DE69333812T2 - Endo-Xyloglucan-Transferase - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft eine neue Endoxyloglucantransferase, die für das Wachstum der Pflanzenzellwand zuständig ist, ein Gen, das für das aus einer Pflanze isolierte Enzym kodiert, ein Verfahren zum Transferieren von Xyloglucanmolekülen unter Verwendung des Enzyms.
  • Xyloglucan (nachfolgend einfach als XG bezeichnet) ist die Hauptkomponente der Pflanzenzellwand, worin XG sich an die Oberfläche von Cellulosemikrofibrillen bindet und sie in ein komplexes Netzwerk vernetzt. Obwohl angenommen wird, dass das Spalten und erneute Verbinden von XG-Vernetzungen für die Wandkonstruktion und -rekonstruktion erforderlich sind, wurde der Mechanismus dafür bisher noch nicht aufgeklärt.
  • Albersheim hat eine Hypothese für einen Mechanismus zur Rekonstruktion von XG durch die Funktion von Endotransglycosylase aufgestellt [Plant Biochemistry, (1976), Academic Press, 225-274].
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben zuvor einen Extrakt untersucht, der vom Apoplast erhalten wurde (Extraplasmamembransektion der Pflanze bestehend aus Zellwand und Zellraum) vom Epikotyl von Keimlingen von Vigna angularis, einer Bohnenpflanze, und fanden als Ergebnis, dass eine Fraktion ausgefällt bei 20% bis 80% Sättigung von Ammoniumsulfat die Polydispersität von XG-Molekülen verstärkt [Nishitani et al., Physiologia Plantarum, 82, 490-497 (1991)).
  • Es wurde jedoch keine Substanz identifiziert, die für die Rekonstruktion von XG-Molekülen verantwortlich ist und die Polydispersität ihres Molekulargewichts. Ferner wurde bisher kein genauer Mechanismus hierfür aufgedeckt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt auf das Isolieren eines Enzyms, das für die Rekonstruktion von XG-Molekülen verantwortlich ist und die Polydispersität ihres Molekulargewichts, Bereitstellen des Enzyms und eines Gens, das für das Enzym in einer Pflanze kodiert, und ferner zur Verfügung stellen eines Verfahrens zum Klonen des Gens, eines Verfahrens zum Steuern der Expression des Enzyms in einem lebenden Organismus, eines Verfahrens zum Regulieren der Morphologie einer Pflanze und eines Verfahrens zum Transferieren von XG-Molekülen unter Verwendung des Enzyms.
  • Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet „Regulieren der Morphologie einer Pflanze" Modifikation von Form, Größe, Farbe, Härte, Textur, Gehalt von Faserkomponenten oder wässrigen Komponenten usw. einer Pflanze oder eines Teils einer Pflanze.
  • Zusammengefasst betrifft der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Gen, das für eine Endo-XG-Transferase kodiert, wie es in Anspruch 1 beansprucht ist. Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonen eines Gens, das für eine Endo-XG-Transferase kodiert, worin das Gen des ersten Aspekts der Erfindung oder ein Teil davon als Sonde verwendet wird. Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Antisense-DNA eines Gens, das für eine Endo-XG-Transferase kodiert, umfassend DNA mit einer Sequenz, die zur Sequenz des Gens des ersten Aspekts der Erfindung komplementär ist, wobei die DNA mindestens 15 Basen lang ist. Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Antisense-RNA eines Gens, das für eine Endo-XG-Transferase kodiert, umfassend RNA mit einer Sequenz, die zur Sequenz des Gens des ersten Aspekts der Erfindung komplementär ist, wobei die RNA mindestens 15 Basen lang ist. Der fünfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA, worin eine DNA-Sequenz, die von einem Gen nach dem ersten Aspekt der Erfindung erhalten wird, mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zellen in einer solchen Weise funktionieren kann, dass die Antisense-RNA eines Gens, das eine Endoxyloglucantransferase kodiert, durch Transkription gebildet wird. Der sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Steuern der Expression einer Endo-XG-Transferase, das umfasst: Einführen der Kassette zum Bilden einer Antisense-RNA des fünften Aspekts der Erfindung in einem lebenden Organismus. Ferner betrifft der siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Regulieren der Morphologie einer Pflanze, das umfasst: Einführen der Kassette zum Bilden einer Antisense-RNA des fünften Aspekts der Erfindung in eine Pflanze, um dadurch die Expression einer Endo-XG-Transferase zu steuern. Der achte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanze mit der darin eingesetzten Kassette zum Bilden einer Antisense-RNA des fünften Aspekts der Erfindung. Der neunte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kassette zum Exprimieren einer Endo-XG-Transferase, worin ein Gen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Lage ist, in Zellen in der Weise zu funktionieren, dass die Expression einer Endo-XG-Transferase möglich ist. Der zehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Steuern der Expression einer Endo-XG-Transferase des neunten Aspekts der Erfindung in einem lebenden Organismus. Der elfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Regulieren der Morphologie einer Pflanze, das umfasst: Einführen der Kassette zum Exprimieren einer Endo-XG-Transferase des neunten Aspekts der Erfindung in einer Pflanze. Der zwölfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanze mit der Kassette zum Exprimieren einer Endo-XG-Transferase des neunten Aspekts der Erfindung darin eingeführt. Der dreizehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Endo-XG-Transferase, das umfasst: Inkubieren eines lebenden Organismus oder von Zellen, die mit einem Gen transformiert sind, das für eine Endo-XG-Transferase des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodiert, und Erhalten der Endo-XG-Transferase aus der Kultur. Der vierzehnte Aspekte der vorliegenden Erfindung betrifft eine isolierte und gereinigte Endo-XG-Transferase, die für das Gen des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodiert. Der fünfzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transferieren von XG-Molekülen, das umfasst: Spalten einer D-Glucosylverbindung in einem XG-Molekül unter Verwendung einer Endo-XG-Transferase gemäß dem vierzehnten Aspekt der Erfindung und Verknüpfen des erhaltenen reduzierenden Endes des XG-Molekülsegments mit D-Glucose des nicht reduzierenden Endes eines anderen XG-Moleküls.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass ein Enzym, das für die Rekonstruktion von XG und die Polydispersität seines Molekulargewichts verantwortlich ist, im Apoplasten vom Epikotyl von Keimlingen von Vigna angularis enthalten ist und haben dieses Enzym isoliert und gereinigt. Anschließend haben sie herausgefunden, dass das Enzym eine neue und vom Gesichtspunkt der Pflanzenphysiologie neue und bedeutende Funktion aufweist zum Spalten von XG-Molekülen und erneuten Verbinden von auf diese Weise gebildeten XG-Molekülsegmenten mit anderen XG-Molekülen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben diese Art von Enzym, das in der Lage ist, XG-Moleküle zu spalten und auf diese Weise gebildete XG-Molekülsegmente mit anderen XG-Molekülen erneut zu verbinden, „Endo-XG-Transferase" genannt.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ferner die Aminosäuresequenz der von Vigna angularis gewonnenen Endo-XG-Transferase analysiert und eine Aminosäureteilsequenz davon bestimmt. Danach haben sie ausgehend von der oben genannten Aminosäuresequenz einen PCR-Primer hergestellt, und PCR unter Verwendung cDNA von Vigna angularis als Templat vorgenommen. Dann wurde das für die Endo-XG-Transferase kodierende Gen verstärkt und auf diese Weise eine Sonde hergestellt. Anschließend wurden Klone, die ein Gen enthalten, das für Endo-XG-Transferase kodiert, aus der cDNA-Bibliothek von Vigna angularis unter Verwendung der oben genannten Sonde gescreent und ein Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert, wurde isoliert. Es wurde ferner gefunden, dass Gene, die für andere oder ähnlich Endo-XG-Transferase kodieren, aus verschiedenen anderen Pflanzen unter Verwendung des Gens als Sonde geklont werden können. Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Organismus oder Zellen, die mit dem oben genannten Gen transformiert sind, inkubiert und gefunden, dass eine Endo-XG-Transferase auf diese Weise hergestellt werden kann. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ferner gefunden, dass die intrazelluläre Expression der Endo-XG-Transferase gesteuert werden kann durch Einführen einer Antisense-DNA oder einer Antisense-RNA des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, in Zellen oder durch Einführen einer Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA, worin eine DNA-Sequenz, die vom Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert, erhalten ist und aus mindestens 15 Basenpaaren besteht, mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Lage ist, in Zellen in der Weise zu funktionieren, dass die Antisense-RNA des für Endo-XG-Transferase kodierenden Gens durch Transkription in die Zellen gebildet wird, und dass die Morphologie einer Pflanze durch das oben beschriebene Verfahren reguliert werden kann. Dann haben sie Pflanzen konstruiert, die diese Substanzen eingeführt enthalten. Außerdem waren die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich bei der Expression einer Endo-XG-Transferase in Organismen durch Einführen einer Kassette zum Exprimieren einer Endo-XG-Transferase, worin ein Gen, das für eine Endo-XG-Transferase kodiert mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Lage ist, in Zellen in der Weise zu funktionieren, dass die Expression der Endo-XG-Transferase möglich ist und dass die Morphologie einer Pflanzenzelle durch das oben beschriebene Verfah ren gesteuert werden kann. Dann haben sie Pflanzen konstruiert, bei denen die Kassette eingeführt ist. Auf diese Weise wird die vorliegende Erfindung erhalten.
  • Bei der vorliegenden Erfindung kann jegliche Pflanze verwendet werden, so lange sie die Endo-XG-Transferase erzeugen kann. Zum Beispiel kann hierfür Vigna angularis ausgewählt werden. Obwohl das Enzym der vorliegenden Erfindung aus jeglichem Abschnitt einer Pflanze ohne Einschränkung gewonnen werden kann, wird es in geeigneter Weise zum Beispiel vom Apoplast vom Epikotyl von Keimlingen erhalten.
  • Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Verwendung von Vigna angularis als Beispiel beschrieben. Zum Keimen von Vigna angularis und zum Erhalten von Rohextrakt des Apoplasts (nachfolgend „Apoplastlösung" genannt) kann das in der oben zitierten Physiologia Plantarum beschriebene Verfahren effektiv eingesetzt werden.
  • Das Zielenzym kann aus der auf diese Weise erhaltenen Apoplastlösung durch jegliche Mittel gereinigt werden, die üblicherweise zum Reinigen von Enzymen eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Reinigung durch Kombinieren von Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Affinitätschromatographie, Gelfiltration oder Ionenaustauschsäulenchromatographie effektiv durchgeführt werden. Auf diese Weise kann das Zielenzym in reinem Zustand ohne Verunreinigung durch Glycosidaseaktivität erhalten werden.
  • Nun werden physikalisch-chemische Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen Endo-XG-Transferase von Vigna angularis (manchmal als „Enzym der vorliegenden Erfindung" bezeichnet) ausführlich erläutert.
  • Das Funktionsmechanismus des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird wie folgt bestimmt.
  • Reduzierende Enden von Tamarind-XG, die nach dem Verfahren hergestellt wurden, das nachfolgend beschrieben wird, werden mit 2-Aminopyridin durch reduktive Aminierung mit Natriumcyanoborhydrid gekoppelt, so dass dadurch Pyridylamino-XG (nachfolgend einfach als XG-PA bezeichnet) erhalten wird. Eine Mischung aus 18 μg 630 kDa XG mit 2 μg 15 kDa XG-PA wird zusammen mit 20 ng einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung über 20 oder 60 Minuten unter solchen Bedingungen inkubiert, wie es nachfolgend in Bezug auf die Bestimmung der Enzymaktivität angegeben wird. Dann werden die Produkte in der Reaktionsmischung mit dem selben HPLC-System erfasst, wie es zur Bestimmung der Enzymaktivität verwendet wird.
  • Die Erfassung wird unter Verwendung eines Impulsamperometriedetektors (nachfolgend einfach als PAD bezeichnet, hergestellt von Dionex) und einem Fluoreszenzspektrometer (RF535, Ex 320 nm/Em 400 nm, hergestellt von Shimadzu Corp.) vorgenommen. 6 zeigt die Ergebnisse der Erfassung mit PAD, während 7 die Ergebnisse der Erfassung mit dem Fluoreszenzspektrometers zeigt. In jeder Figur zeigt der Pfeil a die Elutionsstelle des 630 kDa XG und der Pfeil b zeigt die von 15 kDa XG-PA.
  • In 6 gibt die Ordinate die PAD-Antwort (nA) an, während die Abszisse das Elutionsvolumen (ml) angibt. In 7 gibt die Ordinate die relative Fluoreszenzintensität an, während die Abszisse das Elutionsvolumen (ml) angibt.
  • Die in 6 gezeigten Ergebnisse der PAD-Messung geben an, dass die Elutionsstelle eines Peaks sich zum Bereich höherer Molekulargewichte verschiebt, wenn die Reaktion fortschreitet. Ferner geben die in 7 gezeigten Ergebnisse der Messung mit dem Fluoreszenzspektrometer an, dass die Elutionsstelle des fluoreszenzmarkierten XG sich zum Bereich höherer Molekulargewichte verschiebt. Ausgehend von diesen Ergebnissen ist es klar erkennbar, dass ein durch die Spaltung von 630 kDa XG neu gebildetes XG-Segment sich mit dem 15 kDa XG-PA verbindet, um dadurch das Molekulargewicht des fluoreszenzmarkierten XG zu erhöhen.
  • Wie die nachfolgende Tabelle 2 zeigt, verändert sich die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung nicht, selbst wenn eines von XG-PA, XG modifiziert durch Reduzieren eines reduzierenden Endes in einen Zuckeralkohol (nachfolgend einfach als XG-OH bezeichnet) und unmodifiziertes XG als Substrat verwendet wird.
  • Deshalb versteht es sich, dass die Zunahme des Molekulargewichts von XG-Molekülen, wie es in den 6 und 7 gezeigt ist, nicht einfach durch die Verbindung des reduzierenden Endes des 630 kDa XG-Moleküls mit dem nicht reduzierenden Ende des 15 kDa XG-PA entsteht, sondern durch die erneute Verbindung des reduzierenden Endes des XG-Segments, das durch die Spaltung der Glycosidbindung des 630 kDa neu gebildet ist, mit dem nicht reduzierenden Ende des 15 kDa XG-PA-Moleküls.
  • Ferner werden die Auswirkungen des Substratmolekulargewichts auf die Enzymwirkung des Enzyms der vorliegenden Erfindung nach dem folgenden Verfahren untersucht. 20 μg Portionen von Tamarind-XG-Substraten mit verschiedenem Molekulargewicht werden mit 20 ng des gereinigten Enzympräparats der vorliegenden Erfindung umgesetzt und die Enzymaktivitäten nach dem Verfahren bestimmt, das unten beschrieben wird. Die Ergebnisse sind in 8 angegeben, worin die Ordinate die Enzymaktivität (U) angibt, während die Abszisse das Substratmolekulargewicht (kDa) angibt. Wie 8 deutlich zeigt, weist das Enzym der vorliegenden Erfindung auf einem Substrat mit höherem Molekulargewicht eine höhere Aktivität auf und auf dem mit einem geringeren Molekulargewicht eine geringere Aktivität.
  • Portionen von einem mg Tamarind-XG werden mit 1 μg des gereinigten nativen Enzympräparates der vorliegenden Erfindung oder 1 μg des nativen Enzympräparates der vorliegenden Erfindung (bei 120°C 5 Minuten lang im Autoklaven) in einer Natriumacetatpufferlösung (pH 5,8) bei 25°C 2 Stunden lang umgesetzt. Nach Abkühlen auf -50°C, um dadurch die Reaktion zu beenden, wird XG durch wiederholtes Ausfällen in 80% Ethanol gefolgt vom Lyophilisieren in schwerem Wasser aufgenommen.
