformante se aplican por g de PCP, más preferentemente en el que alrededor de 1,5 ml de líquido que comprende el agente transformante se aplican por g de PCP Preferentemente, la masa de pentaclorofenol se calcula a partir de la densidad de masa húmeda del cultivo y del volumen de éste utilizado.

El término "período de incubación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al tiempo transcurrido entre la aplicación del líquido que contiene el agente transformador y la eliminación de dicho líquido. Sin querer estar limitado por la teoría, se considera que el periodo de incubación es el tiempo necesario para que al menos parte del agente transformante entre en contacto con las células vegetales de forma que no se eluya al retirar el líquido que contiene el agente transformante. Por lo tanto, el período de incubación puede ser corto y, preferentemente es de 10 min a 3 h, preferentemente de 30 min a 60 min, en una realización preferida de 20 min a 60 min.

La expresión "eliminar un líquido que contiene un agente transformador" es comprensible para el experto. Preferentemente, dicha eliminación consiste en retirar el líquido que contiene el agente transformante, sin tomar ninguna medida para eliminar el agente transformante. Así, la eliminación de dicho líquido que comprende un agente transformante comprende centrifugar el PCP a de 500 x g a 3500 x g, preferentemente de 1500 x g a 2000 x g, preferentemente sobre un soporte poroso, más preferentemente sobre el mismo soporte poroso utilizado para generar el PCP Preferentemente, dicha centrifugación se realiza durante al menos 15s, preferentemente al menos 30s; más preferentemente, dicha centrifugación se realiza durante de 15s a 10 min, preferentemente de 30s a 1 min.

De acuerdo con el procedimiento de transformación de la presente invención, el PCP es, después de la eliminación de la solución que comprende un agente transformante, preferentemente, incubada. Como, preferentemente, también las etapas precedentes, dicha incubación se realiza preferentemente a la temperatura óptima de crecimiento de las células vegetales cultivadas. Así, la temperatura, preferentemente es de 20 °C a 35 °C, más preferentemente es de 25 °C a 30 °C, más preferentemente es de aproximadamente 26 °C. Preferentemente, la atmósfera en la que se incuba el PCP es aire ambiente, preferentemente, con una humedad relativa del 50% al 100%, preferentemente al menos del 50%, más preferentemente al menos del 70%, aún más preferentemente al menos del 80%, lo más preferentemente al menos del 90%. Como comprenderá el experto, la incubación se realiza para permitir que se produzca la transformación y, opcionalmente, la expresión génica. En consecuencia, la incubación de PCP es de al menos 12 h, preferentemente al menos un día, más preferentemente al menos dos días, aún más preferentemente al menos cinco días, en una realización más preferida al menos tres días; o la incubación es de 12 h a 3 semanas, preferentemente de 3 días a 2 semanas, más preferentemente de 4 días a 8 días, más preferentemente 5 o 6 días. En una realización preferida, la incubación de PCP es de 12 h a 3 semanas, preferentemente de 2 días a 2 semanas, más preferentemente de 3 días a 8 días, más preferentemente 4 o 5 días. Preferentemente, los PCP se incuban en una placa filtrante como se ha especificado anteriormente, más preferentemente boca abajo, es decir, con las aberturas orientadas hacia el suelo. Lo más preferible es incubar los PCP en placas de filtro de forma invertida con las aberturas apuntando a un depósito de agua.

