KR20200015629A - 식물 세포 팩의 자동 형질전환 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 형질전환시키려는 배양된 식물 세포의 식물 세포 패키지 (PCP)를 제공하는 단계, b) 인큐베이션 기간 동안 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계, c) 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계; 및, 그리하여, d) 상기 배양된 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비에 의해서, 바람직하게 50 ㎕/초 이하의 속도로 단계 b)에서 PCP에 도포되는 것인 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 형질전환된 식물 세포, 이와 관련된 용도 및 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 a) 형질전환시키려는 배양된 식물 세포의 식물 세포 패키지 (PCP)를 제공하는 단계, b) 인큐베이션 기간 동안 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계, c) 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계; 및 그리하여 d) 상기 배양된 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비에 의해서, 바람직하게 50 ㎕/초 이하의 속도로 단계 b)에서 PCP에 도포되는 것인 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 형질전환된 식물 세포, 이와 관련된 용도 및 방법에 관한 것이다.
2차 대사산물 또는 단백질의 재조합 생산을 위한 식물-기반 시스템을 제공하기 위해 많은 노력들이 이루어져왔다. 원칙적으로, 식물 세포 배양물을 비롯하여, 온전한 식물이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 물질대사에서 필요한 변화를 획득하고, 식물 세포가 재조합 유전자 또는 이의 생성물을 생산하게 만들기 위해서, 원칙적으로 2가지 방법, 즉 한편으로는 안정한 유전자이식 식물 또는 식물 세포 배양물을 제공하거나, 또는 다른 한편으로는 일시적으로 형질감염된 식물 또는 식물 세포 배양물을 제공하는 것이 사용될 수 있다. 형질전환을 위해서, 일반적으로, 불활성 담체 입자 (예를 들어, 금으로 제조된 미세입자, "유전자 총"), 박테리아 (특히 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 종), 바이러스 (예를 들어, 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 뒤쪽 2가지의 조합 ("매그니펙션 (magnifection)", WO 2002088369 A1)이 사용될 수 있다.
일반적으로, 일시적 형질전환은 안정한 형질전환이 필요하지 않은 경우 및 결과를 신속하게 수득해야 하는 경우에 유리한데, 유전자이식 세포의 선별 및 선택압 하에서 그들의 배양이 필요하지 않기 때문이다. 이것은 온전한 식물에 보다 더 적용된다.
이식유전자를 위한 최적 구성체를 제공하기 위해서, 일반적으로 예비스크리닝을 수행하여 소규모로 대량의 가능한 후보물 및/또는 조건을 시험한다. 현재는, 형질전환 용액을 잎 재료에 수동으로 주입하여 예비스크리닝을 수행하고 손으로 샘플을 수확 및 추출하는 것이 일반적이다. 그러나, 엽위의 차이, 엽령, 및 또한 상이한 식물 간 작은 유전자형 또는 표현형 차이로 인해, 복제물 그룹 간에 강력한 변동성이 존재할 수 있어서, 전달성 및 확장성 관점에서 이러한 실험의 가치를 감소시킨다. 게다가, 시험하려는 구성체의 수가 증가함에 따라서, 작업량과 그에 따라 시간 및 비용이 극적으로 증가된다.
식물 세포 패키지 (PCP)는 예를 들어 EP 3136841 A1에 교시된 바와 같이 회분식 배양으로 수득될 수 있는 식물 세포의 동종 개체군을 제공하는 장점을 가지는, 식물 세포 배양 (EP 2623603 A1)의 예비스크리닝 실험을 수행하기 위한 가능성을 제공한다. 게다가, PCP를 사용하는 실험에서, 온도, 영양분 공급 등과 같은 환경적 매개변수는 온전한 식물에 비해 더 쉽게 제어될 수 있다.
PCP 이외에도, 또한 세포질 망상구조체의 미세-소포체를 함유하는 시스템을 포함하고, 그에 따라서 단백질의 번역후 변형을 제공하는, 세포-무함유 발현 시스템이 제안되었다 (예를 들어, WO 2015165583 A1 및 [Buntru et al. (2014), BMC Biotechnol. 14:37] 참조).
예비스크리닝 시스템의 상기 장점에도 불구하고, 시간 소모적이고 값비싼 실습 단계들의 수로 인해서 이러한 스크리닝을 수행하기 위한 개선된 수단 및 방법에 대한 요구는 여전히 존재한다. 그러므로 적어도 부분적으로 종래 기술의 단점을 피하는, 상기 언급된 요구에 부응하는 수단 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
상기 언급된 문제는 본 명세서에 기술된 방법 및 수단을 통해서 해결된다. 단독 방식으로 또는 어떠한 임의 조합으로 실현될 수 있는 바람직한 실시형태는 독립항으로 열거되어 있고 본 명세서에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은
a) 형질전환시키려는 배양된 식물 세포의 식물 세포 패키지 (PCP)를 제공하는 단계,
b) 인큐베이션 기간 동안 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계,
c) 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계; 및 그리하여,
d) 상기 배양된 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고,
형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비를 통해서, 바람직하게 50 ㎕/초 이하의 속도로 단계 b)에서 PCP에 도포되는 것인 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 관한 것이다.
하기에서 사용시, 용어 "가지다", "포함하다" 또는 "포괄하다" 또는 이의 어떠한 임의의 문법적 변화형은 비배타적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어에 의해 도입되는 특성 이외에, 본 문맥에서 설명되는 독립체에 추가 특성이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특성이 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다. 예로서, 표현 "A가 B를 가지다", "A가 B를 포함하다" 및 "A가 B를 포괄하다"는 B 이외에, 다른 구성요소가 A에 존재하지 않는 상황 (즉, A가 단독으로 오로지 B로만 이루어진 상황) 및 B 이외에, 하나 이상의 추가 구성요소, 예컨대 구성요소 C, 구성요소 C 및 D 또는 더 추가의 구성요소가 독립체 A에 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다.
뿐만 아니라, 하기에서 사용시, 용어 "바람직하게", "보다 바람직하게", "가장 바람직하게", "특히", "보다 특히", "특별히", "보다 특별히" 또는 유사한 용어는 추가의 가능성을 제한하지 않고, 선택적 특성과 함께 사용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입되는 특성은 선택적 특성이고 임의 방식으로 청구항의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자가 인식하게 되는 바와 같이, 본 발명은 대안적인 특성을 사용해 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 실시형태에서" 또는 유사한 표현에 의해서 도입되는 특성은 본 발명의 범주에 대한 임의의 제한없이, 그리고 본 발명의 다른 선택적 또는 비선택적 특성과 이러한 방식으로 도입된 특성을 조합하는 가능성에 대한 임의의 제한없이, 선택적 특성으로 의도된다. 게다가, 달리 표시하지 않으면, 용어 "약"은 관련 분야에서 통상적으로 허용되는 기술적 정밀도를 갖는 표시된 값을 의미하고, 바람직하게는 표시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게 ± 10%, 가장 바람직하게 ± 5%에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 바람직하게 시험관내 방법이다. 게다가, 상기에 명확하게 언급된 것들 이외의 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계들은 예를 들어 단계 a)를 위한 특별한 조건 하에서 식물 세포를 성장시키는 단계, 또는 단계 d) 이후에 식물 세포 팩 중 식물 세포를 용해시키는 단계에 관한 것일 수 있다. 게다가, 상기 단계들 중 하나 이상은 하기 본 명세서에 명시된 바와 같이 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다. 단계 a) 내지 c) 중 바람직하게 적어도 하나, 보다 바람직하게 적어도 둘, 보다 더 바람직하게 모든 3개 단계는 자동화 장비에 의해 수행된다. 가장 바람직하게, 모든 단계는, 바람직하게 형질전환제를 포함하는 액체를 제공하는 단계를 포함하여, 자동화 장비에 의해 수행된다. 바람직하게, 본 발명의 방법에서, 배지 및 장비는 멸균되지만, 보다 바람직하게, 샘플 취급 동안 멸균을 위해 특별한 예방 조치를 취하지는 않는다. 따라서, 바람직하게, 방법의 단계들은 멸균을 보장하는 조건 하에서, 예를 들어 층류 장치 하에서 수행될 수 있지만; 보다 바람직하게, 유일한 멸균 예방 조치로서 멸균된 배지 및 장비를 사용하는 것이 바람직하다.
