CN103834683A - 具有增强的产量相关性状的植物和产生所述植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通常涉及分子生物学的领域，涉及通过调节编码GS1（谷氨酰胺合酶1）的核酸序列、编码PEAMT（磷酸乙醇胺N-甲基转移酶）多肽的核酸序列、迄今为止未知的PEAMT-编码核酸序列、编码脂肪酰酰基载体蛋白（ACP）硫酯酶B（FATB）多肽的核酸序列、编码LFY样（LEAFY-样）的核酸序列在植物中的表达，来改善多种植物生长特征的方法。本发明还关于包含所述核酸序列的受调节的表达的植物，其中相对于相应的野生型植物或其他对照植物，所述植物具有增强的产量相关性状。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和产生所述植物的方法
本申请为2009年6月10日提交的、发明名称为“具有增强的产量相关性状的植物和产生所述植物的方法”的PCT申请PCT/EP2009/057190的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年12月20日，申请号为200980123377.3。
本发明通常涉及分子生物学的领域，涉及通过调节编码GS1(谷氨酰胺合酶1)的核酸序列在植物中的表达，来改善多种植物生长特征的方法。本发明还关于具有编码GS1的核酸序列的受调节的表达的植物，其中相对于相应的野生型植物或其他对照植物，所述植物具有改善的生长特征。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。
此外，本发明通常涉及分子生物学的领域，涉及通过调节编码PEAMT(磷酸乙醇胺N-甲基转移酶)多肽的核酸序列在植物中的表达，来增强多种植物产量相关的性状的方法。本发明还关于具有编码PEAMT的核酸序列的受调节的表达的植物，其中相对于相应的野生型植物或其他对照植物，所述植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今为止未知的PEAMT-编码核酸序列，和包含所述序列的构建体，它们在实施本发明的方法中是有用的。
此外，本发明通常涉及分子生物学的领域，且涉及通过增加编码脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)多肽的核酸序列在植物中的表达，来增加多种植物种子产量相关性状的方法。本发明还关于具有编码FATB多肽的核酸序列的增加的表达的植物，其中相对于对照植物，所述植物具有增加的种子产量相关性状。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸序列、核酸序列构建体、载体和植物。
此外，本发明通常涉及分子生物学的领域，且涉及通过调节编码LFY样(LEAFY-样)的核酸序列在植物中的表达，来改善多种植物生长特征的方法。本发明还关于具有编码LFY样的核酸序列的受调节的表达的植物，其中相对于相应的野生型植物或其他对照植物，所述植物具有改善的生长特征。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新枝条和新根的来源)和胚乳(萌发期间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒(grain)。
植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮玉米和干草的产量。在籽粒作物中已使用了多种代表(proxy)。其中主要的是植物大小的估计值。根据物种和发育阶段，可以以多种方式测量植物大小，包括总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长度、根长度、根量、分蘖数和叶数量。许多物种在给定发育阶段的植物不同部分的大小之间维持了保守的比例。上述异速生长关系用于从上述一种大小测量推测另一种(例如，Tittonell等人，2005Agric Ecosys& Environ 105：213)。在早期发育阶段的植物大小通常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶面积的较大的植物通常可以比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，从而在相同的时期可能获得更多重量(Fasoula& Tollenaar 2005 Maydica 50：39)。除微环境的潜在连续性或遗传优势外，植物必须在一开始就获得较大的尺寸。对于植物的大小和生长速率而言存在强烈的遗传成分(例如，ter Steege等人，2005Plant Physiology139：1078)，并且迄今为止，在同一环境条件下，一系列不同基因型的植物大小可能与另一种环境条件下的大小相关(Hittalmani等人，2003Theoretical Applied Genetics107：679)。因此，使用标准的环境作为田间作物在不同地区和时间遇到的多样且变化的环境的代表。
对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改善早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的枝条与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出幼苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Beltgermplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
收获指数，种子产量与地上部分干重的比例，在许多环境条件下是相对稳定的，从而通常能够获得植物大小和籽粒产量之间强有力的相互关系(例如，Rebetzke等人，2002Crop Science42：739)。这些方法是内在相关联的，因为大多数籽粒生物量取决于植物茎叶的现有的或储存的光合作用生产力(Gardener等人，1985Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，第68-73页)。因此，即使在发育的早期阶段，选择植物的大小已用作未来潜在产量的提示(例如，Tittonell等人，2005 Agric Ecosys & Environ 105：213)。当测试遗传差异对胁迫耐受的影响时，将土壤性质、温度、水和养分的有效性，以及光强度标准化的能力，是温室或植物培养室环境相比田间的内在优势。然而，由于缺少风或昆虫而造成的低下的授粉，或者对于成熟的根或株冠生长不充足的空间所造成的对产量的人为限制，可以制约这些受控环境用于测试产量差异的应用。因此，在培养室或温室的标准化条件下，测量早期发育阶段的植物大小，是为潜在的遗传产量优势提供提示的标准实践。
又一个重要性状是改善的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改善植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过修饰植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
关于GS1多肽，目前已发现通过调节植物中编码GS1(谷氨酰胺合酶1)的核酸在植物中的表达，可以改善植物中的多种生长特征。
关于PEAMT多肽，目前已发现通过调节植物中编码PEAMT(磷酸乙醇胺N-甲基转移酶)的核酸序列在植物中的表达，可以改善植物中的多种产量相关性状。
关于FATB多肽，目前已发现通过增加编码脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)多肽的核酸序列在植物中的表达，可以相对于对照植物增加植物中多种种子产量相关性状。增加的种子产量相关性状包括一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满(filled)种子数、增加的种子饱满率(fill rate)和增加的收获指数。
关于LFY样多肽，目前已发现通过调节植物中编码LFY样(LEAFY-样)的核酸序列在植物中的表达，可以改善植物中的多种生长特征。
背景
谷氨酰胺合酶(GS1)
谷氨酰胺合酶催化从谷氨酸和NH3形成谷氨酰胺，这是硝酸盐同化通路的最后一步。基于序列比较，谷氨酰胺合酶分为两个家族，细胞溶胶(cytosolic)(GS1)和叶绿体(GS2)同种型。GS1谷氨酰胺合酶形成小的基因家族，其中GS2似乎作为单拷贝基因存在，GS1和GS2都存在于植物和藻类中。许多报告描述了在氮受限的条件下，来自高等植物的谷氨酰胺合酶具有对植物生长的直接影响(Oliveira等人，PlantPhysiol.129，1170-1180，2002；Fuentes等人，J.Exp.Bot.52，1071-1081，2001；Migge等人，Planta210，252-260，2000；Martin等人，Plant Cell18，3252-3274)。然而，迄今为止，没有获得关于藻类类型的谷氨酰胺合酶对植物生长的影响，特别是在降低氮有效性的条件下的影响的任何数据。
磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)也称为S-腺苷-L-甲硫氨酸：乙醇胺磷酸N-甲基转移酶，涉及植物中的胆碱生物合成。PEAMT在将磷酸乙醇胺转化为磷酸胆碱所需的甲基化步骤中发挥功能(Nuccio等人，2000.J Biol Chem.275(19)：14095-101)。因此，PEAMT酶催化一种或多种下列反应：
1)N-二甲基乙醇胺磷酸+S-腺苷-L-甲硫氨酸
Figure BDA0000461644550000051
磷酰胆碱+S-腺苷-高半胱氨酸
2)N-甲基乙醇胺磷酸+S-腺苷-L-甲硫氨酸
Figure BDA0000461644550000061
N-二甲基乙醇胺磷酸+S-腺苷-高半胱氨酸
3)磷酸-乙醇胺+S-腺苷-L-甲硫氨酸S-腺苷-高半胱氨酸+N-甲基乙醇胺磷酸
IUPAC-IUBMB(生物化学和分子生物学国际联盟)赋予PEAMT的酶学会编号是EC2.1.1.103。PEAMT酶属于依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移酶(Mtases)类别。在从细菌到植物和哺乳动物的多种生物中，频繁的使用从独特的SAM向氮、氧或碳原子转移甲基。结构分析显示，PEAMT蛋白属于Mtases类别，包含形成Rossman样α-β折叠的甲基转移酶结构域(Yang等人，2004 J.Mol.Biol.340，695-706)。此外，磷脂酰乙醇胺转移酶通常包含ubiE/COQ5甲基转移酶结构域(Pfam参考PF01209)。该结构域还存在于多种参与泛醌/甲萘醌、生物素和固醇的生物合成的甲基转移酶中。
磷脂是细胞膜的重要结构组分，此外，它们在必需化合物如脂肪酸的代谢中扮演相关的角色。在人中，胆碱、维生素B样分子，是天然产生的必需养分，参与构建细胞膜和在细胞之间移动脂肪和养分。
磷酸胆碱是大部分各种植物组织的主要磷脂。在非光合作用的组织中，磷酸乙醇胺是第二多的磷脂，而在绿色组织中，磷酸胆碱的水平与磷脂酰甘油的水平相似(Dykes等人，1976.Biochem J.158(3)：575-581)。
已报道，过表达编码PEAMT酶的基因的烟草植物具有增加水平的磷酸胆碱和游离胆碱，而不影响磷脂酰胆碱的含量或生长(McNeil等人，2001.PNAS.2001，第98卷，第17期，10001-10005)。
脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
植物含有相当多的膜脂和贮藏脂类，在每种脂中，可发现多种不同的脂肪酸。脂肪酸的链长度和双键数量不同。不同于其它生物，所有的植物细胞都从乙酰-CoA通过位于质体中的共同通路从头合成脂肪酸。脂肪酸或者在该细胞器中被利用，或者被运输供应多个细胞质生物合成通路和细胞过程。用于运输的脂肪酸的生产依赖于脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(FATs；也称为酰基-ACP TE)的活性，所述酶释放游离脂肪酸和ACP。其活性代表质体脂肪酸生物合成通路的最终步骤。获得的游离脂肪酸可以进入细胞溶胶(cytosol)，在该处其与辅酶A酯化，并进一步代谢进入膜脂和/或贮藏的甘油三酯。
FAT在决定进入贮藏脂库的脂肪酸的量和组成中扮演关键性角色。在植物中已描述了两类FAT，基于氨基酸序列比较和底物特异性：FATA类和FATB类(Voelker等人，(1997)Plant Physiol 114：669-677)。这些同种型的底物特异性确定了植物的饱和脂肪酸的链长度和水平。FATA的最高活性是使用油酰-ACP，一种不饱和的酰基-ACP，而与其它酰基-ACP具有极低的活性。FATB与饱和的酰基-ACP具有最高活性。
FATA和FATB是核编码的、质体靶向的球状蛋白质，作为二聚体发挥功能。此外，FATB多肽包括螺旋跨膜锚。FATB活性在拟南芥(Arabidopsis)中至少由2种基因编码(Bonaventure等人，(2003)PlantCell 15：1020-1033)，而在稻中至少由4种基因编码。
在种子特异性启动子控制下表达编码FATB的基因的转基因拟南芥植物(Doermann等人，(2000)Plant Physiol 123：637-643)和转基因卡诺拉油菜(canola)植物(Jones等人，(1995)Plant Cell 7：359-371)表现出修饰的种子油组成。
国际专利申请WO 2008/006171描述了通过调节FAD2和/或FATB基因表达，遗传修饰稻植物的方法，例如从其生产的米糠油(rice oil)、米糠(rice bran)和稻种(rice seed)，具有改变的油酸、棕榈酸和/或亚油酸的水平。
Leafy样(LFY-样)
Leafy是花诱导和花发育必需的转录因子，参与花分生组织决定的特化：LFY表达是受调控的，限于芽顶端分生组织侧翼的小群细胞，其中它的高水平表达标志着叶原基向花原基的命运的改变(Weigel等人，Cell 69，843-859，1992)。蛋白质序列是高度保守的，在许多植物物种中，蛋白质是由单个基因编码的，在少数物种中也存在旁系同源物。在玉米中，存在2个拷贝的基因(zfl1和zfl2)。双突变体显示在营养生长过程中的正常发育，但花发育受干扰(Bomblies等人，Development130，2385-2395，2003)。在拟南芥中，LFY的失功能突变体也表现出花发育的缺陷，具有花部分转化为花序芽(inflorescence shoot)(Weigel等人，1992)。也报道Leafy在开花时间中起作用。
概述
谷氨酰胺合酶(GS1)
令人惊讶的，已发现调节编码藻类-类型GS1多肽的核酸序列的表达，使植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物，改善植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码GS1多肽的核酸序列的表达。
磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
令人惊讶的，已发现调节编码PEAMT多肽的核酸序列的表达，使植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码PEAMT多肽的核酸序列的表达。
脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
令人惊讶的，已发现增加编码如本文定义的FATB多肽的核酸序列在植物中的表达，使植物相对于对照植物具有增加的种子产量相关性状。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物，增加植物的种子产量相关性状的方法，包括增加植物中编码如本文定义的FATB多肽的核酸序列的表达。增加的种子产量相关性状包括一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
Leafy-样(LFY-样)
令人惊讶的，现已发现调节编码LFY-样多肽的核酸序列的表达使植物相对于对照植物，具有增强的产量相关性状，特别是增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物，改善植物的产量相关性状的方法，包括调节编码LFY-样多肽的核酸序列在植物中的表达。改善的产量相关性状包括增加的种子产量，并是在与对照植物相比不改变开花时间的条件下获得的。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸序列/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸序列分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是因分离而丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与从中衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure BDA0000461644550000101
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
取代指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约1至10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的例子
残基 保守性取代 残基 保守性取代
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比较，它们包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变的氨基酸残基。与从中衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在的蛋白质的氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包括用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内因祖先基因复制而来源的基因；直向同源物是来自不同生物的因物种形成而来源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
结构域
术语“结构域”指在进化相关性蛋白质的序列比对结果上的特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示了很可能在蛋白质结构、稳定性或功能方面是必需的氨基酸。结构域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高保守程度而鉴定，故它们可以作为鉴定物用来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中短的保守区域。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补核酸序列均处于溶液中。杂交过程也可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补核酸序列之一进行。杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸序列阵列或微阵列或称作核酸序列芯片)的互补核酸序列之一进行。为使杂交发生，核酸序列分子通常被热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或去除来自单链核酸序列的发夹或其他二级结构。
术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受诸条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，低严格条件选择为在定义的离子强度和pH处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度低于Tm20℃时，并且高严格条件是当所述温度低于Tm10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。但是，核酸序列可以在序列上偏离且依旧编码基本上相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸序列分子。
Tm是在定义的离子强度和pH处的下述温度，其中50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在更高温度上特异性地杂交。最大杂交速率在低于Tm约16℃直至32℃上获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸序列链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高的浓度而言，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率将降低。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言和对于大探针而言，Tm下降约1℃/每％碱基错配。根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2)DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：
对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)
对20-35个核苷酸而言：Tm＝22+1.46(ln)
a或者用于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于在30％-75％范围内的％GC是精确的。
cL＝双链体的碱基对长度。
dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。技术人员了解可以在杂交期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交引起的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性处或低于所述杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸序列杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。也可以选择严格性更高或更低的条件。技术人员了解可以在洗涤期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸序列的预期长度。当序列已知的核酸序列杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于定义严格性的水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包括其中已经切除、替换、置换或添加所选内含子和/或外显子或其中已经缩短或加长内含子的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex，BMC Bioinformatics.2005；6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因位于相同染色体位置处的备选形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸序列或其部分的变体而组成(Castle等人(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调控元件/控制序列/启动子
术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调控性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸序列转录的核酸序列控制序列。前述术语包括从经典真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)衍生的转录调控序列和应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其它调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调控序列，在此情况下它可以包括一个-35框序列和/或一个-10框转录调控序列。术语“调控元件”也包含赋予、激活或增强核酸序列分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列节段表达的调控元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用在本发明方法中待表达并在本文中描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调控信号，如“植物”终止子。在本发明方法中有用的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调控区如终止子或远离ORF存在的其他3’调控区的功能性或活性。还有可能的是：所述启动子的活性因其序列的修饰或被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换而增加。为了在植物中表达，如上所述，核酸序列分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空间表达模式表达基因的合适启动子。
鉴定功能性等价启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过将此启动子有效地与报道基因连接并分析该报道基因在植物多种组织中的表达水平和模式进行分析。熟知的合适报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸序列的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”是指驱动编码序列以低于强启动子水平表达的启动子，特别是所述水平在一切情况下低于在35S CaMV启动子控制下时所获得的水平。
有效地连接
如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，从而该启动子序列能够起动该目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分期间而无需在全部期间和在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
Figure BDA0000461644550000171
Figure BDA0000461644550000181
遍在启动子
遍在启动子基本上在生物的全部组织或细胞中有活性。
发育调控型启动子
发育调控型启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有诱导型或增加的转录启动作用，或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够偏好性地在某些器官或组织如叶、根、种子组织等中启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是这样的启动子，该启动子优势地在植物根中具有转录活性，基本上在植物的任何其他部分中无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性的”。
根特异性启动子的例子列于下表2b：
表2b：根特异性启动子的实例
Figure BDA0000461644550000191
Figure BDA0000461644550000201
