JPH03180180A - 植物細胞壁由来エンド―１，４―β―グルカナーゼとその抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 植物細胞の伸長作用をもたらす植物ホルモンのオーキシ
ンは、エンド−１，４−β−グルカナーゼを誘導して細
胞壁にゆるみをもたらせることが知られている。この酵
素を単離して、植物細胞壁の軟化や分解に用いることが
産業的に望まれている。

また、この酵素の抗体を用いることによって、逆に分解
の程度をコントロールすることや、遺伝子をクローニン
グすることができる。

本発明は、これらに利用できる植物細胞壁由来エンド−
１，４−β−グルカナーゼとその抗体を提供するもので
ある。

〔従来の技術〕

オーキシンで誘導され、細胞壁に局在するエンド−１，
４−β−グルカナーゼは、エントウ上胚軸より単離され
ている（Ｈ，Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
ｃｈｅｍ、。

２５０、１０１２−１０１８．１９７５）、このものは
分子量７０，０００、等電点６．９、そして比活性が３
．２９Ｘ１０’Ｕ／■蛋白である。

〔発明が解決しようとする課題〕

エンド−１，４−β−グルカナーゼを種々の用途に供す
るため、多種の酵素の開発が望まれており、また、比活
性の高い酵素の開発が要望されている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討の結果エ
ントウ上胚軸より新たなエンド−１，４−β−グルカナ
ーゼを単離することに成功し、該酵素が比活性も高いも
のであることを見出し、さらに該酵素に対する特異抗体
の作製にも成功して本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、β−１，４−グルカンをエンド型
で分解する活性を有し、分子量４万６千、等イオン点７
．２、至適ｐＨが６．２、オーキシンにより誘導されて
細胞壁に局在するエンド−１，４−β−グルカナーゼと
この酵素蛋白と特異的に結合する抗体に関するものであ
る。

実施例で得られた本発明の酵素蛋白は次の物性を有して
いる。

１）物性 ■分子量 ＳＯ３−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５
ｕｌｆａｔｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｗｉｄｅ　ｇｅｔ
　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による電気泳動法
で得られた分子量は４６．０００であった。

■等電点 等電点電気泳動法で得られた等電点ｐｌ＝７．２であっ
た。

２）酵素活性 ■活性測定法 β−１，４−グルカンを分解する活性は次のようにして
測定した。Ｃａｎｎｏｎ粘度計に１．９　ｄの０．３％
カルボキシメチルセルロース（２０ｍＭナトリウムリン
酸緩衝液ｐＨ６，２に溶解）を加え、１００μ２の酵素
液を加えた後、一定時間中に低下した粘度を測定した。

１ユニツト（ｕｎｉｔ）の活性は、２時間に１％の粘度
低下を生じさせる酵素量として定義した。

■至適ｐｔｔ 反応液緩衝液のｐＨを変えて活性を測定したところｐｌ
＋６．２で最高の活性を示した。

■基質特異性 植物細胞壁に存在するβ−１，４−グルコシル結合を有
する多糖、キシログルカン、リケナンおよびセルロース
を分解した。これに対して、β−１゜３−グルカン、β
−１，６−グルカン、β−１，６−グルカンおよびその
地歩糖類は分解しなかった。

■基質に対する親和性 エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性のカルボキシセ
ルロース、セロヘキサオースおよびキシログルカンに対
する親和性す値は、ともに３．８■７ｍｌであった。

■植物組織中でのオーキシンによる誘導植物組織をオー
キシン溶液で噴霧することにより、活性が１００倍〜１
０００倍に上昇した。

上記の酵素は従来のエンド−１，４−β−グルカナーゼ
と明らかに異なり、特に分子量、等電点及び至適ｐｉが
大きく異なっているところから本酵素を新規な酵素であ
ると判断するに至った。

本発明で得られたエンド−１，４−β−グルカナーゼに
特異的に結合する抗体は次の物性を有している。

（１）起源 マウスＩｇＧ由来の抗体 （２）結合能 抗体をエンド−１，４−β−グルカナーゼとともにイン
キュベイトした後、抗体をプロティンＧ−セファロース
で除くことにより、酵素活性を除去することができる。