  • Das auf diese Weise erhaltene lyophilisierte Produkt wird in schwerem Wasser gelöst, so dass sich eine Konzentration von 1 mg/0,6 ml ergibt und das 1H-NMR-Spektrum davon wird bei 85°C unter Verwendung von JEOL GSX400 (hergestellt von Nippon Denshi K.K.) aufgezeichnet. Es werden chemische Verschiebungen bezüglich Natrium-4,4-dimethyl-4-silapentan-1-sulfonat ermittelt, das als interner Standard eingesetzt wird. 9 zeigt die so erhaltenen Spektren, worin (a) das unter Verwendung des nativen Enzyms erhaltene Spektrum darstellt, während (b) das unter Verwendung des denaturierten Enzyms erhaltene Spektrum darstellt.
  • In den Spektren (a) und (b) ist das Signal (1) einem Wassermolekül zuzuordnen, dessen eines Wasserstoffatom durch ein schweres Wasserstoffatom (HDO) substituiert ist; Signal (2) (chemische Verschiebung: 4,53–4,54 ppm) ist dem anomeren Proton des β-(1,4)-verknüpften Glucosylrests zuzuordnen, das die Rückgratkette des Tamarind-XG-Moleküls bildet und dem Galactosylrest, der am nicht reduzierenden Ende einer der beiden Seitenketten gelegen ist, die eine Sequenz Gal-β-(1,2)-Xyl-α-(1,6)- des Tamarind-XG-Moleküls bildet; Signal (3) (chemi sche Verschiebung 4,927 ppm) ist dem anomeren Proton des Xylosylrests zuzuordnen, der am nicht reduzierenden Ende einer anderen Seitenkette gelegen ist; und Signal (4) (chemische Verschiebung: 5,116 ppm) ist dem anomeren Proton des Xylosylrests in einer Seitenkette mit einer Gal-β-(1,2)-Xyl-α-(1,6)-Verknüpfung zuzuordnen.
  • Die Tatsache, dass die chemischen Verschiebungen der in den Spektren (a) und (b) gezeigten Signale sich nicht voneinander unterscheiden und dass der relative Gehalt der anomeren Protonen jedes der durch die Signale (2), (3) und (4) im Spektrum (a) dargestellten Saccharide gleich ist wie im Spektrum (b) legen nahe, dass selbst nach der Umsetzung mit dem Enzym der vorliegenden Erfindung, die Verknüpfungsart wie vor der Umsetzung beibehalten wurde.
  • Auf diese Weise kann geschlossen werden, dass das Enzym der vorliegenden Erfindung eine D-Glucosylverbindung in einem XG-Molekül spaltet und dann das reduzierende Ende eines neu gebildeten XG-Molekülsegments mit einem D-Glucosylrest des nicht reduzierenden Endes eines anderen XG-Moleküls verknüpft.
  • (Transferreaktion des Pyridylamino-XG-Heptamers in die Zellwand mit Endo-XG-Transferase)
  • In 40 μl einer Acetatpufferlösung (pH 5,7) wurden 600 μg (bezogen auf das Trockengewicht) einer Zellwandprobe, hergestellt nach dem Verfahren, das später beschrieben wird, vermischt mit 5 μg Pyridylamino-XG-Heptamer {XG7-PA, hergestellt durch Verbinden von 2-Aminopyridin mti dem reduzierenden Ende von XG-Heptamer [XG7, beschrieben als XG-Oligomer I im Journal of Biological Chemistry, 267, 21058-21064 (1992)] durch reduktive Aminierung unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid} und 3 μg einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung oder 3 μg einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung, die durch Behandlung im Autoklaven bei 120°C über 5 Minuten denaturiert wurde, um eine Reaktion über 12 Stunden bei 25°C vorzunehmen. Dann wurde die Reaktionsmischung unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran ultrafree C3HV (hergestellt von Millipore) in die erste unlösliche Fraktion und die erste lösliche Fraktion aufgeteilt. Die erste unlösliche Fraktion wurde in 210 μl Wasser suspendiert und auf die selbe Weise wie oben beschrieben erneut ultrafiltriert, um sie dadurch in die zweite unlösliche Fraktion und die zweite lösliche Fraktion aufzuteilen. Durch Kombinieren der ersten und zweiten löslichen Fraktion betrug die lösliche Fraktion 250 μl. Diese Fraktion wurde S-Fraktion genannt.
  • Die zweite unlösliche Fraktion wurde in 100 μl Wasser suspendiert, das 30 μg Trichoderma viride Cellulase [(1,4-β-D-Glucanglucanohydrolase, E.C. 3.2.1.4] gereinigt aus rohem Trichoderma viride Enzympräparat (Meiselase-P, hergestellt von Meiji Seika Kaisha Ltd.) gereinigt wurde durch Gazesäulenchromatographie [Toyama et al., J. Ferment. Technol., 42, 199-206 (1964)] und 4 Stunden lang bei 40°C umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Ultrafiltration in die dritte unlösliche Fraktion und die dritte lösliche Fraktion aufgeteilt. Die dritte unlösliche Fraktion wurde in 100 μl einer 0,2 M Natriumacetatlösung (pH 5,7) suspendiert und durch Ultrafiltration in die vierte unlösliche Fraktion und die vierte lösliche Fraktion aufgeteilt. Die dritte und vierte lösliche Fraktion wurden miteinander kombiniert und die so erhaltene wässrige Lösung wurde C-Fraktion genannt. Auf diese Weise betrug die C-Fraktion 200 μl. Zu jeder der S- und C-Fraktionen wurden dreimal so viel Acetonitril hinzugefügt und die erhaltene Mischung wurde auf ein nichtmetallisches HPLC-System gegeben (hergestellt von Dionex), das mit einem TSK Gel Amide 80 (4,6 × 250 mm, hergestellt von Tosoh Corp.) versehen ist, das zuvor mit 0,1 M Natriumacetatpufferlösung ins Gleichgewicht gebracht wurde, der 65% Acetonitril enthält (pH 5,7). Diese Säule wurde mit linearer Gradientenelution mit 65%–35% Acetonitril in einer 0,1 M Natriumacetatpufferlösung mit einer Strömungsrate von 1 ml/min entwickelt. Die Fluoreszenzabsorption des Eluats wurde mit dem oben genannten Fluoreszenzspektrometers (RF535, eingestellt auf Ex 320 nm/Em 400 nm, hergestellt von Shimadzu Corp.) bestimmt.
  • 10 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse der C-Fraktion. In 10 gibt die Ordinate die relative Fluoreszenzintensität an, während die Abszisse das Elutionsvolumen (ml) angibt. In 10 ist (a) ein Chromatogramm, das unter Verwendung eines denaturierten Enzyms erhalten wurde, (b) ein Chromatogramm, das unter Verwendung eines nativen Enzyms erhalten wurde und (c) ist ein Chromatogramm, das durch Eluieren von nicht umgesetztem XG7-PA erhalten wurde. Ein durch Pfeil (A) gezeigter Peak ist ein Peak, der die Elutionsstelle von XG7-PA zeigt.
  • Tabelle 1 zeigt die Mengenverhältnisse an XG7-PA, das aus den S- und C-Fraktionen erfasst wurde.
  • Tabelle 1
    Figure 00120001
  • In 10(b) wird ein durch den Pfeil (A) gezeigter Peak beobachtet, ähnlich wie im Fall von (c). In Tabelle 1 wird, wenn das denaturierte Enzym verwendet wird, XG7-PA ausschließlich aus der S-Fraktion erfasst, während es aus der C-Fraktion erfasst wird, wenn das native Enzym verwendet wird. Ausgehend von diesen Tatsachen kann man verstehen, dass aufgrund der Wirkung des Enzyms der vorliegenden Erfindung XG7-PA zunächst in XG-Ketten in der Zellwandprobe eingebracht wird, und dann mit Cellulase entfernt wird.
  • (Substratspezifität)
  • Substratportionen von 20 μg, hergestellt nach dem Verfahren, das nachfolgend beschrieben wird, wurden mit 60 ng einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung 1 Stunde lang bei 25°C umgesetzt. Dann wurden die Enzymaktivitäten nach dem Verfahren bestimmt, das nachfolgend beschrieben wird. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
  • Tabelle 2
    Figure 00140001
  • Die Grundstruktur von XG besteht aus einem Rückgrat von β-(1,4)-verknüpften Glycosylresten, wobei Seitenketten an der 0-6-Position einiger der Glucosylreste verknüpft sind. Die Art der Seitenketten und ihre Anordnungen an der Hauptkette unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Pflanze, von der XG gewonnen ist. Tropaeolum XG und Tamarind-XG sind mit zwei Arten von Seitenketten substituiert, nämlich Xyl-α-(1,6) und Gal-β-(1,2)-Xyl-α-(1,6), während Vigna-XG eine Seitenkette Fuc-α-(1,2)-Gal-β-(1,2)-Xyl-α-(1,6) zusätzlich zu Xyl-α-(1,6) und Gal-β-(1,2-Xyl-α-(1,6) aufweist. Wie die obige Tabelle 1 zeigt, wirkt das Enzym der vorliegenden Erfindung gleichermaßen auf diese drei XGs ein, die von Vigna, Tamarind und Tropaeolum gewonnen sind. Dieses Enzym wirkt jedoch weder auf Carboxymethylcellulose noch auf Hafer-β-(1,3)-; β-(1,4)-Glucan, die als ausgezeichnete Substrate für β-1,4-Glucanase wirken.
  • (Optimaler pH)
  • Der Einfluss des pH-Werts auf die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde unter den folgenden Bedingungen untersucht. 20 ng einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurden mit 20 μg Tamarind-XG bei 25°C 30 Minuten lang in der Mcllvaine-Pufferlösung (0,2 M Na2HPO4 und 0,1 M Citronensäure in einem pH-Bereich von 3 bis 7) umgesetzt oder in einer Natriumboratpufferlösung (in einem pH-Bereich von 7 bis 11). Dann wurde die Enzymaktivität nach dem Verfahren gemessen, das nachfolgend beschrieben wird. 11 zeigt die Ergebnisse, worin ein offener Kreis die Daten zeigt, die bei Verwendung der Mcllvaine-Pufferlösung erhalten wurden, während ein geschlossener Kreis die Daten zeigt, die bei Verwendung der Natriumboratpufferlösung erhalten wurden. Auf diese Weise wurde herausgefunden, dass der optimale pH-Wert für das Enzym der vorliegenden Erfindung um 5,8 liegt.
  • (Optimale Temperatur)
  • Der Einfluss der Temperatur auf die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde unter den folgenden Bedingungen untersucht. 20 ng einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurden mit 20 μg Tamarind-XG in einer Acetatpufferlösung (pH 5,8) 30 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen umgesetzt. Dann wurde die Enzymaktivität nach dem Verfahren gemessen, das nachfolgend beschrieben wird. 12 zeigt die Ergebnisse. Auf diese Weise wurde herausgefunden, dass die optimale Temperatur für das Enzym der vorliegenden Erfindung um 30°C liegt.
  • (Molekulargewicht)
  • Eine gereinigte Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde nach dem Reinigungsverfahren erhalten, das nachfolgend beschrieben wird, und wird einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Als Ergebnis davon wird es als eine einzelne Bande eines Molekulargewichts von ungefähr 33.000 identifiziert.
  • (Messung der Enzymaktivität)
  • Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird auf folgende Weise gemessen: zu 2 bis 20 μg Tamarind-XG werden 10 μl einer Enzymsuspension verdünnt mit einer 0,2 M Natriumacetatpufferlösung (pH 5,8) hinzugegeben. Nach Umsetzen bei 25°C über 30 Minuten wird die Reaktionsmischung bei -50°C eingefroren, um die Reaktion dadurch zu beenden. Die Reaktionsmischung wird in 20 μl 50 mM NaOH aufgelöst und einem nichtmetallischen NPLC-System zugeführt, das mit Säulen aus TSK Gel-3000 PW (8 × 300 mm, hergestellt von Tosoh Corp.) und TSK Gel-5000 PW (8 × 300 mm, hergestellt von Tosoh Corp.) aufgegeben. Nach Eluieren der Säulen mit einer 30 mM NaOH-Lösung, die 15 mM Natriumacetat enthält, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min, wurde das Eluat mit einem PAD erfasst, das mit einer Goldelektrode ausgerüstet ist.
  • 13 zeigt ein Beispiel der Ergebnisse der Messung. 13 zeigt ein PAD-Chromatogramm, das nach dem oben genannten Verfahren erhalten wurde, worin die Ordinate die PAD-Reaktion (nA) angibt, während die Abszisse das Elutionsvolumen (ml) angibt.
  • In 13 zeigt (a) ein Chromatogramm, das mit der denaturierten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, die durch 5 Minuten Autoklavenbehandlung bei 120°C erhalten wurde; (b) zeigt eines, das mit einer apoplastischen Lösung erhalten wurde; und (c) zeigt eines, das mit dem gereinigten Enzym erhalten wurde. Ein Pfeil 1 stellt die Elutionsstelle des Tamarind-Substrats XG und ein Pfeil 2 stellt die Elutionsstelle von Polysacchariden dar.
  • Im Chromatogramm (c) nimmt die Peakbreite auf halber Höhe des Peaks 1 proportional zur Menge an zugeführtem Enzym zu. Dementsprechend wird die Peakbreite auf halber Höhe des Substratpeaks als Indikator für die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung herangezogen.
  • Wenn Tamarind-XG als Substrat verwendet wird, wird 1 U der Enzymaktivität als die Menge des Enzyms definiert, die in der Lage ist, die oben genannte Peakbreite um 2,3 ml bei 25°C in 30 Minuten zu erhöhen.
  • Nun werden Verfahren zum Herstellen der Substrate zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • (XGs) – Rohes Vigna-XG gewonnen vom Epikotyl von 6 Tage alten im Dunklen gezogenen Keimlingen von Vigna angularis [Physiologia Plantarum, 82, 490-497 (1991) und 52, 482-494 (1981)] und von trockenen Samen von Tropaeolum Majus L. [McDougall et al., Plant Physiol., 89, 883-887 (1988)) werden hergestellt.
  • Ein rohes XG gewonnen aus Tamarindus Indica L. wird von Dainippon Seiyaku Co. (Handelsname: Glyloid 9S) erhalten.
  • 300 mg jedes rohen XG werden teilweise hydrolysiert unter Verwendung von 150 μg der oben genannte Trichoderma viride Cellulase in 40 ml einer wässrigen Lösung bei 45°C über 2 Stunden. Das so erhaltene Aufschlussprodukt wird im Autoklaven behandelt, um dadurch die Cellulase zu denaturieren, und wird danach durch Ultrafiltration fraktioniert (Diaflo XM-3000 und YM5, hergestellt von Amicon). Die Fraktion (40 mg oder mehr), die durch XM-300 hindurchgeht, aber von YM5 aufgehalten wird, wird in 2 ml Wasser aufgelöst. Dann wird es auf einer HPLC der Chromatographie unterzogen (Shimadzu LC6A), die mit einer Säule (16 × 500 mm, hergestellt von Pharmacia) mit Superose 6 versehen ist, die nachfolgend als „System A" bezeichnet wird und mit 0,5 ml/min Wasser eluiert. Es werden Fraktionen in 1,5 ml Portionen gesammelt und lyophilisiert, um dadurch XG-Proben zu erhalten. Die Molekulargewichte dieser Proben werden unter Verwendung des selben Chromatographiesystems gemessen wie es zur Messung der Enzymaktivität verwendet wird.