용어 "식물 세포"는 진핵생물역 내 식물계 구성원의 임의 세포에 관한 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게, 식물 세포는 상과 녹색식물, 바람직하게 관다발 식물, 보다 바람직하게 스퍼마토피티나 (Spermatophytina), 가장 바람직하게 장초형 사초 또는 풀사료 콩류, 관상용 식물, 식용 작물, 수목 또는 관목을 포함한 단자엽 및 쌍자엽 식물에 속하는 식물로부터의 세포이다. 바람직하게, 식물 세포는 단풍나무속 (Acer spp.), 다래나무속 (Actinidia spp.), 닥풀속 (Abelmoschus spp.), 아가베 시살라나 (Agave sisalana), 밀풀속 (Agropyron spp.), 아그로스티스 스톨로니페라 (Agrostis stolonifera), 부추속 (Allium spp.), 비름속 (Amaranthus spp.), 암모필라 아레나리아 (Ammophila arenaria), 아나나스 코모서스 (Ananas comosus), 번여지속 (Annona spp.), 아피움 그라베올렌스 (Apium graveolens), 땅콩속 (Arachis spp.), 빵나무속 (Artocarpus spp.), 아스파라거스 오피시날리스 (Asparagus officinalis), 귀리속 (Avena spp.) (예: 아베나 사티바 (Avena sativa), 아베나 파투아 (Avena fatua), 아베나 비잔티나 (Avena byzantina), 아베나 파투아 (Avena fatua) var. sativa, 아베나 히브리다 (Avena hybrida)), 아베로아 카람볼라 (Averrhoa carambola), 대나무속 (Bambusa sp.), 베닌카사 히스피다 (Benincasa hispida), 베르톨레티아 엑셀세아 (Bertholletia excelsea), 베타 불가리스 (Beta vulgaris), 배추속 (Brassica spp.) (예: 브라시카 나푸스 (Brassica napus), 브라시카 라파종 (Brassica rapa ssp.) (카놀라, 유채, 순무), 카다바 파리노사 (Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis), 칸나 인디카 (Canna indica), 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa), 고추속 (Capsicum spp.), 카렉스 엘라타 (Carex elata), 카리카 파파야 (Carica papaya), 카리사 마크로카르파 (Carissa macrocarpa), 카리아속 (Carya spp.), 칼타머스 틴크토리우스 (Carthamus tinctorius), 밤나무속 (Castanea spp.), 세이바 펜탄드라 (Ceiba pentandra), 시코리움 엔디비아 (Cichorium endivia), 녹나무속 (Cinnamomum spp.), 시트룰러스 라나터스 (Citrullus lanatus), 귤속 (Citrus spp.), 코코스속 (Cocos spp.), 커피나무속 (Coffea spp.), 콜로카시아 에스쿨렌타 (Colocasia esculenta), 코카나무속 (Cola spp.), 황마속 (Corchorus sp.), 코리안드럼 사티범 (Coriandrum sativum), 개암나무속 (Corylus spp.), 산사나무속 (Crataegus spp.), 크로커스 사티버스 (Crocus sativus), 호박속 (Cucurbita spp.), 오이속 (Cucumis spp.), 키나라속 (Cynara spp.), 다우커스 카로타 (Daucus carota), 도둑놈의 갈고리속 (Desmodium spp.), 디모카르퍼스 론간 (Dimocarpus longan), 마속 (Dioscorea spp.), 감나무속 (Diospyros spp.), 피속 (Echinochloa spp.), 기름야자속 (예: 엘라에이스 귀네엔시스 (Elaeis guineensis), 엘라에이스 올레이페라 (Elaeis oleifera)), 엘레우신 코라카나 (Eleusine coracana), 에라그로스티스 테프 (Eragrostis tef), 메뚜기속 (Erianthus sp.), 에리오보트리야 자포니카 (Eriobotrya japonica), 유칼립투스속 (Eucalyptus sp.), 유제니아 유니플로라 (Eugenia uniflora), 메밀속 (Fagopyrum spp.), 너도밤나무속 (Fagus spp.), 페스투카 아룬디나세아 (Festuca arundinacea), 피쿠스 카리카 (Ficus carica), 금감속 (Fortunella spp.), 딸기속 (Fragaria spp.), 징코 빌로바 (Ginkgo biloba), 콩속 (Glycine spp.) (예: 글리신 막스 (Glycine max), 소자 히스피다 (Soja hispida) 또는 소자 막스 (Soja max)), 고십피움 힐수텀 (Gossypium hirsutum), 해바라기속 (Helianthus spp.) (예: 헬리안터스 안누우스 (Helianthus annuus)), 헤메로칼리스 풀바 (Hemerocallis fulva), 히비스커스속 (Hibiscus spp.), 겉보리속 (Hordeum spp.) (예: 홀데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스 (Ipomoea batatas), 가래나무속 (Juglans spp.), 락투카 사티바 (Lactuca sativa), 연리초속 (Lathyrus spp.), 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris), 리넘 우시타티시멈 (Linum usitatissimum), 릿치 치넨시스 (Litchi chinensis), 연꽃속 (Lotus spp.), 루파 아쿠탄굴라 (Luffa acutangula), 루피너스속 (Lupinus spp.), 루줄라 실바티카 (Luzula sylvatica), 토마토속 (Lycopersicon spp.) (예: 리코퍼시콘 에스쿨렌텀 (Lycopersicon esculentum), 리코퍼시콘 리코퍼시컴 (Lycopersicon lycopersicum), 리코퍼시콘 피리포르메 (Lycopersicon pyriforme)), 마크로틸로마속 (Macrotyloma spp.), 꽃사과나무속 (Malus spp.), 말피그히아 에마르기나타 (Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나 (Mammea americana), 만기페라 인디카 (Mangifera indica), 닥풀속 (Manihot spp.), 마닐카라 자포타 (Manilkara zapota), 메디카고 사티바 (Medicago sativa), 전동싸리속 (Melilotus spp.), 박하속 (Mentha spp.), 미스칸투스 시넨시스 (Miscanthus sinensis), 여주속 (Momordica spp.), 모러스 니그라 (Morus nigra), 무사속 (Musa spp.), 담배속 (Nicotiana spp.), 올리브속 (Olea spp.), 부채선인장속 (Opuntia spp.), 오르니토푸스속 (Ornithopus spp.), 벼속 (Oryza spp.) (예: 오리자 사티바 (Oryza sativa), 오리자 라티폴리아 (Oryza latifolia)), 파니컴 밀리아세움 (Panicum miliaceum), 파니컴 빌가텀 (Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스 (Passiflora edulis), 파스티나카 사티바 (Pastinaca sativa), 수크령속 (Pennisetum sp.), 후박나무속 (Persea spp.), 페트로셀리넘 크리스펌 (Petroselinum crispum), 팔라리스 아룬디나세아 (Phalaris arundinacea), 강남콩속 (Phaseolus spp.), 플레움 프라텐스 (Phleum pratense), 야자나무속 (Phoenix spp.), 프라그미테스 아우스트랄리스 (Phragmites australis), 꽈리속 (Physalis spp.), 소나무속 (Pinus spp.), 피스타시아 베라 (Pistacia vera), 완두속 (Pisum spp.), 포아속 (Poa spp.), 사시나무속 (Populus spp.), 프로소피스속 (Prosopis spp.), 벚나무속 (Prunus spp.), 프시디움속 (Psidium spp.), 푸니카 그라나텀 (Punica granatum), 피루스 코뮤니스 (Pyrus communis), 참나무속 (Quercus spp.), 라파너스 사티버스 (Raphanus sativus), 레움 라바르바럼 (Rheum rhabarbarum), 까치밥나무속 (Ribes spp.), 리시누스 코뮤니스 (Ricinus communis), 산딸기속 (Rubus spp.), 개사탕수수속 (Saccharum spp.), 버드나무속 (Salix sp.), 딱총나무속 (Sambucus spp.), 세칼레 세레알레 (Secale cereale), 참깨속 (Sesamum spp.), 들갓속 (Sinapis sp.), 가지속 (Solanum spp.) (예: 솔라넘 튜버로섬 (Solanum tuberosum), 솔라넘 인테그리폴리움 (Solanum integrifolium) 또는 솔라넘 리코페르시컴 (Solanum lycopersicum)), 솔검 비콜로르 (Sorghum bicolor), 시금치속 (Spinacia spp.), 도금양속 (Syzygium spp.), 매리골드속 (Tagetes spp.), 타마린두스 인디카 (Tamarindus indica), 테오브로마 카카오 (Theobroma cacao), 토끼풀속 (Trifolium spp.), 트립사컴 닥틸로이데스 (Tripsacum dactyloides), 트리티코세칼레 림파우이 (Triticosecale rimpaui), 밀속 (Triticum spp.) (예: 트리티컴 애스티범 (Triticum aestivum), 트리티컴 두럼 (Triticum durum), 트리티컴 툴기덤 (Triticum turgidum), 트리티컴 히버르넘 (Triticum hybernum), 트리티컴 마차 (Triticum macha), 트리티컴 사티범 (Triticum sativum), 트리티컴 모노코쿰 (Triticum monococcum) 또는 트리티컴 불가레 (Triticum vulgare)), 트로파에올럼 미너스 (Tropaeolum minus), 트로파에올럼 마주스 (Tropaeolum majus), 산앵도나무속 (Vaccinium spp.), 나비나물속 (Vicia spp.), 동부속 (Vigna spp.), 비올라 오도라타 (Viola odorata), 포도속 (Vitis spp.), 제아 마이스 (Zea mays), 및 지자니아 팔루스트리스 (Zizania palustris), 대추나무속 (Ziziphus spp.)으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 식물로부터의 세포이다. 