KR100271594B1

KR100271594B1 - 엔도-1, 4-베타-d-글루카나제

Info

Publication number: KR100271594B1
Application number: KR1019940703020A
Authority: KR
Inventors: 잭클린 드실바; 칼 두들리 자르맨; 데이비드 앤드류 애로우스미쓰; 존 스펜스 그랜트 리이드; 메리 엘리자베쓰 에드워즈
Original assignee: 알 브이 테이트 (로드니 비버스 테이트), 에이치 드로이. 씨. 지. 오닌크, 이. 에디, 산드라 웨드워즈 (에스 제이 에드워즈); 유니레버 엔.브이.
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1993-03-01
Publication date: 2000-11-15
Also published as: MX9301120A; CA2117608A1; ES2164655T3; AU3529597A; EP0628075B1; EP0628075A1; ATE209677T1; KR950700405A; DE69331226D1; US5767364A; JPH07508159A; AU3572893A; DE69331226T2; ZA931333B; WO1993017101A1

Abstract

본 발명은 크실로글루칸-특이 엔도-(1,4)-β-D-글루카나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 서열 및 그의 기능적 동등 서열에 관한 것이다. 또한, 상기 서열로 이루어지는 벡터, 상기 서열이 도입된 변종 식물, 식물 특성의 변경 방법, 및 재조합 DNA 기법에 의해 상기 정의한 활성을 갖는 효소의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

엔도-1,4-β-D-클루카나제

[발명의 분야]

본 발명은 식물 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터, 상기 뉴클레오티드 서열을 함유하는 변종 식물, 상기 효소 생성의 재조합 DNA법, 및 식물 특성의 변경 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

과실 및 채소의 세포벽은 대개 펙틴, 셀룰로오스 및 크실로글루칸을 주성분으로 하는 다당류이다(참고 문헌 1). 강도 및 유연성의 필수적 특성을 반영하기 위한 많은 세포벽 모델이 제안되어 있다(참고 문헌 2, 3, 4).

크실로글루칸은 α-1,6-크실로실 측쇄로 광범위하게 치환되고, 일부가 1,2-β-갈락 토실화된 1,4-β-글루칸이다. 이들은 쌍자엽 식물의 1차 세포벽에서 다량으로 발견되지만, 특정 종자에서도 발견되며 이들 종자에서 이들은 다른 역할을 담당한다.

1차 세포벽 크실로글루칸은 푸코실화되어 있다. 이것은 셀룰로오스 미세 섬유에 단단하게 수소 결합되어 있어 이를 분리하기 위해서는 진한 알칼리 또는 강한 팽윤제가 필요하다. 크실로글루칸은 셀룰로오스 미세섬유들 간에 교차 가교를 형성하고, 이러한 셀룰로오스/크실로글루칸 망상 조직이 세포벽의 중요 하중 지지의/탄력적 망상 조직을 형성하는 것으로 생각된다. DCB 돌연변이 현탁 배양 세포(셀룰로오스 결여 세포벽)는 크실로글루칸을 그의 매질로 방출시키는데, 이는 크실로글루칸이 통상적으로 셀룰로오스에 강하게 결합되어 있음을 암시한다.

1차 세포벽 크실로글루칸의 가수분해는 IAA 유도 성장 동안에 암(dark) 성장 호박 배축(胚軸)의 단편에서 입증되었다(참고 문헌 15). 세포벽 크실로글루칸의 엔도형 가수분해(endohydrolysis)는 세포 팽윤을 수반하는 세포벽의 완화(loosening)에 기여하는 것으로 보여진다(참고 문헌 16). 또한, 크실로글루칸의 평균 분자량은 토마토 열매가 성숙(ripening)하는 동안 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 성숙 과정을 수반하는 조직 연화에 기여할 수 있다(참고 문헌 17).

특정 종자, 예를 들면 한련(nasturtium)은 후자엽(厚子葉)세포벽에 저장된 크실로글루칸을 30 중량%이하 함유하고, 이 크실로글루칸은 저장 다당류로서 사용되며 발아시 신속하게 해중합 분해된다.

크실로글루칸에 특히 작용하는 엔도-1,4-β-D-글루카나제(즉, 크실로글루카나제)는 발아하는 한련(Tropaeolum majus L.)종자로부터 단리 및 뚜렷한 동종으로 정제되다(참고문헌 11).

정제된 크실로글루카나제는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서(겉보기 분자량, 20 내지 31 킬로달톤(kDa)) 및 등전점 분화 전기 영동에서(등전점 5.0) 단일 폴리펩티드 밴드가 보인다. 이 효소는 타마린드(tamarind) 종자의 크실로글루칸의 가수분해 후 최종 생성물 분석법에 의해 관찰한 결과 크실로글루칸에 대한 절대 특이성 및 엔도형의 작용을 보였다(참고 문헌 15). 효소의 본래 기질이 한련 자엽의 저장 크실로글루칸이지만, 실험관내에서 푸코스(fucose) 함유 1차 세포벽 크실로글루칸도 가수분해하는 것으로 보여진다(참고 문헌 11). 높은 기질 농도에서, 크실로글루칸 엔도-트란스글리코실라제(XET) 활성이 입증되었다(참고 문헌 18).

유사 효소 활성이 다른 식물 조직에서 검출되었고, 완두 줄기의 상이한 부분에서 성장 속도와 절대적인 상호 관련이 있는 것으로 보여진다(참조 문헌 19). XET가 미세섬유 상호간의 크실로글루칸 사슬을 절단하고 재연결하는 작용을 하고, 이러한 작용이 식물 세포 팽윤에 필요한 세포벽 완화의 원인이라는 것이 제안되었다. 또한, XET 활성은 토마토 열매(크실로글루칸 올리고당에 의해 활성화될 수 있는 크실로글루카나제)에서 입증되었는데, 보고된 바에 의하여 상기 활성은 성숙기의 "절단(breaker)"단계에서 최고이며(참고 문헌 20), 연화 과정과 연관될 수 있다.