  • (Andere Glucane) – 500 mg Natrium-Carboxymethylcellulose gelöst in 40 ml Wasser werden mit 100 mg der oben genannten Trichoderma viride Cellulase bei 25°C 3 Stunden lang teilweise hydrolysiert. Nach Ultrafiltration und Chromatographie wird eine Fraktion von 123 kDa erhalten.
  • 50 mg β-(1,3), β-(1,4)-Glucan werden aus Haferkleie gemäß dem Verfahren von Nishitani et al. [Plant Physiology 87, 883-890 (1988)] hergestellt. Das erhaltene Glucan wird mit 5 μg gereinigter Bacillus subtilis Glucanase bei 40°C 1 Stunde lang teilweise hydrolysiert [1,3-1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase, gereinigt aus Bacillus subtilis (α-Amylasepräparat Ban L-20 hergestellt von Novo gemäß dem in Plant Physiology 87, 883-890 (1988) beschriebenen Verfahren]. Durch Fraktionieren mit dem oben genannten System A werden Glucane von 144 kDa erhalten.
  • (Xylane) – Glucuronoarabinoxylan mit einem mittleren Molekulargewicht von 84 kDa wird aus dem Stängel von 6 Tage alten etiolierten Maiskeimlingen hergestellt [Nishitani et al., J. Biol. Chem. 266, 6539-6543 (1991)].
  • β-(1,3)-Xylan, das β-(1,4)-Verknüpfungen enthält (146 kDa) wird aus Rhodymenia xylan extrahiert und mit dem oben genannten System A gereinigt [Plant Physiology 87, 883-890 (1988)].
  • Ferner werden 10 mg Tamarind XG mit Natriumborhydrid gemäß dem in J. Biol. Chem., 266, 6539-6543 (1991) angegebenen Verfahren reduziert und durch Gelfiltration mit Superose 6 prep. fraktioniert. Auf diese Weise wird endständig reduziertes XG (XG-OH) erhalten.
  • (Zellwandproben)
  • Keimlinge von Vigna angularis (erhältlich von Watanabe Shushi) wurden im Dunkeln gekeimt und das Hypokotyl wurde in einer Länge von 3 cm geschnitten und bei -50°C eingefroren. Nach Homogenisieren bei 0°C in einer 0,3 M wässrigen Lösung von NaCl wurde es in einer 1 M wässrigen Lösung von NaCl suspendiert und gewaschen. Nach weiterem Waschen zweimal in kaltem Wasser, wurde es in 80% Ethanol 10 Minuten lang gekocht, mit Ethanol gewaschen, durch ein Polyamidnetz gefiltert (Porengröße: 35 μm) und getrocknet, um dadurch die Zellwand zu extrahieren. Die Zellwand wurde erneut in Wasser suspendiert und bei 120°C 20 Minuten lang im Autoklaven behandelt, um dadurch die aus Pflanzengeweben stammenden Enzyme zu inaktivieren. Durch Waschen mit einer großen Menge Wasser und Lyophilisieren wurde eine Zellwandprobe erhalten.
  • Das für Endo-XG-Transferase kodierende Gen kann wie unten beschrieben isoliert werden.
  • Die Aminosäuresequenz einer gereinigten Endo-XG-Transferase wird zum Beispiel unter Verwendung einer Proteinsequenzierungseinrichtung analysiert. Auf diese Weise kann die Aminosäuresequenz an der N-Endstelle bestimmt werden, die in SEQ ID Nr. 11 in der Sequenzliste dargestellt ist. Ausgehend von dieser Sequenz kann ein Mixprimer für PCR hergestellt werden. Zum Beispiel werden Mixprimer pAZ-1 und pAZ-2, die entsprechend in den SEQ ID Nr. 12 und Nr. 13 in der Sequenzliste dargestellt sind, auf einer DNA-Synthetisierungseinrichtung synthetisiert. Nach dem Reinigen können diese Primer beim Screening eines Gens verwendet werden, das für Endo-XG-Transferase kodiert. Zum Beispiel wird RNA aus Vigna angularis hergestellt und dann wird poly(A)+RNA unter Verwendung von Oligotex-dT 30 (hergestellt von Nippon Roche) gereinigt. Danach wird eine cDNA unter Verwendung des oben genannten poly(A)+RNA zusammen mit beispielsweise einem Primer pTM4 hergestellt, seine Sequenz ist die selbe wie des M13 Primers M4 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dargestellt durch die SEQ ID Nr. 14 in der Sequenzliste, mit der Ausnahme, dass die poly-T-Sequenz ferner an die 3'-Stelle gebunden ist, unter der Wirkung von Reverstranskriptase. PCR wird unter Verwendung der erhaltenen cDNA als Templat ausgeführt, um dadurch die cDNA zu amplifizieren, die für Endo-XG-Transferase kodiert. Um die Ziel-DNA effizient zu amplifizieren, werden der oben genannte Mixprimer pAZ-1 und der M13 Primer M4 im ersten PCR-Schritt eingesetzt und anschließend wird der zweite PCR-Schritt unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Reaktionsprodukts als Templat unter Verwendung des Primers pAZ-2 und M13 Primer M4 ausgeführt. Auf diese Weise wird ein DNA-Segment von ungefähr 1,1 kbp amplifiziert. Das auf diese Weise amplifizierte DNA-Segment kann in eine geeignete Restriktionsenzymstelle eines geeigneten Plasmids subgeklont werden, zum Beispiel die Stelle Hinc II von pUC 119.
  • Dann kann ein Klon mit einem Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek von Vigna angularis oder einer Genombibliothek gescreent werden, indem das auf diese Weise erhaltene amplifizierte DNA-Segment als Sonde verwendet wird. Die cDNA-Bibliothek kann zum Beispiel aus der oben genannten Vigna angularis cDNA erhalten werden, die von einem cDNA-Synthesekitsystem Plus (hergestellt von Amersham) hergestellt wurde. Plaquehybridisierung unter Verwendung des oben genannten amplifizierten DNA-Segments als Sonde macht es möglich, zum Beispiel 5 positive Plaques von 1 × 104 Plaques zu erhalten. Dann werden in die Phagenvektor eingesetzte DNA-Segmente extrahiert. Auf diese Weise kann ein DNA-Segment von zum Beispiel ungefähr 1,1 kbp erhalten werden. 1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Segments. SEQ ID Nr. 15 in der Sequenzliste zeigt einen Teil der DNA-Sequenz des Segments. Dann wird dieses Segment in eine geeignete Restriktionsenzymstelle eines geeigneten Expressionsvektors eingesetzt und ein geeigneter Wirt unter Verwendung eines Plasmids, das das Fragment darin eingesetzt enthält, transformiert. Ein Plasmid pUC 119 mit dem Segment in die Stelle EcoRI von pUC 119 eingesetzt wird als pVX103 bezeichnet und ein Stamm Escherichia coli JM109 transformiert mit dem pVX103 wird als Escherichia coli JM109/pVX103 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4104 hinterlegt.
  • In industriellem Maßstab kann eine Endo-XG-Transferase durch Herstellen von pVX103 aus der oben genannten Transformante produziert werden, wobei das eingesetzte DNA-Segment wie oben beschrieben herausgeschnitten wird, das Segment in ein geeignetes Expressionsplasmid integriert wird, es in einen geeigneten Wirt eingeführt wird und dann der Wirt inkubiert wird. Zum Beispiel wird unter Verwendung von Mutan-KTM (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), einem Plasmid mit der Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms HincII im Upstream einer Gensequenz, die für eine Endo-XG-Transferase in pVX103 kodiert, durch Punktmutation gemäß dem Verfahren von Kunkel konstruiert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1982)]. Danach wird dieses Plasmid mit einem Restriktionsenzym HincII gespalten und auf diese Weise ein Segment von ungefähr 1,1 kbp, das eine Gensequenz enthält, die für eine Endo-XG-Transferase kodiert, herausgeschnitten. Diesem Segment wird NcoI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unter Verwendung eines Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) hinzugefügt. Nach Verdauen mit NcoI wird dieses Segment in die Stelle NcoI eines Plasmids pTV119N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) eingesetzt und das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird pVX110 bezeichnet. Wenn ein Stamm E. coli JM109 mit pVX110 darin eingesetzt inkubiert wird, kann die Endo-XG-Transferase in der Kultur erzeugt werden. 14 zeigt einen Prozess zum Konstruieren von pVX110 von pVX103. In 14 stellen H, E und N die Erkennungsstellen HindIII, EcoRI bzw. NcoI dar. Die Inkubation das Stamms E. coli JM109 mit darin eingeführtem pVX110 kann nach einem Verfahren vorgenommen werden, das allgemein zum Inkubieren von Transformanten verwendet wird. Zum Beispiel wird der Stamm E. coli JM109 mit pVX110 darin eingeführt in einer L-Brühe suspendiert, die Ampicillin enthält und auf diese Weise wird eine Vorkultur vorgenommen. Dann wird IPTG (Isopropyl-β-D-galactopyranosid) hinzugegeben, und die Inkubation wird unter Schütteln bei 37°C über Nacht durchgeführt. Anschließend wird Endo-XG-Transferase in der Kultur akkumuliert. Die Endo-XG-Transferase kann aus der Kultur nach einem Verfahren gereinigt werden, das allgemein zum Reinigen von Enzymen eingesetzt wird. Zum Beispiel wird nach Beendigung der Inkubation die Kultur zentrifugiert, um dadurch Zellen aufzunehmen. Dann werden die Zellen durch Ultraschallbehandlung gemahlen und einer Kombination von Techniken unterzogen wie Zentrifugieren, Dialyse, Ionenaustauschersäulenchromatographie und Gelfiltration.
  • Das für Vigna angularis Endo-XG-Transferase kodierende Gen, das oben ausführlich erläutert ist, ist ein Beispiel von Genen, die für verschiedene Pflanzenendo-XG-Transferasen dieser Erfindung kodieren, und Gene, die für andere Pflanzenendo-XG-Transferasen kodieren, können von anderen Pflanzen unter Verwendung des Gens, das für Vigna angularis Endo-XG-Transferase kodiert oder einer Teilsequenz davon als Sonde geklont werden. Außerdem kann die Amplifizierung und das Klonen von Genen, die für Endo-XG-Transferasen anderer Pflanzen kodieren, unter Verwendung der Primer durchgeführt werden, die zum Klonen des Gens eingesetzt wurden, das für Vigna angularis Endo-XG-Transferase kodiert. Gleichermaßen können Gene, die für andere Pflanzenendo-XG-Transferasen kodieren, auch von anderen Pflanzen unter Verwendung des Gens oder einer Teilsequenz davon, die für Endo-XG-Transferase von Sojabohne, Arabidopsis, Tomate, Weizen, Mais oder Reis kodieren, die in dieser Erfindung als Sonde beschrieben sind, geklont werden. Zum Beispiel können solche Pflanzenspezies in dikotylen wie Sojabohne, Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Raps, Sonnenblume, Baumwolle, Tabak, in monokotylen wie Weizen, Reis, Korn, Zuckerrohr als Ziele zum Klonen eingesetzt werden. Zum Beispiel wird die cDNA von ungefähr 1,1 kbp, die nach der oben genannten Verfahrensweise erhalten wurde, mit (α-32P)dCTP unter Verwendung des Random Primer DNA Labeling Kit markiert, um dadurch eine Sonde für die Hybridisierung zu erhalten. Dann kann eine cDNA-Bibliothek erhalten aus mRNA von Sojabohnengewebe (Glycin max) (hergestellt von Clonetech) durch Plaquehybridisierung unter Verwendung dieser Sonde gescreent werden. Es werden Phagen aus positiven Plaques isoliert und darin eingesetzte DNA-Segmente von ungefähr 1 kbp können daraus gereinigt werden. 2 zeigt eine Restriktionsenzymkarte dieses Segments. SEQ ID Nr. 16 in der Sequenzliste zeigt einen Teil der DNA-Sequenz dieses Segments. Dieses Segment kann zum Beispiel in die Stelle EcoRI eines Plasmids pUC119 subgeklont werden. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird pSX102 genannt. Danach wird ein Stamm E. coli JM109 unter Verwendung dieses Plasmids pSX102 transformiert. Die auf diese Weise erhaltene Transformante wird Escherichia coli JM109/pSX102 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4226 hinterlegt. Die 3, 4 und 5 zeigen jeweils Restriktionsenzymkarten von DNA-Segmenten, die für Endo-XG-Transferasegene kodieren, die von Arabidopsis thaliana, Tomate und Weizen stammen, die nach Verfahren erhalten sind, die den oben genannten ähnlich sind. SEQ ID Nr. 17, 18 und 19 der Sequenzliste zeigen jeweils DNA-Teilsequenzen dieser DNA-Segmente. Plasmide, bei denen diese DNA-Segmente eingeführt sind, werden jeweils als pAX101, pTX201 und pWX101 bezeichnet, während Stämme von E. coli JM109 transformiert mit diesen Plasmiden jeweils als Escherichia coli JM109/pAX101, Escherichia coli JM109/pTX201 und Escherichia coli JM109/pWX101 bezeichnet werden, und Escherichia coli JM109/pWX101 ist beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4225 hinterlegt.
  • Außerdem zeigen die 15 bzw. 16 jeweils Restriktionsenzymkarten von DNA-Segmenten, die für Endo-XG-Transferasegene kodieren, die von Mais und Reis stammen, die nach Verfahren erhalten sind, die den oben genannten ähnlich sind. Plasmide, bei denen DNA-Segmente eingeführt sind, werden entsprechend als pCX101 und pRX102 bezeichnet, während Stämme von E. coli JM109, die mit diesen Plasmiden transformiert sind, jeweils als Escherichia coli JM109/pCX101 und Escherichia coli JM109/pRX102 bezeichnet werden, und Escherichia coli JM109/pRX102 ist beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4221 hinterlegt.
  • Eine Endo-XG-Transferase kann durch Herstellen eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, aus der oben genannten Transformante, Konstruieren eines geeigneten Expressionsplasmids mit dem Gen, Transformieren eines geeigneten Wirts mit dem Plasmid und dann Inkubieren des Wirts produziert werden.
  • Die Expressionsgene, die für Endo-XG-Transferase kodieren, können in lebenden Organismen kontrolliert werden. Zum Beispiel kann das Zellwandwachstum durch Steuern der Expression von Genen, die für Endo-XG-Transferase kodieren, reguliert werden. Wenn die Expression dieser Gene in den Pflanzen inhibiert ist, zum Beispiel die Rekonstruktion der Zellwand inhibiert ist, ist es möglich, dass sich Zwergpflanzen ergeben.
  • Es gibt keine besondere Einschränkung bei Verfahren zum Beeinflussen der Expression von Endo-XG-Transferase. Zum Beispiel kann es durch Einführen einer Antisense-DNA oder einer Antisense-RNA eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, in eine Pflanze erreicht werden.
  • Als Antisense-DNA zum Einführen kann zum Beispiel eine Antisense-DNA eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder ein Teil derselben verwendet werden. SEQ ID Nr. 1 bis 5 der Sequenzliste zeigen Beispiele dieser Antisense-DNAs. Das heißt, SEQ ID Nr. 1 bis 5 entsprechen jeweils den Sequenzen von Antisense-DNAs von Endo-XG-Transferasegenen, die durch SEQ ID Nr. 15 bis 19 in der Sequenzliste dargestellt sind. Zum Beispiel können Segmente verwendet werden, die durch geeignetes Spalten eines Teils dieser Antisense-DNAs erhalten sind oder ausgehend von diesen Antisense-DNA-Sequenzen synthetisierte DNAs.
