CN101978064A - 具有改变的生长和/或发育的植物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码UBP15亚家族的泛素特异性蛋白酶(UBP)或其同源物的核酸在植物中的表达改变植物生长和/或发育的多个方面的方法。本发明还涉及具有编码UBP15或其同源物的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其它对照植物具有改变的生长和/或发育。本发明还提供了用于本发明方法的构建体。

Description

具有改变的生长和/或发育的植物及其生产方法
本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码UBP15亚家族的泛素特异性蛋白酶(UBP)或其同源物的核酸在植物中的表达来改变植物生长和/或发育的多个方面的方法。本发明还涉及具有编码该UBP15多肽或其同源物的核酸调节的表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其它对照植物具有改变的生长和/或发育。本发明还提供用于本发明方法的构建体。
不断增长的世界人口和用于农业的耕地供应减少激发了提高农业效率的研究。用于农作物和园艺改良的常规手段利用选择育种技术来鉴定具有想要的特征的植物。然而，此类选择育种技术具有若干缺点，即这些技术通常是劳动密集型的并产生经常含有异源遗传组分的植物，所述异源遗传组分可能不总是产生从亲本植物传递的期望性状。分子生物学的进展已经允许人类来修饰动物和植物的种质。遗传改造植物需要分离并操纵遗传物质(通常是DNA或RNA的形式)，随后将遗传物质引入植物中。该技术具有向农作物或植物递送多种改良的经济、农学或园艺性状的能力。
目前已经发现可通过调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸在植物中的表达来改变植物生长和/或发育。
发明背景
泛素特异性蛋白酶(UBPs)是真核生物中的保守蛋白质家族，其在蛋白质去泛素化中起重要作用。泛素对蛋白质的共价修饰在不同细胞途径，如细胞周期进程、信号转导、转录调控、DNA修复、胁迫应答、内吞作用和程序性细胞死亡中起关键作用(Hochstrasser，1996；Varshavsky，1997；Hershko和Ciechanover，1998；Weissman，2001；Pickart，2004)。蛋白质泛素化由三种酶的级联催化。泛素首先由与泛素C末端形成硫酯键的泛素激活酶(E1)激活。然后泛素转移到泛素缀合酶(E2)上。尽管一些E2可在泛素连接酶(E3s)的帮助下催化泛素C末端连接靶蛋白的赖氨酸残基，但其它E2在靶向底物之前将其缀合的泛素转移到E3上。靶底物蛋白质通过泛素C末端经几个可能的连接连续缀合到前一个泛素的赖氨酸残基上被单泛素化或多泛素化。泛素化底物蛋白质的命运部分依赖于缀合泛素的数量和泛素链中连接的方式。最常见的泛素化是Lys48连接的多泛素链(泛素数量＞＝4)，Lys48作为26S蛋白酶体蛋白质降解的信号。
泛素通过去泛素化酶(DUBs)从蛋白质上的切割也可影响泛素化底物蛋白质的活性和命运(Wilkinson，1997；Amerik和Hochstrasser，2004；Crosas等，2006；Hanna等，2006)。那些DUB是特异性切割泛素之间的肽键或泛素C末端和共价附着多肽之间的肽键的蛋白酶。目前已知的DUB共同行使四种类型的基本生化功能：第一，它们从泛素前体(融合到核糖体蛋白质)和多聚泛素基因产物产生成熟泛素；第二，它们修复不适当泛素化的蛋白质；第三，它们从附着的底物蛋白质上切割泛素(链)；第四，从多泛素链上释放游离的泛素单体。最后三个功能伴随着泛素C末端Gly与靶蛋白质的Lys ε-氨基残基之间异肽键的切割。
半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶是DUB超家族的两个主要群体，而半胱氨酸蛋白酶在真核生物中最多(Nijman等，2005)。所有已知的金属蛋白酶具有负责催化活性的JAMM结构域(Verma等，2002)。半胱氨酸蛋白酶DUB基于泛素蛋白酶催化中心结构和组织可进一步分成四个家族(Wilkinson，1997；Amerik和Hochstrasser，2004；Nijman等，2005)。泛素特异性蛋白酶(UBP，或在哺乳动物中定义的USP)在高度保守的半胱氨酸盒和组氨酸盒中具有催化三联体残基(Hu等，2002)。在两个保守的半胱氨酸和组氨酸盒中具有相似的催化三联体残基(Johnston等，1997；Johnston等，1999)的泛素C末端水解酶(UCHs)具有更小的总蛋白大小以及催化表面上的结构阻碍，以限定其仅水解泛素C末端小的酰胺和酯类的能力(Amerik和Hochstrasser，2004)。卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)在半胱氨酸和组氨酸盒中具有与上述两个家族相当的催化三联体，但含有OUT相关基序，并被认为是UBP家族的一部分(Balakirev等，2003；Nanao等，2004)。最后，马-约病蛋白结构域蛋白酶(MJDs)具有半胱氨酸和组氨酸盒样结构域，但与其它三组具有相当低的序列相似性(Burnett等，2003；Scheel等，2003)。UBP家族组成了大量的半胱氨酸蛋白酶。在BUP家族中发现了所有四种类型的上述DUB生化功能，而UCH仅在小的蛋白质和泛素前体上行使其功能。
在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，完整测序基因组的计算机(in silico)分析基于保守Cys和His盒的存在揭示了共27种UBPs；这27种UBPs可进一步分成14个亚家族(Yan等，2000)。前面报道显示UBP3和UBP4组成了一个亚家族，在体外具有UBP活性，并存在于细胞核中(Chandler等，1997；Rao-Naik等，2000)。另一成员UBP5在体外也显示具有去泛素化活性(Rao-Naik等，2000)。报道了另一亚家族成员UBP1和UBP2的遗传分析为氨基酸类似物刀豆氨酸的抗性所需(Yan等，2000)。此外，UBP14的功能缺失突变显示在早期胚胎发育中是致死的(Doelling等，2001)。
发明概述
令人惊奇的是，目前已经发现调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸的表达赋予了植物相比于对照植物改变的生长和/或发育。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物改变植物的生长和/或发育的方法，其包括调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸在植物中的表达。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，并指通过肽键连接在一起的任何长度聚合形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中互换使用，并指任何长度聚合的未分支形式的核苷酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。
对照植物
合适对照植物的选择是实验方案的例行部分，并可包括相应的野生型植物或没有目的基因的相应植物。对照植物通常是与待评估植物相同的植物种类或甚至是与其相同的品种。对照植物还可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而丢失转基因的个体。如本文所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括相对于讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并与其来源的未修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。
缺失指从蛋白质中去除的一个或更多氨基酸。
插入指一个或更多氨基酸残基引入到蛋白质中预定位置上。插入可包含N末端和/或C末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般地，氨基酸序列内的插入比N末端或C末端融合小约1到10个残基。N末端和/或C末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活子的结合域或激活域、噬菌体外壳蛋白、组氨酸-6-标签、谷胱甘肽S转移酶标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG
Figure BPA00001213049700041
表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
替换指蛋白质氨基酸用具有相似性质(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其它氨基酸替换。氨基酸替换通常是单个残基的替换，但根据置于多肽上的功能限制可以是成簇的；插入一般是大约1到10个氨基酸残基的插入。氨基酸替换优选保守氨基酸替换。保守替换表为本领域所熟知(参阅例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(编辑)以及下文的表A)。
表A：保守氨基酸替换的实例
  残基   保守替换   残基   保守替换
  Ala   Ser   Leu   Ile；Val
  Arg   Lys   Lys   Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met   Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe   Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser   Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr   Ser；Val
  Glu   Asp   Trp   Tyr
  Gly   Pro   Tyr   Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val   Ile；Leu
  Ile   Leu，Val
可使用本领域所熟知的肽合成技术，如固相肽合成等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸替换、缺失和/或插入。用于操作DNA序列以产生蛋白质替换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。例如，用于在DNA预定位点产生替换突变的技术为本领域技术人员所熟知，并包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
衍生物
“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，其相比于天然发生形式蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列，包含氨基酸用非天然发生氨基酸残基的替换，或非天然发生氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，其相比于天然发生形式多肽的氨基酸序列包含天然发生的改变的(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物相比于其来源氨基酸序列还可包含一个或更多氨基酸替换或添加，例如共价或非共价结合的氨基酸序列的报告分子或其它配体(如结合以利于其检测的报告分子)，和相对于天然发生蛋白质的氨基酸序列的非天然发生氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然发生形式蛋白质与标签肽，如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合(对于标签肽的综述，参阅Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包括用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是通过祖先基因复制来源的同一物种内的基因；直向同源物是来自通过物种形成的不同生物的基因，并也来自共同的祖先基因。
结构域
术语“结构域”指沿进化相关蛋白质序列比对的特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其它位置上的氨基酸在同源物之间不同，特定位置上高度保守的氨基酸表示很可能在蛋白质结构、稳定性或功能上至关重要的氨基酸。通过其在蛋白质同源物家族比对序列中的高度保守鉴定，它们可用作确定讨论的任何多肽是否属于前面鉴定的多肽家族的标志。
基序/共有序列/标记
术语“基序”或“共有序列”或“标记”指进化上相关蛋白质序列中短的保守区域。基序通常是结构域的高度保守部分，但也可包括结构域的仅部分，或可定位在保守结构域之外(如果基序的所有氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文定义的术语“杂交”是其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可完全在溶液中发生，即两条互补核酸在溶液中。杂交过程也可与固定在基质，如磁珠、Sepharose珠或任何其它树脂上的互补核酸进行。杂交过程还可与固定在固相支持体，如硝基纤维素或尼龙膜上的或通过例如光刻固定到含硅玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)的一条互补核酸进行。为了允许杂交进行，核酸分子一般通过热或化学变性以熔解双链成为两条单链和/或从单链核酸中去除发夹结构或其它二级结构。
术语“严格性”指发生杂交的条件。杂交的严格性受如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组分等条件的影响。一般地，在确定的离子强度和pH下对特定序列选择低于解链温度(Tm)约30℃的低严格条件。中严格条件是温度低于Tm 20℃，高严格条件是温度低于Tm的10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高度序列相似性的杂交序列。然而，核酸可在序列上有偏差，但由于遗传密码的简并性仍然编码基本相同的多肽。因此，有时候需要中等严格杂交条件来鉴定此类核酸分子。
Tm是确定的离子强度和pH下的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm依赖于溶液条件和碱基组成以及探针长度。例如，更长的序列在更高温度下特异性杂交。从低于Tm约16℃高至32℃获得杂交的最大速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，由此促进杂合体形成；该效应在高达0.4M的钠浓度下可见(对于更高的浓度，该效应可忽略)。每百分之一的甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的熔解温度0.6到0.7℃，并且加入50％甲酰胺允许杂交在30到45℃下进行，尽管杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。平均起来对大的探针而言，Tm每％碱基错配降低约1。可使用以下方程式根据杂合体类型计算Tm：
1)DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂合体：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(In)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(In)
a或对于其它一价阳离子，但仅在0.01-0.4M范围内准确。
b仅在30％到75％范围内对％GC准确。
cL＝碱基对中双链体的长度。
d寡聚物，寡核苷酸；In＝引物的有效长度＝2×(G/C的数量)+(A/T的数量)。
可使用许多已知技术中的任何一种，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中加入异源RNA、DNA和SDS，并用RNA酶进行处理来控制非特异性结合。对于非同源探针，可通过改变以下中的一种(i)渐进性降低退火温度(例如从68℃到42℃)或(ii)渐进性降低甲酰胺浓度(例如从50％到0％)进行一系列杂交。技术人员知道可在杂交过程中改变并且维持或改变杂交条件的多种参数。
除了杂交条件，杂交的特异性通常也依赖于杂交后洗涤的功能。为了去除因非特异性杂交引起的背景，用稀盐溶液洗涤样品。该洗涤的临界因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，洗涤严格性就越高。洗涤情况通常在杂交严格性下或低于杂交严格性下进行。阳性杂交产生至少两倍背景的信号。一般地，如上文描述了用于核酸杂交测定或基因扩增检测方法的合适的严格条件。也可选择更高或更低的严格条件。技术人员知道可在洗涤过程中改变和维持或改变严格条件的多个参数。
例如，用于长于50个核苷酸的DNA杂合体的典型高严格杂交条件包括在1x SSC中65℃下或在1x SSC和50％甲酰胺中42℃下的杂交，随后在0.3x SSC中65℃下洗涤。用于长于50个核苷酸的DNA杂合体的中等严格杂交条件的实例包括在4x SSC中50℃下或在6x SSC和50％甲酰胺中40℃下杂交，然后在2x SSC中50℃下洗涤。杂合体长度是用于杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来测定杂合体的长度。1x SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可额外地包括5x Denhardt′s试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989及每年的更新资料)。
剪接变体
如本文所用的术语“剪接变体”包括核酸序列的变体，其中已经切除、替换、移位或添加了所选的内含子和/或外显子，或其中已经缩短或加长了内含子。此类变体是其中蛋白质生物活性基本保留的变体；这可通过选择性保留蛋白质的功能区段来完成。此类剪接变体可见于自然界中或可以是人造的。用于预测并分离此类剪接变体的方法为本领域所熟知(参阅例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是定位在同一染色体位置上给定基因的可选形式。等位变体包括单核苷酸多态性(SNPs)，以及小的插入/缺失多态性(INDELs)。INDELs的大小一般少于100bp。SNPs和INDELs在大多数生物体的天然发生多态性株系中形成了最大一组序列变体。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由DNA改组后跟适当的筛选和/或选择的重复组成，以产生编码具有改变的生物活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中均互换使用，并在宽泛上下文中指能够实现其连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”通常指定位在基因转录起始上游的核酸控制序列，并且其参与识别并结合RNA聚合酶和其它蛋白质，由此指导有效连接的核酸的转录。上述术语包括来自典型真核基因组基因的转录调节序列(包括准确的转录起始所需的TATA盒，有或没有CCAAT盒序列)和额外的调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默基因)，其响应发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达。该术语中还包括典型的原核基因的转录调节序列，在该情况下其可包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中的核酸分子表达。
“植物启动子”包含调节元件，其介导植物细胞中编码序列区段的表达。因此，植物启动子不需要是植物来源，而是可来源于病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可来源于植物细胞，例如来自转化有待在本文所述本发明方法中表达的核酸序列的植物。这还应用于其它“植物”调节信号，如“植物”终止子。通过一个或更多核苷酸替换、插入和/或缺失修饰用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游，而不干扰任一启动子、可读框(ORF)或3′-调节区(如终止子)或远离ORF的其它3′调节区的功能或活性。还可能的是通过修饰其序列可增强启动子的活性，或者用更具活性的启动子，甚至来自异源生物的启动子完全替换它们。对于在植物中的表达，如上述，核酸分子必须有效连接或包含合适的启动子，其在正确时间点上并以需要的空间表达模式及时表达基因。
为了鉴定功能等同的启动子，例如通过将启动子有效连接到报告基因上并在植物的多个组织中测定报告基因的表达水平和模式来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。合适的众所周知的报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测定β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子的活性。然后可将启动子强度和/或表达模式与参考启动子(如在本发明方法中使用的启动子)的强度和/或表达模式进行比较。或者，可使用本领域已知的方法，例如Northern印记与放射自显影图的密度分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过比较用于本发明方法中的核酸的mRNA水平与管家基因如18S rRNA的mRNA水平测定启动子的强度。一般地，“弱启动子”表示驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”表示每个细胞约1/10,000转录物到约1/100,000转录物，到约1/500,0000转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或以每个细胞约1/10转录物到约1/100转录物到约1/1000转录物的水平表达。
有效连接
如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能连接，以便启动子序列能够起始目的基因的转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在大多数，但不必是全部生长和发育阶段中并在大多数环境条件下，在至少一个细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下文中的表B给出了组成型启动子的实例。
表B：组成型启动子的实例
Figure BPA00001213049700111
遍在启动子
遍在启动子在生物体的基本上所有组织或细胞中均有活性。
发育调节的启动子
发育调节的启动子在特定发育阶段或在经历发育变化的植物部分中有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子响应化学刺激(对于综述参阅Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激诱导或增强转录起始，或可以是“胁迫诱导型的”，即当植物暴露于多种胁迫条件下时被激活，或是“病原体诱导型的”，即当植物暴露于多种病原体时激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是在特定器官或组织，如叶、根、种子组织等中能够优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中有转录活性的启动子，基本上排除植物任何其它部分，但仍然允许在这些其它植物部分中有任何渗漏表达。能够在特定细胞中起始转录的启动子在本文中称为“细胞特异性的”。