본 명세서는 한련으로부터 크실로글루칸 특이 엔도-(1-4)-β-D-글루카나제(크실로글루카나제/XET) 유전자의 단리에 대해 기재한다. 이 신규 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 요소는 크실로글루칸에 대해 매무 특이적이다(참조 문헌 11)

[발명의 요약]

일면에 있어서, 본 발명은 제9도에 나타낸 서열 NXG1의 뉴클레오티드 35 내지 919로 이루어지는, 크실로글루칸 특이 엔도-(1-4)-β-D-글루카나제 활성 보유 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 또는 그의 기능적 동등 서열을 제공한다.

당업자에게 명백한 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 기능적 동등 서열은 예를 들면, 동일 폴리펩티드를 암호화(그러나, 유전 암호의 축퇴성으로 인해 상이한 튜클레오티드 서열을 보유함)하는 뉴클레오티드 서열; 1개 이상의 보존된 아미노산 치환(즉, 한 아미노산이 유사한 성질의 다른 아미노산으로 치환)이 있을 수 있는 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 1개 이상의 작은 결실 또는 말단 절단이 있을 수 있는, (바람직하게는 50%이상의 아미노산 상동성, 보다 바람직하게는 60%이상의 아미노산 상동성을 갖는) 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 서열; 뉴클레오티드 35 내지 919의 상보 서열에 표준 조건하에서 혼성화하는 서열을 들 수 있다. 전형적으로, 상기 기능적 동등 서열은 75%이상, 바람직하게는 85%이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는다. 기능적 동등 서열의 한 예가 제9도에 나타낸 서열 NXG2(서열 번호 2)이다.

기능적 동등 서열의 특정예는 본 발명의 서열에 대한 안티센스 동등 서열로 이루어지는 서열이다. 일반적으로, 안티센스 서열이 기능적 동등 서열로 이해되고 있지 않지만, 본 발명의 목적을 위해서 이러한 서열을 포함하는 용어로서 기능적 동등 서열을 사용한다.

바람직하게는, 서열은 적합한 숙주 세포에서 발현을 가능케하기 위해 프로모터를 포함하는 적합한 5'-비번역 영역을 포함할 수도 있다.

바람직하게는, 서열은 실질적으로 본 발명의 3' 말단에 가깝게 인접한 "정지 (stop)" 코돈을 포함하는 적합한 3'-비번역 영역을 포함할 수도 있다. 정지 코돈외에도 3'-비번역 영역은 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 신호를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 3'-비번역 영역은 제9도에 나타낸 서열 NXG1의 뉴클레오티드 920 내지 1055를 포함한다.

필요한 경우, 서열은 유전자의 일부를 포함한다.

상기 유전자의 한 예로는 한련(Tropaeolum majus L.)기원 유전자로서, 그의 cDNA는 본 발명의 발명자들에 의해 클로화되고, 염기 서열이 결정되었다.

또 다른 면에서, 본 발명은 제9도에 나타낸 서열 또는 그의 기능적 동등 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 정의한 서열을 상기 벡터 내의 적합한 프로모터에 작동가능하도록 연결하여 다량의 효소를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 크실로글루카나제는 타마린드 종자 기원 크실로글루칸을 변경시키는데 유용한 것으로 알려져 있다.

따라서, 또다른 면에서, 본 발명은, 효소를 암호화하는 서열 또는 그의 기능적 동등 서열을 적절한 벡터에 삽입하는 단계, 숙주 세포를 상기 벡터를 사용하여 형질 전환시키는 단계, 효소가 발현될 수 있는 적합한 배양 조건에서 숙주 세포를 성장시키는 단계, 이어서 배양 배지 및(또는) 숙주 세포로부터 효소를 얻는 단계로 이루어지는 효소 생산 방법을 제공한다.

바람직하게는, 숙주 세포는 미생물이다. 반드시 필수적인 것은 아니지만, 숙주 세포는 진핵 세포가 바람직한데, 그 이유는 진핵 숙주가 완전한 기능적 구조의 효소를 발현하는 경향이 크기 때문이다.

식물에서 본 발명의 서열을 도입 및 발현하기 위해 사용될 수 있는 적합한 벡터는 공지되어 있다. 식물은 예를 들면 정상적으로는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 식물일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열은 이미 1이상의 상기 서열을 보유하는 식물내로 도입될 수 있다. 1이상의 상기 서열의 도입은 크실로글루카나제의 발현을 변경시키기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 서열 및 그의 기능적 동등 서열이 도입된 식물을 제공한다.

본래 발생되지 않거나, 상이한 수준으로 발생되는 식물에 있어서, 본 발명의 서열 또는 그의 기능적 동등 서열의 발현은 상기 서열에 의해 암호화한 효소의 활성으로 인해 이러한 식물의 특성을 변경시킬 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 마찬가지로, 안티센스 RNA를 만들기 위한, 본 발명의 서열에 상보적인 mRNA으로의 전사(기능적 동등 서열의 특정예)는 변종 식물의 내인성 크실로글루카나제 유전자 발현을 방해하고, 이로 인해 크실로글루카나제 활성의 수준을 감소시킬 수 있다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 크실로글루카나제 활성 수준을 변경시키기 위하여, 본 발명의 서열 또는 그의 기능적 동등 서열을 식물에 도입하는 것으로 이루어지는 식물 또는 그의 일부의 특성을 변경시키는 방법을 제공한다.