  • Als Antisense-RNA zum Einführen kann zum Beispiel eine Antisense-RNA eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder ein Teil derselben verwendet werden. SEQ ID Nr. 6 bis 10 der Sequenzliste zeigen Beispiele dieser Antisense-RNAs. Das heißt, SEQ ID Nr. 6 bis 10 entsprechen jeweils den Sequenzen von Antisense-RNAs von Endo-XG-Transferasegenen, die durch SEQ ID Nr. 15 bis 19 in der Sequenzliste dargestellt sind. Zum Beispiel können Segmente verwendet werden, die durch geeignetes Spalten eines Teils dieser Antisense-RNAs erhalten sind, RNAs, die ausgehend von diesen Antisense-RNA-Sequenzen synthetisiert sind, oder RNAs, die synthetisiert sind unter Verwendung von Genen, die für Endo-XG-Transferase kodieren oder Teile davon als Template mit RNA-Polymerase in einem in vitro Transkriptionssystem.
  • Die Region und Länge der einzuführenden Antisense-DNA oder Antisense-RNA sind nicht besonderes beschränkt, so lange die Antisense-DNA oder Antisense-RNA mit endogener RNA von Endo-XG-Transferase in einem Organismus zusammenwirken und auf diese Weise deren Funktion unterdrücken kann. Es ist wünschenswert, dass das einzuführende Segment aus mindestens 15 Basenpaaren besteht.
  • Die Antisense-DNAs und die Antisense-RNAs können chemisch modifiziert sein, um deren Zersetzung in vivo zu unterdrücken.
  • Beispiele von Verfahren zum Einführen von Antisense-DNA oder Antisense-RNA in Organismen umfassen Mikroinjektion [Mol. Gen. Genetics, 202, 179-185 (1985)], das Polyethylenglykolverfahren [Nature, 296, 72-74 (1982)], das Partikelbeschussverfahren [Nature, 327, 70-73 (1987)], ein Verfahren zur Fusion zum Beispiel von Minizellen, Zellen oder Lysosomen, die eine Antisense-DNA oder eine Antisense-RNA enthalten mit Protoplasten (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1859-1863 (1982)] und das Elektroporationsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824-5828 (1985)].
  • Ferner umfasst ein wirksames Verfahren Konstruieren einer Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA, worin eine DNA-Sequenz erhalten aus einem Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert mit einem Promotor verknüpft wird, der in der Lage ist, in Zellen in der Weise zu funktionieren, das sich eine Antisense-RNA des Endo-XG-Transferasegens durch Transkription bildet, und dann Einführen der Kassette in eine Pflanze. Diese Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA kann zum Beispiel konstruiert werden durch Einsetzen eines Teils eines Strukturgens, das für EndoXG-Transferase kodiert, in den Downstream eines Promotors in der Weise, dass sich eine Antisense-RNA des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, durch Transkription bildet. Die einzusetzende Gensequenz ist nicht besonders eingeschränkt, so lange die durch Transkription gebildete Antisense-RNA mit der endogenen RNA von Endo-XG-Transferase in einem Organismus zusammenwirken kann, um dadurch die Funktion des Enzyms zu unterdrücken. Das einzusetzende Segment besteht bevorzugt aus mindestens 15 Basenpaaren.
  • Zum Beispiel kann ein Teil eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, mit einem geeignete Restriktionsenzym gespalten werden und dann mit einer geeigneten Stelle im Downstream des Promotors verknüpft werden in der Weise, dass eine Antisense-RNA des Endo-XG-Transferasegens gebildet wird. Alternativ kann ein PCR-Primer, der in der Lage ist, eine geeignete Region eines Gens zu amplifizieren, das für Endo-XG-Transferase kodiert, ausgehend von der Gensequenz von Endo-XG-Transferase nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Unter Verwendung dieses Primers wird dann PCR durchgeführt unter Verwendung eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, als Templat und das so erhaltene amplifizierte DNA-Segment wird mit dem Downstream der Promotorregion verknüpft integriert in einem geeigneten Vektor in einer solchen Richtung, dass eine Antisense-RNA eines Endo-XG-Transferasegens durch Transkription gebildet werden kann, was auf diese Weise eine Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA ergibt. In diesem Fall wird das amplifizierte DNA-Segment eingesetzt durch Auswählen einer geeigneten Restriktionsenzymstelle, die im Vektor gelegen ist, um die Antisense-RNA des Endo-XG-Transferasegens zu bilden. Es ist effektiv, PCR unter Verwendung von Primern mit Erkennungssequenzen dieser Restriktionsenzyme am 5'-Ende durchzuführen.
  • Außerdem kann die Morphologie einer Pflanze durch Konstruieren einer Kassette zum Exprimieren einer Endo-XG-Transferase reguliert werden, worin ein Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Lage ist, in Zellen in einer Weise zu funktionieren, dass die Expression des Gens möglich ist, und Einführen dieser Kassette in einen Organismus wie eine Pflanze, um dadurch die Endo-XG-Transferase in der Pflanze zu exprimieren. Das für Endo-XG-Transferase kodierende Gen, das in die Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase eingesetzt werden soll, kann beliebig ausgewählt sein, so lange es Regionen enthält, die für die Expression der Aktivität der Endo-XG-Transferase in Pflanzenzellen erforderlich sind. Bevorzugt enthält es zum Beispiel eine Region, die von einer Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, bis zu einem Terminationscodon reicht. Zum Beispiel kann ein Teil eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym abgespalten werden und dann mit einer geeigneten Stelle im Downstream des Promotors verknüpft werden, in der Weise, dass das Endo-XG-Transferasegen exprimiert werden kann. Alternativ kann ein PCR-Primer, der in der Lage ist, eine geeignete Region eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert zu amplifizieren, ausgehend von der Gensequenz von Endo-XG-Transferase nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Unter Verwendung dieses Primers wird dann PCR durchgeführt unter Verwendung eines Gens, das für Endo-XG-Transfe rase kodiert, als Templat und dann wird das so erhaltene amplifizierte DNA-Segment mit dem Downstream der Promotorregion verknüpft, die in einen geeigneten Vektor integriert ist, in einer solchen Richtung, dass Endo-XG-Transferase exprimiert weden kann, was auf diese Weise eine Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase ergibt. In diesem Fall wird das amplifizierte DNA-Segment durch Auswählen einer geeigneten Restriktionsenzymstelle, die im Vektor gelegen ist, eingesetzt. Ähnlich wie im Fall der Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA ist es effektiv, PCR unter Verwendung von Primern mit Erkennungssequenzen für diese Restriktionsenzyme am 5'-Ende durchzuführen.
  • Die Promotorsequenz zur Verwendung in der Kassette zur Ausbildung einer Antisense-RNA oder zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase ist nicht besonders beschränkt, so lange sie in Zellen funktionieren kann. Es kann entweder eine Promotorsequenz, die von einem Gen stammt, das für Endo-XG-Transferase kodiert dafür eingesetzt werden oder eine, die von einem anderen Gen stammt.
  • Ein Promotor enthält eine Region, die TATA-Box genannt wird, die 20 bis 30 Basenpaare vor der Transkriptionsstartstelle (+1) ist und für die Initiation der Transkription mit Polymerase von einer akkuraten Stelle verantwortlich ist. Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Promotorsequenz ist nicht notwendigerweise auf Regionen beschränkt, die vor oder nach der TATA-Box sind, kann aber außer der oben genannten Region weitere Upstreamregionen enthalten, die für die Assoziation von anderen Proteinen als Polymerase erforderlich sind, um die Expression zu beeinflussen.
  • Bei der Konstruktion einer Kassette zum Ausbilden einer Antisense-DNA, macht es zum Beispiel die Verwendung eines Promotors möglich, wodurch die Expression eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, in einer natürlichen Pflanze beeinflusst wird, die Menge an im ganzen Lebenszyklus eines Pflanzenorgans erzeugten Endo-XG-Transferase zu reduzieren, was auf diese Weise eine Zwergpflanze ergibt. Unter Verwendung eines konstitutiven Promotors, der von einem anderen Gen stammt, kann ein Pflanzenorgan über den gesamten Lebenszyklus morphologisch verändert werden. Als Beispiel für den konstitutiven Promotor kann Blumenkohlmosaikviruspromotor 35S verwendet werden, der in pBI121 (hergestellt von Clonetech) enthalten ist. Wenn ein durch Stimulation induzierbarer Promotor verwendet wird, kann ferner eine Pflanze hergestellt werden, die in der Lage ist, ihre Morphologie in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen zu verändern. Zum Beispiel macht es die Verwendung eines lichtempfindlichen Promotors möglich, die Morphologie einer Pflanze in Abhängigkeit von den Beleuchtungsbedingungen zu verändern. Wenn ein für ein bestimmtes Organ oder Gewebe spezifischer Promotor verwendet wird, kann nur die Morphologie des spezifischen Organs oder Gewebes verändert werden. Zum Beispiel macht es die Verwendung eines Promotors eines Gens, das spezfiisch in Blättern transkribiert wird, möglich nur deren Morphologie zu verändern. Alternativ macht es die Verwendung eines Promotors, der spezifisch auf ein bestimmtes Stadium des Lebenszyklus einwirkt, möglich die Aktivität der Endo-XG-Transferase im spezifischen Stadium des Lebenszyklus zu erhöhen oder zu reduzieren, und als Folge davon kann die Morphologie nur des spezifischen Organs oder Gewebes verändert werden. Wenn ein Promotor, der in der Lage ist, Transkription nur im Stadium zum Ausbilden von Blütenorganen zu induzieren, kann zum Beispiel nur die Morphologie der Blütenorgane verändert werden. Alternativ kann die Ausbildung von Pollenschläuchen unterdrückt werden durch Verwendung einer Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA, die unter Verwendung eines Promotors konstruiert ist, der nur auf das Stadium zum Ausbilden von Pollenschläuchen wirkt und als Folge davon, kann eine männlich sterile Pflanze erhalten werden.
  • In der Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase kann Transkription effizient beendet werden durch Ligation einer Transkriptionterminationssequenz am Downstream des Gensegments mit einem Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert, oder einer Teilsequenz davon (nachfolgend einfach als die eingesetzte Sequenz bezeichnet), die nach dem Promotor in einer Weise verknüpft ist, dass die Antisense-RNA des Endo-XG-Transferasegens gebildet wird oder das Endo-XG-Transferasegen exprimiert wird. Als Transkriptionsterminationssequenz kann eine Sequenz verwendet werden, die von einem Gen stammt, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder es können solche verwendet werden, die von anderen Genen erhalten sind. Ferner kann die Translationseffizienz durch Verknüpfen einer Poly-A-Signalsequenz mit dem Downstream der eingesetzten Sequenz erhöht werden. Als Poly-A-Signalsequenz kann eine verwendet werden, die von einem Gen stammt, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder solche, die von anderen Genen stammen, zum Beispiel Agrobacterium octopine Synthase [The EMBO J. 3, 835-846 (1984)] oder die Nopalinsynthase [Mol. and Appl. Genet. I, 561-573 (1982)].
  • Die Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder die Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase kann ohne Einschränkung nach verschiedenen bekannten Verfahren in Organismen eingeführt werden. Ein Beispiel der dafür effektiven Verfahren umfasst Einsetzen einer solchen Kassette in einen geeigneten Vektor und Einführen des Vektors in einen Organismus. In diesem Fall können die 5'- und 3'-Enden der Kassette Restriktionsenzymstellen enthalten, die nicht in der Kassette enthalten sind, sondern nur an der Stelle des Vektors, in den die Kassette eingesetzt werden soll, dies in Abhängigkeit vom ausgewählten Vektor.
  • Es ist wünschenswert, dass der Vektor, in den die Kassette eingesetzt werden soll, ein selektierbares Markergen enthält, durch das transformierte Pflanzen leicht identifiziert werden können. Als das selektierbare Markergen sind diejenigen verwendbar, die die Pflanze gegen ein Antibiotikum (Antibiotikaresistenzgene) resistent machen. Zum Beispiel können hierfür Gene verwendet werden, die eine Pflanze gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin, Gentamicin und Chloramphenicol resistent machen. Wenn der Vektor ein Antibiotikaresistenzgen enthält, können Transformanten, d. h. diejenigen, die die Kassette darin eingeführt enthalten, durch Auswählen derjenigen erhalten werden, die in einem Medium wachsen können, das das Antibiotikum enthält.
  • Beispiele des Verfahrens zum direkten Einführen von Vektoren mit der darin eingesetzten Kassette in Organismen wie Pflanzen beinhalten die oben genannte Mikroinjektion, das Polyethylenglykolverfahren, das Partikelbeschussverfahren, ein Verfahren mit Fusion, zum Beispiel von Minizellen, Zellen oder Lysosomen, die einen Vektor enthalten in Protoplasten, und das Elektroporationsverfahren.
  • Ferner können diese Kassetten unter Verwendung eines Pflanzenvirus als Vektor in Pflanzen eingeführt werden. Als hierbei verwendbarer Pflanzenvirus kann zum Beispiel Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) in einen Vektor eingesetzt werden, der zum Beispiel von E. coli stammt, um dadurch eine Rekombinante zu bilden und dann wird die oben genannte Kassette in das Virusgenom eingesetzt. Dann wird das auf diese Weise modifizierte Virusgenom aus der Rekombinante unter Verwendung von Restriktionsenzymen herausgenommen und in eine Pflanze inokuliert. Auf diese Weise kann die Kassette in die Pflanze eingesetzt werden [Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors, Academic Press, New York, 549-560 (1982); US-Patent Nr. 4,407,956].
  • Außerdem können diese Kassetten in Pflanzen unter Nutzung eines Merkmals eingeführt werden, dass ein Teil einer Plasmid-DNA eines Bakteriums, das um Genus Agrobacterium gehört, in ein Pflanzengenom transferiert wird, wenn eine Pflanze mit dem Bakterium infiziert ist. Eine mit Agrobacterium tumefaciens unter den Bakterien, die zum Genus Agrobacterium gehören, infizierte Pflanze leidet an Crown-Galltumoren (Wurzelhalsgallen), während eine mit Agrobacterium rhizogenes infizierte unter haarigen Wurzeln leidet. Diese Phänomene werden durch die Übertragung von T-DNA-Regionen (transferierte DNA), die entsprechend auf dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens oder Ri-Plasmid von A. rhizogenes gelegen sind, in Pflanzen und Integration darin bewirkt. Darüber hinaus ist die vir-Region, die für den Transfer der T-DNA-Region in eine Pflanze und ihre Integration in ein Pflanzengenom wesentlich ist, auf dem Ti- oder Ri-Plasmid. Diese vir-Region per se wird nicht in Pflanzen transferiert und kann ihre Funktion ausüben, selbst wenn sie auf einem anderen Plasmid gelegen ist, als das, auf dem die T-DNA-Region vorhanden ist [Nature, 303, 179-189 (1983)]. Eine Ziel-DNA kann in ein Pflanzengenom integriert werden, wenn sie mit einem Bakterium infiziert ist, das zum Genus Agrobacterium gehört, indem die DNA, die in ein Pflanzengenom integriert werden soll, in die T-DNA-Region des Ti- oder Ri-Plasmids eingesetzt wird. Der Teil des Ti- oder Ri-Plasmids, der in der Lage ist, Crown-Galltumoren oder haarige Wurzeln zu induzieren, kann eliminiert werden, ohne die Transferfunktion zu schädigen und das so erhaltene Produkt kann als Vektor verwendet werden. Auf diese Weise sind verschiedene Vektoren in der vorliegenden Erfindung verwendbar. Zum Beispiel kann die Antisense-RNA-Formationskassette oder die Endo-XG-Transferaseexpressionskassette in einen sogenannten binären Vektor wie pBI121 (Clonetech) oder pBI-H1-35S-IG (geliefert von Dr. Kenzo Nakamura, Nagoya Univ.) eingesetzt werden, um dadurch diese Kassetten in Pflanzen einzuführen.