种子特异性启动子是主要在种子组织中有转录活性的启动子，但不必限于种子组织(在渗漏表达的情况下)。种子特异性启动子在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可以是胚乳和/或糊粉和/或胚胎特异性的。
终止子
术语“终止子”包括控制序列，其为转录单位末端的DNA序列，并且用作初级转录物的3’加工和多腺苷酸化和转录终止的信号。终止子可来自天然基因，来自多种其它植物基因，或来自T-DNA。待加入的终止子可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或来自另一植物基因，或较不优选地来自任何其它真核基因。
调节
术语“调节”表示与表达或基因表达相关的过程，其中所述基因表达的表达水平相比于对照植物改变，表达水平可以升高或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何种类的表达，随后进行翻译。
表达
术语“表达”或“基因表达”表示一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其表示一个基因或多个基因或遗传构建体转录成为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
升高的表达/过表达
如本文所用的术语“升高的表达”或“过表达”表示原始野生型表达水平以外的任何形式的表达。
用于提高基因或基因产物表达的方法在本领域中得到了很好的记载，并包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。用作启动子或增强子元件的分离核酸可引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(通常是上游)中，以上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源启动子在体内通过突变、缺失和/或替换而改变(参阅US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或分离的启动子可以适当方向并远离本发明基因引入植物细胞中，以控制基因的表达。
如果希望多肽表达，一般希望在多核苷酸编码区3′-末端包括多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可来自天然基因，来自多种其它植物基因，或来自T-DNA。待加入的3′末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或来自另一植物基因，或较不优选地来自任何其它真核基因。
还可以向5′非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。已经显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包括可剪接内含子在mRNA和蛋白质水平上增加基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev 1：1183-1200)。当置于转录单位5′末端附近时，基因表达的这种内含子增强通常最高。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，以及Bronze-1内含子的使用为本领域所知。对于一般信息参阅：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot，编辑，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文的“内源”基因不仅指在植物中发现的正在讨论的天然形式(即没有任何人为介入)的基因，也指随后引入(重新引入)植物的分离形式的同一基因(或基本同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有该转基因的转基因植物可遭受转基因表达的重大降低和/或内源基因表达的重大降低。分离的基因可分离自生物体或可以是人造的，例如通过化学合成。
降低的表达
本文认为“降低的表达”或表达的“降低或基本消除”表示相对于对照植物，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性的降低。降低或基本消除优选相比于对照植物以优选性递增顺序为至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更高。
对于植物中内源基因表达的降低或基本消除，需要足够长的核酸序列的基本上邻近的核苷酸。为了进行基因沉默，这应该少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，或者这可以多到完整基因(包括部分或全部的5’和/或3’UTR)。基本上邻近的核苷酸序列可来自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上邻近的核苷酸序列能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上邻近的核苷酸序列与靶基因(有义链或反义链)具有以优选性递增顺序50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能)多肽的核酸序列不是本文讨论用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种降低或基本消除可使用常规工具和技术实现。用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是通过在植物中引入并表达遗传构建体，其中将核酸(在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码任何一个目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的基本邻近的核苷酸序列)作为反向重复(部分或完全)克隆到所述遗传构建体中，通过间隔区(非编码DNA)分开。
在该优选方法中，通过RNA介导的沉默使用核酸或其部分(在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸的基本邻近的核苷酸序列)，优选能够形成发夹结构的反向重复降低或基本消除内源基因的表达。将反向重复克隆到包含对照序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔区，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多聚接头等)定位在形成反向重复的两条反向核酸之间。反向重复转录后，形成(部分或完全)具有自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中的siRNAs。RISC进一步切割mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。对于更多一般细节参阅例如，Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明方法的执行不依赖于在植物中引入和表达遗传构建体，其中核酸作为反向重复序列克隆到该构建体中，但任何一种或多种众所周知的“基因沉默”方法可用于达到相同效果。
用于降低内源基因表达的一个此类方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在该情况下，植物中的沉默通过与靶内源基因基本相似的双链RNA序列(dsRNA)触发。该dsRNA进一步通过植物加工成约20到约26个核苷酸，称为短干扰RNAs(siRNAs)。siRNAs掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其切割内源靶基因的mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一实例涉及核酸序列或其部分(在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何一个核酸的基本邻近的核苷酸序列)以有义方向引入植物中。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因此至少一个拷贝的核酸序列将引物植物中。额外的核酸序列将降低内源基因的表达，产生称为共抑制的现象。如果几个额外拷贝的核酸序列引入植物中，那么基因表达的降低将更明显，因为在高转录物水平与共抑制触发之间存在正相关性。
RNA沉默方法的另一实例涉及使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可定位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。术语“非编码区”指在转录但不翻译成氨基酸的编码区侧翼的5′和3′序列(也称作5′和3′非翻译区)。
可根据Watson和Crick碱基配对原则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与完整的核酸序列(在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸的基本邻近核苷酸序列)互补，但也可以是仅与核酸序列(包括mRNA 5’和3’UTR)一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与编码多肽的mRNA转录物翻译起始位点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度为本领域所知，并且长度可从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少核苷酸开始。可使用化学合成和酶连接反应，使用本领域已知的方法构建本发明的反义核酸序列。例如，可使用天然发生的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学合成反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)，设计所述修饰核苷酸来增加分子的生物学稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例为本领域所熟知。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“帽化”以及类似物如次黄嘌呤核苷对一个或更多天然发生核苷酸的取代。核苷酸的其它修饰为本领域所熟知。
可使用其中已经以反义方向(即从插入的核酸转录的RNA将是目的靶核酸的反义方向)亚克隆了核酸序列的表达载体在生物学上产生反义核酸序列。优选地，通过包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的稳定整合的核酸构建体在植物中产生反义核酸序列。
在本发明方法中用于沉默的核酸分子(无论引入植物中或在原位产生)与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，由此例如通过抑制转录和/或翻译抑制蛋白质的表达。杂交可以是通过常规核苷酸互补性形成双链体，或例如，在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中特异的相互作用来形成稳定双链体。可通过转化或在特定组织位点上直接注射将反义核酸序列引入植物中。或者，可修饰反义核酸序列，以靶向所选细胞，然后全身施用。例如，对于全身施用，可修饰反义核酸序列，使得它们例如通过将反义核酸序列连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体上而特异性结合在所选细胞表面上表达的受体或抗原。也可使用本文描述的载体将反义核酸序列递送到细胞中。
根据另一方面，反义核酸序列是a-异头核酸序列。a-异头核酸序列与互补RNA形成特异性双链杂合体，与常见的b-单位相反，在所述互补RNA中，链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列还可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
也可使用核酶进行内源基因表达的降低或基本消除。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与其具有互补区的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如，锤头状核酶(描述于Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中))可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。可设计对核酸序列具有特异性的核酶(参阅例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。或者，对应于核酸序列的mRNA转录物可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。用于植物中基因沉默的核酶的用途为本领域所知(例如，Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
也可通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3)：357-62)、(Amplicon VIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)中所述的策略实现基因沉默。
如果在内源基因上有突变和/或在随后引入植物中的分离的基因/核酸上有突变，那么也可发生基因沉默。非功能多肽可引起降低或基本消除。例如，多肽可结合多种相互作用的蛋白质；一个或更多突变和/或截短因此可提供仍然能够结合相互作用蛋白质(如受体蛋白质)但不能显示其正常功能(如信号转导配体)的多肽。
用于基因沉默的另一方法是通过靶向与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列，以在靶细胞中形成防止基因转录的三螺旋结构。参阅Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992；和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
其它方法，如使用针对内源多肽的抗体抑制其在植物中的功能，或在多肽参与的信号途径中进行干扰为技术人员所熟知。具体而言，可以想像人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与的信号途径。
或者，可设置筛选程序来鉴定植物群体中基因的天然变体，所述变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可用于例如进行同源重组。
人造的和/或天然的微小RNAs(miRNAs)可用于敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNAs通常是19-24个核苷酸长的单链小RNA。它们主要调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微小RNAs(miRNAs)与其靶序列具有完全或近乎完全的互补性。然而，存在具有高达5个错配的天然靶标。它们通过切丁酶家族双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长非编码RNA加工得到。加工时，它们通过结合其主要组分Argonaute蛋白质掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。MiRNAs作为RISC的特异性组分起作用，因为它们在细胞质中与靶核酸，大多数情况下与mRNAs进行碱基配对。随后的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过表达的结果因此经常在靶基因的降低的mRNA水平上得到反映。
可特异地遗传改造长度通常是21个核苷酸的人造微小RNA(amiRNAs)，以负调节单个或多个目的基因的表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素为本领域所熟知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且其可用于帮助设计特异性amiRNAs(Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005)。公众也可获得用于设计并产生amiRNAs及其前体的便利工具(Schwab等，Plant Cell 18，1121-1133，2006)。
对于最佳操作，用于在植物中降低内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列来转化单子叶植物，来自双子叶植物的核酸序列来转化双子叶植物。优选地，来自任何给定植物种类的核酸序列引入同一物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列不是绝对需要来源于与其引入的植物相同的植物种类。内源靶基因和待引入核酸之间具有基本同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本消除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域的技术人员将容易地能够调整上述方法用于沉默，以通过例如使用适当启动子实现整株植物或其部分中内源基因表达的降低。
选择标记(基因)/报告基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，在所述细胞中其表达以利于鉴定和/或选择转染或转化有本发明核酸构建体的细胞。这些标记基因使得能够鉴定核酸分子通过一系列不同原理的成功转移。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可见选择。选择标记基因的实例包括赋予对抗生素(如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素抗性的基因)、除草剂(例如提供对Basta
Figure BPA00001213049700191
抗性的bar；提供针对草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺酰脲类抗性的基因)，或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或用于利用木糖的木糖异构酶或抗营养物标记，如对2-脱氧葡萄糖的抗性)抗性的基因。可见标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶以及其有色的底物，例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白、GFP及其衍生物)的形成。该列表仅代表了少量可能的标记。技术人员熟悉这些标记。根据生物体和选择方法优选不同的标记。
已知稳定或瞬时整合核酸到植物细胞中后，仅少数细胞吸收外源DNA，并且需要时，根据所用的表达载体和所用的转染技术将其整合到细胞基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，编码选择标记(如上文描述的标记)的基因一般与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记例如可用于突变体中，所述突变体中例如通过常规方法缺失这些基因而使得其没有功能。此外，编码选择标记的核酸分子可引入宿主细胞中位于包含编码本发明多肽的序列的同一载体上，或用于本发明的方法中，或在分开的载体中。例如通过选择可鉴定已经稳定转染了引入的核酸的细胞(例如，已经整合了选择标记的细胞存活，而其它细胞死亡)。
一旦核酸已经成功引入，转基因宿主细胞中不再需要或不想要标记基因，特别是对抗生素和除草剂具有抗性的基因，用于引入核酸的本发明方法有利地使用使得能够去除或切除这些标记基因的技术。一种该方法是称为共转化的方法。共转化方法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸，第二种载体携带标记基因。大部分转化体接受，或在植物情况下包含(高达40％或更多的转化体)两种载体。在用农杆菌(Agrobacteria)转化的情况下，转化体一般仅接受部分载体，即在T-DNA侧翼的序列，其一般代表表达盒。然后可通过进行杂交从转化的植物中去除标记基因。在另一方法中，整合到转座子中的标记基因用于与想要的核酸一起转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶源杂交，或转化体可瞬时或稳定转化赋予转座酶表达的核酸构建体。在一些情况下(约10％)，一旦转化成功发生，转座子就跳出宿主细胞的基因组，并丢失。在其它情况下，转座子跳到不同位置上。在这些情况下，必须通过进行杂交去除标记基因。在微生物学中，发展了可能或利于检测此类事件的技术。其它有利的方法依赖于称为重组系统的系统；其优势在于可免除通过杂交去除。这种类型的最佳的已知系统是称为Cre/lox的系统。Cre1是去除定位在loxP序列之间的序列的重组酶。如果标记基因整合到loxP序列之间，一旦转化成功发生了，其通过表达重组酶被去除。其它的重组系统是HIN/HIX，FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。本发明核酸序列位点特异性整合到植物基因组中是可能的。天然地，这些方法也可应用于微生物，如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组的
为了本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”表示例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体，或转化有本发明核酸序列、表达盒或载体的生物体，所有那些构建由重组方法产生，在所述方法中
(a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或
(b)有效连接本发明核酸序列的遗传对照序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不位于其天然遗传环境中，或已经通过重组方法修饰，修饰可以采取例如替换、添加、缺失、倒置或插入一个或更多核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为表示原始植物中的天然基因组或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。环境位于核酸序列至少一侧并具有至少50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。当该表达盒通过非天然的合成(“人造”)方法，例如诱变处理进行修饰时，天然发生的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与如上述编码用于本发明方法的多肽的相应核酸序列的天然的组合-变成了转基因表达盒。合适的方法描述于例如US 5,565,350或WO 00/15815中。
用于本发明目的的转基因植物因此理解为如上用于本发明方法的核酸不在所述植物基因组中其天然基因座上，核酸可能同源表达或异源表达。然而，如上提及，转基因还表示尽管本发明的核酸或用于本发明方法中的核酸位于植物基因组中其天然位置，序列关于天然序列已经被修饰了，和/或天然序列的调节序列已经被修饰了。转基因优选理解为指本发明的核酸在基因组中非天然基因座上的表达，即发生核酸的同源，或优选异源表达。在本文中提及了优选的转基因植物。