바람직하게는 변경되는 식물은 본 발명의 방법을 수행하기에 충분한 지식이 있고, 식물 내의 크실로글루칸이 구조적 기능을 갖는 모든 상업적으로 중요한 식물(과실 또는 채소류 포함)(즉 쌍자엽 및 비화본과 당자엽 식물)이다.

상기 식물의 예로는 자주개자리(alfalfa), 사과나무, 브로콜리, 양배추, 당근, 꽃양배추, 셀러리, 목화, 덩굴월귤, 오이, 가지, 아마, 포도나무, 양고추냉이, 키위, 상추, 망고, 멜론, 오일시드 평지(oilseed rape), 파파야, 완두, 복숭아 나무, 배 나무, 후추 나무, 플럼, 포플라, 감자, 나무 딸기, 콩, 가문비나무, 딸기, 사탕무우, 고구마, 담배, 토마토, 호두 나무를 들 수 있다.

식물 전체의 특성이 변경될 필요가 없음을 인식할 수 있다. 식물 부위들(예를 들면, 종자, 과실)의 성질을 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들면, 도입된 서열의 전사를 조절하는 조직 특이성 프로모터를 사용함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 방법은 식물의 관련 부위에서 크실로글루카나제의 활성 수준 및 크실로글루칸의 평균 분자량을 변경시키는 것으로 예상된다. 더우기, 크실로글루칸의 중요한 구조적 역할이라는 측면에서, 변경될 수 있는 특성으로는 크기, 성장 속도,조직(texture) 또는 성숙 속도를 들 수 있다.

본 발명을 하기의 예시적인 실시예와 도면을 참조하여 더 기재한다. 즉, 제1 및 2도는 조(粗)(제1a도) 또는 친화 정제된(제1b 또는 2도) 항 크실로글루카나제항체로 탐침화한 면역 블롯의 사진이고, 제3도는 항 크실로글루카나제 항체(레인 1 내지 3)를 사용하여 면역 침전시킨 한련 종자 RAN의 시험관내 번역 산물(레인 5 및 6)의 SDS-PAGE 분석 사진이다.

제4도는 한련 종자에서 크실로글루카나제 발현 수준 대 시간의 관계를 나타내고, 제5도는 한련 cDNA 클론의 제한 효소 분석 결과를 나타내고, 제6도는 cDNA 클론 2A에 대한 서브 클로닝 및 염기 서열 결정 전략을 나타내고, 제7도는 다양한 한련 크실로글루카나제 cDNA클론들의 관계를 나타내고, 제8도는 전장(全長)의 크실로글루카나제 코딩 서열을 포함하는 플라즈미드의 제조에 사용된 방법을 나타내고, 제9도는 완전한 크실로글루카나제 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열(NXG1), 기능적 동등 서열(NXG2) 및 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열(NXG1, 서열 번호 3)을 나타내고, 제10 내지 18도는 센스 및 안티센스 식물 발현 벡터를 제조하기 위해서 사용된 플라즈미드의 다양한 지도를 나타낸다.

[도면의 상세한 설명]

제1도

크실로글루카나제 활성은 저장된 크실로글루칸 보존물의 신속한 분해와 일치하는, 발아 후 12 내지 14일에서 최고로 나타났다. 이것이 처음부터(de novo) 크실로글루카나제의 합성을 나타내는 것인지를 입증하기 위해서, 발아하는 동안 단백질 수준을 웨스턴(Western) 블롯팅을 사용하여 정량화하였다.

12일째 발아중인 종자의 조추출물을 스털링(Stirling) 대학에서 준비한 조 다중 클론성 항체에 대하여 블롯팅(공지량의 항원과 함께)하였다. 강하게 교차 반응하는 폴리펩티드가 전체 종자 단백질의 약 0.5%에 해당하는 31kDa에서 확인되었다. 또한 45 내지 46kDa에서의 두번째 폴리펩티드도 조혈청과 교차 반응하였다 (제1a도).

조(粗) 항체는 겔 분별 크실로글루카나제(31kDa)를 사용하여 친화 정제하였다. 단백질(25㎍)을 진공 건조에 의해 농축시키고, PAGE에 의해 분별하고, 상기한 바와 같이 니트로셀룰로오스 필터상에 블롯팅하였다. 필터를 (1%아세트산 중의) 0.1% 풍소 S(Ponseau S)를 사용하여 염색하고, 1% 아세트산 중에서 탈색하였다. 니트로 셀룰로오스의 항원 결합 스트립을 트리스 완충 염수(TBS)중에 각각 5분씩 5회 세척하고, 4℃에서 TBS, 15% 헤모글로빈, 2.5%조 항체 중에서 20시간 동안 배양하고, 이어서 TBS중에서 세정하였다. 항체를 pH 2.8의 0.2M 글리신 중에 방출하고, 이어서 1M NaOH 또는 pH 8의 1M 트리스-HCl를 사용하여 중화시켰다. 친화 정제된 항체는 종자 추출물의 블롯중의 보다 큰 폴리펩티드를 더 이상 인식하지 못했으며(제1b도), 이는 크실로글루카나제에 면역학적으로 관련이 없는, 원래의 항원 제조에서의 작은 불순물일 수 있음을 암시한다.

제2도

친화 정제 항체를 사용하여 발아하는 동안 크실로글루카나제 수준을 정량화 하였다. 이 수준은 초기에 급격하게 상승하여, 발아 후 약 11일째 되는 날 최고점에 이르렀다(제2도). 이는 발아하는 한련에서 이전에 보고된 크실로글루카나제에서의 최고점과 일치하며, 이는 효소가 종자 발아 동안 처음부터 합성됨을 암시한다.