种子特异性启动子是优势地在种子组织中有转录活性，但并非必需排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。种子特异性启动子的例子(胚乳/糊粉/胚特异性)示于下表2c-表2f中。种子特异性启动子的其他例子在QingQu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内容如完整所述那样通过引用方式并入本文。
表2c：种子特异性启动子的例子
Figure BDA0000461644550000202
Figure BDA0000461644550000211
Figure BDA0000461644550000221
表2d：胚乳特异性启动子的例子
Figure BDA0000461644550000222
表2e：胚特异性启动子的例子：
基因来源 参考文献
稻OSH1 Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子的例子：
Figure BDA0000461644550000241
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是优势地在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。
可以用于进行本发明方法的绿色组织特异性启动子的例子在下表2g中显示。
表2g：绿色组织特异性启动子的例子E
Figure BDA0000461644550000242
Figure BDA0000461644550000251
组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其优势地在分生组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。可以用于进行本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的例子在下表2h中显示。
表2h：分生组织特异性启动子的例子
Figure BDA0000461644550000252
终止子
术语“终止子”包括作为转录单元末端处DNA序列的控制序列，所述的DNA序列产生初级转录物的3’加工和多聚腺苷化及转录终止的信号。所述终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
调节
就表达或基因表达而言，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比较，表达水平因所述基因的表达而改变，表达水平可以增加或减少。原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随后是翻译。术语“调节活性”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，这导致植物产量增加和/或生长增加。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或诸基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，而所述RNA随后翻译或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。
在本领域内充分记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且这些方法包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。充当启动子或增强子元件的分离核酸序列可以导入多核苷酸的非异源形式的适宜位置(一般在上游)中，从而上调编码目的多肽的核酸序列表达。例如，内源性启动子可以在体内通过突变、缺失和/或取代进行改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的恰当方向及距离导入植物细胞，从而控制该基因的表达。
若需要多肽表达，通常希望的是在多核苷酸编码区的3’末端处包括多聚腺苷化区。所述多聚腺苷化区可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的3’末端序列可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
也可以将内含子序列添加至5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列以增加细胞溶胶内聚集的成熟信使的数量。已经证实在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子增加了mRNA水平及蛋白质水平上的基因表达至多到1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev1：1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于总体信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中对“内源的”基因的称谓不仅仅涉及如植物中以其天然形式(即没有人类任何干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式下的随后(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸序列/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以出现转基因表达的大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。所述的分离基因可以从生物分离或可以是人造的，例如通过化学合成法人造的。
减少的表达
本文中提及的“减少的表达”或“降低或基本消除表达”意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的下降。与对照植物相比较，所述降低或基本消除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。用于减少表达的方法是本领域已知的，技术人员会轻易地能够调整用于沉默的已知方法以至于通过利用例如合适启动子，实现降低完整植物中或其部分中内源基因的表达。
为了降低或基本消除植物中内源基因的表达，需要核酸序列的基本上连续的核苷酸的足够长度。为了进行基因沉默，这个长度可以是短至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以长至完整基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。基本上连续的核苷酸片段可以从编码目的蛋白的核酸序列(靶基因)或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列衍生。优选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是用于降低或基本消除内源基因表达的本文中所讨论多种方法的必要条件。
用于降低或基本消除植物中内源基因的表达或者用于降低蛋白质的水平和/或活性的多种方法的例子是本领域技术人员已知的。本领域技术人员能够容易地调整已知的方法用于例如通过使用适当的启动子进行沉默从而实现在完整植物中或其部分中内源基因表达的降低。
表达的这种降低或基本消除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达基因构建体，其中将核酸序列(在此情况下，从目的基因或从能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列中衍生的一段基本上连续的核苷酸)克隆至所述基因构建体，作为被间隔序列(非编码性DNA)隔开的(部分或完全)反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸序列或其部分(在此情况下，所述部分是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列中衍生的一段基本上连续的核苷酸)的反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用降低或基本上消除内源基因的表达。在包含控制序列的表达载体中克隆所述反向重复序列。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成所述反向重复序列的两个反向核酸序列之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自我互补性结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，该siRNA掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该RISC进一步切开所述mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等人(1998)WO 98/53083；Waterhouse等人(1999)WO 99/53050。
本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达所述核酸序列作为反向重复序列克隆到其中的基因构建体，不过可以使用几种熟知“基因沉默”方法的任何一种或多种方法来实现相同的作用。
用于降低内源基因表达的这样一种方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA进一步由植物加工成约20个至约26个核苷酸，称作短干扰RNA(siRNA)。siRNA掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其中所述的RISC切割内源性靶基因的mRNA转录物，从而大幅降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，所述双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个例子包括将核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列中衍生的一段基本上连续的核苷酸)以有义方向导入植物。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而，将所述核酸序列的至少一个拷贝导入植物。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生称为共抑制作用的现象。当一种核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与触发共抑制作用之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个例子包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。所述反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。此互补性可以位于基因的“编码区”中和/或基因的“非编码区”中。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”指被转录但不被翻译成氨基酸的分布在编码区侧翼的5’和3’序列(也称作5’和3’非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基对规则设计。反义核酸序列可以与完整核酸序列(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列中衍生的一段基本上连续的核苷酸)互补，不过也可以是仅与所述核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，所述反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以使用化学合成和酶连接反应，利用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的例子是本领域熟知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。对核苷酸的其他修饰是本领域熟知的。
所述反义核酸序列可以使用表达载体以生物学方式产生，其中将一种核酸序列以反义方向亚克隆(即从所插入核酸序列转录出的RNA将与目的靶核酸序列呈反义方向)至所述表达载体。优选地，植物中反义核酸序列的产生借助稳定整合的核酸序列构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
本发明方法中用于沉默作用的核酸序列分子(无论导入植物中或原位(in situ)产生)与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，从而抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译做到这一点。杂交可以通过常规核苷酸互补性以形成稳定双链体引起，或例如与DNA双链体结合的反义核酸序列的情形下，因双螺旋大沟内的特异性相互作用引起。反义核酸序列可以通过转化法或在特定组织部位处的直接注射法导入植物。或者，反义核酸序列可以受到修饰以靶向所选的细胞并且随后全身性施用例如，对于全身性施用，可以修饰反义核酸序列，从而它们与表达在所选细胞表面上的受体或抗原特异性地结合，例如通过将所述反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体连接而做到这一点。所述反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细胞。
根据又一个方面，反义核酸序列是α-端基异构核酸序列。α端基异构核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，在所述双链杂交体中与常见的b-单元相反，所述链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。或者，与核酸序列相对应的mRNA转录物可以用来从RNA分子汇集物中选出具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。
内源基因中存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸序列中存在突变时，基因沉默也可以发生。所述降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一种或多种突变和/或截短因而可以产生仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白)但不能表现其正常功能的多肽(如信号配体)。
基因沉默的又一种方法是靶向与基因的调控区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成可阻止靶细胞中基因转录的三重螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。
技术人员熟知其他方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制其在植物中的功能，或干扰其中涉及某多肽的信号传导途径。尤其，可以考虑人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰其中涉及所述靶多肽的信号传导途径。
或者，可以设立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，其中所述的天然变体编码活性降低的多肽。也可以使用此类天然变体，例如来开展同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常长19-24个核苷酸的单链小RNA。它们主要发挥调控基因表达和/或mRNA翻译的功能。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列完全互补或接近完全互补。但是，存在具有多达5个错配的天然靶。它们由Dicer家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折返结构的较长非编码性RNA加工而来加工后，它们通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)的主要组分-Argonaute蛋白结合被掺入该复合体。miRNA充当RISC的特异性组分，因为它们与胞质内的靶核酸序列(大多是mRNA)发生碱基配对。后续调控事件包括靶mRNA切割和摧毁和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此往往反映为靶基因的mRNA水平减少。
可以按照遗传工程方式专门设计通常长21个核苷酸的人工微RNA(amiRNA)以负向地调控单个或多个目的基因的基因表达。选择植物的微RNA靶的决定因素是本领域熟知的。已经定义了用于靶识别的经验参数和可以使用它们来辅助特定amiRNA的设计(Schwab等，Dev.Cell8，517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，2006Plant Cell.2006 18(5)：1121-33)。
为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，来自任何给定植物物种的核酸序列导入相同物种。例如，来自稻的核酸序列转化至稻植物。但是，并非绝对要求待导入的核酸序列源自与该核酸序列待导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸序列之间存在基本的同源性即可。
上文描述的是用于降低或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的例子。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子，实现降低完整植物中或其部分中内源基因的表达。
选择标记(基因)/报道基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中所述″选择标记″、″选择标记基因″或“报道基因”在所述细胞中表达旨在促进鉴定和/或选择用本发明的核酸序列构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够借助一系列不同原理而鉴定核酸序列分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供
Figure BDA0000461644550000341
抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生物)的形成。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸序列稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取了外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述的基因)通常连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上导入宿主细胞。已经用所导入核酸序列稳定转染的细胞可以通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。一旦不再需要标记基因，可以从转基因细胞移除或删去标记基因。用于标记基因去除的技术是本领域已知的，有用的技术在定义部分中描述于上文。
因为所述标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因一旦核酸序列已经成功地导入，则在转基因宿主细胞中是不再需要或不想要的，故而，用于导入核酸序列的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法称作共转化法。共转化法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸序列而第二种载体携带标记基因。大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。标记基因随后可以通过开展杂交从转化的植物中除去。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与目的核酸序列一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源物杂交，或该转化体用导致转座酶表达的核酸序列构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功发生，则转座子从宿主细胞的基因组中跳出并丢失。在其他许多情况下，转座子跳到不同位置。在这些情况下，必须通过开展杂交消除标记基因。在微生物学中，开发了有可能或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于所谓重组系统；此方法的优势在于可以用所述的重组系统实行杂交消除作用。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。Cre1是除去位于loxP序列之间序列的重组酶。若所述标记基因整合在loxP序列之间，则一旦转化已经成功发生，它因重组酶表达而被除去。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”例如就核酸序列而言，意指包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不位于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，所述的修饰有可能采取例如取代、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地保留，至少部分保留。该环境分布在所述核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp序列长度。当天然存在的表达盒受非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)被修饰时，天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码在本发明方法中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350或WO 00/15815中描述。
为本发明目的，如上所述，将转基因植物因此理解为意指在本发明方法中有用的核酸序列不处于所述植物基因组中所述核酸的天然基因座处，所述核酸序列有可能同源或异源地表达。但是，如所提及，转基因的还意指尽管本发明的或在本发明方法中有用的核酸序列处于植物基因组中所述核酸的天然位置处，然而其序列相对于天然序列而言已经被修饰，和/或所述天然序列的调控序列已经被修饰。转基因的优选地理解为意指本发明核酸序列在基因组的非天然基因座处表达，即，所述核酸序列的同源表达或优选异源表达发生。优选的转基因植物在本文中提及。
转化
如本文中提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞，无论转化所用的方法是什么方法。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且完整植物可以从中再生。所选的具体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导性分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，它可以整合至宿主基因组。所得的转化植物细胞随后可以用来按照本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。转化植物物种现在是极为常规的技术。有利地，几种转化方法中的任何方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant MolBiol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是植物内(in planta)转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明特别有利的是将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基。随后继续培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的众知方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。所述方法还例如由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)描述。待表达的核酸序列或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过将擦伤的叶或切碎的叶浸泡在农杆菌溶液中并随后将它们在合适培养基中培育。借助根癌农杆菌转化植物例如由
Figure BDA0000461644550000381
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，还可转化植物分生组织的细胞，并且尤其是发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然植物发育过程，从而产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet208：274-289；Feldmann K(1992)，在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in ArabidopsisResearch.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复除去花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌温育，因而同样可以在较晚的时间点上获得转化的种子(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。但是，特别有效的方法是改良真空渗入法，如“花器浸蘸”法。在拟南芥属植物真空渗入法的情况下，在减压下用农杆菌悬液处理完整植物[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在”花器浸蘸法”的情况下，将正在发育的花组织与经表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中母系地遗传，这降低或消除了经过花粉的转基因流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中已示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导进入原质体的位点特异性整合。已经对许多不同植物物种描述了质体转化并且Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basicresearch and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progresstowards commercialization of plastid transformation technology)，Trends Biotechnol.21，20-28进行了综述。其他生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式进行报道，其中所述的无标记质体转化体可以通过瞬时共整合性标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。