また、エンド−１，４−β−グルカナーゼを電気泳動（
ＳＯ５−ＰＡＧＥ）に供した後、抗体を作用させると、
分子量４６．０００のバンドルのみ抗体は結合する。

このような植物細胞壁由来のエンド−１，４−β−グル
カナーゼは、高等植物であればその種類は問うところで
はなく、例えばエントウ、ダイズ、タバコ、ニンジン、
トマト、カエデ、ポプラ等の双子葉類、イネ、コムギ、
トウモロコシ、オオムギ等の単子葉類などの植物組織か
らオーキシンにより誘導させて取得することができる。

オーキシンによるエンド−１，４−β−グルカナーゼの
誘導は常法によって行えばよく、噴霧液は、０．０１〜
１％オーキシンを含む溶液を用いる。オーキシンは、イ
ンドール酢酸、インドール醋酸等の天然オーキシンの他
、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸やα−ナフタレン酢
酸等の合成オーキシンも用いることができる。この溶液
にはさらにトウィーン８０１トライトンＸ−１００、ラ
ノリン等の界面活性剤を含ませることによって噴霧回数
を１〜２回ですませることができる。誘導は通常１〜１
０日間程度で達成できる。

エンド−１，４−β−グルカナーゼを取得するには、ま
ず誘導が行なわれた植物組織の細胞壁を集める。細胞壁
の調製は、２０〜１００ｍＭ程度の低塩濃度溶液、例え
ば２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，２＞で数回ホモジナ
イズした後、生じる不溶性画分を集めることによって行
なうことができる。次に、この細胞壁から１〜５Ｍ程度
の高塩濃度溶液で抽出を行なう。塩は通常塩化ナトリウ
ムが用いられるが、ナトリウム、リチウム、カリウム等
のアルカリ金属塩を広く用いることができる。高塩濃度
溶液にもリン酸緩衝液等の緩衝液を溶媒に用いることが
望ましい。

抽出液から、本発明のエンド−１，４−β−グルカナー
ゼを取得するには、例えば蛋白等の高分子をイオンの性
質や親和性に基づいて分画する公知の方法を利用するこ
とができる。このような方法の例としては、イオン交換
クロマトグラフィーアフィニティクロマトグラフィー、
電気泳動法、透析硫安塩析法、限外濾過法などを挙げる
ことができる。

本発明のエンド−１，４−β−グルカナーゼに対する抗
体を取得するには、エンド−１，４−β−グルカナーゼ
を動物体内にアジュバントとともに注入した後、その血
清から取得することができる。

動物は、マウス、ウサギ、ヤギ、イヌ等なんでもよく、
抗体の生成まで通常２〜８週間の期間が必要である。抗
体の単離精製を行なう場合に・はアフィニティークロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、エタノ
ール分画法等の公知の方法を利用すればよい。

〔実施例〕

実施例１　エントウ由来エンド−１，４−β−グルカナ
ーゼの調製 エントウ種子をバーミニキュライトに蒔いた後、暗黒下
２０℃で１週間培養して発芽、生長させた。

このエントウ苗の第３節間に０．１％２．４−ジクロロ
フェノキシ酢酸と０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍ
Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を噴霧した。エントウ
苗はさらに２０°Ｃで暗黒下さらに５日間培養し、肥大
生長した部分（第３節間）をハサミで切り取ることによ
り誘導が行なわれたエントウ組織を採取した。