  • Da diese Vektoren keine vir-Region enthalten, sollte das Bakterium des Genus Agrobacterium, das zum Integrieren der oben genannten Vektoren in ein Pflanzengenom eingesetzt werden soll, andere Plasmide mit der vir-Region enthalten.
  • Diese Vektoren sind Fährenvektoren, die nicht nur in Bakterien replizieren können, die zum Genus Agrobacterium gehören, sondern auch in Escherichia coli. Deshalb kann die Manipulation des Ti-Plasmids unter Verwendung von Escherichia coli durchgeführt werden. Außerdem enthalten diese Vektoren Antibiotikaresistenzgene, die es möglich machen, leicht Transformanten zu selektieren, wenn Bakterien, die zum Genus Agrobacterium gehören und Pflanzen transformiert werden. Darüber hinaus können diese Vektoren einen 35S-Promotor von CaMV enthalten und deshalb können in diese Vektoren eingesetzte Gene konstitutiv exprimiert werden, nachdem sie in Pflanzengenome integriert sind.
  • Alle Pflanzen, die mit Bakterien infiziert werden können, die zum Genus Agrobacterium gehören und deren Regenerationssysteme ausgebildet sind, können transformiert werden unter Verwendung eines Vektors mit einer Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase darin eingesetzt und Transferieren der Kassette in Pflanzengenome über ein Bakterium, das zum Genus Agrobacterium gehört. Die meisten dikotylen Pflanzen können unter Verwendung eines Bakteriums, das zum Genus Agrobacterium gehört transformiert werden. Insbesondere alle Pflanzen, die natürliche Wirte für Bakterien von Agrobacterium sind, können in vitro transformiert werden. Obwohl monokotyle Pflanzen darunter Getreide keine natürlichen Wirte für Bakterien von Agrobacterium sind, Roggen [Nature, 325, 274-276 (1987)], Korn [Science, 240, 204-207 (1988)] und Reis [Nature, 338, 274-276 (1989)] können in vitro transformiert werden.
  • Die Transformation kann vorgenommen werden (1) unter Verwendung von Protoplasten oder (2) unter Verwendung von intakten Zellen. Das Verfahren (1) erfordert Ausbilden eines Systems, das Regeneration von Pflanzen aus transformierten Protoplasten ermöglicht. Hingegen erfordert das Verfahren (2) Transformieren von Gewebestücken oder intakten Zellen unter Verwendung eines Bakteriums, das zum Genus Agrobacerium gehört und Ausbilden eines Systems, das ermöglicht, dass Transformanten sich in ganze Pflanzen regenerieren. Die transformierten Pflanzen können durch Kultivieren in einem Medium selektiert werden, das ein Antibiotikum enthält, das in der Lage ist als der oben genannte Marker für die Transformation zu dienen.
  • Mittel zum Regenerieren von Pflanzen variieren von einer Pflanzenspezies zur anderen. Allgemein kann es vorgenommen werden durch Ausbilden eines Callusgewebes aus einer Suspension von transformierten Protoplasten [im Falle des Verfahrens (1)] oder eines transformieren Gewebestücks oder intakter Zellen auf einer Platte [im Falle des Verfahrens (2)] und dann Induzieren von Sprossen daraus. Das Kulturmedium kann allgemein verschiedene Aminosäuren und Hormone enthalte wie Auxin und Cytokinine. Es kann zum Beispiel durch Southern-Hybridisierung bestimmt werden, ob die gewünschte Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder die gewünschten Kassetten zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase in das Pflanzengenom eingesetzt werden können. Es kann zum Beispiel durch Northern-Hybridisierung bestimmt werden, ob die Sense-RNA oder die Antisense-RNA von Endo-XG-Transferasegen in der Pflanze gebildet werden.
  • Die Verwendung der so erhaltenen Pflanze mit der Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder der Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase macht es möglich, eine Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder eine Kassette zum Exprimieren von Endo- XG-Transferase in Pflanzen der nächsten Generation durch Paarung zu übertragen.
  • Zum Beispiel kann eine Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder ein Plasmid, das eine Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase enthält, die aus einem upstream gelegenen 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und einem Gen, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder seiner Teilsequenz im Downstream gebildet ist, konstruiert werden durch Integrieren des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert oder seiner Teilsequenz erhalten in der vorliegenden Erfindung in einen Vektor pBI-H1-35S-IG in einer solchen Richtung, dass eine Antisense-RNA durch Transkription gebildet wird oder die Endo-XG-Transferase exprimiert wird. Unter Verwendung der so konstruierten Plasmide kann ein geeigneter Bakterienstamm, der dem Genus Agrobacterium angehört wie Agrobacterium tumefaciens LBA4404 [Nature, 303, 179-180 (1983); erhältlich von Clonetech] transformiert werden. Dann können Pflanzen durch Infizieren mit der oben erhaltenen Transformante transformiert werden. Ferner werden diese Plasmide, zum Beispiel pAX301, pAX302 und pTX302, die später beschrieben werden, mit geeigneten Restriktionsenzymen wie HindIII und SacI verdaut und auf Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und dann werden die Zielfragmente entnommen und gereinigt. Diese Fragmente sind bei der Transformation von Pflanzen verwendbar durch Integrieren in andere Plasmide, zum Beispiel die HindIII-SacI-Stelle von pBI101 als Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase oder eine Kassette zum Ausbilden einer Antisense-DNA.
  • Zum Beispiel können vier Primer ATX-AS, ATS-AS, ATX-S und ATS-S, exprimiert durch SEQ ID Nr. 20, 21, 22 und 23 im Sequenzprotokoll, konstruiert und synthetisiert werden auf Basis der Sequenz eines Gens, das für Arabidopsis thaliana Endo-XG-Transferase kodiert, dargestellt durch SEQ ID Nr. 17 im Sequenzprotokoll, das in der vorliegen den Erfindung erhalten ist. Die Primer ATS-AS und ATX-S sind solche, worin die Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms SacI und XbaI jeweils an der 5'-Stelle der Sequenz hinzugefügt ist, die den Basen Nr. 40 und 56 in SEQ ID Nr. 17 im Sequenzprotokoll in Richtung 5' → 3' entspricht, während die Primer ATX-AS und ATS-S solche sind, worin die Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms XbaI und SacI jeweils an der 5'-Stelle der Sequenz hinzugefügt ist, die der Base Nr. 1007 bis 1023 in Richtung 3' → 5' entsprechen.
  • Unter Verwendung zum Beispiel des Gens, das für Endo-XG-Transferase von Arabidopsis thaliana kodiert als Templat, wird die Gensequenz nach dem PCR-Verfahren amplifiziert unter Verwendung eines Paars Primer ATS-AS und ATX-AS unter den oben zitierten, und ein so amplifiziertes DNA-Segment von ungefähr 1 kbp wird mit den Restriktionsenzymen XbaI und SacI gespalten. Nach der Reinigung kann es an einer Stelle zwischen der XbaI-Stelle und der SacI-Stelle von pBI-H1-35S-IG eingesetzt werden. Das so erhaltene Plasmid wird pAX301 bezeichnet. Dieses pAX301 weist einen 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und die Sequenz des Teils ausgedrückt durch Basen Nr. 40 bis 1023 in SEQ ID Nr. 17 im Sequenzprotokoll auf, der in solcher Weise integriert ist, dass er die Bildung der Antisense-RNA von Endo-XG-Transferasegen durch Transkription in der XbaI-Stelle-SacI-Stelle downstream vom Promotor ermöglicht. Es enthält Gene, die gegen Kanamycin und Hygromycin resistent sind.
  • Gleichermaßen wird das Gen nach dem PCR-Verfahren unter Verwendung eines Paars Primer ATX-S und ATS-S amplifiziert und das so amplifizierte DNA-Segment von ungefähr 1 kbp wird in eine Stelle zwischen der XbaI-Stelle und der SacI-Stelle von pBI-H1-35S-IG eingesetzt. Das so erhaltene Plasmid wird pAX302 bezeichnet. Dieses Plasmid pAX302 weist einen Promotor auf und Resistenzgene ähnlich wie es das oben genannte pAX301 trägt und eine Sequenz dargestellt durch die Basen Nr. 40 bis 1023 in SEQ ID Nr. 17 in dem hier beigefügten Sequenzprotokoll in einer solchen Richtung, dass die Expression von Endo-XG-Transferase möglich ist.
  • Unter Verwendung dieser Plasmide pAX301 und pAX302 kann zum Beispiel ein Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 nach dem Elektroporationsverfahren transformiert werden [Shokobutsu Saibo Kogaku (Plant Cell Engineering), Band 4, 193-203, Shujunsha (1992)].
  • Ein Escherichia coli Stamm JM109 wird mit pAX301 transformiert. Die so erhaltene Transformante wird Escherichia coli JM109/pAX301 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4222 hinterlegt.
  • Verfahren zum Transformieren der gewünschten Pflanze mit einem transformierten Bakterium des Genus Agrobacterium sind nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel wird eine sterile Pflanze gezüchtet und ein Stück dieser Pflanze wird in einem Callus induzierenden Medium inkubiert [eine CIM-Platte, die durch Zusatz von 2,4-D präpariert wurde (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer solchen Menge, dass sich eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml ergibt und Kinetin (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer solchen Menge, dass sich eine Endkonzentration 0,05 μg/ml ergibt auf einer MSO-Platte (4,6 g Murashigeskoog anorganische Salze, 10 g Sucrose, 1 ml 1000 × Vitaminstammlösung, jeweils pro Liter, pH 6,2)] über einige Tage und dann mit einem transformierten Agrobacterium infiziert. Dann wird Überschuss an Agrobacteriumzellen aus dem infizierten Pflanzenstück entfernt, das inkubiert wird und überführt in eine Platte, die Antibiotika enthält, die in der Lage sind, als selektierbare Marker für den eingesetzten Vektor zu dienen. Nach dem Inkubieren können transformierte Pflanzen selektiert werden.
  • Es kann bestimmt werden, ob eine Kassette zum Ausbilden einer Antisense-RNA oder eine Kassette zum Exprimieren von Endo-XG-Transferase in den Genomen dieser Pflanzen eingesetzt ist, die auf der Platte erhalten sind, die die Antibiotika enthält, durch Extrahieren von DNA dieser Pflanzen oder aus deren Samen ausgebildeten Pflanzen und Ausführen zum Beispiel einer Southern-Hybridisierung an der DNA unter Verwendung des Endo-XG-Transferasegens oder seiner Teilsequenz als Sonde.
  • Es kann bestimmt werden, ob die Expression des Endo-XG-Transferasegens in den transformierten Pflanzen beeinflusst wird, indem RNA der transformierten Pflanzen oder aus deren Samen erhaltenen Pflanzen extrahiert wird und Ausführen zum Beispiel einer Northern-Hybridisierung an der DNA unter Verwendung des Endo-XG-Transferasegens oder seiner Teilsequenz als Sonde.
  • Zum Beispiel werden Samen von Arabidopsis thaliana unter sterilen Bedingungen auf herkömmliche Weise kultiviert und Wurzelexplantate davon werden einer Callusinkubation auf einer CIM-Platte unterzogen, die oben beschrieben ist. Agrobacterium-Stämme transformiert mit pAX301, pAX302 und pBI-H1-35S-IG werden kultiviert, verdünnt und in Röhrchen pipettiert. Dann werden Wurzelexplantate mit Callus darin eingetaucht und auf der CIM-Platte einige Tage co-inkubiert. Wenn jeder Stamm genügend gewachsen ist, so dass er zu beobachten ist, wird Überschuss von Agrobacteriumzellen aus der Kultur entfernt, die in einem Sprossen induzierenden Medium über mehrere Tage weiter inkubiert [eine SIMC-Platte, hergestellt durch Zusatz von 2-ip{N6-(2-Isopentanyl)adenin} (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), IAA (3-Indolessigsäure, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Claforan jeweils in solchen Mengen, dass sich eine Endkonzentration von 5 μg/ml, 0,15 μg/ml und 500 μg/ml auf einer MSO-Platte ergibt].
  • Diese Explantate werden schließlich auf einer SIMCS-Platte inkubiert (eine SIMC-Platte, die Kanamycin und Hygromycin B enthält) und jede Woche in eine frische Platte überführt. Die transformierten Explantate wachsen weiter und bilden konvexe Callusse, während die nicht transformierten braun werden. Die Transformanten werden inkubiert, bis sich Rosettenblätter bilden, dann mit einem Skalpell unten abgeschnitten, so dass kein Callusteil darin enthalten ist und in ein Wurzel induzierendes Medium überführt (RIM-Platte, hergestellt durch Zusatz von IAA zu einer MSO-Platte in einer solchen Menge, dass sich eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml ergibt). Nach 8 bis 10 Tagen werden sie in einen Rock Fiber Minipot (hergestellt von Nitto Boseki Co., Ltd.) überführt, der in ein anorganisches Salzmedium eingetaucht wird, das nachfolgend beschrieben wird, und darin inkubiert. Pflanzen, die blühen und Frucht ansetzen, werden in eine Erde überführt, die in das anorganische Salzmedium eingetaucht ist und auf diese Weise können Samen erhalten werden. Diese Samen werden sterilisiert, auf einer MSH-Platte ausgesät (enthält Hygromycin B), die nachfolgend beschrieben wird, und gekeimt, so dass eine Transformante erhalten wird. Eine aus dieser Transformante auf herkömmliche Weise extrahierte DNA wird mit einem Restriktionsenzym HindIII oder PstI gespalten und Southern-Hybridisierung unterzogen, wobei ein DNA-Segment von ungefähr 1 kbp verwendet wird, das unter Verwendung eines Paars Primer ATX-S und ATS-S als Sonde wie oben beschrieben amplifiziert wurde. Auf diese Weise kann das Ergebnis der Transformation bestätigt werden. Insbesondere enthalten bei einem untransformierten WS-Stamm (1) einer Transformante (2) mit pAX301 darin eingeführt, einer anderen Transformante (3) mit pAX302 darin eingeführt und einer anderen Transformante (4) mit Vektor pBI-H1-35S-IG allein darin eingeführt, beide Transformanten (2) und (3) ein spezifisches Signal von ungefähr 1 kbp, das in einer mit HindIII gespaltenen Probe beobachtet wird, und bei ungefähr 3 kbp, das in einer mit PstI gespaltenen Probe beobachtet wird, zusätzlich zu endo genen Signalen, die den Stämmen (1) bis (4) gemeinsam sind. Diese Ergebnisse beweisen, dass eine DNA, die für Endo-XG-Transferase kodiert, in beide Stämme (2) und (3) integriert wurde.
