PL187026B1 - Komórka roślinna, DNA, promotor, gen chimerowy i sposób wytwarzania rośliny - Google Patents
Komórka roślinna, DNA, promotor, gen chimerowy i sposób wytwarzania roślinyInfo
- Publication number
- PL187026B1 PL187026B1 PL96326082A PL32608296A PL187026B1 PL 187026 B1 PL187026 B1 PL 187026B1 PL 96326082 A PL96326082 A PL 96326082A PL 32608296 A PL32608296 A PL 32608296A PL 187026 B1 PL187026 B1 PL 187026B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- zone
- plant
- seq
- promoter
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 335
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 216
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 79
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 63
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 55
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 40
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 38
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims description 33
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 claims description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 18
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 14
- 101150075111 ROLB gene Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 10
- 230000009172 bursting Effects 0.000 claims description 10
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims description 9
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 9
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 9
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 claims description 7
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000005506 Tryptophan Hydroxylase Human genes 0.000 claims 3
- 108010031944 Tryptophan Hydroxylase Proteins 0.000 claims 3
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 claims 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-M ethanimidate Chemical compound CC([O-])=N DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000023753 dehiscence Effects 0.000 abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 131
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 42
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical class C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 21
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 15
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 12
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,4-dichlorophenyl)pentyl]1,2,4-triazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1C(CCC)CN1C=NC=N1 WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 9
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 9
- 101100240646 Scheffersomyces stipitis (strain ATCC 58785 / CBS 6054 / NBRC 10063 / NRRL Y-11545) NMA111 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 239000011031 topaz Substances 0.000 description 9
- 229910052853 topaz Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- PAJPWUMXBYXFCZ-UHFFFAOYSA-N 1-aminocyclopropanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(N)CC1 PAJPWUMXBYXFCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 101710097941 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase CwlA Proteins 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108091054761 ethylene receptor family Proteins 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 6
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 6
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- USGUVNUTPWXWBA-JRIXXDKMSA-N (e,2s)-2-amino-4-(2-aminoethoxy)but-3-enoic acid Chemical compound NCCO\C=C\[C@H](N)C(O)=O USGUVNUTPWXWBA-JRIXXDKMSA-N 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 5
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 5
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 5
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 5
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 5
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 5
- SODPIMGUZLOIPE-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1 SODPIMGUZLOIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 4
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 4
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 4
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 101100333778 Arabidopsis thaliana ERS1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 3
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 3
- 102100039327 Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000961707 Homo sapiens Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 101100279542 Arabidopsis thaliana EIN3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100279543 Arabidopsis thaliana EIN4 gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 102100036576 Coiled-coil domain-containing protein 174 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150101101 EIN2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150068804 ETR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 101710196315 High affinity copper uptake protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008618 cell wall macromolecule catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- -1 glucanase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 101150104752 iaaH gene Proteins 0.000 description 2
- 101150063121 iaaM gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101150046289 tms2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QBGTUKHXPABEHI-UHFFFAOYSA-N 2-{[hydroxy(1H-indol-3-yl)methylidene]amino}acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)NCC(=O)O)=CNC2=C1 QBGTUKHXPABEHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150093547 AUX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 101900166660 Agrobacterium tumefaciens Tryptophan 2-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108700015969 Arabidopsis ERS Proteins 0.000 description 1
- 101100285389 Arabidopsis thaliana HLS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100018713 Arabidopsis thaliana ILR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100520141 Arabidopsis thaliana PIN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100156949 Arabidopsis thaliana XRN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 1
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 1
- 235000011332 Brassica juncea Nutrition 0.000 description 1
- 235000014700 Brassica juncea var napiformis Nutrition 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000969022 Dasineura Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100256850 Drosophila melanogaster EndoA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010072039 Histidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038264 NR gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000012515 Protein kinase domains Human genes 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101100367246 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SWA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010051098 beta-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- KFAGNCXRTORBDS-UHFFFAOYSA-N cyano thiocyanate;guanidine Chemical compound NC(N)=N.N#CSC#N KFAGNCXRTORBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001295 genetical effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012794 pre-harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
Abstract
1. Komórka roslinna zawierajaca co najmniej jeden specyficzny dla strefy pekania („DZ”) gen chimerowy wlaczony w genom jadrowy komórki, znamienna tym, ze specy- ficzny dla strefy pekania gen chimerowy zawiera nastepujace funkcjonalnie polaczone fragmenty DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujacy co najmniej 50 nukleotydowych sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) promotor roslinny ulegajacy ekspresji w roslinach, który kieruje ekspresja transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pekania, przy czym, roslina zawierajaca te komórke roslinna charakteryzuje sie tym, ze ma zmienione wlasciwosci strefy pekania, korzystnie opóznione pekanie, w porównaniu z roslinami niezawierajacymi takich komórek roslin. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna, DNA, promotor, gen chimerowy i sposób wytwarzania rośliny. DNA, będące przedmiotem wynalazku, zawiera fragmenty kwasu nukleinowego kodujące białka charakterystyczne dla strefy pękania, szczególnie hydrolazy ściany komórkowej, takie jak poligalakturonazy, regiony regulatorowe odpowiednich genów roślinnych. Sekwencje DNA służą do modyfikowania cechy pękania u roślin, bardziej szczegółowo pękania strąków Brassica napus.
Straty plonów powodowane przez wyrzucanie nasion z dojrzałych owoców lub strąków, zwane także pękaniem strąków lub rozłupywaniem strąków, a także towarzyszący temu proces niepotrzebnego wzrostu niepożądanych roślin w następnym roku są częstym problemem w czasie uprawy roślin wytwarzających suche pękające owoce. Ważne z ekonomicznego punktu widzenia uprawy do których odnosi się ten problem obejmują rzepak; w niesprzyjających warunkach pogodowych można utracić do 50% zbiorów.
Suche pękające owoce, potocznie nazywane strąkami, mogą rozwinąć się z pojedynczego owocolistka (tak jak strączek u wielu motylkowych) lub z więcej niż jednego owocolistka (tak jak łuszczyna u wielu krzyżowych). W przypadku łuszczyny strąk składa się z dwóch owocolistków połączonych brzegami. Szew pomiędzy brzegami tworzy grube żebro, zwane przegrodą. W miarę zbliżania się dojrzałości, dwie łuski oddzielają się od przegrody, co powoduje czasami zrzucanie nasion przyczepionych do przegrody.
Badania ultrastrukturalne wykazały, że rozłupywanie strąków związane jest z precyzyjnym rozkładem materiału tworzącego ścianę komórkową, w miejscu rozdzielania strąka (to znaczy szwu). Degradacja ściany komórkowej i utrata zwartości komórek tuż przed pęknięciem
187 026 strąka związane jest głównie z rozpuszczaniem się blaszki środkowej ściany komórkowej. Blaszka środkowa znajduje się pomiędzy ścianami pierwotnymi komórek i jest spoiną trzymającą razem poszczególne komórki tworzące tkankę. Rozdział komórek poprzedzony jest przekwitaniem etylenowym, które czasowo zgadza się ze specyficznym tkankowo wzrostem aktywności enzymu hydrolitycznego - celulazy (beta-l,4-glukanazy). Zjawisko to zachodzi specyficznie w warstwie komórek wzdłuż szwu, która nazywana jest strefą pękania. Przeciwnie do tego aktywność poligalakturonazy, enzymu rozkładającego ścianę komórkową, nie wykazuje żadnej korelacji czasowej lub przestrzennej z dojrzewaniem strąków (Meakin i Roberts (1990), J. Exp. Bot. 41; 1003). Dojrzewanie strąków we wczesnym etapie rozwoju jest charakterystyczne dla zarobaczywienia strąka przez szkodnika Dasineura brassicae. Obserwuje się lokalne zwiększenie aktywności zarówno poligalakturonazy jak i celulazy. Jednakże stwierdzono, że regulacja rozłupywania strąków wywołanego przez zarobaczywienie i naturalną dojrzałość jest różna (Meakin i Roberts (1991), Annals of Botany 67:193).
Na pierwszy rzut oka proces pękania ma wiele cech wspólnych z procesem zrzucania, w trakcie którego roślina zrzuca niepotrzebne organy, takie jak liście, kwiaty i owoce. Stwierdzono, że etylen wywołuje lub przyspiesza zrzucanie, podczas gdy auksyny je hamują lub opóźniają. Najważniejszym etapem w czasie zrzucania jest skoordynowana ekspresja, synteza i wydzielanie enzymów rozkładających ścianę komórkową w określonej warstwie komórek, nazywanych strefą odcinania. Jedną klasę hydrolaz ściany komórkowej tworzą celulazy (beta-1,4-glukanazy). Aktywność celulazowa została znaleziona w różnych tkankach włączając strefy odcinania liści, strefy odcinania owoców, dojrzewające owoce, starzejące się liścienie, słupki i pylniki (Kemmerer i Tucker (1994), Plant Physiol. 104:557 i odnośniki w nim zawarte). Drugą klasę hydrolaz biorących udział w odrzucaniu głównie owoców, tworzą poli-galakturonazy, wśród których zidentyfikowano kilka różnych form (Bonghi i wsp. (1992), Plant Mol. Biol. 20:839; Taylor i wsp. (1990) Planta 183: 133).
Kadkol i wsp., ((1986), Aust. J. Biol. 34: 79) stwierdził wzrost oporności na rozbijanie u jednej australijskiej odmiany rzepaku. Zróżnicowanie dojrzewania strąków obserwowano także u mutantów rzepaku, które wyrosły z napromienionych nasion (Luczkiewicz (1987), Proc. 7th Int. Rapeseed Congress 2: 463). Można jednakże stwierdzić, że tradycyjne sposoby hodowli nie są zdolne do wytworzenia oporności na rozbijanie u odmian rzepaku, bez obniżenia innych korzystnych cech, takich jak wczesne kwitnięcie, dojrzałość i oporność na wytwarzanie pustych strąków (Prakash i Chopra (1990), Genetical Research 56: 1).
Pomijając aspekt ekonomiczny, niewiele jest wiadomo o zjawiskach molekularnych i zmianach ekspresji genów jakie zachodzą w czasie w pękania strąków roślin oleistych. Dotąd opisano dwa rodzaje mRNA, którego ekspresja jest czasowo i miejscowo skorelowana z rozwojem strąka. Jednakże funkcja kodowanych przez nie białek nie jest znana. (Coupe i wsp. (1994), Plant Mol. Biol. 24: 223). Publikacja patentowa W094/23043 w sposób ogólny opisuje podejście do regulacji zjawiska pękania i zrzucania u roślin.
Celem wynalazku było dostarczenie genów selektywnych dla strefy pękania u roślin.
Przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna zawierająca co najmniej jeden specyficzny dla strefy pękania („DZ”) gen chimerowy włączony w genom jądrowy tej komórki, charakteryzująca się tym, że specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący co najmniej 50 nukleotydowych sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) promotor roślinny ulegający ekspresji w roślinach, który kieruje ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania, przy czym, roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami niezawierającymi takich komórek roślin.
Komórka roślinna korzystnie zawiera transkrybowany region DNA, który koduje białko zdolne zahamować aktywność poligalakturonazy, korzystnie endo-poligalakturonazy.
Komórka roślinna według wynalazku korzystnie posiada taką cechę, która powoduje, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodziny Brassica, szczególnie korzystnie Brassica napus.
187 026
Promotor, w komórce według wynalazku, wtedy gdy ulega ekspresji w roślinach jest promotorem specyficznym dla strefy pękania. Bardziej korzystnie specyficzny dla strefy pękania promotor pochodzi z genu kodującego mRNA, przy czym, pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka roślinna zawierająca co najmniej jeden specyficzny dla strefy pękania („DZ”) gen chimerowy włączony w genom jądrowy tej komórki, charakteryzująca się tym, że specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący białko albo polipeptyd. Polipeptyd ten po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej bamazę, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryplofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko ETR1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie regulatorowym sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328. Promotor ten wybiórczo kieruje ekspresją transkrybowanego regionu wybiórczo w komórkach strefy pękania, przy czym roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami niezawierającymi wspomnianych komórek roślinnych.
Korzystnie, komórka roślinna według wynalazku posiada cechę powodującą, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodzaju Brassica, bardziej korzystnie Brassica napus.
Korzystnie, komórka roślinna według wynalazku zawiera specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe, które obejmują region promotorowy zawierający przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
Bardziej korzystnie, komórka roślinna według wynalazku zawiera specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierające region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13, zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.
Jeszcze bardziej korzystnie komórka roślinna zawiera specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe obejmujące region promotorowy z przynajmniej sekwencją nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.
Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący antysensowny RNA zawierający region o długości przynajmniej 50 nukleotydów, który jest komplementarny do regionu mRNA, przy czym pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
Przedmiotem wynalazku jest także promotor genu kodującego mRNA, charakteryzujący się tym, że pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
Następnym przedmiotem wynalazku jest DNA zawierający przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
DNA korzystnie zawiera przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.
Jeszcze bardziej korzystnie DNA zawiera przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest gen chimerowy specyficzny dla strefy pękania, który to gen obejmuje (a) transkrybowany region DNA kodujący co najmniej 50 nukleotydowych sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) promotor roślinny ulegający ekspresji w roślinach, kierujący ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania. Roślina zawierająca taką komórkę roślinną ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami nie zawierającymi takich komórek roślinnych.
Korzystnie gen chimerowy obejmuje transkrybowany region DNA które koduje białko. Białko to jest zdolne do zahamowania aktywności poligalakturonazy, korzystnie endo-poligalakturonazy.
187 026
Gen chimerowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor wchodzący w skład tego genu kieruje ekspresję w strefie pękania, która to strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodziny Brassica, szczególnie korzystnie Brassica napus.
Szczególnie korzystnie, gen chimerowy ulegający ekspresji w roślinach, posiada promotor będący promotorem specyficznym dla strefy pękania.
Jeszcze bardziej korzystnie, gen chimerowy zawiera specyficzny dla strefy pękania promotor pochodzący z genu kodującego mRNA, przy czym, podzodzacy z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
Następnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna lub hodowla komórek roślinnych transformowanych specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym jak określono powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także gen chimerowy specyficzny dla strefy pękania, stanowiący funkcjonalne połączenie następujących fragmentów DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący białko albo polipeptyd, który po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej bamazę, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryplofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko ETR1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie regulatorowym sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328, który wybiórczo kieruje ekspresją transkrybowanego regionu w komórkach strefy pękania. Roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami niezawierającymi wspomnianych komórek roślinnych.
Korzystnie strefa pękania jest strefą pękania strąka, a bardziej korzystnie rośliny z rodzaju Brassica, korzystnie Brassica napus.
Jeszcze bardziej korzystnie te specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
Specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe mogą zawierać region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13, zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzymy restrykcyjne SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.
Specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe mogą zawierać korzystnie region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna lub hodowla komórek roślinnych transformowanych specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym jak określono powyżej.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny ze zmienionymi właściwościami strefy pękania, polegajacy na tym, że transformuje się genom jądrowy komórki rośliny wyjściowej specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym obejmującym: (a) transkrybowany region DNA co najmniej 50 nukleotydów z sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) ulegający ekspresji promotor roślinny, kierujący ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania, przy czym, roślina zawierająca taką komórkę roślinną ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami niezawierającymi takich komórek roślinnych i odtwarza się transformowaną roślinę z tej transformowanej komórki roślinnej.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rośliny ze zmienionymi właściwościami strefy pękania, polegający na tym, że transformuje się genom jądrowy komórki rośliny wyjściowej specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym, zawierającym białko albo polipeptyd, który po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub peptyd wybrany jest z grupy bamazy, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryplofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko ETR1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie
187 026 regulatorowym sekwencji dukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328, wybiórczo kierujący ekspresją tradpkrebowndzgo regionu w komórkach strefy pękania. Roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami dlezawizrającemi wspomnianych komórek roślinnych i odtwarza się transformowaną roślinę z tej transformowanej komórki.
Używany tu termin „pękanie” oznacza proces w którym organ rośliny lub jej struktura, taka jak słupek lub owoc otwiera się po osiągnięciu dojrzałości wzdłuż określonej linii lub w określonym kierunku, co powoduje zrzucenie zawartości tego organu lub struktury. W dizktórych aspektach proces pękania przypomina proces zrzucania w którym część lub organ roślinny, taki jak liść, kwiat lub owoc jest oddzielany od reszty rośliny.
Używany tu termin „strąk” oznacza suchy, pękający owoc, składający się z jednego, dwóch lub więcej owocaSistków. U rzepaku strąk jest dwuluskową łuszczyną, której łuski są ograniczone podłużnymi i poprzecznymi szwami zawierającymi strefy pękania.
Używany tu termin „pękanie strąka” oznacza proces w którym owoc, szczególnie strąk, rozdziela się otwierając wzdłuż określonej warstwy komórek, co może powodować rozdzielanie się łusek i wyrzucanie nasion zawartych w owocu szczególnie strąku. Pękanie zachodzi w różnych roślinach wytwarzających suche owoce, takich jak większość rodzajów krzyżowych (Cruciferae).
Termin „strefa pękania” (DZ) oznacza ogólnie tkanki w strefie, wzdłuż której organ rośliny lub jej struktura rozdziela się, otwierając w czasie procesu pękania. Makroskopowo strefę pękania można z reguły poznać po obecności wyraźnego szwu w organie rośliny. Bardziej dokładnie DZ zawiera obszar szerokości 1-3 komórek pαredchemαtycznech. W strąku region ten zawiera gęsto upakowane komórki i leży w peryferiach tkanki przewodzącej łuski, oddzielając ją od krawędzi klapki. Do celów tego wynalazku DZ obejmuje też warstwę komórek otaczających ten region. DZ rozciąga się od skórki wewnętrznej strąka do szwu w epidemie.
Używany tu termin „promotor” oznacza każdy DNA, który jest rozpoznawany i z którym w czasie zapoczątkowywania transkrypcji wiąże się (pośrednio lub bezpośrednio) DNA-zależna polimeraza RNA. Promotor zawiera miejsce inicjacji transkrypcji, miejsce wiązania czynników inicjacji transkrypcji i polimzrαne RNA. Może on zawierać także różne iddz miejsca (na przykład, sekwencje wzmacniające) z którymi mogą się wiązać białka regulatorowe.
Używany tu termin „promotor ulegający ekspresji w roślinach ” oznacza promotor, który jest zdolny kierować transkrypcją w komórkach roślinnych. Obejmuje on każdy promotor pochodzący z komórek roślinnych, ale także każdy promotor niepo^odzący z komórek roślinnych, a który' jest zdolny kierować transkrypcją w komórkach roślinnych, na przykład, niektóre promotory pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego, takie jak promotory CaMV35S lub T-DNA.
Używany tu termin „region regulatorowy” oznacza każdy DNA, biorący udział w prowadzeniu transkrypcji i kontrolowaniu (to znaczy regulowaniu) czasu i poziomu transkrypcji danej sekwencji DNA, takiej jak DNA kodujący białko lub peptyd. Na przykład, 5'-regian regulatorowy (lub region pramatarowy) jest sekwencją DNA umiejscowioną powyżej (to znaczy 5') sekwencji kodującej, zawierającą promotor i nie ulegający translacji 5'-regiod prowadzący 3'-region regulatorowy jest sekwencją DNA umiejscowioną poniżej (to znaczy 3') sekwencji kodującej, zawierającą odpowiednie sygnały terminali transkrypcji i/lub regulacji, włączając jeden lub więcej sygnałów poliαaedylacji.
Używany tu termin „hydrola^ ściany komórkowej” oznacza enzym biorący udział w degradacji materiału tworzącego ścianę komórkową, na przykład, w czasie procesu pękania. Przykłady takich enzymów obejmują, poligalαkturadazę, celulazę (beta-T4-glukanazę), betα-galaktoneaazę, proteazy hydrolizające białka ściany komórkowej i tym podobne.