보다 바람직하게, 식물 세포는 담배 (니코티아나 타바컴 (Nicotiana tabacum)) 세포, 당근 (다우커스 카로타 (Daucus carota)) 세포, 또는 밀 (트리시움 애스티범 (Tricium aestivum)) 세포이다. 식물 세포는 전체 식물, 식물 일부분, 식물 기관, 또는 식물 조직으로부터의 세포 또는 그로부터 유래된 세포일 수 있다. 따라서, 이 용어는 바람직하게, 종자, 새싹, 줄기, 잎, 뿌리 (괴경 포함), 및 꽃으로부터의 세포 및 그로부터 유래된 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "배양된 식물 세포"는 원형질체를 포함하는, 배양 배지 중 세포 응집체로서 또는 단독 세포로서 유지되는 식물 세포에 관한 것이다. 바람직하게, 배양된 식물 세포는 현탁 배양으로 유지되는 식물 세포이다. 캘러스 형성을 유도하고 식물 세포의 현탁 배양을 개시시키기 위한 방법 및 배양 배지는 당분야에 공지되어 있다. 세포의 현탁 배양을 위한 바람직한 배지는 무라시게 및 스쿠그 (Murashige & Skoog) 배지 (Murashige & Skoog (1962), Physiologia Plantarum. 15 (3): 473)이다. 본 명세서에 기술된 형질전환을 위한 방법을 적용시키기 전에, 바람직하게, 적어도 1주, 보다 바람직하게 적어도 2주에, 세포는 회분식 현탁 배양, 보다 바람직하게 연속 현탁 배양으로 유지된다. 식물 세포를 배양하기 위한 바람직한 방법은 예를 들어 WO 2015/165583 A1에 기술되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 식물 세포는 형질전환 이전에 단일 세포 상태에 도달할 때까지 배양된다. 바람직하게, 배양된 식물 세포는 형질전환 전에 25 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 바람직하게 75 g/ℓ 내지 100 g/ℓ의 습윤 질량 밀도까지 성장된다. 용어 "습윤 질량 밀도"는 당업자가 이해하며, 바람직하게 이 용어는 배양 배지의 정해진 부피에 포함된 세포 덩이를 원심분리하고 칭량하여 결정되는, 배양물 부피 당 세포 질량에 관한 것이다. 바람직하게, 배양된 식물 세포는 바람직하게 진공 여과 또는 원심분리에 의해서, 보다 바람직하게 침강에 의해서, 식물 세포 팩으로 전환되기 전에 300 g/ℓ 이하, 바람직하게 200 g/ℓ 이하의 습윤 질량 밀도로 농축된다. 바람직하게, 배양된 식물 세포는 본 명세서에 기술된 형질전환을 위한 방법을 적용하기 전에, 바람직하게 적어도 1주 동안, 보다 바람직하게 적어도 2주 동안 10 g/ℓ 내지 50 g/ℓ의 사카로스, 바람직하게 15 g/ℓ 내지 35 g/ℓ의 사카로스, 보다 바람직하게 약 20 g/ℓ의 사카로스를 포함하는 배지에서 유지된다. 또한 바람직하게, 배양된 식물 세포는 본 명세서에 기술된 형질전환을 위한 방법을 적용하기 전에, 바람직하게 적어도 1주 동안, 보다 바람직하게 적어도 2주 동안, 1 mM 내지 10 mM의 포스페이트 이온, 바람직하게 2 mM 내지 5 mM의 포스페이트 이온, 보다 바람직하게 약 2.7 mM의 포스페이트 이온을 포함하는 배지에서 유지된다. 바람직하게, PCP를 생성시키기 위해 배양된 식물 세포를 분배하기 위해서, 식물 세포를 포함하는 배지는 바람직하게 진탕 또는 교반에 의해서, 보다 바람직하게 교반에 의해서, 가장 바람직하게 자성 교반기에 의한 교반에 의해서 교반된다,
용어 "식물 세포 패키지" (또는 "PCP")는 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 EP 2 623 603 A1은 식물 세포의 조밀 패키지, 예를 들어, 식물 세포의 펠렛에 관한 것이다. EP 2 623 603 A1에 기술된 바와 같이, PCP는 배양된 식물 세포를 다공성 지지체에 도포시키고, 다공성 지지체에 진공을 인가하여 배양 배지를 제거함으로써 제공될 수 있다. 바람직하게, PCP는 배양된 식물 세포를 원심분리하여 제조된다. 바람직하게, PCP는 배양된 세포를 500g 내지 3500g, 바람직하게 1500g 내지 2000g로 원심분리하여 제공되고, 여기서 상기 원심분리는 적어도 15초, 바람직하게 적어도 30초 동안 수행된다. 보다 바람직하게, 상기 원심분리는 15초 내지 10분, 바람직하게 30초 내지 1분 동안 수행된다. 바람직하게, 원심분리 이후에, 상청액이 제거된다. 보다 바람직하게, PCP는 배양된 식물 세포를 다공성 지지체 상에서 원심분리시켜 제공되고, 바람직하게, 다공성 지지체는 필터이거나 또는 그를 포함하고, 보다 바람직하게, 다공성 지지체는 필터 플레이트, 가장 바람직하게 다중웰 필터 플레이트이다. 다중웰 필터 플레이트는 원칙적으로 당업자에게 공지되어 있고, 다양한 구성으로 상업적으로 입수가능하다. 바람직하게, 다공성 지지체는 1 ㎛ 내지 200 ㎛, 바람직하게 30 ㎛ 내지 40 ㎛의 평균 직경을 갖는 포어를 갖는다. 바람직하게, PCP는 보다 바람직하게 0.1 g/㎤ 내지 0.9 g/㎤의 질량 밀도, 가장 바람직하게 0.4 g/㎤ 내지 0.6 g/㎤의 질량 밀도를 갖는 식물 세포의 조밀 패키지이다. 바람직하게, PCP의 생성은 완전 자동화이고, 바람직하게, 다시 말해서, 바람직하게 사전 정해진 습윤 질량 밀도를 갖는 배양된 식물 세포의 적절한 부피를 적절한 용기, 바람직하게 다중웰 필터 플레이트에 파이펫팅하는 것, 및 다중웰 필터 플레이트의 원심분리하는 것은 바람직하게 사용자에 의한 임의 상호작용없이, 자동화 장비에 의해 수행된다. 바람직하게, PCP는 보다 바람직하게 웰 당 0.5 ㎖ 이하의 액체, 바람직하게 웰 당 0.25 ㎖ 이하의 액체를 수용하는, 다중웰 (다중-클러스터) 플레이트에 제공된다.
바람직하게, 식물 세포 패키지를 제공하기 위해서, 적절한 양의 세포 덩이가 다공성 지지체, 바람직하게 필터 상에서 원심분리된다. 용어 "적절한 양의 세포 덩이"는 당업자가 이해하며 PCP의 유지를 위해 선택된 용기에 의해 제공되는 공간 및 후속 단계에 필요한 세포 질량에 본질적으로 의존하게 될 것이다. 따라서, 예를 들어, 96-웰 플레이트의 단일 웰 경우에, 바람직하게 50 mg 내지 100 mg, 보다 바람직하게 약 65 mg의 세포 질량이 사용될 수 있다. 바람직하게, PCP를 제공시, 고화 수단이 포함된다. 본 명세서에서 사용시 "고화 수단"은 PCP의 전반적인 안정성을 향상시키는데 적합한 모든 수단을 포함한다. 따라서, 고화 수단은 가요성 고화 수단 또는 비가요성 고화 수단일 수 있다. 가요성 고화 수단은 바람직하게 PCP 구조로 유입되게 하여 PCP의 세포 응집체가 분리되는 것을 방지하는 수단이며, 따라서, 바람직하게, 가요성 고화 수단은 섬유성 화합물이고, 보다 바람직하게는 셀룰로스 섬유를 포함하거나 또는 그로 이루어지는 섬유성 화합물이다. 비가요성 고화 수단은 바람직하게 PCP 구조에 스캐폴드를 제공하여 PCP의 세포 응집체가 분리되는 것을 방지하는 수단이다. 따라서, 바람직하게, 비가요성 고화 수단은 PCP에 외부 및/또는 내부 지지체를 제공하는 강성 또는 반강성 화합물이고, 그에 따라서, 비가요성 고화 수단은 배양된 세포가 도포되기 전에 다공성 지지체에 첨가될 수 있거나, 또는 다공성 지지체의 일부분일 수 있다.
명확함을 위해서, 용어 "식물 세포 배양물"은 원형질체로서 제공되거나 또는 식물 세포에 전형적인 현탁 배양된 식물 세포의 배양물에 대해 본 명세서에서 사용되는 한편, 용어 "식물 세포 패키지"는 기술된 바와 같이 제공되는 식물 세포의 응축된 패키지에 대해 사용된다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 식물 세포 배양 및 PCP 둘 모두는 배양된 식물 세포를 함유할 것이고, 식물 세포 배양물 및 PCP 간 차이는 남아있는 유리 세포외 액체 (즉, 바람직하게 성장 배지)의 부피가 PCP에서는 낮아서, PCP 중 세포 및 세포 응집체가 그들의 상대적 위치에서 본질적으로 고정된다는 것이다. 이해하게 되는 바와 같이, 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계는 PCP의 구조를 뒤틀리게 하지 않을 정도로 낮은 상기 액체의 부피를 도포하는 단계를 포함한다. 따라서, 바람직하게, 본 발명의 방법은 전체 형질전환 과정 동안 PCP로서 배양된 식물 세포를 유지시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환"은 식물 세포로의 바람직하게 이종성 폴리뉴클레오티드의 도입에 관한 것이다. 도입되는 폴리뉴클레오티드는 식물 세포 및/또는 색소체 및/또는 이의 미토콘드리아의 게놈으로 안정하게 통합될 수 있다. 임의로는, 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/Cas 단백질 복합체의 특별한 작용을 촉발시키는 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 바람직하게, 도입되는 폴리뉴클레오티드는 안정하게 통합되지 않고, 따라서, 바람직하게 형질전환은 일시적 형질전환이다. 보다 바람직하게, 형질전환은 일시적 핵 형질전환이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 원형 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드 (즉, 이의 천연 상황으로부터 단리)로서, 유전자 변형된 형태로, 또는 하기 본 명세서에서 명시되는 바와 같은 벡터에 포함되어 제공될 것이다. 이 용어는 DNA 및 RNA를 포괄하고, 바람직하게 폴리뉴클레오티드는 DNA이고, 또한 이 용어는 단일 가닥뿐만 아니라 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 게다가, 또한 자연 발생 폴리뉴클레오티드 예컨대 글리코실화 또는 메틸화 폴리뉴클레오티드 또는 인공 변형된 유도체 예컨대 바이오티닐화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드, 즉 형질전환된 식물 세포에서 비자연 발생 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 관심 유전자, 예를 들어 관심 폴리펩티드를 코딩하는 발현가능한 서열을 코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함될 수 있다. 용어 "벡터"는 바람직하게 플라스미드 및 바이러스 벡터를 비롯하여, 인공 염색체, 예컨대 박테리아 또는 효모 인공 염색체를 포괄한다. 게다가, 이 용어는 또한 게놈, 색소체, 및/또는 미토콘드리아 DNA로 표적화 구성체의 무작위 또는 부위-지정 통합을 가능하게 하는 표적화 구성체에 관한 것이다. 이러한 표적 구성체는 바람직하게 상동성 또는 이종성 재조합을 위해 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포괄하는 벡터는 바람직하게 박테리아 및/또는 식물 세포에서 증식 및/또는 선택을 위한 선택가능 마커를 더 포함한다.