제3도

한련 자엽(2g)을 드라이 아이스 존재하 모울리넥스(Moulinex) 블렌더 중에서 조분쇄하고, 이어서, 액체 질소 존재하에서 막자 및 막자 사발을 사용하여 미분으로 분쇄하였다. RNA를 주로 홀(Hall)에 의한 문헌(참고 문헌 12)에 기재된 방법으로 크게 단리하되, 단 재현탁된 LiCl 침전물을 페놀/클로로포름(1:1)으로 2회 추출하였다.

관례적으로, 분광학적으로 순수한 RNA 500㎍을 발아 중인 한련 자엽 2g으로부터 얻었다. RNA는 아가로스 겔 전기 영동에 의해 대부분 완전한 것으로 판단되었다.

전체 RNA를 아머샴 인터내셔날(Amersham International)에 의해 공급되는 무세포의 뉴클레아제 고갈된 밀 배아 번역 시스템을 사용하여 실험관내 번역하였다. 관례적으로, 1M 포타슘 아세테이트 12㎕, 메티오닌 제거 아미노산 혼합물 8㎕,³⁵S-메티오닌(아머샴 인터내셔날, 800Ci/mmol) 10㎕, H₂O 34㎕ 및 밀 배아 추출물 60㎕을 함유하는 혼합물을 제조하였다. 총 RNA(10㎍) 1㎕를 밀 배아 혼합물 14㎕과 함께 25℃에서 60분 동안 배양하였다. 번역 혼합물(10㎕)을 H₂O/SDS(0.1%, 0.5%, 1% 또는 2% SDS) 100㎕중에서 1분간 비등시키고, 이어서 면역 침전 완충액(1% 트리톤 X-100, 50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.3M NaCl) 900㎕와 함께 항체 1㎕의 존재 또는 부재하 20℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 단백질 A-세파로스(Protein A-Sepharose) (1mg)을 첨가하고, 1시간 더 배양시키고, 침전된 항원-항체/단백질 A-세파로스 복합체를 벤치 탑 미크로 원심분리기에서 원심분리하여 수집하였다. 펠렛을 면역 침전 완충액으로 2회, pH 8.0의 50mM 트리스-HCl로 1회 세척하고, 이어서 램리 (Laemmli) 시료 완충액 중에서 1회 비등시키고, PAGE로 분석하였다. 결과를 제3도에 나타내었는데, 이는 번역 산물이 2% SDS(레인 1), 1% SDS(레인 2), 0.5% SDS(레인 3), 0.1% SDS(레인 4)의 존재시, SDS 결여시(레인 5), 및 항체 결여시(레인 6)에 면역 침전되는 경우를 보여준다. 레인 7은 단백질 분자량 표지물(아머샴사 제조) 및 면역 침전된 크실로글루카나제를 포함한다. 0.5% 이상의 SDS에서, SDS겔 상의 겉보기 분자량이 33.5kDa인 단일 폴리펩티드가 친화 정제된 항 크실로글루카나제 항체에 의해 면역 침전(트랙 1 내지 3, 겔의 거의 중간 아래)되었다.

면역 침전된 크실로글루카나제는 종자 추출물에서 검출된 성숙 단백질 (31kDa)보다 2.5kDa만큼 더 크다. 이러한 발견은 크실로글루카나제가, 세포벽을 표적으로 하는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 전구체로서 합성된다는 것과 일치한다.

제4도

총 RNA는 8,9,10 및 12일째 발아하는 한련 종자로부터 단리하였다. RNA 10㎍를 시험관 내 번역을 하고, 항 크실로글루카나제 항체 및 단백질 A-세파로스 비드를 사용하여 면역 침전된 크실로글루카나제 전구체를 방사선 동위 원소로 표지하였다. 크실로글루카나제 수준을 PAGE로, 이어서, 플루오로그라피 및 주사레이저 밀도법에 의해 정량화하였다. 막대그램 형태로 제시된 결과(제4도)는 크실로글루카나제 mRNA의 수준이 크실로글루카나제 단백질 수준 및 효소 활성과 협조하여 발아시 증가하여, 12일 째 최고에 도달하는 것을 나타낸다.

제5도

다수의 12일 째 총 RNA 제조물을 함께 모으고, 폴리 A⁺RNA 20㎍을 폴리 U 세파로스 크로마토그래피에 의해 단리하였다. 폴리 U 세파로스는 BRL로부터 공급되는 것으로서, 칼럼을 제품 설명서에 따라 준비하였다. RNA(4㎍이하)를 결합 완충액(0.2M NaCl, 10mM 트리스-HCl pH 7.5 1mM EDTA, 0.2% SDS)중의 컬럼상에 걸고, 이어서 이 완충액을 사용하여 수집된 분획물의 OD₂₆₀이 무시될 때까지 컬럼을 세척하였다. 이어서, 폴리 A⁺RNA를 용출 완충액(90% 포름아미드, 10mM 트리스-HCl pH 7.5 1mM EDTA, 0.2% SDS)중에서 컬럼으로부터 세척하고, 에탄올 침전을 이용하여 농축시켰다.

폴리 A⁺RNA 2.5㎍를 클로닝 벡터, 람다 ZAPII[스트라타젠(Stratagene) 사에서 구입하여, 제품 설명서에 따라 사용함)중에서 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용하였다. 이 벡터의 주요 이점은 생체내 절단을 통하여 지향성 cDNA 클로닝 및 신속한 서브 클로닝을 제공하는 것이다. 얻어진 라이브러리의 적정값은 약 일백만 클론이고, 이것의 75% 측정치가 재조합된 것이었다.