转化
本文涉及的术语“引入”或“转化”包括外源多核苷酸转移到宿主细胞中，不考虑用于转移的方法。可用本发明的遗传构建体转化能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织，并且从其可再生整株植物。选择的特定组织根据转化的特定物种可得到的并最适合的克隆繁殖系统而变化。示例性组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可瞬时或稳定引入宿主细胞中，或可例如作为质粒非整合地维持。或者，其可整合到宿主基因组中。所得的转化植物细胞然后可用于以本领域技术人员已知的方式再生转化的植物。
外源基因转移到植物的基因组中称为转化。植物物种的转化目前是十分常规的技术。有利地，几种转化方法中的任何一种均可用于向合适的祖先细胞中引入目的基因。可以利用描述用于从植物组织或植物细胞转化并再生植物的方法来瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学试剂、直接将DNA注射到植物中、基因枪轰击、使用病毒或花粉转化和显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的颗粒轰击(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)；用(非整合)病毒感染等。优选通过农杆菌介导的转化产生转基因植物，包括转基因农作物。有利的转化方法是植物中的转化。为此，例如可以允许农杆菌在植物种子上作用或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明已经证明了尤其便利的是允许转化农杆菌的悬浮液作用于完整植物或至少花原基。植物随后生长直至获得处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导转化稻的方法包括众所周知用于稻转化的方法，如在任何以下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985 A1、Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文引入作为参考，如同完全阐明一样。在玉米转化的情况下，在Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)中描述了优选的方法，其公开内容在本文引入作为参考，如同完全阐明一样。例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述了所述方法。待表达的核酸或构建体优选克隆到载体中，其适合于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由该载体转化的农杆菌然后以已知方式(例如通过在农杆菌溶液中进入有伤痕的叶片或剁碎的叶片，然后在合适培养基中培养它们)用于转化植物，如作为模型的植物，像拟南芥(拟南芥在本发明范围内，但不认为其是农作物)，或农作物，如烟草植物。通过根癌农杆菌转化植物例如由
Figure BPA00001213049700231
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或尤其在F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中已知。
除了转化体细胞(其然后再生成完整植株)，还可以转化植物分生组织的细胞，尤其是发育成配子的那些细胞。在该情况下，转化的配子遵循天然植物发育，产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从特定部分被转化因此是转基因的发育植物中获得种子[Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992).C Koncz，N-H Chua和J Shell，eds，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复去除花序并将莲座叶中间的切除部位与转化的农杆菌温育，由此在稍晚时间点上获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是具有修饰的真空渗入方法，如“花浸”法。在真空渗入拟南芥的情况下，用农杆菌悬浮液处理减压下的完整植株[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸”法的情况下，发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬浮液短暂地温育[Clough，SJ和Bent AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获特定比例的转基因种子，并且这些种子与非转基因种子通过上述选择条件下生长区分开。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体为母系遗传的，大多数农作物降低或消除了转基因随花粉流动的风险。一般通过Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中概要展示的方法完成叶绿体基因组的转化。简言之，待转化的序列与选择标记基因一起克隆到与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导向原质体系中的位点特异性整合。已经对许多不同植物物种描述了质体转化，并在Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001 Sep 21；312(3)：425-38或Maliga，P(2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28中给出了综述。目前已经以无标记转化体的形式报道了其它生物技术进展，所述转化体可通过瞬时共整合标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA激活标签
T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括插入T-DNA，其一般在目的基因基因组区域或基因编码区上游或下游10kb处含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)，处于使得启动子指导靶基因表达的构型。通常，其天然启动子对靶基因表达的调节被破坏，并且所述基因落入新引入的启动子的控制之下。启动子通常嵌入T-DNA中。该T-DNA例如通过农杆菌感染随机插入植物基因组内，并导致插入T-DNA附近的基因的修饰表达。所得转基因植物由于引入的启动子附近的基因修饰表达而显示显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组中定向诱导局部损伤”的缩写，并指用于产生和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING也允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体在强度或定位或时间选择(例如如果突变影响了启动子)上显示修饰的表达。这些突变体变体可以比天然形式的基因显示更高的活性。TILLING组合了高密度诱变与高通量筛选方法。TILLING中通常遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，编辑Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)Meyerowitz EM，Somerville CR，编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)J Martinez-Zapater，JSalinas，编辑，Methods on Molecular Biology，第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体DNA的制备和合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性并退火以允许异源双链体的形成；(e)DHPLC，其中在层析图中检测混合物中异源双链体的存在为额外峰；(f)鉴定突变体个体；和(g)对突变体PCR产物测序。用于TILLING的方法为本领域所熟知(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50中进行了综述)。
同源重组
同源重组允许在基因组明确选定的位置上引入所选的核酸。同源重组是生物科学中对低等生物如酵母或苔藓(Physcomitrella)常规使用的标准技术。不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)，还对农作物，例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)描述了用于在植物中进行同源重组的方法，并且存在不管靶生物体如何一般均可应用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
增加/提高/增强
术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，并在应用意义上表示与任何对照相比正在讨论的倍数高至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％。
植物
如本发明所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代、和植物部分，包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中各上述部分包含目的基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，其中各上述部分也包含目的基因/核酸。
特别用于本发明方法的植物包括所有植物，其属于绿色植物(Viridiplanta)超家族，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其选自包含以下的列表：槭属(Acer spp.)，猕猴桃属(Actinidia spp.)，黄葵属(Abelmoschus spp.)，剑麻(Agave sisalana)，冰草属(Agropyron spp.)，匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)，葱属(Allium spp.)，苋属(Amaranthus spp.)，Ammophila arenaria，菠萝(Ananas comosus)，番荔枝属(Annona spp.)，芹菜(Apium graveolens)，落花生属(Arachis spp)，木菠萝属(Artocarpus spp.)，石刁柏(Asparagus officinalis)，燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)，野燕麦(Avena fatua)，比赞燕麦(Avena byzantina)，Avena fatua var.sativa，杂种燕麦(Avena hybrida))，阳桃(Averrhoa carambola)，山白竹(Bambusa sp.)，冬瓜(Benincasa hispida)，Bertholletia excelsea，甜菜(Beta vulgaris)，芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)，芜青(Brassica rapa ssp.)[芸苔，油菜，萝卜])，Cadaba farinosa，野茶树(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，大麻(Cannabis sativa)，辣椒属(Capsicum spp.)，Carex elata，番木瓜(Carica papaya)，大花假虎刺(Carissa macrocarpa)，山核桃属(Carya spp.)，红花(Carthamus tinctorius)，栗属(Castanea spp.)，爪哇木棉(Ceiba pentandra)，缩叶菊苣(Cichorium endivia)，樟属(Cinnamomum spp.)，西瓜(Citrullus lanatus)，柑桔属(Citrus spp.)，椰子属(Cocos spp.)，咖啡属(Coffea spp.)，芋头(Colocasia esculenta)，可乐属(Cola spp.)，黄麻属(Corchorus sp.)，芫荽(Coriandrum sativum)，榛属(Corylus spp.)，山楂属(Crataegus spp.)，番红花(Crocus sativus)，南瓜属(Cucurbita spp.)，香瓜属(Cucumis spp.)，Cynara spp.，胡萝卜(Daucus carota)，山马蝗属(Desmodium spp.)，龙眼(Dimocarpus longan)，薯蓣属(Dioscorea spp.)，柿属(Diospyros spp.)，稗属(Echinochloa spp.)，油棕属(Elaeis)(例如油椰(Elaeis guineensis)，美洲油棕(Elaeis oleifera))，龙爪稷(Eleusine coracana)，蔗茅属(Erianthus sp.)，枇杷(Eriobotrya japonica)，桉树属(Eucalyptus sp.)，红仔果(Eugenia uniflora)，荞麦属(Fagopyrum spp.)，山毛榉属(Fagus spp.)，苇状羊茅(Festuca arundinacea)，无花果(Ficus carica)，金柑属(Fortunella spp.)，草莓属(Fragaria spp.)，银杏(Ginkgo biloba)，大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)，黄豆(Soja hispida)或Soja max)，陆地棉(Gossypium hirsutum)，向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))，萱草(Hemerocallis fulva)，木槿属(Hibiscus spp.)，大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))，甘薯(Ipomoea batatas)，核桃属(Juglans spp.)，莴苣(Lactuca sativa)，山黧豆属(Lathyrus spp.)，兵豆(Lens culinaris)，亚麻(Linum usitatissimum)，荔枝(Litchi chinensis)，莲属(Lotus spp.)，丝瓜(Luffa acutangula)，羽扇豆属(Lupinus spp.)，Luzula sylvatica，番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum)，番茄(Lycopersicon lycopersicum)，Lycopersicon pyriforme)，硬皮豆属(Macrotyloma spp.)，苹果属(Malus spp.)，凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)，曼密苹果(Mammea americana)，芒果(Mangifera indica)，木薯属(Manihot spp.)，人心果(Manilkara zapota)，紫花苜蓿(Medicago sativa)，草木犀属(Melilotus spp.)，薄荷属(Mentha spp.)，芒草(Miscanthus sinensis)，苦瓜属(Momordica spp.)，黑桑(Morus nigra)，芭蕉属(Musa spp.)，烟草属(Nicotiana spp.)，齐墩果属(Olea spp.)，仙人掌属(Opuntia spp.)，料豆属(Ornithopus spp.)，稻属(Oryza spp.)(例如稻(Oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia))，稷(Panicum miliaceum)，柳枝稷(Panicum virgatum)，鸡蛋果(Passiflora edulis)，欧洲防风(Pastinaca sativa)，狼尾草属(Pennisetum sp.)，鳄梨属(Persea spp.)，欧芹(Petroselinum crispum)，虉草(Phalaris arundinacea)，菜豆属(Phaseolus spp.)，梯牧草(Phleum pratense)，刺葵属(Phoenix spp.)，南方芦苇(Phragmites australis)，酸浆属(Physalis spp.)，松属(Pinus spp.)，阿月浑子(Pistacia vera)，豌豆属(Pisum spp.)，早熟禾属(Poa spp.)，杨属(Populus spp.)，牧豆树属(Prosopis spp.)，李属(Prunus spp.)，番石榴属(Psidium spp.)，石榴(Punica granatum)，西洋梨(Pyrus communis)，栎属(Quercus spp.)，萝卜(Raphanus sativus)，Rheum rhabarbarum，茶藨子属(Ribes spp.)，蓖麻(Ricinus communis)，悬钩子属(Rubus spp.)，甘蔗属(Saccharum spp.)，柳属(Salix sp.)，接骨木属(Sambucus spp.)，黑麦(Secale cereale)，胡麻属(Sesamum spp.)，白芥属(Sinapis sp.)，茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)，红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))，两色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜属(Spinacia spp.)，蒲桃属(Syzygium spp.)，万寿菊属(Tagetes spp.)，酸豆(Tamarindus indica)，可可(Theobroma cacao)，三叶草属(Trifolium spp.)，Triticosecale rimpaui，小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)，硬粒小麦(Triticum durum)，圆柱小麦(Triticum turgidum)，Triticum hybernum，马卡小麦(Triticum macha)，普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))，Tropaeolum minus，金莲花(Tropaeolum majus)，越桔属(Vaccinium spp.)，野豌豆属(Vicia spp.)，豇豆属(Vigna spp.)，香堇(Viola odorata)，葡萄属(Vitis spp.)，玉米(Zea mays)，Zizania palustris，枣属(Ziziphus spp.)，等等。
发明详述
令人惊奇的是，目前已经发现调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有改变的生长和/或发育的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了用于改变植物相对于对照植物生长/或发育的方法，其包括调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸在植物中的表达。
用于调节(优选增加)编码UBP15多肽或其同源物的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码UBP15多肽或其同源物的核酸。
认为下文参考的“用于本发明方法的蛋白质”表示如本文定义的UBP15亚家族的UBP多肽或其同源物。认为下文参考的“用于本发明方法的核酸”表示能够编码该UBP多肽的核酸。待引入植物(并因此用于实施本发明方法)的核酸是编码目前所述，下文也称为“UBP15核酸”或“UBP15基因”类型的蛋白质的任何核酸。
如本发明定义的“UBP15多肽”指包含以下各种的任何多肽：
(i)半胱氨酸盒(Cys盒)；和
(ii)组氨酸盒(His盒)；和
(iii)ZnMYND锌指结构域。
Cys和His盒是在称为UBP结构域的保守催化结构域中发现的两个十分保守的基序(参阅图1)。Cys盒和His盒包含催化性三联体残基(在Cys盒中的Cys，在His盒中的His和Asp/Asn)(Amerik和Hochstrasser，2004)。UBP结构域的长度在300到900个氨基酸之间变动，并且尽管有时候具有低的总序列保守性，但它们一般显示保守的三维结构。在UBP结构域中，Cys盒中的半胱氨酸在催化活性中起至关重要的作用，并且半胱氨酸中的特定突变可消除UBPs的去泛素化活性(Papa and Hochstrasser，1993；Chandler 等，1997；Rao-Naik等，2000；Yan等，2000；Baek等，2001；Doelling等，2001；Hanna等，2006)。
UBP15亚家族包括UBP15、UBP16、UBP17、UBP18和UBP19。该亚家族的成员及其同源物包含标志性的MYND类型的锌指结构域，其在哺乳动物中被报道为蛋白质-蛋白质相互作用结构域(Gross和McGinnis，1996；Lutterbach等，1998a；Lutterbach等，1998b；Masselink和Bernards，2000)。
UBP15亚家族成员间的遗传相互作用分析揭示UBP15和UBP16，而非UBP17具有功能冗余性，尽管UBP16和UBP17与UBP15等同相关。另一亚家族成员UBP19的突变导致胚胎致死性，而其最近相关成员UBP18的功能丧失却没有显示任何可见缺陷。
也可通过在UBP系统树，如图1中所示的树中包括查询序列来鉴定可用于进行本发明方法的UBP序列。UBP15多肽或其同源物将与UBP15亚家族而非任何其它亚家族聚类。
此外，UBP15多肽及其同源物在体外通常具有UBP活性。
用于本发明方法的UBP15多肽或其同源物通常与来自拟南芥的UBP15(SEQ ID NO：2)、UBP16(SEQ ID NO：4)、UBP17(SEQ ID NO：6)、UBP18(SEQ ID NO：8)或UBP19(SEQ ID NO：10)中的任何一个具有以优选性递增顺序至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总序列同一性。可使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选施用默认参数测定总体序列同一性。与总体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性一般更高。
在本文“定义”部分定义了术语“结构域”和“基序”。存在鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)，InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.，编辑，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))，或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。在ExPASy蛋白质组服务器上可获得用于蛋白质的计算机分析的一组工具(Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。还可使用常规技术，如通过序列比对鉴定结构域或基序。
