CN102046797A

CN102046797A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

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Publication number: CN102046797A
Application number: CN2009801156724A
Authority: CN
Inventors: X·W·邓; Y·刘; C·勒佐
Original assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin; BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin; BASF Plant Science Co GmbH; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-05-05
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明一般涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码泛素特异性蛋白酶(UBP)的核酸的表达来增强产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码UBP的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或者其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生经常含有异源性遗传组分的植物，所述异源性遗传组分可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后将该遗传物质导入植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜(canola)和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。

许多作物的一个重要性状是早期萌发势。提高早期萌发势是温带和热带稻栽培种中现代稻育种程序的重要目标。长根对于水中播种的稻的正确土壤锚定是重要的。当稻直接播种到被淹没的田间并且当植物必须快速出水时，较长的根与萌发势有关。当实施播种机播种时，较长的中胚轴和胚芽鞘对于好的幼苗萌出是重要的。将早期萌发势改造到植物中在农业中是重要的。例如，弱的早期萌发势局限于对于基于欧洲大西洋部玉米带种质的玉米杂种的引入产生限制。

另一重要的性状是提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界作物减产的主要原因，对于多数作物植物，将平均产量减少50％以上(Wang etal.，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫的耐受性的能力对于世界上的农场主将具有主要的经济利益并且将允许在不利条件下和否则不可能栽培作物的领域中栽培作物。

因此，通过优化上述因素之一可以提高作物产量。

取决于最终用途，某些产量性状的修饰可以相对于其他性状是有利的。例如，对于诸如粮草或木材生产或生物燃料来源的应用，植物的营养部分的增加可以是想要的，对于诸如面粉、淀粉或油生产的应用，种子参数的增加可以是尤其想要的。甚至在种子参数中，一些可以比其他有利，这取决于应用。多种机理可以促进提高种子产量，无论其为增加的种子大小或增加的种子数目的形式。

提高植物中种子产量(种子产量和/或生物量)的一种方法是通过改变植物的内在生长机理，如涉及植物生长或防御机理的细胞周期或多种信号途径。

现在已经发现通过调节植物中编码UBP的核酸的表达可以改善植物中多种产量增强性状。

背景

泛素特异性蛋白酶(UBPs)是真核生物中保守的蛋白质家族，它们在蛋白质去泛素化中起关键作用。泛素对蛋白质的共价修饰在多种细胞途径如细胞周期进展、信号转导、转录调节、DNA修复、胁迫应答、胞吞和细胞凋亡中起关键作用(Hochstrasser，1996；Varshavsky，1997；Hershko andCiechanover，1998；Weissman，2001；Pickart，2004)。蛋白质泛素化由三种酶的级联催化。泛素首先被泛素活化酶(E1)活化，泛素活化酶与泛素C-末端形成硫酯键。泛素然后被转移到泛素缀合酶(E2)。尽管一些E2可以在泛素连接酶(E3)的帮助下催化泛素C-末端与目标蛋白赖氨酸残基的连接，但是其他E2将它们缀合的泛素在靶定底物前转移到E3。通过经一些可能的连接将泛素C-末端连续缀合到前一个泛素的赖氨酸残基，靶标底物蛋白质可以被单泛素化或多泛素化。泛素化底物蛋白质的命运部分取决于缀合的泛素的数目和泛素链中连接的模式。最常见的泛素化是通过Lys48连接的多泛素链(泛素数目＞＝4)，作为被26S蛋白酶体进行蛋白质降解的信号。

去泛素化酶(DUBs)从蛋白质切割泛素也可以影响泛素化底物的蛋白质活性和命运(Wilkinson，1997；Amerik and Hochstrasser，2004；Crosas etal.，2006；Hanna et al.，2006)。那些DUB是特异切割泛素之间或者泛素C-末端和共价连接的多肽之间肽键的蛋白酶。当前已知的DUB一起发挥四种类型的基本生物化学功能：首先，它们从泛素前体(融合到核糖体蛋白)和多泛素基因产物产生成熟的泛素；其次，它们挽救不适当泛素化的蛋白；第三，它们从连接的底物蛋白质切割泛素(链)；第四，从多泛素链释放游离泛素单体。最后三种角色伴随着切割泛素C-末端Gly和靶蛋白的Lys ε-氨基残基之间的异肽键。