라이브러리의 일부(40,000 클론)를 즉시 플레이팅하고 증폭시켰다. 대장균 (E. coli) 수레(SURE) 세포를 사용하여 20,000 클론을 플레이팅하고, 조 항크실로글루카나제 항체로 스크리닝하였다. 4개의 양성 반응 클론을 확인하였다. 상기 양성 클론에 대응하는 파지 스톡(stock)을 회수하고, 후속적인 플레이팅 및 스크리닝에 의해 플라크(plaque)를 정제하였다.

플라즈미드 DNA를 세포내 절단하고, 증식시키고, 제한된 제한 분석법을 수행하였다(제5도). 모두 4개의 클론이 내부 Sal 1 자리를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 2개의 가장 큰 클론은 3' 말단 가까이에 HindIII 자리를 가졌다. 전체 4개의 클론의 cDNA 삽입체를 BamH1 및 Xho1으로 분해시켜 절단하고, 크실로클루카나제 특이 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 써던(Southern) 블롯팅하였다.

크실로글루카나제 펩티드 Fll : Asn Tyr Met Val Tyr Asn Tyr

(서열 번호 4의 일부)

NEG1 올리고뉴클레오티드 혼합물 : TTA ATA TAC CAN ATA TTA AT

G G G G

(서열 번호 5, 및 나타낸 위치중 1개 이상에서 G를 포함하는 변이체)

모두 4개의 cDNA 삽입체가 크실로글루카나제 특이 탐침에 혼성화되었다(결과는 나타내지 않음)

제6도

가장 큰 클론(2A)를 M13 서브 클로닝 및 DNA 서열 분석하였다(제6도). 6개의 유전자 특이 내부 DNA 프라이머를 사용하여, 삽입체(EcoR1-HindIII)를 양방향으로 완전히 서열 결정하였다. 서열 결정된 단편은 길이가 914p이고, 528개의 뉴클레오티드(176개의 아미노산)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다.

제7도

4종의 크실로글루카나제 lysC 펩티드인 F11, F13, F14 및 F20(각각 서열 번호 4, 6, 7 및 8)을 2A ORF 내에 위치시키고, 크실로글루카나제 cDNA 클론으로 그 존재를 확인하였다(제7a도). 또한, 4개 펩티드 모두는 추론된 아미노산 서열에서 리신 잔기 뒤에 놓인다.

크실로글루카나제 전사물의 크기를 노던(Northern) 블롯팅에 의해 측정한 결과 약 1.5kb(데이타를 제시하지 않음)로서, 한련의 시험관내 번역으로부터 면역 침전된 크실로글루카나제 전구체를 암호화하기에 충분한 크기였다. 이 33.5kDa의 단백질(약 290 아미노산)은 특정 870bp의 ORF에 의해 암호화되는 것으로 보여진다. 5' 번역 초기 신호의 결여와 함께, 이러한 발견은 2A가 5'코딩 영역 및 5' 비코딩 영역의 본질적인 부분이 없는 부분적 크실로글루카나제 클론임을 암시한다.

한련 cDNA 라이브러리로부터 전장의 크실로글루카나제 클론을 단리하기 위해서, 클론 2A의 5' 말단(뉴클레오티드 2 내지 31)에 대응하는 올리고뉴클레오티드 (NEG 5)를 합성하였다.

(첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 9)

NEG 5 : CCAGGTATTGTTCCGAGAAATTCAATATCG(안티센스)

이것을 방사선 동위 원소로 표지하고 1차 및 증폭된 cDNA 라이브러리 모두를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 그러나, "추정의" 양성 클론의 수를 확인하고, 이들을 모두 계속된 NEG5 스크리닝으로 제거하였다. 증폭된 라이브러리의 100,000 클론(약 40,000개의 1차 클론을 나타냄)를 항 크실로글루카나제 항체를 사용하여 스크리닝 하고, 78개의 양성 클론을 확인하였다. 취급의 편의를 위하여, 이들은 각각 20 및 58 클론을 함유하는 A 및 B의 두 군으로 나누었다.

항체 스크리닝으로부터 추정의 양성 클론을 포함하는 20개의 파지 스톡(A군)을 회수하고, 이어서 항체 스크리닝으로 플라크 정제하였다. 이어서, 플라크 순수 파지 스톡을 5' 특이 크실로글루카나제 올리고뉴클레오티드 탐침인 NEG5를 사용하여 스크리닝하였다. 20개의 클론 중 9개가 NEG5와 양성 신호를 보였다. 상기 클론에 대한 플라즈미드 DNA를 생체내 절단하고 제한 효소 BamH1 및 Sal1을 사용하는 분해에 의해 분석하였다. 이에 의해 클론 9개 중 8개에서 내부 Sal1 제한 자리의 존재를 확인하였고, 가장 긴 5' 영역을 갖는 것으로서 클론 8.2를 확인하였다.

8.2의 BamH1-Sal1 단편을 M13 mp9로 클론화하고, M13 범용 프라이머를 사용하여 서열 결정하였다. 클론 8.2가 2A보다(5' 말단에서) 40bp 더 긴 것으로 밝혀졌다(제7c도).

클론 8.2의 뉴클레오티드 4 내지 26에 대응하는 두번째 5' 특이 크실로글루카나제 올리고뉴클레오티드(NEG 6)를 합성하였다.