用于序列比对比较的方法为本领域所知，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)来发现两条序列的总体(即横跨完整序列)比对，其使配对数量最大化并使空位数量最小化。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算百分比序列同一性，并对两条序列之间的相似性进行统计学分析。可通过National Centre for Biotechnology Information(NCBI)公开获得用于进行BLAST分析的软件。例如使用ClustalW多序列比对算法(版本1.83)，利用默认配对比对参数和百分比的计分方法容易地鉴定同源性。也可使用在MatGAT软件包中可得到的一种方法测定相似性和同一性的总体百分比(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003 Jul 10；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.)。如对本领域技术人员显而易见的是，可进行较少的人工编辑，以优化保守基序之间的比对。此外，除了使用全长序列鉴定同源物，还可使用特定结构域。可在完整核酸或氨基酸序列或在所选结构域或保守基序上，使用上文提及的程序使用默认参数测定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法特别有用(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
由SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39和44代表编码UBP15亚家族成员的核酸的实例。此类核酸可用于实施本发明的方法。SEQ ID NO：11代表的核苷酸序列编码SEQ ID NO：12代表的多肽序列，其为来自稻(Nipponbare品系)的UBP，与AtUBP15紧密相关，并且在核苷酸水平上与AtUBP15具有53％的同一性，在蛋白质水平上具有40％的同一性，以及54％的相似性。SEQ ID NO：13代表的核苷酸序列编码SEQ ID NO：14代表的多肽序列，其为来自稻(Nipponbare品系)的UBP，与AtUBP16紧密相关，并且在核苷酸水平上与AtUBP16具有44％的同一性，在蛋白质水平上与AtUBP16具有30％的同一性，以及44％的相似性。SEQ ID NO：15代表的核苷酸序列编码SEQ ID NO：16代表的多肽序列，其为来自稻(Nipponbare品系)的UBP，与AtUBP17紧密相关，并且在核苷酸水平上与AtUBP17具有40％的同一性，在蛋白质水平上与AtUBP17具有33％的同一性，以及45％的相似性。SEQ ID NO：17代表的核苷酸序列编码SEQ ID NO：18代表的多肽序列，其为来自稻(Nipponbare品系)的UBP，与AtUBP18紧密相关，并且在核苷酸水平上与AtUBP17具有34％的同一性，在蛋白质水平上与AtUBP18具有30％的同一性，以及39％的相似性。SEQ ID NO：19是来自玉米(玉米)的核苷酸序列，其显示与SEQ ID NO：11具有一定相似性。SEQ ID NO：19是通过装配SEQ ID NOs 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38的ESTs获得的玉米的最长cDNA序列。SEQ ID NO：39是来自玉米的另一核苷酸序列，其显示与SEQ ID NO：11具有一定相似性。SEQ ID NO：39从SEQ ID NOs 40、41、42和43的EST装配。SEQ ID NO：44是来自玉米的另一核苷酸序列，其显示与SEQ ID NO：11具有一定相似性。SEQ ID NO：44从SEQ ID NOs 45、46、47、48、49、50和51的ESTs装配。
SEQ ID NOs 12、14、16和18是分别由SEQ ID NOs：2、4、6和8代表的UBP多肽的直向同源物。术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文定义。可通过进行所谓的交互blast搜索容易地鉴定其它直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一次BLAST，涉及针对任何序列数据库，如公共可得的NCBI数据库进行BLASTing查询序列(例如使用序列SEQ ID NOs 2、4、6、8或10的任一个)。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，当从蛋白质序列开始时一般使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可任选地过滤BLAST结果。任一过滤结果或非过滤结果的全长序列然后可针对来自查询序列(其中查询序列是SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：10，第二次BLAST因而可以针对拟南芥序列进行)来源的生物体序列反向BLAST(第二次BLAST)。然后比较第一次和第二次BLAST的结果。如果来自第一次blast的高阶命中与查询序列来自同一物种，则鉴定了旁系同源物，反向BLAST然后理想地导致查询序列位于最高命中中；如果来自第一次blast的高阶命中不与查询序列来自同一物种，则鉴定了直向同源物，并优选在反向BLAST后导致查询序列位于最高命中中。
高阶命中是具有低E值的那些数据。E值越低，得分越显著(或者换言之，偶然发现命中的机会就越低)。E值的计算为本领域所知。除了E值，也通过百分比同一性对比较计分。百分比同一性指两条比较的核酸(或多肽)序列在特定长度上相同核苷酸(或氨基酸)的数量。在大家族的情况下，可使用ClustalW，然后构建邻接树，以帮助显示相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可用于实践本发明的方法。此类变体的实例包括编码SEQ ID NOs 2、4、6、8或10代表的氨基酸序列中任何一个的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文定义。也用于本发明方法中的是编码SEQ ID NOs 2、4、6、8或10代表的氨基酸序列中任何一个的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法的同源物和衍生物与它们来源的未修饰蛋白质具有基本相同的生物活性和功能活性。
用于实践本发明方法的其它核酸变体包括编码UBP15多肽或其同源物的核酸部分、与编码UBP15多肽或其同源物的核酸杂交的核酸、编码UBP15多肽或其同源物的核酸的剪接变体、编码UBP15多肽或其同源物的核酸的等位变体以及编码UBP15多肽的核酸通过基因改组获得的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。
编码UBP15多肽或其同源物的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供用于改变植物生长和发育的方法，其包括在植物中引入并表达SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核苷酸序列的部分，或编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物或同源物的核酸的部分。
例如通过产生一个或更多核酸缺失来制备核酸的部分。多个部分可以分离形式使用，或者它们可融合到其它编码(非编码)序列上，例如来产生组合几种活性的蛋白质。当融合其它编码序列时，翻译后产生的多肽比蛋白部分预测的更大。
用于本发明方法的部分编码如本文定义的UBP15多肽或其同源物，并与SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。优选地，所述部分是在SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44中给出的任何一个核酸的部分，或是编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，所述部分长度为至少1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸是SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核酸序列，或编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续核苷酸。最优选地，所述部分是SEQ ID NOs 1、3、5、7或9任何一个的核酸的部分。优选地，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建UBP系统树，如图1中描述的树时，其与蛋白质的UBP15亚家族而不是UBP的任何其它亚家族聚类。
用于本发明方法的另一核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下与编码如本文定义的UBP15多肽或其同源物，或与如本文定义的部分杂交的核酸。
根据本发明，提供用于改变植物生长和/或发育的方法，其包括在植物中引入并表达能够与SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达能够与编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何核酸序列的直向同源物或旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。
用于本发明方法的杂交序列编码如本文定义的UBP15多肽，其与SEQID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18任何一项代表的氨基酸序列具有基本相同的生物活性。优选地，杂交序列能够与SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核酸，或任何这些序列的部分(上文定义的部分)杂交，或杂交序列能够与编码SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸杂交。最优选地，杂交序列能够与SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15或17代表的核酸或其部分杂交。
优选地，杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，当全长序列用于构建UBP系统树，如图1中描述的树时，其与UBP15多肽亚家族而不是任何其它UBP亚家族聚类。
用于本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的剪接变体，剪接变体如本文定义。
根据本发明，提供用于改变植物生长和/或发育的方法，其包括在植物中引入并表达SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是NOs 1、3、5、7、9、11、13、15或17任何一项代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，当用于构建UBP系统树，如图1中描述的树时，剪接变体编码的氨基酸序列与UBP15多肽亚家族而不是任何其它UBP亚家族聚类。
用于实施本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的核酸的等位变体，等位变体如本文定义。
根据本发明，提供用于改变植物生长和/或发育的方法，其包括在植物中引入并表达SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44代表的任何一个核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达编码SEQID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何一个氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
用于本发明方法的等位变体与SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18代表的任何一个UBP15亚家族多肽具有基本相同的生物活性。等位变体在自然界中存在，并且在本发明方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44任何一项的等位变体，或编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，当用于构建UBP系统树，如图1中描述的树时，等位变体编码的氨基酸序列与UBP15多肽亚家族而不是任何其它UBP亚家族聚类。
基因改组或定向进化也可用于产生编码如本文定义的UBP15多肽或其同源物的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。
根据本发明，提供用于改变植物生长和/或发育的方法，其包括在植物中引入并表达SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44任何一项代表的任何一个核酸序列的变体，或包括在植物中引入并表达编码SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16或18任何一项代表的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，通过基因改组获得所述变体核酸。
优选地，当用于构建UBP系统树，如图1中描述的树时，通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列与UBP15多肽亚家族而不是任何其它UBP亚家族聚类。
此外，还可通过位点定向诱变获得核酸变体。可利用几种方法来完成位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。
编码UBP15多肽的核酸可来自任何天然或人工来源。可通过刻意的人为操作从组合物和/或基因组环境中其天然形式修饰核酸。优选地，编码UBP多肽的核酸来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科(Brassicaceae)，最优选所述核酸来自拟南芥。
本发明方法的实施产生具有改变的植物生长和/或发育的植物。
改变的发育可以是在植物的任何部分，任何细胞、组织或器官中，特别是在叶中。改变的发育可以是改变的繁殖发育。改变的发育可引起改变的植物表型，如改变的叶形(特别是更窄和/或锯齿状和/或扁平的叶)；和改变的表型(如改变的开花和/或顶端优势上的改变和/或改变的可育性)。改变的发育或表型可能是由细胞增殖的改变引起。
本发明包括通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。植物或其部分包含编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体，以利于在植物中引入和/或表达编码UBP15多肽或其同源物的核酸。基因构建体可插入到载体中，所述载体可通过商业途径获得，适合于转化到植物中并适合在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供如本文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
具体而言，本发明提供了构建体，其包含：
(a)编码多肽的核酸，所述多肽是如上文定义的UBP15亚家族的成员或其同源物；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或更多控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码UBP15多肽或其同源物的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。
用包含如上述任一核酸的载体转化植物。技术人员熟知必须在载体上存在的遗传元件，以成功转化、选择并繁殖含有目的序列的宿主细胞。目的序列有效连接一个或更多控制序列(至少连接启动子)。
有利地，任何类型的启动子，无论天然的或合成的，均可用于驱动核酸序列的表达。组成型启动子特别用于本发明方法。优选地，组成型启动子也是遍在启动子。对于多种启动子类型的定义可参阅“定义”部分。
组成型启动子优选为CaMV35S启动子。进一步优选地，组成型启动子由与SEQ ID NO：52基本相似的核酸序列代表，最优选地，组成型启动子由SEQ ID NO：52代表。对于组成型启动子的其它实例参阅本文“定义”部分中的表B。
任选地，一个或更多终止子序列可用于引入植物中的构建体。额外的调节序列可包括转录以及翻译增强子。本领域技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子序列。也可向5′非翻译区(UTR)或在编码区添加内含子序列，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量，以如定义部分中所述。其它控制序列(除了启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区域)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员将已知这些序列或可容易地获得这些序列。
本发明的遗传构建体可进一步包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当在细菌细胞中时需要维持遗传构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为了检测如本发明方法中使用的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利地使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可任选地包含选择标记基因。在本文“定义”部分更详细地描述了选择标记。一旦不再需要它们，可从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记去除的技术为本领域所知，在上文定义部分中描述了有用的技术。
本发明还提供用于产生相对于对照植物具有改变的生长和/或发育的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的任何核酸。
具体而言，本发明提供用于产生具有改变的生长和/或发育的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入并表达编码UBP15多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
(i)的核酸是能够编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的任何核酸。
核酸可直接引入植物细胞或植物本身中(包括引入植物的组织、器官或任何其它部分中)。根据本发明的优选特征，核酸优选通过转化引入植物中。在本文“定义”部分更详细地描述了术语“转化”。
可通过技术人员熟悉的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure BPA00001213049700391
和Willmitzer的出版物。
一般在转化后，选择植物细胞或细胞群体中一种或更多标记的存在，所述标记由与目的基因共转染的植物表达基因编码，然后转化材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料通常经受选择条件，以便转化的植物可与未转化植物区分开。例如，可种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期后通过喷雾进行适当选择。其它可能性在于灭菌后适当时使用合适的选择剂在琼脂平板上播种种子，使得仅转化的种子可生长成植物。或者，筛选转化植物中选择标记(如上文所述标记)的存在。
DNA转移和再生后，例如还使用Southern分析评估推测的转化植物中目的基因的存在、拷贝数目和/或基因组组织。备选或额外地，可使用Northern和/或Western分析监测新引入DNA的表达水平，所述两种技术为本领域技术人员所熟知。
可通过多种手段，如通过克隆繁殖或经典的育种技术繁殖所产生的转化植物。例如，第一代(或T1)转化植物可自交，并选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2代植物然后可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。产生的转化生物体可采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，转化以含有表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接物(例如，在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗)。
本发明清晰地延伸到本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，及其所有植物部分和繁殖体。本发明还延伸到包括通过任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代显示与在本发明方法中亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。
本发明还包括含有编码如上文定义的UBP15多肽或其同源物的分离核酸的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是所有植物，其能够合成用于本发明方法的多肽。
本发明方法有利地应用于任何植物。特别用于本发明方法的植物包括属于绿色植物超家族的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆类、观赏植物、粮食作物、树木或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是农作物植物。农作物植物的实例包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。进一步优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明还延伸到植物的可收获部分，如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及来自，优选直接来自此植物的可收获部分的产品，如干沉淀或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，调节的表达是增加的表达。在本领域中很好地记载了用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法，并且在定义部分中提供了实例。
如上提及，用于调节编码UBP15多肽或其同源物的核酸表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码UBP15多肽或其同源物的核酸；然而，还可使用其它众所周知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组实现进行本发明的效果，即改变的植物生长和/或发育。在定义部分提供了对这些技术的描述。