T-DNA活化标签技术(T-DNA activation tagging)
T-DNA活化标签技术(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及以启动子指导靶向的基因表达的方式在目的基因的基因组区域内或基因的编码区上游或下游10kb处插入通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA。一般，靶向基因的天然启动子对该靶向基因表达的调控被破坏，并且所述基因处于新导入的启动子控制下。该启动子一般嵌入T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感染，并且导致在插入的T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物因在导入的启动子附近的基因表达受到调节而显示显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组中定向诱导的局部损伤法”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有改良表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以表现在强度或在位置或在时间方面改良的表达(例如若所述突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。在TILLING中一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，ChuaNH，Schell J，Singapore编辑，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在JMartinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和复性以使得异双链体形成；(e)DHPLC，其中异双链体在汇集物中的存在作为色谱图中一个额外的峰被检测到；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物的测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许在基因组中定义的所选位置处导入选择的核酸序列。同源重组是在生物科学中例行用于低等生物如酵母或小立碗藓属(Physcomitrella)苔藓的标准技术。已经对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada等(2002)NatBiotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)描述了用于植物中开展同源重组的方法，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与特定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接有助于对产量，或实际产量是对于某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量(根和/或枝条生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
早期萌发势
“早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期期间，并且可以因植物适应性增加引起，其中所述的植物适应性增加原因在于例如该植物更好地适应环境(即优化能量来源的用途和枝条与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示幼苗存活增加和作物建立更佳，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往形成更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过测量多种因子如千粒重(ThousandKernel Weight)、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量和许多其他因素等确定。
增加/改善/增强
术语“增加”、“改善”或“增强”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
增加的种子产量自身可以表现为以下一个或多个指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子基础和/或每株植物和/或每平方米；b)增加的每株植物花数目；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，以及g)增加的初级圆锥花序的数量，这从计数的饱满种子数及其总重量中外推出来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量引起，并且也可以因胚和/或胚乳大小的增加引起。
种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增长。此外，种子产量的增加自身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的种子产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
绿度指数
从植物的数字图像计算如本文中所用的“绿度指数”。对属于图像上植物目标的每个像素计算绿色值与红色值的比率(在编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在营养可用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。
植物
本文中所用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织、器官在内的植物部分，其中每种前述对象包含目的基因/核酸序列。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种前述对象包含目的基因/核酸序列。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocussativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia unifiora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgobiloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzulasylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersiconesculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、番茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻(Oryzasativa)、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenis spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopisspp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanumtuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticale sp.，Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticumsativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zeamays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)及其他。
发明详述
令人惊讶的，现已发现调节编码GS1多肽的核酸序列在植物中的表达，使植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，包括调节编码GS1多肽的核酸序列在植物中的表达。
此外，令人惊讶的，现已发现调节编码PEAMT多肽的核酸序列在植物中的表达，使植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物，增强植物中的产量相关性状的方法，包括调节编码PEAMT多肽的核酸序列在植物中的表达。
此外，令人惊讶的，现已发现增加编码如本文定义的FATB多肽的核酸序列在植物中的表达，使植物相对于对照植物具有增加的种子产量相关性状。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物，增加植物的种子产量相关性状的方法，包括增加编码FATB多肽的核酸序列在植物中的表达。
此外，令人惊讶的，现已发现调节编码LFY样多肽的核酸序列在植物中的表达，使植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括调节编码LFY样多肽的核酸序列在植物中的表达。
用于调节(优选增加)编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列表达的优选的方法是通过在植物中导入和表达编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列。
关于GS1多肽，下文中任何指代“用于本发明的方法的蛋白质”考虑意指如本文定义的GS1多肽。下文中任何指代“用于本发明的方法的核酸序列”考虑意指能够编码此类GS1多肽的核酸序列。待导入植物的核酸序列(从而用于实施本发明方法)是任何编码目前描述的蛋白质类型的核酸序列，后文也称为“GS1核酸序列”或“GS1基因”。
如本文中定义的，出于本发明目的的“GS1多肽”指在进化系统树(例如图3中显示的)中与藻类来源的GS1蛋白聚类在一起(以形成藻类-类型进化枝)的任何谷氨酰胺合酶1(GS1)。优选的，GS1是藻类来源的。谷氨酰胺合酶(酶分类号EC 6.3.1.2)催化下列反应：
ATP+L-谷氨酸+NH3
Figure BDA0000461644550000461
L-谷氨酰胺+ADP+磷酸
优选的，GS1蛋白包含Gln-synt_C结构域(Pfam登录号PF00120)和Gln-synt_N结构域(Pfam登录号PF03951)。更优选的，用于本发明方法的GS1蛋白包含至少1个、优选的至少2个、更优选的全部3个下列保守序列，其中存在最多4个，优选的3个或更少，更优选的2个或更少，最优选的1个或没有错配：
基序1(SEQ ID NO：3)：GY(Y/L/F)(E/T)DRRP(A/S/P)(A/S)(N/D)(V/L/A/M)D(P/A)Y
优选地基序1是GY(Y/L/F)(E/T)DRRP(A/P)(A/S)(N/D)(V/L/A)D(P/A)Y
基序2(SEQ ID NO：4)：DP(I/F)RG(A/E/D/S/G/L/V)(P/N/D)(H/N)(V/I)(L/I)V(L/I/M)(C/T/A)
优选地，基序2是DP(I/F)RG(A/E/G)(P/N/D)(H/N)(V/I)LV(L/M)(C/A)
基序3(SEQ ID NO：5)：G(A/L/M/G/C)H(T/S/I/V/F)(N/K)(F/Y/V)S(T/S/N)
优选地基序3是G(A/M/G/C)H(T/I/V/F)(N/K)(F/Y)S(T/N)
可选的，GS1蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性，条件是同源蛋白包含上文列出的保守基序。利用全局比对算法确定整体序列同一性，例如GAP程序(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选的使用缺省的参数，且优选的使用成熟蛋白质的序列(即，在不考虑分泌信号或转运肽的条件下)。与整体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常较高。
优选的，当用于构建进化系统树，例如图3a和3b中描述的时，多肽序列与藻类类型进化枝(包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，下文中任何指代“用于本发明的方法的蛋白质(或多肽)”考虑意指如本文定义的PEAMT多肽。下文中任何指代“用于本发明的方法的核酸序列”考虑意指能够编码此类PEAMT多肽的核酸序列。待导入植物的核酸序列(从而用于实施本发明方法)是任何编码目前描述的蛋白质类型的核酸序列，后文也称为“PEAMT核酸序列”或“PEAMT基因”。
如本文定义的“PEAMT多肽”指具有磷酸乙醇胺N-甲基转移酶活性的任何多肽。
用于测量磷酸乙醇胺N-甲基转移酶活性的工具和技术是本领域普遍已知的。例如，可以通过在Schizosaccharommyces pombe中的互补(Nuccio等人，2000)分析PEAMT多核苷酸及其编码的多肽的体内活性。还可以如Nuccio等人，2000所述在体外确定PEAMT活性。
“PEAMT多肽”包含两个IPR013216，甲基转移酶11型结构域(Interpro登录号：IPR013216；pfam登录号：PF08241)和任选的ubiE/COQ5甲基转移酶结构域(Ubie_methyltran(Pfam登录号：PF01209))。
甲基转移酶11型结构域，和鉴别多肽中存在此类结构域的方法是本领域普遍已知的。表A2中提出了包含2个甲基转移酶11型结构域的蛋白质的实例。SEQ ID NO：86和87给出了SEQ ID NO：58中存在的甲基转移酶11型结构域。实施例章节教导了在SEQ ID NO：58表示的PEAMT多肽中鉴别甲基转移酶11型和ubiE/COQ5甲基转移酶的存在的方法。
SEQ ID NO：58包括2个甲基转移酶11型结构域，它们表示为SEQID NO：86
(PPYEGKSVLELGAGIGRFTGELAQKAGEVIALDIIESAIQKNESVNGHYKNIKFMCADVTSPDLKIKDGSIDLIFSNWLLMYLSDKEVELMAERMIGWVKPGGYIFFRES)和SEQ ID NO：87
(DLKPGQKVLDVGCGIGGGDFYMAENFDVHVVGIDLSVNMISFALERAIGLKCSVEFEVADCTTKTYPDNSFDVIYSRDTILHIQDKPALFRTFFKWLKPGGKVLITDY)。此外，SEQ ID NO：58包括ubiE/COQ5甲基转移酶结构域，其表示为SEQ ID NO：88
(ERVFGEGYVSTGGFETTKEFVAKMDLKPGQKVLDVGCGIGGGDFYMAENFDVHVVGIDLSVNMISFALERAIGLKCSVEFEVADCTTKTYPDNSFDVIYSRDTILHIQDKPALFRTFFKWLKPGGKVLITDYCRSAETPSPEFAEYIKQRGYDLHDVQAYGQMLKDAGFDDVIAEDRTDQ)。
用于本发明方法的“PEAMT多肽”还可以包含一个或多个下列基序：
1.基序4：IFFRESCFHQSGD(SEQ ID NO：89)：
2.基序5：EYIKQR(SEQ ID NO：90)：
3.基序6：WGLFIA(SEQ ID NO：91)：
基序4至6位于SEQ ID NO：58表示的PEAMT多肽的C端部分，分别在氨基酸位置138-150、383-388和467-472。
优选的，用于本发明方法的PEAMT蛋白包括与基序1至3中任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基序。
更优选的，用于本发明方法的PEAMT蛋白包括保守结构域，所述保守结构域以增加的优选顺序与SEQ ID NO：86至88中任一个，或与实施例章节的表C2提出的任何氨基酸结构域具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
如本文中定义的，“PEAMT或其同源物”指以增加的优选顺序与SEQ ID NO：58表示的氨基酸具有至少50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性的任何多肽。
可选的，PEAMT蛋白的同源物包括保守的氨基酸结构域，所述保守结构域以增加的优选顺序与表C2提出的氨基酸基序具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
利用比对算法确定序列同一性，例如GAP程序(GCG WisconsinPackage，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选的使用缺省的参数或BLAST。与整体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常较高。
优选的，当用于构建进化系统树时，例如图6中描述的，多肽序列与包含SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与其它任何其它组聚类。
此外，本发明还提供了迄今未知的编码FATB多肽的核酸序列和FATB多肽。
根据本发明的一个实施方案，从而提供了分离的核酸序列，其包括：
(i)由SEQ ID NO：130表示的核酸序列；
(ii)由SEQ ID NO：130表示的核酸序列的互补序列；
(iii)编码FATB多肽的核酸序列，所述核酸序列以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：131表示的多肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
根据本发明的另一个实施方案，还提供了分离的多肽序列，其包括：
(i)由SEQ ID NO：131表示的多肽序列；
(ii)以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：131表示的多肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽序列；
(iii)由上述(i)或(ii)给出的任意多肽序列的衍生物。
用于在植物中增加编码FATB多肽的核酸序列的表达的优选的方法是通过在植物中导入和表达编码FATB多肽的核酸序列。
关于FATB多肽，下文中任何指代“用于本发明的方法的蛋白质”考虑意指如本文定义的FATB多肽。下文中任何指代“用于本发明的方法的核酸序列”考虑意指能够编码此类FATB多肽的核酸序列。待导入植物的核酸序列(从而用于实施本发明方法)是任何编码目前描述的多肽类型的核酸序列，后文也称为“FATB核酸序列”或“FATB基因”。
如本文定义的“FATB多肽”指任何包含(i)质体转运肽；(ii)至少一个跨膜螺旋；(iii)和酰基-ACP硫酯酶家族结构域(具有InterPro登录号IPR002864)的多肽。
可选的或额外地，如本文定义的“FATB多肽”指任何这样的多肽序列，所述多肽序列具有(i)质体转运肽；(ii)以增加的优选顺序与SEQ ID NO：141表示的跨膜螺旋具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性；且以增加的优选顺序与SEQ ID NO：140表示的酰基-ACP硫酯酶家族结构域具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
可选的或额外地，如本文定义的“FATB多肽”指任何这样的多肽，所述多肽以增加的优选顺序与由SEQ ID NO：93表示的FATB多肽或与本文的表A3给出的任一多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
可选的或额外地，如本文定义的“FATB多肽”指任何这样的多肽序列，当用于构建FATs(FATA和FATB一起)进化系统树例如图10中描述的时，所述多肽序列与包含SEQ ID NO：93表示的多肽序列的FATB多肽进化枝聚类(如图10中箭头所示)，而不与FATA多肽的进化枝聚类。
可选的或额外地，“FATB多肽”是具有酶活性的多肽，所述酶活性在于水解酰基-ACP硫酯键，优选的从饱和的酰基-ACP(具有在8至18个碳之间的链长度)上释放游离的脂肪酸和酰基载体蛋白(ACP)。
关于LFY-样多肽，下文中任何指代“用于本发明的方法的蛋白质”考虑意指如本文定义的LFY-样多肽。下文中任何指代“用于本发明的方法的核酸序列”考虑意指能够编码此类LFY-样多肽的核酸序列。待被导入植物的核酸序列(从而用于实施本发明方法)是任何编码目前描述的蛋白质类型的核酸序列，后文也称为“LFY-样核酸序列”或“LFY-样基因”。
如本文定义的“LFY-样多肽”指任何包含FLO_LFY结构域(InterPro登录号IPR002910；Pfam登录号PF01698)的转录因子。FLO_LFY结构域代表蛋白质序列的主要部分(参见图14)，且是高度保守的(图15)。
优选的，LFY-样蛋白以增加的优选顺序与SEQ ID NO：146表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性，条件是同源蛋白质包含上文列出的保守FLO_LFY基序。利用全局比对算法确定整体序列同一性，例如GAP程序(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选的使用缺省的参数。与整体序列同一性相比，当仅考虑保守结构域或基序(例如FLO-LFY结构域)时，序列同一性通常较高。
优选的，用于构建进化系统树时，例如图16中描述的，多肽序列与LFY-样多肽组聚类。
术语“结构域”、“标签”和“基序”定义在本文的“定义”章节中。存在用于鉴别结构域的专门数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic acid sequences Res30，242-244)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，SearlsD.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人，Nucleic acidsequences Research30(1)：276-280(2002))。在ExPAsy蛋白组学服务器(瑞士生物信息中心(Gasteiger等人，ExPASy：the proteomics serverfor in-depth protein knowledge and analysis，Nucleic acid sequencesRes.31：3784-3788(2003)))上可获得成套的蛋白质序列计算机分析的工具。还可以使用常规技术，例如通过序列比对，鉴别结构域或基序。
关于FATB多肽，本文下面的实施例4中显示了SEQ ID NO：93的多肽序列分析。例如，SEQ ID NO：93表示的FATB多肽包括具有InterPro登录号IPR002864的酰基-ACP硫酯酶家族结构域。图13显示了本文表A3的多肽的比对。此类比对可用于鉴别FATB多肽之间最保守的结构域或基序，例如TMpred预测的跨膜螺旋(参见本文的实施例5)，由SEQ ID NO：141表示(包含在SEQ ID NO：93中)。
用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol215：403-10)计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNAsequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替代，也可以使用特定结构域。利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸序列或氨基酸序列范围或选定的结构域或保守基序范围内确定序列同一性值。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
关于FATB多肽，本文实施例3描述了表B3中由SEQ ID NO：93表示的FATB多肽和表A2中列出的FATB多肽间的同一性百分数，可低至53％氨基酸序列同一性。
蛋白质亚细胞定位预测的任务是重要的且深入研究的。了解蛋白质的定位帮助阐述蛋白质的功能。用于蛋白质定位的实验方法从免疫定位到利用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。此类方法是准确的，但与计算机方法相比耗费劳动力。目前，在从序列数据计算机预测蛋白质定位中已有很大进步。除本领域技术人员普遍已知的算法外，还可利用瑞士生物信息中心提供的ExPASy蛋白组学工具，例如，PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等。实施例5显示了本发明多肽的亚细胞定位的鉴别。特别是，本发明的SEQ ID NO：2定位在植物细胞的质体(叶绿体)区室。除转运肽外，FATB多肽还包括预测的跨膜螺旋(参见本文的实施例5)，用于锚定至叶绿体膜。
用于靶向质体的方法是本领域普遍已知的，包括使用转运肽。下表3显示了转运肽的实例，可用于将任何FATB多肽靶向至质体，所述FATB多肽的天然形式通常不是靶向质体的，或者所述FATB多肽的天然形式通过不同的转运肽(例如，它的天然转运肽)靶向质体。将编码转运肽的核酸序列克隆到编码多肽(例如，缺少自身转运肽的FATB多肽)的核酸序列的上游和框内，涉及本领域普遍已知的标准分子技术。
表3：用于将多肽靶向质体的转运肽序列的实例
FATB多肽是靶向并在叶绿体中有活性的，即，FATB多肽能够水解酰基-ACP硫酯键，优选的从饱和的酰基-ACP(具有在8至18个碳之间变化的链长度)上释放游离的脂肪酸和酰基载体蛋白(ACP)。用于测试这些活性的测定是本领域普遍已知的。实施例6中提供了其它细节。
此外，GS1多肽(至少其天然的形式)通常具有谷氨酰胺合酶活性。用于测量谷氨酰胺合酶活性的工具和技术是本领域普遍已知的(参见例如Martin等人，Anal.Biochem.125，24-29，1982和实施例6)。
此外，当根据实施例章节概述的本发明的方法在稻中表达时，PEAMT多肽使植物具有增加的产量相关性状，特别是一种或多种增加的绿色生物量、早期萌发势、种子总重、每个圆锥花序的花数目、种子饱满率、千粒重和收获指数。
此外，LFY-样多肽(至少其天然的形式)通常具有DNA结合活性。用于测量DNA结合活性的工具和技术是本领域普遍已知的。Xue(PlantJ.41，638-649，2005)提供了表征蛋白质的DNA结合性质的实例。
此外，当根据实施例7和8概述的本发明的方法在稻中表达时，LFY-样多肽使植物具有增加的产量相关性状，特别是增加的种子产量。
在关于GS1多肽的方面，本发明通过用SEQ ID NO：1所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码GS1的核酸序列或GS1多肽实施。
编码GS1多肽的核酸序列的例子在本文实施例1的表A1中给出。此类核酸序列用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所表示的GS1多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，第二BLAST因而将针对衣藻属序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
在关于PEAMT多肽的方面，本发明通过用SEQ ID NO：57所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ IDNO：58的多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码PEAMT的核酸序列或PEAMT多肽实施。