半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶是两个主要类别的DUB超家族，半胱氨酸蛋白酶在真核生物中最多(Nijman et al.，2005)。所有已知的金属蛋白酶都具有用于催化活性的JAMM结构域(Verma et al.，2002)。半胱氨酸蛋白酶DUB可以基于泛素-蛋白酶催化中心结构和组织被进一步分成四个家族(Wilkinson，1997；Amerik and Hochstrasser，2004；Nijman et al.，2005)。泛素特异性蛋白酶(UBP，或如哺乳动物中定义的USPs)在高度保守的半胱氨酸盒和组氨酸盒中具有催化性三联残基(Hu et al.，2002)。泛素C-末端水解酶(UCHs)在两个保守的半胱氨酸和组氨酸盒中具有相似的催化性三联残基(Johnston et al.，1997；Johnston et al.，1999)，具有更小的总体蛋白质大小以及在催化表面具有结构障碍以限制它们的能力而仅仅水解泛素C-末端的小酰胺和酯类(Amerik and Hochstrasser，2004)。卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)在半胱氨酸和组氨酸盒中具有与上面两个家族相当的催化性三联体，但是含有OUT相关基序并且被认为是UBP家族的部分(Balakirev et al.，2003；Nanao et al.，2004)。最后，马-约病蛋白结构域蛋白酶(MJDs)具有半胱氨酸和组氨酸样结构域但是与其他三组具有相当低的序列相似性(Burnett et al.，2003；Scheel et al.，2003)。UBP家族组成半胱氨酸蛋白酶的大多数。所有四种类型的上述DUB生物化学功能都在UBP家族中发现，而UCH仅仅对小的蛋白质和泛素前体发挥它们的功能。

在模式植物拟南芥中，对完全测序的基因组的计算机(in silico)分析基于保守Cys和His盒的存在揭示了共27个UBP；那27个UBP被进一步分成14个亚家族(Yan et al.，2000)。以前的报导表明UBP3和UBP4组成一个亚家族，具有体外UBP活性并且存在于细胞核中(Chandler et al.，1997；Rao-Naik et al.，2000)。也表明另一成员UBP5具有体外去泛素化活性(Rao-Naik et al.，2000)。对另一亚家族成员UBP1和UBP2的遗传分析据报导是对氨基酸类似物刀豆氨酸的耐受性所需的。此外，UBP14中功能丧失突变表明在早期胚胎发育中是致死性的(Doelling et al.，2001)。

概述

令人惊奇地，现在发现调节编码UBP多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

根据一个实施方案，提供了相对于对照植物在植物中增强产量相关性状的方法，包括调节植物中编码UBP多肽的核酸的表达。

定义

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式的通过肽键连接在一起的氨基酸。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合未分枝形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。

对照植物

选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而缺少所述转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。

缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。

插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比N端融合或C端融合小约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。

取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。

表1：保守性氨基酸取代的实例

残基	保守性取代	残基	保守性取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然发生形式的蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然发生的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然发生的氨基酸残基的添加。蛋白质“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，它们包含天然发生的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然发生的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然发生的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标记肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(标记肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来自共同的祖先基因。

结构域

术语”结构域″指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。

基序/共有序列/标签

术语”基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

杂交

如本文中所定义的术语”杂交″是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。

术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(T_m)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于T_m约20℃并且高严格性条件是此时温度低于T_m约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。

T_m是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于T_m约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交体形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配T_m下降约1℃。取决于杂交体的类型，T_m可以使用下列等式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog₁₀[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

T_m＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^bb)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体：

对于＜20个核苷酸：T_m＝2(ln)

对于20-35个核苷酸：T_m＝22+1.46(ln)

^a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。

^b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。

^cL＝双链体的长度(以碱基对计)。

^d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。本领域技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。

剪接变体

如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)，BMC Bioinformatics.；6：25)。

等位变体

等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

调节元件/控制序列/启动子

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF的其他3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因该启动子的修饰，或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 GenomeMethods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。

有效连接

如本文中所用的术语”有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。

发育调节性启动子

发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。

诱导性启动子

诱导性启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

根特异性启动子的实例在下面的表2b中列出：

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子主要在种子组织中具有转录活性，但不一定仅仅在种子组织中具有转录活性(在渗漏表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育和/或种子萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉粒/胚特异性的。种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例在下面的表2c中显示。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，将其公开并入本文作为参考，就好像完整给出一样。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子实例

表2e：胚乳特异性启动子实例：

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX	Postma-Haarsma et al，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
		PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
		PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

表2f：糊粉特异性启动子实例：

如本文定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。

可以用于实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下面的表2g中显示。

表2g：绿色组织特异性启动子实例

基因	表达	参考文献
			玉米正磷酸二激酶	叶特异性	Fukavama et al.，2001
玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	叶特异性	Kausch et al.，2001
			稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	叶特异性	Liu et al.，2003
稻小亚基Rubisco	叶特异性	Nomura et al.，2000
			稻β扩展蛋白EXBP9	根特异性	WO 2004/070039
木豆小亚基Rubisco	叶特异性	Panguluri et al.，2005
			豌豆RBCS3A	叶特异性