Termin „gen” oznacza każdy fragment DNA, zawierający region DNA („transkrybawany region DNA”), z którego w komórce w czasie transkrypcji pod kontrolą odpowiednich regionów regulatorowych na przykład, promotora ulegającego ekspresji w roślinach, powstaje cząsteczka RNA (na przykład, mRNA). Gen zawiera więc kilka połączonych funkcjonalnie fragmentów DNA, takich jak promotor, nie ulegający translacji 5'-regiod prowadzący, region kodujący, nie ulegający translacji 3'-regiod zawierający sygnał poliαaedelαcji. Endogenny gen
187 026 roślinny jest to gen, który występuje w roślinach w sposób naturalny. Gen chimerowy jest to gen, który nie występuje w roślinach w sposób naturalny, lub alternatywnie jest to każdy gen, którego promotor nie jest w naturze związany z częścią lub całym regionem transkrybowanym, a przynajmniej z innym regionem regulatorowym tego genu.
Termin „ekspresja genu” oznacza proces w którym region DNA pozostający pod kontrolą regionów regulatorowych, szczególnie promotora, transkrybowany jest do RNA, który jest aktywny biologicznie, to znaczy który jest zdolny do interakcji z innym kwasem nukleinowym lub może ulegać translacji do aktywnego biologicznie białka lub polipeptydu. Gen koduje RNA, jeżeli produkt końcowy jego ekspresji jest aktywnym biologicznie RNA, takim jak antysensowny RNA lub rybozym. Gen koduje białko, jeżeli produkt końcowy jego ekspresji jest aktywnym biologicznie białkiem lub polipeptydem.
Fenotypowy efekt ekspresji genu oznacza biochemiczny, fizjologiczny lub rozwojowy efekt wytwarzania RNA lub białka kodowanego przez ten gen w komórkach roślinnych (lub roślinach) w których jest wytwarzany. Fenotypowe efekty ekspresji genu można zahamować lub zlikwidować przez zahamowanie lub likwidację wytwarzania kodowanego RNA lub białka, lub przez inny sposób oddziaływania z biologiczną aktywnością takiego RNA lub białka.
Jak tu zdefiniowano, gdziekolwiek napisano w opisie, że „cDNA z takiego mRNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No X” to taki RNA ma taką samą sekwencję nukleotydową jak sEq ID No X, a reszty U (w sekwencji RNA) są zastąpione przez reszty T (sekwencji DNA).
Sposobem według wynalazku DZ-specyficzne cDNA i odpowiadające im fragmenty genomowego DNA roślin, zidentyfikowano jak opisano poniżej:
1) konstruuje się bibliotekę cDNA wychodząc z mRNA wyizolowanego z tkanek strefy pękania i taką bibliotekę bada się celu zidentyfikowania mRNA, które występuje tylko w tkankach określonej strefy pękania, porównując z innymi tkankami roślinnymi, włączając: ściany strąka, nasiona, łuski, liście, łodygę, korzenie, organy rozrodcze, i tym podobne. Alternatywnie, taką bibliotekę bada się oligonukleotydami, których sekwencję określono na podstawie znanej sekwencji aminokwasowej wyizolowanych białek, takich jak na przykład, hydrolaza ściany komórkowej, o której wiadomo, że wybiórczo występuje w strefie pękania. Ponadto, można użyć tych samych oligonukleotydów w metodzie zagnieżdżonego PCR i powtórnie użyć namnożonych fragmentów jako sondy do badania biblioteki. Bibliotekę cDNA selektywnego w stosunku do DZ można skonstruować z mRNA wyizolowanego na różnych etapach rozwoju DZ.
2) izoluje się i charakteryzuje cDNA kodujący mRNA lub białko specyficzne dla DZ;
3) ten cDNA stosuje się jako sondy w celu zidentyfikowania i wyizolowania regionu genomu roślinnego, zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą mRNA lub białko specyficzne dla DZ. Alternatywnie, genomowy cDNA można wyizolować metodą odwrotnego PCR używając oligonukleotydów, których sekwencję określono na podstawie sekwencji cDNA;
4) ewentualnie, sondy RNA odpowiadające cDNA konstruuje się i stosuje w tradycyjnej analizie metodą hybrydyzacji in situ RNA-RNA (patrz na przykład, (De Błock i wsp. (1993), Anal. Biochem. 215: 86) różnych tkanek roślinnych, włączając tkanki strefy pękania, w celu stwierdzenia w takich tkankach strefy pękania fakt specyficznego występowania mRNA wytwarzanego przez specyficzne dla strefy pękania endogenne geny roślinne.
Termin „specyficzne dla strefy pękania” w odniesieniu do ekspresji DNA, oznacza ze względów praktycznych dla potrzeb tego wynalazku wysoce specyficzną, praktycznie wyłączną ekspresję DNA w komórkach jednej określonej strefy pękania, szczególnie strefy pękania strąka, lub ograniczonej ilości stref pękania.
Gen specyficzny dla strefy pękania jest to endogenny gen roślinny, który ulega selektywnej ekspresji w komórkach pewnych stref pękania, szczególnie w komórkach strefy pękania strąka rośliny. Do izolacji genów specyficznych dla strefy pękania można użyć każdej rośliny posiadającej strefę pękania. Odpowiednie dla izolacji genów specyficznych dla strefy pękania rośliny należą do rodziny krzyżowych, włączając Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica juncea, a szczególnie Brassica napus; rośliny z rodziny motylkowych włączając Glycine max, Phaseolus vulgaris, i tym podobne. mRNA (lub cDNA z niego otrzymany) transkrybowany z takich genów jest specyficznym dla strefy pękania mRNA (lub cDNA). Promotor, który
187 026 rozpoczyna i kontroluje transkrypcje takiego mRNA jest nazywany promotorem specyficznym dla strefy pękania. Promotor specyficzny dla strefy pękania może być użyty na przykład, do kontrolowania ekspresji w roślinach genu cytotoksycznego (na przykład, genu barnazy), w taki sposób, że normalny wzrost i rozwój rośliny, a także jej własności agrotechniczne (mierzone na przykład, wydajnością plonowania) nie są obniżone przez ekspresję takiego cytotoksycznego genu w komórkach innych niż komórki strefy pękania, korzystnie w komórkach innych niż komórki strefy pękania strąka.
Po otrzymaniu genu specyficznego dla strefy pękania (to znaczy fragmentu genomowego DNA kodującego mRNA specyficzny dla strefy pękania z którego uzyskuje się cDNA specyficzny dla strefy pękania), określa się region promotorowy zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor, jako region powyżej (to znaczy znajdujący się w kierunku 5') od kodonu kodującego pierwszy aminokwas białka kodowanego przez to mRNA. Dobrze jest gdy taki region promotorowy zawiera przynajmniej 400 do 500 par zasad, korzystnie przynajmniej około 1000 par zasad, szczególnie korzystnie przynajmniej 1500 do 2000 par zasad powyżej kodonu startowego. Dla wygody korzystnie jest gdy taki region promotorowy nie rozciąga się na więcej niż 3000 do 5000 par zasad powyżej kodonu startowego. Rzeczywistym promotorem specyficznym dla strefy pękania jest region genomowego DNA powyżej (to znaczy znajdujący się w kierunku 5') od regionu kodującego mRNA specyficzny dla strefy pękania. Chimerowy gen zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor połączony funkcjonalnie z regionem kodującym genu gus (Jefferson i wsp. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8447) powoduje w roślinach transgenicznych specyficzny wzrost wykrywalnej aktywności beta-glukoronidazy (kodowanej przez gen gus) w komórkach określonej strefy pękania. Aktywność oznaczono tradycyjnymi metodami histochemicznymi in situ (De Blok i Debrouwer (1992), The Plant Journal 2: 261; De Błock i Debrouwer (1993), Planta 189: 218).
Korzystnym specyficznym dla strefy pękania genem z którego otrzymuje się specyficzny dla strefy pękania promotor jest gen, korzystnie gen Brassica napus, który koduje mRNA specyficzny dla strefy pękania z którego uzyskuje się cDNA zawierający sekwencję odpowiadającą sekwencji oligonukleotydowej PG1 (SEQ ID No 2) pomiędzy nukleotydem w pozycji 11 i 27 i/lub sekwencji oligonukleotydowej PG3 (SEQ ID No 4) pomiędzy nukleotydem w pozycji 11 i 27 (to znaczy zaczynającą się w pozycji 11 i kończącej się w pozycji 27) i/lub sekwencji oligonukleotydowej PG2 (SEQ ED No 3) pomiędzy nukleotydami w pozycji 11 i 25 i/lub sekwencji oligonukleotydowej PG5 (SEQ ID No 5) pomiędzy nukleotydem w pozycji 11 i 27. Korzystnie taki specyficzny dla strefy pękania cDNA zawiera wspomniane wcześniej sekwencje oligonukleotydowe PG1 i PG3 i PG2 i PG5, lub koduje białko kodowane przez region SEQ ID No 1, pomiędzy nukleotydami w pozycji 95 i 1393.
Szczególnie korzystnym specyficznym dla strefy pękania genem jest gen Brassica napus, który koduje mRNA specyficzny dla strefy pękania z którego uzyskuje się cDNA zawierający sekwencję oligonukleotydową SEQ ID No 1 pomiędzy przynamniej nukleotydem w pozycji 10 i 1600. Innym korzystnym specyficznym dla strefy pękania genem jest gen Brassica napus, który koduje mRNA specyficzny dla strefy pękania z którego uzyskuje się cDNA zawierający sekwencję oligonukleotydową SEQ ID No 10.
Korzystnym promotorem wykonanym sposobem według wynalazku jest promotor zawierający 5'-region regulatorowy klonu genomowego odpowiadającego cDNA SEQ ID No 1, na przykład, 5'-region regulatorowy SEQ ID No 13 zaczynający się w pozycji 1 i kończący się w pozycji 2328. Bardziej korzystnie regionem promotorowym jest fragment DNA zawierający SEQ ID No 13 i zaczynający się gdziekolwiek pomiędzy unikalnym miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI (pozycje 246-251) i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny Hindll (pozycje 1836-1841), szczególnie miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI (pozycje 1051-1056), kończący się w pozycji 2328 (tuż przed kodonem startującym translację ATG). Taki region promotorowy zawiera promotor będący przedmiotem wynalazku i nie ulegający translacji 5'-region prowadzący i jest używany do konstruowania specyficznych dla strefy pękania genów chimerowych. Bardziej korzystnym pod tym kątem jest regionem promotorowym
187 026 fragment DNA (oznaczony tu „PDZ”) zawierający SEQ ID No 13 zaczynający się w pozycji 251 (miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SphI) i kończący się w pozycji 2328.
Jednakże sposobem według wynalazku, jako regionów promotorowych można też użyć mniejszych fragmentów DNA i przyjmuje się, że można użyć każdego fragmentu DNA SEQ ID No 13 zawierającego przynajmniej około 490 par zasad, bardziej korzystnie przynajmniej 661 par zasad i najbardziej korzystnie przynajmniej 1326 par zasad powyżej kodonu inicjacji transkrypcji. Szczególnie korzystnym małym fragmentem DNA, który można użyć jako regionu promotorowego sposobem według wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję DNA SEQ ID No 13 pomiędzy nukleotydami w pozycji 1002 i 2328.
Przyjmuje się, że specyficzny dla strefy pękania promotor 5'-region regulatorowy SEQ ID No 13 może być znacznie ulepszony przez włączenie sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy nukleotydami w pozycji 1002 i 1674. Promotory zawierające tę sekwencję są szczególnie korzystne.
Alternatywnie, można skonstruować sztuczny promotor zawierający te wewnętrzne części promotora 5'-regionu regulatorowego SEQ ID No 13, które określają jego specyficzność do strefy pękania. Takie sztuczne promotory mogą zawierać „rdzeń promotora” lub „region TATA box” z innego promotora zdolnego wywołać ekspresję w roślinach, takiego jak CaMV35S „region TATA box” opisany w WO 93/19188. Odpowiednie fragmenty promotora lub sztuczne promotory można poznać na przykład, dzięki ich odpowiednim połączeniu z genem reporterowym (takim jak gen gus) i wykryciu ekspresji genu reporterowego w odpowiednich tkankach w odpowiedniej fazie ich rozwoju. Wiadomo, że takie małe promotory i/lub sztuczne promotory zawierające wewnętrzne części 5'-regionu regulatorowego SEQ ID No 13, które określają jego specyficzność do strefy pękania mogą dawać lepszą specyficzność transkrypcji w komórkach specyficznych dla strefy pękania i/lub zwiększony poziom transkrypcji regionów transkrybowanych specyficznych dla strefy pękania chimerowych genów wytworzonych sposobem według wynalazku.
Oprócz rzeczywistego promotora 5'-region regulatorowy specyficznego dla strefy pękania genu zawiera także fragment DNA kodujący nie ulegający translacji 5'-region prowadzący (5'UTL) RNA umieszczony pomiędzy miejscem startu translacji i miejscem startu transkrypcji. Przyjmuje się, że 5' miejsce startu transkrypcji znajduje się pomiędzy pozycją 12219 i 2227 (w SEQ ID No 13), co daje 5'UTL długości około 102-110 nukleotydów. Przyjmuje się także, że bez znaczącego wpływu na specyficzność promotora, region ten można zastąpić innym 5'UTL, takim jak 5'UTL innego genu ulegającego ekspresji w roślinach.
Innymi genami specyficznymi dla strefy pękania lub cDNA użytecznymi w sposobie według wynalazku są geny lub cDNA izolowane z innych źródeł, na przykład, z innych odmian B. napus lub nawet z innych gatunków roślin, na przykład, używając cDNA SEQ ID No 13 (lub SEQ ID No 10) jako sondy do badania bibliotek genomowych w warunkach hybrydyzacji z wysoką siłą jonową tradycyjnymi metodami opisanymi w (Nucleic Acid Hibridization: A Practical Approach (1985), IRL Press Ltd UK (Eds. B. D. Hames i S. J. Higgins). Genem użytecznym do wykorzystania w sposobie według wynalazku jest więc każdy gen, który koduje mRNA z którego z kolei można otrzymać wariant cDNA zawierający region kodujący, o sekwencji, która jest bardzo podobna do sekwencji regionu kodującego cDNA klonu SEQ ID No 1 i kodującego białko o aktywności poligalakturonidazy. Można zidentyfikować także regiony promotorowe i promotory, na przykład, używając takich wariantów cDNA, które są bardzo podobne do regionu promotorowego lub promotora o sekwencji zawartej w sEq ID No 13.
W odniesieniu do sekwencji nukleotydowych (DNA lub RNA), takich jak sekwencje cDNA lub regiony regulatorowe genów, „bardzo podobna” oznacza, że po porównaniu dwóch sekwencji przez określenie procentu identyczności sekwencji, to znaczy podzieleniu liczby pozycji z identycznymi w obu sekwencjach nukleotydami przez całkowitą liczbę nukleotydów w krótszej z dwóch sekwencji, otrzymuje się procent identyczności większy niż 80%, korzystnie większy niż 90% szczególnie w odniesieniu do regionów regulatorowych. Porównania dwóch sekwencji nukleotydowych dokonuje się algorytmem Wilbura i Lipmanna ((1983), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726), stosując okno wielkości 20 nukleotydów, długość słowa 4 nukleotydy i dopuszczalną przerwę 4.
187 026
Dwa bardzo podobne warianty cDNA typowo kodują bardzo podobne do siebie białka. Na przykład, wariant cDNA SEQ ID No 1 typowo koduje białko o sekwencji aminokwasowej która jest bardzo podobna do sekwencji aminokwasowej białka kodowanego przez cDNA SEQ ID No 1. W odniesieniu do sekwencji aminokwasowej „bardzo podobna ” oznacza, że po porównaniu dwóch sekwencji aminokwasowych przez określenie procentu identyczności sekwencji, to znaczy podzieleniu liczby pozycji z identycznymi w obu sekwencjach aminokwasami przez całkowitą liczbę aminokwasów w krótszej z dwóch sekwencji, otrzymuje się procent identyczności większy niż 80%, korzystnie większy niż 90%. Porównania dwóch sekwencji aminokwasowych dokonuje się algorytmem Wilbura i Lipmanna ((1983), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726), stosując okno wielkości 20 aminokwasów, długość słowa 2 aminokwasy i dopuszczalną przerwę 4. Wspomaganą komputerowo analizę i interpretację danych sekwencji, włączając porównanie sekwencji opisane powyżej, wygodnie jest prowadzić używając oprogramowania Intelligenetics ™ Suitę (Intelligenetics Inc., CA).
Sposobem według wynalazku cDNA specyficzne dla strefy pękania i genomowe cDNA, a także regiony regulatorowe otrzymane z genomowych cDNA są używane do modyfikacji właściwości stref pękania u roślin, szczególnie właściwości stref pękania strąków Brassica napus.
Sposobem według wynalazku dostarcza się zrekombinowanego DNA zawierającego przynajmniej jeden specyficzny dla strefy pękania chimerowy gen zawierający ulegający ekspresji w roślinach promotor i region transkrybowany, z których jeden lub oba pochodzą ze specyficznego dla strefy pękania genu otrzymanego sposobem według wynalazku.
Ekspresja specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego w transgenicznych rośli; nach ma efekt fenotypowy tylko w komórkach strefy pękania. Ekspresja specyficznego dla strefy pękania genu może więc selektywnie uniemożliwić, znieść, zahamować lub zmniejszyć fenotypowe efekty ekspresji endogennych genów roślinnych w pewnych określonych strefach pękania (takich jak strefy pękania strąków), może selektywnie zabić lub uszkodzić komórki strefy pękania, lub może oddziaływać z normalnym metabolizmem komórek strefy pękania, powodując opóźnienie lub zahamowanie pękania, szczególnie pękania strąków. Dla celów tego wynalazku komórka roślinna (taka jak komórka strefy pękania) jest zabijana lub uszkadzana jeżeli biochemiczne i fizjologiczne procesy komórki są zahamowane lub alternatywnie jeżeli biochemiczne i fizjologiczne procesy komórki są zmienione w celu wydajnego zmniejszenia zewnątrzkomórkowego wytwarzania przynajmniej jednego enzymu biorącego udział w degradacji roślinnej ściany komórkowej, szczególnie enzymu degradującego pektyny, takiego jak poligalakturonaza, korzystnie przynajmniej o 30%, szczególnie korzystnie przynajmniej o 75%, bardziej korzystnie przynajmniej o 90%.
Dla celów tego wynalazku efekt fenotypowy ekspresji endogennego genu w komórkach roślinnych jest uniemożliwiony, zniesiony, zahamowany lub zmniejszony, jeżeli ilość mRNA i/lub białka wytwarzanego przez te komórki w wyniku ekspresji endogennego genu jest zmniejszona, korzystnie przynajmniej o 30%, szczególnie korzystnie przynajmniej o 75%, bardziej korzystnie przynajmniej o 90%.
Rośliny, w których pękanie jest opóźnione o pewien okres lub nawet zahamowane, wytwarza się przez transformację rośliny zrekombinowanym DNA zawierającym przynajmniej jeden specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku, którego ekspresja powoduje wytwarzanie RNA lub białka lub polipeptydu, które zaburzają w różnym stopniu normalne funkcjonowanie komórek strefy pękania, na przykład, przez zmniejszenie efektów fenotypowych ekspresji jednego lub więcej endogennych genów kodujących enzymy hydrolizujące ściany komórkowe, lub zabijając komórki strefy pękania. Opóźnienie przebiegu pękania, szczególnie pękania owoców i zrzutu nasion przed zbiorem jakie można osiągnąć, znajduje zastosowanie u tych roślin jakie cierpią z powodu przedwczesnej (to znaczy przed zbiorem) utraty nasion.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera transkrybowany region DNA, który jest transkrybowany do RNA, którego wytwarzanie w komórkach strefy pękania zmniejsza, hamuje lub uniemożliwia ekspresję endogennego genu, korzystnie genu kodującego hydrolazę ściany komórkowej, szczególnie endo-poligalakturonazę w komórkach strefy pękania. Zmniejszenie ekspresji
187 026 endogennego genu można wykazać przez zmniejszenie poziomu mRNA w cytoplazmie, w stosunku do poziomu enzymu normalnie wytwarzanego przez endogenny gen. Endogenny gen wyizolowany z rośliny będzie tu nazywany genem sensownym, kodującym sensowny mRNA (lub sensowny pre-mRNA, to znaczy mRNA który jeszcze nie uległ obróbce i zawiera introny).