编码PEAMT多肽的核酸序列的例子在本文实施例部分的表A2中给出。此类核酸序列用于实施本发明的方法中。在实施例部分的表A中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：58所表示的PEAMT多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A2中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：57或SEQID NO：58的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
在关于FATB多肽的方面，本发明通过用SEQ ID NO：92所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：93的FATB多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码FATB多肽的核酸序列实施。
编码FATB多肽的核酸序列的例子在本文实施例1的表A3中给出。此类核酸序列用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A3中给出的多肽序列是由SEQ ID NO：93所表示的FATB多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A3中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：93的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
在关于LFY-样多肽的方面，本发明通过用SEQ ID NO：145所表示的核酸序列转化植物进行说明，其中所述的核酸序列编码SEQ ID NO：146的多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码LFY-样的核酸序列或LFY-样多肽实施。
编码LFY-样多肽的核酸序列的例子在本文实施例1的表A4中给出。此类核酸序列用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A4中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：146所表示的LFY样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A4中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥属序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较过程也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类和鉴定直向同源物和旁系同源物。
此外，本发明还提供了迄今未知的GS1编码核酸序列和GS1多肽。
根据本发明的其它实施方案，还提供了分离的多肽，选自：
(i)由SEQ ID NO：53或54表示的氨基酸序列；
(ii)以增加的优选顺序，与SEQ ID NO：53或54表示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列；
(iii)上述(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
本发明还提供了如上公开的编码未知的GS1多肽的核酸序列，和与其杂交的核酸序列，优选的在严格条件下。
核酸序列变体也可用于实践本发明的方法。此类变体的实例包括编码实施例章节的表A1至A4给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸序列，术语“同源物”和“衍生物”如本文中所定义的。还可用于本发明方法的是编码实施例章节的表A1至A4给出的任一氨基酸序列的直向同源物和旁系同源物的同源物和衍生物的核酸序列。可用于本发明方法的同源物和衍生物具有与其来源的未修饰的蛋白质的基本相同的生物学和功能活性。
用于实践本发明方法的其它核酸序列包括编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的部分，与编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列杂交的核酸序列，编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的剪接变体，编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的等位变体，和通过基因改组(gene shuffling)获得的编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组是如本文定义的。
编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列不需要是全长的核酸序列，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达实施例章节的表A1至A4给出的任一核酸序列的部分，或者编码实施例章节的表A1至A4给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的部分。
核酸序列的一部分可以例如通过对所述核酸序列产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，在翻译时产生的所得多肽可以比对于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
关于GS1多肽，用于本发明方法的部分编码如本文定义的GS1多肽，并具有与实施例1的表A1给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例1的表A1给出的任一的核酸序列的部分，或者是编码实施例1的表A1给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选的，部分是长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例1的表A1给出的任一核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例1的表A1给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：1的核酸序列的一部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，其中所述的氨基酸序列在构建进化系统树例如图3所描述的进化系统树中使用时，与藻类类型进化枝(包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，用于本发明方法的部分编码如本文定义的PEAMT多肽，并具有与实施例章节的表A2给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例章节的表A2给出的任一的核酸序列的部分，或者是编码实施例章节的表A2给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选的，部分是长度为至少150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例章节的表A2给出的任一核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例章节的表A2给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：57的核酸序列的一部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，其中所述的氨基酸序列在构建进化系统树例如图6所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ IDNO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与任何其它组聚类。
关于FATB多肽，用于本发明方法的部分编码如本文定义的FATB多肽，并具有与实施例1的表A3给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例1的表A3给出任一的核酸序列的部分，或者是编码实施例1的表A3给出的任一的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选的，部分是，以增加的优选顺序，长度为至少600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例1的表A3给出的任一核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例1的表A3给出的任一的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的连续的核苷酸。优选的，部分是这样的核酸序列的部分，所述核酸序列编码的多肽序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO：93表示的FATB多肽，或者与本文的表A给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。最优选的，部分是SEQ ID NO：92的核酸序列的一部分。
关于LFY-样多肽，用于本发明方法的部分编码如本文定义的LFY-样多肽，并具有与实施例1的表A4给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例1的表A4给出的任一的核酸序列的部分，或者是编码实施例1的表A4给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选的，部分是长度为至少600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例1的表A4给出任一核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例1的表A4给出的任一的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：145的核酸序列的一部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，其中所述的氨基酸序列在构建进化系统树例如图16所描述的进化系统树中使用时，与LFY-样多肽的组聚类。
可用于本发明方法的另一种核酸序列是在降低严格条件下，优选的是在严格条件下，能够与编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列，或者与如本文定义的部分杂交的核酸序列。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达能够与实施例1的表A1至A4给出的任一核酸序列杂交的核酸序列，或者包括在植物中导入和表达能够与编码实施例1的表A1至A4给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列杂交的核酸序列。
关于GS1多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GS1多肽，其具有如实施例1的表A1中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A1中给出的任一核酸序列的互补序列或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与下述核酸序列的互补序列杂交，其中所述的核酸序列编码在实施例1的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所表示的核酸序列的互补序列或与其一部分杂交。
关于GS1多肽，优选的，杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列当全长且在构建进化系统树例如图3a和3b所描述的进化系统树中使用时，与藻类类型进化枝(包含SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的PEAMT多肽，其具有如实施例部分的表A2中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A2中给出的任一核酸序列的互补序列或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与下述核酸序列的互补序列杂交，其中所述的核酸序列编码在实施例部分的表A2中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：57所表示的核酸序列的互补序列或与其一部分杂交。
关于PEAMT多肽，优选的，杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列当全长且在构建进化系统树例如图6所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与任何其它组聚类。
关于FATB多肽，用于本发明方法的杂交序列编码如本文定义的FATB多肽，并具有与实施例1的表A3给出的多肽序列基本相同的生物学活性。优选的，杂交序列能够与实施例1的表A3给出任一的核酸序列杂交，或者与其互补序列杂交，或者与任何这些序列的部分杂交，所述部分如上文定义，或者其中杂交序列能够与编码实施例1的表A3给出任一的多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或与其互补序列杂交。
关于FATB多肽，优选的，杂交序列能够与编码这样的多肽序列的核酸序列杂交，所述多肽序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO：93表示的FATB多肽，或者与本文的实施例1的表A3给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。最优选的，杂交序列能够与SEQ ID NO：92表示的核酸序列或其部分杂交。
关于LFY-样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的LFY-样多肽，其具有如实施例1的表A4中所给出氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A4中给出的任一核酸序列的互补序列或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或其中所述杂交序列能够与下述核酸序列的互补序列杂交，其中所述的核酸序列编码在实施例1的表A4中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：145所表示的核酸序列的互补序列或与其一部分杂交。
关于LFY-样多肽，优选的，杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列当全长和在构建进化系统树例如图16所描述的进化系统树中使用时，与LFY-样多肽的组聚类。
可用于本发明方法的另一种核酸序列是编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的剪接变体，剪接变体是如本文定义的。
关于GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽，根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达在实施例1的表A1、或A2或A4中给出的任一核酸序列的剪接变体，或者编码在实施例1的表A1、A2或A4中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。
关于FATB多肽，根据本发明，提供了用于在植物中增加种子产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达在实施例1的表A3中给出的任一核酸序列的剪接变体，或者编码在实施例1的表A3中给出的任何多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体，其具有与SEQ ID NO：93表示的多肽序列和与实施例1的表A3中描述的任何多肽序列基本相同的生物学活性。
关于GS1多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1表示的核酸序列的剪接变体，或者是编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选的，由剪接变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图3a和3b所描述的进化系统树中使用时，与藻类类型进化枝(包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：57表示的核酸序列的剪接变体，或者是编码SEQ ID NO：58的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选的，由剪接变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图6所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQID NO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与任何其它组聚类。
关于FATB多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：92表示的核酸序列的剪接变体，或者是编码SEQ ID NO：93的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选的，剪接变体是由编码这样的多肽序列的核酸序列的剪接变体，所述多肽序列以增加的优选顺序与SEQ IDNO：93表示的FATB多肽，或者与本文的表A3给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于LFY-样多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：145表示的核酸序列的剪接变体，或者是编码SEQ ID NO：146的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选的，由剪接变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图16所描述的进化系统树中使用时，与LFY-样多肽的组聚类。
可用于实施本发明方法的另一种核酸序列变体是编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的等位变体，等位变体是如本文定义的。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达在实施例1的表A1至A4中给出的任一核酸序列的等位变体，或者包括在植物中导入和表达编码在实施例1的表A1至A4中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的等位变体。
关于GS1多肽，用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ IDNO：2的GS1多肽和实施例1的表A1描述的任何氨基酸具有基本相同的生物学活性。等位变体是天然存在的，本发明方法中涵盖了这些天然等位基因的应用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：1的等位变体，或者是编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选的，由等位变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图3a和3b所描述的进化系统树中使用时，与藻类类型进化枝(包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQID NO：58的PEAMT多肽和实施例章节的表A2描述的任何氨基酸具有基本相同的生物学活性。等位变体是天然存在的，本发明方法中涵盖了这些天然等位基因的应用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：57的等位变体，或者是编码SEQ ID NO：58的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选的，由等位变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图6所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与任何其它组聚类。
关于FATB多肽，用于本发明方法的等位变体与SEQ ID NO：93的FATB多肽和实施例1的表A3描述的任何多肽序列具有基本相同的生物学活性。等位变体是天然存在的，本发明方法中涵盖了这些天然等位基因的应用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：92的等位变体，或者是编码SEQ ID NO：93的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选的，等位变体是这样的多肽序列的等位变体，所述多肽序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO：93表示的FATB多肽，或者与本文实施例1的表A3给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于LFY-样多肽，用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQID NO：146的LFY-样多肽和实施例1的表A4描述的任何氨基酸具有基本相同的生物学活性。等位变体是天然存在的，本发明方法中涵盖了这些天然等位基因的应用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：145的等位变体，或者是编码SEQ ID NO：146的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选的，由等位变体编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图16所描述的进化系统树中使用时，与LFY-样多肽的组聚类。
基因改组或定向进化也可以用于产生编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的变体；术语“基因改组”是如本文定义的。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达在实施例1的表A1至A4中给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中导入和表达编码在实施例1的表A1至A4中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，所述变体核酸序列是通过基因改组获得的。
关于GS1多肽，优选的，由通过基因改组获得的变体核酸序列编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图3a和3b所描述的进化系统树中使用时，与藻类类型进化枝(包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的藻类GS1多肽的组)聚类，而不与植物叶绿体或植物细胞溶胶谷氨酰胺合酶组聚类。
关于PEAMT多肽，优选的，由通过基因改组获得的变体核酸序列编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图6所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列的PEAMT多肽的组I聚类，而不与任何其它组聚类。
关于FATB多肽，优选的，由通过基因改组获得的变体核酸序列编码这样的多肽序列，所述多肽序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO：93表示的FATB多肽，或者与本文表A3给出的任何多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于LFY-样多肽，优选的，由通过基因改组获得的变体核酸序列编码的氨基酸序列，在构建进化系统树例如图16所描述的进化系统树中使用时，与LFY-样多肽的组聚类。
此外，还可以通过定点诱变获得核酸序列变体。可利用一些方法实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。
编码GS1多肽的核酸序列可以源自任何天然的或人工的来源。通过有意的人为操作，可以在组成和/或基因组环境上从其天然形式修饰核酸序列。优选的，GS1多肽编码核酸序列是来自绿藻门(Chlorophyta)，更优选的来自绿藻纲(Chlorophyceae)，更优选的来自衣藻科(Chlamydomonadaceae)，最优选的来自雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
编码PEAMT多肽的核酸序列可以源自任何天然的或人工的来源。通过有意的人为操作，可以在组成和/或基因组环境上从其天然形式修饰核酸序列。优选的，PEAMT多肽编码核酸序列是来自植物的，还优选的来自双子叶植物，更优选的来自十字花科(Brassicaceae)，最优选的核酸序列来自拟南芥。
有利的，本发明提供迄今未知的PEAMT核酸序列和多肽序列。
根据本发明的其它实施方案，提供了分离的PEAMT核酸序列分子，其包含与SEQ ID NO：57至少98％的序列同一性。
此外，提供了分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：58至少99％的序列同一性。
编码FATB多肽或LFY-样多肽的核酸序列可以源自任何天然的或人工的来源。通过有意的人为操作，可以在组成和/或基因组环境上从其天然形式修饰核酸序列。编码FATB多肽或LFY-样多肽的核酸序列是来自植物的，还优选的来自双子叶植物，更优选的来自十字花科，最优选的核酸序列来自以南芥。
本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有增加的产量、尤其增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本文中对增强的产量相关性状的称谓意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为以下一个或多个指标：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物穗数的增加、行数、每行籽粒数、籽粒重、千粒重、穗长度/直径的增加、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)增加，及其他。以稻为例，产量增加可以自身表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、每圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数目(其表述为饱满种子数对原发圆锥花序数的比)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)增加、千粒重增加及其他。