  • Ferner kann die Expression von Endo-XG-Transferase in den obigen Stämmen (1) bis (4) beobachtet werden durch Extrahieren von RNAs aus den Stämmen (1) bis (4) auf herkömmliche Weise, wobei Sonden konstruiert werden, die eine Sense-DNA-Sequenz von ungefähr 1 kbp oder eine Antisense-DNA-Sequenz aufweisen, nach einem Verfahren das nachfolgend beschrieben wird, und Durchführen von Northern-Hybridisierung unter Verwendung dieser Sonden. Wenn nämlich die Sense-DNA-Sequenz als Sonde verwendet wird, wird keine Bande in den oben genannten Stämmen (1), (3), (4) beobachtet, jedoch wird eine Bande von ungefähr 1 kbp nur im Stamm (2) beobachtet. Wenn die Antisense-DNA-Sequenz als Sonde verwendet wird, werden Banden von ungefähr 1 kbp in allen Stämmen (1) bis (4) beobachtet. Die Signalintensität der Bande in (3) ist höher als die von (1), während ein schwaches Signal aus (2) erfasst wird. Auf diese Weise wird bestätigt, dass die Expression der Endo-XG-Transferase durch den Stamm (3) intensiviert, aber in Stamm (2) unterdrückt ist.
  • Unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich wie das oben genannte können Transformanten anderer Pflanzen wie Tabak konstruiert werden, indem zum Beispiel die Sequenz eines Gens verwendet wird, das für Endo-XG-Transferase von Tomate kodiert, das gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
  • Zum Beispiel können ausgehend von der Sequenz eines Gens, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, die eine Pflanze der selben Familie wie Tabak ist, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll, vier Primer TOMXSP, TOMSAP, TOMSSP und TOMXAP jeweils dargestellt durch SEQ ID Nr. 24, 25, 26 und 27 im Se quenzprotokoll konstruiert und synthetisiert werden. Die Primer TOMXSP und TOMSSP sind solche, worin die Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms XbaI und SacI an der 5'-Stelle eines Sequenz hinzugefügt wird, die den Basen Nr. 46 bis 66 in SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll in Richtung 5' → 3' entsprechen, während die Primer TOMSAP und TOMXAP solche sind, worin eine Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms SacI und XbaI an der 5'-Stelle eines Sequenz hinzugefügt wird, die den Basen Nr. 921 bis 941 in Richtung 3' → 5' entsprechen.
  • Unter Verwendung eines Gens, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, als Templat kann zum Beispiel eine Gensequenz nach dem PCR-Verfahren amplifiziert werden, wobei ein Paar Primer TOMXSP und TOMSAP aus den oben genannten verwendet wird. Dann wird das so amplifizierte DNA-Segment von ungefähr 930 bp mit Restriktionsenzymen XbaI und SacI gespalten. Nach der Reinigung kann es in eine Stelle zwischen der XbaI-Stelle und der SacI-Stelle von pBI-H1-35S-IG eingesetzt werden. Das so erhaltene Plasmid wird pTX301 bezeichnet, eine Teilsequenz eines Strukturgens, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, die durch die Basen Nr. 46 bis 941 in SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll dargestellt ist, wird an der XbaI-Stelle-SacI-Stelle downstream des 35S Promotors des Blumenkohlmosaikvirus in einer solchen Richtung integriert, dass die Expression von Endo-XG-Transferase möglich ist. Es enthält ein Gen, das gegen Kanamycin und Hygromycin resistent ist. Gleichermaßen wird ein Gen nach dem PCR-Verfahren amplifiziert unter Verwendung eines Paars Primer TOMSSP und TOMXAP und ein so amplifiziertes DNA-Segment von ungefähr 930 bp wird in eine Stelle zwischen der XbaI-Stelle und der SacI-Stelle von pBI-H1-35S-IG eingesetzt. Das so erhaltene Plasmid wird pTX302 bezeichnet. In diesem pTX302, das einen Promotor und ein Resistenzgen beide gleich wie die entsprechenden in pTX301 aufweist, wird die Sequenz entsprechend den Basen Nr. 46 bis 941 in SEQ ID Nr. 8 im Sequenzprotokoll in einer solchen Weise integriert, dass die Bildung einer Antisense-RNA durch Transkription möglich ist.
  • Unter Verwendung dieser Plasmide kann ein geeigneter Stamm, der zum Genus Agrobacterium gehört, zum Beispiel ein Agrobacterium tumefaciens LBA44044 nach dem selben Verfahren wie oben beschrieben transformiert werden.
  • Ein Stamm Escherichia coli JM109 wird mit pTX301 und pTX302 transformiert. Die so erhaltenen Transformanten werden entsprechend Escherichia coli JM109/pTX301 und Escherichia coli JM109/pTX302 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4223 und FERM BP-4224 hinterlegt.
  • Unter Verwendung von Agrobacterium-Stämmen transformiert mit pTX301 und pTX302 können mit pTX301 und pTX302 transformierte Tabakpflanzen auf die selbe Weise konstruiert werden, wie sie im oben genannten Fall von Arabidopsis thaliana eingesetzt wurde. Aus diesen Transformanten wurden DNAs nach einem herkömmlichen Verfahren extrahiert und mit einem Restriktionsenzym PstI verdaut. Dann wird Southern-Hybridisierung durchgeführt unter Verwendung von zum Beispiel einem DNA-Segment amplifiziert mit PCR unter Verwendung eines Paars der oben genannten Primer TOMSSP und TOMXAP als Sonde und auf diese Weise kann bestätigt werden, ob eine Transformation erfolgt ist.
  • Tabakpflanzen mit pTX301 und pTX302 darin eingeführt zeigen nämlich Banden zusätzlich zu der, die dem Endo-XG-Transferasegen des Tabaks zugeordnet wird, im Vergleich zu einer Kontrolltabakpflanze, die pBI-H1-35S-IG allein darin eingeführt aufweist und einer untransformierten. Alternativ wird eine Bande eines intensiven Signals erfasst, das sich deutlich unterscheidet von dem, das in einem Kontrolltabak gefunden wird. Auf diese Weise kann bestätigt werden, dass das Strukturgen, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, in die Tabakpflanzen mit darin eingeführten pTX301 und pTX302 eingeführt wurde.
  • Ferner kann die Expression von Endo-XG-Transferase durch Extrahieren von RNAs aus diesen Transformanten bestätigt werden, wobei Sonden konstruiert werden, die eine Sense-DNA-Sequenz oder eine Antisense-DNA-Sequenz davon aufweisen, nach einem Verfahren, das nachfolgend beschrieben wird und Durchführen von Northern-Hybridisierung unter Verwendung dieser Sonden. Wenn eine Sonde mit der Sense-DNA-Sequenz verwendet wird, zeigen nämlich die Tabakpflanzen mit pBI-H1-35S-IG und pTX301 darin eingeführt und die untransformierte Tabakpflanze keine entsprechende Bande, während eine mit pTX302 darin eingeführt die entsprechende Bande zeigt. Wenn hingegen eine Sonde mit der Antisense-DNA-Sequenz verwendet wird, zeigen die Tabakpflanze mit pBI-H1-35S-IG darin eingeführt und die untransformierte Tabakpflanze jeweils eine entsprechende Bande, während eine mit pTX301 darin eingeführt eine Bande erhöhter Intensität zeigt. Die Tabakpflanze mit pTX302 darin eingeführt zeigt nur eine schwache Bande. Ausgehend von diesen Ergebnissen ist bewiesen, dass die Expression von endogener Endo-XG-Transferase durch Einführen von pTX301 intensiviert, aber durch Einführen von pTX302 unterdrückt wird.
  • Wenn die Rekonstruktion von XG-Molekülen unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung von nach der vorliegenden Erfindung erhaltener Endo-XG-Transferase mehrmals wiederholt wird, können XG-Moleküle einer beliebigen Struktur konstruiert werden, die zum Beispiel bei der Synthese von chimären Polysacchariden anwendbar sind.
  • Es ist auch möglich, die Pflanzenzellwandstruktur durch Verwendung der Endo-XG-Transferase zu verändern, was bei der Verarbeitung von Pflanzenmaterial zur Verwendung im industriellen Bereich nützlich ist. Der Prozess für die Expression eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, kann unter Verwendung des Gens das für Endo-XG-Transferase kodiert und eines damit hybridisierbaren Gens oder einem Polynukleotid mit einer Teilsequenz davon beobachtet und beeinflusst werden, wie es in der vorliegenden Erfindung erhalten ist. Außerdem können unter Verwendung von Polypeptiden, die durch die Expression des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, wie in der vorliegenden Erfindung erhalten sind, verschiedene Antikörper immunologisch erzeugt werden. Diese Antikörper sind zum Beispiel auch für die Reinigung von Endo-XG-Transferase geeignet.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Vigna angularis kodieren.
  • 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Sojabohnen kodieren.
  • 3 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Arabidopsis thaliana kodieren.
  • 4 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Tomaten kodieren.
  • 5 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Weizen kodieren.
  • 6 zeigt das PAD-Chromatogramm, das durch Messen der Transferreaktion von XG-Molekülen mit der Endo-XG-Transferase erhalten ist.
  • 7 zeigt das Fluoreszenzchromatogramm, das durch Messen der Transferreaktion von XG-Molekülen mit der Endo-XG-Transferase unter Verwendung eines Fluorophotometers erhalten ist.
  • 8 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität von Endo-XG-Transferase und dem Substratmolekulargewicht.
  • 9 zeigt die 1H-NMR-Spektren von Produkten, die durch Umsetzen von XG mit der Endo-XG-Transferase oder denaturiertem Enzym der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
  • 10 zeigt ein Schaubild aufgestellt durch Messen der Transferreaktion von XG7-PA in der Zellwand mit der Endo-XG-Transferase unter Verwendung eines Fluorophotometers.
  • 11 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität von Endo-XG-Transferase von Vigna angularis und dem pH.
  • 12 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität von Endo-XG-Transferase von Vigna angularis und der Temperatur.
  • 13 zeigt das PAD-Chromatogramm, das durch Messen des Produkts der Enzymreaktion der Endo-XG-Transferase von Vigna angularis erhalten ist.
  • 14 zeigt den Prozess zum Konstruieren von Plasmid pVX110.
  • 15 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Mais kodieren.
  • 16 zeigt die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels der Gensegmente, die für Endo-XG-Transferase von Reis kodieren.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, sind aber nicht als Einschränkung ihres Rahmens vorgesehen.
  • Beispiel 1: Reinigung von Endo-XG-Transferase
  • Samen von Vigna angularis Ohwi et Ohashi cv.Takara (erhalten von Watanabe Seed Co., Ltd.) werden nach dem in Physiologia Plantarum, 82, 490-497 (1991) beschriebenen Verfahren gekeimt und auf diese Weise eine Apoplastenlösung erhalten.
  • (Ammoniumsulfatfällung)
  • Insgesamt 600 ml der Apoplastenlösung werden mit 10 g eines Polyvinylpyrrolidonpulvers und 60 ml einer 0,5 M Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,8), die 50 mM Dithiothreitol enthält und 2 mM EDTA bei 0°C vermischt und 5 Minuten stehen gelassen. Nach Entfernen von unlöslichen Substanzen durch Zentrifugieren bei 18000 × G über 30 Minuten wird ein Ammoniumsulfatpulver zum Überstand hinzugefügt, so dass 80% Sättigung erreicht werden. Dann wird das so erhaltene Fällungsprodukt, das 10,5 mg Protein enthält, durch Zentrifugieren aufgenommen. Das erhaltene Fällungsprodukt wird in 2 ml einer 0,2 M Natriumacetatpufferlösung (pH 5,7) gelöst und 1 ml einer 100% gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat hinzugefügt, um eine Sättigung von 33 zu erhalten. Das so gebildete Fällungsprodukt wird bei 18000 × G über 30 Minuten zentrifugiert und eine Fraktion erhalten, die 1,8 mg Protein enthält.
  • (Fraktionierung mit Con-A Sepharose 6B)
  • Das oben erhaltene Fällungsprodukt wird in 2,4 ml Natriumacetatpufferlösung (pH 5,7) gelöst, die 0,15 M NaCl, 1 mM MnCl2 und 1 mM CaCl2 enthält und in eine mit 4 ml Con-A Sepharose 6B (hergestellt von Pharmacia) gepackte Säule aufgegeben, die mit der selben Pufferlösung a ins Gleichgewicht gebracht ist. Diese Säule wurde nacheinander mit 36 ml der Pufferlösung a, 20 ml der Pufferlösung a mit 7 mM Methyl-α-D-mannopyranosid und 40 ml der Pufferlösung a mit 500 mM Methyl-α-D-mannopyranosid eluiert. Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde in der Fraktion gefunden, die mit der Pufferlösung a mit 500 mM Methyl-α-D-mannopyranosid eluiert wurde. Die aktive Fraktion wurde dann durch Ultrafiltration aufkonzentriert unter Verwendung von Ultrafree (hergestellt von Millipore), so dass 400 μl einer Fraktion mit 668 μg Protein erhalten werden.
  • (Fraktionierung mit TSK-Gel 2000SW)
  • 200 μl des Proteins in der oben erhaltenen Fraktion wurden auf einer Säule mit TSK-Gel G2000SW (7,5 × 300 mm, hergestellt von Tosoh Corp.) unter Verwendung einer 0,15 M Natriumacetatpufferlösung (pH 5,7) als Elutionsmittel bei einer Strömungsrate von 0,5 ml/min chromatographiert. Die Chromatographievorgang wird wiederholt und aktive Fraktionen werden kombiniert und konzentriert. Auf diese Weise wird eine Fraktion erhalten, die 60 μg Protein in 100 μl der oben genannten Pufferlösung enthält.
  • (Fraktionierung mit Mono-S)
  • Die im oben genannten Verfahren erhaltene Fraktion wurde mit 500 μl einer 20 mM Natriumacetatlösung verdünnt und auf eine Säule (5 × 50 mm) von Mono-S (hergestellt von Pharmacia) aufgegeben, die zuvor mit einer 40 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,7) ins Gleichgewicht gesetzt wurde. Diese Säule wurde zunächst mit 2,5 ml der 40 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,7) eluiert, gefolgt von einer Elution mit 20 ml der 40 mM Natriumacetatpufferlösung, die eine linearen Gradienten von 0–1 M NaCl enthält bei einer Strömungsrate von 0,4 ml/min. Auf diese Weise werden ungefähr 30 μg einer gereinigten Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung erhalten.
  • Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der oben genannten Reinigungsprozesse Tabelle 3
    Figure 00500001
  • In 13, ist (b) ein Chromatogramm, das durch eine Reaktion unter Verwendung der Apoplastenlösung erhalten ist und ein Pfeil 2 in 13 stellt die Elutionsstelle von Monomersacchariden gebildet durch die Glycosidaseverunreinigung dar. Im Chromatogramm (c), das durch eine Reaktion unter Verwendung des gereinigten Enzyms erhalten ist, ist kein den Monomersacchariden zuzuordnender Peak zu beobachten, was angibt, dass die Glycosidaseverunreinigung durch den Reinigungsprozess entfernt wurde.
  • (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
  • Die gereinigte Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung, das im obigen Reinigungsprozess erhalten wurde, wird einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen gemäß dem Verfahren von Laemmili et al. [Nature, 227, 680-685 (1970)]. Es werden ein 12% Polyacrylamidgel, das SDS enthält (10 × 10 cm, 1 mm dick) verwendet und Proteinbanden mit Silber angefärbt. Auf diese Weise wurde die gerei nigte Probe des Enzyms der vorliegenden Erfindung als eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 33000 identifiziert.