Opcionalmente, el procedimiento para transformar una célula vegetal cultivada comprende los pasos adicionales de lisar dichas células vegetales cultivadas, preferentemente lisando dichas células vegetales mediante un tampón de lisis. Preferentemente, el tampón de lisis comprende un detergente, preferentemente un detergente aniónico, más preferentemente dodecilsulfato sódico, y/o un agente quelante de cationes divalentes de magnesio (Mg2+). Más preferentemente, el tampón de lisis comprende dodecilsulfato sódico en una concentración de 0,1% (p/v) a 10% (p/v), preferentemente 1% (p/v), y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en una concentración de 1 mM a 200 mM, preferentemente aproximadamente 50 mM. En una realización preferida, el tampón de lisis comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) a una concentración de 10 mM a 200 mM, preferentemente aproximadamente 100 mM a un valor de pH de 8,0 a 10,0, preferentemente aproximadamente 9,0. Típicamente se ponen en contacto de 1 a 6 ml de dicho tampón de lisis por gramo de biomasa de PCP, preferentemente de 2 a 4 ml de dicho tampón de lisis por gramo de biomasa de PCP Preferentemente, la adición de dicho tampón de lisis tiene lugar en el mismo soporte poroso utilizado para la generación de el PCP Más preferentemente, la adición se realiza de forma automatizada. Preferentemente, la acción del tampón de lisis se potencia incubando el PCP junto con el tampón de lisis a temperaturas elevadas de 22 a 100°C, más preferentemente de 10 a 60 min, preferentemente en un agitador con una velocidad de 200 a 2000 rpm, más preferentemente de 1000 rpm. Más preferentemente, se añade un aceite mineral para evitar la evaporación del agua a temperatura elevada; el volumen de aceite mineral, preferentemente es de 50 a 200 jiL, más preferentemente de 60 a 80 jiL. Después de la lisis de las células vegetales que constituyen el PCP, se eliminan los restos celulares, preferentemente, mediante centrifugación de 200 x g a 2000 x g, más preferentemente de aproximadamente 1000 x g, utilizando preferentemente el mismo soporte poroso utilizado durante la generación del PCP En una realización preferida, los restos celulares se eliminan mediante centrifugación de 500 x g a 4000 x g, más preferentemente alrededor de 1000 x g, utilizando preferentemente el mismo soporte poroso utilizado durante la generación de el PCP Preferentemente, en tal caso, el lisado celular libre de restos se recoge en una placa multipared que contiene el mismo número de cavidades que la placa multipared que contiene el soporte poroso, en cuyo caso la placa utilizada para recoger el lisado celular libre de restos se ha colocado debajo de la placa con el soporte poroso antes de la centrifugación. Preferentemente una, más preferentemente todas las etapas se realizan utilizando equipos automatizados.

El término "equipo automatizado" lo entiende el experto. Preferentemente, el término se refiere a cualquier dispositivo o combinación de dispositivos que realicen el paso o pasos indicados de forma que, una vez establecidos, no requieran la interacción con un operador humano. Así, una vez establecido, un procedimiento puede, en principio, ser ejecutado por un equipo automatizado cualquier número de veces sin necesidad de interacción de control. Un equipo automatizado adecuado es conocido por los expertos y está disponible comercialmente, por ejemplo, el equipo descrito en los Ejemplos.

Ventajosa y sorprendentemente, se descubrió en el trabajo subyacente a la presente invención que la aplicación de la solución de transformación a un PCP mediante un equipo automatizado posibilita tasas de transformación más consistentes. Como se muestra en los Ejemplos a continuación, la variación de pozo a pozo en el procedimiento de acuerdo con la presente invención es muy pequeña. Dado que el procedimiento puede realizarse en formato miniaturizado (por ejemplo, 96 pocillos), es muy adecuado para aplicaciones de alto rendimiento. Preferentemente, y también ventajosamente, se encontró además que la eliminación de líquidos de el PCP por centrifugación proporciona una mayor transformación global y una menor variación en la eficiencia de transformación en comparación con la eliminación de líquidos por vacío. Además, se observó que la eliminación de líquidos de el PCP mediante centrifugación permitía concentraciones más elevadas de sacarosa en el líquido que contenía un agente transformador.

Las definiciones anteriores se aplican mutatis mutandis a lo siguiente. Las definiciones y explicaciones adicionales que se dan más adelante también se aplican a todas las realizaciones descritas en esta memoria descriptiva mutatis mutandis.

También se describe, pero no se reivindica, una célula vegetal transformada obtenida u obtenible por el procedimiento según el procedimiento para la transformación de células vegetales cultivadas de acuerdo con la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula vegetal transformada" se refiere a una célula vegetal que comprende al menos un polinucleótido heterólogo. Así, una célula vegetal transformada obtenida u obtenible por el procedimiento según el procedimiento para la transformación de células vegetales cultivadas de acuerdo con la presente invención es una célula vegetal que comprende al menos un polinucleótido heterólogo, habiendo sido introducido dicho polinucleótido heterólogo en dicha célula vegetal por el mencionado procedimiento de la presente invención. Puesto que la transformación puede ser una transformación estable, y puesto que una planta puede regenerarse a partir de la citada célula transformada, la presente invención también se refiere a una planta o parte de planta que comprende al menos una de las citadas células vegetales transformadas.