本发明提供了用于相对于对照植物，增加植物的产量，特别是种子产量的方法，所述方法包括调节编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列在植物中的表达。
本发明提供了用于相对于对照植物，增加植物的产量，特别是种子产量的方法，所述方法包括调节编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的核酸序列在植物中的表达。
本发明还提供了用于相对于对照植物，增加植物的种子产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码如本文定义的FATB多肽的核酸序列在植物中的表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量和/或增加的种子产量相关性状，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现增加的生长速率。然而，关于LFY-样多肽，没有观察到开花时间的更早诱导。
增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受以下因素影响，如萌发速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。增加的生长速率在植物生活周期的早期期间可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物较晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。若生长速率充分增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产增加(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。生长速率可以通过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节和/或增加编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列在植物中的表达。
与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，产量和/或生长速率的增加均出现。植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
与生长在可比较条件下的对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，增加的种子产量相关性状均出现。植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。如本文使用的，术语“非胁迫”条件是允许植物的最佳生长的环境条件。本领域技术人员知晓给定地区的普通土壤条件和气候条件。
具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件的植物(在非胁迫条件下生长的)，以增加的优选顺序，通常产生此类植物在给定环境中至少90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产生。可以基于收获和/或季节基础，计算平均产生。本领域技术人员知晓作物的平均产量生产。
关于GS1多肽，本发明方法的实施使生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物的产量的方法，所述方法包括在植物中调节编码GS1多肽的核酸序列的表达。
关于PEAMT多肽，本发明方法的实施使生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物的产量的方法，所述方法包括在植物中调节编码PEAMT多肽的核酸序列的表达。
关于FATB多肽，本发明方法的实施使生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的种子产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物的种子产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中增加编码FATB多肽的核酸序列的表达。
关于LFY-样多肽，本发明方法的实施使生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件下或生长在轻度干旱条件下的植物的产量的方法，所述方法包括在植物中调节编码LFY-样多肽的核酸序列的表达。
关于GS1多肽，本发明方法的实施使生长在养分缺乏条件下，特别是生长在氮缺乏条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在养分缺乏条件下的植物的产量的方法，所述方法包括调节编码GS1多肽的核酸序列在植物中表达。养分缺乏可以是由缺少养分导致的，所述养分例如氮、磷酸盐和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，及其它。在本发明的特定实施方案中，提供了用于增加生长在氮缺乏条件下的植物的产量的方法，所述方法包括调节编码GS1多肽的核酸序列在植物中表达。
关于GS1多肽，本发明方法的实施使生长在盐胁迫条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在盐胁迫条件下的植物的产量的方法，所述方法包括调节编码GS1多肽的核酸序列在植物中表达。术语盐胁迫不限于普通的盐(NaCl)，而可以是任何一种或多种的：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2，及其它。
关于PEAMT多肽，本发明方法的实施使生长在养分缺乏条件下，特别是生长在氮缺乏条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在养分缺乏条件下的植物的产量的方法，所述方法包括调节编码PEAMT多肽的核酸序列在植物中表达。养分缺乏可以是由缺少养分导致的，所述养分例如氮、磷酸盐和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，及其它。
关于FATB多肽，本发明方法的实施使生长在非生物胁迫条件下的植物，相对于生长在可比较的胁迫条件下的对照植物，具有增加的种子产量相关性状。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。由于不同的环境胁迫激活相似的通路，本发明用干旱胁迫示例不应该视为局限于干旱胁迫，而是作为筛选(screen)表示，相对于生长在可比较的胁迫条件(一般是非生物胁迫)下的对照植物，如上文定义的FATB多肽参与增加种子产量相关性状。
如本文定义的，术语“非生物胁迫”意指任何一种或多种的：水胁迫(由于干旱或过多的水导致的)、厌氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冷冻的温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透压胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选的，水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不限于普通的盐(NaCl)，而可以是由一种或多种的NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2及其它导致的任何胁迫。
关于FATB多肽，本发明方法的实施使在非生物胁迫条件下的植物，相对于生长在可比较的胁迫条件下的对照植物，具有增加的种子产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非生物胁迫条件下的植物的种子产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码FATB多肽的核酸序列在植物中表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透压胁迫，选自以下一种或多种的：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
非生物环境胁迫的另一个实例是植物生长和发育需要同化的一种或多种养分的降低的有效性。由于营养利用效率对植物产量和产物质量的强烈影响，向田地倾倒了大量的肥料，来优化植物生长和质量。植物的生产力通常受三种主要养分的限制：磷、钾和氮，这三种中通常氮是植物生长的限速元件。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。它是在活细胞中发现的许多重要化合物的组分，包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸序列和叶绿素。植物干物质的1.5％至2％是氮，约16％的总植物蛋白。因此，氮的有效性是作物植物生长和产生的主要限制因子(Frink等人，(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(4)：1175-1180)，并对蛋白质积累和氨基酸组成具有重要影响。因此，令人极感兴趣的是当生长在氮限制条件下时，具有增加的种子产量相关性状的作物植物。
关于FATB多肽，本发明方法的实施使生长在降低养分有效性条件下的植物，特别是生长在降低氮有效性条件下的植物，相对于生长在可比较的条件下的对照植物，具有增加的种子产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在降低养分有效性(优选降低的氮有效性)条件下的植物的种子产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码FATB多肽的核酸序列在植物中表达。降低的养分有效性可以由养分的缺乏或过度导致，所述养分例如氮、磷和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，及其它。优选的，降低的养分有效性是降低的氮有效性。
关于LFY-样多肽，本发明方法的实施使生长在养分缺乏条件下的植物，特别是生长在氮缺乏条件下的植物，相对于生长在可比较条件下的对照植物，具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在养分缺乏条件下的植物的产量的方法，所述方法包括调节编码LFY-样多肽的核酸序列在植物中表达。养分缺乏可以由养分的缺少导致，所述养分例如氮、磷和其它含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，及其它。
本发明涵盖了可通过本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)或细胞。植物或其部分或细胞包含编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列转基因。
本发明还提供了基因构建体和载体，有利于编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列在植物中的导入和/或表达。基因构建体可以被插入到可商购的载体中，所述载体适合转化到植物中并适合在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供了如本文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更特别的，本发明提供了构建体，包含：
(a)编码如上文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
(c)转录终止序列。
优选的，编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列是如上文定义的。术语“控制序列”和“终止序列”是如本文定义的。
用包含任何上述核酸序列的载体转化植物。技术人员熟知为了成功的转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞，而必须存在于载体中的遗传元件。目的序列是与一种或多种控制序列(至少与启动子)有效连接的。
关于FATB，优选的，构建体的一种控制序列是分离自植物基因组的组成型启动子。植物组成型启动子的实例是GOS2启动子，优选的是稻的GOS2启动子，更优选的是SEQ ID NO：144表示的GOS2启动子。
关于GS1，有利的，可以使用任何类型的启动子，不论是天然的或合成的，来驱动核酸序列的表达，但优选的是植物来源的启动子。能够驱动在枝条中，特别是在绿色组织中表达的启动子在本方法中是特别有效的。参见本文“定义”章节关于不同启动子类型的定义。
关于PEAMT，有利的，可以使用任何类型的启动子，不论是天然的或合成的，来驱动核酸序列的表达，但优选的是植物来源的启动子。组成型启动子在本方法中是特别有效的。优选的组成型启动子也是中等强度的遍在启动子。参见本文“定义”章节关于不同启动子类型的定义。
关于FATB，有利的，可以使用任何类型的启动子，不论是天然的或合成的，来增加核酸序列的表达。组成型启动子在本方法中是特别有效的，优选的是从植物基因组分离的组成型启动子。植物组成型启动子驱动编码序列以下述水平表达，所述水平在任何情况下都低于在35SCaMV病毒启动子的控制下获得的水平。
仍然关于FATB，器官特异性的启动子，例如用于优选的在叶、茎、块茎、分生组织中表达的，可用于实施本发明的方法。发育调控性的启动子也可用于实施本发明的方法。参见本文“定义”章节关于不同启动子类型的定义。
关于LFY-样，有利的，可以使用任何类型的启动子，不论是天然的或合成的，来驱动核酸序列的表达，但优选的是植物来源的启动子。组成型启动子在本方法中是特别有效的。优选的组成型启动子也是中等强度的遍在启动子。参见本文“定义”章节关于不同启动子类型的定义。还可用于本发明方法的是枝条特异性的(或绿色组织特异性的)启动子。
关于GS1多肽，应该明确本发明的应用不限于SEQ ID NO：1表示的GS1多肽编码核酸序列，本发明的应用也不限于由枝条特异性的启动子驱动时GS1多肽编码核酸序列的表达。
枝条特异性的启动子优选的驱动在绿色组织中的表达，更优选的枝条特异性的启动子是从植物分离的，例如原叶绿素酸酯还原酶启动子(pPCR)，更优选的原叶绿素酸酯还原酶启动子是来自稻的。更优选的原叶绿素酸酯还原酶启动子是由与SEQ ID NO：6基本相似的核酸序列表示的，最优选的组成型启动子是由SEQ ID NO：6表示的。参见本文“定义”章节关于绿色组织特异性的启动子的其它实例。
关于GS1多肽，任选的，在导入植物的构建体中可以使用一个或多个终止子序列。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO：6基本相似的原叶绿素酸酯还原酶启动子，和编码GS1多肽的核酸。
关于PEAMT多肽，应该明确本发明的应用不限于SEQ ID NO：57表示的PEAMT多肽编码核酸序列，本发明的应用也不限于由组成型启动子驱动时PEAMT多肽编码核酸序列的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子，更优选的选自植物来源的启动子，例如GOS2启动子，更优选的是来自稻的GOS2启动子。更优选的，组成型启动子是由与SEQ ID NO：85基本相似的核酸序列表示的，最优选的，组成型启动子是由SEQ ID NO：85表示的。参见本文“定义”章节关于组成型启动子的实例。
关于PEAMT多肽，任选的，在导入植物的构建体中可以使用一个或多个终止子序列。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO：85基本相似的GOS2启动子，和编码PEAMT多肽的核酸。
关于FATB多肽，应该明确本发明的应用不限于SEQ ID NO：92表示的FATB多肽编码核酸序列，本发明的应用也不限于由组成型启动子驱动时FATB多肽编码核酸序列的表达。
任选的，在导入植物的构建体中可以使用一个或多个终止子序列。其它调控序列可包括转录以及翻译增强子(increaser)。本领域技术人员可以知晓适合在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。还可以在5’非翻译区(UTR)或者在编码序列中添加内含子序列，以增加细胞溶胶中积累的成熟信使的量，如定义章节中所述。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。此类序列可以是已知的或者可以是本领域技术人员可以方便获得的。
关于LFY-样多肽，应该明确本发明的应用不限于SEQ ID NO：145表示的LFY-样多肽编码核酸，本发明的应用也不限于由组成型启动子或由枝条特异性的启动子驱动时LFY-样多肽编码核酸的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子，例如GOS2启动子，优选的，启动子是来自稻的GOS2启动子。更优选的，组成型启动子是由与SEQ ID NO：149基本相似的核酸序列表示的，最优选的，组成型启动子是由SEQ ID NO：149表示的。参见本文“定义”章节表2a关于组成型启动子的其它实例。
关于LFY-样多肽，根据本发明的另一个优选的特征，编码LFY-样多肽的核酸与枝条特异性的(或绿色组织特异性的)启动子有效连接。枝条特异性的启动子优选的是原叶绿素酸酯还原酶启动子，更优选的原叶绿素酸酯还原酶启动子是来自稻的，更优选的原叶绿素酸酯还原酶启动子是由与SEQ ID NO：150基本相似的核酸序列表示的，最优选的启动子是由SEQ ID NO：150表示的。上文“定义”章节表2b中显示了也可用于实施本发明方法的其他枝条特异性的启动子的实例。
关于LFY-样多肽，任选的，在导入植物的构建体中可以使用一个或多个终止子序列。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含GOS2启动子或原叶绿素酸酯还原酶启动子，其与编码LFY-样多肽的核酸序列有效连接。
额外的调控元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加细胞溶胶内聚集的成熟信使的数量。(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他控制序列可以是蛋白质/或RNA稳定元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，所述基因构建体可以任选地包含选择标记基因。选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。用于移出标记的技术是本领域已知的，有用技术在上文定义部分中描述。
已知当核酸序列稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取了外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述的基因)通常连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上导入宿主细胞。已经用所导入核酸序列稳定转染的细胞可以通过例如选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。一旦不再需要标记基因，可以从转基因细胞移除或删去标记基因。用于标记基因去除的技术是本领域已知的，有用的技术在定义部分中描述于上文。
本发明还提供了用于生产转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，包括在植物中导入和表达编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的任何核酸。
更具体的，本发明提供了用于生产具有增强的产量相关性状，特别是增加的(种子)产量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中导入和表达编码GS1多肽、或编码PEAMT多肽、或编码LFY-样多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的任何核酸。
本发明还提供了用于生产相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中导入和表达编码如本文定义的FATB多肽的任何核酸序列
更具体的，本发明提供了用于生产相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达编码FATB多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物、植物部分或植物细胞。
(i)的核酸序列可以是能够编码如本文定义的FATB多肽的任何核酸序列。
所述核酸序列可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸序列优选地通过转化作用导入植物。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的全部方法再生。合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure BDA0000461644550000831
和Willmitzer的出版物中找到。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整植物。为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化植物可以与非转化植物区分。例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对所述转化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化接穗嫁接的转化根状茎)。
本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明方法中的亲代产生的那些相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括含有编码如本文以上所定义的GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的分离核酸序列的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
此外，本发明还包括这样的宿主细胞，所述细胞含有如上文定义的编码FATB多肽的分离的核酸序列，其与组成型启动子有效连接。根据本发明的优选的宿主细胞是植物细胞。用于在本发明方法使用的核酸序列或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物，原则上有利的是所有植物，所述植物能够合成本发明方法中使用的多肽。
本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗。更优选地，所述植物是谷类。谷类的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包括编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的重组核酸序列。本发明进一步涉及了源自、优选直接源自此种植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
此外，本发明还扩展至植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包括与组成型启动子有效连接的编码FATB多肽(如上文定义的)的分离核酸序列。本发明进一步涉及了源自、优选直接源自此种植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选的特征，受调节的表达是增加的表达。用于增加核酸序列或基因或基因产物的表达的方法良好的记载在本领域中，且定义章节中提供了实例。
如上所述，用于调节编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的表达的优选的方法，是通过在植物中导入和表达编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸；然而，还可以利用其它普遍已知的技术获得实施方法的效果，即，增强产量相关性状，包括但不限于T-DNA活化标签、TILLING、同源重组。定义章节中提供了这些技术的说明。
本发明还涵盖了如本文所述的编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的用途，以及这些GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽在植物中增强任意上述产量相关性状的用途。
此外，本发明还涵盖了如本文所述的编码FATB多肽的核酸序列的用途，以及在正常生长条件下、在非生物胁迫生长(优选的渗透胁迫生长条件)条件下，和在降低的养分有效性的生长条件下，优选的在降低的氮有效性的生长条件下，这些FATB多肽在植物中增加任意上述种子产量相关性状的用途。
关于如本文所述的GS1多肽、编码GS1多肽的核酸序列、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽，或者GS1多肽自身，可用于鉴别DNA标记的育种程序中，所述标记与编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或LFY-样多肽的基因遗传连锁。核酸/基因、或者GS1多肽自身、或PEAMT多肽自身、或LFY-样多肽，可用于定义分子标记。然后，该DNA或蛋白质标记可用于育种程序中选择如上文定义的在本发明方法中具有增强的产量相关性状的植物。
关于FATB多肽、本文所述的编码FATB多肽的核酸序列、或FATB多肽自身，可用于鉴别DNA标记的育种程序中，所述标记与FATB多肽编码基因遗传连锁。基因/核酸序列、或FATB多肽自身，可用于定义分子标记。然后，该DNA或蛋白质标记可用于育种程序中选择如上文定义的在本发明方法中具有增加的种子产量相关性状的植物。
编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的基因/核酸序列的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致增加的产量的序列的优异等位变体。选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以开发具有所希望表型的品系。编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码GS1的核酸探测。所得的条带图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码GS1多肽、或PEAMT多肽、或FATB多肽、或LFY-样多肽的核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用以上概述的方法学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。
所述核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，所述核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic acid sequence Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic acid sequence Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差异。但是，这通常对作图法而言不是必需的。
如前文所述，本发明的方法产生了具有增强的产量相关性状或增强的种子产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
项目