Korzystnie jest gdy endogenny sensowny gen koduje enzym biorący udział w degradacji ściany komórkowej, szczególnie enzym degradujący pektyny, taki jak esteraza pektynowa, esteraza metylo-pektynowa, liaza pektynowa, liaza pektynowa i poligalakturonaza i tym podobne, a szczególnie endo-poligalakturonaza. Uważa się, że enzymy degradujące pektyny, szczególnie endo-poligalakturonazy pełnią ważną rolę w degradacji materiału blaszki środkowej ścian komórek roślinnych i procesach pękania. Uważa się także, że selektywne zahamowanie wytwarzania takich enzymów w strefie pękania lub w regionach otaczających strefę pękania (na przykład, przez ekspresję RNA antysensownego do mRNA kodującego endo-poligalakturonazę) opóźnia zrzucanie strąków o przynajmniej 1 dzień, korzystnie o 2-5 dni.
Chociaż sensowne geny mogą kodować każdą hydrolazę ściany komórkowej jaka jest wydzielana przez komórki strefy pękania w czasie procesu pękania i która bierze udział w degradacji materiału ściany komórkowej w pewnych strefach pękania, takie jak na przykład, celulaza, glukanaza lub beta-galaktozydaza, korzystnie jest gdy sensowny gen jest endogennym genem specyficznym dla strefy pękania.
W jednym aspekcie sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku koduje antysensowny RNA, który jest komplementarny do przynajmniej części sensownego mRNA lub sensownego pre-mRNA. Taki antysensowny RNA musi być kierowany do sensownego RNA (lub sensownego pre-mRNA). Pod tym względem kodowany antysensowny RNA zawiera region komplementarny do części sensownego mRNA lub sensownego pre-mRNA, korzystnie do jego ciągłego odcinka długości przynajmniej 50 par zasad, korzystnie przynajmniej pomiędzy 100 i 1000 par zasad. Górną granicą długości regionu antysensownego RnA komplementarnego do sensownego RNA jakiego można użyć jest oczywiście wielkość pełnej długości sensownego pre-mRNA lub wielkość pełnej długości sensownego mRNA (który może powstać lub może nie powstać w wyniku obróbki sensownego pre-mRNA). Jednakże, antysensowny RNA może być komplementarny do dowolnej części sekwencji sensownego pre-mRNA i/lub powstałego sensownego mRNA: może być komplementarny do części bliższej 5'-końca lub miejsca zamykającego, do części nie ulegającego translacji 5'-regionu, do intronu lub egzonu (lub do regionu łączącego egzon i intron) sensownego pre-mRNA, do regionu łączącego region niekodujący i region kodujący, do całego lub części regionu kodującego włączając 3'-koniec regionu kodującego i/lub do całego lub części nie ulegającego translacji 3'-regionu. W przypadku gdy sensowny gen należy do rodziny genów, korzystnie jest gdy antysensowny RNA kodowany przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku zawiera sekwencję, która jest komplementarna do regionu sensownego RNA, na przykład specyficznego dla strefy pękania sensownego RNA, o długości przynajmniej 50 nukleotydów i która ma procent identyczności sekwencji (patrz powyżej) mniej niż 50%, korzystnie mniej niż 30%, z regionem długości 50 nukleotydów dowolnego sensownego RNA kodowanego przez dowolny inny gen należący do tej rodziny.
Transkrybowany region DNA specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego wytworzonego sposobem według wynalazku może kodować specyficzny enzym RNA, tak zwany rybozym (patrz na przykład W089/05852) zdolny do wysokospecyficznego cięcia sensownego mRNA lub sensownego pre-mRNA. Taki rybozym musi być skierowany do sensownego mRNA (lub sensownego pre-mRNA).
Ekspresja endogennego genu wytwarzająca sensowny mRNA w roślinie może być również zahamowana lub zablokowana przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy kodujący część lub cały, korzystnie cały, taki sensowny RNA (Jorgensen i wsp. (1992), Ag. Biotech. News Info. 4: 265N).
Sensownym RNA do którego kierowany jest antysensowny RNA lub rybozym kodowany przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku korzystnie jest mRNA, znamienny tym, że (dwuniciowy) cDNA powstały z takiego
187 026 mRNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1 (lub SEQ ID No 10) lub ich wariantów. Korzystny region cDNA odpowiadający sensownemu RNA do którego kierowany jest antysensowny RNA lub rybozym kodowany przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku, zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1 zaczynającą się gdziekolwiek pomiędzy nukleotydami 890 i 950 i kończącą się gdziekolwiek pomiędzy nukleotydami 1560 i 1620, taką jak na przykład, ale bez ograniczania, sekwencja nukleotydową zawarta pomiędzy nukleotydami 952 i 1607. Inny korzystny region cDNA odpowiadający sensownemu RNA do którego kierowany jest antysensowny RNA lub rybozym kodowany przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku, zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1 zaczynającą się gdziekolwiek pomiędzy nukleotydami 1280 i 1340 i kończącą się gdziekolwiek pomiędzy nukleotydami 1560 i 1620, takąjak na przykład, ale bez ograniczania, sekwencja nukleotydową zawarta pomiędzy nukleotydami 1296 i 1607.
Opisany powyżej specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy kodujący jest antysensowny RNA lub rybozym jest korzystnie pod kontrolą specyficznego dla strefy pękania promotora. Szczególnie użyteczne, specyficzne dla strefy pękania promotory są promotorami specyficznych dla strefy pękania, opisanych powyżej genów, szczególnie promotor zawarty w 5'-regionie regulatorowym SEQ ID No 13 pomiędzy nukleotydami 1 i 2328. Jednakże jeżeli specyficzny dla strefy pękania gen koduje antysensowny RNA i/lub rybozym kierowany do sensownego RNA wytwarzanego przez endogenny gen specyficzny dla strefy pękania, korzystnie gen kodujący endo-poligalakturonazę, nie jest konieczne, żeby promotor specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego był promotorem specyficznym dla komórek strefy pękania. Tym niemniej w takim przypadku promotor specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego powinien kierować jego ekspresją przynajmniej w komórkach strefy pękania. W rzeczywistości, ponieważ sensowny RNA wytwarzany jest selektywnie tylko w komórkach strefy pękania, wytwarzanie antysensownego RNA lub rybozymu kodowanego przez specyficzny dla strefy pękania gen w komórkach innych niż komórki strefy pękania nie ma w takich komórkach zauważalnego efektu fenotypowego. Przykładem takich promotorów kierujących ekspresją przynajmniej w komórkach strefy pękania są konstytutywne, ulegające ekspresji w roślinach promotory, takie jak promotor (p35S) transkryptu 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) (Guilley i wsp. (1982), Celi 30: 763) lub promotor (Pnos) genu syntetazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens (Depicker i wsp. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561).
W innym korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy koduje mRNA, który po wytworzeniu w komórkach rośliny ulega translacji do białka lub polipeptydu które zaburza metabolizm i/lub procesy fizjologiczne komórek roślinnych. W większości przypadków wytwarzanie takiego białka lub polipeptydu nie jest pożądane w komórkach innych niż komórki strefy pękania i w związku z tym korzystnie jest gdy taki chimerowy gen zawiera promotor specyficzny dla strefy pękania. Szczególnie użytecznymi specyficznymi dla strefy pękania promotorami są znów opisane powyżej promotory genów specyficznych dla strefy pękania.
W innym korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku, zawiera transkrybowany region DNA kodujący białko lub polipeptyd, których aktywność zwiększa w komórkach poziom biologicznie aktywnych auksyn lub analogów auksyn. Białka takie mogą na przykład, brać udział w biosyntezie auksyn, tak jak monooksygenaza fryptofanu, i/lub hydrolaza indolo-3-acetyloamidu kodowane odpowiednio przez genl T-DNA (iaaM) i/lub gen2 T-DNA (iaaH) Agrobacterium tumefaciens (Gielen i wsp. (1984), The EMBO J. 3: 835) lub mogą być amidohydrolazami kodowanymi przez gen ILR1 Arabidopsis thaliana, które uwalniają aktywny kwas indolo-3-octowy (IAA) z jego koniugatów (Bartel i Fink (1995), Science 268: 1745). Ze względu na obserwowany spadek poziomu IAA przed pękaniem strąka (patrz przykład 1) uważa się, że wytwarzanie takich auksyn zwiększających poziom białka selektywnie w komórkach strefy pękania rośliny nie będzie ich zabijało z powodu nadprodukcji IAA a raczej spowoduje zachowanie i/lub odtworzenie poziomu IAA do wartości obserwowanych przed spadkiem. To opóźni proces pękania strąka powodując przedłużone zahamowanie przez IAA
187 026 wytwarzania i/lub aktywności enzymów hydrolizujących ścianę komórkową, które są normalnie wytwarzane w strefie pękania.
Alternatywnie transkrybowany region DNA specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego zawiera otwartą ramkę odczytu dla genu rolB Agrobacterium tumefaciens (Fumer i wsp. (1986), Naturę 319: 422)
Ekspresja takiego specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego w komórkach roślin powoduje wzrost wrażliwości komórek roślin na auksyny, dzięki wytwarzaniu w komórkach strefy pękania produktu genu rolB, co z kolei opóźnia normalny spadek stężenia IAA w strefie pękania przed zrzucaniem strąka.
W innym aspekcie sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku zawiera transkrybowany region DNA kodujący białko, którego aktywność zmniejsza wrażliwość komórek w których jest wytwarzane, na etylen. Metodą analizy mutacyjnej znaleziono w roślinach kilka genów biorących udział w drodze przekazywania sygnału pochodzącego od etylenu (na przykład ETR1, ETR2, EIN4, ERS, CTR1, EIN2, EIN3, EIN5, EIN6, HLS1, EIR1, AUX1, EIN7), wiele z tych białek i odpowiadające im geny zostały sklonowane (Chang (1996), TIBS 21:129; Bleecker i Schaller (1996), Plant Physiol. 111: 653). Wiadomo, że ETR1, ETR2, EIN4, ERS kodują białko receptora etylenu, a pozostałe biorą udział w drodze przekazywania sygnału od receptora (Ecker (1995), Science 268: 667). Receptory etylenu które zostały zsekwencjonowane wykazują homologię do domeny przyjmującej sygnał komponentu regulatora odpowiedzi i/lub domeny histydynowej kinazy białkowej komponentu czujnika tak zwanych bakteryjnych dwuskładnikowych regulatorów i dzieli się je na dwie klasy w zależności od wystąpienie braku homologii w domenie przyjmującej sygnał. Receptory etylenowe klasy I zawierające domeny homologiczne do domeny przyjmującej sygnał i domeny czujnika są oznaczone ETR1 (Arabidopsis) i eTAEl (pomidor). Receptory etylenowe klasy II zawierające tylko domenę homologiczną do domeny histydynowej kinazy białkowej komponentu czujnika są oznaczone ERS (Arabidopsis) i NR (pomidor). Receptory kodowane przez zmutowane allele opisanych genów zapewniają komórkom dominującą niewrażliwość na etylen (Chang (1996), TIBS 21: 129; Bleecker i Schaller (1996), Plant Physiol. 111: 653). Przykładem specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego zawierającego transkrybowany region DNA kodujący białko, którego aktywność zmniejsza wrażliwość komórek w których jest wytwarzane na etylen jest gen, który zawiera otwartą ramkę odczytu dla dominującego, niewrażliwego na etylen, zmutowanego allelu genu ETR.1 Arabidopsis thaliana, takiego jak ETR1-1 (Chang i wsp. (1993), Science 262: 539). Roślina w której taki specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy ulega ekspresji wytwarza zmutowany receptor etylenu (białko ETR1-1) wybiórczo w komórkach strefy pękania i komórki te stają się niewrażliwe na hormon roślinny etylen i nie odpowiadają (metabolicznie) na zmiany stężenia tego hormonu, na przykład przez dojrzewanie etylenowe obserwowane przez nastąpieniem procesu pękania strąków Przyjmuje się, że alternatywnie można użyć z tym samym skutkiem transkrybowanego regionu DNA zawierającego otwartą ramkę odczytu dla dominującego, niewrażliwego na etylen, zmutowanego allelu każdego genu wspomnianej wcześniej klasy I receptorów etylenu. Innym przykładem specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego zapewniającego komórkom w których ulega ekspresji niewrażliwość na etylen, jest gen którego transkrybowany region zawiera otwartą ramkę odczytu dla dominującego, niewrażliwego na etylen, zmutowanego allelu każdego genu wspomnianej wcześniej klasy II receptorów etylenu, takich jak gen ERS Arabidopsis thaliana (Hua i wsp. (1995), Science 269: 1712) lub gen NR pomidora (Wilkinson i wsp. (1995), Science 270: 1807), których można użyć z tym samym skutkiem.
Zakłada się także, że inne, wspomniane powyżej produkty genów biorące udział w drodze przekazywania sygnału działają poniżej receptora. Geny CTR1, EIN2 i EIN3 zostały skolonowane (Ecker (1995), Science 268: 667). Modulacja ekspresji tych genów w strefie pękania, na przykład przez antysensowny RNA lub rybozymowy RNA skierowany przeciw wymienionym genom i transkrybowany pod kontrolą specyficznego dla strefy pękania promotora także zmienia wrażliwość na etylen.
187 026
W innym aspekcie sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku zawiera transkrybowany region DNA kodujący białko lub polipeptyd, które jeżeli są wytwarzane w komórkach roślinnych, takich jak komórki strefy pękania, zabijają te komórki a przynajmniej zaburzają ich metabolizm, funkcjonowanie lub rozwój. Przykładem takich transkiybowanych regionów DNA są regiony zawierające sekwencje DNA kodujące rybonukleazy, takie jak RNaza Tl, a szczególnie bamaza (Hartley (1988), J. Mol. Biol. 202: 913); cytotoksyny, takie jak domena-A toksyny błonicy (Greenland i wsp. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6853) lub egzotoksyna A Pseudomonas. Można użyć też innych sekwencji DNA kodujących białka o znanych właściwościach cytotoksycznych. Przykłady obejmują, ale bez ograniczania, sekwencje DNA kodujące proteazy, takie jak papaina; glukanazy; lipazy, takie jak fosfolipaza A2 ; peroksydazy lipidów, metylazy, takie jak Dam metylaza E. Coli; DNazy, takie jak endonukleaza EcoRI; inhibitory wytwarzania ściany komórkowej roślin i tym podobne.
W innym aspekcie sposobu według wynalazku specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku zawiera transkrybowany region DNA kodujący białko lub polipeptyd, które mogą być wydzielane na zewnątrz komórek rośliny i hamują aktywność przynajmniej jednej endo-poligalakturonazy, która jest wytwarzana w strefie pękania (takiej jak strefa pękania strąków), szczególnie endo-poligalakturonazy kodowanej przez cDNA SEQ ID No 1.
Korzystnie jest gdy nieulegający translacji 5'-region kodowanego RNA specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego wytworzonego sposobem według wynalazku jest normalnie połączony z promotorem, takim jak promotor specyficzny dla strefy pękania genu chimerowego. Jednakże, nie ulegający translacji 5'-region może także pochodzić z innego genu ulegającego ekspresji w roślinach. Korzystnie jest gdy specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku zawiera kompletny 5’-region regulatorowy (włączając nieulegający translacji 5'-region) genu specyficznego dla strefy pękania. Szczególnie użyteczny jest 5'-region regulatorowy SEQ ID No 13, zaraz powyżej pozycji 1329, korzystnie przynajmniej 490 par zasad, bardziej korzystnie region rozciągający się pomiędzy pierwszym miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI do pozycji 2329.
Specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku korzystnie zawiera także nieulegający translacji 3'-region, który powoduje właściwą poliadenylację mRNA i zakończenie transkrypcji w komórkach roślin. Taki sygnał można otrzymać z genów roślinnych, takich jak gen poligalakturonazy, lub można je otrzymać także z genów nieroślinnych. Przykłady 3'-sygnałów terminacji transkrypcji i poliadenylacji obejmują gen syntetazy oktopiny (De Greve i wsp. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 499), gen syntetazy nopaliny (Depicker i wsp. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561), lub gen 7 T-DNA (Velten i Schell (1985), Nuci. Acids Res. 13: 6998) i tym podobne.
Korzystnie, zrekombinowany DNA zawierający specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera także wygodny w użyciu chimerowy gen markerowy. Chimerowy gen markerowy zawiera markerowy DNA, który znajduje się pod kontrolą i jest funkcjonalnie połączony 5'-końcem z końcem promotora ulegającego ekspresji w roślinach, korzystnie promotora konstytutywnego, takiego jak promotor CaMV 35S, indukowanego przez światło promotora, takiego jak promotor genu kodującego małą podjednostkę Rubisco, oraz jest funkcjonalnie połączony 3'-końcem z odpowiednimi roślinnymi sygnałami terminacji transkrypcji i poliadenylacji. Gen markerowy korzystnie koduje RNA, białko lub polipeptyd, które jeżeli są wytwarzane w komórkach roślinnych, pozwalają na łatwe oddzielenie tych komórek od komórek w których gen markerowy nie ulega ekspresji. Wybór genu markerowego nie jest sprawą krytyczną i znanymi metodami można wybrać odpowiedni gen markerowy. Na przykład, markerowy DNA może kodować białko, które nadaje wyróżniający się kolor transformowanym komórkom roślinnym, tak jak gen Al (Meyer i wsp. (1987), Nature 330: 677), lub może dawać transformowanym komórkom oporność na herbicydy, tak jak gen bar, kodujący oporność na fosfmotrycynę (EP 02422465) lub może dawać transformowanym komórkom oporność na antybiotyki, tak jak gen aac(6)', kodujący oporność na gentamycynę (W094/01560).
187 026
Uważa się, że specyficzne dla strefy pękania promotory wytworzone sposobem według wynalazku są wysoko specyficzne w odniesieniu do aktywności i działania w kierowaniu ekspresją genów w komórkach strefy pękania. Jednakże charakterystyka (to znaczy specyficzność tkankowa) promotora zawartego w genie chimerowym w niektórych roślinach do których taki chimerowy gen jest transformowany może być lekko zmodyfikowana. Może to wynikać na przykład, z „efektu pozycji”, ze względu na losową integrację z genomem roślinnym.
W pewnych komórkach nienależących do strefy pękania niektórych roślin transformowanych chimerowym genem wytworzonym sposobem według wynalazku, obserwuje się niski poziom ekspresji tego genu chimerowego. Wtedy opcjonalnie genom roślinny transformuje się drugim genem chimerowym zawierającym drugi transkrybowany region DNA będący pod kontrolą drugiego ulegającego ekspresji w komórkach roślinnych promotora i kodujący RNA, białko lub polipeptyd, który jest zdolny przeciwdziałać, zapobiegać lub hamować aktywność produktu specyficznie dla strefy pękania genu chimerowego. Jeżeli specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy koduje bamazę, korzystnie jest gdy drugi chimerowy gen koduje barstar, to znaczy inhibitor bamazy (Hartley (1988), J. Mol. Biol. 202: 913). Innym użytecznym białkiem kodowanym przez drugi gen chimerowy są przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, korzystnie pojedyncze łańcuchy przeciwciał zdolne do specyficznego wiązania się z białkami kodowanymi przez specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i powodujące ich biologiczną inaktywację.
