CN114524866B

CN114524866B - 一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白

Info

Publication number: CN114524866B
Application number: CN202210170558.9A
Authority: CN
Inventors: 张悦; 王庆雷; 时荣荣; 刘青松; 宋素胜; 赖德强; 刘福顺; 吴娱; 冯晓洁
Original assignee: Cangzhou Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Current assignee: Cangzhou Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114524866A

Abstract

本发明提供了一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白。其中的植物内源其蛋白可以影响昆虫取食所述植物的量，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

Description

一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白

技术领域

本发明涉及一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白，特别是缺失或沉默该基因后的纯合子植物能够获得对鳞翅目昆虫的抗性。

背景技术

在农业生产中，害虫是影响作物产量和品质的重要原因之一，每年都会给农民造成巨大经济损失。鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫，属有翅亚纲、全变态类。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目，分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。目前，针对作物害虫的防治主要依赖于化学农药，但化学农药具有刺激气味，对环境和人身健康都有严重威胁，所以从自然资源中挖掘天然杀虫材料越来越受到人们重视。在植物中寻找天然的抗虫基因或影响昆虫取食的基因，对于开发新型天然抗虫品系作物具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明之一提供了一种植物内源蛋白在影响昆虫取食所述植物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在一个具体的实施方式中，通过抑制所述植物内源蛋白、失活所述植物内源蛋白、沉默所述植物内源蛋白，抑制所述植物内源蛋白的表达、沉默所述植物内源蛋白的表达以及降低所述植物内源蛋白的表达量中的一种使所述植物获得对昆虫的抗性。

在一个具体的实施方式中，所述昆虫为鳞翅目昆虫中的至少一种。

在一个具体的实施方式中，所述昆虫为灰翅夜蛾属昆虫中的至少一种。

在一个具体的实施方式中，所述昆虫为草地贪夜蛾和/或甜菜夜蛾。

在一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。

本发明之二提供了编码如本发明之一中任意一项所述的应用中的植物内源蛋白的核酸在影响昆虫取食所述植物中的应用。

在一个具体的实施方式中，通过对所述核酸进行突变得到突变型植物获得对昆虫的抗性。

在一个具体的实施方式中，所述突变为插入突变、缺失突变、移码突变中的一种。

在一个具体的实施方式中，所述突变为插入突变或缺失突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变为T-DNA插入突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变型植物为突变型纯合子。

在一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。

在一个具体的实施方式中，所述核酸的序列如SEQ ID No.1所示。

在一个具体的实施方式中，所述昆虫为草地贪夜蛾。

本发明的有益效果：

本发明首次发现在植物中存在的cznky2020003基因可以吸引鳞翅目昆虫幼虫，特别是草地贪夜蛾或甜菜夜蛾幼虫的取食，而将cznky2020003基因从植物中敲除或基因的部分序列缺失的纯合子则可以抑制昆虫幼虫的取食，进而提高植物对鳞翅目昆虫幼虫，特别是对草地贪夜蛾或甜菜夜蛾幼虫的抗虫性。因此，可以据此通过将植物中的cznky2020003基因敲除、沉默或缺失获得纯合子植株以达到抑制昆虫幼虫的取食，进而提高植物抗虫性的目的。

附图说明

图1为cznky2020003的基因结构。

图2显示了14天后取食cznky2020003-1、cznky2020003-2和Col-0植株的草地贪夜蛾幼虫的平均单只虫重。

图3显示了14天后取食cznky2020003-1、cznky2020003-2和Col-0植株的甜菜夜蛾幼虫的平均单只虫重。

具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

在ABRC(https://abrc.osu.edu/)官网订购拟南芥Col-0(野生型)、cznky2020003T-DNA插入型突变体cznky2020003-1(种子号：SALK_113300)和cznky2020003T-DNA插入型突变体cznky2020003-2(种子号：SALK_009641C)。图1显示了cznky2020003的基因结构。如图1所示，在cznky2020003-1中，T-DNA插入在第12个外显子处；在cznky2020003-2中，T-DNA插入在第8个内含子处。其中，cznky2020003的核酸序列如SEQ ID No.1所示，其蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.2所示。