También se describe, pero no se reivindica, el uso de una célula vegetal transformada obtenida u obtenible de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la presente invención para el cribado de alto rendimiento.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para proporcionar un lisado de una célula vegetal transformada que comprende

a) proporcionar un PCP obtenido según el procedimiento para la transformación de células vegetales cultivadas de acuerdo con la presente invención, y las etapas adicionales de

b) incubar el PCP en condiciones adecuadas para que se produzca la transformación,

c) lisar las células vegetales contenidas en el PCP y, de este modo

d) proporcionar un lisado de una célula vegetal transformada.

El procedimiento para proporcionar un lisado de la presente invención, preferentemente, es un procedimientoin vitro.

Además, puede comprender pasos además de los anteriores mencionadas explícitamente. Por ejemplo, otros pasos pueden referirse, por ejemplo, al cultivo de células vegetales antes del paso a), o a la extracción y/o análisis de constituyentes celulares después del paso d). Además, una o más, preferentemente todas, de dichos pasos pueden ser realizados por equipos automatizados.

El término "lisado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier extracto que comprenda constituyentes celulares de una célula vegetal transformada y, preferentemente, que no contenga células vegetales intactas o que contenga un número reducido de ellas. Preferentemente, el número de células vegetales intactas es inferior a 1000/ml, más preferentemente inferior a 100/ml. Como se comprenderá, la eficacia de transformación del procedimiento de transformación de la presente invención será típicamente inferior al 100%, pero, preferentemente, será superior al 80%, por lo que el lisado será una mezcla de constituyentes celulares de células transformadas y no transformadas. Los procedimientos preferidos para incubar el PCP y para lisar las células vegetales se han tratado anteriormente.

Además, la presente invención se refiere a un lisado de células vegetales obtenible por el procedimiento para proporcionar un lisado de la presente invención.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para provocar la transcripción y, opcionalmente, la traducción de al menos una secuencia de ácido nucleico in vitro en un sistema libre de células, que comprende

a) proporcionar un extracto libre de células que comprenda constituyentes celulares necesarios para la transcripción y/o traducción de un polinucleótido

b) poner en contacto el extracto libre de células de la etapa a) con un polinucleótido que comprenda una secuencia de ácido nucleico expresable, y, de ese modo

c) provocar la transcripción y, opcionalmente, la traducción de dicha secuencia de ácido nucleico.

El procedimiento para provocar la transcripción de la presente invención, preferentemente, es un método in vitro.. Además, puede comprender otras etapas además de las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, otros pasos pueden referirse, por ejemplo, al cultivo de células vegetales antes del paso a), o a la extracción y/o análisis de productos de expresión génica después del paso c). Asimismo, el procedimiento puede comprender el ajuste de la concentración del polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico expresable a un valor objetivo predeterminado antes del paso b). Además, una o más, preferentemente todas, de dichos pasos pueden ser realizados por equipos automatizados.

El término "extracto libre de células", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un extracto que comprende en una forma funcional todos los componentes necesarios para que se produzca la transcripción y, opcionalmente, la traducción. En el presente documento, el término "libre de células" no se utiliza en un sentido absoluto, sino relativo. Preferentemente, se considera libre de células un extracto que no contenga células vegetales intactas o que contenga un número reducido de ellas. Así, preferentemente, un extracto está libre de células si el número de células vegetales intactas es inferior a 1000/ml, más preferentemente inferior a 100/ml. Se han descrito medios para proporcionar extractos libres de células adecuados, por ejemplo, en WO 2015/165583 A1.