1、相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码藻类类型细胞质谷氨酰胺合酶(GSl)多肽的核酸的表达，其中所述藻类类型GS1多肽包含Gln-synt_C结构域(Pfam登录号PF00120)和Gln-synt_N结构域(Pfam登录号PF03951)。
2、项1的方法，其中所述GS1多肽包括一个或多个下列基序：
(a)基序1，SEQ ID NO：3；
(b)基序2，SEQ ID NO：4；
(c)基序3，SEQ ID NO：5；
其中基序最多允许2个错配。
3、项1或2的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码藻类类型GS1多肽的核酸来实现。
4、项1-3的任一项的方法，其中所述编码GS1多肽的核酸编码表A1中列出的任一种蛋白质，或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
5、项1-4的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6、项1-5的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选的增加的生物量和/或增加的种子产量。
7、项1-6的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在养分缺乏的条件下获得的。
8、项3-7的任一项的方法，其中所述核酸与枝条特异性启动子，优选的与原叶绿素酸酯还原酶启动子，最优选的与来自稻的原叶绿素酸酯还原酶启动子有效连接。
9、项1-8的任一项的方法，其中所述编码GS1多肽的核酸是植物来源的，优选的来自藻类，还优选的来自绿藻纲(Chlorophyceae)，更优选的来自衣藻科(Chlamydomonadaceae)，最优选的来自雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
10、通过项1-9的任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码GS1多肽的重组核酸。
11、构建体，包含：
(i)编码如项1或2定义的GS1多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
12、项11的构建体，其中一种所述控制序列是枝条特异性启动子，优选的是原叶绿素酸酯还原酶启动子，最优选的是来自稻的原叶绿素酸酯还原酶启动子。
13、项11或12的构建体在方法中的用途，所述方法用于产生相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物。
14、用项11或12的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
15、用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量，包括：
(i)在植物中导入和表达编码如项1或2定义的GS1多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
16、相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物是由编码如项1或2定义的GS1多肽的核酸的受调节的表达产生的。
17、项10、14或16的转基因植物，或源自它们的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
18、项17的植物的可收获的部分，其中所述可收获的部分优选的是枝条生物量和/或种子。
19、源自项17的植物和/或项18的植物的可收获的部分的产物。
20、编码GS1多肽的核酸在相对于对照植物，在植物中增加产量，特别是增加种子产量和/或枝条生物量中的用途。
21、分离的多肽，选自：
(i)SEQ ID NO：53或54表示的氨基酸序列；
(ii)以增加的优选顺序，与SEQ ID NO：53或54表示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列；
(iii)上述(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
22、编码如项22定义的多肽的分离的核酸，或与其杂交的核酸。
23、相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码PEAMT多肽或其同源物的核酸的表达，所述PEAMT多肽或其同源物包含以增加的优选顺序与表C2所述的任一蛋白质结构域具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的蛋白质结构域。
24、项23的方法，其中核酸编码PEAMT多肽或其同源物，所述PEAMT多肽或其同源物以增加的优选顺序，与SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列具有至少50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性。
25、项23或24的方法，其中所述编码PEAMT多肽或其同源物的核酸是SEQ ID NO：57表示的核酸的一部分，或者编码SEQ ID NO：58的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分，其中所述部分的长度是至少150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810个连续核苷酸，所述连续核苷酸是SEQ ID NO：57的连续核苷酸，或者是编码SEQ ID NO：58的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续核苷酸。
26、项23-25的任一项的方法，其中编码PEAMT多肽或其同源物的核酸能够与SEQ ID NO：1表示的核酸杂交，或者能够与编码SEQ IDNO：58的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
27、项23-26的任一项的方法，其中所述编码PEAMT多肽或其同源物的核酸编码由SEQ ID NO：58表示的序列的直向同源物或旁系同源物。
28、项23-27的任一项的方法，其中所述受调节的表达是通过在植物中导入和表达编码PEAMT多肽或其同源物的核酸来实现的。
29、项23-28的任一项的方法，其中所述相对于对照植物增强的产量相关的性状是在非胁迫条件下获得的，所述性状包括增加的产量，优选的增加的生物量和/或增加的种子产量。
30、项23-29的任一项的方法，其中所述相对于对照植物增强的产量相关的性状是在干旱胁迫的条件下获得的，所述性状包括增加的产量，优选的增加的生物量和/或增加的种子产量。
31、项28、29或30的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选的与GOS2启动子，最优选的与来自稻的GOS2启动子有效连接。
32、项23-31的任一项的方法，其中所述编码PEAMT多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自十字花科(Brassicaceae)，更优选的来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
33、通过前述任一项的项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码PEAMT多肽或其同源物的重组核酸。
34、分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：57至少98％的序列同一性。
35、分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：58至少99％的序列同一性。
36、构建体，其包含：
(i)编码如项23-27和项34和35中任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
37、项36的构建体，其中一种所述控制序列是组成型启动子，优选的是GOS2启动子，最优选的是来自稻的GOS2启动子。
38、项36或37的构建体在方法中的用途，所述方法用于产生相对于对照植物，具有改变的产量相关性状的植物。
39、用项36或37的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
40、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其包括：
(i)在植物中导入和表达编码如项23-27和项34和35的任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
41、相对于对照植物，具有增强的产量相关性状的转基因植物，其获得自编码如项23-27和项34和35的任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸的受调节的表达。
42、项33、39或41的转基因植物，或源自它们的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
43、源自项42的植物的产物。
44、编码PEAMT多肽或其同源物的核酸在相对于对照植物，改变植物的产量相关性状中的用途。
45、相对于对照植物，在植物中增加与种子产量相关性状的方法，包括在植物中增加编码脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)多肽的核酸序列的表达，以及任选的选择具有增加的种子产量相关性状的植物，所述FATB多肽包含(i)质体转运肽；(ii)至少一个跨膜螺旋；(iii)和具有InterPro登录号IPR002864的酰基-ACP硫酯酶家族结构域。
46、项45的方法，其中所述FATB多肽具有(i)质体转运肽；(ii)以增加的优选顺序与SEQ ID NO：141表示的跨膜螺旋具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性；且以增加的优选顺序与SEQ ID NO：140表示的酰基-ACP硫酯酶家族结构域具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
47、项45或46的方法，其中所述FATB多肽以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：93表示的FATB多肽，或具有与本文表A3中给出的任何多肽序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
48、项45-47的任一项的方法，其中所述FATB多肽是任意这样的多肽序列，当所述多肽序列在构建FAT进化系统树例如图10所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：93表示的多肽序列的FATB多肽进化枝聚类，而不与FATA多肽进化枝聚类。
49、项45-48的任一项的方法，其中所述FATB多肽是具有酶活性的多肽，所述酶活性在于优先从饱和的酰基-ACP(具有在8至18个碳之间变化的链长度)上水解酰基-ACP硫酯键，释放游离的脂肪酸和酰基载体蛋白(ACP)。
50、项45-49的任一项的方法，其中所述编码FATB多肽的核酸序列是由表A3中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分所表示的，或者是能够与A3中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分杂交的序列。
51、根据任一项前述项的方法，其中所述核酸序列编码由表A3中给出的任何多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
52、根据任一项前述项的方法，其中所述增加的表达通过任意一种或多种：T-DNA活化标签、TILLING或同源重组来实现。
53、根据任一项前述项的方法，其中所述增加的表达通过在植物中导入和表达编码FATB多肽的核酸序列来实现。
54、根据任一项前述项的方法，其中所述增加的产量相关性状是一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
55、根据任一项前述项的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接。
56、项55的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选的是稻GOS2启动子，更优选的是SEQ ID NO：144表示的GOS2启动子。
57、根据任一项前述项的方法，其中所述编码FATB多肽的核酸序列是来自植物，还优选的来自双子叶植物，更优选的来自十字花科(Brassicaceae)，最优选的核酸序列来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
58、通过前述任一项的项的方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或细胞包含与组成型启动子有效连接的编码FATB多肽的分离的核酸转基因。
59、分离的核酸序列，包含：
(i)由SEQ ID NO：130表示的核酸序列；
(ii)由SEQ ID NO：130表示的核酸序列的互补序列；
(iii)编码FATB多肽的核酸序列，所述多肽以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：131表示的多肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
60、分离的多肽，包含：
(i)由SEQ ID NO：131表示的多肽序列；
(ii)以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：131表示的多肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽序列；
(iii)由上述(i)或(ii)给出的任意多肽序列的衍生物。
61、构建体，包含：
(a)编码如项45-51任一项定义的FATB多肽的核酸序列；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
(c)转录终止序列。
62、项61的构建体，其中所述控制序列是组成型启动子。
63、项60的构建体，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选的是稻的GOS2启动子，更优选的是SEQ ID NO：144表示的GOS2启动子。
64、根据项61-63的任一项的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的植物，其中所述增加的种子产量相关性状是一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
65、用项61-63的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
66、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的种子产量相关性状，包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达编码如项45-51的任一项定义的FABT多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。
67、相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的转基因植物，或者源自所述转基因植物的转基因植物细胞或转基因植物部分，所述转基因植物获得自与组成型启动子有效连接的编码如项45-51的任一项定义的FATB多肽的核酸序列的增加的表达。
68、项58、65或67的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱和燕麦。
69、项68的植物的包含编码FATB多肽的分离核酸序列的可收获部分，其中所述可收获的部分优选的是种子。
70、源自项68的植物和/或源自项69的植物的可收获部分的产物。
71、编码如项45-51的任一项定义的FATB多肽的核酸序列在增加种子产量相关性状中的用途，所述性状包括一种或多种的增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
72、用于相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码LFY样多肽的核酸的表达，其中所述LFY样多肽包含FLO-LFY结构域。
73、项72的方法，其中所述LFY样多肽具有与SEQ ID NO：146至少50％序列同一性。
74、项72或73的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入和表达编码LFY样多肽的核酸来实现。
75、项72-74的任一项的方法，其中所述编码LFY样多肽的核酸编码表A4中列出的任一蛋白质，或是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
76、项72-75的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A4中给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
77、项72-76的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选的增加的种子产量。
78、项72-77的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
79、项74-78的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选的与GOS2启动子，最优选的与来自稻的GOS2启动子有效连接。
80、项72-79的任一项的方法，其中所述编码LFY样多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自十字花科(Brassicaceae)，更优选的来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
81、通过前述任一项的项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码LFY样多肽的重组核酸。
82、构建体，包含：
(i)编码如项72或73定义的LFY样多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
83、项82的构建体，其中一种所述控制序列是组成型启动子，优选的是GOS2启动子，最优选的是来自稻的GOS2启动子。
84、项82或83的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物。
85、用项82或83的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
86、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量，包括：
(i)在植物中导入和表达编码如项72或73定义的LFY样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
87、相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物，或者源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物获得自编码如项72或73定义的LFY样多肽的核酸的受调节的表达。
88、项81、85或87的转基因植物，或源自它们的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
89、项88的植物的可收获部分，其中所述可收获的部分优选的是种子。
90、源自项88的植物和/或源自项89的植物的可收获部分的产物。
91、编码LFY样多肽的核酸在相对于对照植物，在植物中增加产量，特别是增加种子产量中的用途。
附图说明
现参照下列附图说明本发明，其中：
图1表示SEQ ID NO：2的结构域结构，其具有用粗体下划线显示的Gln-synt_N结构域(PF03951)，用斜体下划线显示的Gln-synt_C结构域(PF00120)，和用虚线显示的保守基序1-3。
图2表示藻类GS1蛋白序列的多重比对。
图3显示了GS1蛋白的进化系统树。a栏给出了GS1(胞质)和GS2(叶绿体)蛋白质在环状的系统发生图中的概况。b栏显示了藻类组中成组的序列，有一些细胞溶胶和细胞质外组的序列。b栏的树中的数目对应下列SEQ ID NOs：(1)SEQ ID NO：21、(2)SEQ ID NO：26、(3)SEQ ID NO：27、(4)SEQ ID NO：10、(5)SEQ ID NO：11、(6)SEQ ID NO：15、(7)SEQ ID NO：24、(8)SEQ ID NO：25、(9)SEQ ID NO：12、(10)SEQ ID NO：2、(11)SEQ ID NO：16、(12)SEQ ID NO：13、(13)SEQ ID NO：28、(14)SEQ ID NO：14、(15)SEQ ID NO：9、(16)SEQ ID NO：17、(17)SEQ ID NO：19、(18)SEQ ID NO：22、(19)SEQ ID NO：30、(20)SEQ ID NO：18、(21)SEQ ID NO：20、(22)SEQ ID NO：23、(23)SEQ ID NO：29。
图4表示在稻原叶绿素酸酯还原酶启动子(pPCR)的控制下，用于增加GS1编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图5表示表A2的PEAMT多肽的氨基酸序列的多重比对。
图6表示表A2的PEAMT多肽的氨基酸序列的进化系统树。
图7表示在稻GOS2启动子(pGOS2)的控制下，用于增加Arath_PEAMT_1编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图8示意的表示了多个脂肪酸(甘油三酯；TAG，通过Kennedy通路合成)合成的常规通路，和种子贮藏脂类生产通常涉及的步骤。用箭头显示了用于实施本发明方法的FATB多肽。根据Marillia等人，(2000)Developments in Plant Genetics and Breeding。第5卷，2000，第182-188页。
图9表示如SEQ ID NO：93表示的FATB多肽的图片(cartoon)，包括以下特征：(i)质体转运肽；(ii)至少一种跨膜螺旋；(iii)以及酰基-ACP硫酯酶家族结构域，其具有InterPro登录号IPR002864。
图10显示来自不同生物来源的FAT多肽的进化系统树，根据Mayer等人，(2007)BMC Plant Biology2007。FATA多肽和FATBA多肽属于非常明确的不同进化枝。已圈出了用于实施本发明方法的多肽的FATB进化枝，箭头指向如SEQ ID NO：93表示的拟南芥FATB多肽。
图11表示用于SEQ ID NO：93的TMpred算法的图形输出。根据使用SEQ ID NO：93的算法预测，在转运肽(位于多肽的N端)和具有InterPro登录号IPR002864的酰基-ACP硫酯酶家族结构域(位于多肽的C端)之间，预测出跨膜螺旋。
图12显示了在来自稻的组成型启动子的控制下，用于增加编码FATB多肽的核酸序列在稻植物中的表达的二元载体。
图13显示了表A3的FATB多肽的AlignX(来自Vector NTI10.3，Invitrogen Corporation)多重序列比对。在SEQ ID NO：93中，已框出了用TargetP预测的N端质体转运肽(Arath_FATB)，并在用于实施本发明方法的FATB多肽中框出了用TMpred预测的预测的跨膜螺旋(仅FATB多肽典型)。在共有序列下用X标记了酰基-ACP硫酯酶家族的保守IPR002864。在比对中框出了三个高度保守的催化残基。
图14表示SEQ ID NO：146的LFY-样蛋白质序列，粗体显示了FLO_LFY结构域。
图15表示多个LFY-样蛋白的ClustalW2.0.3多重比对。星号表示绝对保守的氨基酸，冒号显示了高度保守的氨基酸残基，圆点指示了保守的氨基酸。
图16显示了用相邻连接算法和1000次bootstrap重复，从图15的比对创造的进化系统树。显示了bootstrap值。
图17表示在稻GOS2启动子(pGOS2)的控制下，用于增加LFY-样编码核酸在稻中的表达的二元载体。
实施例
本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是示意性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定在本发明中有用的序列
1.1谷氨酰胺合酶(GS1)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列启动。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更少的严格匹配。以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
表A1提供与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A1：藻类类型GS1多肽的实例
Figure BDA0000461644550001021
Figure BDA0000461644550001031
在一些情形中，相关序列已经被研究机构暂时汇集和公开，例如The Institute for Genomic Research(TIGR)。真核基因直向同源物(TheEukaryotic Gene Orthologs(EGO))数据库已经用来鉴别此类相关的序列，这是通过关键词搜索或者通过使用目的核酸或多肽序列的BLAST算法。优选地，藻类类型GS1多肽是藻类来源的(例如SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：9至16所示例的蛋白质)。
1.2磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列启动。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，调整默认参数以修改搜索的严格性，例如，增加E-值的界点(cut-off)阈值以显示更少的严格匹配。以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
表A2提供与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列及其编码多肽的名单。
表A2：PEAMT多肽的实例
Figure BDA0000461644550001041
1.3.脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸序列编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列启动。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸序列(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更少的严格匹配。以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
表A3提供与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A3：FATB多肽序列的实例，以及编码核酸序列