本发明还包括编码如本文所述的UBP15多肽或其同源物的核酸的用途，以及这些UBP15多肽在改变植物生长和/或发育中的用途。
编码本文所述UBP15多肽的核酸或UBP15多肽本身可用于育种程序，其中鉴定可遗传连接UBP15多肽编码基因的DNA标记。核酸/基因，或UBP15多肽本身可用于确定分子标记。该DNA或蛋白质标记然后可用于育种程序来选择在本发明方法中具有如上文定义的改变的生长和/或发育的植物。
UBP15多肽编码核酸/基因的等位变体也用于标记辅助的育种程序。此类育种程序有时候需要通过使用例如EMS诱变来诱变处理植物以引入等位变异；或者，程序可以以无意引起的所谓“天然”起源的一组等位变体开始。然后例如通过PCR进行等位变体的鉴定。这之后是选择正在讨论的序列的高级等位变体的步骤，并且其产生改变的生长和/或发育。通过监测含有正在讨论的序列的不同等位变体的植物的生长性能进行选择。可在温室或田间监测生长性能。其它任选的步骤包括将其中鉴定了高级等位变体的植物与另一植物杂交。这可用于例如制备感兴趣表型特征的组合。
编码UBP15多肽或其同源物的核酸也可用作对基因遗传作图和物理作图的探针，其作为与这些基因连锁的性状的一部分或是其标记。此类信息可用于植物育种，以开发具有想要表型的株系。UBP15多肽编码核酸的这种用途仅需要长度为至少15个核苷酸的核酸序列。UBP15多肽编码核酸可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用UBP15编码核酸探测限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)。然后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对所得带型进行遗传分析以构建遗传图。此外，核酸可用于探测含有代表确定遗传杂交的亲本和后代的一组个体的限制性内切核酸酶处理的基因组DNA的Southern印迹。指出了DNA多态性的分离，并用于计算之前使用该群体获得的遗传图中UBP15多肽编码核酸的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源探针的制备及用于遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上述方法或其变型进行的特异性cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组可用于作图。此类方法为本领域技术人员所熟知。
核酸探针还可用于物理作图(即，序列在物理图谱上的布局；参阅Hoheisel等Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可用于在原位杂交(FISH)作图中直接荧光(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前的FISH作图方法倾向于使用大克隆(几kb到几百kb；参阅Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，灵敏性上的提高可允许使用更短的探针进行FISH作图。
可使用核酸进行多种基于核酸扩增的方法用于遗传和物理作图。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，核酸序列用于设计并产生在扩增反应或引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计为本领域技术人员所熟知。在使用基于PCR的遗传作图方法中，鉴定对应于本发明核酸序列的区域中的作图杂交的亲本之间DNA序列差异是必要的。然而，这对作图方法一般不是必须的。
本发明的方法产生如上文所述具有改变的生长和/或发育的植物。这些性状也可以与其它经济有益的性状(如产量增强性状、对其它非生物和生物胁迫的耐性、修饰多种农业特征和/或生化和/或生理学特征的性状)组合。
实施例
本发明将参考以下实施例进行描述，所述实施例仅用于说明。以下实施例不旨在完全限定或者限制本发明的范围。
1.植物材料和生长条件
该研究中使用的野生型拟南芥植株为Columbia-0生态型。从SALK库中获得表1列出的38株T-DNA插入株系(包括具有已观察到表型的ubp15-1、ubp15-2和ubp19-1那三个株系)。通过将PUBP15：UBP15(或PUBP15：UBP15C447A/S)转化到野生型背景中来获得UBP15(或UBP15C447A/S)过表达的转基因植株。通过将PUBP15：UBP15(或PUBP15：UBP15C447A/S)转化到ubp15-1背景中获得UBP15互补(或UBP15C447A/S)转基因植株。通过将PUBP19：GUS构建体转化到野生型背景中获得PUBP19：GUS转基因植株。通过将ubp15-1(或ubp15-2)与ubp16-1或ubp17-1杂交，或将ubp16-1与ubp17-1杂交来获得ubp15 ubp16、ubp15ubp17和ubp16 ubp17双突变体；通过PCR分析来证实F2代的纯合子。通过将ubp15与双突变体ubp16 ubp17杂交来获得ubp15 ubp16 ubp17三突变体；通过PCR分析来证实F2代的纯合子。
用15％(v/v)NaOCl将种子表面消毒。4℃春化48小时后，将种子置于1×Murashige和Skoog(MS)平板上(含1％蔗糖和0.3％Phytagel)并在转移到土壤前在22℃的培养箱中持续光照条件下放置7天。随后植株在标准长日照(16小时光照/8小时黑暗)的生长室中生长。在短日照(8小时光照/16小时黑暗)下生长的种子直接播种至土壤中并在短日照条件室中生长。
2.序列比对和系统发育分析
通过TAIR和NCBI CDART来进行27个UBP蛋白质间共有的共同结构域的搜索。通过去除可变区并使用ClustalW(Thompson等，1994)进行比对及随后手工比对来将每一蛋白质内的保守结构域连接起来。
使用MAGA版本3.1(Kumar等，2004)用邻接算法及1000次引导程序重复在比对的保守位置上构建系统树。
3.幼苗、根、长角果及莲座叶宽度和长度的测量
为了获得幼苗的根长，将野生型、ubp15-1和ubp15-2垂直生长于平板上。测量随机挑选的20株野生型或突变体幼苗的根长。测量随机挑选的野生型或突变体的20个成熟长角果(授粉后超过8天)。从野生型或ubp15-1中切下从第一片至最后一片真叶的成熟莲座叶，并测量叶片的宽度和长度。
4.开花时间和莲座叶数目的测定
按照从种子萌发至第一朵花开放的天数来测定野生型、ubp15-1、UBP15-过表达株系的开花时间。在抽苔时对莲座叶数目计数。
5.RNA分离和RT-PCR
使用Trizol(Invitrogen)分离RNA。在进行RT-PCR前，用无RNA酶的DNA酶(Premega)来处理4μg的RNA，以避免DNA污染，随后用氯仿∶苯酚(1∶1)抽提来避免离子的影响。随后用At3g04120/GAPDH引物对一部分RNA进行PCR来确定已去除了DNA。使用SuperscriptTM IIRNA酶H-Reverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen)和随机引物对剩余样品进行RT反应。将反应混合物稀释10倍并取1μL用rTaq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR。At3g04120/GAPDH用作内部对照。通过在22、30和35个循环后比较PCR产物的相对量来监测PCR反应的线性。用于检测基因转录物的正向和反向引物序列如下At3g04120/GAPDH，5’-CACTTGAAGGGTGGTGCCAAG-3’和5’-CCTGTTGTCGCCAACGAAGTC-3’；UBP15，5’-TCGAGAGGCAACAGTTATGCTG-3’和5’-CTCAGGCCTCCAGTAACTGTAAGTTCTATCCTG-3’。
6.RNA凝胶印迹分析
如前所述进行RNA印迹(Yang等，2005)。提取叶片不同区域的总RNA并将每一泳道的20μg总RNA在琼脂糖凝胶上分离，转移至Hybond-N+膜上(Amersham Biosciences)，并用UBP15特异性探针进行杂交。将18SrRNA作为上样对照。引物如下：UBP15，5’-TCGAGAGGCAACAGTTATGCTG-3’和5’-CTCAGGCCTCCAGTAACTGTAAGTTCTATCCTG-3’。
7.洋葱表皮细胞中的瞬时表达
如前描述使用粒子轰击进行在活的洋葱(Allium cepa)表皮细胞中瞬时表达的操作(Ang等，1998)。轰击后，将洋葱细胞层在22℃光照条件下培育24小时。随后用激光共焦显微镜检查细胞层。
8.转基因株系的构建体
为了获得UBP15-过表达和UBP15互补的植株，将HindIII/XbaI消化后的UBP15启动子(ATG上游1.8kb)片段和XbaI/StuI UBP15 CDS片段(2.8kb)插入到pCAMBIA1300双元载体中。随后通过农杆菌介导的转化将所产生的构建体转化到野生型和ubp15-1中。用同样方法还构建了在Cys位点突变的构建体PUBP15：UBP15C447A和PUBP15：UBP15C447S并转化至野生型和ubp15-1中。在MS平板上用潮霉素(20μg/mL；Roche)筛选转基因植株。
为了产生35S：GFP-UBP15(或35S：UBP15-GFP)构建体，将35S和GFP融合的全长UBP15 CDS(或融合GFP的全长UBP15 CDS)亚克隆至pCAMBIA1300的XbaI/SphI位点中。
为了使用GUS染色检测UBP19的组织表达模式，将UBP19启动子的BamHI/KpnI片段(1.2kb)插入到pCAMBIA1381Z中并用农杆菌介导的转化将其转化至野生型背景中。使用潮霉素(20μg/mL；Roche)筛选转基因株系。
9.体外DUB活性测定
使用his标记的底物聚泛素UBQ10和泛素延展蛋白UBQ1在大肠杆菌(E.coli)中测定UBP15切割经α氨基键连接的泛素的能力。标准条件下(22℃诱导)(Novagen)在大肠杆菌菌株NovaBlue(DE3)中将两个α-氨基底物(UBQ1在pET28a中以及UBQ10在pACYCDuet-1中)与pGEX4T-3中的GST或GST-UBP15或GST-UBP15C447A/S进行共表达。用抗泛素抗体(Sigma)或抗his抗体(Sigma)通过Western印迹分析裂解物。使用ECL化学发光系统(Amersham)进行检测。
10.用于组织切片的组织固定和包埋
为了观察叶片的横切结构，将样品在室温下用FAA(50％乙醇、5％乙酸和5％甲醛)固定超过24小时，经H2O∶95％乙醇∶叔丁醇混合物的梯度系列(4∶5∶1、3∶5∶2、1.5∶5∶3.5、0∶5∶5、0∶2.5∶7.5、100％叔丁醇两次)脱水(每种溶液中温育2小时)，并随后逐步加入石蜡浸润(叔丁醇∶石蜡为3∶1、2∶2、1∶3、0∶4、0∶4)。用切片机(Leica RM2255)将包埋后的组织切成8μm的切片。将切片置于聚L-赖氨酸包被的载玻片上，用连续乙醇梯度(乙醇∶H2O为1∶0、1∶0、9.5∶0.5、9∶1、8∶2、7∶3和1∶1)(每种溶液中温育5分钟)去石蜡并再水化。随后用1％的番红O和0.02％的快绿对切片染色。用树脂将盖玻片贴在载玻片上。在显微镜下对近轴表皮细胞和栅栏细胞数目进行计数。
11.微阵列分析和定量RT-PCR
微阵列实验和数据分析中所用的方法如前所述(Ma等，2002)。将野生型和ubp15-1最先出现的第9片莲座叶用作样品。使用RNAwiz试剂(Ambion)分离总RNA并用RNeasy试剂盒(Qiagen)进行纯化。对于每一样品，通过反转录用氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP，Sigma-Aldrich)对50μg的总RNA标记。使用Microcon YM-30滤器(Millipore)纯化氨基烯丙基-dUTP标记的cDNA并在0.1M的NaHCO3中重悬浮。进一步通过将单功能的Cy3或Cy5染料(Amersham)与氨基烯丙基官能团连接来对纯化的cDNA进行荧光标记。用两种选择样品的配对组合来同时检测一张载玻片，并且进行四次独立的生物学重复(两次重复后交换染料)。用GenePix 4000B扫描仪(Axon)对杂交的载玻片进行扫描，并使用GenePix Pro5.0软件包分别对Cy3和Cy5通道的独立TIFF图像进行后续分析。
为了验证微阵列的结果，在ABI 7900系统上用ABI SYBR Green PCR总混合物在20μL的体积中进行实时PCR。PCR混合物由0.3μL的cDNA、0.6μM的引物、和1x主混合物组成。在每一次实时PCR反应中，使用At1g42970/GAPDH作为内部对照来对cDNA模板量的差异进行归一化。t检验结果证实了它为组成型表达的基因。所用的引物序列为：At1g42970/GAPDH，5′-TCTTTCCCTGCTCAATGCTCCTC-3′和5′-TTTCGCCACTGTCTCTC CTCTAAC-3′。挑选7种下调的基因和2种上调的基因用于定量RT-PCR检测。用于这些基因定量的引物为At1g71030/MYB，5’-CATTTGCCTGACCTAAACATTG-3’和5’-AAGCGTTTCTTGACCTGTTGA-3’；At5g57660/TRANSCRIPT FACTOR，5’-GGCTCATCCACCACCGTT-3’和5’-GGGAGAGGCTCTGTTTTCGTC-3’；At5g67030/ABA1，5’-GGGCTTGGTCCTCTGTCTT-3’和5’-GTGAGTCTGCAACTAGGTGGC3’；At5g35970/HELICASE-LIKE，5’-CCACAGGGCTCGGAGGTAT-3’和5’-TCGTAAGTAAGGGCATCGGC-3’；At3g49160/PYRUVATE KINASE FAMILY PROTEIN，5’-TCCAGCAGGTCTCACATAAACAA-3’和5’-CTGCTGCTAAGAGATGTGACCG-3’；At1g73480/HYDROLASE，5’-AATGGCGGTGGAAACAATG-3’和5’-ACGACGCGAAACGGAAGGAG-3’；At5g24470/APRR5，5-TACCCTACGCCAACCCCTAT-3’和5’-ATGTGATTGCCTATTGCACTATGT-3’；At3g20810/TRANSCRIPTION FACTOR，5’-CCTCAATGCTGTTGCTGGTAA-3’和5’-TGGGCAAGATAAGTAGGCTCC-3’；At4g21990/APR3，5’-CTGTCAACACGCTTCACGC-3’和5’-TCTTTCCGGTTCTCTAACTTCATC-3’。为了测定这些引物的特异性，使用机器上的标准方法对扩增产物进行熔解曲线分析。循环条件如下：50℃2分钟、95℃10分钟，40个循环的：95℃15秒、60℃30秒、及72℃1分钟。所报道的值为六次独立试验(两次生物学重复以及三次技术重复)的平均值。相对表达水平计算如下。在野生型或ubp15-1中使用公式ΔCT＝CT(基因X)技术重复的平均值-CT(GAPDH)技术重复的平均值将那些基因的转录物水平相对于标准(GAPDH)进行归一化。随后，获得每一基因的ΔCt(野生型)和ΔCt(ubp15-1)。用野生型作为比较表达水平的标准。随后使用方程式2-[ΔCT(ubp15-1)-ΔCT(野生型)]来计算相对表达水平。随后，计算2次生物学重复的CT平均值。
12.检测GUS活性
PUBP19：GUS转基因株系生长于MS平板上。用100mM磷酸钠缓冲液pH7.0温和地洗涤幼苗，随后于37℃下在溶于0.1mM铁氰化钾、0.1mM亚铁氰化钾、10％Triton X-100、100μg/ml氯霉素和500mM磷酸钠缓冲液pH 7.0中的2mM X-葡糖苷酸中染色4小时(Weigel和Glazebrook，2002；Byrne等，2003)。随后室温下用100mM磷酸钠缓冲液和95％和70％的乙醇洗涤组织。在解剖显微镜(Leica MZFLIII)10x物镜下进行显微镜观察，并用Canon数码照相机(Power Shot S70)获取图像。
13.登录号
文中提及基因的Arabidopsis Genome Initiative基因座标识符列于表1中。
14.显示不相同表达谱的UBP基因
为了获得UBP基因的表达模式，检验了包括18种不同的拟南芥器官的前述微阵列数据集，所述器官包括茎生叶、莲座叶、授粉前一天的雌蕊、授粉后一天的雌蕊、授粉后3天的长角果、授粉后8天的长角果、茎、萼片、茎、花瓣、种子、培养细胞、黑暗中生长的根、白光下生长的根、黑暗中生长的下胚轴、白光中生长的下胚轴、黑暗中生长的子叶和白光下生长的子叶(Ma等，2005；附表1)。在所述研究中，所用的微阵列覆盖了27种UBP基因中的24种并且在一种或更多组织中均检测到了所有24种基因的表达。在这24种基因中，发现UBP9和UBP10基本相同并且它们的寡探针相互之间可以杂交，因此使得无法确定这两个基因表达的准确度。在更早的研究中报道了该微阵列未包括的三种基因UBP13、UBP14和UBP20的表达(Yan等，2000)。作为样品，UBP15亚家族中的5种基因的组织特异表达谱在附表2中给出。5种基因看起来具有不同的表达谱。
15.基因组广泛分离和UBP基因的T-DNA插入突变体的分析
作为UBP基因家族功能分析的第一步，搜索了北美拟南芥资源中心(Arabidopsis Resource Center)数据库中所有可用的T-DNA插入株系以寻找UBP基因家族成员。获得并验证了对应于25种UBP基因的总计38个T-DNA插入株系，结果总结于表1中，并附有每一株系的T-DNA插入位点的位置。根据基于PCR的基因分型，设计了正向和反向引物(附表2)。对那些各个突变的纯合株系可能表型的检验揭示了2个亚家族中的3个基因的仅5个功能缺失突变体株系显示出可见的表型(表1)。与之前报道类似(Doelling等，2001)，UBP14的两个独立的T-DNA等位基因表现出隐性胚致死性。具有两个UBP15等位基因的属于UBP15亚家族的另外三株突变体株系表现出叶片形态表型，并且一个UBP19等位基因表现出胚致死性。该亚家族中的5个基因之前未进行过表征，因此被选择进行深入分析。
在稻(Oriza Sativa)中进行了AtUBP15亚家族同源基因的搜索，来发现它们是否具有相似的功能。发现了四种基因具有高相似性，并与5种AtUBP15亚家族基因进行了比对。所得的系统树示于附图3中。一种稻基因甚至比其它的拟南芥基因更相似于AtUBP15。
16.两个ubp15突变体等位基因显示出相似的叶片发育缺陷
从Salk库中鉴定到两株UBP15的T-DNA插入株系Salk_018601和Salk_015611，命名为ubp15-1和ubp15-2，分别在UBP15基因的第12个和第8个外显子中存在T-DNA插入(图2A)。半定量RT-PCR显示在任何一个突变体中均不能检测到mRNA表达水平(图2B)，揭示两者均为无效等位基因。两个株系分离出彼此类似的单一隐性孟德尔性状(下文描述)，与T-DNA共分离，表明该性状是由UBP15中的单插入导致的。与野生型成年植株相比，两个突变体植株更小且具有窄的锯齿状叶片，在晚期的莲座叶中叶片形态变得更为严重(图2C)。突变体在幼苗期也表现出更短的根(图2D)、更小的花(图2E)、更短的长角果(图2F)以及短小且纤细的茎。这些形态变化(长角果长度、根长、初生茎长度和初生茎直径)总结于表2中。
进一步用ubp15-1分析莲座叶的形态。长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)生长的野生型拟南芥的莲座叶会逐渐改变它们的全部形态，从圆且平的真叶慢慢变得更接近卵形且稍微向下卷曲，最后变为具有严重向下卷曲边缘的长且窄的形状。而ubp15-1突变体的莲座叶甚至在更晚的阶段仍更平，并且在抽苔前始终具有更少的莲座叶(10.8片相对于野生型的12.6片)(图2C)。将ubp15-1和野生型的长宽比作图并定义为叶指数值(Tsukaya，2006)，并揭示出突变体中莲座叶叶片的宽度较长度出现更严重的下降(图2G)。相反，ubp15-1的茎生叶与野生型相比未表现出任何明显的差别。
与营养叶片数目减少一致的是，ubp15-1还表现出早开花的表型，相对于野生型的41.5(±3.79)天，其平均开花时间为39.1(±2.02)天(表2)。即使在短日照条件下(8小时光照/16小时黑暗)，ubp15-1仍轻度地早开花(表2)。还应注意的是ubp15-1的莲座叶具有更少的重量(表2)并且更细，暗示细胞结构发生了改变。
17.UBP15在莲座叶和生殖组织中高水平表达，并且定位于胞质溶胶和细胞核中
ubp15-1莲座叶和花中缺陷的存在说明UBP15参与了营养发育和生殖发育的调节。为了支持该结论，并验证之前的微阵列分析，使用半定量RT-PCR来检测UBP15的组织特异性表达。如图3A中所示，UBP15的mRNA水平主要高度积累于莲座叶和花序中，而在根、长角果和子叶中为低水平，在茎和茎生叶中为中等水平。该表达模式很大程度上与微阵列数据是一致的(附表1和附图2)。
进一步还检测了UBP15在莲座叶中的空间表达模式。如图3B，选择了早期、中期和晚期的莲座叶并解剖成中间和边缘区域用于分离RNA制备物(图3B上部，由黑线显示)和RNA印迹分析(图3B，底部)。UBP15的mRNA水平从早期叶片向晚期叶片增加，并且在晚期叶片的边缘处具有更为显著的高表达。发育过程中这些叶片的表达模式与UBP15在决定叶片形态和叶片边缘的形状(如锯齿状和卷曲)中的作用是一致的。
为了评估UBP15的亚细胞分布，将含有35S：GFP-UBP15或35S：UBP15-GFP的构建体转化入洋葱表皮细胞。瞬时表达显示融合蛋白质广泛存在于胞质溶胶和细胞核中，并且35S：GFP-UBP15的结果示于图3C中。
18.UBP15在体外具有去泛素化活性并且该生化活性对体内功能至关重要
为了验证UBP15是真正的去泛素化酶，UBP15以及两个突变形式(保守催化中心半胱氨酸447残基改变成丙氨酸或丝氨酸)在大肠杆菌中共表达为GST融合蛋白。组氨酸标记的UBQ1或UBQ10多聚泛素蛋白质与重组GST-UBP15野生型或突变体形式蛋白质用作体外DUB活性测定的底物。利用抗泛素抗体的免疫印迹分析显示UBP15能够切割这两种底物，并且半胱氨酸447对该DUB活性至关重要(分别见图4A和4B)。
为了检测UBP15在植物发育中的DUB活性的重要作用，我们将UBP15天然启动子控制下的野生型UBP15及其两个半胱氨酸447突变体形式通过农杆菌介导的转化引入野生型拟南芥和ubp15-1背景中。对于具有野生型背景的转基因株系，对于野生型UBP15转基因，我们获得了总共36个独立的T0代植物。一半的株系(36株中有18株)不显示任何表型改变，而另一半显示与野生型的有趣差异，其与ubp15突变体表型相反(图4C，中间左边)。对于在ubp15-1背景中具有野生型转基因的那些株系，5个独立株系显示野生型表型(图4C，中间右边)，因此在功能上挽救突变体缺陷。对来自各组的两个代表性株系进行的RNA凝胶印迹分析(图4D)揭示野生型背景中转基因的高水平表达揭示了与ubp15-1突变体相反的正常表型，而与内源基因相似的表达水平赋予了ubp15-1突变体中的表型挽救，并在野生型背景中没有表型效应。当野生型转基因不能成功挽救ubp15-1表型时，那些转基因株系仅表达截短的ubp15 mRNA并且不能成功表达野生型mRNA。
将UBP15天然启动子控制下的UBP15C447A或UBP15C447S突变体转基因引入野生型中，ubp15-1不能引起野生型背景中的过表达表型和ubp15-1背景中的突变体表型互补，因为RNA凝胶印迹分析显示了突变体基因的正常或甚至更高水平的表达(图4C和4E)。相反，在野生型中具有UBP15C447A的一些株系显示与ubp15-1突变体相似的表型(图4C左下，和4E)，其与野生型背景中的UBP15过表达相反，如野生型过表达UBP15C447S的转基因株系一样(数据未显示)。那些株系倾向于以更高水平表达突变体转基因，很可能引起对内源蛋白质功能的显性负相干扰。这些结果暗示DUB活性对UBP15在体内的功能至关重要。
19.UBP15的过表达显示了与ubp15-1突变体相反的表型