Preferentemente, en el procedimiento para provocar la transcripción, el extracto libre de células se dispensa en los pocillos de una placa multiclúster de forma totalmente automatizada mediante un equipo automatizado. También preferentemente, algunos, más preferentemente todos, los pasos de pipeteado adicionales están totalmente automatizados. Preferentemente, la determinación de la concentración del polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico expresable y el ajuste de la concentración a un valor objetivo también se realizan mediante equipos automatizados, en particular en caso de que el procedimiento se realice en un formato de placa multipocillo (multiclúster). Preferentemente, el procedimiento comprende además poner en contacto dicho extracto libre de células con una ARN polimerasa heteróloga, preferentemente ARN polimerasa T7; y/o comprende poner en contacto dicho extracto libre de células con un polinucleótido que comprende un gen expresable que codifica una ARN polimerasa heteróloga, preferentemente ARN polimerasa T7. También preferentemente, el extracto libre de células se obtuvo a partir de células vegetales obtenidas según el procedimiento para transformar células vegetales de acuerdo con la presente invención o en el que dicho extracto libre de células es un lisado de una célula vegetal transgénica de acuerdo con la presente invención.

Leyendas de las Figuras

Fig. 1: A) Fluorescencia de extractos de células vegetales obtenidos como se describe en los Ejemplos utilizando 50 g L-1 de sacarosa en tampón de infiltración a partir de células transformadas con plásmidos que codifican constructos DsRed-Fusion dirigidos a los compartimentos celulares indicados. B) Cuantificación de la fluorescencia de los extractos mostrados en A); la fluorescencia se midió para cada pocillo y se promediaron los valores medidos para los pocillos correspondientes; se indica el coeficiente de variación (CV); eje y: fluorescencia DsRed media en unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU).

Fig. 2: Cuantificación de la fluorescencia de células y extractos preparados según el Ejemplo 7 utilizando 50 g L-1 de sacarosa en tampón de infiltración. A) fluorescencia en fluorescencia promedio de la superficie; B) fluorescencia promedio del extracto; se indica el coeficiente de variación (CV); eje y: fluorescencia promedio DsRed en unidades arbitrarias de fluorescencia (UFA).

Fig. 3: Comparación del patrón de fluorescencia DsRed en los PCP Nicotiana tabacum BY-2 generadas por vacío o centrifugación según el Ejemplo 7 utilizando 50 g L-1 de sacarosa en tampón de infiltración. El DsRed en las secciones de PCP (área sombreada) se visualizó mediante microscopía de fluorescencia (530Ex/590Em).

Fig. 4: Influencia de la concentración de sacarosa en el tampón de infiltración sobre la expresión de DsRed en los PCP generados por vacío y centrifugación según el Ejemplo 7. A. Fluorescencia superficial de los PCP cuatro días después de la infiltración (559Ex/585Em, x ± SD, n=16). B. Mapa de expresión de DsRed en PCPs generado por vacío cuatro días después de la infiltración, sombreado=expresión, gris=sin expresión. C. Mapa de expresión de DsRed en PCPs generados por centrifugación cuatro días después de la infiltración.

Los siguientes Ejemplos se limitarán a ilustrar la invención. No deben interpretarse, en modo alguno, como una limitación del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Dispositivos y control

Todos los pasos de pipeteado y los movimientos de las placas fueron realizados por la estación automatizada de pipeteado JANUS g 3 (PerkinElmer). En función del volumen a transferir, se seleccionaron las puntas de un solo uso y los parámetros de pipeteado adecuados. El software WinPREP de JANUS (versión 5.1) se encargó del control y el intercambio de datos entre los dispositivos periféricos. Los cálculos de volumen se realizaron mediante guiones proporcionados por el usuario.