Figure BDA0000461644550001051
Figure BDA0000461644550001061
在一些情形中，相关序列已经被研究机构暂时汇集和公开，例如The Institute for Genomic Research(TIGR，以TA开始)。真核基因直向同源物(The Eukaryotic Gene Orthologs(EGO))数据库已经用来鉴别此类相关的序列，这是通过关键词搜索或者通过使用目的核酸序列或多肽序列的BLAST算法。在其他情形中，已经对特定生物产生了专门的核酸序列数据库，例如Joint Genome Institute。
1.4.Leafy-样(LFY-样)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列启动。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更少的严格匹配。以这种方式，可以鉴定几乎完美的短匹配。
表A4提供与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A4：LFY-样多肽的实例
Figure BDA0000461644550001081
Figure BDA0000461644550001091
在一些情形中，相关序列已经被研究机构暂时汇集和公开，例如The Institute for Genomic Research(TIGR)。真核基因直向同源物(TheEukaryotic Gene Orthologs(EGO))数据库已经用来鉴别此类相关的序列，这是通过关键词搜索或者通过使用目的核酸或多肽序列的BLAST算法。
实施例2：在本发明中有用的序列比对
2.1谷氨酰胺合酶(GS1)
多肽序列的比对使用累进比对的ClustalW2算法实施(Larkin等人，Bioinformatics23，2947-2948，2007)。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分0.2并且所选的权重矩阵是Gonnet(若比对多肽)。可能进行少许手工编辑以进一步优化该比对。GS1多肽之间的序列保守基本上在整个序列中，并且对应于这样的事实，即Gln-synt_C结构域和Gln-synt_N结构域大范围的跨越完整蛋白质序列。在图2中比对GS1多肽。
使用大量的植物谷氨酰胺合酶蛋白质序列(栏a)从比对中构建GS1多肽的进化系统树(图3)。从该树中，清楚地看出与其他植物来源的谷氨酰胺合酶蛋白质相比，藻类谷氨酰胺合酶蛋白质形成不同组(藻类类型进化枝)。栏b显示谷氨酰胺合酶蛋白质的相同藻类类型进化枝，但是具有有限集合的组外蛋白质。
使用MUSCLE(Edgar(2004)，Nucleic Acids Research32(5)：1792-97)比对栏a中显示的蛋白质。使用QuickTree(Howe等人(2002)，Bioinformatics18(11)：1546-7)计算邻接树。针对100bootstrap重复指出主要分支的支持。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMCBioinformatics8(1)：460)绘制环形系统发生图。该树清楚地显示藻类GS1蛋白质形成不同的组。使用ClustalW2(蛋白质权重矩阵：Gonnet系列，空位开口罚分10，空位延伸罚分0.2)比对栏b中显示的序列，使用具有1000bootstrap重复(repetition)的邻接算法计算树。使用Dendroscope用于绘制环形系统发生图。
2.2.磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
多肽序列的比对使用累进比对Clustal w算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003)，NucleicAcids Res31：3497-3500)实施。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分0.1并且所选的权重矩阵是Blosum62(若比对多肽)。PEAMT多肽之间的序列保守基本上在多肽的C端部分，而N端结构域通常在序列长度和组成上更加多变。PEAMT多肽在图5中比对。在PEAMT蛋白质中用＊或：标注的位置的氨基酸残基是高度保守的。
使用邻接聚类算法(如Clustal w程序中提供)构建PEAMT多肽的进化系统树(图6)。
2.3.脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
使用AlignX算法(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen Corporation)实施表A中所有FATB多肽序列的多重序列比对。比对结果显示在本申请的图10中。通过TargetP预测的N端质体转运肽(本文实施例5)已经在SEQ ID NO：93(Arath_FATB)中被框出，并且通过TMpred(本文实施例5)所预测的预测的跨膜螺旋(仅FATB多肽的典型)已经在用于实施本发明方法的FATB多肽中被框出。在共有序列下用X标出酰基ACP硫酯酶家族的保守IPR002864。在比对中已经框出了3个高度保守的催化残基。
2.4.Leafy-样(LFY-样)
多肽序列的比对使用Clustal w算法2.0.3(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res31：3497-3500)用标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet；空位开口罚分10，空位延伸罚分：0.2)来实施。LFY样多肽之间的序列保守基本上在多肽的整个长度上，而N端和C端通常在序列长度和组成上更加多变。LFY样多肽在图15中比对。
使用如ClustalW2.0.3所提供的，具1000bootstrap重复的邻接聚类算法构建LFY-样多肽的进化系统树(图16)。
实施例3：在本发明中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数的计算
3.1谷氨酰胺合酶(GS1)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵内。在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B1中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线以上以黑体给出了同一性百分数，在对角线以下(正常字体)给出了相似性百分数。
用于实施本发明方法的藻类GS1多肽序列之间的同一性百分数，与SEQ ID NO：2(雷氏衣藻_133971)相比可以低至23％的氨基酸同一性。应当注意到来自高等植物的藻类类型GS1多肽(例如SEQ IDNO：21、24、25、26、27和28)具有至少41％的序列同一性，当用如上文所述的MatGAT分析时。
表B1：在GS1多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1.雷氏衣藻_129468 43.7 95.3 20.5 86.6 43.9 45.6 41.7 40.0
2.雷氏衣藻_133971 62.3 42.1 23.0 43.7 92.1 52.1 68.3 48.5
3.雷氏衣藻_136895 95.8 61.3 20.1 86.3 42.9 46.2 42.2 39.8
4.雷氏衣藻_147468 31.5 36.6 31.2 21.0 23.0 20.7 26.1 22.1
5.V.carterii_103492 92.4 63.9 91.3 33.6 43.4 46.3 42.3 41.5
6.V.carterii_77041 62.3 95.3 61.3 37.1 63.9 52.2 70.4 49.0
7.A.anophagefferens_20700 57.4 64.9 58.4 30.8 59.9 65.4 49.6 52.3
8.Helicosporidum_DQ323125 60.1 79.8 59.6 37.1 60.1 81.1 62.7 46.3
9.T.pseudonana_26051 56.0 60.1 55.0 34.8 57.2 61.1 63.5 59.9
3.2.磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵内。在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B2中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线以下以黑体给出了同一性百分数，在对角线以上(正常字体)给出了相似性百分数。
用于实施本发明方法的PEAMT多肽序列之间的同一性百分数，与SEQ ID NO：58相比可以低至60.2％的氨基酸同一性。
3.3.脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵内。在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B3中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果(排除部分多肽序列)。
用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的同一性百分数，与SEQID NO：93相比可以低至53％的氨基酸同一性。
Figure BDA0000461644550001161
3.4.Leafy-样(LFY-样)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵内。在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B4中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线以上给出了同一性百分数，在对角线以下给出了相似性百分数。
用于实施本发明方法的LFY-样多肽序列之间的同一性百分数，与SEQ ID NO：146相比可以低至50％的氨基酸同一性。
表B4：在LFY-样多肽序列的全长范围内的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1.Atleafy 99.1 98.8 90.4 90.8 87.8 94.9 85.8 86.0 87.5 79.8 88.8 85.0
2.Q1PDG5 99.1 99.8 89.5 89.9 86.9 94.0 85.1 85.1 86.6 78.7 87.8 84.1
3.Q1KLS1 99.1 99.8 89.3 89.6 86.6 93.5 84.8 84.9 86.4 78.7 87.6 83.9
4.Q6XPU8 94.1 93.2 93.2 87.1 83.2 87.8 82.3 87.9 83.9 76.1 84.2 81.0
5.Q6XPU7 93.9 93.8 93.8 90.6 88.3 87.9 81.8 82.9 83.4 78.1 84.7 86.5
6.Q3ZLS6 90.3 90.2 90.2 86.6 91.6 85.8 85.2 86.1 84.2 81.0 87.8 89.9
7.Q8LSH1 96.5 95.6 95.1 92.1 91.4 88.8 84.8 85.1 84.7 78.7 88.4 84.7
8.Q3LZW7 88.0 88.1 88.1 85.7 86.1 90.1 87.0 83.9 82.7 79.3 90.6 86.2
9.Q3ZLR9 90.8 90.7 90.7 91.8 89.2 90.7 88.4 88.9 83.5 78.9 87.2 84.3
10.BOFH_BRAOB 90.6 90.5 90.5 87.3 88.0 88.4 88.4 86.7 89.9 76.1 85.0 80.8
11.Q6XPU5 85.1 84.3 84.3 82.2 84.7 88.3 84.2 85.9 85.0 82.9 82.2 78.9
12.Q3ZK20 91.0 91.0 91.0 87.1 89.0 91.8 89.8 92.6 90.9 88.7 88.5 90.1
13.Q3ZK15 88.0 87.9 87.9 84.5 89.0 92.1 87.0 88.8 88.7 85.3 87.3 92.7
14.genpept7227884 78.8 79.5 79.3 76.3 76.0 77.4 77.4 76.2 78.4 77.3 76.7 77.2 74.0
15.genpept123096 73.8 74.5 74.3 73.5 74.6 77.4 74.4 76.7 75.9 74.0 77.8 78.4 75.0
16.genpept72278g3 77.8 78.6 78.3 76.1 76.7 77.2 76.3 76.3 78.2 78.6 75.3 78.0 74.3
17.genpept7227894 80.2 81.0 80.7 77.2 77.2 77.4 77.2 75.2 77.6 79.1 74.8 77.6 74.5
18.genpept86261940 62.5 61.9 61.7 62.2 63.8 65.5 61.9 62.8 65.4 63.4 65.8 65.2 64.9
19.genpept86261942 63.2 61.9 61.7 62.9 64.0 64.0 62.1 64.3 65.1 63.4 65.1 65.7 63.9
20.genpept11935156 63.7 64.0 64.0 63.6 62.8 63.8 62.8 64.5 67.1 64.6 63.3 66.3 62.3
21.genpept2274790 63.9 64.5 64.5 63.6 64.5 65.5 62.1 66.7 67.3 63.1 66.8 64.9 63.6
22.genpept28974117 65.8 66.4 66.4 64.1 65.0 64.3 63.7 64.5 66.3 63.6 64.6 64.9 65.1
23.genpept28974119 62.5 63.1 63.8 62.2 62.4 65.0 61.9 65.5 65.4 62.9 66.2 64.2 63.9
24.genpept27544560 62.9 62.9 62.7 61.6 62.9 61.6 60.7 61.0 61.8 63.2 58.8 60.7 60.1
25.genpept7658233 77.6 78.3 78.1 76.8 76.5 77.4 76.0 77.4 79.1 78.3 77.2 77.9 75.7
26.genpept66864715 73.6 74.3 74.0 73.2 74.6 76.7 71.9 73.7 76.4 74.2 76.1 75.9 73.8
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1.Atleafy 65.5 65.0 65.8 67.3 50.3 50.7 51.3 51.5 51.9 51.3 49.5 64.8 65.8
2.Q1PDG5 66.1 65.6 66.4 67.9 49.8 49.5 51.7 52.5 52.4 52.0 49.9 65.4 66.4
3.Q1KLS1 65.8 65.3 66.2 67.7 49.5 49.3 51.7 52.5 52.4 51.5 49.7 65.1 66.2
4.Q6XPU8 63.9 63.7 64.0 64.7 50.2 50.1 51.4 51.2 50.5 51.2 49.5 63.9 63.6
5.Q6XPU7 62.8 65.0 64.5 64.3 50.6 50.5 50.8 52.0 50.0 50.2 50.0 63.5 66.7
6.Q3ZLS6 64.5 66.0 66.0 65.0 51.8 52.2 51.4 52.4 52.6 53.2 49.0 65.4 67.0
7.Q8LSH1 65.8 64.1 64.7 65.7 50.7 51.2 50.5 50.8 51.5 50.9 48.6 64.2 64.4
8.Q3LZW7 63.7 64.0 64.5 64.3 50.1 50.4 50.2 52.4 52.0 52.5 49.5 64.8 64.0
9.Q3ZLR9 65.4 64.6 64.6 64.6 51.4 51.9 512 52.6 53.4 51.8 49.8 65.3 66.2
10.BOFH_BRAOB 64.1 64.1 64.3 64.8 51.3 51.2 51.9 51.6 50.9 52.0 49.3 64.1 64.4
11.Q6XPU5 63.1 64.6 64.1 64.3 52.8 52.4 51.8 53.1 52.4 53.1 47.6 65.4 65.6
12.Q3ZK20 65.0 65.5 64.5 64.5 51.2 51.6 50.5 51.8 51.6 51.2 49.5 65.6 65.7
13.Q3ZK15 62.1 63.2 63.2 61.7 50.7 50.0 48.2 49.4 50.5 49.5 48.3 63.6 64.4
14.genpept7227884 76.2 89.9 89.3 55.4 55.4 55.0 55.5 55.7 55.2 49.5 89.3 72.6
15.genpept123096 84.7 76.2 76.3 54.5 55.4 55.4 56.0 54.2 56.3 50.2 76.0 73.8
16.genpept7227893 93.9 84.5 96.4 55.7 56.1 55.1 56.9 54.6 54.7 50.5 89.1 73.2
17.genpept7227894 93.3 83.4 97.6 55.9 55.2 54.1 56.5 54.2 54.4 50.3 88.0 72.4
18.genpept86261940 68.4 66.2 67.1 67.5 96.7 87.3 86.4 80.0 78.7 48.9 56.5 53.4
19.genpept86261942 68.0 66.9 67.6 67.1 98.0 88.1 85.9 79.9 78.2 48.6 55.0 52.9
20.genpept11935156 69.2 67.5 67.8 66.6 91.8 92.0 83.1 76.4 74.6 47.1 55.8 52.3
21.genpept2274790 69.2 67.7 68.8 68.0 91.3 90.6 88.8 82.5 80.4 50.0 56.8 54.9
22.genpept28974117 69.2 65.4 66.8 66.3 87.0 86.5 85.3 89.6 91.2 48.2 55.5 52.5
23.genpept28974119 68.4 68.4 67.6 66.8 85.7 85.7 84.0 87.5 94.4 48.5 55.6 54.2
24.genpept27544560 62.5 63.6 64.0 63.6 58.8 60.3 58.8 61.2 58.8 59.2 50.1 50.5
25.genpept7658233 93.9 84.5 93.7 93.3 67.7 67.2 68.4 69.4 68.2 69.2 62.9 73.4
26.genpept66864715 80.1 81.8 80.1 79.3 65.6 65.8 65.8 67.9 63.9 67.0 62.5 80.1
实施例4：鉴定在本发明中有用的多肽序列中所包含的结构域
4.1谷氨酰胺合酶(GS1)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resousce ofProtein Families，Domains and Sites)(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
如SEQ ID NO：2所示的多肽序列的InterPro扫描的结果示于表C1中。
表C1：如SEQ ID NO：2所示的多肽序列的InterPro扫描的结果(主要登录号)。
Figure BDA0000461644550001201
4.2.磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resousce ofProtein Families，Domains and Sites)(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
如SEQ ID NO：58所示的多肽序列的InterPro扫描的结果示于表C2中。
表C2：如SEQ ID NO：58所示的多肽序列的InterPro扫描的结果(主要登录号)。
Figure BDA0000461644550001211
4.3脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resousce ofProtein Families，Domains and Sites)(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、Panther、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
如SEQ ID NO：93所示的多肽序列的InterPro扫描的结果示于表C3中。
表C3：如SEQ ID NO：93所示的多肽序列的InterPro扫描的结果。
Figure BDA0000461644550001221
4.4.Leafy-样(LFY-样)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resousce ofProtein Families，Domains and Sites)(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
如SEQ ID NO：146所示的多肽序列的InterPro扫描的结果示于表C4中。
表C4：如SEQ ID NO：146所示的多肽序列的InterPro扫描的结果(主要登录号)。
Figure BDA0000461644550001231
实施例5：在本发明中有用的多肽序列的拓扑结构预测
5.1谷氨酰胺合酶(GS1)
TargetP1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。但是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
用TargetP1.1分析SEQ ID NO：2。选择“植物”生物组别，未定义界点，以及要求转运肽的预测的长度。如SEQ ID NO：2所示的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或核，无转运肽被预测(预测的定位：其它：可能性0.737，可靠性类别3)。来自其他算法的预测给出了类似的结果：
Psort：过氧化物酶体0.503；细胞质0.450
PA-SUB：细胞质，确定性(certainity)100％
PTS1：未靶向过氧化物酶体
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
5.2.脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
TargetP1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。但是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、界点集合(无、预定义的界点集合或用户指定的界点集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
TargetP v1.1预测结果：
查询序列数：1
包括的切割位点预测。
使用PLANT网络。
Figure BDA0000461644550001251
如SEQ ID NO：93所示的多肽序列的亚细胞定位是叶绿体，转运肽的预测长度是49个氨基酸，起始自N-端(未如亚细胞定位本身的预测那么可靠，可能在长度上有少数氨基酸的变化)
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
跨膜结构域通常是指跨膜蛋白质的单个跨膜α螺旋。其被称为“结构域”是因为膜中的α-螺旋可以在蛋白质的剩余部分上独立地折叠。更广泛地，跨膜结构域是在膜中热力学稳定的任何三维蛋白质结果。这可以是单个α螺旋、一些跨膜α螺旋的稳定复合体、跨膜β桶、短杆菌肽A的β螺旋，或任何其它结构。
Tmpred程序预测跨膜区域和它们的方向。算法是基于Tmbase(天然存在的跨膜蛋白的数据库)的统计学分析。预测使用用于评分的一些权重矩阵的组合进行(K.Hofmann & W.Stoffel(1993)TMbase-Adatabase of membrane spanning proteins segments.Biol.Chem.Hoppe-Seyler374,166)。Tmpred是欧洲分子生物学网络(EMBnet.ch)服务的一部分并且在瑞士生物信息机构的服务器上维持。
TMpred输出(对于图像输出，参见图11)：
Figure BDA0000461644550001261
5.3.Leafy-样(LFY-样)
TargetP1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。但是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、界点集合(无、预定义的界点集合或用户指定的界点集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
在表D中呈现如SEQ ID NO：146所表示的多肽序列的TargetP1.1分析的结果。选择“植物”生物组别，未定义界点，并且对转运肽的预测长度提出要求。如SEQ ID NO：146所代表的多肽序列的亚细胞定位可以是线粒体的，尽管该预测的可靠性低。
表D：如SEQ ID NO：146所示的Atleafy的TargetP1.1分析，其中Len是蛋白质长度，cTP：叶绿体转运肽的概率，mTP：线粒体转运肽的概率，SP：分泌通路信号肽的概率，其它：其它亚细胞靶向的概率，Loc：预测的定位，RC：可靠性级别，TPlen：预测的转运肽长度：
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
实施例6：与本发明中有用的多肽序列相关的测定
6.1谷氨酰胺合酶(GS1)
已被Sigma-Aldrich商业化的用于谷氨酰胺合酶的测定(自Kingdon，H.S.，Hubbard，J.S.，和Stadtman，E.R.(1968)Biochemistry7，2136-2142改良)。
原理：
使用在合成谷氨酰胺时通过GS1产生的ADP，与磷酸(烯醇)丙酮酸和丙酮酸激酶一起产生丙酮酸和ATP。通过L-乳酸脱氢酶将丙酮酸转化为L-乳酸，其中将β-NADH氧化为β-NAD。NADH氧化后是在37℃在340nm分光光度分析，光路为1cm，在pH7.1的缓冲液中。
试剂：
A.100mM咪唑HCl缓冲液，pH7.1，在37℃
(在去离子水中制备200ml，其中使用咪唑，Sigma Prod.No.I-0250。在37℃用1M HCl调节至pH7.1)
B.3M谷氨酸钠溶液(Glu)
(在去离子水中制备10ml，其中使用L-谷氨酸，单钠盐，Sigma Prod.No.G-1626.)
C.250mM腺苷5′-三磷酸溶液(ATP)
(在去离子水中制备5ml，其中使用腺苷5′-三磷酸溶液，二钠盐，Sigma Prod.No.A-5394.新鲜制备。)
D.33mM磷酸烯醇丙酮酸溶液(PEP)
(在去离子水中制备10ml，其中使用磷酸烯醇丙酮酸溶液，三钠盐，水合物，Sigma Prod.No.P-7002.新鲜制备。)
E.900mM氯化镁溶液(MgCl2)
(在去离子水中制备10ml，其中使用氯化镁，六水合物，Sigma Prod.No.M-0250.)