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中具有转录活性，基本上排除植物的任何其他组织，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。可以用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例在下面的表2h中显示。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

调节

术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加的或减少的。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。

表达

术语“表达”或“基因表达”指一种或多种特定基因或者基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其指基因或基因构建体转录为结构RNA(rRNA，tRNA)或者mRNA，其随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

增加的表达/过量表达

如本文中所用的术语”增加的表达”或“过量表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。

在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。

若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其它真核基因。

内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5′末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。

内源基因

本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可以分离自生物或者可以是人造的，例如，通过化学合成。

降低的表达

本文中提及的”降低的表达”或“降低或基本去除”表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％，或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。

为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。

在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含调控序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其它一般细节，见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。

本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。

一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。

RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。″反义″核酸序列包含与编码蛋白质的″有义″核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区″指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区″指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5′和3′非翻译区)。

反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和′加帽′及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修饰是本领域众所周知的。

这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。

根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。

基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。

当在内源基因上存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。

另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。

其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。

备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。

人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。

通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA，Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的，Schwab等，Plant Cell 18，1121-1133，2006。

为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。

上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。

选择性标记(基因)/报道基因

“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供

抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。本领域技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。

已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。

因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中

(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)。

不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的或在基因组文库中存在的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然发生的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然发生的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。

为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中(该核酸序列)的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸序列的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

转化

如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、胼胝体组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。

外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(inplanta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant MolBiol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。

除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)MolGen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-HChua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)MolGen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ und Bent，AF(1998).The PlantJ.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J MolBiol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastidtransformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。

T-DNA激活标签化

T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

TILLING

术语“TILLING”是基因组内定向诱导的局部损伤的缩写并且意指用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且存在不管靶标生物如何可通常应用的方法(Miller et al，NatureBiotechnol.25，778-785，2007)。

产量

术语”产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。

早期萌发势

早期萌发势(尤其在植物生长早期期间活跃、健康、良好平衡的生长)可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。

增加/改善/增强

术语“增加”，”改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。

种子产量

增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。

种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。

绿色指数

本文所用的“绿色指数”从植物的数字图像计算而来。对于属于图像上植物物体的每个像素，计算绿色值与红色值的比值(用于编码颜色的RGB模式)。将绿色指数表示为绿色与红色比值超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下，和在降低的养分有效性生长条件下，在开花之前测量最后成像中植物的绿色指数。相比，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后第一次成像中植物的绿色指数。

植物

如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。

特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachisspp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(CoffeasPP.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynaraspp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、Eragrostis tef、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malusspp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(紫苜蓿)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(蓖麻)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(马铃薯)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(两色蜀黍)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Tripsacumdactyloides，Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(普通小麦)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

发明详述

令人惊奇地，现在已经发现调节植物中编码UBP多肽的核酸的表达得到了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码UBP多肽的核酸的表达。

调节(优选增加)编码UBP多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码UBP多肽的核酸。

下文中对“用于本发明方法的蛋白质”的任何参考指如本文定义的UBP多肽。下文中对“用于本发明方法的核酸”的任何参考指能够编码此类UBP多肽的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现在描述类型蛋白质的任何核酸，其在下文中也称作“UBP核酸”或“UBP基因”。

如本文定义的“UBP多肽”指具有切割通过肽(α-氨基)和/或异肽(ε-氨基)键与其他蛋白质连接的泛素的任何多肽。此外，UBP多肽包含：

(i)半胱氨酸盒(Cys盒)；和

(ii)组氨酸盒(His盒)。

Cys和His盒是在称作UBP结构域的保守催化性结构域中发现的两种良好保守的基序。Cys盒和His盒包含催化三联残基(Cys盒中Cys，His盒中His和Asp/Asn)(Amerik and Hochstrasser，2004)。UBP结构域的长度为300到900个氨基酸残基不等，并且尽管有时具有低的总体序列保守性，但是它们通常展示保守的三维结构。在UBP结构域内，Cys盒中的半胱氨酸在催化活性中起关键作用并且该半胱氨酸中的特定突变可以消除UBP的去泛素化活性(Papa and Hochstrasser，1993；Chandler et al.，1997；Rao-Naik et al.，2000；Yan et al.，2000；Baek et al.，2001；Doelling et al.，2001；Hanna et al.，2006)。