보다 바람직하게, 본 발명의 벡터에서 폴리뉴클레오티드는 식물 세포 또는 이의 단리된 분획에서 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 따라서, 바람직하게, 벡터는 발현 벡터이고, 보다 바람직하게는 일시적 발현 벡터이다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의, 바람직하게 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵생물 세포, 바람직하게 식물 세포에서 발현을 보장하는 조절성 엘리먼트는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 바람직하게, 그들은 전사 및 번역의 개시를 보장하는 조절성 서열, 및 임의로는, 번역의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절성 엘리먼트는 전사를 비롯하여 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 게다가, 유도성 발현 제어 서열은 본 발명에 의해 포괄되는 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유도성 벡터는 tet (테트라사이클린) 오퍼레이터 서열 또는 열충격 또는 다른 환경 인자에 의해 유도가능한 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 바람직한 벡터는 또한 WO 2002/088369 A1 및 이에 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉되는"은 화합물들이 상호작용할 수 있도록, 2개 화합물을 밀접하게 근접시키거나 또는 혼합물이 되게 하는 것에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환제"는 세포, 바람직하게 식물 세포의 형질전환을 유발시키는데 적합한 임의 화합물 또는 화합물의 혼합물에 관한 것이다. 원칙적으로 식물 세포 형질전환을 위한 형질전환제는 당분야에 공지되어 있다. 당업자는 또한 특이적 형질전환제의 적합성이 형질전환되는 식물 세포의 종, 유형 및 상태를 비롯하여, 다른 인자들에 의존적일 수 있다는 것을 알고 있다. 따라서, 배양된 식물 세포가 원형질체인 경우에, 바람직하게 형질전환제는 바람직하게 형질전환을 증강시키는 화학적 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌이민과의 혼합물로서, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 본 명세서에서 명시된 바와 같은 벡터이다. 바람직하게, 배양된 식물 세포는 유전자 총 방법 등을 통해서, 바이러스 및/또는 박테리아 벡터에 의해 형질전환된다. 바람직하게, 형질전환제는 식물 바이러스이고, 보다 바람직하게 형질전환시키려는 식물 세포를 감염시키는 재조합 식물 바이러스이고, 보다 바람직하게는 비르가바이러스과 (Virgaviridae), 포티바이러스과 (Potyviridae) 및 제미니바이러스과 (Geminiviridae)의 바이러스과 중 하나의 재조합 구성원이고, 가장 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스, 담배 식각 바이러스, 또는 옥수수 줄무늬 바이러스이다. 보다 바람직하게, 형질전환제는 바람직하게 재조합 박테리아, 바람직하게 리조비아과 (Rhizobiaceae), 보다 바람직하게 아그로박테리아 속으로부터 유래되고, 보다 더 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter), 또는 리조비움 라디오박터 (Rhizobium radiobacter)이고, 가장 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스이다. 바람직하게, 아그로박테리움 튜머파시엔스는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101, 보다 바람직하게 플라스미드 pMP90RK를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101 (아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101:pMP90RK)이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 당업자에게 충분히 공지된 방법을 사용하여 재조합 형질전환제를 구축할 수 있고, 예를 들어, [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.] 및 [Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]에 기술된 기술을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환제를 포함하는 액체"는 하기 본 명세서에 명시된 바와 같은 형질전환제를 포함하는, PCP에 도포 및 형질전환제와 상용성인 임의의 액체에 관한 것이다. 바람직하게, 액체는 수성 액체이고, 보다 바람직하게는 물이며, 보다 더 바람직하게는 완충액이다. 형질전환제가 박테리아, 예를 들어 아그로박테리움인 경우에, 바람직하게, 액체는 수성 완충액이고, 보다 바람직하게는 사카로스, 글루코스, 필수 미네랄, 및/또는 아세토시린곤을 포함하는 완충액이고, 가장 바람직하게는 약 50 g/ℓ 농도의 사카로스, 약 2 g/ℓ 농도의 글루코스, 약 0.5 g/ℓ 농도의 표준 식물 비료 (예: Ferty 2 MEGA (Planta Dungemittel GmbH)), 및 약 200 μM 농도의 아세토시린곤을 포함하고, 약 5.6의 pH를 갖는 완충액이다. 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체는 0.1 내지 1.5, 바람직하게 0.2 내지 1.0, 보다 바람직하게 0.3 내지 0.7, 가장 바람직하게 약 0.5의 600 nm에서 측정된 광학 밀도 (OD600)로, 재조합 박테리아, 바람직하게 아그로박테리움 박테리아를 포함하는 상기에 명시된 바와 같은 용액이다.
바람직한 실시형태에서, 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법은 형질전환제를 포함하는 액체의 자동화 생성의 단계 또는 몇몇 단계들을 포함한다. 따라서, 바람직하게, 형질전환제의 밀도를 조정하는 단계, 특히 형질전환 박테리아의 밀도를 조정하는 단계는 자동화 장비에 의해 수행된다. 보다 바람직하게, 형질전환 박테리아를 수확하는 단계, 이를 재현탁시키는 단계, 및 밀도를 결정하는 단계의 선행 단계들이 또한 자동화 장비에 의해 수행된다. 바람직하게, 이러한 경우에, 박테리아는 PCP를 생성시키는데 사용되는 플레이트와 동일한 개수의 웰을 갖는 다중웰 (다중클러스터) 플레이트에서 배양된다. 또한, 바람직하게, 상기 박테리아는 1000 x g 내지 3000 x g, 바람직하게 1300 x g 내지 2300 x g, 보다 바람직하게 약 1800 x g에서 원심분리에 의해 성장 이후 펠렛화된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 박테리아는 500 x g 내지 4000 x g, 바람직하게 1300 x g 내지 3000 x g, 보다 바람직하게 약 2400 x g에서 원심분리에 의해 성장 이후 펠렛화된다. 또한, 바람직하게, 상기 박테리아는 적절한 양의 완충액을 첨가하고 다중웰 (다중클러스터) 플레이트를 적어도 5분 동안 회전시켜 재현탁된다. 또한, 바람직하게, 상기 재현탁된 박테리아의 밀도는, 바람직하게, 자동화 플레이트 판독기를 통해 결정되고, 잠재적으로 필요한 희석물이 자동으로 계산되고 도포된다. 보다 더 바람직하게, 상기 형질전환 박테리아를 배양하는 추가의 선행 단계도 역시 자동화 장비에 의해 수행된다. 따라서, 형질전환제가 박테리아인 경우에, 가장 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 방법, 바람직하게 상기 박테리아를 배양하는 단계로부터 출발하는 모든 단계를 포함하여 완전 자동화 방법에 의해 제공된다. 96-웰 구성으로 형질전환제로서 아그로박테리움 박테리아를 포함하는 용액을 제조하기 위한 바람직한 조건은 본 명세서의 실시예에 기술되어 있다.
본 발명에 따라서, 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비에 의해 단계 b)에서 PCP에 도포된다. 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체는 바람직하게 조정가능한 분배 속도를 갖는, 자동 분배기에 의해 PCP에 도포된다. 바람직하게, PCP 상에 형질전환제를 포함하는 액체를 도포하는 속도는 바람직하게 단일-개구부 분배기가 사용되면 50 ㎕/초 이하이다. 보다 바람직하게, 상기 언급된 분배 속도는 1 ㎕/초 내지 50 ㎕/초이고, 보다 더 바람직하게는 10 ㎕/초 내지 50 ㎕/초이다. 바람직하게, 본 발명에 따라서 분배에 사용되는 자동화 장비는 멸균 파이펫 팁이 장착된다. 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체를 PCP에 도포하는 단계에서, 자동화 장비의 배출구는 PCP에 근접하게 된다. 바람직하게, 상기 언급된 문맥에서 "근접"은 자동화 장비의 배출구 상에 형성되는 형질전환제를 포함하는 액체의 평균 액적의 직경 미만의 거리를 의미한다. 따라서, 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체를 PCP에 도포하는 단계에서, PCP의 표면 및 분배기의 배출구 사이 거리는 5 mm 미만, 바람직하게 4 mm 미만이다. 보다 바람직하게, 형질전환제를 포함하는 액체를 PCP에 도포하는 단계에서, PCP의 표면 및 분배기의 배출구 사이의 거리는 0.5 mm 내지 5 mm이고, 보다 더 바람직하게는 1 mm 내지 4 mm이다. 바람직하게, 0.5 ㎖ 내지 2 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포되고, 바람직하게 1 ㎖ 내지 2 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포되며, 보다 바람직하게 약 1.5 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포된다. 바람직하게, PCP의 질량은 배양물의 습윤 질량 밀도 및 사용된 이의 부피로부터 추산된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인큐베이션 기간"은 형질전환제를 포함하는 액체를 도포하는 단계 및 상기 액체를 제거하는 단계 사이의 시간에 관한 것이다. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 인큐베이션 기간은 형질전환제를 포함하는 액체의 제거 시에 용리되지 않게 식물 세포가 형질전환제의 적어도 일부분과 접촉되는데 필요한 시간 기간이라고 여겨진다. 따라서, 인큐베이션 기간은 짧을 수 있고, 바람직하게, 10분 내지 3시간, 바람직하게 30분 내지 60분이며, 바람직한 실시형태에서는 20분 내지 60분이다.