  • Beispiel 2: Klonen des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert
  • (1) Herstellung von Poly(A)+RNA
  • Samen von Vigna angularis Ohwi et Ohashi cv.Takara werden nach dem in Physiologia Plantarum beschriebenen Verfahren gekeimt. Eine Woche nach dem Keimen wurde der Stängel auf 2 bis 5 cm unter der Knospenspitze abgeschnitten, um dadurch ungefähr 3 g Pflanzengewebe zu erhalten. Das Gewebe wurde unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser in Gegenwart von flüssigem Stickstoff gemahlen. Das erhaltene Pulver wurde dann in ungefähr 30 ml einer Denaturierungslösung gelöst [4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz], 3 ml 2 M Natriumacetat (pH 4,0) und 30 ml wassergesättigtes saures Phenol und 6 ml Chloroform/Isoamylalkoholmischung (49:1) sukzessive hinzugefügt, gefolgt von gründlichen Rühren. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert. Der so erhaltene wässrigen Schicht wurde Isopropanol zugesetzt und die Mischung zentrifugiert. Auf diese Weise wurden ungefähr 1 mg eines Fällungsprodukts von RNA erhalten. Dieses Fällungsprodukt wurde in 400 μl einer Elutionspufferlösung gelöst [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS] und 1 ml Oligotex-dT30 (hergestellt von Nippon Roche) wurden hinzugegeben, um dadurch ausschließlich Poly(A)+RNA durch das Harz zu adsorbieren. Das Harz wurde mit reinem Wasser aus dem Autoklaven gewaschen und auf diese Weise ungefähr 10 μg Poly(A)+RNA gewonnen.
  • (2) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von Endo-XG-Transferase
  • Unter Verwendung von ungefähr 1 nmol der gereinigten Endo-XG-Transferaseprobe aus dem obigen Beispiel 1 wurde die Aminosäuresequenz von ungefähr 30 Resten bestimmt, die am N-terminalen Ende gelegen sind, mit einem Protein Sequencer 470A (hergestellt von Applied Biosystems). Diese Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 11 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • (3) Amplifizierung von Endo-XG-Transferase durch PCR
  • Ausgehend von der oben in (2) bestimmten Aminosäuresequenz wurden Primer pAZ-1 (SEQ ID Nr. 12) und pAZ-2 (SEQ ID Nr. 13) konstruiert und in einem DNA-Synthesegerät synthetisiert. Ferner wurde ein anderer Primer pTM4 mit einer Sequenz, worin weitere 20 T-Reste an der 3'-Stelle der Sequenz von M13 Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo, Co. Ltd.) gebunden sind, auf ähnliche Weise synthetisiert. Die Sequenz dieses Primers pTM4 ist in SEQ ID Nr. 14 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • 2 μg Poly(A)+RNA wie oben in (1) erhalten wurden zu einer Reaktionsmischung hinzugegeben (Gesamtvolumen: 20 μl), die 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,01% Gelatine, 1 mM dNTP, 2,5 μM Primer pTM4, 20 U RNase-Inhibitor und 50 U Reverse-Transkriptase RAV-2 enthält. Dann wurde Reverse-Transkription bei 42°C über 40 Minuten durchgeführt, um eine cDNA zu synthetisieren.
  • Zu diesem Röhrchen wurden sukzessive hinzugegeben 4 μl 25 mM MgCl2, 8 μl 10 × PCR-Pufferlösung [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,1% Gelatine], 65,5 μl sterilisiertes destilliertes Wasser, 2,5 U Ampli Taq (Marke) DNA-Polymerase (hergestellt von Perkon-Elmer Cetus Instruments), 20 pmol Primer pAZ-1 und 20 pmol M13 Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Nach weiterer Zugabe von Mi neralöl wurde die Mischung einer PCR unterzogen. Die Reaktion wurde durchgeführt durch 30 mal Wiederholen eines Zyklus (94°C 0,5 Minuten lang, 45°C 2 Minuten lang und 72°C 1 Minute lang) und dann 7 Minuten bei 72°C halten. Danach wurde PCR auf die selbe Weise unter Verwendung von 1 μl der Reaktionsmischung als Templat, dem Primer pAZ-2 als Sense-Primer und dem M13 Primer M4 als Antisense-Primer durchgeführt. Nach 25 mal Wiederholen des oben genannten Zyklus, wurde die Reaktionsmischung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass eine cDNA von ungefähr 1,1 kbp spezifisch amplifiziert wurde. Diese cDNA wurde gereinigt und subgeklont in die Restriktionsenzymstelle (HincII) eines Vektors pUC 119.
  • (4) Herstellung einer cDNA-Bibliothek und Screening
  • Ausgehend von der Poly(A)+RNA wie oben in (1) erhalten wurde eine cDNA-Bibliothek mit λgt 10 als Vektor hergestellt gemäß dem in Gene 25, 263 (1983) beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines cDNA Synthesis Kit System Plus (hergestellt von Amersham). Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp subgeklont wie oben in (3) wurde dann markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), um dadurch eine Sonde für die Hybridisierung zu erhalten. Dann wurde die oben erhaltene cDNA-Bibliothek einer Plaquehybridisierung unter Verwendung dieser Sonde unterzogen. Durch Untersuchen von 1 × 104 Plaques wurden 5 positive Plaques erhalten. Dann wurden Phagen aus diesen positiven Plaques isoliert und dann die darin eingesetzten DNAs extrahiert. Diese DNAs wurden mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und die Länge jedes DNA-Segments durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Ein DNA-Segment von ungefähr 1,1 kbp wurde gereinigt und subgeklont in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC 119. Das so erhaltene Plasmid wird pVX103 bezeichnet. Das erhaltene DNA-Segment von ungefähr 1,1 kbp wurde mit mehreren Restriktionsenzymen gespalten und durch Agaro segelelektrophorese analysiert. 1 zeigt die Ergebnisse. Das heißt, 1 ist eine Restriktionsenzymkarte des DNA-Segments von ungefähr 1,1 kbp. Das Segment kann nicht mit solchen Restriktionsenzymen wie BamHI, HindII und KpnI gespalten werden. Ein Escherichia coli JM109 Stamm wurde mit dem Plasmid pVX103 transformiert und die so erhaltene Transformante wurde Escherichia coli JM109/pVX103 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4104 hinterlegt.
  • Beispiel 3
  • Bestimmung der DNA-Sequenz von Endo-XG-Transferasegen
  • 10 μg des im obigen Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pVX103 wurden mit Restriktionsenzymen XbaI und PstI gespalten. Dann wurde ein DNA-Segment in einen Vektor integriert aus der Erkennungssequenzstelle von XbaI gemäß dem Verfahren von Henikoff et al. [Gene, 28, 351-359 (1984)] unter Verwendung eines Kilo Sequence Deletion Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, um dadurch Klone zu erhalten, die Segmente verschiedener Größen enthalten. Es wurden acht Plasmide daraus selektiert, die Segment geeigneter Größe enthalten und die Sequenz eines DNA-Segments von ungefähr 1,1 kbp wurde gemäß dem Sanger-Verfahren bestimmt [Science, 214, 1205-1210 (1981)] unter Verwendung eines BcaBESTTM Labeling Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). SEQ ID Nr. 5 im Sequenzprotokoll zeigt einen Teil dieser Sequenz. In SEQ ID Nr. 5 im Sequenzprotokoll entspricht die durch die Basen Nr. 57 bis 872 dargestellte Region der Kodiersequenz für Endo-XG-Transferase von Vigna angularis.
  • Beispiel 4
  • (4-1) Klonen von Endo-XG-Transferasegen der Sojabohne und Bestimmung der DNA-Sequenz
  • Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Eine von Sojabohnengewebe (Glycine max) mRNA (hergestellt von Clonetech) hergestellte cDNA-Bibliothek wurde einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis einer Untersuchung an 5 × 104 Plaques wurden drei positive Plaques erhalten. Dann wurden Phagen aus diesen drei Plaques isoliert und DNAs aus den Phagen gereinigt. Diese DNAs wurden mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge des eingesetzten cDNA-Segments zu sehen. Auf diese Weise konnte das längste cDNA-Segment (ungefähr 1 kbp) unter den drei oben genannten positiven Plaques erhalten werden. Dann wurde dieses cDNA-Segment gereinigt und in die EcoRI-Stelle eines Vektors pUC119 subgeklont. Das so erhaltene Plasmid wird pSX102 bezeichnet. Das so erhaltene cDNA-Segment von ungefähr 1 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 2 zeigt das Ergebnis. 2 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des cDNA-Segments von ungefähr 1 kbp zeigt.
  • Unter Verwendung des Plasmids pSX102 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die auf diese Weise erhaltene Transformante wird Escherichia coli JM109/pSX102 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4226 hinterlegt.
  • Das Plasmid pSX102 wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und SphI gespalten. Unter Verwendung des so erhaltenen cDNA-Segments wurde die DNA-Sequenz des cDNA-Segments von ungefähr 1 kbp nach dem selben Verfahren wie oben im Beispiel 3 eingesetzt bestimmt. Ein Teil dieser Sequenz ist in SEQ ID Nr. 15 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • (4-2) Klonen des Endo-XG-Transferasegens von Arabidopsis thaliana und Bestimmung der DNA-Sequenz
  • Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Eine aus Gewebe von Arabidopsis thaliana mRNA (hergestellt von Clonetech) hergestellte cDNA-Bibliothek wurde einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis wurden ungefähr drei positive Plaques pro 5 × 104 Plaques erhalten. Dann wurden Phagen aus diesen drei Plaques isoliert und DNAs aus den Phagen gereinigt. Diese DNAs wurden mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge des eingesetzten cDNA-Segments zu sehen. Auf diese Weise konnte das längste cDNA-Segment (ungefähr 1,3 kbp) unter den drei oben genannten positiven Plaques erhalten werden. Dann wurde dieses cDNA-Segment gereinigt und in die EcoRI-Stelle eines Vektors pUC119 subgeklont. Das so erhaltene Plasmid wird pAX101 bezeichnet. Das so erhaltene cDNA-Segment von ungefähr 1,3 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 3 zeigt das Ergebnis. 3 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des cDNA-Segments von ungefähr 1,3 kbp zeigt.
  • Unter Verwendung des Plasmids pAX101 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die auf diese Weise erhaltene Transformante wird Escherichia coli JM109/pAX101 genannt.
  • Das Plasmid pAX101 wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und SphI gespalten. Unter Verwendung des so erhaltenen DNA-Segments wurde die DNA-Sequenz von ungefähr 1,3 kbp nach dem selben Verfahren wie oben im Beispiel 3 eingesetzt bestimmt. Ein Teil dieser Sequenz ist in SEQ ID Nr. 7 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • (4-3) Klonen von Endo-XG-Transferasegen der Tomate und Bestimmung der DNA-Sequenz
  • Tomatensamen (Lycopersicon esculentum) (erhältlich von Watanabe Saishujo) wurden gekeimt und 10 μg poly(A)+RNA extrahiert aus dem Epikotylgewebe dieser Samen nach dem selben Verfahren wie es oben im Beispiel 2-(1) beschrieben ist. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung eines λEXloxTM Introductory Cloning Kit (hergestellt von Novagen). Insbesondere wurde eine cDNA gemäß einem Verfahren synthetisiert, das in Gene, 25, 263 (1983) beschrieben ist und in einen Vektor λEXLX ligiert [Palazzolo et al.: Gene 88, 25-36 (1990)] unter Verwendung eines EcoRI-Linkers und eines HindII-Linkers, die in diesem Kit enthalten sind, was auf diese Weise die angezielte cDNA-Bibliothek ergibt.
  • Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Dann wurde die oben hergestellte cDNA-Bibliothek einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis wurden ungefähr zwei positive Plaques pro 1 × 105 Plaques erhalten. Diese beiden Plaques wurden dann nach dem oben genannten Verfahren von Palazzolo et al. behandelt und auf diese Weise ein Segment, das eine cDNA enthält als Plasmid aus einer λ-Phagen-DNA erhalten. Diese DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge der cDNAs zu bestimmen. Auf diese Weise konnte die Länge das längeren cDNA-Segments (ungefähr 1,2 kbp) unter den zwei positiven Plaques identifiziert werden. Dann wurde dieses cDNA-Segment gereinigt und die hervorstehende Endstelle unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase gekappt (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Dann wurde sie in die HincII-Stelle eines Vektors pUC118 subkloniert. Das so erhaltene Plasmid wird pTX201 bezeichnet. Das so erhaltene cDNA-Segment von ungefähr 1,2 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 4 zeigt das Ergebnis. 4 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des cDNA-Segments von ungefähr 1,2 kbp zeigt.
  • Das Plasmid pTX201 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SacI gespalten. Unter Verwendung des so erhaltenen cDNA-Segments wurde die DNA-Sequenz von ungefähr 1,2 kbp nach dem selben Verfahren wie oben im Beispiel 3 eingesetzt bestimmt. Ein Teil dieser Sequenz ist in SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • (4-4) Klonen von Endo-XG-Transferasegen von Weizen und Bestimmung der DNA-Sequenz
  • Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Eine aus Weizengewebe (Triticum aestrivum) mRNA (hergestellt von Clonetech) hergestellte cDNA-Bibliothek wurde einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis wurde eine positive Plaque pro 1 × 105 Plaques erhalten. Dann wurde ein Phage aus der Plaque isoliert und DNA aus dem Phagen gereinigt. Diese DNA wurde mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge des eingesetzten cDNA-Segments zu sehen. Auf diese Weise konnte ein cDNA-Segment von ungefähr 0,9 kbp identifiziert werden. Dieses cDNA-Segment wurde gereinigt und in die EcoRI-Stelle eines Vektors pUC119 subgeklont. Das so erhaltene Plasmid wird pWX101 bezeichnet. Das so erhaltene DNA-Segment von ungefähr 0,9 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 5 zeigt das Ergebnis. 5 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des DNA-Segments von ungefähr 0,9 kbp zeigt.
  • Unter Verwendung des Plasmids pWX101 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die auf diese Weise erhaltene Transformante wird Escherichia coli JM109/pWX101 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4225 hinterlegt.
  • Das Plasmid pWX101 wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und Sse8387I gespalten. Unter Verwendung des so erhaltenen cDNA-Segments wurde die DNA-Sequenz von ungefähr 0,9 kbp nach dem selben Verfahren wie oben im Beispiel 3 eingesetzt bestimmt. Ein Teil dieser Sequenz ist in SEQ ID Nr. 19 im Sequenzprotokoll dargestellt.
  • (4-5) Klonen des Endo-XG-Transferasegens von Mais und Bestimmung der Sequenz
  • Maissamen (Zea mays) (erhältlich von Snow Brand Seed Co., Ltd. Japan) wurden gekeimt und 10 μg poly(A)+RNA extrahiert aus dem Epikotylgewebe dieser Samen nach dem selben Verfahren wie es oben im Beispiel 2-(1) beschrieben ist. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung eines λEXloxTM Introductory Cloning Kit. Insbesondere wurde eine cDNA gemäß einem Verfahren synthetisiert, das in Gene, 25, 263 (1983) beschrieben ist und in einen Vektor λEXLX unter Verwendung eines EcoRI-Linkers und eines HindII-Linkers ligiert, die in diesem Kit enthalten sind, was auf diese Weise die angezielte cDNA-Bibliothek ergibt.
  • Die cDNA von ungefähr 1,2 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Dann wurde die oben hergestellte cDNA-Bibliothek einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis wurde eine positive Plaque pro 1 × 104 Plaques erhalten. Diese positive Plaque wurden dann nach dem oben genannten Verfahren von Palazzolo et al. behandelt und auf diese Weise ein Segment, das eine cDNA enthält, als Plasmid aus einer λ-Phagen-DNA erhalten. Diese DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge des DNA-Segments zu sehen. Auf diese Weise konnte die Länge das cDNA-Segments (ungefähr 1,2 kbp) bestimmt werden. Das so erhaltene Plasmid wird pCX101 bezeichnet. Das so erhaltene DNA-Segment von ungefähr 1,2 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 15 zeigt das Ergebnis. 15 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des DNA-Segments von ungefähr 1,2 kbp zeigt.