UBP多肽也可以包含Q盒和/或G盒和/或L盒和/或F盒。这些盒是UBP中发现的保守基序。Q、G、L和F指在它们各自的结构域中存在这些氨基酸的一个或多个。

UBP多肽也可以通常包含额外的序列基序，如锌指结构域、锌指MYND结构域、DUF1055结构域、DUSP结构域、MATH结构域、泛素样结构域和泛素相关的结构域。

下面的表3阐明了一组UBP中包含的结构域。

表3：UPB中包含的结构域

UBP类

结构域2

结构域3

UBP10	DUF1055(97-228)	肽酶_C19_E(307-490)
			UBP5	DUF1055(107-247)	肽酶_C19_E(326-493)
UBP9	DUF1055(97-228)	肽酶_C19_E(308-491)
			UBP11	DUF1055(95-233)	肽酶_C19_E(302-473)
UBP8	DUF1055(448-618)	肽酶_C19_E
			UBP26	DUSP(522-597)	UBL(960-1027)
UBP12	肽酶_C19_C(196-525)
			UBP13	肽酶_C19_C(196-524)
UBP4
			UBP3
UBP24
			UBP25
UBP15	肽酶_C19E(437-742)
			UBP19	肽酶_C19E(173-478)	MDN1(489-670)
UBP18	肽酶_C19E(167-472)
			UBP17	肽酶_C19E(328-631)
UBP16	肽酶_C19E(541-845)
			UBP6	肽酶_C19A(370-437)
UBP7	肽酶_C19A(160-394)	肽酶_C19A(459-526)
			UBP14	肽酶_C19B(309-571)	UBA(615-653)
UBP20

UBP21
			UBP1	肽酶_C19K(203-362)	肽酶_C19K(791-837)
UBP2	肽酶_C19K(232-383)	肽酶_C19K(708-747)
			UBP23
UBP27	肽酶_C19F(209-297)
			UBP22

额外或备选地，UBP蛋白的同源物与本文表A中所列氨基酸序列任一个具有按优选升序至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％的总体序列同一性。使用全局比对算法，如GAP程序(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比，当仅仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常更高。

额外或备选地，UBP蛋白的同源物具有与上面表3中所列结构域的任一个或多个按优选升序至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。

额外或备选地，UBP多肽序列当用于构建系统树时，与其他UBP多肽聚类。

术语“结构域”、“标记”和“基序”在文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation(用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能)，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(瑞士生物信息学研究所(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列比对而鉴定。

用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的全局性(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法(以百分数计)而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列或氨基酸或针对选择的结构域或保守基序测定了序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法尤其有用(SmithTF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。

此外，UBP多肽(至少在它们的天然形式中)通常具有UBP活性。用于测量UBP活性的工具和技术是本领域公知的。Yan et al.，2000(PlantPhysiol.Vol.124)给出了UBP活性测定法的细节。

此外，UBP多肽当根据实施例部分中所述方法在稻中表达时，产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

通过用本文实施例7的表B中所提到的任一序列(其编码也在表B中提到的对应多肽序列)转化植物阐明本发明。然而，本发明的实施不局限于这些序列；用如本文定义的任一种UBP编码核酸或者UBP多肽有利地实施本发明的方法。

在本文实施例1的表A中给出了编码UBP多肽的核酸的实例。此类核酸可用于实施本发明的方法。在实施例1的表A中给出的氨基酸序列包含实施例7表B中所列多种UBP多肽的直向同源物和旁系同源物，术语“直向同源物”和“旁系同源物”在本文中定义。通过进行所称作的相互blast搜索可以容易的鉴定直向同源物和旁系同源物。通常，这涉及第一次BLAST，涉及对任一序列数据库，如公众可用的NCBI数据库用查询序列(例如，使用实施例1的表A中所列的任一序列)进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准的默认值)，当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准的默认值)。BLAST结果可任选过滤。过滤的结果或者未过滤的结果的全长序列然后对查询序列所来源的生物(其中查询序列为表B中所列的序列的任一个)的序列进行向后BLAST(第二次BLAST，第二次BLAST将因此是针对稻序列)。然后比较第一次和第二次BLAST的结果。如果来自第一次BLAST的高阶命中与查询序列来自相同物种，那么鉴定了旁系同源物，然后向后BLAST将理想地导致查询序列在最高命中中；如果第一次BLAST中的高阶命中与查询序列不来自相同的物种，那么鉴定了直向同源物，并且向后BLAST时优选导致查询序列在最高命中中间。