용어 "형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계"는 당업자가 이해하는 것이다. 바람직하게, 상기 제거 단계는 형질전환제를 제거하기 위한 임의의 측정을 착수하지 않고, 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계로 이루어진다. 따라서, 바람직하게, 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계는 PCP를 500 x g 내지 3500 x g, 바람직하게 1500 x g 내지 2000 x g에서, 바람직하게 다공성 지지체, 보다 바람직하게 PCP를 생성시키기 위해 사용된 동일한 다공성 지지체 상에서 원심분리시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 원심분리는 적어도 15초, 바람직하게 적어도 30초 동안 수행되고, 보다 바람직하게, 상기 원심분리는 15초 내지 10분, 바람직하게 30초 내지 1분 동안 수행된다.
본 발명의 형질전환 방법에 따라서, PCP는 형질전환제를 포함하는 용액의 제거 이후에, 바람직하게 인큐베이션된다. 바람직하게, 또한 선행 단계처럼, 상기 인큐베이션은 바람직하게 배양된 식물 세포의 최적 성장 온도에서 수행된다. 따라서, 온도는 바람직하게 20℃ 내지 35℃, 보다 바람직하게 25℃ 내지 30℃, 가장 바람직하게는 약 26℃이다. 바람직하게, PCP가 인큐베이션되는 분위기는 주변 대기이고, 바람직하게, 상대 습도가 50% 내지 100%, 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 더 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 적어도 90%이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 인큐베이션은 형질전환이 일어날 수 있게, 임의로는 유전자 발현이 일어날 수 있게 수행된다. 따라서, PCP의 인큐베이션은 적어도 12시간 동안, 바람직하게 적어도 1일 동안, 보다 바람직하게 적어도 2일 동안, 보다 더 바람직하게 적어도 5일 동안이고, 가장 바람직한 실시형태에서는 적어도 3일 동안이거나, 또는 인큐베이션은 12시간 내지 3주 동안이고, 바람직하게 3일 내지 2주 동안이고, 보다 바람직하게 4일 내지 8일, 동안, 가장 바람직하게 5일 또는 6일 동안이다. 바람직한 실시형태에서, PCP의 인큐베이션은 12시간 내지 3주 동안, 바람직하게 2일 내지 2주 동안, 보다 바람직하게 3일 내지 8일 동안, 가장 바람직하게 4일 또는 5일 동안이다. 바람직하게, PCP는 상기 명시된 바와 같은 필터 플레이트에서, 보다 바람직하게 윗쪽을 아래로 하여, 즉 개구부가 바닥을 향하게 하여 인큐베이션된다. 가장 바람직하게, PCP는 개구부가 저수기를 향하는 반전된 방식으로 필터 플레이트에서 인큐베이션된다.
임의로는, 배양된 식물 세포를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 배양된 식물 세포를 용해시키는 추가의 단계, 바람직하게 상기 식물 세포를 용해 완충액을 통해서 용해시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 용해 완충액은 세제, 바람직하게 음이온성 세제, 가장 바람직하게 소듐 도데실술페이트, 및/또는 2가 마그네슘 양이온 (Mg2+)을 킬레이팅하는 작용제를 포함한다. 보다 바람직하게, 용해 완충액은 0.1% (w/v) 내지 10% (w/v), 바람직하게 1% (w/v) 농도의 소듐 도데실술페이트, 및 1 mM 내지 200 mM, 바람직하게 약 50 mM 농도의 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 용해 완충액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris)을 10 mM 내지 200 mM, 바람직하게 약 100 mM의 농도로, 8.0 내지 10.0의 pH 값, 바람직하게 약 9.0의 pH 값으로 포함한다. 전형적으로, 약 1 ㎖ 내지 6 ㎖의 상기 용해 완충액이 PCP 생물량의 그램 당 접촉되고, 바람직하게 2 ㎖ 내지 4 ㎖의 상기 용해 완충액이 PCP 생물량의 그램 당 첨가된다. 바람직하게 상기 용해 완충액의 첨가는 PCP의 생성을 위해 사용된 동일한 다공성 지지체에서 수행된다. 보다 바람직하게 첨가는 자동화 방식으로 수행된다. 바람직하게 용해 완충액의 작용은 22 내지 100℃의 고온에서, 보다 바람직하게 10 내지 60분 동안, 바람직하게 200 내지 2000 rpm, 보다 바람직하게 1000 rpm의 속도의 진탕기 상에서, 용해 완충액과 함께 PCP를 인큐베이션시켜서 증강된다. 보다 바람직하게, 고온에서 물의 증발을 방지하기 위해 미네랄유가 첨가되며, 미네랄유의 부피는 바람직하게 50 내지 200 ㎕, 보다 바람직하게 60 내지 80 ㎕이다. PCP를 구성하는 식물 세포의 용해 이후에, 세포 찌꺼기는 바람직하게, 200 x g 내지 2000 x g, 보다 바람직하게 약 1000 x g의 원심분리를 통해서, 바람직하게 PCP의 생성 동안 사용된 동일한 다공성 지지체를 사용하여 제거된다. 바람직한 실시형태에서, 세포 찌꺼기는 500 x g 내지 4000 x g, 보다 바람직하게 약 1000 x g의 원심분리를 통해서, 바람직하게 PCP의 생성 동안 사용된 동일한 다공성 지지체를 사용하여 제거된다. 바람직하게, 이러한 경우에, 찌꺼기-무함유 세포 용해물은 다공성 지지체를 함유하는 다중벽 플레이트와 동일한 수의 동공을 함유하는 다중벽 플레이트에 수집되고, 이러한 경우에 찌꺼기-무함유 세포 용해물을 수집하는데 사용된 플레이트는 원심분리 전에 다공성 지지체를 갖는 플레이트 아래에 위치시켰다. 바람직하게 한 단계, 보다 바람직하게 모든 단계는 자동화 장비를 사용해 수행된다.
용어 "자동화 장비"는 당업자가 이해하고 있다. 바람직하게, 이 용어는 확립되면, 인간 조작자의 상호작용을 필요로 하지 않는 방식으로 표시되는 단계 또는 단계들을 수행하는 임의의 장치 또는 장치의 조합에 관한 것이다. 따라서, 확립되면, 원칙적으로 방법은 제어 상호작용을 필요로 하지 않고, 임의 횟수 동안 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다. 적합한 자동화 장비는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 본 명세서의 실시예에 기술된 장비이다.
유리하게, 그리고 놀랍게도, 자동화 장비에 의해 형질전환 용액을 PCP에 도포하는 단계가 보다 일관적인 형질전환 속도를 가능하게 한다는 것을 본 발명의 기초가 되는 작업에서 확인하였다. 하기 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에서 웰-대-웰 변동성은 매우 작다. 방법이 소형화 (예를 들어, 96웰) 구성으로 수행될 수 있으므로, 고속대량 용도에 매우 적합하다. 바람직하게, 그리고 또한 유리하게, 원심분리에 의한 PCP로부터 액체의 제거는 진공에 의한 액체의 제거와 비교하여 더 높은 전체 형질전환 및 형질전환 효율의 적은 변동성을 제공한다는 것이 더욱 확인되었다. 뿐만 아니라 원심분리에 의한 PCP로부터 액체의 제거는 형질전환제를 포함하는 액체 중 더 높은 수크로스 농도를 가능하게 하는 것으로 확인되었다.
상기에서 이루어진 정의는 하기에 준용하여 적용된다. 하기에서 더욱 이루어지는 추가의 정의 및 설명은 또한 준용하여 본 명세서에 기술된 모든 실시형태에 적용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 따른 방법으로 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환된 식물 세포"는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포이고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 상기 언급된 방법에 의해 상기 식물 세포에 도입된다. 형질전환이 안정한 형질전환일 수 있으므로, 그리고 식물이 상기 언급된 형질전환된 세포로부터 재생될 수 있으므로, 본 발명은 또한 상기 언급된 형질전환된 식물 세포 중 적어도 하나를 포함하는 식물 또는 식물 일부분에 관한 것이다.
본 발명은 또한 고속대량 스크리닝을 위한 본 발명에 따른 방법에 따라 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하기 위한 방법에 관한 것으로서,
a) 본 발명에 따른 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법에 따라 수득되는 PCP를 제공하는 단계, 및
b) 형질전환이 일어나기에 적합한 조건 하에서 PCP를 인큐베이션시키는 단계,
c) PCP에 포함된 식물 세포를 용해시키는 단계, 및, 그리하여
d) 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하는 단계의 추가 단계들을 포함한다.