(첨부된 서열 목록에서 서열 번호 10)

NEG 6 : CCTGGATAGTCTTGATTATTCGA(안티센스)

NEG 6은 23개의 뉴클레오티드 중 9개의 GC를 포함하고, ZAPII 라이브러리 중의 크실로글루카나제 클론의 대다수의 상부 스트림에 놓인 영역에 대응한다.

i) PCR 증폭

ii) mRNA 프라이밍, 또는

iii) 올리고뉴클레오티드 스크리닝

중 어느 하나에 의한 전장의 크실로글루카나제 cDNA의 단리를 용이하게 하는 방법이 고안되었다.

항체 스크리닝으로부터 추정의 양성 클론을 함유하는 58개의 파지 스톡(B군)을 회수하였다. 양성 클론의 cDNA 삽입체(5' 말단)을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증폭시켰다. 이 반응은 10 내지 50% 플라크 순수 파지 스톡반 5㎕ 또는 증폭된 cDNA 라이브러리 스톡(10^-2희석)을 사용하여 수행하였다. PCR 생성물의 재차 증폭을 H₂O 15㎕중에 재현탁된 겔 정제 DNA를 사용하여 수행하였다. 반응을 완충액 (10mM 트리스-HCl pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01%[w/v] 젤라틴) 100μ중의 50pmol 의 센스 및 안티센스 프라이머, 20mM dNTPs 및 2.5단위의 Taq 폴리머라제(스트라타젠)를 사용하여 수행하였다.

부분적으로 순수 파지 스톡 및 겔 정제 DNA를 94℃에서 30초(변성), 55℃에서 20초(어닐링) 및 72℃에서 30초(연장)의 30사이클을 사용하여 증폭시켰다.

cDNA 라이브러리 스톡을 하기의 단계를 사용하여 증폭시켰다.

- 95℃에서 2분

- 95℃/2분, 55℃/20초, 72℃/2분의 1사이클

- 95℃/30분, 55℃/20초, 72℃/2분의 5사이클

- 95℃/30분, 55℃/20초, 72℃/30초의 24사이클

- 72℃에서 5분

- 4℃에서 유지

초기에 21 머(mer) 프라이머(약50% GC 풍부)를 사용하였다.

(첨부된 서열 목록에서 서열 번호 11)

1) XPCR1 GACCATGATTACGCCAAGCTC(블루스크립트(Bluescript) 벡터)

(서열 번호 12)

2) XPCR2 TGTTGTTGGCTCAACTGACCA(안티센스 크실로글루카나제)

증폭된 cDNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 5개의 가장 긴 클론을 확인하였다.

5개의 가장 긴 클론(5' 말단)의 cDNA 삽입체를 두번째 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증폭하였다. XPCR1 및 NEG6 프라이머를 사용하여 클론이 8.2보다 길다는 것을 확인하였다.

클론 3.4(pSK 3.4)의 BamH1-Sal1 단편은 M13 mp9 및 mp8로 서브클로닝하고, 각각 M13 범용 프라이머 및 NEG6을 사용하여 서열 결정하였다. 크실로글루카나제의 존재를 클론 2A 및 8.2와의 서열 중복에 의해 확인하였다. 클론 3.4의 cDNA 삽입체는 8.2보다 74bp 더 길지만(5' 말단에서), 완전한 크실로글루카나제 ORF를 포함할 만큼 길지 않았다(제7d도).

증폭된 ZAPII 라이브러리 스톡을 XPCR1 및 XPCR2를 사용하여, 크실로글루카나제 클론의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 이는 라이브러리 중의 크실로글루카나제 클론 대다수가 2A와 길이가 유사한, 즉 부분 클론이지만, 라이브러리는 작은 비율의 보다 큰 클론을 포함하기도 함을 입증시켜주었다.

두번재 증폭을 XPCR1 및 NEG6B(증폭된 생성물의 클로닝을 용이하게 하기 우해서, NEG6의 5' 말단에 있는 BamH1 자리)를 사용하여 수행하였다:

(첨부된 서열 목록에서 서열 번호 13)

NEG 6B : GAGGATCCTGGATAGTCTTGATTATTCGA

NEG 6B 프라이머는 클론 2A의 5'말단 상부 스트림에 위치하고, 따라서 라이브러리 중 소수의 보다 긴 크실로글루카나제 클론에 대해 특이적이어야 한다. PCR은 다수의 밴드를 제공하고, 이를 겔 정제 및 재증폭하여 서브클로닝용 순수 DNA를얻었다. 450bp(1) 및 250bp(2) 단편을 EcoR1 및 BamH1을 사용하여 분해시키고, H13 mp8 및 mp9로 클로닝하였다. 플라스미드 pM13 XGPCR1는 보다 큰 단편을 M13mp9로 클로닝하여 제조하였다. 보다 큰 단편을 서열 결정하여, cDNA 부분이 346bp의 길이를 갖고, cDNA 클론 3.4와 75bp 중복됨을 알아냈다. 제7도는 cDNA 클론 2A, 8.2 및 3.4와 PCR 증폭 cDNA 단편 사이에 중복됨을 보여준다.