Drugi promotor jest korzystnie zdolny do kierowania ekspresji drugiego transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach nie należących do strefy pękania rośliny co przeciwdziała, zapobiega lub hamuje niepożądane w tych komórkach efekty niskiego poziomu ekspresji specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego. Przykłady użytecznych drugich promotorów obejmują promotor minimalny 35S CaMV, promotor genu syntetazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens T-DNA (Depicker i wsp. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561). Inne użyteczne promotory to promotory genów o których wiadomo, że nie są aktywne w komórkach strefy pękania, takie jak gen Brassica napus kodujący mRNA z którego otrzymany cDNA zawiera sekwencję SEQ ID No 7, SEQ ID No 9, SEQ ID No 11.
Drugi chimerowy gen znajduje się w roślinach korzystnie w tym samym locus co gen chimerowy specyficzny dla strefy pękania co zapewnia ich łączną segregację. Można to osiągnąć łącząc oba geny chimerowe na jednym transformującym DNA, takim jak wektor lub część T-DNA. Jednakże w niektórych przypadkach łączna segregacja nie jest zawsze pożądana. Wtedy oba geny można umieścić na oddzielnych transformujących DNA, tak że w wyniku transformacji otrzyma się dwa konstrukty w różnych lokalizacjach w genomie rośliny.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, roślinę o zmodyfikowanych właściwościach strefy pękania uzyskuje się z jednej komórki transformując tę komórkę w znany sposób, i uzyskując stałe włączenie specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego wytworzonego sposobem według wynalazku do jądrowego genomu roślinnego.
Zrekombinowany DNA zawierający specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy włącza się na stałe w jądrowy genom komórki roślinnej, szczególnie rośliny podatnej na transformację za pomocą Agrobacterium. Przeniesienie genu prowadzi się wektorem, który jest uszkodzonym Ti-plazmidem, zawierającym specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy, wytworzony sposobem według wynalazku i niesionym przez Agrobacterium. Transformację prowadzi się według procedur opisanych, na przykład, w EP 0116718. Ti-plazmid zawiera specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy pomiędzy sekwencjami granicznymi T-DNA, a przynajmniej po lewej stronie od prawej sekwencji granicznej. Alternatywnie do transformacji komórek roślinnych można użyć każdego innego wektora stosując metody takie jak bezpośredni transfer genów (opisany, na przykład w EP 0233247), transformację za pomocą pyłku (opisaną, na przykład w Ep 0270356, W085/01856 i US 46844611), transformację za pomocą roślinnych RNA-wirusów (opisaną, na przykład w EP 0067553 i US 4407956), transformację za pomocą liposomów (opisaną, na przykład w US 4536475) i tym podobne.
Użyteczne są też inne metody, takie jak bombardowanie mikropociskami opisane na przykład, (Fromm i wsp. (1990), Bio/Technology 8: 833 i Gordon-Kamm i wsp. (1990), The Plant Celi 2: 603). Komórki roślin jednoliściennych, takie jak większość zbóż można także
187 026 transformować za pomocą uszkodzonych lub zdegradowanych enzymatycznie normalnych tkanek zdolnych do tworzenia embriogendzj tkanki kallusa, lub embriageddej tkanki kallusa otrzymanej z takich tkanek, jak opisano w W092/09696. Uzyskaną transformowaną roślinę używa się następnie do odtworzenia transformowanej rośliny w tradycyjny sposób.
Uzyskane transformowane rośliny używa się w tradycyjnym schemacie namnażania do wytworzenia większej liczby transformowanych roślin o takiej samej charakterystyce lub w celu wprowadzenia specyficznego dla strefy pękania genu chimerowzga, wytworzonego sposobem według wynalazku do innych odmian tego samego lub zbliżonych gatunków roślin. Nasiona otrzymane z transformowanych roślin zawierają specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony sposobem według wynalazku jako stabilny insert gzdamogy.
Następujące przykłady opisują izolowanie i charakteryzowanie specyficznego dla strefy pękania genu Brassica napus, identyfikację specyficznego dla strefy pękania promotora i użycie tego promotora do modyfikacji właściwości strefy pękania roślin. Jeżeli nie podano inaczej w przykładach, wszystkie techniki ^kombinowania DNA prowadzono według standardowych protokołów opisanych w Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Taboretom Manuał, Secodd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY i w woluminach 1 i 2 Ausubel i wsp. (1994) Current protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardowe materiały i metody badań molekularnych roślin opisano w Plant Molecular Biology Labfax (1993) przez R. D. D. Croy wspólnie opublikowane przez BIOS Sciedtlflc Publicatiads Ltd (UK) i Blackwell Scledtlflc Publications, UK.
W przykładach i w opisie sposobu według wynalazku czyni się odniesienia do następujących sekwencji z Listy Sekwencji:
SEQ ID No 1 : specyficzny dla strefy pękania cDNA kodujący enda-pollgalαkturanazę z Brassica napus SEQ ID No 2 SEQ ID No 3 SEQ ID No 4 SEQ ID No 5 SEQ ID No 6 SEQ ID No 7 SEQ ID No 8 SEQ ID No 9 SEQ ID No 10 SEQ ID No 11 SEQ ID No 12
SEQ ID No 13 oligodukleotyd PG1 oligonukleotyd PG2 aligodukleatya PG3 aligonuklzotyd PG5 fragment PCR BPG32-26 fragment PCR KPG32-8 fragment PCR LPG12-16 fragment PCR LPG32-24 : fragment PCR LPG32-25 : fragment PCR LPG32-32 : T-DNA pGSV5 sekwencja genomowego klonu zawierającego specyficzny dla strefy pękania region promotorowy kierujący ekspresją enaopallgalakturodαze z Brassica napus
Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.
Przykład 1
Charakterystyka pękania strąka w czasie jego rozwoju
Endogenny profil fitohormonalny w czasie rozwoju strąka
Rośliny Brassica napus odmiany Fido hoduje się w nagrzewanej szklarni. 12 dni po wzejściu rośliny przenosi się i dalej hoduje w 1000 cm3 kompostu. Strąki zbiera się w tygodniowych odstępach pomiędzy drugim i ósmym tygodniem od zapylenia. Strąki pobiera się z podstawy jednej kiści z pierwszych trzech rozgałęzień. Strąki dzieli się na strefę pękania, ścianę strąka i nasiona.
Próbki rozdrabnia się w moździerzu za pomocą tłuczka i ekstrahuje przez 16 godzin w temperaturze -20°C całkowitą objętością metanolu. Oczyszczanie i analizę fltoharmadów prowadzi się dokładnie tak jak opisano (Białek i Cohen (1989), Plant Physiol. 90: 398; Pridszd i wsp. (1991), w A Laboratory Guide for Cellular and Molecular Plant Bio^y. Wyd. Negrutiu and Ghani-Chlieni. Birkhauser Verlag, Bapel/Bostad/Bzrlln str. 175-185, str. 323-324; Chauvaux i wsp. (1993), J. Chwmatogr. A 657: 337).
187 026
Różne części strąka (ścianę strąka, strefę pękania i nasiona) bada się pod kątem endogennego stężenia prekursora etylenu kwasu 1-aminocyklopropano-l-karboksylowego (ACC) i jego koniugatów, a także stężenia kwasu indolo-3-octowego (IAA) i jego koniugatów.
Pik powstawania etylenu (zobacz także w Meakin i Roberts (1990), J. Exp. Bot. 41: 1003) obserwuje się tuż przed pękaniem strąka, pik ten jest skorelowany z obserwowanym pikiem stężenia wolnego ACC. Tuż przed otwarciem się strąka obserwuje się też spadek stężenia LAA (formy wolnej i koniugatów), szczególnie w strefie pękania. Ten spadek stężenia IAA jest specyficznie skorelowany ze wzrostem aktywności celulazowej w strefie pękania.
W następnym doświadczeniu wytwarzanie etylenu zostało zahamowane przez traktowanie strąków aminoetoksywinyloglicyną (AVG), kompetytywnym inhibitorem enzymu syntetazy ACC. AVG podaje się 28 dnia po zapyleniu w dawce 500 mg/l. Takie traktowanie powoduje 40-50% zmniejszenie wydzielania etylenu w całym strąku i towarzyszy mu opóźnienie starzenia się ściany strąka o około 4 dni. Zmniejszenie się endogennego stężenia ACC zarówno w strefie pękania jak i w nasionach traktowanych roślin koreluje ze zmniejszeniem się wytwarzania etylenu. W innych analizowanych tkankach (ściana strąka, przegroda, i strefa pomiędzy strefą pękania a ścianą strąka) nie obserwuje się spadku stężenia lub syntezy ACC. Spadek endogennej zawartości IAA w strefie pękania poprzedzający otwarcie się strąka obserwuje się zarówno w doświadczeniach z roślinami kontrolnymi jak i traktowanymi AV G.
Aby stwierdzić czy auksyny biorą udział w rozłupywaniu się strąka, do zmiany poziomu auksyn używa się syntetycznej auksyny kwasu 4-chlorofenoksyoctowego (4CPA). W celu sztucznego podtrzymania wysokiego poziomu stężenia auksyny w czasie dojrzewania, 35 dni po zapyleniu podaje się 4CPA w postaci oprysku z dawce 150 mg/l. Powoduje to znaczne zahamowanie tendencji do rozłupywania strąków (patrz tabela 1), a także opóźnienie starzenia się ściany strąka o około dwa tygodnie. Nie obserwuje się żadnego efektu na stężenie fitohormonów. Jednakże w strefie pękania obserwuje się znaczny spadek aktywności beta-glukanazy.
Wyniki te jasno wskazują na hamujące działanie auksyn na wytwarzanie i aktywność beta-glukanazy.
Spadek poziomu auksyn jest głównym czynnikiem warunkującym rozłupywanie strąków.
Tabela 1: Siła (w 10-3 N) konieczna do zapoczątkowania i utrzymania otwierania się strąka, mierzona testem ugięcia Cantilevera (Kadkol i wsp. (1986), Aust. J. Bot. 34: 595) na strąkach (o wilgotności 8%) rzepaku odmiany Fido. Testowano nietraktowane rośliny, opryskane AVG w celu zmniejszenia poziomu etylenu, lub opryskane 4CPA w celu zmniejszenia spadku poziomu auksyn. (SED: Błąd standardowy, df: stopnie swobody)
| nietraktowane | AVG | 4 CPA | SED | |
| dla zapoczątkowania pękania | 143,6 | 170,8 | 194,9 | 14,40 |
| dla dalszego pękania | 167,1 | 171,4 | 222,6 | 17,21 |
Wykazanie aktywności enzymów degradujących poligalakturonaty w strefie pękania strąka
Strąki rzepaku odmiany Fido zbiera się 6,5 tygodnia po zapyleniu, usuwa się owocolistki i nasiona, a z tkanek otaczających strefę pękania, włączając przegrodę z wiązką tkanki przewodzącej i cienką błonkę rozdzielającą dwie łuski, przygotowuje się surowy ekstrakt enzymatyczny. Ekstrakty następnie bada się pod kątem ich działania na związki polimeryczne (kwasy uronowe) używając testu zmiany rozkładu masy cząsteczkowej, opartego na chromatografii żelowej. Substrat gotuje się (i używa jako kontrolę) lub inkubuje się z aktywnym preparatem enzymatycznym. Test ten wykrywa enzymy o aktywności typu endo, ponieważ usuwanie pojedynczych monosacharydów przez aktywności typu egzo zmienia rozkład masy cząsteczkowej polimerycznego substratu bardzo powoli. Analizę kwasów uronowych prowadzi się dokładnie jak opisano w (Blumenkrantz i Asboe-Hansen (1973), Anal. Biochem. 54: 484). Testu używa się wyłącznie do wykazania obecności aktywności enzymatycznych w sensie jakościowym.
Preparaty strefy pękania strąków rzepaku zawierają wszystkie aktywności enzymatyczne konieczne do całkowitej depolimeryzacji polimerów pektynowych o niskim stopniu metylacji.
187 026
Stwierdzono, że jeden składnik mieszaniny enzymów wyjątkowo działa na polimery poliga-lakturonowe. Wykazano następnie, że ze znanych enzymów roślinnych tylko endo-poligala-kturonaza zdolna jest do zmiany rozkładu masy cząsteczkowej używanych preparatów poli-galakturonowych.
Można stwierdzić, że endo-poligalakturonaza gra istotną rolę w degradacji materiału blaszki środkowej obserwowanej w czasie pękania strąka.
Obserwacje anatomiczne w czasie procesu pękania
Szczegółowe obserwacje struktury tkanek strąka dają więcej informacji o anatomicznych zmianach związanych z biochemicznymi procesami zachodzącymi w strefie dojrzewania. Obserwacje przy użyciu mikroskopu elektronowego wykazały, że degradację komórek parenchymatycznych, znajdujących się w strefie pękania, mezokarpie, przegrodzie i strefie zrzucania nasion, poprzedza gwałtowne odwodnienie ściany strąka. Następujące potem rozdzielenie komórek obserwuje się wyłącznie w strefie pękania i ma ono miejsce wzdłuż linii blaszki środkowej. Po nim następuje rozproszenie mikrofibryli ściany komórkowej. W końcu, obserwuje się rozdzielenie wszystkich komórek strefy pękania podczas gdy dwa zawiasy strąka pozostają związane tylko wiązkami przewodzącymi, które przechodzą przez strefę pękania. Analiza metodą mikroskopii elektronowej wykazała, bardzo dramatyczną degradację blaszki środkowej w czasie otwierania się strąka, podczas gdy pierwotna ściana komórkowa pozostała w zasadzie niezmieniona, poza niewielkim zmniejszeniem się grubości i twardości. Obserwacje te wykazały, że procesy zachodzące w ścianie pierwotnej są następstwem degradacji blaszki środkowej.
Całkowite rozpuszczenie komórek blaszki środkowej w strefie pękania wykazuje obecność enzymów rozkładających pektyny, takich jak endo-poligalakturonaza. Podczas gdy enzymy te degradują naładowaną część pektyn blaszki środkowej, inne hydrolazy polisacharydów wykazujące powinowactwo do obojętnych polimerów, biorą udział w całkowitej depolimeryzacji blaszki środkowej.
Oczyszczono do homogenności beta-galaktanazę i beta-glukanazę. Szczegółowe badania specyficzności substratowej wykazały, że enzymy te biorą udział w zmniejszaniu grubości komórkowej ściany pierwotnej w strefie pękania.
Przykład 2
Izolacja specyficznego dla strefy pękania cDNA klonu endo-poligalakturonazy z Brassica napus
Poli-A+ mRNA ze strefy pękania strąka Brassica napus odmiany Topaz otrzymuje się w sposób następujący. Dwadzieścia gramów tkanki (liści, strefy pękania, ściany strąka, korzeni lub łodygi) rozdrabnia się w ciekłym azocie i homogenizuje przez 30 sekund w młynie Waringa w 100 ml buforu do ekstrakcji (4M cyjanosiarczek guanidyny, 25 mM cytryniam sodowy, pH 7,0, 0,5% sarkozyl, 0,1 M 2-merkapto-etanol). Homogenat przenosi się do świeżej probówki i dodaje się 1/10 objętości 2M octanu sodowego, pH 4,0 i 1 objętość nasyconej buforem TE mieszaniny fenol/chloroform. Roztwór intensywnie wytrząsa się, oziębia na lodzie przez 15 minut i wiruje przez 15 minut w temperaturze 4°C przy szybkości 10000 x g. Nadsącz ekstrahuje się ponownie mieszaniną fenol/chloroform jak opisano powyżej. Do ponownie ekstrahowanego nadsączu dodaje się równą objętość izopropanolu i wytrąca się RNA przez całonocną inkubację w temperaturze -20°C. Po odwirowaniu przez 15 minut w temperaturze 4°C przy szybkości 10000 x g, osad RNA rozpuszcza się w 2 ml buforu do denaturacji. Dodaje się 14 ml 4M LiCl i roztwór trzyma się w łaźni lodowej przez noc. RNA zbiera się przez odwirowanie przez 15 minut przy szybkości 10000 x g, przemywa 80% etanolem, suszy i rozpuszcza w 1 ml wody. Poly-A+ RNA izoluje się na kolumnie oligo-d(T) sepharose według zaleceń producenta (Boehringer Mannheim).
Losową syntezę pierwszego łańcucha cDNA lub syntezę pierwszego łańcucha cDNA przy użyciu oligo-d(T)-primerów prowadzi się przy użyciu według zaleceń producenta odwrotnej transkryptazy M-MLV (Life Technologies/BRL) i 6 jig całkowitego poli-A+ RNA otrzymanego tak jak opisano powyżej. Pierwszego łańcucha cDNA używa się jako matrycy do następnych reakcji PCR.
187 026
Cztery zdegenerowane primery projektuje się w oparciu o konserwowane regiony opublikowanych sekwencji aminokwasowych poligalakturonazy (PG) dla pomidora (DellaPenna i wsp. (1986), Nuci. Acids Res. 14:8595), kukurydzy (Niogret i wsp. (1991), Plant Mol. Biol. 17: 1155), avocado i Oenothera (Brown i Crouch (1990), The Plant Celi 2: 263). Sekwencje czterech użytych primerów (PG1, PG2, PG3, PG5) pokazano na SEQ ID No 2-5. Na 5'-końcu primerów PG1 i PG3 wprowadzono miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI, a na 5'-końcu primerów PG2 i PG5 wprowadzono miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BamHI.
Wszystkie reakcje PGR miały następujący skład: 50 mM KC1 10 mM Tris-HCl, pH 8,3,
1,5 mM MgCl2 i 0,001% (wagowo/objętościowy) żelatyny, 100 pmoli zdegenerowanych primerów i 1 U Taq DNA polimerazy w całkowitej objętości reakcji równej 50 μΐ. Po wstępnej denaturacji matrycy DNA w temperaturze 95°C przez 3 minuty w 1x bufor PCR, zapoczątkowuje się reakcję PCR dodając 1 U Taq DNA polimerazy w 1x bufor PCR (PCR z gorącym startem). Reakcje prowadzi się w następujących warunkach: 1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 45°C, 1 minuta w temperaturze 72°C przez 35 cykli następnie 3 minuty w temperaturze 72°C. W zagnieżdżonym PCR z gorącym startem używa się 2 μl pierwszej reakcji PCR jako matrycy dla nowej reakcji. Produkt PCR ekstrahuje się chloroformem, wytrąca etanolem, rozpuszcza w TE i trawi enzymem restrykcyjnym BamHI i EcoRI. Strawione produkty PCR oczyszcza się z agarozy o niskim punkcie krzepnięcia i klonuje do plazmidu pGEM-7 z przeciętego BamHI i EcoRI. Sekwencję fragmentów PCR oznacza się metodą terminacji łańcucha za pomocą dwudezoksynukleotydów używając zestawu Sequenase wersja 2.0 (Pharmacia).
Najdłuższy fragment PCR uzyskano stosując kombinację primerów PG1/PG5. W zagnieżdżonym PCR z gorącym startem używa się kombinacji primerów PG3/PG2, PG1/PG2, PG3/PG5 i używając jako matrycy niewielkiej ilości produktów reakcji PCR z primerami PG1/PG5. Sekwencjonując produkty PCR zidentyfikowano siedem różnych związanych z PG klonów co wskazuje na istnienie przynajmniej siedmiu różnych izoform PG. Trzy różne formy otrzymuje się tylko z jednej tkanki, konkretnie Ipg32-25 (SEQ ID No 10) ze strefy pękania, kpg32-8 (SeQ ID No 7) ze ścian strąka i bpg32-26 (SEQ ID No 6) z liści. Lpg32-32 (SEQ ID No 11) i Ipg32-24 (SEQ ID No 9) znaleziono w dwóch tkankach strąka, a Ipgl2-16 (SEQ ID No 8) uzyskuje się ze wszystkich trzech badanych tkanek. Należy zauważyć, że Ipg35-8 (zawierająca sekwencję DNA SEQ ID No 1 od pozycji 884 do 1245) jest jedyną formą znalezioną w strefie pękania jeżeli używa się reakcji zagnieżdżonego PCR, używa się kombinacji primerów PG3/PG5.