본 발명의 용해물을 제공하기 위한 방법은, 바람직하게 시험관내 방법이다. 게다가, 상기에 명확하게 언급된 것들 이외에 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예를 들어 단계 a) 전에 식물 세포를 배양하는 단계, 또는 단계 d) 이후에 세포 성분을 추출 및/또는 분석하는 단계에 관한 것일 수 있다. 게다가, 상기 단계 중 하나 이상, 바람직하게 전부는 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "용해물"은 형질전환된 식물 세포의 세포 성분을 포함하고, 바람직하게 온전한 식물 세포를 오직 소수로만 함유하거나 또는 전혀 함유하지 않는 임의의 추출물에 관한 것이다. 바람직하게, 온전한 식물 세포의 수는 1000/㎖ 미만, 보다 바람직하게 100/㎖ 미만이다. 이해하게 되는 바와 같이, 본 발명의 형질전환 방법의 형질전환 효율은 전형적으로 100% 미만일 것이지만, 바람직하게는 80% 초과일 것이므로, 용해물이 형질전환 및 비형질전환 세포의 세포 성분의 혼합물이 될 것이다. PCP를 인큐베이션시키고 식물 세포를 용해시키기 위한 바람직한 방법은 본 명세서에서 상기에 기술되어 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 용해물을 제공하기 위한 방법에 의해 수득가능한 식물 세포 용해물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 시험관내에 세포-무함유 시스템에서 적어도 하나의 핵산 서열의 전사, 및 임의로는, 번역을 유발시키기 위한 방법에 관한 것이고,
a) 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역에 필요한 세포 성분을 포함하는 세포-무함유 추출물을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 세포-무함유 추출물을 발현가능한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및 그리하여
c) 상기 핵산 서열의 전사, 및 임의로는, 번역을 유발시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 전사를 유발시키기 위한 방법은, 바람직하게, 시험관내 방법이다. 게다가, 이것은 상기에 명확하게 언급된 것들 이외에 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예를 들어 단계 a) 전에 식물 세포를 배양시키는 단계, 또는 단계 c) 이후에 유전자 발현 생성물을 추출 및/또는 분석하는 단계에 관한 것일 수 있다. 또한, 방법은 단계 b) 전에 사전 결정된 표적 값으로 발현가능한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 게다가, 상기 단계 중 하나 이상, 바람직하게 전부는 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포-무함유 추출물"은 전사 및 임의로는 번역을 일으키는데 필요한 모든 성분을 기능적 형태로 포함하는 추출물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포-무함유"는 절대적이 아닌, 상대적 의미로 사용된다. 바람직하게, 온전한 식물 세포를 오직 소수로만 함유하거나 또는 전혀 함유하지 않는 것을 세포-무함유로 간주된다. 따라서, 바람직하게, 추출물은 온전한 식물 세포의 수가 1000/㎖ 미만, 보다 바람직하게 100/㎖ 미만이면 세포-무함유이다. 적합한 세포-무함유 추출물을 제공하기 위한 수단은 예를 들어 WO 2015/165583 A1에 기술되어 있다.
바람직하게, 전사를 유발시키기 위한 방법에서, 세포-무함유 추출물은 자동화 장비에 의해 완전하게 자동화된 방식으로 다중-클러스터 플레이트의 웰에 분배된다. 또한 바람직하게, 일부, 보다 바람직하게 전부의, 추가적인 파이펫팅 단계는 완전하게 자동화된다. 바람직하게, 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 결정하는 단계 및 표적값으로 농도를 조정하는 단계는, 특히 방법이 다중웰 (다중클러스터) 플레이트 구성으로 수행되는 경우에, 역시 자동화 장비에 의해 수행된다. 바람직하게, 방법은 상기 세포-무함유 추출물을 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 더 포함하고/하거나, 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 발현가능한 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 또한 바람직하게, 세포-무함유 추출물은 본 발명에 따른 식물 세포를 형질전환시키기 위한 방법에 따라 수득된 식물 세포로부터 수득하였거나, 또는 상기 세포-무함유 추출물은 본 발명에 따른 유전자이식 식물 세포의 용해물이다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 그들 전체 개시 내용 및 본 명세서에 특별히 언급된 개시 내용에 대해 참조하여 본 명세서에 편입된다.
상기 관점에서, 하기 실시형태가 바람직하다:
1. 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법으로서,
a) 형질전환시키려는 배양된 식물 세포의 식물 세포 패키지 (PCP)를 제공하는 단계,
b) 인큐베이션 기간 동안 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계,
c) 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계; 및, 그리하여,
d) 상기 배양된 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고,
형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비를 통해서, 바람직하게 50 ㎕/초 이하의 속도로 단계 b)에서 PCP에 도포된다.
2. 실시형태 1의 방법에서, 식물 세포 패키지를 제공하는 상기 단계는 다공성 지지체, 바람직하게 필터 상에서 적절한 양의 세포 덩이를 원심분리시키는 단계를 포함한다.
3. 실시형태 2의 방법에서, 상기 다공성 지지체는 1 ㎛ 내지 200 ㎛, 바람직하게 30 ㎛ 내지 40 ㎛의 평균 직경을 갖는 포어를 갖는다.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 다공성 지지체는 다중웰 필터 플레이트이다.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 PCP는 웰 당 0.5 ㎖ 이하의 액체, 바람직하게 웰 당 0.25 ㎖ 이하의 액체를 수용하는 다중-클러스터 플레이트에 제공된다.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 PCP는 바람직하게 0.1 g/㎤ 내지 0.9 g/㎤, 바람직하게 0.4 g/㎤ 내지 0.6 g/㎤의 질량 밀도를 갖는, 식물 세포의 조밀 패키지이다.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 PCP는 500g 내지 3500g, 바람직하게 1500g 내지 2000g에서 상기 배양된 세포를 원심분리시켜서 제공된다.
8. 실시형태 7의 방법에 있어서, 상기 원심분리는 적어도 15초, 바람직하게 적어도 30초 동안 수행된다.
9. 실시형태 7 또는 8의 방법에 있어서, 상기 원심분리는 15초 내지 10분 동안, 바람직하게 30초 내지 1분 동안 수행된다.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 고화 수단을 상기 배양된 식물 세포에 첨가하는 단계를 포함한다.
11. 실시형태 10의 방법에 있어서, 상기 고화 수단은 가요성 고화 수단, 바람직하게 셀룰로스-포함 섬유이고, 단계 a) 전에 배양된 식물 세포에 첨가된다.
12. 실시형태 10의 방법에서, 상기 고화 수단은 비가요성 고화 수단이고, 세포는 상기 비가요성 고화 수단에 투여된다.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 배양된 식물 세포는 단계 a) 전에 현탁 배양된다.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 배양된 식물 세포는 단계 a) 전에 25 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 바람직하게 75 g/ℓ 내지 100 g/ℓ의 습윤 질량 밀도를 갖는다.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 세포는 단계 a) 전에 300 g/ℓ 이하, 바람직하게 200 g/ℓ 이하의 습윤 질량 밀도로 농축된다.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 세포는 단계 a) 전에 10 g/ℓ 내지 50 g/ℓ의 사카로스, 바람직하게 15 g/ℓ 내지 35 g/ℓ의 사카로스, 보다 바람직하게 약 20 g/ℓ의 사카로스를 포함하는 배지에서 배양된다.
17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 세포는 단계 a) 전에 1 mM 내지 10 mM의 포스페이트 이온, 바람직하게 2 mM 내지 5 mM의 포스페이트 이온, 보다 바람직하게 약 2.7 mM의 포스페이트 이온을 포함하는 배지에서 배양된다.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 형질전환제는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드, 재조합 식물 바이러스, 및 재조합 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 재조합 박테리아이다.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 재조합 식물 바이러스는 비르가바이러스과, 포티바이러스과 및 제미니바이러스과의 바이러스과 중 하나의 구성원이고, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스, 담배 식각 바이러스, 또는 옥수수 줄무늬 바이러스이다.
20. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 재조합 박테리아는 리조비아과의 박테리아, 바람직하게 아그로박테리움 튜머파시엔스, 아그로박테리움 라디오박터 또는 리조비움 라디오박터이고, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101, 가장 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101: pMP90RK의 박테리아이다.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 방법에 있어서, 형질전환제를 포함하는 액체는 재조합 아그로박테리움 박테리아를 0.1 내지 1.5, 바람직하게 0.2 내지 1.0, 보다 바람직하게 0.3 내지 0.7, 가장 바람직하게 약 0.5의 600 nm에서 측정된 광학 밀도 (OD600)로 포함하는 수성 용액이다.
22. 실시형태 21의 방법에 있어서, 상기 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 방법에 의해서, 바람직하게 상기 아그로박테리움 박테리아를 배양하는 단계로부터 출발하는 모든 단계를 포함하여 완전 자동화 방법에 의해서 제공된다.
23. 실시형태 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이고 상기 배양된 식물 세포는 식물 세포 원형질체이다.
24. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 있어서, 인큐베이션 기간은 10분 내지 3시간, 바람직하게 30분 내지 60분이다.
25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 상기 단계는 상기 PCP를 500g 내지 3500g, 바람직하게 1500g 내지 2000g에서 원심분리시키는 단계를 포함한다.
26. 실시형태 25의 방법에 있어서, 상기 원심분리는 적어도 15초, 바람직하게 적어도 30초 동안 수행된다.
27. 실시형태 25 또는 26의 방법에 있어서, 상기 원심분리는 15초 내지 10분 동안, 바람직하게 30초 내지 1분 동안 수행된다.
28. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나의 방법에 있어서, 0.5 ㎖ 내지 2 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포되고, 바람직하게 1 ㎖ 내지 2 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포되며, 보다 바람직하게 약 1.5 ㎖의 형질전환제를 포함하는 액체가 PCP의 g 당 도포된다.
29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 c) 이후에, 상기 식물 세포는 PCP로서 적어도 12시간 동안, 바람직하게 적어도 1일 동안, 보다 바람직하게 적어도 2일 동안, 보다 더 바람직하게 적어도 5일 동안 인큐베이션된다.
30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 c) 이후에, 상기 식물 세포는 PCP로서 12시간 내지 3주 동안, 바람직하게 3일 내지 2주 동안, 보다 바람직하게 4일 내지 8일 동안, 가장 바람직하게 5일 또는 6일 동안 인큐베이션된다.