제8도

pM13 XGPCR1의 이중 가닥 DNA(RF)을 제조하고, cDNA의 5'말단을 포함하는 EcoR1-Pst1 단편을 회수하였다. 이것을 EcoR1-BamHI 어댑터를 사용하여 EcoR1-BamHI 절단 pSK3.4(이 플라즈미드는 람다 ZAP II 라이브러리로부터 3.4cDNA 클론의 생체내 절단에 의해 형성됨)으로 연결시켜 pSKNXG를 제조하였다(제8도)

제9도

제9도는 전장의 한련 크실로글루카나제 cDNA의 뉴클레오티드 서열(NXG1)을 보여준다. NXG1은 PCR 증폭 cDNA 단편(뉴클레오티드 1 내지 353) 및 cDNA 클론 3.4(제7d도, 뉴클레오티드 279 내지 1229)로부터 유도된다. 즉, PCR 단편과 클론 3.4 사이에 75bp(완전한 상동성)의 중복이 있다. 길이가 약 1300bp이고, 885bp(295 아미노산)의 ORF를 포함한다. 박스 구역은 제7a도에서 보여준 펩티드 F20, F13, F14 및 F11의 위치를 보여준다. 또 다른 프레임내(in-frame) ATG 3중자(triplet)가 나타낸 서열의 출발로부터 18bp 상류에 존재한다. 이 다른 ATG 코돈에 있는 서열 5'은 식물 번역 개시 신호에 대한 공통 서열과 덜 유사하지만 가능한 후보이다. 이러한 별개의 ATG 코돈이 실제 번역 개시 코돈인 경우, 얻어진 유전자 산물은 본 발명의 서열의 기능적 동등 서열이 될 것으로 예상된다.

또한, NXG1에 의해 암호화한 폴리펩티드 서열(NXG1)을 단일 문자의 아미노산 코드를 사용하여 제9도에 나타내었다. NXG1와 NXG2 사이의 서열 차이는 비교를 위해 나타냈다. NXG2는 cDNA 클론 2A(제7b도, 뉴클레오티드 41 내지 954) 및 8.2(제7c도)로부터 유도된 기능적 동등 서열로서, 5'말단에서 클론 2A보다 40bp 더 길다.

제10 내지 18도 : 변종 식물에서 한련 크실로글루카나제의 센스 및 안티센스 서열의 발현

a) pSLJ2'LNOS의 제조

벡터 pSLJ1006(참고 문헌 13)를 제한 효소 Cla1로 분해시켰다(제10도). 2008bp의 DNA 단편(β-글루쿠로니다제[GUS] 유전자 및 노팔린 신타제(synthase) [NOS] 3' 종결 서열)을 회수하고, Cla1 선형화 블루스크립트 SK⁺에 연결시켜 pBLUE-GUS-NOS(제11도)를 제조하였다. 이 벡터를 제한 효소 Xba 및 Sst1로 분해시키고, 1852bp의 GUS 유전자 단편을 하기의 폴리링커 서열(-Xba-EcoR1-Xho1-Sst1-Bg12-Cla1-)로 대체시켜 pBLUE-L-NOS(제12도)를 얻었다.

5' CTAGAGAATTCTCGAGAGCTCAGATCTATCGATAGCT 3'

(서열 번호 14)

3' TCTTAAGAGCTCTCGAGTCTAGATAGCTA 5'

(서열 번호 15)

pSLJ2'LNOS(제13도)를 Cla1을 사용하여 pBLUE-L-NOS로부터 링커 NOS(L-NOS) 단편을 회수시켜 제조하고, 이것에 pSLJ1006의 큰(벡터 부분) Cla1단편을 연결시켰다.

b) pSLJGXN-S의 제조

벡터 pSLJGXN-S(제14도)를 pSKNXG(제15도, 이 플라스미드는 앞서 제8도에서 참조 인용됨)로부터 Xba-Sall DNA 단편상의 한련 크실로글루카나제 코딩 영역을 효소 Xho1 및 Xba로 분해시킨 벡터 pSLJ2'LNOS로 삽입시켜 제조하였다.

c) pSLJGXN-X의 제조

벡터 pSLJGXN-X(제16도)를 pSKNXG로부터 Xba-Sal1 DNA 단편상의 한련 크실로글루카나제 코딩 영역을 벡터 pSLJ2'LNOS의 대응하는 자리에 삽입시켜 제조하였다.

d) pSLJNXG의 제조

벡터 pBLUE-NXG(제17도)를 Xho1(평활된 부착 말단) 및 Sst1로 플라스미드 pSKNXG를 분해시키고, NXG 단편은 EcoR1(평활된 부착 말단) 및 Sst1로 분해시킨 pBLUE-L-NOS의 벡터 부분으로 이동시켜 제조하였다. 이어서, 크실로글루카나제 코딩 영역을 pBLUE-NXG로 부터 Xba 선형화 pSLJ2'LNOS로 Xba DNA 단편상에 이동시켰다. 얻어진 클론을 센스 방향으로 크실로글루카나제 유전자 단편의 삽입을 위해 스크리닝하였다(pSLJNXG)(제18도).

상기 T-DNA 제조물을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens 종 LBA 4404로 이동시킨 후, 표준 식물 형질 변환 방법을 사용하여 담배잎 원반상 조직 또는 토마토 자엽 단편을 형질 변환시키기 위해 사용하였다. 본래의 T-DNA 단편의 이동을 PCR/게놈 써던 블롯 분석법을 사용하여 확인하였다(데이타는 나타내지 않음).

구성성 또는 적당히 유도성인(예를 들면, 성장에 따라 조절되는) 프로모터 서열의 조절하의 센스 서열의 발현은 크실로글루카나제 mRNA를 생성시키며, 이 mRNA는 번역되어 변종 식물에서 크실로글루카나제 효소 수준을 증가시킨다.

구성성 또는 유도성 프로모터 서열의 조절하의 안티센스 유전자의 발현은 내인성 크실로글루카나제 mRNA에 상보적인 mRNA를 제조한다. 서로 DNA 상보성이 상당한 수준인 내인성 및 안티센스 mRNA는 RNA 복합체를 형성하고, 이로 인해 내인성 mRNA의 정상적인 전사, 가공, 이송 또는 번역을 방해할 수 있다. 또한, 불안정한 이중 가닥 표준 RNA 복합체는 분해될 수 있다.