我们进一步检查了上文UBP15-过表达株系(野生型背景中的野生型转基因)的表型。一个明显的表型是植物更大的总体状态以及各莲座叶。这些过表达株系的莲座叶从非常早期阶段开始就比野生型圆，并且在中期到晚期阶段严重地向下卷曲(图4C，中间左边)。晚期发育的莲座叶，如第九片莲座叶不仅向下卷曲，有时候在叶尖区域还显示节(图5B中的箭头，比较5A和5B)，这可能是由叶内不同位置的细胞不平衡增殖引起的。此外，UBP15-过表达株系还晚开花，在抽苔前比野生型具有更多数量的莲座叶(16.2)，并且在长日照条件下开花时间延迟(表2)。与野生型相比，UBP15-过表达株系每块面积上的莲座叶鲜重也增加了(表2)。
在UBP15-过表达株系中还有明显的花表型。与野生型相比，UBP15-过表达株系显示更大的花(比较图5I和5J)，在早期花的花瓣或雄蕊数量上具有高比例的异常(91.3％，在一株植物中46个中有40个)(图5C和5D、5E、5K)。然而，这种花型异常在晚期花中较不常见。过表达株系也具有比野生型大的长角果(图5L)，这与ubp15-1突变体相反。花和长角果异常不影响可育性，除非是其中损坏的性器官阻止了可育性的极端情况(图5H和5M)。过表达株系中增加的顶端优势相比于ubp15突变体中减少的顶端优势是可见的(表2和附图4)。在UBP15过表达植株的一些极端情况中，与野生型(图5F)相比，在唯一的主要过早结实中预期的次级过早结实的位置退化成花，然后是长角果(图5G)。
20.ubp15功能丧失突变体和UBP15-过表达植物在叶细胞增殖中显示相反的异常
为了进一步表征UBP15在拟南芥叶发育中的作用，比较来自功能丧失突变体、过表达植株和野生型的所有叶(从子叶、真叶到茎生叶)的形态发生型。如图6A所示，野生型植物具有约11个莲座叶，而两个ubp15突变体均具有约9个莲座叶。相反，UBP15-过表达株系产生约14个莲座叶。两个突变体中的莲座叶窄，呈锯齿状并且扁平，但UBP15-过表达植物的早期叶更圆，晚期叶向下卷曲。在那些检测的株系中，除了两个突变体具有稍微更窄的叶之外，茎生叶没有显示明显的差异。
为了检查ubp15突变体其小的植物大小和窄的叶片的细胞基础，来自突变体以及UBP15-过表达株系的叶的横切面与野生型叶的进行比较。图6B右边的图说明了常规获得并分析的代表性切片的位置，其位于叶的中间区域。图5B左边的图是野生型中间区域的切片模型。选择从第一片子叶到第一片、第三片、第五片、第九片真叶和第一片长成的茎生叶的六片叶(图6A中奇数叶)用于测量。第九片叶后的那些真叶不被包括用于均一性，因为两个突变体仅产生9～10片真叶。在显微镜下连续切片(3～4)中计数各株系中近轴表皮细胞数目和栅栏细胞数目。
对于近轴表皮细胞，在图6C中显示了各株系中各方向上的细胞数目。在叶发育开始时，这些株系中叶片的近轴表皮细胞数目相近，其在各株系的子叶中有～30个细胞，但随着叶的发育差异增加，并且第九片莲座叶十分不同，在野生型中叶片的细胞数目是～290个，在两个突变体中是～180个(降低了～40％)，在UBP15-过表达株系中是～400个(增加了～40％)。与观察到的表型一致的是在发育晚期差异变得显著。茎生叶的近轴表皮细胞数目比任何莲座叶的数目更高。这可能是由茎生叶的近轴表皮细胞数目密度更大引起的。在测定栅栏细胞数目中观察到了类似结果(附图5)。UBP15突变导致了侧向上近轴表皮细胞和栅栏细胞数目减少，而UBP15的过表达导致了相反的现象。
21.拟南芥UBP15参与叶细胞层组织
为了扩展细胞数目改变的发现，检查了那些株系叶的细胞结构。在晚期发育的莲座叶显示出严重表型的结果基础上，选择完全伸展的第九片莲座叶用于比较株系中间区域的细胞结构的横切面(图6B)。如图7A左边第一个野生型所示，叶具有有组织的内部解剖结构，其在近轴表面下含有一层垂直填充的栅栏细胞，并且散布气室的～4层海绵组织细胞松散地排列在栅状层下面。ubp15-1和ubp15-2也显示类似的结构，但突变体中海绵细胞层的数目比野生型中的少，而UBP15-过表达株系的更高(图7A，从左，第二个到第四个)。野生型中的海绵细胞层一般是～4个，但在两个突变体中海绵细胞层是～3个，在UBP15-过表达株系中海绵细胞层达到了～5个。通过其相应野生型UBP15的表达挽救了ubp15-1中细胞层结构的缺陷，证明了这些ubp15-1表型由UBP15基因的破坏直接引起(数据未显示)。这些结果与鲜重结果一致，因为更少重量对应于更少细胞层(表2)，更高的重量起因于更多的细胞层(见上文)。检测到了突变体细胞大小的微小增长，暗示细胞数目损失的部分补偿。
还比较了那些株系的中间叶脉和外周结构。野生型的脉管束由薄壁组织细胞层围绕的几层木质部和韧皮部组成(图7B，左边第一个)。相反，两个突变体显示厚度减少。由于木质部和韧皮部中的细胞数目减少，两个突变体的脉管束与野生型的类似。此外，两个突变体维管束周围的薄壁组织细胞数目也减少了。在UBP15-过表达株系中，获得了相反结果，其显示具有增加的维管束，木质部和韧皮部均显著(图7B，从左边开始第二个到第四个)。
22.转录物组分析表明UBP15影响了804种基因的表达水平(调整到P＜0.15)
为了检查ubp15-1中的细胞周期效果并探索UBP15在调节其它基因转录中的可能作用，我们进行微阵列测定以在刚出现的第九片莲座叶上进行基因组范围的表达分析。微阵列分析也证实了在ubp15-1中没有UBP15mRNA的表达(附表3)。统计学分析显示，调整到P＜0.15(4％的表达基因)时，20,000个基因中共804个基因在ubp15-1中相比于野生型差异表达，其中406个(50.5％)上调，398个(49.5％)下调，表达倍数变化分别从1.72变化到8.35，从0.09变化到0.56(附表3)。为了证实在转录物组分析中观察到的趋势，我们随机挑选了9个基因(7个下调，2个上调)，进行了实时PCR。那些基因的表达水平与微阵列结果100％一致(图8)，揭示了微阵列测定是可信的。At1g42970/GAPDH作为内部对照。
为了表征涉及的生物学过程，分析ubp15-1突变体影响的那些基因的代表用于基因本体论(GO)(Maere等，2005)(表3)。与细胞周期相关的两个基因在ubp15-1中差异表达(表3)。因为在ubp15-1中开花时间也受到了影响，于是着重于控制开花的基因上。正调节花发育的花同源异形基因CAL在ubp15-1背景中上调了1.98倍，而负调节花发育的另一个基因MAF5下调了0.31倍(表3)。
ubp15-1影响的其它种类包含参与生物合成代谢、叶绿素生物合成、光合作用、信号转导的基因，并也包括许多转录因子(表3)。因此，除了对一些表型相关基因，如细胞周期和开花控制的基因影响外，ubp15-1突变体在许多植物代谢途径中在转录水平上一般均有缺陷，提示对所观察的生长缺陷的二次影响，而不仅仅只是初次影响。
23.UBP15和UBP16部分冗余但不是与UBP17
UBP16和UBP17是两个密切相关的蛋白质(图1)，提示它们可能具有功能冗余性。这两个基因的敲除株系(ubp16-1、ubp17-1和ubp17-2)(图9A)不显示任何可观察的表型。ubp16-1与ubp17-1或ubp17-2杂交以检查双突变体是否有缺陷。杂交株系的纯合子F2代不显示可察觉的表型，说明还有其它蛋白质具有冗余性。然后将ubp15突变体与双突变体ubp16ubp17杂交。在F2代中，获得了三种基因型的双突变体ubp15 ubp16、ubp15 ubp17和ubp16 ubp17，以及三突变体ubp15 ubp16 ubp17(图9B和9C，ubp16 ubp17未显示)。双突变体ubp15 ubp16与ubp15突变体显示相似但更严重的表型，说明这两个基因可能存在功能冗余性。ubp15 ubp16显示矮的植株和夭折的长角果，莲座叶比ubp15突变体的更窄(图9C)。细胞水平上的改变也很明显，仅2层海绵细胞层(图7A，右边第一个)和严重退化的维管束(图7B，右边第一个)。在第九片叶的情况下，与栅栏细胞数目一样(数据未显示)，叶片上近轴表皮细胞数目比野生型降低了60％(附图6)。相反，ubp15 ubp17未加深ubp15突变体的缺陷，暗示这两个基因在两个不同途径中起作用，以调节细胞功能。三突变体ubp15 ubp16 ubp17与双突变体ubp15 ubp16相似，进一步证实UBP17参与了与UBP15和UBP16不同的另一条调节途径，尽管其与UBP16具有更高的序列同源性。
数据提示UBP15突变破坏了莲座叶发育，并且其影响比与UBP16组合时更明显。UBP16的影响仅在UBP15存在下可检测到。UBP17突变对该过程没有可检测到的影响。这些结果表明UBP15是莲座叶形状和整株植物发育的主要调节子。UBP16也参与了这些过程，尽管其贡献没有UBP15的显著。
24.UBP19可能参与胚发育，而UBP18的功能未知
图9A显示各具有两个T-DNA突变体的UBP18和UBP19基因结构。T-DNA插入到ATG上游195bp处5’UTR区中的ubp19-1显示了隐性胚致死，在一个杂合子长角果中具有～1/4(13/47)的夭折胚(图9B，箭头表示黄色胚)。各杂合子株系中平均10个长角果的进一步统计学分析显示正常∶异常的比例是～3∶1(372/136)，证明其为隐性胚致死株系。检查了特定杂合子长角果中从成熟阶段追溯回球形阶段的胚发育。发现ubp19-1在球形阶段停止发育(图10C)。
因此提出，UBP19参与了早期胚发育。将1.2kb UBP19启动子驱动的GUS构建体转化野生型，并检查组织表达模式。发现UBP19遍在表达，包括在整个幼苗中(除了根分生组织区(图11A)(在图11A中放大的是根尖区的详细展示))、成熟莲座叶的维管组织和气孔(图11B)以及花序中。详细检查发现GUS在萼片和花瓣维管组织中表达，也在花药和花柱中表达(图11C)。在长角果的尖端和基底区中检测到了GUS，但在胚中几乎检测不到(图11D)。
ATG上游205bp处的另一ubp19突变体不显示任何明显表型，表明ATG上游195bp到205bp之间的区域对UBP19的功能至关重要。
在UBP18外显子和内含子中插入的两个突变体都不显示任何可观察到的表型，暗示UBP18与该家族其它蛋白质之间存在潜在的功能冗余性。
25.UBP15参与莲座叶发育
ubp15突变体和UBP15-过表达株系的表型为在植物叶发育中进一步分析该基因提供了基础。两个ubp15突变体均显示了窄的、锯齿状和扁平的莲座叶，而UBP15-过表达株系产生了相反的表型，其莲座叶为圆的(早期发育的)和向下卷曲的(晚期发育的)(图2A和图5B)。与野生型相比，ubp15突变体横切片的细胞数目(跨叶片上的栅栏细胞和近轴表皮细胞)减少，而UBP15-过表达株系的显著增加。这表明UBP15通过细胞增殖，可能通过调节细胞周期蛋白改变叶形状。目前，发现hub1显示由细胞数目减少引起的更窄的莲座叶，并且微阵列测定发现与细胞周期和胞质分裂相关的基因量改变(Fleury等，2007)。在该研究中，尽管微阵列数据显示仅有两个与细胞周期相关的基因(含ICK1和周期样F盒结构域的蛋白质)发生了改变，但其表达水平与细胞数目减少一致。突变体中莲座叶变得扁平而它们在过表达UBP15的株系中向下卷曲。随着植物的发育，莲座叶中UBP15的表达水平在叶边缘中增加(图3B)，提示UBP15特异(至少部分)决定了莲座叶的边缘。这与iamt1-D相似，其显示出由IAMT1基因的增加的表达水平引起的显著偏下叶表型，并且通过GUS表达测定法发现在莲座叶的边缘中特异表达(Qin等，2005)。
因为具有更窄的莲座叶，ubp15-1突变体中的叶指数增加(尽管叶长更短但改变不大，导致大的叶指数值)。叶细胞的极性伸长或极性细胞增殖控制叶片在叶宽方向上的极性生长(Tsukaya，2006)。截至目前报道的改变叶宽方向上细胞增殖的基因是GIF1(也称为AN3)(Kim和Kende，2004)、GRF5(Horiguchi等，2005)和HUB1(Kim和Kende，2004；Horiguchi等，2005；Fleury等，2007)。它们在正控制叶宽方向上的细胞数目中均是重要的。ubp15突变体改变叶宽方向上的近轴表皮细胞和栅栏细胞数目，但微阵列数据未显示ubp15-1背景中GIF1(AN3)、GRF5或HUB1的表达水平有任何改变。这可能是因为UBP15和那些基因参与不同的途径。
26.UBP15的半胱氨酸氨基酸对其在体外和体内的功能是关键的
体外共表达测定显示UBP15是真正的泛素特异性蛋白酶，并且Cys447对其活性至关重要。发现UBP15可切割α-连接的肽(聚泛素和泛素延展基因)(图5A)，而不切割ε-连接的异构肽(通过异构肽连接的聚泛素链)(数据未显示)，提示其仅在α-连接的肽上起作用，或仅可识别链的靠近底物末端的位点。报道了UBP3、4和5蛋白质含有核定位信号，并推测其仅在异构肽连接的底物上起作用(Chandler等，1997；Rao-Naik等，2000)。UBP15的亚细胞定位(在整个细胞内普遍表达)提示该酶可识别多于一个底物，以行使其不同功能；或其具有去泛素化以外的其他功能。
在该研究中，我们第一次证明了UBP15的Cys447在叶发育中的体内功能。尽管在ubp15-1中表达UBP15野生型构建体可挽救突变体表型，而过表达UBP15C447A或UBP15C447S均不显示对突变体缺陷的互补。这暗示半胱氨酸447是UBP15的功能残基。另一方面，含有野生型UBP15的构建体产生的野生型转基因株系显示向下卷曲的成熟莲座叶，而在Cys447Ala或Cys447Ser中含有突变的构建体产生的那些转基因株系显示ubp15-1突变体表型。该结果证实莲座叶的表型是由UBP15的过表达引起，并且Cys447对该功能至关重要。还暗示是去泛素化活性而不是其它结构域(如锌指MYND)引起异常。最近发现的基因HUB1(Fleury等，2007)，单泛素化H2B的E3连接酶，与ubp15突变体具有相似表型，可能与UBP15具有相同的途径。
也有另一种结果，在野生型背景中含有由35S启动子驱动的UBP15的构建体产生的转基因株系不显示任何表型，突变体也不能被挽救(数据未显示)。这提示天然启动子可为更好的行使外源蛋白质的功能提供有利的空间结构。
27.UBP15调节许多基因的转录
进行微阵列测定以分析UBP15在转录水平上调节其它基因的可能作用。发现与细胞周期相关的两个基因发生了改变，并且可能直接引起ubp15-1中的细胞数目的改变，尽管不像HUB1，其改变基因组内细胞周期蛋白(24种基因)。
我们还发现控制开花的两个基因发生了改变，并且该改变引起了我们观察到的表型。MAF5和花同源异形基因CAL以相反的方向调节开花，两者均显示改变的ubp15-1并引起早花表型。
尽管许多其它基因在ubp15-1中被上调或下调，但是它们看起来是次级效应子，而不是邻近下游的靶标。
28.UBP15亚家族成员间的功能冗余
UBP15亚家族成员编码含有锌指MYND结构域的蛋白质。基于序列相似性可将它们进一步分成3组。UBP16和UBP17在其保守结构域中具有50％的氨基酸同一性，而UBP18和UBP19在全长上具有68％的同一性。但是UBP15与其它四个的相似性更低(UBP15与UBP16在UBP结构域中是37％同一性，与UBP18在全长上是45％的同一性)，这解释了ubp15突变体表型。为了判断UBP16与UBP17是否具有功能冗余性，将这两个基因的两个突变体杂交以产生双突变体。双突变体的纯合子不显示任何表型，提示它们可能在不同的途径中起作用。随后，双突变体与ubp15突变体杂交以检查是否有任何改变。在F2代中，仅ubp15 ubp16鉴定到ubp15突变体的表型，其它的没有检测到。这表明UBP15和UBP16可能具有功能冗余性。三突变体ubp15 ubp16 ubp17显示出与ubp15 ubp16相似表型，进一步提示UBP17不参与其它两个共有的功能。另一方面，ubp16突变体不显示任何可见的表型，但其加强了ubp15突变体的表型，提示在拟南芥中，UBP15是该途径的主要调节子。在另一亚家族UBP1和UBP2中也观察到了功能冗余性，所述UBP1和UBP2的双突变体而不是单突变体对刀豆氨酸敏感(Yan等，2000)。
UBP18和UBP19的序列同源性也暗示了功能冗余性。然而，四个中仅一个突变体(ubp19-1)显示隐性胚致死性。此外，在UBP19 5’UTR上游195bp处的插入引起表型，而在UBP19 5’UTR上游205bp处插入不显示任何表型。这暗示UBP19 5’UTR上游195bp到205bp的区域对UBP19的功能至关重要。
另一方面，尽管在蛋白质序列上除UBP15外，UBP16和UBP17彼此更相关，但是ubp15 ubp16显示与ubp15突变体相似的表型提示相比于UBP17，UBP16在功能上与UBP15更相关。这也应用于UBP18和UBP19组，因为仅在ubp19突变体而不是ubp18突变体中检测到了该表型。这表明序列水平上密切相关的蛋白质不总是在功能上冗余。
附图描述
现在参考下图描述本发明，其中：
图1.拟南芥27个UBPs家族的系统发育分析。
27个UBPs的系统树。树的分支长度与分叉成比例。0.1刻度代表10％变化。自举值以百分数示于结点处。27种蛋白质基于结构域相似性可细分成以不同颜色区分的14个亚家族。在附图1中显示了用于该分析的多序列比对。
在示意性标尺上绘制了具有保守结构域的蛋白质。每一种有色盒代表一个结构域。黑色线代表UBP蛋白质的长度，而可通过结合黑色线评估结构域的长度。aa，氨基酸；UBP，泛素特异性蛋白酶；ZnF，锌指；MYND，骨髓的，Nervy和DEAF-1；DUSP，泛素特异性蛋白酶中的结构域；UBQ，泛素同源物；MATH，甲丙氨酯和TRAF同源性；UBA，泛素相关的。
图2.泛素特异性蛋白酶基因UBP15的表征。
(A)UBP15的基因结构。在4.37kb基因组区域内分散着14个外显子。黑色盒代表外显子，而那些外显子之间的线是内含子。两端的白色盒代表5’和3’UTRs。两个T-DNA敲除株系分别插在第8个和第12个外显子中，每一个导致被破坏的UBP结构域。
(B)通过RT-PCR利用引物UBP15FP和UBP15RP检测了野生型以及纯合ubp15-1和ubp15-2中UBP15的表达。At3g04120/GAPDH作为内部对照。
(C)野生型、纯合ubp15-1和纯合ubp15-2的1个月龄植物。比例尺＝1cm。
(D)野生型、纯合ubp15-1和纯合ubp15-2的12天龄幼苗。比例尺＝1cm。
(E)野生型、纯合ubp15-1和纯合ubp15-2的花。比例尺＝1mm。
(F)野生型、纯合ubp15-1和纯合ubp15-2的长角果。比例尺＝1cm。上述所有植物均在16小时光照/8小时黑暗条件下生长。
(G)野生型和ubp15-1在短日照条件(8小时光照/16小时黑暗)中莲座叶的长宽比。误差线代表了7次重复的标准差。
图3.UBP15的组织和发育表达模式，以及UBP15在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。
(A)UBP15组织表达模式的RT-PCR分析。At3g04120/GAPDH用作内部对照。
(B)三个发育阶段P1、P2和P3的叶中央和边缘区域中UBP15表达模式的Northern印迹分析。如图中线所示，将叶切成两部分：中央和边缘。使用来自不同样品的等量总RNA，并用UBP15基因特异性探针杂交并标记凝胶印迹。rRNA带型用于显示相同上样量。C，中央区域；M，边缘区域。比例尺＝1cm。
(C)UBP15在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。比例尺＝100μm。
图4.UBP15编码能够切割多肽的功能性去泛素化酶，并且其Cys447对在体外和体内的功能是关键的。
(A)UBP15可切割底物UBQ1(泛素伸展蛋白质)。在大肠杆菌Novablue(DE3)菌株(Novagen)中的共表达质粒是UBQ1与GST载体(泳道1)、GST-UBP15(泳道2)、GST-UBP15C447A(泳道3)和GST-UBP15C447S(泳道4)。利用抗泛素抗体通过免疫印迹分析检测切割的产物。
(B)UBP15可切割底物UBQ10(六聚体聚泛素)。在大肠杆菌Novablue(DE3)菌株(Novagen)中的共表达质粒是UBQ10与GST载体(泳道1)、GST-UBP15(泳道2)、GST-UBP15C447A(泳道3)和GST-UBP15C447S(泳道4)。利用抗泛素抗体通过免疫印迹分析检测切割的产物。以白色箭显示切割的产物。
(C)UBP15在ubp15-1中的表达概括了其野生型功能，而UBP15而非UBP15C447A或UBP15C447S的过表达引起了具有圆的(早期发育的)和向下卷曲的(成熟的)莲座叶的表型，与ubp15-1突变体相反。从左到右，从上到下的一个月龄样品是：野生型、ubp15-1、UBP15-过表达株系、UBP15-互补株系、UBP15C447A-过表达株系和在ubp15-1中的UBP15C447A-过表达株系。比例尺＝1cm。
(D)转基因株系中UBP15基因表达的RNA凝胶印迹分析。分析了来自野生型(1)、ubp15-1(2)、具有UBP15转基因的野生型(3～6)和具有UBP15转基因的ubp15-1(7～9)植物的RNA水平。从生长了4周的莲座叶中分离总RNA。使用来自不同植物样品的等量总RNA，并用UBP15基因特异性探针杂交并标记凝胶印迹。rRNA带型用于显示等量上样。上边的带(上方箭头)是UBP15 mRNA的全长，而下边的带(下方箭头)代表截短的mRNA。泳道3、4是具有UBP15过表达表型的样品，而泳道5、6与野生型相似，没有明显的UBP15过表达表型。泳道7、8而不是9是挽救样品，因为它们没有显示突变体表型，而是与野生型一样正常。泳道9样品显示ubp15-1突变体表型。
(E)转基因株系中UBP15C447A基因表达的RNA凝胶印迹分析。
图5.野生型与UBP15-过表达株系的比较。
(A)野生型的第九片莲座叶。比例尺＝1mm。
(B)UBP15-过表达株系的第九片莲座叶。比例尺＝1mm。
(C)野生型花的上视图。比例尺＝1mm。
(D)(E)(K)UBP15-过表达株系的异位花。比例尺＝1mm。
(I)野生型花的侧视图。比例尺＝1mm。
(J)UBP15-过表达株系的花的侧视图。比例尺＝1mm。
(F)野生型的次生茎。比例尺＝1cm。
(G)UBP15-过表达株系的退化次生茎。比例尺＝1cm。
(H)野生型的长角果。比例尺＝1cm。
(M)UBP15-过表达株系的异常长角果。比例尺＝1cm。
(L)野生型(左)和UBP15-过表达株系(右)的正常长角果的比较。比例尺＝1cm。
图6.四个株系中叶片上莲座叶的横切面的比较。
(A)从上到下：野生型、ubp15-1、ubp15-2和UBP15-过表达株系。在各小图中，两个子叶和莲座叶从第一到最后一个以及前两个茎生叶从左到右放置。箭头表示茎生叶的位置。比例尺＝1cm。
(B)模型表明了横切面的位置。
(C)莲座叶片上横切面中近轴表皮细胞数目的比较。误差线代表三次生物学重复的标准差。
图7.第九片莲座叶中间区域横切面的组织学比较。
(A)野生型、ubp15-1、ubp15-2、UBP15-过表达株系和ubp15 ubp16的横切面中细胞层的比较。Ad，近轴的；pa，栅栏细胞；sm，海绵状叶肉；ab，远轴的；x，木质部；p，韧皮部。比例尺＝0.1mm。
(B)野生型、ubp15-1、ubp15-2、UBP15-过表达株系和ubp15 ubp16的横切面中中间维管结构的比较。比例尺＝0.1mm。
图8.实时PCR证实了微阵列结果。
随机挑选7个下调基因和2个上调基因用于实时PCR分析，其证实了微阵列结果。
图9.UBP16和UBP17的表征。
(A)UBP16(左)和UBP17(右)的基因结构。
(B)野生型、ubp15-1、ubp15 ubp17、ubp15 ubp16和ubp15 ubp16 ubp17的12天龄幼苗。比例尺＝1cm。
(C)野生型、ubp15-1、ubp15 ubp17、ubp15 ubp16和ubp15 ubp16 ubp17的2个月龄植物。比例尺＝1cm。
图10.UBP18和UBP19的表征。
(A)UBP18(上图)和UBP19(下图)的基因结构。
(B)ubp19显示隐性胚致死性。上边的长角果是ubp19杂合子，下边的是野生型。箭头表示那些异常的纯合子胚。比例尺＝1mm。
(C)野生型(左)和ubp19纯合子(右)的胚的显微镜检查。bup19纯合子在球形期停止发育。比例尺＝20μm。
图11.UBP19的组织表达模式。使用PUBP19：GUS转基因株系测定UBP19的表达模式。
(A)PUBP19：GUS株系12天龄的幼苗。比例尺＝1mm。右下的图是放大6倍的根尖区。