31. 실시형태 29 또는 30의 방법에 있어서, 상기 PCP는 형질전환이 일어나기에 적합한 조건 하에서 유지되고, 바람직하게 상기 PCP는 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 더 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 적어도 90% 습도의 대기, 및 20℃ 내지 35℃의 온도에서 유지되고, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 30℃이고, 가장 바람직하게는 약 26℃이다.
32. 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 c) 이후에 상기 배양된 식물 세포를 용해시키는 추가 단계, 바람직하게 상기 식물 세포를 용해 완충액을 통해 용해시키는 추가 단계를 더 포함한다.
33. 실시형태 32의 방법에 있어서, 상기 용해 완충액은 세제 및/또는 2가 마그네슘 양이온 (Mg2+)-킬레이트화제를 포함한다.
34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 형질전환은 일시적 형질전환이다.
35. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 완전 자동화 방법이다.
36. 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 a) 내지 c) 중 적어도 하나, 바람직하게 적어도 둘, 보다 바람직하게 모든 3개 단계는 자동화 장비에 의해 수행된다.
37. 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나의 방법에 있어서, 모든 단계는 자동화 장비에 의해 수행된다.
38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나의 방법에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포.
39. 고속대량 스크리닝을 위한 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포의 용도.
40. 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하기 위한 방법으로서,
a) 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 수득된 PCP를 제공하는 단계, 및
b) 형질전환이 일어나기에 적합한 조건 하에서 PCP를 인큐베이션시키는 단계,
c) PCP에 포함된 식물 세포를 용해시키는 단계, 및 그리하여,
d) 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하는 단계의 추가 단계들을 포함한다.
41. 실시형태 40에 따른 방법으로 수득되거나 또는 수득가능한 식물 세포 용해물.
42. 시험관 내에 세포-무함유 시스템에서 적어도 하나의 핵산 서열의 전사, 및 임의로는, 번역을 유발시키기 위한 방법으로서,
a) 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역에 필요한 세포 성분을 포함하는 세포-무함유 추출물을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 세포-무함유 추출물을 발현가능한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및 그리하여
c) 상기 핵산 서열의 전사, 및 임의로는 번역을 유발시키는 단계를 포함한다.
43. 실시형태 42의 방법에 있어서, 상기 단계 a) 및 b) 중 적어도 하나는 자동화 장비에 의해 수행된다.
44. 실시형태 42 또는 43의 방법에 있어서, 상기 세포-무함유 추출물은 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 수득된 식물 세포로부터 수득되었거나 또는 상기 세포-무함유 추출물은 실시형태 40에 따른 유전자이식 식물 세포의 용해물이다.
45. 실시형태 42 내지 44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 세포-무함유 추출물을 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하고/하거나, 상기 세포-무함유 추출물을 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 발현가능한 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
46. 전술된 실시형태 중 어느 하나의 주제에 있어서, 상기 식물 세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물, 보다 바람직하게 담배 (Nicotiana tabacum), 당근 (Daucus carota) 또는 밀 (Tricium aestivum)로부터 선택되는 세포이다.
도면 범례
도 1: A) 표시된 세포 구획을 표적으로 하는 DsRed-융합 구성체를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포로부터 주입 완충액 중 50 g L-1 수크로스를 사용하여 실시예에 기술된 바와 같이 수득된 식물 세포 추출물의 형광도. B) A)에 표시된 추출물의 형광도의 정량; 형광도는 각 웰에 대해 측정되었고 상응하는 웰에 대해 측정된 값은 평균내었으며; 변동 계수 (CV)가 표시되어 있으며; y-축: 임의 형광도 유닛 (AFU)의 평균 DsRed 형광도이다.
도 2: 주입 완충액 중 50 g L-1 수크로스를 사용하여 실시예 7에 따라 제조된 세포 및 추출물의 형광도의 정량. A) 평균 표면 형광도에 대한 형광도; B) 평균 추출물 형광도; 변동 계수 (CV)가 표시되어 있고; y-축: 임의 형광도 유닛 (AFU)의 평균 DsRed 형광도이다.
도 3: 주입 완충액 중 50 g L-1 수크로스를 사용하여 실시예 7에 따라 진공 또는 원심분리에 의해 생성된 니코티아나 타바컴 BY-2 PCP에서의 DsRed 형광도 패턴의 비교. PCP 절편의 DsRed (평행선 영역)는 형광 현미경 (530Ex/590Em)으로 가시화되었다.
도 4: 실시예 7에 따라 진공- 및 원심분리 생성된 PCP에서 DsRed 발현에 대한 주입 완충액 중 수크로스 농도의 영향. A. 주입 후 4일간 PCP의 표면 형광도 (559Ex/585Em, 
± SD, n=16). B. 주입 후 4일간 진공에 의해 생성된 PCP 중 DsRed 발현 지도, 평행선=발현, 회색=무발현. C. 주입 후 4일간 원심분리에 의해 생성된 PCP 중 DsRed 발현 지도.
다음의 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이다. 그들은 전혀 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 장치 및 제어
모든 파이펫팅 단계 및 플레이트 이동은 자동화 파이펫팅 스테이션 JANUS G3 (PerkinElmer)에 의해 수행되었다. 전달하려는 부피에 따라서, 적절한 1회용 팁 및 파이펫팅 매개변수를 선택하였다. 주변 장치 간 대조군 및 데이타 교환은 JANUS WinPREP 소프트웨어 (버전 5.1)에 의해 제공되었다. 부피 계산은 사용자 제공 스크립트에 의해 수행되었다.
실시예 2: PCP 주입을 위한 아그로박테리움 튜머파시엔스의 제조
모두 pTRA (Sack et al. (2015), Plant Biotechnol. J. 13: 1094)를 기반으로 하는, 식물 발현 벡터 pTRAc-rfp-H, pTRAc-rfp-ERH, pTRAc-rfp-AH 또는 pTRAc-TPrfp-H 중 하나를 보유하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101(pMP90RK) 세포는 6.0의 OD600 까지 2 mm의 진폭을 갖는 통합 회전 진탕기 상에서 1000 rpm으로, 96-웰 "딥-웰" 다중클러스터 플레이트에서, 웰당 500 ㎕의 PAM 배지 (대두 펩톤 20 g/ℓ; 효모 추출물 0.5 g/ℓ; 프룩토스 5 g/ℓ; 마그네슘 술페이트 (MgSO4) 1 g/ℓ, pH 7.0; 카르베니실린 (50 mg/ℓ) 및 카나마이신 (25 mg/ℓ) 첨가) 중에, 28℃에서 성장시켰다. 박테리아 세포를 1800g에서 4분 동안 펠렛화시켰고, 상청액은 폐기하였다. 펠렛을 200 ㎕의 멸균된 주입 완충액 (수크로스 50 g/ℓ; 글루코스 일수화물 2 g/ℓ; 0.5 g/ℓ Ferty 2 MEGA (Planta Dungemittel GmbH); 200 ㎛ 아세토시린곤; pH 5.6)중에, 1000 rpm 및 2 mm 진폭에서 8분 동안 재현탁시켰다. 1:20 희석물의 OD600 는 통합 플레이트 판독기를 통해 96-웰 플레이트에서 결정하였고, 개별 웰의 모든 박테리아 현탁액은 신선한 96웰 플레이트에 0.4의 OD600 로 정규화시켰다.
실시예 3: PCP의 생성
니코티아나 타바컴 BY-2는 무라시게 및 스쿠그 배지 (수크로스 20 g/ℓ; MS 염 (최소 유기물, Fa. Duchefa) 4.3 g/ℓ; KH2PO4 200 mg/ℓ; 미오-이노시톨 100 mg/ℓ; HCl-티아민 1 mg/ℓ; 2,4-디클로로페녹시아세트산 0.2 mg/ℓ, pH 5.0) 중에 26℃에서 80 g/ℓ의 습윤 질량 밀도에 도달할 때까지 연속 배양으로 성장시켰다. 2 ℓ의 배양물을 추출하여, 약 45분 동안 침강되게 두었고 배지를 디켄팅시켜서 200 g/ℓ ± 5%의 습윤 질량 밀도로 농축시켰다.
자성 교반기에 의해 일정한 교반 하에서 멸균 저장소로부터, 300 ㎕의 농축된 배양물을 Agroprep Advance PP/PE 30-40 ㎛ 필터 플레이트 (Fa. Pall)의 웰로 옮겼고 덮개를 덮었다. 플레이트를 통합 원심분리에 적재시켰고, 배지를 1800 x g에서 1분 동안 원심분리하여 제거하였으며 필터 플레이트에 저장소 플레이트를 깔아서 수집하였다.
실시예 4: 아그로박테리움 주입
실시예 3의 PCP에, 90 ㎕의 각각의 정규화된 아그로박테리움-현탁액을 점적한 후에, 60분 동안 22℃에서 인큐베이션시켰다. 그 이후에, 플레이트를 내부 원심분리기에 재적재하였고 1800 x g에서 1분 동안 원심분리하여 주입 용액을 제거하였다.
실시예 5: PCP의 인큐베이션
주입된 PCP를 갖는 필터 플레이트를 반전시켰고 72시간 동안 26℃ 및 80% 상대 습도에서 1-웰 "딥-웰" 저장소 상에서 인큐베이션시켰다. 저장소는 150 ㎖의 H2O로 충전시켰고 160 ㎤의 개방 공간을 가졌으며, 필터 플레이트 및 저장소 사이의 연결부는 기밀 밀봉시켰다.