안티센스 유전자 기법은 총 가시적 표현형 수준(예를 들면, 유색 꽃잎 대신 무색 꽃을 유도하는 피튜니아 꽃입에서의 안토시아닌 생성 결여)(참고 문헌 14) 및 생화학적 수준(예를 들면, 토마토 과실 성숙시의 폴리갈락투로니다제의 양 변화 및 헥틴의 해중합의 감소)(참고 문헌 8) 모두에서 적용됨이 입증되었다.

상기 방법을 사용하여 크실로글루칸 엔도크실로글루카나제의 목적하는 수확수준을 변경시킬 수 있다. 한련 항 크실로글루카나제 항체를 사용하여 형질 전환된 식물 조직중의 크실로글루카나제 수준을 측정할 수 있다. 이어서, 크실로글루카나제의 변경된 수준은 변경된 표현형 특성, 예를 들면, (과실 또는 채소에 대한) 성장 속도, 기관 탈리 또는 조직 및 저장 특성과 상호 관련될 수 있다.

[참고문헌]

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4. 히아시(T. Hyashi)의 문헌(Xyloglucans in the primary cell wall, Ann Rev Plant Physiol & Plant Mol Biol, 40, 139-168, 1989).

5. 크룩스 및 그리어슨(P R Crookes & D Grierson)의 문헌(Ultrastructure of tomato ripening and the role of polygalacturonase isoenzymes in cell wall degradation. Plant Physiol. 72, 1088-1093, 1983).

6. 프라이(S Fry)의 문헌(Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of Angiosperms. Ann Rev Plant Physiol, 37, 165-186, 1986).

7. 버드(C R Bird) 등의 문헌 (The tomato polygalacturonase gene and ripening specific expression in transgenic plants. Plant Mol Biol, 11, 651-662, 1988).

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9. 카스(L G Cass)등의 문헌(Isolation and characterisation of a cellulase gene family member expressed during avocado fruit ripening. Mol Gen Genet, 223, 76-86, 1990).

10. 턱커 및 밀리간 (M L Tucker & S B Milligan)의 문헌(Sequence analysis and comparison of avocado fruit and bean abscission cellulases. Plant Physiol, 95, 928-933, 1991).

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13. 존즈(J Jones) 등의 문헌(Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in trasgenic plants. Transgenic research, 1, 285-297, 1992).

14. 반 데르 크롤(van der Krol) 등의 문헌 (Nature, 333, 866-869, 1988).

15. 와까바야시(K Wakabayashi)등의 문헌 [Differential effect of auxin on molecular weight distributions of xyloglucans in cell walls of outer and inner tissues from segments of dark grown squash(Cucurbita maxima Duch.). hypocotyls. Plant Physiol, 95, 1070-1076, 1991].

16. 히아시(T Hyashi)의 문헌 (Xyloglucans in the primary cell wall. Ann Rev Plant Physiol & Plant Mol Biol, 40, 139-168, 1989).

17. 후버(D J Huber)의 문헌(Polyuronide degradation and hemicellulose modifications in ripening tomato fruit. J. Amer Soc Hort Sci, 108(3), 405-409, 1983).

18. 파누티(C Fanutti) 등의 문헌 [Action of a pure xyloglucan endotransglycosylase(xyloglucan-spedific endo-(1-4)-beta-D-glucanase가 정식 명칭) from the cotyledons of geminating nasturtium seeds. the Plant Journal(인쇄중)].

19. 프라이(S C Fry) 등의 문헌 (Xyloglucan endotransglycosylase, a new wall-loosening enzyme activity from plants. Biochem. J, 282, 821-829, 1992).

20. 마클라클란 및 브레디(G Machlachlan and C Brady)의 문헌(Multiple forms of 1,4-beta-glucanase in ripening tomato fruits including a xyloglucanase activatable by xyloglucan oligosaccharides. Aust. J Plant Physiol, 19, 137-146, 1992).

Claims

제9도(서열 번호 1)에 나타낸 서열 중 뉴클레오티드 35 내지 919을 포함하는 크실로글루칸-특이 엔도-(1,4)-β-D-클루카나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 75% 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열.
제1항에 있어서, 5'-비번역 영역을 더 포함하는 서열.
제1항 또는 제2항에 있어서, 3'-비번역 영역을 더 포함하는 서열.
제1항 또는 제2항에 있어서, 한련(Topaeolum majus L.)으로부터 얻을 수 있는 서열을 포함하는 서열.
제1항 또는 제2항의 서열을 포함하는 벡터.
제1항 또는 제2항의 서열이 도입된 식물 세포.
제1항 또는 제2항의 서열을 도입하는 것을 포함하는 식물 전체 또는 그의 일부의 특성의 변경 방법.
제7항에 있어서, 상기 변경되는 특성에 크기, 조직 또는 성숙 속도가 포함되는 방법.
제7항에 있어서, 과실 또는 채소의 특성이 변경되는 방법.
제9항에 있어서, 토마토 식물 전체 또는 그의 일부의 특성이 변경되는 방법.
제1항 또는 제2항의 서열을 적합한 벡터에 삽입하는 단계; 상기 벡터로 적합한 미생물 또는 식물 세포를 형질 전환시키는 단계; 효소가 발현되는 적합한 배양 조건에서 상기 형질 전환 미생물 또는 식물 세포를 성장시키는 단계; 배양 배지 및(또는) 미생물 또는 식물 세포로부터 효소를 얻는 단계를 포함하는 크실로글루칸-특이 엔도-(1,4)-β-D-글루카나제 활성을 갖는 효소의 제조 방법.