(B)PUBP19：GUS株系的成熟莲座叶。比例尺＝1mm。
(C)PUBP19：GUS株系的花序。左下的图是花的两倍。比例尺＝1mm。
(D)PUBP19：GUS株系的长角果。比例尺＝1mm。
Figure BPA00001213049700641
Figure BPA00001213049700651
Figure BPA00001213049700661
筛选了对应于27个UBP基因中24个基因的30个T-DNA敲除株系的表型。属于3种基因的仅5个株系显示可观察到的表型。
Figure BPA00001213049700662
a.从抽苔植物中取测定结果。植物在16小时光照/8小时黑暗中生长。
b.从抽苔植物中取测定结果。植物在8小时光照/16小时黑暗中生长。
c.从播种后60天的植物中取测定结果。植物在16小时光照/8小时黑暗中生长。
d.从播种后14天的植物中取测定结果。植物在16小时光照/8小时黑暗中生长。
Figure BPA00001213049700671
Figure BPA00001213049700681
Figure BPA00001213049700691
Figure BPA00001213049700701
附图1.27种UBP蛋白质的比对。
高度保守的氨基酸以黑色为底纹，而较不保守的氨基酸以灰色为底纹。比对上方的数字表示共有序列中的氨基酸位置。
附图2.UBP15亚家族的基因表达模式。
1到18种器官是茎生叶、莲座叶、授粉前一天的雌蕊、授粉后一天的雌蕊、授粉后3天的长角果、授粉后8天的长角果、茎、萼片、雄蕊、花瓣、种子、培养细胞、暗中生长的根、白光下生长的根、暗中生长的下胚轴、白光下生长的下胚轴、暗中生长的子叶和白光下生长的子叶。
附图3.稻中AtUBP15亚家族及其同源物的系统发育分析。
拟南芥或稻中9个UBPs的系统树。在结点处以百分数显示自举值。
附图4.两个月大小的野生型株系、两个ubp15突变体株系和UBP15-过表达株系。
两个月大小的野生型、ubp15-1、ubp15-2、UBP15-过表达株系和挽救株系。突变体弱小，开花时间早，并且有更多的次生茎，而UBP15-过表达株系显示相反表型，晚花且具有明显的顶端优势。比例尺＝1cm。
附图5.莲座叶叶片的横切面中栅栏细胞数目的比较。误差线代表三次生物学重复的标准差。
附图6.野生型、突变体以及转基因株系中第九片莲座叶的比较。
(A)野生型、ubp15-1、ubp15-2、UBP15-过表达株系和ubp15 ubp16的第九片成熟的莲座叶。比例尺＝1cm。
(B)第九片莲座叶的三个区域中横切面近轴表皮细胞数目的比较。
附表
附表1.多个器官中27种UBP基因表达的微阵列数据。
Figure BPA00001213049700711
  At1g04860   UBP2   211.2680412   381.2307692   367.7518797   222.8424242   306.9485294   149
  At4g39370   UBP27   46.94845361   74.52631579   127.5   61.02941176   57   77.9
  At5g10790   UBP22   379.1443299   600.3508772   273.7743975   238.0147059   289.1911765   91
  At5g46740   UBP21   120.9278351   158.4335664   383.9718913   241.4545455   222.3897059   124.1388889
  At5g57990   UBP23   491   1614.736842   1162.335897   1227.911765   1056   726.6111111
  At3g14400   UBP25   407.5979381   719.3859649   611.4935415   376.2666667   496.0240964   315.4722222
  At4g24560   UBP16   152.2268041   443.9440559   509.277381   546.8235294   367.1686747   142.3611111
  At5g65450   UBP17   59.04123711   193.0909091   134.8794872   150.9090909   152.2058824   85
  At1g17110   UBP15   711.3402062   1031.982456   1031.665293   758.0666667   845   514.7777778
  At4g31670   UBP18   142   404.3356643   203.3615577   209.3308824   181.8014706   188
  At2g24640   UBP19   56   222   205.9252747   238.0147059   203   84.27777778
Figure BPA00001213049700731
  基因代码   基因名   根 暗中   根 白光   下胚轴 暗中   下胚轴 白光   子叶 暗中   子叶 白光
  At4g10590   UBP10   424.8228346   438.28125   173.40625   131.5095238   393.2027027   370.7176157
  At4g10570   UBP9   424.8228346   438.28125   173.40625   131.5095238   393.2027027   370.7176157
  At1g32850   UBP11   51.77382175   85.8125   17.91666667   36.67142857   44.11560694   39.55357143
  At2g40930   UBP5   325.4406923   344.65625   97.63541667   123.1904762   353.9322034   313.0154762
  At5g22030   UBP8   279.9637111   408.21875   129.2604167   143.8857143   419.0860927   422.2265816
  At4g30890   UBP24   414.0984252   531.8125   188.71875   313.3857143   467.1186441   429.1309524
  At4g39910   UBP3   462.4347826   666.46875   311.2708333   294.1071429   540.1788079   598.1203056
  At2g22310   UBP4   128.5507246   111.09375   20.54166667   46.95714286   62.12582781   101.2047619
  At5g06600   UBP12   1517.831793   2085.65625   416.6458333   406.9738095   1479   1652.075033
  At3g49600   UBP26   425.0354331   616.53125   202.71875   183.6095238   397.9595376   378.8214286
  At1g51710   UBP6   1981.102362   3926.3125   569.9583333   668.4071429   889   1159.790698
  At3g21280   UBP7   105.6540784   209.125   42.21875   91.56428571   131.4277457   177.4428571
  At2g32780   UBP1   62.84468789   34.8125   20.13541667   28.72619048   26.65317919   26.14784053
  At1g04860   UBP2   502.2960018   594.59375   183.71875   200.4095238   438.0397351   410.7517483
  At4g39370   UBP27   92.94123017   106.28125   28.96875   47.19047619   109   73.32009044
  At5g10790   UBP22   410.9566929   420.59375   106.6354167   127.0714286   470.7118644   562.8515873
  At5g46740   UBP21   146.8093119   215.71875   63.33333333   84.58809524   145.2138728   122.7753913
  At5g57990   UBP23   832.6963369   1380.65625   540.7708333   948.9547619   817.1125828   1300.761526
  At3g14400   UBP25   730.0184868   1210.8125   323.5520833   322.2595238   837.2774566   704.6364653
  At4g24560   UBP16   345.6990291   359.90625   148.8854167   179.4928571   431.9653179   379.5714286
  At5g65450   UBP17   171.0468619   137.28125   48.69791667   90.40714286   195.8543046   184.5927003
 At1g17110  UBP15   787.4924113   1596.84375   409.7291667   498.3833333   1680.243243   1613.125
 At4g31670  UBP18   388.7701246   783.5625   268.8229167   230.0404762   196.7288136   236.5464286
 At2g24640  UBP19   216.5870136   405.65625   110.78125   162.3714286   315.8513514   298.2021164
附表2.设计用于鉴定T-DNA插入株系基因型的引物。
Figure BPA00001213049700741
Figure BPA00001213049700761
附表3.ubp15-1的转录物组分析。
  基因代码   ID   M   W   M/W
  At1g17110   AF302665   110   1959   0.06
  At1g28375   AC010155   21   221   0.09
  At4g01525   AC069551   25   236   0.11
  At1g14550   AC010657   32   204   0.16
  At3g59970   AF181966   39   239   0.16
  At5g05820.a   F15569   45   270   0.17
  At3g29000   AB025615   37   209   0.18
  At4g12900   AL079349   47   247   0.19
  At1g38450   AC006918   50   233   0.22
  At1g41720   AC006918   50  233   0.22
  At2g06330   AC006918   50  233   0.22
  At1g42360   AC006918   50  233   0.22
  At1g42370   AC006918   50  233   0.22
  At1g37160   AC006918   50  233   0.22
  At5g39890   AB010077   57  256   0.22
  At1g63530   AC008047   56  253   0.22
  At1g71150   AC016972   55  244   0.22
  At1g32060   AC074309   517  2159   0.24
  At5g66990   AB026640   73  302   0.24
  At1g35690   AC007887   81  322   0.25
  At5g41315   AB006707   60  230   0.26
  At3g02120   AC011664   76  290   0.26
  At4g02240   AL096882   64  244   0.26
  At5g65330   AL096882   64  244   0.26
  At5g45820   AB016870   495  1874   0.26
  At2g06410   AC006918   69  244   0.28
  At5g48490   AB020745   2248  7953   0.28
  At4g28440   AV557403   62  217   0.29
  At1g62710   AF367254   85  281   0.3
  At1g77880   AC009243   83  276   0.3
  At1g48980   AC016041   61  203   0.3
  At3g60500   AL138646   62  206   0.3
  At3g01650   AC009325   71  241   0.3
  At5g01600   AF326869   5374  17383   0.31
  At5g16580   AB008270   72  231   0.31
  At1g14500   AC012188   71  228   0.31
  At5g65080   AF214485   114  363   0.31
  At4g07938   AC006423   63  200   0.31
  At5g02720   AL162973   66  212   0.31
  At5g58830   AB016885   120  386   0.31
  At1g43830   AC006423   63  200   0.31
  At2g38690   AC005499   90  287   0.31
  At2g02690   AC002521   64  201   0.32
  At1g51960   AC006216   160  502   0.32
  At1g48660   AC073555   116  364   0.32
  At5g19840   AB024038   71  218   0.33
  At1g65920   AC009513   123  376   0.33
  At4g24080   AC002343   94  282   0.33
  At3g55240   AL132954   508  1545   0.33
  At1g44446   AB021316   3029  8868   0.34
  At4g39090   AL035679   2180  6320   0.34
  At4g38590   AL035540   74  220   0.34
  At4g12440   AL049730   80  231   0.34
  At4g20450   AL080253   104  308   0.34
  At2g29670   AF375460   6906  19504   0.35
  At4g31360   AL021633   190  547   0.35
  At1g53930   AC006577   112  318   0.35
  At3g63160   BE039458   1963  5579   0.35
  At2g34940   AC004238   113  320   0.35
  At3g26210   AB024038   515  1421   0.36
  At5g44510   AB017065   73  202   0.36
  At1g32810   AC006424   153  421   0.36
  At4g13490.a   AA404812   4980  13728   0.36
  At3g58650   AL137082   87  244   0.36
  At5g62080   AB016880   81  217   0.37
  At4g09930   AL049481   110  297   0.37
  At1g47730   AC007519   110  296   0.37
  At2g22240   U30250   235  626   0.37
  At3g59400   AL356014   6379  17232   0.37
  At3g01080   AC008261   102   276   0.37
  At2g46590   AC006418   145   386   0.38
  At4g20970   AL080282   95   248   0.39
  At3g27500   AB025626   78   200   0.39
  At1g17740   AB010407   105   267   0.39
  At4g26460   AL022223   100   256   0.39
  At5g54190   U29699   880   2255   0.39
  At3g56790   AL390921   111   287   0.39
  At3g46760   AL096859   80   207   0.39
  At1g32900   AC006424   158   406   0.39
  At5g49140   AB023028   107   268   0.4
  At4g36195   AL022141   97   242   0.4
  At4g35960   AL022373   96   242   0.4
  At3g30130   AY046045   221   555   0.4
  At1g74980   AY045856   476   1195   0.4
  At1g77410   AC078898   85   214   0.4
  At1g49800   AC079674   112   280   0.4
  At1g28470   AV567286   152   381   0.4
  At1g56350   AY046045   221   555   0.4
  At2g18150   AC007212   152   383   0.4
  At1g05700   AC007153   108   273   0.4
  At4g29230   AL161574   126   313   0.4
  At3g52040   AL049711   94   236   0.4
  At1g63570   AC008047   151   378   0.4
  At5g11330   AL360314   1143   2805   0.41
  At3g13760   AP001307   151   368   0.41
  At1g27220   AC004557   85   207   0.41
  At1g04710   AC002376   144   356   0.41
  At5g51670   AB025607   198   477   0.41
  At1g63840   H77052   242   585   0.41
  At2g31670   AV540982   214  519   0.41
  At4g20380   U87834   101  247   0.41
  At3g18780   U41998   687  1650   0.42
  At3g03590   AC009327   190  450   0.42
  At3g27160   AY039901   6880  16566   0.42
  At4g16780   X68146   1165  2800   0.42
  At1g56080   AC009894   115  272   0.42
  At3g25080   AB026647   163  389   0.42
  At3g10440   AC011560   231  555   0.42
  At2g11010   AB028615   133  315   0.42
  At2g46570   AC006418   84  200   0.42
  At1g71030   Z68157   3598  8496   0.42
  At1g41630   AC006250   238  572   0.42
  At1g41600   AC006250   238  572   0.42
  At1g41660   AC006250   238  572   0.42
  At4g23700   AL035394   142  336   0.42
  At4g10220   AF096373   89  211   0.42
  At5g37230   AB017069   104  245   0.42
  At5g37250   AB017069   104  245   0.42
  At5g37270   AB017069   104  245   0.42
  At5g03350   AL162751   2212  5268   0.42
  At5g24470   AF027408   407  972   0.42
  At1g79910   AC011717   104  247   0.42
  At1g62690   AC007190   137  317   0.43
  At5g06980   AY042849   657  1544   0.43
  At1g75100   AC013258   117  271   0.43
  At1g30080   AC022455   108  251   0.43
  At2g35310   AC004667   171  397   0.43
  At1g44542   AC084807   133  312   0.43
  At1g50720   AC079027   120  276   0.43
  At2g47150   AC004411   103  238   0.43
  At2g46140   AC005397   112  259   0.43
  At3g51150   AL132980   93  218   0.43
  At3g42230   AL138645   168  390   0.43
  At3g49160   AL132956   485  1128   0.43
  At4g36470   AL161589   146  340   0.43
  At1g36960   AC051631   86  202   0.43
  At1g66100   AF380652   6908  15905   0.43
  At2g47860   AC005309   117  275   0.43
  At3g60570   AL138646   116  260   0.44
  At1g08630   AC003981   93  213   0.44
  At3g04360   AC016829   89  201   0.44