Ekspresję związanego z PG klonu PCR Ipg35-8 w korzeniach, łodygach, liściach i częściach podliścieniowych i w czasie rozwoju strąka bada się metodą Northern bloting. Całkowity RNA z pojedynczych tkanek rozdziela się metodą elektroforezy na żelu 0,66 M formaldehyd/1% agaroza (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). RNA przenosi się na błonę Hybond-N i wiąże z błoną promieniowaniem UV. Błonę prehybrydyzuje się przez 4 godziny z 5 x Denhardt, 25 mM Na2HPO4, 25 mM NaH2PO4, 0,1% pirofosforanu, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA i 100 μg zdenaturowanego DNA nasienia śledzia w temperaturze 68°C. Produkty PCR znakuje się radioaktywnie i denaturuje cieplnie, a następnie dodaje się bezpośrednio do buforu do prehybrydyzacji i hybrydyzuje przez 16 godzin w temperaturze 68°C. Błonę płucze się sposobem opisanym przez (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), a ostatnie płukanie prowadzi się w temperaturze 68°C w 0,2 x SSC, 0,1% SDS. Błony poddaje się autoradiografii w temperaturze -80°C stosując ekran wzmacniający.
Nie znaleziono żadnych transkryptów hybrydyzujących do klonu Ipg35-8 w całkowitym RNA wyizolowanym z korzeni, łodyg, liści i części podliścieniowych. Jednakże, klon Ipg35-8 hybrydyzuje z 1,6-1,7 par zasad transkryptem, który ulega ekspresji wyłącznie w strefie pękania we wszystkich badanych etapach rozwoju i gwałtownie się zwiększa jego ilość po 5 tygodniu.
Przy użyciu 5 μg poli-A+ RNA ze strefy pękania 6 tygodni po zapyleniu konstruuje się w wektorze insercyjnym Lambda ZAP®II (Stratagen) bibliotekę specyficznego dla strefy pękania
187 026 cDNA. cDNA większe niż 1000 par zasad oczyszcza się z agarozy o niskim punkcie krzepnięcia i łączy z wektorem Lambda ZAP®II. Biblioteka pierwotna zawiera 1,25 x 106 pfu, a średnia wielkość insertu wynosi około 1,5 kilopar zasad. Przegląd biblioteki prowadzi się według standardowych metod w warunkach wysokiej siły jonowej opisanych (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
cDNA sekwencjonuje się przy użyciu Seąuenase v.2.0 (Amersham). Analizę sekwencji prowadzi się za pomocą pakietu oprogramowania do analizy sekwencji GCG v. 7 (Devereux i wsp. (1984), Nuci. Acids Res. 12: 387).
Analizując 300000 łysinek przy użyciu fragmentu PCR Ipg35-8 jako sondy dało około 200 pozytywnych sygnałów hybrydyzacji. Pięć silnie hybrydyzujących łysinek oczyszczono do homogenności. Po wycięciu insertu DNA wektora lambda, przeprowadzona analiza za pomocą enzymów restrykcyjnych wykazała, że wszystkie oprócz jednego inserty cDNA mają około 1600 par zasad DNA. Jeden insert miał tylko 1300 par zasad. Mapowanie restrykcyjne czterech największych insertów cDNA (oznaczonych jako X, 5, 9 i 11) wykazało, że różnią się one tylko nieznacznie.
Najważniejsza jest obecność miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny Nsil w cDNA klonów X i 11, oraz obecność miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny HindII w cDNA klonu 9. Żadne z tych miejsc nie występuje w cDNA klonu 5. Częściowa analiza sekwencji 5' i 3' końców cDNA wykazała występowanie dodatkowych wariancji sekwencji, włączając małe delecje i insercje w różnych klonach. Wyniki te wskazują, że w strefie pękania zachodzi ekspresja różnych genów kodujących PG, jednak charakteryzujących się wysoką homologią. Dane otrzymane ze strefy pękania wykazały także, że 4 większe inserty cDNA zawierają kompletne sekwencje kodujące białko PG.
Kompletna sekwencja cDNA klonu X i jego przewidywana sekwencja aminokwasowa jego największej otwartej ramki odczytu pokazana jest w SEQ ID No 1. Otwarta ramka odczytu koduje białko wielkości 433 aminokwasów o szacunkowej masie cząsteczkowej równej 46,6 kD i znacznym podobieństwie do znanych poligalakturonaz. Podobnie jak inne hydrolazy ściany komórkowej znaleziona specyficzna dla strefy pękania endo-PG jest początkowo wytwarzana jako nieczynna forma wyjściowa, zawierająca N-końcowy peptyd, który jest odcinany w czasie translacji. Najbardziej prawdopodobne miejsce cięcia znajduje się pomiędzy aminokwasami 23 i 24, a w wyniku tego powstaje dojrzałe białko o szacunkowej masie cząsteczkowej 44,2 kD.
Analiza metodą Northern bloting przy użyciu jako sondy cDNA klonu X potwierdziła wcześniej otrzymany wzór ekspresji. Całkowity RNA wyizolowano tak jak opisano wcześniej z różnych tkanek strąka (strefy pękania, ścian strąka, nasion i przegrody) w 5 różnych punktach czasowych (2, 3, 5, 7 i 9 tygodni po zapyleniu). 5 pg całkowitego RNA rozdziela się na żelu metodą elektroforezy i hybrydyzuje się ze znakowanym izotopowo cDNA SEQ ID No 1 użytym jako sonda w warunkach wysokiej siły jonowej jak opisano powyżej. Autoradiogram wywołuje się po całonocnej ekspozycji. 2 tygodnie po zapyleniu nie stwierdzono występowania żadnego sygnału, a 3 tygodnie po zapyleniu stwierdzono występowanie słabego sygnału. W oparciu o odczyty densytometryczne poziom ekspresji zmierzony 5 tygodni po zapyleniu był 3,5 raza większy niż poziom znaleziony 3 tygodnie po zapyleniu, poziom ekspresji zmierzony 7 tygodni po zapyleniu był 7 razy większy niż poziom znaleziony 3 tygodnie po zapyleniu, poziom ekspresji zmierzony 9 tygodni po zapyleniu był 12 razy większy niż poziom znaleziony 3 tygodnie po zapyleniu. Nie wykryto żadnego sygnału w ścianach strąka i nasionach. Słabą ekspresję (porównywalną z poziomem ekspresji w strefie pękania 3 tygodnie po zapyleniu) stwierdzono w przegrodzie 9 tygodni po zapyleniu.
RNA użyty w tym doświadczeniu ekstrahuje się z odpowiednich tkanek rośliny, której strąki rozwijały się około 9 tygodni po zapyleniu.
Przykład 3
Izolacja promotora specyficznego dla strefy pękania z klonu genomowego DNA B. napus odpowiadającego cDNA klonu Ipg35-8
Dostępną w handlu bibliotekę genomową lambda EMBL3 Brassica napus cv Bridger (Clontech Laboratories Inc.) w Escherichia coli szczepie NM538 przegląda się jak następuje.
187 026
Po przeniesieniu na błonę Hybond-N Ipg35-8 cDNA znakuje się radioaktywnie metodą losowych primerów i błonę hybrydyzuje się w warunkach wysokiej siły jonowej w 5 x SSPE, 5 x Denhardt, 0,5% SDS, 50 pg/ml DNA nasienia śledzia (1 x SSPE: 0,18 M NaCl, 10 mM fosforan sodowy, pH 7,7, 1 mM EDTA) i płucze się w warunkach wysokiej siły jonowej (ostatnie płukanie w temperaturze 68°C, 1 x SSPE, 0,1% SDS). Przejrzano około 600000 łysinek i wyizolowano 11 dających pozytywny sygnał hybrydyzacji. Dwie łysinki lambda 2 i lambda 11 zbadano dwa razy. Drugie badanie lizatów fagowych wykonano dla lambda 2 i lambda 11 z E.coli NM538 rosnących na podłożu bez maltozy. Preparaty DNA z łysinki lambda 2 i lambda 11 trawi się SalI i po poddaniu elektroforezie przenosi się na bonę nylonową Hybond N. Hybrydyzacja ze znakowanym cDNA klonu Ipg35-8 dała taki sam wzór hybrydyzacji dla obu klonów. Silnie hybrydyzujący fragment SalI wielkości 6,3 par zasad izoluje się z lambda 11 i włącza się w pUC18, tak powstaje wzorcowy klon 6.3Sal. W celu potwierdzenia podobieństwa 6.3Sal do Ipg35-8, zaprojektowano primer do sekwencjonowania umożliwiający stwierdzenie czy w badanym klonie występuje fragment DNA kodujący dwa unikalne dla Ipg35-8 aminokwasy. Sekwencjonowanie metodą dwudezoksynukleotydów Sangera potwierdziło, że wyizolowany klon genomowy 6.3Sal jest pod tym względem identyczny z Ipg35-8 cDNA. Mapowanie restrykcyjne wykazało, że klon ten pokrywa całą otwartą ramkę odczytu Ipg35-8 i zawiera około 100 do 200 par zasad więcej poniżej końca Ipg35-8 i około 3,5 kilopar zasad więcej powyżej. Sekwencję DNA fragmentu około 2,3 kilopar zasad (włączając promotor, nie ulegający translacji 5'-region i pierwsze 24 nukleotydy otwartej ramki odczytu) określono i przedstawiono w SEQ ID No 13.[m7]
Biorąc pod uwagę fakt, że cDNA klonu SEQ ID No 1 i klon genomowy (SEQ ID No 13) wyizolowano z różnych odmian B. napus (odpowiednio odmiany Topaz i odmiany Bridger) jest zupełnym zaskoczeniem, że po porównaniu sekwencji wspólne fragmenty wykazują 100% identyczność.
Miejsce startu transkrypcji genu specyficznego dla strefy pękania odpowiadające genowi zawartemu w klonie 6.3Sal określa się ogólnie znanymi w sztuce technikami, takimi jak analiza wydłużania primerów (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) lub RACE-PCR (Innis i wsp. (1990) PCR Protocols: A Guaide to Methods and Applications, Academic Press Inc.). 5'UTL znajduje się pomiędzy pozycją 2219 i 2227 w SEQ ID No 13.
Przy użyciu dobrze znanych technik skierowanej miejscowo mutagenezy (Ausubel i wsp. (1994) Current protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA ) modyfikuje się sekwencje DNA w celu stworzenia unikalnych miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne (na przykład, Ncol) w pobliżu kodonu startu translacji ATG kodowanej sekwencji. Pozwala to na bezpośrednie połączenia regionu promotorowego genu specyficznego dla strefy pękania interesującą sekwencją DNA w celu stworzenia sposobem według wynalazku specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego. Wykorzystując unikalne miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, umieszczone 500 do 2000 par zasad powyżej (to znaczy w kierunku 5') unikalnego miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny, znajdującego się w pobliżu kodonu startu translacji ATG, można wyizolować dobrze zdefiniowany fragment DNA, którego następnie używa się jako kasety promotorowej, nazywanej dalej PDZ, która kontroluje w roślinach specyficzną dla strefy pękania ekspresję.
Na przykład, fragmentu SphI-Ncol (około 2,08 kilopar zasad, który jest zdolny do kontrolowania w roślinach specyficznej dla strefy pękania ekspresji używa się jako kasety promotorowej, nazywanej dalej PDZ1.
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ lub PDZ1-gus-3'nos) zawierający następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 : 5'-region regulatorowy zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- gus : fragment DNA kodujący beta-glukuronidazę (Jefferson i wsp. (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 8447)
- 3'nos : nie ulegający translacji 3'-region zawierający miejsce poliadenylacji genu syntetazy nopaliny („3'nos”) (Depicker i wsp. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561).
187 026
Drugą kasetę promotorową, która jest zdolna do kontrolowania w roślinach specyficznej dla strefy pękania ekspresji uzyskuje się stosując dobrze znane techniki skierowanej miejscowo mutagenezy do modyfikacji sekwencji DNA w celu stworzenia unikalnych miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne w pobliżu kodonu startu translacji ATG kodowanej sekwencji. W tym celu utworzono miejsce Smal zaraz powyżej kodonu ATG, zmieniając nukleotydy A SEQ ID No 13 w pozycji 2327 i 2328 na nukleotydy G. Fragment SphI-Smal wielkości około 2,1 kilopar zasad nazywany dalej kasetą promotorową PDZ2 łączy się miejscem Smal powyżej regionu kodującego genu GUS w plazmidzie pB1101 (Clontech Laboratories, Inc CA, USA), tak powstaje plazmid (2.1gusgem7) zawierający chimerowy konstrukt PDZ2-gus-3'nos.
Konstruuje się chimerowy selektywny gen markerowy PS-SU-bar-3'ocs (De Almeida i wsp. (1989), Mol. Gen. Genet. 218: 78). Zawiera on następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PSSU : region promotorowy genu kodującego małąpodjednostkę 1Akarbo.ksylazy rybulo-zo-1,5-dwufosforanu z Arabidopsis thaliana (Krebbers i wsp. (1988), Plant Mol. Biol. 11: 745),
- bar : region genu bar kodujący acetylotransferazę fosfinotrycyny (Thompson i wsp. (1987), The EMBO J. 6: 2519)
- 3’ocs : nie ulegający translacji 3'-region zawierający miejsce poliadenylacji genu syntazy oktopiny (De Greve i wsp. (1983), J. Mol. Appl. Genet. 1: 499).
Alternatywnie, konstruuje się gen PSSU-bar-3' g7 zawierający identyczne fragmenty jak poprzedni markerowy gen chimerowy, ale 3'ocs fragment zastępuje się nieulegającym translacji 3'-regionem zawierającym miejsce poliadenylacji T-DNA genu 7 (3'g7; Velten i Schell (1985), Nuci. Acid. Research, 13: 6981).
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ2-gus-3'nos, wycięty jako HindIII-XhoI fragment o wielkości około 4,2 kilopar zasad) i markerowy gen chimerowy (PSSU-bar-3'g7) wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5. Powstający wektor plazmid pTCO155 zawiera geny chimerowe PDZ2-gus-3'nos i pSsuAra-bar-3'g7 pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami granicznymi T-DNA. PGSV5 otrzymuje się z plazmidu pGsC1700 (Comelissen i Vandewiele '(1989), Nuci. Acids Res. 17: 833) ale różni się od niego tym, że nie zawiera genu beta-laktamazy i że jego T-DNA ma sekwencję SEQ ID No 12.
Przykład 4
Konstrukcja genu chimerowego zawierającego gen bamazy pod kontrolą promotora endo-PG
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy fPDZ-bamase-3'nos lub PDZl-bamase-3'nos lub PDZ-bamase-3'nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- bamase : fragment DNA kodujący bamazę Bacillus amyololiquefaciens (Hartley (1988), J. Mol. Bio. 202: 913)
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen chimerowy PSSU-bar-3'g7 lub PSSU-bar-3'ocs wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Gen PDZ2-bamase-3'nos pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami granicznymi T-DNA otrzymuje się przez zamienienie promotora pTA29 powyżej regionu kodującego bamazę i pTC099 przez kasetę promotorową PDZ2. Fragment SphI-Smal wielkości 2,1 kilopar zasad (z wypełnionymi końcami DNA) zawierający PDZ2 łączy się końcem Smal z wypełnionym miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny Ncol nakładającym się na kodon AGT, który został zmieniony w 5' końcu sekwencji kodującej dojrzałego genu bamazy w pTC099. Powstający wektor plazmidowy pTPRl zawiera gen chimerowy PDZ2-bamase-3'nos pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami granicznymi T-DNA. T-DNA jest częścią wektora pTC099, pochodzi z wektora pGSV5 i otrzymuje się jego przez wstawienie linkera EcoRI (GGAATTCC) w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Smal polilinkera, i wstawienie
187 026 linkera Bglll (CAGATCTG) w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Ncol polilinkera, a następnie wprowadzenie genu chimerowego pSSUAra-bar-3'7g z pTCO113 (WO95/26283) w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI polilinkera. Po wprowadzeniu markerowego genu chimerowego pSSUAra-bar-3'7g do sekwencji polilinkera z pTPRl pomiędzy powtarzające się sekwencje graniczne T-DNA powstaje pTPR4.
Przykład 5
Konstrukcja genu chimerowego zawierającego T-DNA gen 1 wytwarzający produkt genu rolB
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-gi-3'nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorów}' według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- gi : fragment DNA kodujący gen 2-monooksygenazy tryptofanu z Agrobacterium tumefaciens (iaaM lub produkt genu 1 T-DNA) (Gielen i wsp. (1984), EMBO J. 3: 835), wytworzony metodą reakcji łańcuchowej polimerazy, przy użyciu odpowiednio zaprojektowanych primerów zawierających sekwencje odpowiednio identyczne i komplementarne do sekwencji flankujących gen 1
- 3'nos
Konstruuje się drugi specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-g2-3* nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- g2 : fragment DNA kodujący gen hydrolazy indolo-3-amidooctanu z Agrobacterium tumefaciens (iaaH lub produkt genu 2 T-DNA) (Gielen i wsp. (1984), EMBO J. 3: 835), wytworzony metodą reakcji łańcuchowej polimerazy, przy użyciu odpowiednio zaprojektowanych primerów zawierających sekwencje odpowiednio identyczne i komplementarne do sekwencji flankujących gen 2
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-gi-31 nos pojedynczo lub w kombinacji z PDZ-g2-3'nos) i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bąr-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Konstruuje się następny specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-rolB-3'nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- rolB : otwartą ramkę odczytu genu rolB Agrobacterium rhizogenes (Fumer i wsp. (1986), Naturę 319: 422)
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Przykład 6
Konstrukcja genu chimerowego kodującego zmutowany gen receptora etylenu ETR1-1
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-etrl-1-3 nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- etrl-1 : otwartą ramkę odczytu dla dominującego, niewrażliwego na etylen, zmutowanego allelu genu ETR Arabidopsis thaliana (Chang i wsp. (1993), Science 262: 539) wyizolowanego jako fragment wielkości 2,7 kilopar zasad, zawierający egzony sekwencji kodującej rozdzielone 5 intronami i uzyskany metodą amlifikacji PCR z plazmidu zawierającego EcoRI fragment wielkości 7,3 kilopar zasad zmutowanego allelu etrl (Chang i wsp. (1993), Science 262: 539) przy użyciu odpowiednio zaprojektowanych primerów
187 026
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Przykład 7
Konstrukcja specyficznego dla strefy pękania genu chimerowego kodującego antysensowny RNA komplementarny do mRNA z którego można otrzymać cDNA o sekwencji SEQ ID No 1
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-anti-PG-1 -3'nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- anti-PG-1: fragment DNA kodujący gen RNA, który jest komplementarny do RNA kodującego region SEQ ID No 1 pomiędzy nukleotydami 10 i 1600.
- 3'nos
CaMV35S promotor 35S-antysensownego konstruktu PG zawierający sekwencję cDNA komplementarną do kompletnej sekwencji SEQ ID No 1 umieszczoną pomiędzy CaMV35S promotorem i sygnałem poliadenylacji (jak opisano poniżej), usuwa się wycinając enzymami restrykcyjnymi HincI i Xhol i zastępuje fragmentem zawierającym PDZ2.