高阶命中是具有低E值的那些命中。E值越低，得分越显著(或者换句话说，命中偶然被发现的机会越低)。E值的计算是本领域公知的。除了E值外，还通过同一性百分比对比较打分。同一性百分比指两个比较的核酸(或者多肽)序列之间在特定长度上相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着是邻接树，以帮助显示相关基因的聚类或者鉴定直向同源物和旁系同源物。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括编码实施例1表A中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文定义。也可用于本发明方法的是编码实施例1表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物具有与其所来源的未修饰蛋白质基本上相同的生物和功能活性。

此外，可用于实施本发明方法的核酸变体包括编码UBP多肽的核酸的部分、与编码UBP多肽的核酸杂交的核酸、编码UBP多肽的核酸的剪接变体、编码UBP多肽的核酸的等位变体和通过基因改组得到的编码UBP多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。

编码UBP多肽的核酸不必是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸序列，或者编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

例如，通过对核酸进行一个或多个缺失可以制备核酸的部分。所述部分可以以分离形式使用或者它们可以融合到其他编码(或非编码)序列以便例如，产生结合几种活性的蛋白质。当融合到其他编码序列时，翻译时所产生的多肽可以比为该蛋白质部分预测的更大。

可用于本发明方法的部分编码如本文定义的UBP多肽，并且具有与实施例1的表A中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，所述部分是实施例1的表A中给出的任一核酸的部分，或者是编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，所述部分长为至少1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、3900个连续核苷酸或更多，所述连续核苷酸为实施例1的表A中给出的任一核酸序列，或者编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，所述部分是SEQ ID NO：1的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的部分，其当用于构建系统树时，与UBP多肽聚类。

可用于本发明方法的另一核酸变体是这样的核酸，其在降低的严格性条件下，优选在严格条件下与编码如本文定义的UBP多肽的核酸杂交，或者与如本文定义的部分杂交。

根据本发明，提供了在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达核酸，所述核酸能够与实施例1的表A中给出的任一核酸杂交，或者包括在植物中导入并表达核酸，所述核酸能够与编码实施例1的表A中给出的任一核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。

可用于本发明方法的杂交序列编码如本文定义的UBP多肽，具有与实施例1的表A中给出的氨基酸序列相同的生物活性。优选地，所述杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一核酸杂交，或与任一这些序列的部分杂交，部分如生物定义，或者杂交序列能够与编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸杂交。最优选地，杂交序列能够与SEQ ID NO：1表示的核酸或者与其部分杂交。

优选地，杂交序列编码多肽，其氨基酸序列当(优选全长)用于构建系统树时，与UBP多肽聚类。

可用于本发明方法的另一核酸变体是编码如上面定义的UBP多肽的剪接变体，剪接变体如本文定义。

根据本发明，提供了增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表1中给出的任一核酸序列的剪接变体，或者编码如实施例1的表1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是表B中所列的任一核酸的剪接变体，或者编码表B中所列任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码的氨基酸序列当用于构建系统树时，与UBP多肽聚类。

可用于实施本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的UBP多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文定义。

根据本发明，提供了增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸的等位变体，或者包括在植物中导入并表达编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。

可用于本发明方法的等位变体编码的多肽具有与实施例1的表A中所列的UBP多肽基本上相同的生物活性。等位变体存在于天然中，并且本发明的方法包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是表B中所列的任一核酸的等位变体，或者编码表B中所列任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码的氨基酸序列当用于构建系统树时，与UBP多肽聚类。

基因改组或定向进化也可以用于产生编码如上文定义的UBP多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供了在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中导入并表达编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，所述变体核酸通过基因改组得到。

优选地，通过基因改组得到的变体核酸编码的氨基酸序列当用于构建系统树时，与UBP多肽聚类。

此外，通过定向诱变也可以得到核酸变体。一些方法可用于实现位点定向诱变，最常用的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Eds.)。

编码UBP多肽的核酸可来自任何天然或人工来源。核酸可以通过有意的人为操作在组成和/或遗传环境中从其天然形式修饰。优选地，UBP多肽编码核酸来自植物，更优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选地，核酸来自稻。

本发明方法的实施得到了具有增强的产量相关性状的植物。具体地，本发明方法的实施得到了相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分更详细描述。

在本文中对增强的产量相关性状的参考意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量具有增加的种子产量的植物。

以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每平方米生长的(establish)植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加等等。

本发明提供了相对于对照植物增加植物产量，特别是种子产量的方法，该方法包括调节植物中编码如本文定义的UBP多肽的核酸的表达。

因为本发明的转基因植物具有增强的产量，所以这些植物可能显示出相对于对照植物在其生命周期的对应阶段的生长速率增加的生长速率(在至少部分其生命周期中)。

增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部过程均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)等。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节核酸在植物中的表达，所述核酸编码本文中所定义的UBP多肽。