エントウ組織（４ｋｇ）は、２倍量のリン酸緩衝液（５
％グリセロールおよび０．０１％アザイドを含む２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６，２）とともに５回ホモジナ
イズした。遠心分離した残置（細胞壁）に１Ｍ塩化ナト
リウムを含むリン酸緩衝液を加えてホモジナイズして濾
過することにより、抽出液を得た。得られた抽出液を硫
安８０％により塩析して沈澱する蛋白を集めた。得られ
た粗蛋白をＤＥＡ［Ｅ−セルロースカラム（５Ｘ５０ｃ
ｍ）に通して、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性
画分を得た。活性画分（５００ｄ）は、アミコンＰＭ−
１０限外濾過膜で濃縮（１０ｄ）した。濃縮液を（：ｏ
ｎＡ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１，Ｉ　Ｘ　２
５ｃｍ　）に通し、充分にリン酸緩衝液で活性画分を溶
出した。活性画分は、透析した後、凍結乾燥し、少量の
リン酸緩衝液に溶かし、５ＯＳ−ＰＡＧＥに供した。グ
ルカナーゼを含む両分を１０％グリセロールと４％ＳＤ
Ｓを含む１２５ＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）とともに３７°Ｃで１５分間処理をすることによって
蛋白のＳＤＳ化を行なった。電気泳動は、７．５％のポ
リアクリルアミドゲル中、４”Ｃ，２０ｍＡで３０分間
行なった。電気泳動の後、ゲルをリン酸緩衝液で１０分
間づつ５回洗浄し、活性画分を切り出して１Ｍ塩化ナト
リウムを含むリン酸緩衝液で４°Ｃ１１晩抽出した。エ
ンド−１，４−β−グルカナーゼの精製、単離結果を表
１にまとめた。

表１ 実施例２ （１）エンド−１，４−β−グルカナーゼに対する抗体
の調製 エントウ由来エンド−１，４−β−グルカナーゼを５Ｏ
５−ＰＡＧＥで分離して得られた活性バンドを切り抜き
、０．９％塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液とともに
ホモジナイズした。これを同量のＦｒｅｕｎｄ’ｓのア
ジュバントとともにホモジナイズして、マウスの背中に
注入した。２週間後、もう−度注入し、５日後に採血し
てその血清中から抗体を得た。抗体の力価は１０−’血
清７０．１μｇ酵素蛋白であった。

（２）抗体によるエンド−１，４−β−グルカナーゼ活
性の中和 抗体とエンド−１，４−β−グルカナーゼを０．９％塩
化ナトリウムを含むリン酸緩衝液とともに４°Ｃで１時
間インキベイトした。反応液にプロティンＧ−セファロ
ースを加えてさらに１時間インキュベイトした。遠心分
離の後、上清を取って活性を測定した。加える抗体の量
を増やすことによって、活性の低下を認めた（図１）。

（３）ウェスタンプロット法による、エンド−１，４−
β−グルカナーゼと抗体の結合実験 エンド−１，４−β−グルカナーゼを５ＯＳ−ＰＡＧＥ
に供した後、分離された蛋白をナイロンメンプランに転
写した。このナイロンメンプランを抗体を含むリン酸緩
衝液とともにインキュベイトした後、ビオチンでラベル
した抗マウスＩｇＧとともにインキュベイトして発色さ
せた。図２に示したように部分精製したエンド−１，４
−β−グルカナーゼ（ＡとＤ）で、Ａは銀染色法により
全蛋白を染色したが、Ｄは抗体と結合したグルカナーゼ
だけが染色された。分子量は４６，０００と測定された
。ＢとＣはそれぞれオーキシン処理を行なっていない植
物組織由来の抽出液と粗酵素標品である。左の矢印は、
分子量マーカー蛋白の位置を示している。

（発明の効果） 本発明により新たなエンド−１，４−β−グルカナーゼ
とその特異抗体を提供し、植物の育種、作出等の開発を
促進することができる。本酵素は従来のエンド−１，４
−β−グルカナーゼに比べて比活性が２倍以上と大きい
点でも優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体を含む血清の量とグルカナーゼの活性の関
係を示すグラフであり、第２図はウェスタンプロット法
によりグルカナーゼと抗体の結合を調べた結果を示す展
開パターンを示すものである。 第 図 血清ｐ１ 第 図 ６６Ｋ＞

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−１，４−グルカンをエンド型で分解する活性
   を有し、分子量４万６千、等電点７．２そして至適ｐＨ
   が６．２のエンド−１，４−β−グルカーゼ（２）請求
   項（１）のエンド−１，４−β−グルカナーゼと特異的
   に結合する抗体