Ejemplo 2: Preparación de Agrobacterium tumefaciens para la infiltración de PCP

Células Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK), portadoras de uno de los vectores de expresión vegetal pTRAc-rfp-H, pTRAc-rfp-ERH, pTRAc-rfp-AH o pTRAc-TPrfp-H, todos ellos basados en pTRA(Sacket al. (2015), Plant Biotechnol. 13. 1094). se cultivaron a 28°C en 500 pl por pocillo de medio PAM (peptona de soja 20 g/l; extracto de levadura 0,5 g/l; fructosa 5 g/l; sulfato de magnesio (MgSO4) 1 g/l, pH 7,0; con carbenicilina (50 mg/l) y kanamicina (25 mg/l) añadidas) en una placa multiclúster "Deep-Well" de 96 pocillos a 1000 rpm en un agitador rotatorio integrado con una amplitud de 2 mm hasta una OD600 de 6,0. Las células bacterianas se pelletearon a 1800g durante 4 min, el sobrenadante se desechó. El precipitado se resuspendió en 200 pl de tampón de infiltración estéril (sacarosa 50 g/l; glucosa monohidrato 2 g/l; 0,5 g/l de Ferty 2 MEGA (Planta Düngemittel GmbH); 200 pM de acetosiringona; pH 5,6) a 1000 rpm y 2 mm de amplitud durante 8 min. La OD600 de una dilución 1:20 se determinó en una placa de 96 pocillos mediante un lector de placas integrado, y todas las suspensiones bacterianas de los pocillos respectivos se normalizaron a una OD600 de 0,4 en una placa de 96 pocillos nueva.

Ejemplo 3: Generación de PCP

Nicotiana tabacum BY-2 se cultivaron en cultvo continuo en medio Murashige & Skoog (sacarosa 20 g/l; sales MS (mínimas orgánicas, Fa. Duchefa) 4,3 g/l; KH2PO4 200 mg/l; mio-inositol 100 mg/l; HCl-tiamina 1 mg/l; ácido 2,4-diclorofenoxiacético 0,2 mg/l, pH 5,0) a 26°C hasta alcanzar una densidad de masa húmeda de 80 g/l. se retiraron 2 1 de cultivo, se dejaron sedimentar durante aproximadamente 45 min y se concentraron hasta una densidad de masa húmeda de 200 g/l ± 5% por decantación del medio.

Desde un depósito estéril y bajo agitación constante con un agitador magnético, se transfirieron 300 pl de cultivo concentrado por pocillo a una placa de filtro Agroprep Advance PP/PE 30-40 pm (Fa. Pall) y cubierto por una tapa. La placa se cargó en la centrifugadora integrada; el medio se eliminó por centrifugación a 1800 x g durante 1 min y se recogió recubriendo la placa de filtro con una placa de reserva.

Ejemplo 4: Infiltración de Agrobacterium

Alas PCP del Ejemplo 3, se añadieron gota a gota 90 pl de cada una de la suspensión normalizada de Agrobacterium, seguidos de incubación durante 60 min a 22°C. A continuación, la placa se volvió a cargar en la centrifugadora interna y se centrifugó a 1800 x g durante 1 min para eliminar la solución de infiltración.

Ejemplo 5: Incubación de PCP

La placa de filtro con PCP infiltrados se invirtió y se incubó sobre un depósito "Deep-Well" de 1 pocillo durante 72 h a 26°C y 80% de humedad relativa. El depósito se llenó con 150 ml de H2O y tenía un espacio abierto de 160 cm3; la conexión entre la placa filtrante y el depósito se cerró herméticamente.

Ejemplo 6: Medición de la fluorescencia de los PCP

Tras la incubación, las placas de filtro que contenían los PCP se transfirieron al lector de placas integrado y se midió directamente la fluorescencia de la proteína DsRed en los PCP (excitación: 559 nm; emisión 585 nm). A continuación, la placa filtrante se selló con una esterilla de silicona/PTFE con aberturas de tabique prefabricadas (Webseal mat M115, Fa. Thermo Scientific) y se añadieron a cada pocillo 200 pl de tampón de extracción (dodecilsulfato sódico 1 g/l; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 50 mM; pH 8,0).

Para la lisis, las placas filtrantes se mantuvieron a 800 rpm con 2 mm de amplitud durante 30 min a 65°C en un agitador rotatorio integrado. Tras la lisis, la placa de filtro se transfirió a la centrifugadora integrada y se centrifugó a 1800 x g durante 1 min, recuperándose el lisado en una placa de 96 pocillos situada debajo de la placa de filtro. Con los extractos recuperados, se realizaron mediciones de fluorescencia como se ha descrito anteriormente; los resultados se muestran en la Fig. 1.