发生产量和/或生长速率的增加，不管与对照植物相比，植物处于非胁迫条件还是植物暴露于多种胁迫。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％或30％，优选小于25％、20％或15％，更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。“轻微胁迫”是植物暴露的常见生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冷温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫通常是病原体，如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

具体地，本发明的方法可以在非胁迫条件或在轻微干旱条件下进行以相对于对照植物具有增加的产量。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。

本发明方法的实施相对于在相当条件下生长的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码UBP多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施得到了植物，其在营养缺乏，尤其氮缺乏条件下生长时与在相当条件下生长的对照植物相比具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了增加在营养缺乏条件下生长的植物中产量的方法，该方法包括调节植物中编码UBP多肽的核酸的表达。营养缺乏可以由营养物的缺乏引起，所述营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，等等。

本发明包括通过本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物、或其部分包含编码如上文所定义的UBP多肽的核酸转基因。

本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码UBP多肽的核酸。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含

(a)编码如上文定义的UBP多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码UBP多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如上文所定义。

用包含上述核酸之一的载体转化植物。技术人员公知必须存在于载体上的遗传元件，以便成功转化、选择和繁殖含有目的序列的宿主细胞。目的序列有效连接一个或多个控制序列(至少启动子)。

有利地，任一类型的启动子，不管是天然还是合成的，都可以用于驱动核酸序列的表达。组成型启动子尤其可用于方法中。优选地，组成型启动子也是遍在启动子。见本文“定义”章节中关于多种启动子类型的定义。

应该清楚的是，本发明的应用不限于本文表A或表B中所列的UBP多肽编码核酸，本发明的应用也不限于组成型启动子驱动时表达UBP多肽编码核酸。

组成型启动子优选为GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，组成型启动子由与SEQ ID NO：89基本上相似的核酸序列代表，最优选地，组成型启动子由SEQ ID NO：89代表。组成型启动子的进一步实例见“定义”部分中的表2a。

任选地，一个或更多终止子序列可用于引入植物的构建体中。优选地，构建体包含表达盒，该表达盒包含与表B中所列核酸序列任一个基本上相似或相同的核酸，并且包含GOS2启动子和T-玉米醇溶蛋白+T-rubisco转录终止子序列。

额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量，如定义部分中所述。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。

本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。

为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描述了选择性标记。标记基因一旦不再需要可以从转基因细胞中除去或者切除。用于标记去除的技术是本领域公知的，有用的技术在上文定义部分中描述。

本发明还提供了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中导入并表达编码如上文定义的UBP多肽的任一核酸。

更特别地，本发明提供了产生具有增强的产量相关性状，尤其增加的(种子)产量的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中导入并表达编码UBP的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

(i)的核酸可以是能够编码如本文定义的UBP多肽的任一核酸。

核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物。文中的“定义”部分更加详细的描述了术语“转化”。

遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或

和Willmitzer的上述出版物。

通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。

在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术是本领域技术人员众所周知的。

产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。

本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文所定义的UBP多肽的分离的核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。

本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦、单粒小麦、teff、蜀黍和燕麦。

本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自此类植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。

根据本发明优选的特征，受调控的表达是增加的表达。在本领域内详细记载了用于增加核酸或基因、或基因产物表达的方法并且实例在定义部分中提供。

如上面提到的，调节编码UBP多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码UBP多肽的核酸；然而，实施该方法的效果，即增强产量相关性状也可以使用其他公知的技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA活化标记、TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义部分中提供。

本发明还包括编码如本文所述的UBP多肽的核酸和这些UBP多肽用于增强植物中任一上述产量相关性状的用途。

编码本文所述的UBP多肽的核酸，或者UBP多肽自身可以用于育种程序，其中鉴定DNA标记，所述标记可以与UBP多肽编码基因遗传连锁。所述核酸/基因，或者UBP多肽自身可以用于定义分子标记。该DNA或蛋白质标记然后可以用于育种程序来选择具有如本发明方法中如上文定义的增强的产量相关性状的植物。

编码UBP多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变通过植物的诱变处理引入等位基因变异；备选地，程序可以以一组非有意引起的所谓的“天然”来源的等位变体开始。然后例如通过PCR开始等位变体的鉴定。接着是选择具有所讨论序列并且得到提高的产量的超级等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。

编码UBP多肽的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码UBP多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码UBP多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码UBP多肽的核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码UBP多肽的核酸序列在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。

所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等，(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook，(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

本发明方法产生具有如前文所述的增强的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增加性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。