  At5g26700   AF058914   111  255   0.44
  At1g04570   AC002376   117  263   0.44
  At2g19070   AC002392   92  206   0.44
  At2g04440   AC006951   113  256   0.44
  At2g41300   AC005662   107  245   0.44
  At4g23970   AL078468   114  254   0.45
  At1g43880   AC006423   147  331   0.45
  At1g27490   AC004557   116  260   0.45
  At1g65300   AC004512   106  236   0.45
  At3g04070   AC011698   152  335   0.45
  At1g38196   AC006423   147  331   0.45
  At3g58350   AL137081   180  401   0.45
  At1g80640   AC018849   96  214   0.45
  At3g45390   AL132953   115  254   0.45
  At1g14390   AC012188   188  407   0.46
  At1g37130   AF367272   4767  10361   0.46
  At5g51760   AB010074   132  289   0.46
  At2g11760   AC074109   217  468   0.46
  At2g12010   AC074109   217   468   0.46
  At2g34980   AC004238   100   215   0.46
  At5g39330   AB009054   171   370   0.46
  At4g12210   AL080318   103   224   0.46
  At4g12220   AL080318   103   224   0.46
  At3g45650   AL138657   239   519   0.46
  At5g62130   AB016880   343   745   0.46
  At3g59060   AL163527   2960   6497   0.46
  At1g38340   AC074109   217   468   0.46
  At5g27700   AV534288   124   271   0.46
  At1g38149   AC074109   217   468   0.46
  At4g07733   AC074109   217   468   0.46
  At3g16320   AC001645   119   260   0.46
  At1g09150   AC003114   104   227   0.46
  At1g20030   AC022472   330   699   0.47
  At1g19010   AF360209   217   458   0.47
  At2g36050   AY044326   179   381   0.47
  At3g48800   AL132963   186   397   0.47
  At4g00320   AL161471   202   429   0.47
  At3g19050   AP000735   149   315   0.47
  At5g46330   AB010698   101   216   0.47
  At1g73480   AY045929   1324   2806   0.47
  At1g77760   AC012193   1190   2545   0.47
  At5g08480   AB006697   120   255   0.47
  At3g51830   U72504   886   1904   0.47
  At4g28950   AF079484   112   237   0.47
  At4g18250   AL021713   116   249   0.47
  At3g19700   AP000417   186   400   0.47
  At3g48940   AL132967   98   207   0.47
  At5g42250   AB023032   935   1961   0.48
  At5g35970   AB026643  2449  5056   0.48
  At1g06210   AC025290  265  546   0.48
  At4g17460   U09332  2470  5158   0.48
  At1g44860   AC007264  125  259   0.48
  At2g10370   AC007264  125  259   0.48
  At1g43740   AC009526  126  262   0.48
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  At3g60810   AL162295  261  118   2.21
  At3g52145   A1995315  206  93   2.22
  At2g16600   U40399  24863  11149   2.23
  At2g30570   U93215  8840  3958   2.23
  At3g53420   AY039579  20978  9407   2.23
  At5g13510   AL391710  21808  9770   2.23
  At4g35450   U70425  19189  8562   2.24
  At3g61700   AV557897  238  106   2.24
  At5g66570   AF372898  8498  3775   2.25
  At2g46330   AC006526  18763  8298   2.26
  At5g06540   AP002543  307  136   2.26
  At3g15530   AC024081  1342  592   2.27
  At1g20300   AC026234  653  286   2.28
  At2g27385   AV531683  327  144   2.28
  NoAnno   AF360265  27827  12129   2.29
  At1g75350   AF370226  16420  7163   2.29
  At1g30260   AC073506  4248  1858   2.29
  At2g32290   AC005700  434  189   2.3
  At3g46430   AL133298  19794  8588   2.3
  At4g16370   AL161543  3197  1382   2.31
  At1g44810   AY042861  277  120   2.32
  At4g17980   AL021889  357  154   2.32
  At5g52050   AB015478  478  205   2.33
  At3g50820   AJ145957  16012  6873   2.33
  At5g42900   AB008264  7894  3370   2.34
  At4g30750   AY037251  209  89   2.36
  At2g31920   AC006533  210  89   2.36
  At2g01300   AC006200  1094  461   2.37
  At5g08280   X73535  25523  10707   2.38
  At5g62300   AF370460  27616  11598   2.38
  At5g50610   AB025619  222  93   2.38
  At5g50710   AB025619  222  93   2.38
  At3g07650   AC009176  4686  1965   2.39
  At5g11780   AL163814  274  114   2.39
  At4g32430   AL034567  394  164   2.4
  At5g02500   X74604  20275  8429   2.41
  At3g54890   AF326866  9157  3789   2.42
  At3g59340   AF370505  692  284   2.43
  At1g79850   Z11151  830  339   2.45
  At2g21660   AY042826  613  250   2.45
  At2g39320   AC004697  773  316   2.45
  At2g21420   AC006841  260  106   2.45
  At4g36010   AF360165  958  388   2.47
  At4g13940   AF325037  26706  10790   2.48
  At1g32080   AC084165  20969  8468   2.48
  At4g01260   AL161491  227  91   2.48
  At4g31830   AL049607  292  118   2.48
  At3g24420   AP000382  8999  3623   2.48
  At2g28900   AY045593  21483  8645   2.49
  At1g63820   AC010852  214  86   2.5
  At5g16400   AF144386  19378  7696   2.52
  At1g14320   AY045866  22985  9128   2.52
  At1g27710   AC012375  213  85   2.52
  At1g75690   AC006434  24943  9882   2.52
  At3g44990   X92975  865  343   2.52
  At5g06290   AF326871  22183  8782   2.53
  At3g15630   AB017071  22541  8902   2.53
  At5g01100   AL137189  595  235   2.53
  At1g73810   AC012679  279  110   2.54
  At5g14610   AL163792  30717  12004   2.56
  At5g42530   AB016888  7812  3054   2.56
  At2g28800   U89272  22626  8809   2.57
  At2g36970   AC006922  308  120   2.57
  At1g77110   AC002291  255  99   2.58
  At1g28410   AC010155  257  99   2.6
  At1g32990   AF325023  20190  7763   2.6
  At5g63580   AB005234  209  80   2.62
  At2g21800   AC007019  204  78   2.63
  At2g33450   AC002332  25052  9518   2.63
  At2g23910   AC005170  699  266   2.63
  At2g19150   AC002392  206  78   2.64
  At5g23660   AF095641  2931  1106   2.65
  At3g21470   AB019232  401  151   2.66
  At5g13630   Z68495  21783  8155   2.67
  At2g42220   AY045616  20113  7535   2.67
  At2g03190   AC005313  206  77   2.68
  At1g44880   AC020576  245  91   2.68
  At2g10350   AC020576  245  91   2.68
  At4g03970   AC020576  245  91   2.68
  At3g42530   AC020576  245  91   2.68
  At3g01310   AC010676  212  79   2.68
  At3g45680   AL157735  258  95   2.72
  At3g45690   AL157735  258  95   2.72
  At2g10940   AC006429  8529  3119   2.73
  At5g46110   AY037211  7130  2614   2.73
  At2g41430   AC004625  8374  3041   2.75
  At1g48300   AC007932  2604  935   2.78
  At1g28760   AC007508  310  111   2.8
  At1g44040   AC022314  360  129   2.8
  At1g08790   AC003981  277  99   2.81
  At5g63090   AB008265  223  80   2.81
  At3g49910   AF370158  22291  7877   2.83
  At3g12840   AB024033  220  77   2.84
  At2g29280   AC004561  496  175   2.84
  At1g12610   AC025417  293  103   2.85
  At2g28460   AC006587  256  89   2.86
  At2g38240   AC003028  282  98   2.87
  At2g05070   AY045787  20173  6958   2.9
  At2g05100   AY045787  20173  6958   2.9
  At4g25050   T45818  15045  5121   2.94
  At4g10260   AL049488  309  105   2.94
  At1g49500   AF370563  22168  7513   2.95
  At5g58310   AB019228  1438  487   2.95
  At3g45520   AL161500  215  72   2.97
  At4g04380   AL161500  215  72   2.97
  At3g25290   AB026647  307  103   2.99
  At3g01500   AC009325  616  205   3
  At4g24420   AL078637  202  67   3
  At3g43600   AB005805  19762  6576   3.01
  At5g11370   AL360314  236  78   3.01
  At2g28000   AC006929  27972  9297   3.01
  At5g39670   AB012243  291  96   3.03
  At5g24780   AF386930  375  123   3.05
  At1g23310   AF360195  31336  10247   3.06
  At2g34420   X64460  7379  2403   3.07
  At3g21640   AJ224640  20590  6686   3.08
  At5g15960   X55053  22316  7183   3.11
  At5g15970   X55053  22316  7183   3.11
  At3g01600   AC009325  233   75   3.11
  At4g32540   AL050398  303   97   3.12
  At2g11820   AB047398  207   66   3.12
  At4g17350   AL161546  215   69   3.13
  At1g04270   AY048221  22066   7025   3.14
  At2g17180   AC007127  345   109   3.15
  At4g21280   AL021960  7348   2313   3.18
  At3g53290   AL132958  228   71   3.2
  At5g44980   AB010693  210   65   3.22
  At2g30950   AF135189  29571   9161   3.23
  At3g12430   AC069474  270   83   3.24
  At4g32490   AL034567  261   81   3.25
  At1g69990   AC002062  249   76   3.26
  At5g05250   AB010692  1176   358   3.28
  At3g56360   AL163972  1291   391   3.3
  At1g72150   AY045913  24133   7291   3.31
  At4g21990   U53865  1684   509   3.31
  At2g30840   AC004669  308   93   3.32
  At1g41810   AC022456  240   71   3.37
  At5g29090   AC022456  240   71   3.37
  At5g32610   AC022456  240   71   3.37
  At3g59170   AL356014  217   64   3.41
  At5g37470   AP000607  223   65   3.45
  At2g25040.a   AV558611  287   83   3.46
  At3g32370.a   AV558611  287   83   3.46
  At5g37300   AB017069  753   217   3.48
  At4g22214   AL021712  256   73   3.51
  At1g48700   AC073555  275   78   3.52
  At1g55850   AC002304  267   75   3.57
  At1g04920   AC004809  362   99   3.64
  At4g03280   AJ243702  1486   400   3.71
  At1g35660.a   AC007887  203   55   3.73
  At4g27110   AL035680  201   51   3.9
  At2g04820   AC006955  341   85   4.01
  At1g75910   AC007396  205   51   4.04
  At3g21980   AB028622  215   52   4.15
  At3g27830   AP000371  25310   6009   4.21
  At1g74080   AC016662  352   83   4.26
  At2g17850   AC003952  277   65   4.29
  At2g45570   AC003680  251   58   4.33
  At3g56040   AV548493  280   62   4.49
  At5g25980   AF360348  28538   6306   4.53
  At3g43580   AL391734  222   48   4.61
  At5g38710   AB011478  376   78   4.81
  At3g12760   AB024033  271   50   5.41
  At1g32920.a   BE522104  235   28   8.35
W，野生型；M，突变体。
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Claims (18)

1.用于改变植物生长和/或发育的方法，其包括调节在植物中编码UBP15亚家族的泛素特异性蛋白酶(UBP)或其同源物的核酸的表达，所述UBP或其同源物包含以下基序：
(i)Cys盒；
(ii)His盒；和
(iii)ZnMYND锌指结构域。
2.权利要求1的方法，其中所述改变的生长和/或发育选自以下的一种或多种：改变的细胞增殖、改变的叶发育、改变的生殖发育。
3.权利要求1到3任何一项的方法，其中通过在植物中引入并表达编码UBP15多肽或其同源物的核酸实现所述受调节的表达。
4.前面权利要求任一项的方法，其中所述编码UBP15多肽的核酸由SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、39或44的任一个代表，或是这种核酸的一部分，或能够与这种核酸杂交的核酸。
5.前面权利要求任一项的方法，其中所述核酸序列编码SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、14、16或18任一个的直向同源物或旁系同源物。
6.权利要求3到5任何一项的方法，其中所述核酸有效连接组成型启动子，优选CaMV35S启动子。
7.前面权利要求任一项的方法，其中所述编码UBP15多肽或其同源物的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。
8.通过前面权利要求任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码UBP15多肽或其同源物的重组核酸。
9.构建体，其包含
(i)编码如权利要求1或2中定义的UBP15多肽或其同源物的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或更多控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
10.权利要求9的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选CaMV35S启动子。
11.权利要求9或10的构建体用于产生相对于对照植物具有改变的生长和/或发育的植物的用途。
12.用权利要求9或10的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
13.产生具有改变的生长和/或发育的转基因植物的方法，其包括：
(i)在植物中引入并表达编码如权利要求1中定义的UBP15多肽或其同源物的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
14.相对于对照植物具有改变的生长和/或发育的转基因植物，其来源于编码UBP15多肽或其同源物的核酸的受调节的表达。
15.权利要求8、12或14的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是农作物植物或单子叶植物或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
16.权利要求15的植物的可收获部分，其中所述收获部分优选为苗生物量和/或种子。
17.来自权利要求15的植物和/或权利要求16的植物的可收获部分的产品。
18.编码UBP15多肽或其同源物的核酸在相对于对照植物改变植物生长和/或发育中的用途。
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