将拟南芥突变体cznky2020003-1和cznky2020003-2种子分别点铺在MS培养基上，待拟南芥植株长至4-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长(24℃；光照:黑暗＝16h:8h)，45天后各取24株分别提取突变体植株叶片的DNA。

1.cznky2020003-1突变型纯合子的筛选

以引物F1(SEQ ID No.3)、引物R1(SEQ ID No.4)，以及以突变体cznky2020003-1各植株的DNA为模板进行PCR扩增，用来鉴定突变体cznky2020003-1的各植株是否在cznky2020003基因上存在T-DNA插入；以引物F2(SEQ ID No.5)、引物R1(SEQ ID No.4)，以及以突变体cznky2020003-1各植株的DNA为模板进行PCR扩增，用来鉴定突变体cznky2020003-1的各植株是否存在cznky2020003基因。将F1/R1引物对扩增后的PCR扩增产物显示约700bp，且F2/R1引物对扩增后无PCR扩增产物的植株确定为cznky2020003-1纯合突变体植株，即突变型纯合子。

2.cznky2020003-2突变型纯合子的筛选

以引物F1(SEQ ID No.3)、引物R2(SEQ ID No.6)，以及以突变体cznky2020003-2各植株的DNA为模板进行PCR扩增，用来鉴定突变体cznky2020003-2各植株在cznky2020003基因上是否存在T-DNA插入。以引物F3(SEQ ID No.7)、引物R2(SEQ ID No.6)，以及以突变体cznky2020003-2各植株的DNA为模板进行PCR扩增，用来鉴定突变体cznky2020003-2各植株是否存在cznky2020003基因。将F1/R2引物对扩增后的PCR扩增产物显示约500bp，且F3/R2引物对扩增后无PCR扩增产物的植株确定为cznky2020003-2纯合突变体植株，即突变型纯合子。

3.收获突变型纯合子的种子

待所筛选出的cznky2020003-1和cznky2020003-2纯合突变体植株的种子成熟后，分别收取cznky2020003-1和cznky2020003-2纯合突变体的种子。

4.对草地贪夜蛾的抗虫试验

将纯合突变体cznky2020003-1和cznky2020003-2的种子和野生型Col-0的种子分别点铺在MS培养基上，待植株长至4-6片叶子时，分别移栽至装满蛭石的花盆中(花盆尺寸为上直径7cm，下直径5cm，高8cm)，每盆移栽5株，每个基因型移栽10盆，将植株放置在24℃，光照:黑暗＝16h:8h条件下生长21天。将草地贪夜蛾初孵幼虫接到拟南芥植株叶片上，每盆接种20只，为1个重复，每个基因型3个重复。在花盆上覆盖透气性的PVC盖子，防治虫体逃逸。分别在第7天、第10天、第12天更换新的相应基因型的拟南芥植株，保证幼虫有充足的叶片可取食。整个试验持续14天。

在整个试验期间观察幼虫的取食情况，结果发现草地贪夜蛾幼虫取食cznky2020003-1和cznky2020003-2植株的量少于野生型Col-0植株，并且取食cznky2020003-1植株的量最少，这表明cznky2020003基因的存在能够吸引草地贪夜蛾幼虫取食该植物，而与野生型对照相比，cznky2020003基因缺失的纯合突变体更不易被草地贪夜蛾幼虫取食，从而表现出抗虫性。

在第14天，取出取食cznky2020003-1、cznky2020003-2和Col-0植株的幼虫，分别单只称重，然后各处理取平均值。结果见图2。

从图2的结果可知，取食拟南芥突变型纯合子cznky2020003-1和cznky2020003-214天后的草地贪夜蛾幼虫的虫重均显著低于取食拟南芥野生型Col-0的草地贪夜蛾幼虫的虫重(P<0.005)。这进一步表明cznky2020003基因的存在能够吸引草地贪夜蛾幼虫取食该植物，进而有利于草地贪夜蛾幼虫的生长发育；而与野生型对照相比，cznky2020003基因缺失的纯合突变体更不易被草地贪夜蛾幼虫取食，进而不利于草地贪夜蛾幼虫的生长发育，从而使有关植株表现出抗虫性。