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-anti-PG-2-3'nos), który zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- anti-PG-2 : fragment DNA kodujący gen RNA, który jest komplementarny do RNA kodującego region SEQ ID No 1 pomiędzy nukleotydami 20 i 700
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Konstruuje się specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy (PDZ-anti-PG-3-3 nos), który zawiera on następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA:
- PDZ lub PDZ1 lub PDZ2 : 5'-region regulatorowy według przykładu 3, zawierający specyficzny dla strefy pękania promotor
- anti-PG-3 : fragment DNA kodujący gen RNA, który jest komplementarny do RNA kodującego region SEQ ID No 1 pomiędzy nukleotydami 800 i 1600
- 3'nos
Oba geny, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce polilinkera pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Konstruuje się trzy inne konstrukty zawierające CaMV35S promotor, zawierający sekwencję cDNA komplementarną do kompletnej sekwencji SEQ ID No 1, lub sekwencję cDNA komplementarną do 679 par zasad od 3'-końca sekwencji SEQ ID No 1 (A67) lub sekwencję cDNA komplementarną do 336 par zasad od 3'-końca sekwencji SEQ ID No 1 (A30) i sygnał poliadenylacji. cDNA klonu X z biblioteki cDNA wycina się jako EcoRI-XhoI fragment i wstawia się do wektora pBluescript® (Stratagene, CA USA). Z tego plazmidu izoluje się pełnej długości cDNA jako BamHI-XhoI fragment i wstawia się do wektora pRT100 trawionego EcoRI-XhoI (Topfer i wsp. (1987) Nucleic Acid Research 15: 5890), pomiędzy CaMV35S promotor i sygnał poliadenylacji. Powstający plazmid trawi się BamHI i RcoRI, traktuje polimerazą Klenowa i łączy się ze samym sobą.
HaeII-XhoI fragment plazmidu pBluescript® z insertem cDNA zawierającym 679 par zasad od 3'-końca SEQ ID No 1 wstawia się do wektora pRTlOO trawionego Smal-Xhoł, pomiędzy CaMV35S promotor i sygnał poliadenylacji, tak powstaje plazmid A67.
187 026
Plazmid A67 trawi się Xbal i Styl, traktuje po^erazą Klenowa i łączy się ze samym sobą, tak powstaje plazmid A30, zawierającym sekwencję DNA komplementarną do 336 par zasad od 3'-końca SEQ ID No 1, wstawioną pomiędzy CaMV35S promotor i sygnał polladedelacji. Gen chimerowy izoluje się jako fragment Pstl.
35S-antysensowny-PG gen chimzrawe i markerowy gen PSSU-bar-3'ocs lub chimerowy PSSU-bar-3'g7 wprowadza się w miejsce palllinkzrα pomiędzy dwie sekwencje graniczne wektora T-DNA pGSV5 jak w przykładzie 4.
Przykład 8
Transformacja rzepaku i charakterystyka transformantów
Transformacja za pomocą Agrobacterium
Pobiera się wycinki części padliśclzniowych Brassica napus, hoduje i transformuje dokładnie tak jak opisał De Błock i wsp. ((1989), Plant Physiol. 91: 694) z następującymi modyfikacjami:
- wycinki części podllścienlogych hoduje się wstępnie przez 3 dni w podłożu A2 (MS, 0,5 g/l Mes, pH 5,7), 1,2% glukozy, 0,5% agarozy, 1 mg/l 2,4-D, 0,25 mg/l kwasu naftaleno-octowego (NAA) i 1 mg/l 6-bedzyloamlnapurede (BAP).
- podłoże do infekcji A3 zawiera MS, 0,5 g/l Mes, (pH 5,7), 1,2% glukozy, 0,1 mg/l NAA i 0,75 mg/l BAP i 0,01 mg/l glberellnawego (GA3).
- podłoże do selekcji A5 zawiera MS, 0,5 g/l Mes, (pH 5,7), 1,2% glukozy, 40 mg/l adeniny · SO4, 0,5g/l pollwlneloplrollaede (pVp), 0,5% agarozy, 0,1 mg/l NAA, 0,75 mg/l BAP i 0,01 mg/l GA3, 250 mg/l kαrbzdlcellne, 250 mg/l triacyliny, 0,5 mg/l AgNO3.
- podłoże do regeneracji A6 zawiera MS, 0,5 g/l Mes, (pH 5,7), 2% sacharozy, 40 mg/l adeniny · SO4, 0,5g/l PVP, 0,5% agarozy, 0,0025 mg/l BAP i 250 mg/l triacyliny.
- zdrowe siewki przenosi się do podłoża wspomagającego wytwarzanie korzeni. A8; 100-130 ml MS o stężeniu x 0,5, 1% sacharozy (pH 5,0), 1 mg/l kwasu izomasłowego (IBA), 100 mg/l trlacylidy dodaje się do 300 ml perlite (pH końcowe 6,2) w 1 litrowych naczyniach.
MS oznacza podłoże Murashige-Skooga (Murashige i Skoog (1962), Physiol. Plant. 15 : 473).
Wycinki części poaliśclzdlawych infekuje się szczepem C58ClRifR Agrobacterium tumefacizds niosącym:
- helperowy plazmid-Ti, taki jak pGV4000, który jest wyprowadzony z plazmidu pMP90 (Kończ i Schell (1986), Mol. Gen. Genek 204: 383) i został otrzymany przez wstawienie do pMP90, bakteryjnego genu oporności na chloramfenikol połączonego z fragmentem wielkości 2,5 kilopar zasad mającym homo^ię do T-DNA wektora pGSV5.
- T-DNA wektor pochodzący z pGSV5 zawierający pomiędzy sekwencjami granicznymi T-DNA specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony według przykładów 3, 4, 5, 6 lub 7 i chimerowy gen markerowy'.
Wyselekcjonowanych z tych tradsformadtów linii posiadających jeden typ genów chimerowych wytworzonych sposobem według wynalazku, używa się później do krzyżowania, aby otrzymać nowe linie zawierające kombinacje genów chimerowych wytworzonych sposobem według wynalazku.
Charakterystyka transformantów
Transformowane rośliny Brassica napus wytworzone w przykładzie 8 zawierały w swoim genomie jądrowym w różnych tkankach, specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony według przykładu 3, co zostało stwierdzone tradycyjnymi histochemicznymi technikami in situ (De Błock i Debrouwer (1992), The Plant Journal 2: 261; De Błock i Debrouwer (1993), Planta 189: 218). Wysoką aktywność GUS stwierdza się tylko w warstwie strefy pękania strąka, na co wskazuje silne wybawienie, podczas gdy nie stwierdza się wybawienia tła w innych tkankach strąka, co wskazuje, że promotor wytworzony w przykładzie 3 kontroluje ekspresję specyficznie w strefie pękania strąka.
187 026
Transformowane rośliny Brassica napus wytworzone w przykładzie 8 zawierające w swoim genomie jądrowym specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy wytworzony według przykładów 4, 5, 6 lub 7 pojedynczo lub w połączeniu, charakteryzuje się pod kątem następujących cech:
1) zmiany procesów fizjologicznych za pomocą analizy zmniejszenia ekspresji docelowego produktu genu (takiego jak hydrolaza ściany komórkowej) lub zmniejszenia jego biochemicznej aktywności (Patrz Blumenkrantz i Asboe-Hansen (1973), Anal. Biochem. 54: 484) przez monitorowanie heterologicznej ekspresji genu (patrz Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) lub przez pomiar w czasie rozwoju rośliny endogennego poziomu IAA i koniugatów IAA (patrz, przykład 1)
2) zmiany budowy anatomicznej strefy pękania i ścian komórkowych w strefie pękania, w czasie starzenia się strąka za pomocą mikroskopii świetlnej, elektronowej mikroskopii transmisyjnej; wielkość rozdzielenia się komórek po otwarciu się strąka za pomocą rozdzielonych powierzchni strąka przy użyciu mikroskopu elektronowego (patrz, przykład 1)
3) zmiany właściwości mechanicznych strefy pękania i oporność roślin na zrzucanie nasion za pomocą analizy oporności na zrzucanie nasion pojedynczych strąków. Można to zrobić testem wspornika opisanym przez Kadkola i wsp. ((1986), Aust. J. Bot. 34: 595). Zamknięte strąki wkłada się jako wspornik do „uniwersalnej maszyny do testowania”, składającej się z wodzika poruszanego przez serwomotor, który przekłada stałą siłę do gniecionego strąka. Zapisuje się siłę potrzebną do zapoczątkowania otwarcia strefy pękania strąka i siłę niezbędną do jej dalszego otwierania. Alternatywnie oznacza się podatność na zrzucanie nasion urwanych strąków, które poddaje się kontrolowanym wibracjom (symulując uderzenie czaszą i podstawą). Wibracje składają się z oscylacji poziomych o stałej amplitudzie w pojemniku wypełnionym stalowymi kulkami w celu polepszenia przenoszenia energii. Jeszcze inną procedurą, określa się podatność na pękanie za pomocą pomiaru tarcia. W tym przypadku, mierzy się siłę tarcia jaka wytwarza się przy wciskaniu klina wzdłuż strefy pękania. Umożliwia to porównanie tkanek strefy pękania w wybranych przykładach oporności.
Pojedyncze wybrane linie poddaje się analizie wydajności na polu. Takie testy polowe, oparte są o hodowlę indywidualnych linii (homozygotycznych pod względem transgeniczności) w dwóch różnych miejscach, w trzech powtórzeniach.
Analiza statystycznie znaczącej liczby strąków z różnych roślin wykazała wzrost oporności strąków na pękanie w stosunku do nietransformowanych roślin kontrolnych.
Nie trzeba podkreślać, że użycie specyficznego dla strefy pękania promotora i zrekombinowanych konstrukcji genetycznych, wytworzonych sposobem według wynalazku nie jest ograniczone do transformacji specyficznych roślin opisanych w przykładach. Taki promotor i zrekombinowane konstrukcje genetyczne są użyteczne do transformowania każdej rośliny uprawnej, w której promotor jest zdolny kontrolować ekspresję genów, korzystnie w których ekspresja ta zachodzi w dużym stopniu w komórkach roślinnej strefy pękania.
Użycie specyficznego dla strefy pękania promotora wytworzonego sposobem według wynalazku nie jest ograniczone do określonych transkrybowanych regionów DNA, wytworzonych sposobem według wynalazku, promotora tego można użyć do kontroli ekspresji każdego obcego genu lub fragmentu DNA w roślinach.
Ponadto, wynalazek nie ogranicza się do specyficznego dla strefy pękania promotora opisanego w powyższych przykładach. Wynalazek obejmuje raczej promotory odpowiadające promotorowi opisanemu w jednym z przykładów i którego można użyć do kontrolowania ekspresji genów strukturalnych specyficznie w komórkach strefy pękania roślin. W rzeczywistości sekwencję DNA specyficznego dla strefy pękania promotora opisanego w przykładach można modyfikować zamieniając niektóre z jego nukleotydów na inne nukleotydy i/lub usuwając i wstawiając pewne nukleotydy, przy założeniu, że takie modyfikacje nie zmienią w zasadniczym stopniu czasu, poziomu i specyficzności tkankowej ekspresji genów kontrolowanych przez ten promotor, mierzonej testem GUS w transgenicznych roślinach transformowanych chimerowym genem gus, pod kontrolą zmodyfikowanego promotora (patrz przykład 3). W promotorze można zmienić do 20% nukleotydów bez zmiany charakterystyki
187 026 promotora. Takie promotory można wyizolować drogą hybrydyzacji w standardowych warunkach (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) przy użyciu wybranych fragmentów SEQ ID No 13, tak jak opisano powyżej.
Wszystkie publikacje (włączając publikacje patentowe) cytowane w tym zgłoszeniu są w nie włączone przez cytowanie.
187 026
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
| APPLIKANT: |
| (A) NAZWA: Plant Genetic Systems |
| (B) ULICA: Jozef Plateaustraat 22 |
| (C) MIASTO: Gent |
| (E) KRAJ: Belgia |
| (F) KOD POCZTOWY : B-0000 |
| (G) TELEFON: 32 9 235 84 54 |
| (H) TELEFAX: 32 9 223 19 23 |
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zrzucanie nasion (iii) LICZBA SEKWENCJI: 13 (iv) FORMA NOŚNIKA KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) BIEŻĄCE INFORMACJE O ZGŁOSZENIU:
NUMER ZGŁOSZENIA: EP 95203328.0 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 1:
187 026 (i) CHARACTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1631 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA dla mRNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 95..1393 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:821..837 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = PG1 /uwaga = region endo-PG cDNA odpowiadający oligonukleotydowi PGl
187 026 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:95..163 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= SP /uwaga = region kodujący przypuszczalny peptyd sygnałowy endo-PG (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:884..900 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= PG3 /uwaga = region endo-PG cDNA odpowiadający oli gonukleotydowi PG3 (ix) CECHA:.
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:1059..1073 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= PG2 /uwaga = region endo-PG cDNA odpowiadający oli gonukleotydowi PG2
| (ix) CECHA: - | ||
| (A) | NAZWA/KLUCZ: - | |
| (B) | LOKALIZACJA:1229..1245 | |
| (D) | INNE INFORMACJE:/nazwa = | PG5 |
| /uwaga = region endo-PG | cDNA odpowiadający oli | |
| gonu kleotydowi PG5 |
187 026 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:
| Ggcacgagaa | aaactgcaaa | gagtctcata | ttagttctta | ctctcaagaa | TCAAACACAC | 60 |
| TCTTTCTAAA | aagattagcg | TTTCAAACCC | cgaaatggcc | cgttgttttg | gaagtctagc | 120 |
| tgttttctta | tgcgttcttt | tgatgctcgc | ttgctgccaa | gctttgagta | gcaacgtaga | 180 |
| tgatggatat | ggtcatgaag | atggaagctt | cgaatccgat | ACTTTAATCA | agctcaacaa | 240 |
| cgacgacgac | gttcttacct | tgaaaagctc | tgatagaccc | actaccgaat | catcaactgt | 300 |
| tagtgtttcg | aacttcggag | ccaaaggaga | tggaaaaacc | gatgatactc | aggctttcaa | 360 |
| gaaagcatgg | aagaaggcat | gttcaacaaa | tggagttact | ACTTTCTTAA | ttcctaaagg | 420 |
| aaagacttat | ctccttaagt | ctattagatt | cagaggccca | tgcaaatctt | tacgtagctt | 480 |
| ccagatccta | ggcactttat | cagcttctac | aaaacgatcg | gattacagta | atgacaagaa | 540 |
| ccactggctt | attttggaag | acgttaataa | TCTATCAATC | gatggcggct | cggcggggat | 600 |
| tgttgatggc | aacggaaata | tctggtggca | aaactcatgc | aaaatcgaca | aatctaagcc | 660 |
| atgcacaaaa | gcgccaacgg | CTCTTACTCT | CTACAACCTA | aagaatttga | atgtgaagaa | 720 |
| tctgagagtg | agaaatgcac | agcagattca | gatttcgatt | gagaaatgca | acaatgttgg | 780 |
| cgttaagaat | gttaagatca | ctgctcctgg | cgatagtccc | aacacggatg | gtattcatat | 840 |
| cgttgctact | AAAAACATTC | gaatctccaa | ttcagacatt | gggacaggtg | atgattgtat | 900 |
| atccattgag | gatggatcgc | aaaatgttca | aatcaatgat | ttaacttgcg | gccccggtca | 960 |
| tgggatcagc | attggaagct | tgggggatga | CAATTCCAAA | gcttatgtat | cgggaattga | 1020 |
| tgtggatggt | gctacgctct | ctgagactga | caatggagta | agaatcaaga | cttaccaggg | 1080 |
| agggtcagga | actgctaaga | ACATTAAATT | CCAAAACATT | cgtatggata | atgtcaagaa | 1140 |
| tccgatcata | atcgaccaga | actactgcga | caaggacaaa | tgcgaacagc | aagaatctgc | 1200 |
| ggttcaagtg | aacaatgtcg | tgtatcagaa | cataaaaggt | acgagcgcaa | cagatgtggc | 1260 |
| gataatgttt | aattgcagtg | tgaaatatcc | atgccaaggt | attgtgcttg | agaatgtgaa | 1320 |
| catcaaagga | ggaaaagctt | cttgcgaaaa | tgtcaatgtt | aaggataaag | gcactgtttc | 1380 |
| tcctaaatgc | CCTTAATTAC | taagctgatt | atgtaatata | cataaatacg | tagtatatnt | 1440 |
| aattatagat | gcatgtatat | cgttatctac | gtattgattc | ttgatatata | tagaaaacta | 1500 |
| aagatatatg | ggaatataca | tacaatagtt | gagataattg | ttgtcttgta | tatgattcac | 1560 |
187 026
TGAAGTTGAT TGCTTGTCCA TGAATAAATG AATAATATCA TTTCTCTAAA AAAAAAAAAA 1620
AAAAAAAAAA A 1631 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis oligonukleotyd PG1 (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada (B) LOKALIZACJA:16 (D) INNE INFORMACJE:/zmodyfikowana_zasada = i /uwaga = N w pozycji 16 oznacza obojętną zasadę inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:
CCAGGAATTC AAYACNGAYG GNRTNCA
187 026 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARACTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = oligonukleotyd PG2 (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (ix) CECHĄ.