附图描述

本发明现在将参考附图描述，其中：

图1代表用于在稻中增强表达处于稻GOS2启动子控制下的UBP编码核酸的双元载体(pGOS2)。UBP编码核酸可以是表B中所列的任一种核酸。

图2详述了可用于实施本发明方法的序列的实例。

实施例

本发明现将参考仅作为说明的下列实施例加以描述。下列实施例不意图彻底定义或限制本发明范围。

DNA操作：除非另外指出，根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel et al.(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和卷2中所述的标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。

实施例1：鉴定UBP序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到UBP序列(全长cDNA、EST或基因组的)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，用于本发明方法中的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如，E值可以增加以显示较低的严紧性匹配。从而，可以鉴定短的几乎精确的匹配。

表A提供了用于本发明方法的UBP核酸序列列表。

表A：UBP多肽和核酸序列的实例：

在一些情况下，序列被试验性装配并被研究机构如基因组研究研究所(Institute for Genomic Research(TIGR))公开。Eukaryotic GeneOrthologs(EGO)数据库可用于鉴定此类序列，通过关键词检索或者通过使用BLAST算法用目的核酸或多肽序列进行鉴定。

实施例2：UBP多肽序列的比对

使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序(其基于普遍使用的渐进比对的Clustal W算法(Thompson等，(1997)Nucleic AcidsRes 25：4876-4882；Chenna等，(2003)Nucleic Acids Res 31：3497-3500))进行多肽序列的比对。空位开放罚分的缺省值为10，空位延伸罚分的缺省值为0.1，选择的权重矩阵是Blosum 62(如果比对多肽))。进行小的手工编辑以进一步优化比对。

使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻居连接聚类算法构建UBP多肽的系统树。

实施例3：UBP多肽序列之间全局同一性百分比(global percentageidentity)的计算

用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用本领域可用的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件((Campanella et al.，BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：anapplication that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences..Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；software hostedby Ledion Bitincka)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可用于产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。

比较所用的参数有：

评分矩阵：Blosum62

第一个空位：12

延伸空位：2

也确定了特定结构域的局部比对的MATGAT表，或者特定结构域之间％同一性/相似性数据。

实施例4：鉴定UBP多肽序列内包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点集成资源(Integrated Resouce of ProteinFamilies，Domain and Site，InterPro)数据库是基于文本和序列的搜索的通常所用标签数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是一组多序列比对和覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的隐蔽马尔可夫模型。Pfam驻留于英国Sanger Institute的服务器。Interpro驻留于英国的欧洲生物信息研究所。

实施例5：UBP多肽序列的拓扑学预测

TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配是基于任何氨基端前序列的预测的存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。作为最终预测基础的记分并不实际是概率，并且它们未必合为一体。然而，具有最高记分的位置根据TargetP是最有可能的，并且记分之间的关系(可靠性类别)可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别(RC)是1-5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学的服务器上维护。

对于预测含有氨基端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。

选择了许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断集合(无、预定的截断集合、或者用户定义的截断集合)，和切割位点预测计算(是或否)。

众多其它算法可以用来执行此类分析，包括：

·在丹麦技术大学(Technical University of Denmar)服务器上驻留的ChloroP 1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute forMolecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器上驻留的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序(Protein ProwlerSubcellular Localisation Predictor)第1.2版；

·在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器上驻留的PENCE Proteme AnalystPA-GOSUB 2.5；

·在丹麦技术大学服务器上驻留的TMHMM。

实施例6：UBP多肽的功能测定法

用于测量UBP活性的工具和技术是本领域公知的。Yan et al.，2000(Plant Physiol.Vol.124)给出了UBP活性测定法的细节。

实施例7：UBP核酸序列的克隆

表B：用于克隆的UBP核酸

通过PCR使用定做的拟南芥幼苗cDNA文库(pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板扩增表B中所列的任一种UBP核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件中，在50μl PCR混合物中使用200ng模板进行PCR。使用标准方法纯化扩增的PCR片段。然后进行Gateway程序的第一步：BP反应，在该反应期间，PCR片段与pDONR201质粒在体内重组产生“进入克隆”(根据Gateway命名法)pUBP。质粒pDONR201购自Invitrogen作为

技术的一部分。

包含UBP的进入克隆然后用于LR反应中，使用用于稻转化的目的载体。该载体在T-DNA边界内含有作为功能元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒；和预期用于与已经克隆在进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的GOS2启动子(SEQ ID NO：89)位于该Gateway盒的上游。

LR重组步骤后，根据本领域公知的方法将所得的表达载体pGOS2::UBP(图1)转化到农杆菌菌株LBA4044中。

实施例8：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中温育一分钟，随后在2％HgCl₂中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中温育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。