5.对甜菜夜蛾的抗虫试验

操作同第4小节，不同之处仅在于将草地贪夜蛾替换为甜菜夜蛾。

甜菜夜蛾幼虫体重的结果见图3。

在整个试验期间观察幼虫的取食情况，结果发现甜菜夜蛾幼虫取食cznky2020003-1和cznky2020003-2植株的量少于野生型Col-0植株，这表明cznky2020003基因的存在能够吸引甜菜夜蛾幼虫取食该植物，而与野生型对照相比，cznky2020003基因缺失的纯合突变体更不易被甜菜夜蛾幼虫取食，从而表现出抗虫性。

从图3的结果可知，取食拟南芥突变型纯合子cznky2020003-1和cznky2020003-214天后的甜菜夜蛾幼虫的虫重均显著低于取食拟南芥野生型Col-0的甜菜夜蛾幼虫的虫重(P<0.005)。这进一步表明cznky2020003基因的存在能够吸引甜菜夜蛾幼虫取食植物，进而有利于甜菜夜蛾幼虫的生长发育；而与野生型对照相比，cznky2020003基因缺失的纯合突变体更不易被甜菜夜蛾幼虫取食，进而不利于甜菜夜蛾幼虫的生长发育，从而表现出抗虫性。

序列表

<110> 沧州市农林科学院

<120> 一种影响鳞翅目昆虫取食的植物内源基因及其蛋白

<130> LHA2060605

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2196

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgatgttgg tttttcttct gattcgccgg caatggagat ctgcttctgt gagaagagaa 60