F.1M氯化钾溶液(KCl)
(在去离子水中制备5ml，其中使用氯化钾，Sigma Prod.No.P-4504。)
G.1.2M氯化铵溶液(NH4Cl)
(在去离子水中制备5ml，其中使用氯化铵，Sigma Prod.No.A-4514。)
H.12.8mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，还原型(β-NADH)
(在适当体积的试剂A中溶解一个10mg小瓶的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型，二钠盐，Sigma Stock No.340-110内容物。新鲜制备。)
I.PK/LDH酶溶液(PK/LDH)
(使用在50％甘油中的PK/LDH酶溶液，Sigma Prod.No.P-0294；包含大约700单位/ml丙酮酸激酶和1,000单位/ml乳酸脱氢酶。L-乳酸脱氢酶单位定义：在pH7.5在37℃，1个单位每分钟将还原1.0μmol的丙酮酸至L-乳酸。丙酮酸激酶单位定义：在pH7.6在37℃，1个单位每分钟将1.0μmol磷酸(烯醇)丙酮酸转化为丙酮酸。)
J.谷氨酰胺合成酶溶液
(在使用前立即，制备在冷的去离子水中包含4-8个单位/ml的谷氨酰胺合成酶的溶液)。
程序：
通过将下列试剂移液(以毫升)到适当的容器中制备反应混合液：
通过搅拌混合并根据需要，在37℃用0.1N HCl或0.1N NaOH调节至pH7.1。
将下列试剂移液(以毫升)至适当的小杯中：
Figure BDA0000461644550001292
通过颠倒混合并平衡至37℃。监控A340nm直至恒定，使用适当的恒温分光光度计。然后添加：
试剂I(PK/LDH)  0.04  0.04
通过颠倒混合并平衡至37℃。监控A340nm直至恒定，使用适当的恒温分光光度计。然后添加：
去离子水          ------    0.10
试剂J(酶溶液)     0.10      ------
立即颠倒混合，并且记录大约10分钟的A340nm的减少。
对于测试和空白都使用最大线速度(linear rate)获得ΔA340nm/min。
计算：
3＝测定的总体积(以毫升)
15＝至15分钟的变换因数(单位定义)
6.22＝β-NADH在340nm的毫摩尔消光系数
0.1＝使用的酶的体积(以毫升)
单位定义：
1个单位将在15分钟内在pH7.1在37℃将1.0μmolL-谷氨酸转化为L-谷氨酰胺。
最终测定浓度：
在3.00ml反应混合物中，最终浓度是34.1mM咪唑，102mM谷氨酸钠，8.5mM腺苷5′-三磷酸，1.1mM磷酸烯醇丙酮酸，60mM氯化镁，18.9mM氯化钾，45mM氯化铵，0.25mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，28个单位丙酮酸激酶，40个单位L-乳酸脱氢酶和0.4-0.8个单位的谷氨酰胺合成酶。
6.2脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
用于实施本发明方法的多肽通常表现出硫酯酶酶促活性。存在许多测定来测量此类活性，例如，可以在从培养基摄入游离脂肪酸缺陷的大肠杆菌菌株中表达FATB多肽。因此，当FATB多肽在该系统中起作用时，硫酯酶反应的游离脂肪酸产物在培养基中聚集。通过测量培养基中的游离脂肪酸，可以鉴别多肽的酶促活性(Mayer & Shanklin(2005)JBiol Chem 280：3621)。如Voelker等人(1992；Science257：72-74)所述，也进行与FATB多肽酶活性相关的硫酯酶测定。
本领域的技术人员熟知测量FATB多肽酶活性的此类实验方法，所述活性包括如SEQ ID NO：93所示的FATB多肽的活性。
实施例7：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
7.1：谷氨酰胺合酶(GS1)
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的雷氏衣藻cDNA文库(在pCMV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm08458(SEQ IDNO：7；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggccgcgggatctgtt-3’和prm08459(SEQ ID NO：8，反义，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgctgctcctgcgcttacagaa-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”，pGS1。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于枝条特异性表达的稻原叶绿素酸酯还原酶启动子启动子(pPCR，SEQ ID NO：6)位于该Gateway盒上游。
在所述LR重组步骤后，所得表达载体pPCR::GS1(图3)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
7.2：磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是引物：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggagcattctagtgatttg-3’(SEQID NO：83；有义)和引物
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagagttttgggataaaaaca-3’(SEQ IDNO：84；反义，互补)，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”pArath_PEAMT_1。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000461644550001321
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：57的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：85)位于该Gateway盒上游。
在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::pArath_PEAMT_1(图7)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
7.3脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientifc Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
通过PCR使用用来自不同发育阶段的拟南芥属植物的RNA构建的cDNA文库作为模板来扩增如SEQ ID NO：93所示的编码FATB多肽序列的拟南芥核酸序列。包括用于Gateway重组的AttB位点的下列引物用于PCR扩增：
prm08145：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtggccacctctgc-3’(SEQ ID NO：142，有义)和prm08146：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttttcttacggtgcagttcc-3’(SEQ ID NO：143，反义，互补)。使用标准条件中的Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。也使用标准方法扩增和纯化期望长度的PCR片段(包括attB位点)。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000461644550001331
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：92的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：144)位于该Gateway盒上游。
在所述LR重组步骤后，用于组成型表达的所得表达载体pGOS2：：FATB(图12)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
7.4Leafy-样(LFY样)
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm4841(SEQ ID NO：147；有义，起始密码子为粗体字)：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggatcctgaaggtttcac-3’和prm4842(SEQ ID NO：148；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaccaaactagaaacgcaagt-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”pLFY-样。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000461644550001341
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：145的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：5)位于该Gateway盒上游。在可选的实施方案中，使用枝条特异性启动子(PCR，原叶绿素酸酯还原酶启动子，SEQ ID NO：150)。
在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2：：LFY-样(图16)或pPCR：：LFY-样根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
实施例8：植物转化
稻转化
使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。无菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15分钟。该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中孵育3日。共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。将这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且枝条在随后4至5周内发育。将枝条从愈伤组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将枝条从所述培养基转移至土壤。硬化的枝条在温室中于高湿度和短日照下培育。
对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移栽后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米(Zea mays)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。谷穗在授粉后大约11日(DAP)从玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。将源自每个胚的绿色枝条转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech14(6)：745-50描述的方法进行。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。在与农杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上体外培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至枝条发育。将源自每个胚的绿色枝条转移至生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5，164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年幼幼苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使辅助节发育。切下这些辅助节并与含有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养基。切下再生的枝条并置于枝条伸长培养基上。将长度不超过1cm的枝条置于生根培养基上直至根发育。将生根的枝条移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
油菜/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep17：183-188)进行转化。商业品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面消毒以便体外播种。从所述体外幼苗切下附带子叶的子叶叶柄外植体，并且通过将此叶柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至枝条再生。当枝条长度是5-10mm时，切下这些枝条并转移至枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的枝条转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。将生根的枝条(shoot)移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
苜蓿转化
使用(McKersie等，1999Plant Physiol119：839-847)的方法转化苜蓿((Medicago sativa))的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(AgricultureCanada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell TissueCulture4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot65：654-659)。叶柄外植体与含有所述表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑止农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在浓度减半的Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
棉花转化
使用根癌农杆菌根据US5,159,135中描述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中在20分钟的期间内表面灭菌，并且在具500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于萌发。将4-6日龄的幼苗的下胚轴移出，切割成0.5cm的片，放置在0.8％的琼脂上。使用农杆菌悬浮液(大约108个细胞每ml，自用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其具有Murashige和Skoog盐(具有B5维生素(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l2，4-D、0.1mg/l6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCL2)，并且具有50-100μg/ml的头孢噻肟和400-500μg/ml的羧苄西林以杀死剩余的细菌。在两个或三个月后(每4至6周继代培养)分离单个细胞系，然后将它们进一步培养在选择培养基上用于组织扩增(30℃，16小时光照期)。然后将转化的组织再培养在非选择性培养基中，经过2至3个月以产生体细胞胚。至少4mm长的健康样子的胚被转移至具有SH培养基的试管中，所述培养基在细的蛭石(vermiculite)中，补充有0.1mg/l的吲哚乙酸、6糠胺嘌呤和赤霉酸。将胚培养在30℃，光周期为16小时，并且将第2或3叶阶段的小植株转移到具有蛭石和养分的花盆中。将植物硬化并且随后移到温室中用于进一步培养。
实施例9：表型评价方法
9.1评价建立
产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。留下下述6个事件，其中所述事件的T1子代对所述转基因的存在/不存在以3：1比例分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达而选出大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下生长的植物按规定间隔浇水以确保水和养分是非限制性的且满足植物对于完成生长和发育的需要。
4个事件按照如对T2世代相同的评价方法进一步评估，不过每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
干旱筛选
来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。当SWC低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如对正常条件下生长详述那样记录生长和产量参数。
氮使用效率筛选
源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)含量降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花钵。其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。如对正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
植物在由椰子纤维和argex(3：1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养溶液。在这两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养溶液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。
9.2统计分析：F-检验
使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以增加结论的可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。通过比较针对卡方分布的似然比检验而获得P-值。
9.3测量的参数
生物量相关的参数测量
植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期萌发势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分的面积。早期萌发势通过计数来自地上植物部分的区别于背景的像素总数确定。该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。下述结果针对萌发后3周的植物。
种子相关的参数测量
将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。饱满壳使用吹气装置与空壳分开。弃去空壳并且再次计数剩余部分。饱满壳在分析天平上称重。饱满种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的饱满壳的数目来确定。种子总产量通过称量从一株植物收获的全部饱满壳而测量。每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的壳数目测量。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比率，乘以系数106。如本发明中定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
实施例10：转基因植物的表型评价结果
10.1谷氨酰胺合酶(GS1)
源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)含量降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花钵。其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。如对正常条件下的生长详述那样记录生长和产量参数。
在养分缺乏条件下的表达GS1核酸的转基因稻植物的评价结果显示在下表E1中。对于种子总产量、饱满种子数、饱满率、种子总数和收获指数而言观察到大于5％的增加。在后续实验中证实了这些增加。
表E1：
Figure BDA0000461644550001421
此外，对于生物量(4个里面有2个正品系，总共增加13％)和早期萌发势(4个里面3个正品系，总共增加28％)发现增加。
10.2磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)
在非胁迫条件下表达Arath_PEAMT_1核酸的转基因稻植物的评价结果显示如下。对于种子总产量、种子饱满率、每个圆锥花序的花数目和收获指数观察到至少5％的增加(表E2)。
表E2.在非胁迫条件下的表型评价结果
Figure BDA0000461644550001422
来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。当SWC低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如对正常条件下生长详述那样记录生长和产量参数。
在干旱胁迫条件下表达PEAMT的转基因稻植物的评价结果显示如下。对于种子总重量、饱满种子数、饱满率、收获指数和千粒重观察到增加(表E3)。对于地上部分面积(AreaMax；绿色生物量)、萌发势(早期萌发势)观察到至少5％的增加，对于千粒重观察到2.5％的增加。
表E3.在干旱筛选下的表型评价结果
10.3.脂肪酰酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶B(FATB)
T1和T2世代转基因稻植物的评价结果显示如下，所述植物表达编码如SEQ ID NO：93所示的FATB多肽的核酸序列，所述核酸序列在GOS2组成型启动子的控制下，所述植物生长在正常生长条件下。
相对于对应的失效合子(对照)，在转基因植物的早期萌发势、地上部分生物量、每株植物的种子总产量、种子总数、饱满种子数、种子饱满率和收获指数中，有显著增加，如表E4所示。
表E4：T1和T2世代转基因稻植物的评价结果，所述植物表达编码如SEQ ID NO：93所示的FATB多肽的核酸序列，所述核酸序列在用于组成型表达的GOS2启动子的控制下。
Figure BDA0000461644550001432
10.4.Leafy-样(LFY-样)
在非胁迫条件下的表达LFY-样核酸的转基因稻植物显示出增加的种子产量。表达在组成型启动子或枝条特异性启动子的控制下的Atleafy的植物给出了一种或多种下列参数的增加：饱满率、收获指数、千粒重、每个圆锥花序的花。
Figure IDA0000461644610000011
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Claims (67)

1.相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码PEAMT多肽或其同源物的核酸的表达，所述PEAMT多肽或其同源物包含以增加的优选顺序与表C2所述的任一蛋白质结构域具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的蛋白质结构域。
2.权利要求1的方法，其中核酸编码PEAMT多肽或其同源物，所述PEAMT多肽或其同源物以增加的优选顺序，与SEQ ID NO:58表示的氨基酸序列具有至少50%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的整体序列同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述编码PEAMT多肽或其同源物的核酸是SEQ ID NO:57表示的核酸的一部分，或者编码SEQ IDNO:58的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分，其中所述部分的长度是至少150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810个连续核苷酸，所述连续核苷酸是SEQID NO:57的连续核苷酸，或者是编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续核苷酸。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中编码PEAMT多肽或其同源物的核酸能够与SEQ ID NO:1表示的核酸杂交，或者能够与编码SEQ ID NO:58的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
5.权利要求1-4的任一权利要求的方法，其中所述编码PEAMT多肽或其同源物的核酸编码由SEQ ID NO:58表示的序列的直向同源物或旁系同源物。
6.权利要求1-5的任一项的方法，其中所述受调节的表达是通过在植物中导入和表达编码PEAMT多肽或其同源物的核酸来实现的。
7.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述相对于对照植物增强的产量相关的性状是在非胁迫条件下获得的，所述性状包括增加的产量，优选的增加的生物量和/或增加的种子产量。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中所述相对于对照植物增强的产量相关的性状是在干旱胁迫的条件下获得的，所述性状包括增加的产量，优选的增加的生物量和/或增加的种子产量。
9.权利要求6、7或8的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选的与GOS2启动子，最优选的与来自稻的GOS2启动子有效连接。
10.权利要求1-9的任一项的方法，其中所述编码PEAMT多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自十字花科（Brassicaceae），更优选的来自拟南芥属（Arabidopsis），最优选的来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）。
11.通过前述任一项的权利要求的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码PEAMT多肽或其同源物的重组核酸。
12.构建体，其包含：
（i）编码如权利要求1-5中任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸；
（ii）能够驱动（a）的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
（iii）转录终止序列。
13.权利要求12的构建体，其中一种所述控制序列是组成型启动子，优选的是GOS2启动子，最优选的是来自稻的GOS2启动子。
14.权利要求12或13的构建体在方法中的用途，所述方法用于产生相对于对照植物，具有改变的产量相关性状的植物。
15.用权利要求12或13的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
16.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其包括：
（i）在植物中导入和表达编码如权利要求1-5的任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸；和
（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
17.相对于对照植物，具有增强的产量相关性状的转基因植物，其获得自编码如权利要求1-5的任一项定义的PEAMT多肽或其同源物的核酸的受调节的表达。
18.权利要求11、15或17的转基因植物，或源自它们的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子（millet）、裸麦（rye）、黑小麦（triticale）、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
19.源自权利要求18的植物的产物。
20.编码PEAMT多肽或其同源物的核酸在相对于对照植物，改变植物的产量相关性状中的用途。
21.相对于对照植物，在植物中增加与种子产量相关性状的方法，包括在植物中增加编码脂肪酰酰基载体蛋白（ACP）硫酯酶B（FATB）多肽的核酸序列的表达，以及任选的选择具有增加的种子产量相关性状的植物，所述FATB多肽包含（i）质体转运肽；（ii）至少一个跨膜螺旋；（iii）和具有InterPro登录号IPR002864的酰基-ACP硫酯酶家族结构域。
22.权利要求21的方法，其中所述FATB多肽具有（i）质体转运肽；（ii）以增加的优选顺序与SEQ ID NO:141表示的跨膜螺旋具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列同一性；且以增加的优选顺序与SEQ IDNO:140表示的酰基-ACP硫酯酶家族结构域具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列同一性。
23.权利要求21或22的方法，其中所述FATB多肽以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO:93表示的FATB多肽，或具有与本文表A3中给出的任何多肽序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列同一性。
24.权利要求21-23的任一项的方法，其中所述FATB多肽是任意这样的多肽序列，当所述多肽序列在构建FAT进化系统树例如图10所描述的进化系统树中使用时，与包含SEQ ID NO:93表示的多肽序列的FATB多肽进化枝聚类，而不与FATA多肽进化枝聚类。
25.权利要求21-24的任一项的方法，其中所述FATB多肽是具有酶活性的多肽，所述酶活性在于优先从饱和的酰基-ACP（具有在8至18个碳之间变化的链长度）上水解酰基-ACP硫酯键，释放游离的脂肪酸和酰基载体蛋白（ACP）。
26.权利要求21-25的任一项的方法，其中所述编码FATB多肽的核酸序列是由表A3中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分所表示的，或者是能够与A3中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分杂交的序列。
27.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述核酸序列编码由表A3中给出的任何多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
28.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述增加的表达通过任意一种或多种：T-DNA活化标签、TILLING或同源重组来实现。
29.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述增加的表达通过在植物中导入和表达编码FATB多肽的核酸序列来实现。
30.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述增加的产量相关性状是一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
31.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接。
32.权利要求31的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选的是稻GOS2启动子，更优选的是SEQ ID NO:144表示的GOS2启动子。
33.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述编码FATB多肽的核酸序列是来自植物，还优选的来自双子叶植物，更优选的来自十字花科（Brassicaceae），最优选的核酸序列来自拟南芥（Arabidopsisthaliana）。
34.通过前述任一项的权利要求的方法可获得的植物、其部分（包括种子）或植物细胞，其中所述植物、其部分或细胞包含与组成型启动子有效连接的编码FATB多肽的分离的核酸转基因。
35.分离的核酸序列，包含：
（i）由SEQ ID NO:130表示的核酸序列；
（ii）由SEQ ID NO:130表示的核酸序列的互补序列；
（iii）编码FATB多肽的核酸序列，所述多肽以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO:131表示的多肽序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的氨基酸序列同一性。
36.分离的多肽，包含：
（i）由SEQ ID NO:131表示的多肽序列；
（ii）以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO:131表示的多肽序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的多肽序列；
（iii）由上述（i）或（ii）给出的任意多肽序列的衍生物。
37.构建体，包含：
（a）编码如权利要求21-27任一项定义的FATB多肽的核酸序列；
（b）能够驱动（a）的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
（c）转录终止序列。
38.权利要求37的构建体，其中所述控制序列是组成型启动子。
39.权利要求36的构建体，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选的是稻的GOS2启动子，更优选的是SEQ ID NO:144表示的GOS2启动子。
40.根据权利要求37-39的任一项的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的植物，其中所述增加的种子产量相关性状是一种或多种的：增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
41.用权利要求37-39的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
42.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的种子产量相关性状，包括：
（i）在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达编码如权利要求21-27的任一项定义的FABT多肽的核酸序列；和
（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。
43.相对于对照植物，具有增加的种子产量相关性状的转基因植物，或者源自所述转基因植物的转基因植物细胞或转基因植物部分，所述转基因植物获得自与组成型启动子有效连接的编码如权利要求21-27的任一项定义的FATB多肽的核酸序列的增加的表达。
44.权利要求34、41或43的转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子（millet）、裸麦（rye）、黑小麦（triticale）、高粱和燕麦。
45.权利要求44的植物的包含编码FATB多肽的分离核酸序列的可收获部分，其中所述可收获的部分优选的是种子。
46.源自权利要求44的植物和/或源自权利要求45的植物的可收获部分的产物。
47.编码如权利要求21-27的任一项定义的FATB多肽的核酸序列在增加种子产量相关性状中的用途，所述性状包括一种或多种的增加的每株植物的种子总产量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。
48.用于相对于对照植物，在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中调节编码LFY样多肽的核酸的表达，其中所述LFY样多肽包含FLO-LFY结构域。
49.权利要求48的方法，其中所述LFY样多肽具有与SEQ IDNO:146至少50%序列同一性。
50.权利要求48或49的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入和表达编码LFY样多肽的核酸来实现。
51.权利要求48-50的任一项的方法，其中所述编码LFY样多肽的核酸编码表A4中列出的任一蛋白质，或是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
52.权利要求48-51的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A4中给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
53.权利要求48-52的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选的增加的种子产量。
54.权利要求48-53的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
55.权利要求50-54的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选的与GOS2启动子，最优选的与来自稻的GOS2启动子有效连接。
56.权利要求48-55的任一项的方法，其中所述编码LFY样多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自十字花科（Brassicaceae），更优选的来自拟南芥属（Arabidopsis），最优选的来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）。
57.通过前述任一项的权利要求的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码LFY样多肽的重组核酸。
58.构建体，包含：
（i）编码如权利要求48或49定义的LFY样多肽的核酸；
（ii）能够驱动（a）的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的
（iii）转录终止序列。
59.权利要求58的构建体，其中一种所述控制序列是组成型启动子，优选的是GOS2启动子，最优选的是来自稻的GOS2启动子。
60.权利要求58或59的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物。
61.用权利要求58或59的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
62.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量，包括：
（i）在植物中导入和表达编码如权利要求48或49定义的LFY样多肽的核酸；和
（ii）在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
63.相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的种子产量的转基因植物，或者源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物获得自编码如权利要求48或49定义的LFY样多肽的核酸的受调节的表达。
64.权利要求57、61或63的转基因植物，或源自它们的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子（millet）、裸麦（rye）、黑小麦（triticale）、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
65.权利要求64的植物的可收获部分，其中所述可收获的部分优选的是种子。
66.源自权利要求64的植物和/或源自权利要求65的植物的可收获部分的产物。
67.编码LFY样多肽的核酸在相对于对照植物，在植物中增加产量，特别是增加种子产量中的用途。
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