一个构建体产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。

玉米转化

玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999 Plant Physiol119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如BrownDCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 PlantPhysiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

根据US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在20分钟内在3％次氯酸钠溶液中表面消毒并在含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。然后将种子转移到含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于发芽。去除4到6天龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm小块并置于0.8％琼脂上。农杆菌悬浮液(约10⁸个细胞/ml，从用目的基因和合适的选择标记转化的过夜培养物稀释得到)用于接种下胚轴外植体。室温并光照下3天后，将组织转移到具有Murashige和Skoog盐与B5维生素(Gamborget al.，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCl₂，并具有用于杀死残留细菌的50到100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄西林的固体培养基(1.6g/l Gelrite)中。2到3个月(每4到6周传代培养)后分离各细胞系并进一步在选择培养基上培养用于组织扩增(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在2到3个月内在非选择培养基上进一步培养以产生体细胞胚。将具有至少4mm长度的看起来健康的胚转移到具有细小蛭石中SH培养基的管中，补充0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠胺嘌呤和赤霉酸。然后在30℃以16小时光周期培养胚，并将2到3片叶阶段的小植株转移到具有蛭石和营养物的盆中。植物变硬并随后移入温室中用于进一步培养。

实施例9：表型评估步骤

9.1 评估设置

产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室中用于生长和收获T1种子。保留6个事件，其中T1后代对于转基因的存在/缺失以3∶1分离。对于每个这些事件，通过监测可见标记表达选择约10个含有转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和约10个缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机的位置上并排生长。温室条件是短日照(12小时光照)，光照中28℃，黑暗中22℃，和70％的相对湿度。

4个T1事件在T2代中按照与T1代相同的评估步骤进一步评估，但是每个事件具有更多个体。从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。

氮使用效率筛选

来自T2种子的稻植物在除了营养溶液之外的正常条件下生长与盆栽土壤中。花盆从移植到成熟用特定营养溶液浇灌，该溶液含有减少的氮(N)含量，通常低7到8倍。培养的剩余部分(植物成熟，种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长详述的记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物生长在由椰子纤维和argex(3∶1比例)组成的基质上。将小植株移植到温室后前两周内使用正常的营养物溶液。前两周后，向营养物溶液加入25mM盐(NaCl)，直到收获植物。然后测量种子相关的参数。

9.2 统计学分析：F-检验

将双因子ANOVA(方差分析)用作植物表型特征的总体评估的统计学模型。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植物测量的所有参数进行F-检验。进行F-检验以检查基因在所有转化事件中的效果并验证该基因的总体效果，也称作总体基因效果。F检验的真实总体基因效果的显著性阈值设为5％概率水平。显著F-检验值指向基因效果，表示并不仅仅是该基因的存在或其位置引起表型差异。

因为用重叠的事件进行了两个实验，所以进行了合并分析。这对于检查两个实验上效果的一致性是有用的，并且如果情况是这样的，积累来自两个实验的证据以便在结论中提高置信度。所用的方法是混合模型方法，其考虑了数据的多级结构(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布得到P-值。

9.3 测量的参数

生物量相关的参数测量

从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。通过对来自地上植物部分的数字图像上区别于背景的像素总数计数来确定植物地上部分面积(或者叶子生物量)。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，其以平方mm表示。实验表明以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物达到其最大叶子生物量的时间点时测量的面积。早期萌发势是萌发后三周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表示为总根生物量的增加(测量为在植物寿命中观察到的根的最大生物量)；或者表示为根/枝条指数的增加(测量为在根和枝条的活跃生长期中根质量和枝条质量之间的比值)。

通过对来自地上植物部分的区别于背景的像素总数计数确定早期萌发势。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，以平方mm表示。萌发后三周测量早期萌发势。

种子相关的参数测量

将成熟的总圆锥花序收获，计数，装袋，用条形码标记，然后在烘箱中37℃下干燥3天。然后将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。用鼓风装置分离饱满的外壳与空壳。丢弃空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。通过计数分离步骤后剩余的饱满外壳数来确定饱满种子数。通过对从植物收获的所有饱满外壳称重来测量总种子产量。通过对从植物收获的外壳数目计数测量每株植物的总种子数。从计数的饱满种子数和它们的总重量外推千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为总种子产量和地上部分面积(mm²)之间的比值，再乘以因数10⁶。每个圆锥花序的总花数在本发明中定义为种子总数和成熟总圆锥花序数目的比值。如本文定义的种子饱满率是饱满种子数在种子(或小花)总数中占的比例(表示为％)。

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