gaggtgattc gtctcattgc tttagccacc gaggaatctt atttggcgga ggaagttcgt 120

cccgccactg ttgattacgg cggagactcg gtttctgatg tttaccgttg tgccgtttgt 180

ctatacccta ccactactcg ttgctctcag tgcaaatctg ttcgttactg ttcaagcaag 240

tgtcaaattc ttcactggcg acgaggtcat aaggaagaat gtcgatcgcc tgattatgat 300

gaagaaaagg aggagtatgt tcaatctgat tatgatgcta aagagtctaa tgtggatttt 360

ccatctcgtg ggactgcgta tgaatcatca tctaatgtgt ctgttgatgt tgcctgtgat 420

atgtctacaa gtaggcctag tattcataaa gtgcaaccta gatctgaagc tgtggatttc 480

actacttctt taaacataaa ggataatctc tatgagacca ggccactaag taggaagaaa 540

tcacgtaatc gtacagacaa ggttgagtca gccagtaatt attccaaagg aaagactgat 600

gcaaagctgc ggaaacttgg caatcaaaat tcacgtaggt caggtgattc ggctaatatg 660

tcaatttcag atcaattttt gtcagttggg tttgaagaag aaatgaatgc acttaaacat 720

gaaagaatta catctgaacc atctagtgct tctgctgcaa tgtcttcgtc ttcaactctt 780

ctcctacctt caaaagctaa cagtaagcca aaagtgtcac aagcttcaag tagtggattg 840

aaaacatcgg tgcagaaagt tgttcagcat tttagacctc cacagtcgtc caaaaagtct 900

caaccttcca gttctattga tgagatgagc ttctcgtatg agttgtttgt gaaactttat 960

tgtgatagag tagaattaca gccatttggc cttgtgaact tagggaacag ttgttatgca 1020

aatgctgtcc ttcagtgctt ggcattcact cggccactga tatcatacct tattagggga 1080

ttacactcta aaacatgtag aaagaagagt tggtgttttg tttgtgagtt tgaacactta 1140

attttaaagg caaggggagg agaatctcct ctttcaccta tcaagatctt atcaaaatta 1200

caaaagattg ggaagcatct tggccctgga aaagaagaag acgcgcacga gtttttaagg 1260

tgtgctgttg atacaatgca atctgttttt ctcaaagagg ctcctgcagc tggtccgttt 1320

gctgaagaaa ctactttagt aggccttacg tttggtggat atcttcactc caagattaaa 1380

tgcatggcat gcctccacaa atctgagcga ccggagctga tgatggatct aactgttgag 1440

attgatgggg atataggaag cctcgaagaa gcacttgctc aattcacagc atacgaagtc 1500

ctagatggag agaaccggta tttctgtggc agatgtaaat cttaccagaa agccaaaaag 1560

aaattgatga tattggaagg acccaatatt cttactgtcg tgctgaaacg ttttcagtct 1620

gataactttg ggaagctgag caaacccatc cattttcccg agcttctcga tattagcccg 1680

tatatgagtg acccaaatca tggggatcat ccggtttata gtctctacgc agtggtggtc 1740

catttggatg ctatgagcac tttattttca ggtcattatg tttgctacat aaaaaccctt 1800

gatggagatt ggttcaaaat tgatgacagc aatgttttcc cggttcagtt agagactgtg 1860

ttactagaag gagcatacat gcttctttat gcaagggatt ctccgagacc ggtgagcaag 1920

aacggtggtc ggaaatcaaa gcaaagaaga aatttggccg caattccgtc aagaaagggc 1980

aacaagaaac agagagacgg tgataataac agtttgttgc cgcgtgtgga ctggtcgagt 2040

ggaagcctgt cgtcaatgtt tagctcatcg gacacaacaa gctcatgtag cacaaaagac 2100

tcatcaggta ttgagaattt atcagattac ctgtttggtg gagttgaacc ggtttggaaa 2160

tgggatcgtc ataataaatc tcaaacgttt gattga 2196

<210> 2

<211> 731

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Met Leu Val Phe Leu Leu Ile Arg Arg Gln Trp Arg Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Arg Arg Glu Glu Val Ile Arg Leu Ile Ala Leu Ala Thr Glu Glu

20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Glu Glu Val Arg Pro Ala Thr Val Asp Tyr Gly Gly

35 40 45

Asp Ser Val Ser Asp Val Tyr Arg Cys Ala Val Cys Leu Tyr Pro Thr

50 55 60

Thr Thr Arg Cys Ser Gln Cys Lys Ser Val Arg Tyr Cys Ser Ser Lys

65 70 75 80

Cys Gln Ile Leu His Trp Arg Arg Gly His Lys Glu Glu Cys Arg Ser

85 90 95

Pro Asp Tyr Asp Glu Glu Lys Glu Glu Tyr Val Gln Ser Asp Tyr Asp

100 105 110

Ala Lys Glu Ser Asn Val Asp Phe Pro Ser Arg Gly Thr Ala Tyr Glu

115 120 125

Ser Ser Ser Asn Val Ser Val Asp Val Ala Cys Asp Met Ser Thr Ser

130 135 140

Arg Pro Ser Ile His Lys Val Gln Pro Arg Ser Glu Ala Val Asp Phe

145 150 155 160

Thr Thr Ser Leu Asn Ile Lys Asp Asn Leu Tyr Glu Thr Arg Pro Leu

165 170 175

Ser Arg Lys Lys Ser Arg Asn Arg Thr Asp Lys Val Glu Ser Ala Ser

180 185 190

Asn Tyr Ser Lys Gly Lys Thr Asp Ala Lys Leu Arg Lys Leu Gly Asn

195 200 205

Gln Asn Ser Arg Arg Ser Gly Asp Ser Ala Asn Met Ser Ile Ser Asp

210 215 220

Gln Phe Leu Ser Val Gly Phe Glu Glu Glu Met Asn Ala Leu Lys His

225 230 235 240

Glu Arg Ile Thr Ser Glu Pro Ser Ser Ala Ser Ala Ala Met Ser Ser

245 250 255

Ser Ser Thr Leu Leu Leu Pro Ser Lys Ala Asn Ser Lys Pro Lys Val

260 265 270

Ser Gln Ala Ser Ser Ser Gly Leu Lys Thr Ser Val Gln Lys Val Val

275 280 285

Gln His Phe Arg Pro Pro Gln Ser Ser Lys Lys Ser Gln Pro Ser Ser

290 295 300

Ser Ile Asp Glu Met Ser Phe Ser Tyr Glu Leu Phe Val Lys Leu Tyr

305 310 315 320

Cys Asp Arg Val Glu Leu Gln Pro Phe Gly Leu Val Asn Leu Gly Asn

325 330 335

Ser Cys Tyr Ala Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Ala Phe Thr Arg Pro