(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada (B) LOKALIZACJA:12 (D) INNE INFORMACJE:/zmodyfikowana_zasada = i /uwaga = N w pozycji 12 oznacza obojętną zasadę inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:
CGACGGATCC ANGTYTTDAT NCKNA 25 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 4:
187 026 (i) CHARACTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwaś nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = oligonukleotyd PG3 (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4:
GGACGAATTC ACNGGNGAYG AYTGYAT 27 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = oligonukleotyd PG5
187 026 (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (ix) CECHA.:
(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada (B) LOKALIZACJA:13 (D) INNE INFORMACJE:/zmodyfikowana_zasada = i /uwaga = N w pozycji 13 oznacza inozynę (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada (B) LOKALIZACJA:16 (D) INNE INFORMACJE:/zmodyfikowana_zasada = i /uwaga N w pozycji 16 oznacza inozynę (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada (B) LOKALIZACJA:19 (D) INNE INFORMACJE:/zmodyfikowana_zasada = i /uwaga = ”N w pozycji 19 oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 5:
CACAGGATCC SWNGTNCCNY KDATRTT (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 6:
187 026 (i) CHARACTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 155 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = fragment PCR BPG32-26 z pierwsze go łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6:
| TCGATTCAAA | CCGGTTGCTC | CAATGTGTAT | GTTCACAATG | TGAATTGTGG | ACCAGGACAT | 60 |
| GGCATCAGCA | TAGGGAGTCT | TGGTAAAGAC | AGTACCAAAG | CTTGTGTCTC | CAATATAACA | 120 |
| GTCAGAGATG | TAGTTATGCA | CAACACAATG | ACTGG | 155 |
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
187 026 (A) DŁUGOŚĆ: 155 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „fragment PCR KPG32-8 z pierwszego łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 7:
| TCTATTGGAG | ACGGGACGAG | AGACCTTCTT | GTCCAAA^GG^G | NTACATGCGG | TCTGGGACAT | 60 |
| GGAATCAGTA | TTGGAAGCCT | CGGTTTATAC | GACAGGAAGA | NAGACGTCAC | TGGAACGAGG | 120 |
| GTCGTGAACT | GCACCCTCAT | AAACACTGAC | AGGCA | 15 5 |
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 219 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
187 026 (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „fragment PCR LPG12-16 z pierwszego łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) antysensowny: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8:
| TTTGGGAAGA | AGTGACGGAG | TCTAAATATT | TAACACATTC | ATCTCCACCG | GAGACGACTG | 60 |
| TATCTCCGTT | GGAGATGGGA | TGTAAAAACT | TCACGTGGAG | AAAAGTCACCT | GCGGTCCAGG | 120 |
| ACATGGAATC | AGTGTCGGAA | GCGCCTTAAA | GTACGGAAAC | GGAACAGGATG | TCAGCGGCAT | 180 |
| TAGAGTCATA | AACTGCACTC | TCTTTAATAC | CGACAACGG | 219 |
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 9:
(I) ClHARAKTERYSTYiKA :
(A) DŁUGOŚĆ: 155 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny
187 026 (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny’kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis - „fragment PCR LPG32-24 z pierwszego łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (Vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9:
| yccayyggag | gcggyacyga | AAATTTACTT | GGTCAGGGGG | SAGTGTTGTGG | ACTGCTAGAC | 60 |
| ggycyyycca | ycggaagycy | TGGAżATGTAC | CCCTATTAGA | STACCAGTGTAT | AGGAATGAGT | 120 |
| ayycgyaaay | gcaycaycaa | GCATACCGAT | AGGTA | l15 |
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 10:
(i) CtyGAGTTRYSSYKA SEEKJENCJI:
(T) DŁUGOŚĆ: 155 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy
187 026 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „fragment PCR LPG32-25 z pierwszego łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (ii) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10:
| YCYAYYGAGA | KCGGGAYAKK | AZAACCTTCTT | GGTGAAKRAR | STTCATGCGG | TCTCGGAGAC | 60 |
| AAAKYCKGYK | YTGAKAGCCY | CGGATTATAC | GGGGARGARA | SŁAGACGTCAC | TGYAACGYAR | 120 |
| AYCAYGKACY | ACKCCCYCAA | AJRRTACTGAC | 155 |
(2) INFORMACJA O 3EQ ID NO: 11:
(i) CCARAKTTRYSSYKA SEKKENCCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 155 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
187 026 (A) OPIS: /opis = „fragment PCR LPG32-32 z pierwszego łańcucha cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
CA) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Topaz (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11:
| TCCGTGGGAG | ATGGGATGAA | GAAYcYCCYC | ATTTi^G^GAA^G; | SYGTGTGCGG | YCCAGGACAC | 60 |
| GGAATCAGTG | TTGGAAGCCT | TGGAAGGTAC | TGAGAYYATC | 120 | ||
| GTTAAGAACT | GTACCCTCGA | GGGAACCGAC | AAAGG | 155 |
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 12:
(i) CCHARKKTEYSTYKK SEKWENCCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
CA) OPIS: /opis = „Sekwencja DNA T-DNA pGSV5
187 026 (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:1..25 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = RB /uwaga = „prawa sekwencja graniczna T-DNA pGSV5 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:26..75 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = MCS /uwaga = Miejsce wielokrotnego klonowania (ix) CECHA.:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:76..100 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= LB /uwaga = „lewa sekwencja graniczna T-DNA pGSV5 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 12:
AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGGGAAGCT
TAGATCCATG GAGCCATTTA CAATTGAATA TATCCTGCCG
100 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO: 13:
187 026 (i) CHARGGCERYSCYKG SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2352 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Brassica napus (B) SZCZEP: odmiana Bridger (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:2329..2331 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = ATG /uwaga = „kodon startu translacji (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:24 6.. 251 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = SphI
187 026 /uwaga = „miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny SphI (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:1051..1056 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = BamHI /uwaga = „miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BamHI (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:1836..1841 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa = HindII /uwaga = „miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny HindII (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:2327..2332 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= Ncol /uwaga = zmutowane miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Ncol (AAATGG zmienione na CCATGG) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: (B) LOKALIZACJA:2219..2227 (D) INNE INFORMACJE:/nazwa= start transkrypcji
187 026 /uwaga = region zawierający miejsce startu transkrypcji (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 13:
| ACGGTGATGG | GAATAGACGG | GAGCCCCCGC | GTGGAAGAGA | AGCCCAATGC | GAGCTGCGCG | 60 |
| GTGCGAGGGT | TACGAGCCGC | AAAGAACGAT | GTGCTCGGGT | CTTTCCGAGC | TGGCTGGAGC | 120 |
| CGTCGGTGCG | TGACCCGAGG | TAGACA^^ | TTCTGCCGTG | CGCGAGGTCG | GAGTGCCCCG | 180 |
| GTTGGAAGTG | CCCCCGCGCT | CTCACACCCT | GGGTACGTGC | GA^^A^A | TCTGCTGGGC | 240 |
| ACTCCGCGTG | ^A^^ATT | AGCCAGGCCT | TTGTCTCGTG | GGGGCACAGC | CTCCGCGGCC | 300 |
| TCTCCGCCGA | GAGTGAGTGC | CACA^C^T | CGTGCGTGGC | TGGGACTCCT | GCACTCATAT | 360 |
| CTTTGTGACG | AGTCCTTCCG | CGGAGCCTGC | GTGTGACGGG | ^G^CAT^ | TCCGTCCGAC | 420 |
| AGGTCGTGCG | TTCGTCGGCG | CGTGCGCCCG | TTGGCTTGTG | CGCCAAGACC | GGCCGCAGGC | 480 |
| CCCTGGACGT | CGTGATACGG | ACCGGGAGCC | GGGCTGTTGT | CTGGCGGAGT | A^^^ACA | 540 |
| GAGTCGTCGG | CCGCGCCCGC | GCATCCTTGG | GCCGAGTCGC | AGCCCCCCCC | GATGCCCGCC | 600 |
| GGCGTCTTGT | CGTGCGATAG | AGCCAAGCAG | GCGTCCCCTC | GGGCCTCGCA | CGACTGTTGC | 660 |
| TCCGCATCGC | CGAGCGCGTC | ACGGGACCCC | CTGTCTCTCG | CGTTGGACGA | ATC^CCC^ | 720 |
| CCGAGAT'TGT | CGTCCACCAT | ^G^CA^A | GCTGCACCGT | AGCCCACACC | CGCTGCGATT | 780 |
| GACCCCCCCG | GCCCGGCCGG | CAACCAAGGC | CCTGCGTCGC | CGCCGCACCC | GCGACCGGCC | 840 |
| TCCGCATGGT | GGTGCCGGAC | TCCGCAGCCT | CTCTCGAGCC | CGGCCGGGTG | TGGGTAGATC | 900 |
| CGAGCATCGC | GCCCCCCGAT | AGCCCCCCCG | TCTCCGCGAT | CGGGGCAGGG | GCGTCCTGAC | 960 |
| GCGCGCTTTT | ^GC^^GG | CCACCAGCGG | GGTGACCCCG | TGGACTCAAC | TGCGCCCCGC | 1020 |
| TG^A^C^ | GCACAGGCAG | TCTCGCGCCC | TTGCGGAGAT | GGGATCAATC | TGCCCGGAAG | 1080 |
| CAGGGATGGT | TTGAGGGATG | CATA^^^ | GTTGGTCGGG | TTCACGCGCG | GATGGGTTGA | 1140 |
| AAGGGAGGGT | TGGGGCATGT | GATGAGCGGA | GGTTGGGGTG | GTCACCCATA | TCCATATCCT | 1200 |
| GGATCCTGGC | GACAGACCGA | GGAGACTCGT | GCTTAGCTGC | GACGTGAGAG | TCCAGTTCGC | 1260 |
| GAGGGTCTGG | TCTAAGCCCT | ACGAGACCCC | GGGTGGTCCC | CCCGACAACT | GTGACGCCCC | 1320 |
CCCGGGACTG GCCGCTTTCC CCCGAAAAGC GCGTCCCCCG CCGAAGCCTC CTCGAGATAC 1380
187 026
| TCCGACGGAT | TGGTGTTTCC | TCAAGATTCC | GTCGGTATAT | TCCATAAGAA | CCCATTTTTG | 1440 |
| TGTTTCCTCG | GATTTTCCTC | AGAAGTTCCT | CGGGATATTC | CGAAGATTTC | ATTTTCCGTC | 1500 |
| AAAATGTCCA | TCGGATTGCC | GCTGTTTTCT | TGTAGTGATT | ATTATTTTTT | ' TTTTCATTTT | 1560 |
| aGaAAGAAAG | AAATATCATC | GAATCGCTAA | CTGTCACATA | TTGTGGGAGC | CCACAGATAG | 1620 |
| TGCAGGGGCT | CACTGGGGGA | agatttytat | TTTGGATTTT | TAGTGATTAA | ATTCTTGACT | 1680 |
| TTTGATGGAG | TTCGCTGGTT | ATTTATTTAT | TTTTTTTTAT | GAACTCACCC | TTATGAATTG | 1740 |
| TTGTTGCGGG | TGTTCTGGTG | TCAACATCAC | ACACCAAAGT | ATTAAGCACA | AAAGAGTAAA | 1800 |
| GGGGACCCGA | CGCTGCTGTC | GAACTTTAAT | AGACGATTGA | CGCCGACGTT | TATCACTTTT | 1860 |
| AGTTATGTAT | TTTCTACTTT | TTATATGTGA | TGTAGGGATA | TATACATCAC | ATAGTCTTAG | 1920 |
| CTCGATGGTT | GCGCGTGGTG | GATTGTTACT | GTGATTGGTA | TACAATGATA | TATATGGACT | 1980 |
| CTTTTCTAAT | AGAATATGAC | TAACTAATTG | TACTCTCTAT | CAATCAGAAA | AGCGATATGA | 2040 |
| ATCTATAAAG | GGGTAGGTTG | AGATAGAAAG | GAGAGGAGAT | AAGGATTAAA | AACTAGGGTG | 2100 |
| TAGTGTTTTC | GTGTCGGTCT | CGATCTCTCT | CCATACCTCC | AACGCCATTA | ATACTTGAAT | 2160 |
| AGGCATGTGA | AGTTTCTCCA | TTAAATTACC | TATTAATACA | CATACATGCG | ACTTGTTCTA | 2220 |
| TTTCGTGTTG | CAAAAGCCTC | CCTAAGACTG | CAGAGAGTCT | CATATTAATT | CTTACTCTCA | 2280 |
| AAGGTCGGGC | GCGCTCTTTC | TATAAAGATT | AGCGTTTCAA | ACCCCGAAAT | AGCCCGTTGT | 2340 |
| TTTGAGGGTC | TG | 2352 |
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (29)
- Zastrzeżenia patentowe1. Komórka roślinna zawierająca co najmniej jeden specyficzny dla strefy pękania („DZ”) gen chimerowy włączony w genom jądrowy komórki, znamienna tym, że specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący co najmniej 50 nukleotydowych sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) promotor roślinny ulegający ekspresji w roślinach, który kieruje ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania, przy czym, roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami niezawierającymi takich komórek roślin.
- 2. Komórka roślinna według zastrz. 1, znamienna tym, że transkrybowany region DNA koduje białko, które jest zdolne zahamować aktywność poligalakturonazy, korzystnie endo-poligalakturonazy.
- 3. Komórka roślinna według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodziny Brassica, szczególnie korzystnie Brassica napus.
- 4. Komórka roślinna według zastrz. 1, znamienna tym, że ulegający ekspresji w roślinach promotor jest promotorem specyficznym dla strefy pękania.
- 5. Komórka roślinna według zastrz. 4, znamienna tym, że specyficzny dla strefy pękania promotor pochodzi z genu kodującego mRNA, przy czym, pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
- 6. Komórka roślinna zawierająca co najmniej jeden specyficzny dla strefy pękania („DZ”) gen chimerowy włączony w genom jądrowy komórki, znamienna tym, że specyficzny dla strefy pękania gen chimerowy zawiera następujące funkcjonalnie połączone fragmenty DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący białko albo polipeptyd, który po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej bamazę, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryptofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko ETR1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie regulatorowym sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328, który wybiórczo kieruje ekspresją transkrybowanego regionu w komórkach strefy pękania, przy czym roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami niezawierającymi wspomnianych komórek roślinnych.
- 7. Komórka roślinna według zastrz. 6, znamienna tym, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodzaju Brassica, korzystnie Brassica napus.
- 8. Komórka roślinna według zastrz. 6, znamienna tym, że specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
- 9. Komórka roślinna według zastrz. 8, znamienna tym, że specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.
- 10. Komórka roślinna według zastrz . a, znamienna tym, że specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję dukleotedową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.187 026
- 11. DNA kodujący antysensowny RNA zawierający region o długości przynajmniej 50 nukleotydów, który jest komplementarny do regionu mRNA, przy czym pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
- 12. Promotor genu kodującego mRNA, znamienny tym, że pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
- 13. DNA zawierający przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
- 14. DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.
- 15. DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.
- 16. Gen chimerowy specyficzny dla strefy pękania, znamienny tym, że obejmuje (a) transkrybowany region DNA kodujący co najmniej 50 nukleotydowych sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) promotor roślinny ulegający ekspresji w roślinach, który kieruje ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania, przy czym, roślina zawierająca taką komórkę roślinną ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami nie zawierającymi takich komórek roślinnych.
- 17. Gen chimerowy według zastrz. 16, znamienny tym, że transkrybowany region DNA koduje białko, które jest zdolne zahamować aktywność poligalakturonazy, korzystnie endo-poligalakturonazy.
- 18. Gen chimerowy według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodziny Brassica, szczególnie korzystnie Brassica napus.
- 19. Gen chimerowy według zastrz. 16, znamienny tym, że ulegający ekspresji w roślinach promotor jest promotorem specyficznym dla strefy pękania.
- 20. Gen chimerowy według zastrz. 19, znamienny tym, że specyficzny dla strefy pękania promotor pochodzi z genu kodującego mRNA, przy czym, pochodzący z tego mRNA cDNA zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No 1.
- 21. Gen chimerowy specyficzny dla strefy pękania, znamienny tym, że stanowi on funkcjonalne połączenie następujących fragmentów DNA: (a) transkrybowany region DNA kodujący białko albo polipeptyd, który po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej bamazę, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryptofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko eTr1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie regulatorowym sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328, który wybiórczo kieruje ekspresją transkrybowanego regionu w komórkach strefy pękania, przy czym roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami niezawierającymi wspomnianych komórek roślinnych.
- 22. Gen chimerowy według zastrz. 21, znamienny tym, że strefa pękania jest strefą pękania strąka, korzystnie rośliny z rodzaju Brassica, korzystnie Brassica napus.
- 23. Gen chimerowy według zastrz. 21, znamienny tym, że te specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy zawierający przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1839 i 2328.
- 24. Gen chimerowy według zastrz. 23, znamienny tym, że te specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 zaczynającą się pomiędzy miejscem rozpoznawanym przez enzymy restrykcyjne SphI i miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHI i kończącą się w pozycji 2328.187 026
- 25. Gen chimerowy według zastrz. 24, znamienny tym, że te specyficzne dla strefy pękania geny chimerowe zawierają region promotorowy obejmujący przynajmniej sekwencję nukleotydową SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328.
- 26. Komórka roślinna lub hodowla komórek roślinnych transformowanych specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym jak określono w zastrz. 16.
- 27. Komórka roślinna lub hodowla komórek roślinnych transformowanych specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym jak określono w zastrz. 21.
- 28. Sposób wytwarzania rośliny ze zmienionymi właściwościami strefy pękania, znamienny tym, że transformuje się genom jądrowy komórki rośliny wyjściowej specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym obejmującym: (a) transkrybowany region DNA co najmniej 50 nukleotydów z sekwencji SEQ ID NO: 1, o orientacji sensownej i antysensownej, (b) ulegający ekspresji promotor roślinny, kierujący ekspresją transkrybowanego regionu DNA przynajmniej w komórkach strefy pękania, przy czym, roślina zawierająca taką komórkę roślinną ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, w porównaniu z roślinami niezawierającymi takich komórek roślinnych i odtwarza się transformowaną roślinę z tej transformowanej komórki roślinnej.