Ejemplo 7: Comparación de los procedimientos de eliminación del medio

Las células BY-2 en cultivo continuo se concentraron a 200 g de biomasa fresca/l y se transfirieron 300 |jl de la suspensión celular en placas de filtro estériles Agroprep Advance PP/PE de 30-40 jm (Pall GmbH, Dreieich, Alemania). El exceso de medio se eliminó mediante centrifugación a 1800 rcf durante un minuto o aplicando un vacío de 800 mbar en un colector de vacío chromabond durante ~10 segundos (Macherey-Nagel, Düren, Alemania).

Las células de Agrobacterium tumefaciens, cultivadas en medio líquido PAM (Carbenicilina 50 jg/ml, Kanamicina 25 jg/ml), se resuspendieron y ajustaron a una DO600nm de 0,4 en tampón de infiltración 1x (0.5 g/l de Fertilizante MEGA2, 50 - 100 g/l de sacarosa, 2 g/l de glucosa monohidratada, 200 jM de acetosiringona) y se dejaron caer 100 j l en cada PCP, se incubaron durante 1h y después se eliminaron por centrifugación o vacío como se ha descrito anteriormente.

Las placas se invirtieron sobre 150 ml de H2O en una placa de pocillos profundos de un pocillo con bordes sellados y se incubaron a 26°C y 80% de humedad relativa (HR) durante tres días.

La fluorescencia superficial de los PCP y posteriormente la fluorescencia del extracto generado por lisis mecánica en tampón de extracción (40 mM de hidrogenofosfato disódico, 10 mM de dihidrogenofosfato sódico, 10 mM de metabisulfito sódico; 3 mL por gramo de biomasa) utilizando un molino de microesferas (MM 300, Retsch GmbH, Han, Alemania) se midieron a 559nm (Excitación) / 585nm (Emisión) con tres lecturas por centro de pocillo.

Se cortaron secciones de aproximadamente 0,5-1 mm de grosor de PCP. La localización de la expresión de DsRed en la sección de PCP se visualizó mediante microscopía de fluorescencia a 530 nm (Excitación) / 590 nm (Emisión).

Resultados: La fluorescencia superficial promediada de los PCP (n=5) mostró niveles de expresión similares de la proteína roja fluorescente (rfp) citosólica (-2700 unidades arbitrarias de fluorescencia [UFA]) y secretada (-1100 UFA) para los PCP generados por vacío o centrifugación. Sin embargo, el coeficiente de varianza (CV) de los PCP generados por vacío fue ~2 veces mayor en el caso de la rfp citosólica y ~2 veces menor en el caso de la rfp secretada en comparación con los PCP generados por vacío (Fig. 2A).

La fluorescencia promediada del extracto de PCP generado por centrifugación fue ~2 veces mayor tanto para la rfp citosólica (-3200 AFU) como para la secretada (-1000 AFU) en comparación con el procedimiento de vacío. El CV de los PCP generados por centrifugación fue ~4 veces menor para la rfp citosólica y ~2 veces menor para la rfp secretada, respectivamente (5,4%, 4,9%, Fig. 2B).

La fluorescencia a 590 nm en el PCP generada por vacío se detectó principalmente en la superficie de el PCP, mientras que los PCP generados por vacío mostraron fluorescencia en todo el cuerpo de el PCP (Fig. 3).

Esto indica una expresión más alta y homogénea de la proteína recombinante en toda el PCP para el procedimiento basado en la centrifugación, mientras que los PCP generados por vacío muestran predominantemente niveles de expresión comparativamente altos sólo en la superficie de el PCP.