340 345 350

Leu Ile Ser Tyr Leu Ile Arg Gly Leu His Ser Lys Thr Cys Arg Lys

355 360 365

Lys Ser Trp Cys Phe Val Cys Glu Phe Glu His Leu Ile Leu Lys Ala

370 375 380

Arg Gly Gly Glu Ser Pro Leu Ser Pro Ile Lys Ile Leu Ser Lys Leu

385 390 395 400

Gln Lys Ile Gly Lys His Leu Gly Pro Gly Lys Glu Glu Asp Ala His

405 410 415

Glu Phe Leu Arg Cys Ala Val Asp Thr Met Gln Ser Val Phe Leu Lys

420 425 430

Glu Ala Pro Ala Ala Gly Pro Phe Ala Glu Glu Thr Thr Leu Val Gly

435 440 445

Leu Thr Phe Gly Gly Tyr Leu His Ser Lys Ile Lys Cys Met Ala Cys

450 455 460

Leu His Lys Ser Glu Arg Pro Glu Leu Met Met Asp Leu Thr Val Glu

465 470 475 480

Ile Asp Gly Asp Ile Gly Ser Leu Glu Glu Ala Leu Ala Gln Phe Thr

485 490 495

Ala Tyr Glu Val Leu Asp Gly Glu Asn Arg Tyr Phe Cys Gly Arg Cys

500 505 510

Lys Ser Tyr Gln Lys Ala Lys Lys Lys Leu Met Ile Leu Glu Gly Pro

515 520 525

Asn Ile Leu Thr Val Val Leu Lys Arg Phe Gln Ser Asp Asn Phe Gly

530 535 540

Lys Leu Ser Lys Pro Ile His Phe Pro Glu Leu Leu Asp Ile Ser Pro

545 550 555 560

Tyr Met Ser Asp Pro Asn His Gly Asp His Pro Val Tyr Ser Leu Tyr

565 570 575

Ala Val Val Val His Leu Asp Ala Met Ser Thr Leu Phe Ser Gly His

580 585 590

Tyr Val Cys Tyr Ile Lys Thr Leu Asp Gly Asp Trp Phe Lys Ile Asp

595 600 605

Asp Ser Asn Val Phe Pro Val Gln Leu Glu Thr Val Leu Leu Glu Gly

610 615 620

Ala Tyr Met Leu Leu Tyr Ala Arg Asp Ser Pro Arg Pro Val Ser Lys

625 630 635 640

Asn Gly Gly Arg Lys Ser Lys Gln Arg Arg Asn Leu Ala Ala Ile Pro

645 650 655

Ser Arg Lys Gly Asn Lys Lys Gln Arg Asp Gly Asp Asn Asn Ser Leu

660 665 670

Leu Pro Arg Val Asp Trp Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Met Phe Ser

675 680 685

Ser Ser Asp Thr Thr Ser Ser Cys Ser Thr Lys Asp Ser Ser Gly Ile

690 695 700

Glu Asn Leu Ser Asp Tyr Leu Phe Gly Gly Val Glu Pro Val Trp Lys

705 710 715 720

Trp Asp Arg His Asn Lys Ser Gln Thr Phe Asp

725 730

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

attttgccga tttcggaac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gaaggagcat acatgcttc 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

caaccaatta taaaagagac tgc 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ataatgacct gaaaataaag tgctc 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ccaggtgtgc tgttgataca atgcaa 26

Claims

1.一种植物内源蛋白在影响昆虫取食所述植物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；

通过抑制所述植物内源蛋白、失活所述植物内源蛋白、沉默所述植物内源蛋白，抑制所述植物内源蛋白的表达、沉默所述植物内源蛋白的表达以及降低所述植物内源蛋白的表达量中的一种使所述植物获得对昆虫的抗性；

所述昆虫为草地贪夜蛾或甜菜夜蛾。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

3.编码如权利要求1或2所述的应用中的植物内源蛋白的核酸在影响昆虫取食所述植物中的应用；

通过对所述核酸进行突变得到突变型植物获得对昆虫的抗性；

所述突变型植物为突变型纯合子；

所述昆虫为草地贪夜蛾或甜菜夜蛾。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述突变为插入突变、缺失突变、移码突变中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述突变为插入突变或缺失突变。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述突变为T-DNA插入突变。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

8.根据权利要求3至7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ IDNo. 1所示。