실시예 6: PCP의 형광도 측정
인큐베이션 후에, PCP를 함유하는 필터 플레이트를 통합 플레이트 판독기로 옮겼고 PCP 중 DsRed 단백질의 형광도를 직접 측정하였다 (여기: 559 nm; 발광 585 nm). 그 이후에, 필터 플레이트는 사전제작된 중격 개방구를 구비한 실리콘/PTFE-mat (Webseal mat M115, Fa. Thermo Scientific)로 밀봉하였고 200 ㎕의 추출 완충액 (소듐 도데실술페이트 1 g/ℓ; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 50 mM; pH 8.0)을 각 웰에 첨가하였다.
용해를 위해서, 필터 플레이트는 통합 회전식 진탕기 상에, 65℃에서 30분 동안 2 mm 진폭으로 800 rpm에서 유지시켰다. 용해 이후에, 필터 플레이트는 통합 원심분리기로 옮겼고 1800 x g에서 1분 동안 원심분리시켰고, 용해물은 필터 플레이트 아래에 둔 96웰 플레이트에 회수하였다. 회수된 추출물을 사용해, 형광도 측정은 상기 기술된 바와 같이 수행하였으며, 결과는 도 1에 도시되어 있다.
실시예 7: 배지 제거 방법의 비교
연속적으로 배양된 BY-2 세포를 200 g의 신선한 생물량/ℓ로 농축시켰고 300 ㎕의 세포 현탁액을 멸균된 Agroprep Advance PP/PE 30-40 ㎛ 필터 플레이트 (Pall GmbH, Dreieich, Germany)로 옮겼다. 과량의 배지는 1800 rcf에서 1분 동안 원심분리하거나 또는 ∼10초 동안 chromabond 진공 매니폴드 (Macherey-Nagel, Duren, Germany) 상에서 800 mbar의 진공을 인가하여 제거하였다.
PAM 액체 배지 (카르베니실린 50 ㎍/㎖, 카나마이신 25 ㎍/㎖)에서 성장시킨아그로박테리움 튜머파시엔스 세포를 재현탁시켰고 1x 주입 완충액 (0.5 g/ℓ 비료 MEGA2, 50 - 100 g/ℓ 수크로스, 2 g/ℓ 글루코스 일수화물, 200 μM 아세토시린곤) 중에 0.4의 OD600nm로 조정하였으며 100 ㎕를 각각의 PCP 상에 적가하고, 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에 상기 기술된 바와 같이 원심분리 또는 진공에 의해 제거하였다.
플레이트는 모서리를 밀봉한 1개 웰의 딥웰 플레이트 상에 150 ㎖ H2O에서 반전시켰고 3일 동안 26℃ 및 80% 상대 습도 (RH)에서 인큐베이션시켰다.
PCP의 표면 형광도 및 이후에 비드밀 (MM 300, Retsch GmbH, Han, Germany)을 사용하여 추출 완충액(40 mM 디소듐 히드로겐 포스페이트, 10 mM 소듐 디히드로겐 포스페이트, 10 mM 소듐 메타비술파이트; 생물량 그램 당 3 ㎖) 중에서 기계적 용해를 통해 생성시킨 추출물의 형광도는 웰 중심 당 3회 판독으로 559nm (여기) / 585nm (발광)에서 측정하였다.
약 0.5-1 mm 두께의 절편을 PCP로부터 절단하였다. PCP 절편 중 DsRed 발현의 국재화는 형광 현미경을 통해 530nm (여기) / 590 nm (발광)에서 가시화시켰다.
결과: PCP의 평균낸 표면 형광도 (n=5)는 진공 또는 원심분리에 의해 생성된 PCP에 대해서 시토졸 (∼2700 임의 형광도 유닛 (AFU)) 및 분비형 (∼1100 AFU) 적색 형광 단백질 (rfp)의 유사한 발현 수준을 보였다. 그러나, 진공에 의해 생성된 PCP의 변동 계수 (CV) 경우에 진공 생성된 PCP와 비교하여 시토졸 rfp의 경우에 ∼2배 더 높았고 분비형 rfp의 경우에 ∼2배 더 낮았다 (도 2A).
원심분리에 의해 생성된 PCP의 평균낸 추출물 형광도는 진공 방법과 비교하여 시토졸 (∼3200 AFU) 및 분비형 (∼1000 AFU) rfp 둘 모두의 경우에 ∼2배 더 높았다. 원심분리에 의해 생성된 PCP의 CV는 각각 시토졸의 경우에 ∼4배 더 낮았고 분비형 rfp의 경우에 ∼2배 더 낮았다 (5.4%, 4.9%, 도 2B).
진공에 의해 생성된 PCP 중에 590 nm에서의 형광도는 주로 PCP의 표면 상에서 검출되었고, 그에 반해 진공에 의해 생성된 PCP는 PCP의 전체 몸체 전반에서 형광도를 보였다 (도 3).
이것은 원심분리 기반 방법의 경우 전체 PCP 전반에서 더 높고 보다 균질한 재조합 단백질 발현을 의미하는데 반해, 진공에 의해 생성된 PCP는 주로 오직 PCP의 표면에서만 비슷하게 높은 발현 수준을 보인다.
원심분리에 의해 생성된 PCP는 주입 완충액 중 60 g L-1의 수크로스 농도에서 붕괴되기 시작하였고 (도 4A), 그 결과로 4일의 인큐베이션 이후에 농도 >70 g L-1 수크로스에서 검출가능한 DsRed 발현이 없었고 샘플간 변동이 컸다 (변동 계수 >70%) (도 4B). 진공에 의해 생성된 PCP는 90 g L-1의 수크로스 농도까지 온전하고 균질하게 발현된 재조합 DsRed 단백질이 남아있었다 (도 4 A, C).
Claims (18)
- 배양된 식물 세포의 형질전환을 위한 방법으로서,
a) 형질전환시키려는 배양된 식물 세포의 식물 세포 패키지 (PCP)를 제공하는 단계,
b) 인큐베이션 기간 동안 상기 PCP를 형질전환제를 포함하는 액체와 접촉시키는 단계,
c) 상기 형질전환제를 포함하는 액체를 제거하는 단계; 및, 그리하여,
d) 상기 배양된 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고,
형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 장비에 의해, 바람직하게 50 ㎕/초 이하의 속도로 단계 b)에서 PCP에 도포되는 것인 형질전환 방법. - 제1항에 있어서, 상기 식물 세포 패키지를 제공하는 단계는 다공성 지지체, 바람직하게 필터 상에서 적절한 양의 세포 덩이를 원심분리시키는 단계를 포함하는 것인 형질전환 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다공성 지지체는 바람직하게 30 ㎛ 내지 40 ㎛의 평균 직경의 포어를 갖는 다중웰 필터 플레이트인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCP는 바람직하게 0.1 g/㎤ 내지 0.9 g/㎤, 바람직하게 0.4 g/㎤ 내지 0.6 g/㎤의 질량 밀도를 갖는, 식물 세포의 조밀 패키지인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양된 식물 세포에 고화 수단을 첨가하는 단계를 포함하는 것인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 10 g/ℓ 내지 50 g/ℓ의 사카로스, 바람직하게 15 g/ℓ 내지 35 g/ℓ의 사카로스, 보다 바람직하게 약 20 g/ℓ의 사카로스를 포함하는 배지에서 단계 a) 전에 배양되는 것인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1 mM 내지 10 mM의 포스페이트 이온, 바람직하게 2 mM 내지 5 mM의 포스페이트 이온, 보다 바람직하게 약 2.7 mM의 포스페이트 이온을 포함하는 배지에서 단계 a) 전에 배양되는 것인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환제는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드, 재조합 식물 바이러스, 및 재조합 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 재조합 박테리아인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 박테리아는 리조비아과 (Rhizobiaceae)의 박테리아, 바람직하게 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter) 또는 리조비움 라디오박터 (Rhizobium radiobacter)이고, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101, 가장 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 GV3101: pMP90RK의 박테리아인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환제를 포함하는 액체는 자동화 방법, 바람직하게 상기 아그로박테리움 박테리아를 배양하는 단계로부터 출발하는 모든 단계를 포함하여 완전 자동화 방법에 의해 제공되는 것인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환은 일시적 형질전환인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 완전 자동화 방법인 형질전환 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포.
- 고속대량 스크리닝을 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득되거나 또는 수득가능한 형질전환된 식물 세포의 용도.
- 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하기 위한 방법으로서,
a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득되는 PCP를 제공하는 단계, 및
b) 형질전환이 일어나기에 적합한 조건 하에서 PCP를 인큐베이션시키는 단계,
c) PCP에 포함된 식물 세포를 용해시키는 단계, 및 그리하여,
d) 형질전환된 식물 세포의 용해물을 제공하는 단계의 추가 단계들을 포함하는 것인 제공 방법. - 시험관 내에 세포-무함유 시스템에서 적어도 하나의 핵산 서열의 전사, 및 임의로는, 번역을 유발시키기 위한 방법으로서,
a) 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역에 필요한 세포 성분들을 포함하는 세포-무함유 추출물을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 세포-무함유 추출물을 발현가능한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및 그리하여
c) 상기 핵산 서열의 전사, 및 임의로는, 번역을 유발시키는 단계
를 포함하고,
상기 세포-무함유 추출물은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득되는 식물 세포로부터 수득되었거나 또는 상기 세포-무함유 추출물은 제13항에 따른 형질전환된 식물 세포의 용해물인 것인 유발 방법. - 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포-무함유 추출물을 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하고/하거나, 상기 세포-무함유 추출물을 이종성 RNA 중합효소, 바람직하게 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 발현가능한 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 유발 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물, 보다 바람직하게 담배 (니코티아나 타바컴 (Nicotiana tabacum)), 당근 (다우커스 카로타 (Daucus carota)) 또는 밀 (트리시움 애스티범 (Tricium aestivum))로부터 선택되는 세포인 방법.
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