Los PCPs generados por centrifugación comenzaron a colapsar a concentraciones de sacarosa de 60 g L'1 en el tampón de infiltración (Fig 4A), resultando en una gran varianza entre muestras (coeficiente de varianza >70%) (Fig. 4 B) y sin expresión detectable de DsRed a concentraciones >70 g L_1 de sacarosa después de cuatro días de incubación. Los PCPs generados por vacío permanecieron intactos y expresaron homogéneamente la proteína recombinante DsRed hasta concentraciones de sacarosa de 90 g L_1 (Fig. 4 A, C).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de transformación de células vegetales cultivadas que comprende

a) proporcionar un paquete de células vegetales (PCP) de células vegetales cultivadas para ser transformadas, b) poner en contacto dicho PCP con un líquido que contenga un agente transformante durante un periodo de incubación,

c) eliminar dicho líquido que comprende un agente transformador; y, de este modo,

d) transformar dichas células vegetales cultivadas,

en el que el líquido que contiene el agente transformante se aplica al PCP en el paso b) mediante un equipo automatizado, preferentemente a una tasa de 50 pl/s como máximo,

en el que dicho PCP es un paquete compactado de células vegetales cultivadas, y

en el que dicho suministro de un PCP en el paso a) y dicha eliminación de dicho líquido que comprende un agente transformante en el paso c) comprenden la centrifugación de el PCP a entre 500 x g y 3500 x g.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho suministro de un paquete de células vegetales comprende centrifugar una cantidad adecuada de masa celular sobre un soporte poroso, preferentemente un filtro.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho soporte poroso es una placa filtrante multipocillo, preferentemente con poros de un diámetro medio de 30 pm a 40 pm.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho PCP es un paquete compactado de células vegetales que tiene una densidad de masa de 0,1 g/cm3 a 0,9 g/cm3, preferentemente de 0,4 g/cm3 a 0,6 g/cm3.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho procedimiento comprende añadir un medio de solidificación a dichas células vegetales cultivadas.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células se cultivan en un medio que comprende de 10 g/l a 50 g/l de sacarosa, preferentemente de 15 g/l a 35 g/l de sacarosa, más preferentemente aproximadamente 20 g/l de sacarosa antes de la etapa a).

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas células se cultivan en un medio que comprende de 1 mM a 10 mM de iones fosfato, preferentemente de 2 mM a 5 mM de iones fosfato, más preferentemente alrededor de 2,7 mM de iones fosfato antes del paso a).

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho agente transformante se selecciona del grupo que consiste en polinucleótidos recombinantes aislados, virus vegetales recombinantes y bacterias recombinantes, preferentemente bacterias recombinantes, preferentemente, donde dichas bacterias recombinantes son bacterias de la familia Rhizobiaceae, preferentemente Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter o Rhizobium radiobacter), más preferentemente son bacterias de Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101, más preferentemente Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101: pMP90RK.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho líquido que comprende el agente transformante se suministra mediante un procedimiento automatizado, preferentemente un procedimiento totalmente automatizado que comprende todos los pasos a partir del cultivo de dicha bacteria Agrobacterium, preferentemente, en el que dicho procedimiento es un procedimiento totalmente automatizado.

10. Un procedimiento para proporcionar un lisado de células vegetales transformadas que comprende

a) proporcionar un PCP obtenido según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y los pasos adicionales de

b) incubar el PCP en condiciones adecuadas para que se produzca la transformación,

c) lisar las células vegetales contenidas en el PCP y, de este modo

d) proporcionar un lisado de células vegetales transformadas.

11. Un procedimiento para provocar la transcripción y, opcionalmente, la traducción de al menos una secuencia de ácido nucleico in vitro en un sistema libre de células, que comprende

a) proporcionar un extracto libre de células que comprenda constituyentes celulares necesarios para la transcripción y/o traducción de un polinucleótido

b) poner en contacto el extracto libre de células del paso a) con un polinucleótido que comprenda una secuencia de ácido nucleico expresable, y, de ese modo

c) provocar la transcripción y, opcionalmente, la traducción de dicha secuencia de ácido nucleico,

en el que dicho extracto libre de células se obtuvo a partir de células vegetales obtenidas según el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho procedimiento comprende poner en contacto dicho extracto libre de células con una ARN polimerasa heteróloga, preferentemente ARN polimerasa T7; y/o comprende poner en contacto dicho extracto libre de células con un polinucleótido que comprende un gen expresable que codifica una ARN polimerasa heteróloga, preferentemente ARN polimerasa T7.

13. El objeto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas células vegetales son células seleccionadas de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, más preferentemente de tabaco (Nicotiana tabacum), zanahoria (Daucus carota) o trigo (Tricium aestivum).