- 29. Sposób wytwarzania rośliny ze zmienionymi właściwościami strefy pękania, znamienny tym, że transformuje się genom jądrowy komórki rośliny wyjściowej specyficznym dla strefy pękania genem chimerowym, zawierającym białko albo polipeptyd, który po wytworzeniu w komórkach strefy pękania zabija je, osłabia lub zaburza ich normalny metabolizm, procesy fizjologiczne lub rozwój, przy czym wspomniane białko lub peptyd wybrany jest z grupy obejmującej bamazę, fragment A toksyny błonicy, monooksygenazę tryptofanu, hydrolazę indolo-3-acetyloamidu, amidohydrolazę, produkt genu rolB lub białko ETR1-1 i (b) ulegający ekspresji specyficzny dla strefy pękania promotor, zawarty w 5' regionie regulatorowym sekwencji nukleotydowej SEQ ID No 13 pomiędzy pozycjami 1 i 2328, wybiórczo kierujący ekspresją transkrybowanego regionu w komórkach strefy pękania, przy czym roślina zawierająca tę komórkę roślinną charakteryzuje się tym, że ma zmienione właściwości strefy pękania, korzystnie opóźnione pękanie, porównując z roślinami niezawierającymi wspomnianych komórek roślinnych i odtwarza się transformowaną roślinę z tej transformowanej komórki.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95402241 | 1995-10-06 | ||
| EP95203328 | 1995-12-08 | ||
| PCT/EP1996/004313 WO1997013865A1 (en) | 1995-10-06 | 1996-10-04 | Seed shattering |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL326082A1 PL326082A1 (en) | 1998-08-17 |
| PL187026B1 true PL187026B1 (pl) | 2004-04-30 |
Family
ID=26139864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96326082A PL187026B1 (pl) | 1995-10-06 | 1996-10-04 | Komórka roślinna, DNA, promotor, gen chimerowy i sposób wytwarzania rośliny |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6420628B1 (pl) |
| EP (1) | EP0853676B1 (pl) |
| JP (1) | JPH11513256A (pl) |
| CN (1) | CN1249245C (pl) |
| AT (1) | ATE331034T1 (pl) |
| AU (1) | AU718082B2 (pl) |
| CA (1) | CA2234222C (pl) |
| CZ (1) | CZ104298A3 (pl) |
| DE (1) | DE69636288T2 (pl) |
| HU (1) | HUP9802535A3 (pl) |
| PL (1) | PL187026B1 (pl) |
| WO (1) | WO1997013865A1 (pl) |
Families Citing this family (133)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6198024B1 (en) | 1997-06-27 | 2001-03-06 | The Regents Of The University Of California | Seed plants characterized by delayed seed dispersal |
| GB9719359D0 (en) * | 1997-09-11 | 1997-11-12 | Nickerson Biocem Ltd | The Use of DNA Sequences |
| GB9720039D0 (en) * | 1997-09-19 | 1997-11-19 | Nickerson Biocem Ltd | Control |
| GB9806113D0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-05-20 | Nickerson Biocem Ltd | Control |
| EP1555317B1 (en) | 1998-03-20 | 2011-09-28 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Synthetic genes and genetic constructs comprising the same |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| US20040214330A1 (en) | 1999-04-07 | 2004-10-28 | Waterhouse Peter Michael | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| US8598332B1 (en) | 1998-04-08 | 2013-12-03 | Bayer Cropscience N.V. | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| ATE507299T1 (de) | 1998-04-08 | 2011-05-15 | Commw Scient Ind Res Org | Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen |
| US7135621B2 (en) | 1998-06-25 | 2006-11-14 | The Regents Of The University Of California | Control of fruit dehiscence in plants by Indehiscent1 genes |
| US6998517B1 (en) | 1998-06-25 | 2006-02-14 | The Regents Of The University Of California | Control of fruit dehiscence in Arabidopsis by indehiscent1 genes |
| US6693185B2 (en) | 1998-07-17 | 2004-02-17 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means to modulate programmed cell death in eukaryotic cells |
| DK1961822T3 (en) * | 2000-04-13 | 2016-04-25 | Univ California | Control of fruit dehiscence in Arabidopsis using indehiscent1 genes |
| JP4932125B2 (ja) | 2000-08-25 | 2012-05-16 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | 新規プレニルプロテアーゼをコードする植物ポリヌクレオチド |
| AU2003209814B2 (en) | 2002-03-14 | 2008-12-04 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation | Modified gene-silencing RNA and uses thereof |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| EP1551983A2 (en) | 2002-10-18 | 2005-07-13 | CropDesign N.V. | Identification of e2f target genes and uses thereof |
| AP2005003409A0 (en) | 2003-04-09 | 2005-12-31 | Bayer Bioscience Nv | Methods and means for increasing the tolerance of plants to stress conditions. |
| US7718850B2 (en) * | 2003-06-23 | 2010-05-18 | The Regents Of The University Of California | Methods and means for delaying seed shattering in plants |
| EP1781083A4 (en) | 2004-06-18 | 2009-09-09 | Univ California | SEQUENCES OF BRASSICA INDEHISCENT1 |
| ATE452199T1 (de) | 2004-09-24 | 2010-01-15 | Bayer Bioscience Nv | Stressresistente pflanzen |
| WO2007039454A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-04-12 | Basf Plant Science Gmbh | Methods for controlling gene expression using ta-siran |
| CA2629953A1 (en) | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Cropdesign N.V. | Plants having improved growth characteristics and a method for making the same |
| EP2166086A3 (en) | 2005-12-01 | 2010-10-20 | CropDesign N.V. | Plants having improved growth characteristics and methods for making the same |
| EP1999263B1 (en) | 2006-03-21 | 2013-04-24 | Bayer CropScience NV | Stress resistant plants |
| WO2007113237A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| US8237017B2 (en) | 2006-05-12 | 2012-08-07 | Bayer Cropscience Nv | Stress-related microRNA molecules and uses thereof |
| EP2423317A3 (en) | 2006-05-30 | 2012-05-30 | CropDesign N.V. | Plants with modulated expression of RAN binding protein (RANB) having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2546262A1 (en) | 2006-08-02 | 2013-01-16 | CropDesign N.V. | Modifying the content of storage compounds in seeds by expression of a Class II HD-Zip transcription factor |
| EP2540832A1 (en) | 2006-08-02 | 2013-01-02 | CropDesign N.V. | Plants transformed with a small inducible kinase having improved yield related traits and a method for making the same |
| WO2008062049A1 (en) | 2006-11-24 | 2008-05-29 | Cropdesign N.V. | Transgenic plants comprising as transgene a class i tcp or clavata 1 (clv1) or cah3 polypeptide having increased seed yield and a method for making the same |
| EP2615174A3 (en) | 2007-01-31 | 2013-10-23 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and/or increased abiotic stress resistance, and a method for making the same |
| BRPI0701172B1 (pt) | 2007-02-05 | 2019-11-26 | Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Embrapa | composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja |
| BRPI0701230B1 (pt) | 2007-02-05 | 2018-06-26 | Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa | Composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro |
| BRPI0701826B1 (pt) | 2007-03-16 | 2021-02-17 | Embrapa - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária | proteínas da teia de aranha nephilengys cruentata, avicularia juruensis e parawixia bistriata isoladas da biodiversidade brasileira |
| CN101802202B (zh) | 2007-05-03 | 2014-12-10 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| WO2008150031A1 (ja) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Riken | 植物ホルモン・オーキシンの生合成阻害剤及び該阻害剤を有効成分として含有する植物化学調節剤、除草剤並びにその使用方法 |
| BRPI0813114A2 (pt) | 2007-06-29 | 2014-11-11 | Basf Plant Scinece Gmbh | Método para melhorar características relacionadas a rendimento em plantas em relação a plantas de controle, construção, uso de uma construção, planta, parte de planta ou célula de planta, método para a produção de uma planta transgênica, partes colhíveis de uma planta, produtos, e, uso de um ácido nucleico |
| WO2009013263A2 (en) | 2007-07-20 | 2009-01-29 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having increased yield-related traits and a method for making the same |
| WO2009016232A2 (en) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| AR067748A1 (es) | 2007-07-31 | 2009-10-21 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas |
| WO2009021288A1 (en) | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved gene silencing methods |
| EP2537940A3 (en) | 2007-09-14 | 2013-04-10 | BASF Plant Science GmbH | Plants having increased yield-related traits and a method for making the same |
| CA2703827A1 (en) | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2574622A1 (en) | 2007-11-26 | 2013-04-03 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CN103898125B (zh) | 2007-11-28 | 2018-03-13 | 拜尔作物科学公司 | 包含突变indehiscent等位基因的芸苔属植物 |
| CN101969759A (zh) | 2007-12-20 | 2011-02-09 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 |
| EP2599874A3 (en) | 2008-01-25 | 2013-11-13 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2247733A2 (en) | 2008-01-31 | 2010-11-10 | National Institute of Biological Sciences | Plants having altered growth and/or development and a method for making the same |
| EP2268820A1 (en) | 2008-04-16 | 2011-01-05 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2009135810A1 (en) | 2008-05-05 | 2009-11-12 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| DE112009001459T5 (de) | 2008-06-20 | 2011-09-29 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben |
| WO2009156360A1 (en) | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CA2728926A1 (en) | 2008-07-04 | 2010-01-07 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same by overexpressing a polynucleotide encoding a tfl1-like protein |
| WO2010007035A1 (en) | 2008-07-17 | 2010-01-21 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| ES2604317T3 (es) | 2008-07-17 | 2017-03-06 | Bayer Cropscience Nv | Planta de Brassica que comprende un alelo INDEHISCENT mutante |
| CA2731038A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having modified growth characteristics and a method for making the same |
| CN102186877A (zh) | 2008-08-20 | 2011-09-14 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| AU2009295991A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| AU2009315732A1 (en) | 2008-11-12 | 2010-05-20 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced abiotic stress tolerance and/or enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2373796A1 (en) | 2008-12-03 | 2011-10-12 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced abiotic stress tolerance and/or enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| DE112009003749T5 (de) | 2008-12-17 | 2012-11-15 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und/oder gesteigerter abiotischerStresstoleranz und Verfahren zur Herstellung derselben |
| GB2467167B (en) | 2009-01-26 | 2013-09-11 | Algentech Sas | Gene targeting in plants |
| CN104232679A (zh) | 2009-01-28 | 2014-12-24 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 |
| EP2401291A1 (en) | 2009-02-25 | 2012-01-04 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CN104789573A (zh) | 2009-04-29 | 2015-07-22 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 |
| DE112010002842T5 (de) | 2009-04-29 | 2012-09-27 | Basf Plant Science Company Gmbh | Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| WO2010127969A1 (en) | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and/or enhanced abiotic stress tolerance and a method for making the same |
| JP5925677B2 (ja) | 2009-06-15 | 2016-06-01 | アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー | キシロシルトランスフェラーゼ活性の欠損したベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物 |
| US9683023B2 (en) | 2009-06-19 | 2017-06-20 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2011009182A2 (pt) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Embrapa - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária | Molécula de ácido nucléico isolada, construção gênica, vetor, célula transgênica, método para obtenção de uma célula e de uma planta transgênica, polipeptídeo isolado e purificado, composição pesticida biodegradável, método para o controle de uma praga, método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga |
| MX2012002045A (es) | 2009-08-19 | 2012-04-11 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas. |
| US20120180165A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-07-12 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants Having Enhanced Yield-Related Traits and a Method for Making the Same |
| CN102648282A (zh) | 2009-09-25 | 2012-08-22 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| EP2491119B1 (en) | 2009-10-20 | 2016-06-08 | Bayer CropScience NV | Methods and means to alter lipid biosynthesis by targeting multiple enzymes to suborganelle domains |
| KR20120126061A (ko) | 2009-10-22 | 2012-11-20 | 재단법인 작물유전체기능연구사업단 | 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 |
| CN104651323A (zh) | 2009-11-13 | 2015-05-27 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| RS55986B1 (sr) | 2010-01-22 | 2017-09-29 | Bayer Ip Gmbh | Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci |
| WO2011104155A2 (en) | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2578686A1 (en) | 2010-02-24 | 2013-04-10 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2361927A1 (en) | 2010-02-26 | 2011-08-31 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EP2361985A1 (en) | 2010-02-26 | 2011-08-31 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| EA201290933A1 (ru) | 2010-03-18 | 2013-05-30 | Басф Плант Сайенс Компани Гмбх | Растения с улучшенными характеристиками урожайности и способ их получения |
| CN102892890A (zh) | 2010-03-18 | 2013-01-23 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| EA201290937A1 (ru) | 2010-03-19 | 2013-06-28 | Басф Плант Сайенс Компани Гмбх | Растения с улучшенными характеристиками урожайности и способ их получения |
| BR112012023502A2 (pt) | 2010-03-19 | 2015-09-01 | Basf Plant Science Co Gmbh | Método para otimizar características relacionadas ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, molécula de ácido nucleido isolada, polipetídeo isolado, uso de uma construção, planta, parte de uma planta ou célula de planta transformada, planta transgênica, método para a produção de uma planta transgênica, partes de uma planta passíveis de colheita, produtos derivados a partir de uma planta, uso de um ácido nucleico que codifica um polipetídeo e método para a produção de um produto |
| EP2371845A1 (en) | 2010-03-22 | 2011-10-05 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| BR112012031323A2 (pt) | 2010-06-09 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Nv | métodos e meios para modificação de genoma vegetal em uma sequência de nucleotídeos comumente usada na engenahria genética de plantas |
| CA2801834A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Kathleen D'halluin | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| AU2011268559A1 (en) | 2010-06-24 | 2013-02-14 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same |
| CA2801688A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants with enhanced yield-related traits and producing method thereof |
| JP2013531502A (ja) | 2010-07-08 | 2013-08-08 | バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー | グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用 |
| BR112013000992A2 (pt) | 2010-07-16 | 2016-05-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | métodos para intensificar traços relacionados ao rendimento em plantas, construtos, usos de um construto, plantas, parte de plantas, células de plantas transformadas, métodos para a produção de uma planta transgênica, plantas transgênicas, partes colhíveis e produtos derivados de uma planta, usos de um ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico isolado, polipeptídeos isolados e uso de ácidos nucleicos de rna helicase dead-box |
| BR112013004183A2 (pt) | 2010-08-24 | 2016-05-10 | Basf Plant Science Co Gmbh | plantas com melhores características relacionadas ao rendimento e método para sua produção |
| WO2012059497A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Bayer Cropscience Ag | N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides |
| CA2815969A1 (en) | 2010-11-10 | 2012-05-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same |
| MX2013005258A (es) | 2010-11-15 | 2013-07-05 | Bayer Ip Gmbh | N-aril pirazol(tio)carboxamidas. |
| AU2011347674B2 (en) | 2010-12-24 | 2015-01-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica plant comprising a mutant ALCATRAZ allele |
| EP2658853A1 (en) | 2010-12-29 | 2013-11-06 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2665819A4 (en) | 2011-01-20 | 2014-09-10 | Basf Plant Science Co Gmbh | PLANTS HAVING AMPLIFIED YIELD CHARACTERS AND PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF |
| WO2012117330A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and producing methods thereof |
| WO2012117324A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and producing methods thereof |
| AU2012222946A1 (en) | 2011-03-01 | 2013-09-19 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and producing methods thereof |
| GB201106845D0 (en) | 2011-04-26 | 2011-06-01 | Vib Vzw | Methods and means to produce abiotic stress tolerant plants |
| WO2013006861A1 (en) | 2011-07-07 | 2013-01-10 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Sorghum grain shattering gene and uses thereof in altering seed dispersal |
| US9181532B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-10 | Icon Genetics Gmbh | Production of galactosylated N-glycans in plants |
| US9265252B2 (en) | 2011-08-10 | 2016-02-23 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| BR122014004140B8 (pt) | 2011-08-22 | 2023-03-28 | Bayer Cropscience Ag | Vetor recombinante ou construção recombinante, bem como métodos para obter e produzir uma planta de algodão ou célula vegetal tolerante a um inibidor de hppd, e para cultivar um campo de plantas de algodão |
| US10196664B2 (en) | 2011-10-04 | 2019-02-05 | Icon Genetics Gmbh | Nicotiana benthamiana plants deficient in fucosyltransferase activity |
| CN102649952B (zh) * | 2012-05-10 | 2014-04-23 | 山东农业大学 | 来自辣椒疫霉的多聚半乳糖醛酸酶pcipg20及其编码基因与应用 |
| WO2013184768A1 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods of gene silencing in plants |
| EP2677035A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-25 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2014006159A1 (en) | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Bayer Cropscience Nv | Soybean rod1 gene sequences and uses thereof |
| EP2877583A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-06-03 | Bayer CropScience NV | Brassica plants with modified seed oil composition |
| CA3195951A1 (en) | 2012-07-06 | 2014-01-09 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica rod1 gene sequences and uses thereof |
| CA2881787A1 (en) | 2012-08-13 | 2014-02-20 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for increasing pest resistance in plants |
| JP6453315B2 (ja) | 2013-05-23 | 2019-01-16 | ノマド・バイオサイエンス・ゲーエムベーハー | 植物に非生物的ストレス抵抗性をもたらす方法 |
| EP3017049B1 (en) | 2013-07-01 | 2018-08-22 | Bayer CropScience NV | Methods and means for modulating flowering time in monocot plants |
| EP2896698A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-22 | BASF Plant Science Company GmbH | Plants having one or more enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2015185701A1 (en) * | 2014-06-05 | 2015-12-10 | Bayer Cropscience Nv | Pod-preferential promoters and uses thereof |
| WO2016038079A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Bayer Cropscience Nv | Plants with altered fruit abscission properties |
| EP3178313A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-14 | Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie | Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives |
| CA3004624A1 (en) | 2015-12-15 | 2017-06-22 | Steven Engelen | Brassicaceae plants resistant to plasmodiophora brassicae (clubroot) |
| CN106967702A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-07-21 | 华南农业大学 | 一种纤维素酶及其编码基因与应用 |
| MX2021000087A (es) | 2018-06-27 | 2021-05-31 | Basf Se | Rubisco activasa termoestable y usos de esta. |
| WO2020234468A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Nomad Bioscience Gmbh | Rna viral rna molecule for gene editing |
| WO2021004838A2 (en) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Rubisco activase with reduced adp inhibition and uses thereof |
| US20230022576A1 (en) | 2019-11-19 | 2023-01-26 | Protalix Ltd. | Removal of constructs from transformed cells |
| KR20230113283A (ko) | 2020-10-05 | 2023-07-28 | 프로탈릭스 리미티드 | 다이서-유사 넉아웃 식물 세포 |
| WO2022101286A1 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie | Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell |
| AU2022313321A1 (en) | 2021-07-23 | 2024-02-01 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Blackleg resistant plants and methods for the identification of blackleg resistant plants |
| WO2023052562A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Basf Se | Wheat plants with an increased yield |
| WO2023052561A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Basf Se | Plants with improved properties |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8626879D0 (en) | 1986-11-11 | 1986-12-10 | Ici Plc | Dna |
| GB9115909D0 (en) | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| DK0651814T3 (da) * | 1992-07-09 | 1997-06-30 | Pioneer Hi Bred Int | Majspollenspecifikt polygalacturonasegen |
| GB9306726D0 (en) * | 1993-03-31 | 1993-05-26 | Neckerson Biocem Limited | Plant molecular biology |
| GB9506684D0 (en) | 1995-03-31 | 1995-05-24 | Nickerson Biocem Ltd | Control of pod dehiscence |
-
1996
- 1996-10-04 AU AU72847/96A patent/AU718082B2/en not_active Ceased
- 1996-10-04 HU HU9802535A patent/HUP9802535A3/hu unknown
- 1996-10-04 CA CA002234222A patent/CA2234222C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-04 AT AT96934530T patent/ATE331034T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-10-04 CN CNB961983590A patent/CN1249245C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-04 PL PL96326082A patent/PL187026B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-10-04 JP JP9514686A patent/JPH11513256A/ja not_active Abandoned
- 1996-10-04 US US09/051,239 patent/US6420628B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-04 CZ CZ981042A patent/CZ104298A3/cs unknown
- 1996-10-04 EP EP96934530A patent/EP0853676B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-04 DE DE69636288T patent/DE69636288T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-04 WO PCT/EP1996/004313 patent/WO1997013865A1/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-05-21 US US10/151,668 patent/US6797861B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7284796A (en) | 1997-04-30 |
| CZ104298A3 (cs) | 1998-09-16 |
| CN1211282A (zh) | 1999-03-17 |
| PL326082A1 (en) | 1998-08-17 |
| AU718082B2 (en) | 2000-04-06 |
| HUP9802535A3 (en) | 2001-04-28 |
| CA2234222A1 (en) | 1997-04-17 |
| CN1249245C (zh) | 2006-04-05 |
| JPH11513256A (ja) | 1999-11-16 |
| US6420628B1 (en) | 2002-07-16 |
| CA2234222C (en) | 2007-12-04 |
| EP0853676B1 (en) | 2006-06-21 |
| US6797861B2 (en) | 2004-09-28 |
| WO1997013865A1 (en) | 1997-04-17 |
| ATE331034T1 (de) | 2006-07-15 |
| HUP9802535A2 (hu) | 1999-02-01 |
| EP0853676A1 (en) | 1998-07-22 |
| DE69636288D1 (de) | 2006-08-03 |
| US20020184660A1 (en) | 2002-12-05 |
| DE69636288T2 (de) | 2007-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL187026B1 (pl) | Komórka roślinna, DNA, promotor, gen chimerowy i sposób wytwarzania rośliny | |
| Woolley et al. | Purification and properties of an endo-β-1, 4-glucanase from strawberry and down-regulation of the corresponding gene, cel1 | |
| Petersen et al. | Isolation and characterisation of a pod dehiscence zone-specific polygalacturonase from Brassica napus | |
| JP4068152B2 (ja) | セルロース及び／又はβ―１，４―グルカンの操作 | |
| US6084164A (en) | Sunflower seeds with enhanced saturated fatty acid contents | |
| NZ284885A (en) | Regulatory element conferring tapetum specifity | |
| BRPI0406573B1 (pt) | construção de dna, sistema de expressão, célula hospedeira, bem como método para expressar um gene preferencialmente em células de paredes secundárias durante a deposição na parede secundária | |
| KR100271594B1 (ko) | 엔도-1, 4-베타-d-글루카나제 | |
| KR20000004915A (ko) | 오일 평지씨로부터 얻어지는 시스테인 프로테아제 촉진유전자및 식물 생식질의 함유 방법 | |
| Harpster et al. | Constitutive overexpression of a ripening-related pepper endo-1, 4-β-glucanase in transgenic tomato fruit does not increase xyloglucan depolymerization or fruit softening | |
| AU680935B2 (en) | Chitinase, DNA coding therefor and plants containing same | |
| Harpster et al. | Isolation and characterization of a gene encoding endo-β-1, 4-glucanase from pepper (Capsicum annuum L.) | |
| US6787687B1 (en) | Rin gene compositions and methods for use thereof | |
| EP1321525A2 (en) | Fruit ripening-related genes | |
| US6350935B1 (en) | Fruit-specific and ripening-regulation expansin gene to control fruit texture and softening | |
| Ohmiya et al. | The role of PopCel1 and PopCel2 in poplar leaf growth and cellulose biosynthesis | |
| US5945580A (en) | Capsicum hemicellulase polynucleotides and polypeptides | |
| KR100424844B1 (ko) | 식물프로모터 및 이 프로모터를사용한 유전자 발현방법 | |
| US5569831A (en) | Transgenic tomato plants with altered polygalacturonase isoforms | |
| JP2003513608A (ja) | イソコリスミ酸シンターゼおよび植物における耐性の誘導のためのその使用 | |
| Oliver et al. | Inhibition of tobacco NADH-hydroxypyruvate reductase by expression of a heterologous antisense RNA derived from a cucumber cDNA: implications for the mechanism of action of antisense RNAs | |
| EP1003372A1 (en) | A nod factor binding protein from legume roots | |
| MXPA98002667A (en) | Transgenic plants with reduction dehyscence | |
| WO1999015680A1 (en) | Control of plant abscission and pod dehiscence or shatter | |
| US6495743B1 (en) | Plant xylanases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20061004 |