  • (4-6) Klonen des Endo-XG-Transferasegens von Reis und Bestimmung der Sequenz
  • Reissamen (Oryza sativa) (geliefert von Dr. Kazuhiko Nishitani, Kagoshima Univ., Japan) wurden gekeimt und 10 μg poly(A)+RNA extrahiert aus dem Epikotylgewebe dieser Samen nach dem selben Verfahren wie es oben im Beispiel 2-(1) beschrieben ist. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung eines λEXloxTM Introductory Cloning Kit. Insbesondere wurde eine cDNA gemäß einem Verfahren synthetisiert, das in Gene, 25, 263 (1983) beschrieben ist und in einen Vektor λEXLX unter Verwendung eines EcoRI-Linkers und eines HindII-Linkers ligiert, die in diesem Kit enthalten sind, was auf diese Weise die angezielte cDNA-Bibliothek ergibt.
  • Die cDNA von ungefähr 1,1 kbp erhalten im obigen Beispiel 2 wurde markiert mit [α-32P]dCTP unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Dann wurde die oben hergestellte cDNA-Bibliothek einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Ergebnis wurde eine positive Plaque pro 1 × 104 Plaques erhalten. Die Plaque wurde dann nach dem oben genannten Verfahren von Palazzolo et al. behandelt und auf diese Weise ein Segment, das eine cDNA enthält, als Plasmid aus einer λ-Phagen-DNA erhalten. Diese DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten und auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Länge des DNA-Segments zu sehen. Auf diese Weise konnte die Länge das cDNA-Segments (ungefähr 1,1 kbp) bestimmt werden. Das so erhaltene Plasmid wird pRX102 bezeichnet. Das so erhaltene DNA-Segment von ungefähr 1,1 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 16 zeigt das Ergebnis. 16 ist eine Figur, die eine Restriktionsenzymkarte des DNA-Segments von ungefähr 1,1 kbp zeigt.
  • Unter Verwendung des Plasmids pRX102 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die auf diese Weise erhaltene Trans formante wird Escherichia coli JM109/pRX102 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4221 hinterlegt.
  • Beispiel 5: Expression des Endo-XG-Transferasegens
  • 5-1 (Konstruktion des Expressionsplasmids pVX110)
  • Ausgehend vom Plasmid pVX103 erhalten im obigen Beispiel 2, wird C der Base Nr. 58 in SEQ ID Nr. 15 des Sequenzprotokolls in T konvertiert nach dem Kunkel-Verfahren unter Verwendung von Mutan-KTM. Das so konstruierte Plasmid, das eine Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms HincII in der Base Nr. 57 bis 62 aufweist, wurde pVX106 bezeichnet. Dieses pVX106 wurde mit HincII an der Erkennungsstelle von HincII hergestellt nach dem obigen Verfahren gespalten und an der Erkennungsstelle von HincII in der Multiklonierungsstelle, um dadurch ein Segment von 1,1 kbp zu entfernen. An dieses Segment wurde ein decamerer NcoI-Linker angefügt unter Verwendung eines Ligations-Kits, gefolgt von Verdauung durch NcoI. Dann wurde ein cDNA-Segment von ungefähr 1,1 kbp durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und dieses Segment wurde in die NcoI-Stelle eines Plasmids pTV119N eingesetzt. Da das so eingesetzte Segment Spaltungsstelle PvuII an asymmetrischen Positionen enthält, wurde die Richtung des eingesetzten Segments ausgehend von der Größe der von PvuII verdauten Produkte bestimmt. Daher wurde das Plasmid mit dem oben genannten Segment darin eingesetzt durch Transkription durch lac-Promotor in einer solchen Richtung, dass mRNA des Gens gebildet wird, die für Endo-XG-Transferase kodiert, pVX110 genannt. 14 zeigt einen Prozess zum Kontruieren des Plasmids pVX110. Ein Escherichia coli JM109 Stamm wurde mit pVX110 transformiert und die so erhaltene Transformante wurde Escherichia coli JM109/pVX110 genannt.
  • 5-2 (Expression von Endo-XG-Transferase in Escherichia coli)
  • Die oben in 5-1 erhaltene Escherichia coli JM109/pVX110 wurde in 50 ml einer L-Brühe mit 100 μg/ml Ampicillin suspendiert und darin unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Wenn die Trübe (O.D. 660) nach der Inkubation 0,3 erreichte, wurde IPTG zur Kultur zugesetzt, so dass sich eine Endkonzentration von 2 mM ergibt. Nach Zusatz von IPTG wurde die Inkubation unter Schütteln bei 37°C 8 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wurden 1 ml Zellsuspension mit einem O.D. 660 Wert von 0,1 aufgenommen und einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen (SDS-PAGE). Ein Escherichia coli JM109 Stamm, der unter Verwendung eines Expressionsvektors pTV119 allein transformiert wurde, wurde unter den selben Bedingungen inkubiert, wie sie oben eingesetzt wurden und dann als Kontrolle gleichermaßen einer SDS-PAGE unterzogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliantblau (CBB, hergestellt von Nacalai Tesque, Inc.) angefärbt und dann mit 7% Essigsäure und 25% Methanollösung entfärbt. Als Ergebnis zeigt Escherichia coli JM109/pVX110 die Zielbande eines Molekulargewichts von ungefähr 31 kDa und die Expression der Endo-XG-Transferase ist damit bestätigt.
  • 5-3 (Reinigung von Endo-XG-Transferase)
  • Escherichia coli JM109/pVX110 wurde in 200 ml L-Brühe mit 100 μg/ml Ampicillin suspendiert und dann nach dem selben Verfahren inkubiert wie es oben in 5-2 beschrieben ist. Nach Beendigung der Inkubation wurden Zellen durch Zentrifugieren der Kulturbrühe aufgenommen und in 10 ml einer Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) suspendiert. Nach Mahlen der Zellen durch Ultraschallbehandlung wurde die Suspension zentrifugiert, um sie dadurch in eine Überstandsfraktion und eine Niederschlagsfraktion zu teilen. Die Niederschlagsfraktion wurde in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert. Portionen von 2,5 μl des Überstands und des Niederschlags wurden SDS-PAGE unterzogen nach dem selben Verfahren wie es oben in 5-2 beschrieben ist. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das Zielprotein in der Niederschlagsfraktion enthalten ist. Die Suspension wurde dann erneut zentrifugiert und 10 mg der so erhaltenen Niederschlagsfraktion wurde in einer Pufferlösung (pH 7,5) aufgelöst, die 7 M Harnstoff enthält, 50 mM Dithiothreitol (DTT) und 20 mM Tris-HCl und über Nacht gegen 2 1 einer Außenlösung dialysiert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthält. Die Innenlösung der Dialyse wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran aufkonzentriert (hergestellt von Amicon) und doppelt so viel 100% gesättigte wässrige Lösung von Ammoniumsulfat hinzugefügt, so dass sich eine Endkonzentration von 66% ergibt. Nach Zentrifugieren bei 15000 Upm über 10 Minuten wurde das so ausgefällte Protein aufgenommen. Dieses Protein wurde in 750 μl einer wässrigen Lösung von 20 mM Tris-HCl und 150 ml NaCl gelöst. Eine Portion von 150 μl der erhaltenen Lösung wurde in HPLC aufgegeben, die mit einem TSK Gel 2000SW (7,6 × 300 mm) ausgerüstet ist, das mit einer wässrigen Lösung von 20 mM Tris-HCl und 150 ml NaCl ins Gleichgewicht gebracht ist. Dann wurde das Eluat fraktioniert mit einer Strömungsrate von 0,5 ml/min in Intervallen von 2 Minuten und die Absorption jeder Fraktion bei 280 nm wurde gemessen, um dadurch die Position der Elution des Proteins zu bestimmen. Nach Beendigung der Gelfiltration wurde die Endo-XG-Transferaseaktivität jeder Fraktion unter Verwendung von XG mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und einem Pyridylamino-XG-Heptamer als Substrat bestimmt. Als Ergebnis wurde eine Endo-XG-Transferaseaktivität aus einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von ungefähr 31 kDa erfasst.
  • Beispiel 6: Herstellung einer Transformante von Arabidopsis thaliana
  • 6-1 Konstruktion von Plasmiden pAX301 und pAX302
  • Ausgehend von der Sequenz eines Gens, das für Endo-XG-Transferase von Arabidopsis thaliana kodiert, dargestellt durch SEQ ID Nr. 17 im Sequenzprotokoll wurden vier Primer ATX-AS, ATS-AS, ATX-S und ATS-S, jeweils dargestellt durch SEQ ID Nr. 20, 21, 22 und 23 im Sequenzprotokoll, konstruiert und synthetisiert. Die Primer ATS-AS und ATX-S sind solche, worin eine Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms SacI und XbaI jeweils an der 5'-Stelle der Sequenz hinzugefügt ist, die den Basen Nr. 40 und 56 in SEQ ID Nr. 17 im Sequenzprotokoll in Richtung 5' → 3' entspricht, während die Primer ATX-AS und ATS-S solche sind, worin eine Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms XbaI und SacI jeweils an der 5'-Stelle der Sequenz hinzugefügt ist, die der Base Nr. 1007 bis 1023 in Richtung 3' → 5' entsprechen.
  • Ungefähr 1 ng (1 μl) der oben im Beispiel 4-(2) erhaltenen cDNA werden als Templat in ein 0,5 ml Röhrchen gegeben. Zu dieser Probe werden 10 μl 10 × PCR-Pufferlösung zugesetzt, die in einem Gene AmpTM Kit enthalten sind, 16 μl 1,25 mM dNTP-Mischung, 2,5 U Ampli TagTM DNA-Polymerase, 20 pmol der Primer ATX-AS und ATS-AS und sterilisiertes destilliertes Wasser in einer solchen Menge, dass das Gesamtvolumen auf 100 μl eingestellt wird. Nach weiterer Zugabe von Mineralöl wurde die Mischung einer PCR unterzogen. Die Reaktion wurde durchgeführt durch 35 mal Wiederholen eines Zyklus (94°C 1 Minute lang, 55°C 1 Minute lang und 72°C 2 Minuten lang) und dann 7 Minuten bei 72°C halten. Danach wurde PCR auf die selbe Weise unter Verwendung der Primer ATX-S und ATS-S ausgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass cDNA von ungefähr 1,1 kbp spezifisch amplifiziert wurden. Jede dieser cDNAs wurde mit XbaI und SacI gespalten, gereinigt und dann in eine Stelle zwischen der Restriktionsenzymstelle XbaI und SacI eines binären Vektors pBI-H1-35S-IG subgeklont.
  • Ein Plasmid mit einem darin eingesetzten DNA-Segment, das unter Verwendung eines Paars Primer ATS-AS und ATX-AS amplifiziert wurde, wird pAX301 genannt, während ein anderes Plasmid mit einem darin eingesetzten DNA-Segment, das unter Verwendung eines Paars Primer ATX-S und ATS-S amplifiziert wurde, pAX302 genannt wird.
  • Unter Verwendung dieses Plasmids pAX301 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die so erhaltene Transformante wurde Escherichia coli JM109/pAX301 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4222 hinterlegt.
  • 6-2 Einführung von pAX301 und pAX302 in Agrobacterium
  • Unter Verwendung von 20 ng Portionen der oben in 6-1 erhaltenen Plasmide pAX301 und pAX302 wurde ein Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Stamm nach einem Elektroporationsverfahren transformiert [Shokobutsu Saibo Kogaku (Plant Cell Engineering), Band 4, 193-203, Shujunsha (1992)].
  • Als Ergebnis wurden Transformanten mit einer Effizienz von 1 × 107 pro Mikrogramm der Plasmid-DNA erhalten. Diese Transformanten wurden in einem LB-Km-Hg-Medium gereinigt (10 g Bactotripton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 50 mg Kanamycin, 4600 U Hygromycin jeweils pro Liter, pH 7,5). Die mit pAX301 und pAX302 transformierten Stämme wurde jeweils LBA4404/pAX301 und LBA4404/pAX302 genannt. In einem Kontrolltest wurde ein Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Stamm unter Verwendung eines binären Vektors pBI-H1-35S-IG allein glei chermaßen transformiert. Die so erhaltene Transformante wurde LBA4404/pBI-H1-35S-IG genannt.
  • 6-3 Herstellung einer Pflanzentransformante
  • 6-3-(1) Kultivierung von sterilen Arabidopsis thaliana
  • Einige Dutzend Samenkörner des Arabidopsis thaliana Wassilewsija Stamms (nachfolgend einfach als WS bezeichnet) [erhalten vom Arabidopsis Information Service, J.W. Goethe Univ., A.R. Kranz, Frankfurt, Deutschland] wurden in ein 1,5 ml Röhrchen gegeben und in 1 ml 70% Ethanol 2 Minuten lang eingetaucht. Anschließend wurden diese Samen 5 Minuten lang in eine sterilisierende Lösung getaucht (5 Natriumhypochlorit, 0,02% Triton X-100). Nach 5 mal Waschen mit sterilisiertem Wasser wurden sie auf eine GM-Platte gesetzt [4,6 g Murashige-skoog anorganische Salze (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g Sucrose, 1 ml 1000 × Vitaminstammlösung (hergestellt von Sigma), 10 ml 5% MES-KOH (pH 5,7) und 5 g Gellangum (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), jeweils pro Liter]. Diese Platte wurde kalt behandelt, in dem man sie bei 4°C 2 Tage stehen lässt und dann in einem Pflanzeninkubator inkubiert (Modell CFH-300, hergestellt von Tomy Seiko Co., Ltd.) über 20 Tage bei 22°C mit einer Lichtintensität von 6000 lux unter Bedingungen eines langen Tages (Beleuchtungsperiode: 16 Stunden, Dunkelperiode: 8 Stunden).
  • 6-3-(2) Infektion mit Agrobacterium
  • Die Wurzeln von einigen Teilen der WS-Pflanzen, die 20 Tage wie oben in 6-3(1) inkubiert wurden, wurden mit einem Skalpell in gleiche Längen von ungefähr 1,5 cm geschnitten und auf eine CIM-Platte aufgebracht. Dann wurden die Wurzelexplantate bei einer Lichtintensität von 3000 lux 3 Tage lang inkubiert (Beleuchtungsperiode: 16 Stunden, Dunkelperiode: 8 Stunden), um dadurch Callus der Wurzelexplantate zu erhalten.
  • Separat wurden die Stämme LBA4404/pAX301, LBA4404/pAX302 und LBA4404/pBI-H1-35S-IG wie oben in 6-2 erhalten in einem flüssigen LB-Km-Hg-Medium bei 28°C 2 Tage lang inkubiert und 3-fach mit einer MS-Verdünnungslösung (6,4 g/l Murashige-skoog anorganische Salze, pH 6,2) verdünnt. Portionen von einem Milliliter der so erhaltenen Lösung wurden in Röhrchen pipettiert und dann Wurzelexplantate mit Callus darin 10 Minuten lang eingetaucht. Dann wurden diese Explantate auf ein doppeltes Filterpapier platziert, um dadurch überschüssige Feuchtigkeit zu eliminieren und auf eine frische CIM-Platte platziert, um eine gemeinsame Inkubation unter den selben Bedingungen über 2 Tage durchzuführen.
  • 6-6-(3) Sterilisation
  • Explantate, bei denen jeder Stamm in einem solchen Maß gewachsen ist, dass er beobachtbar ist, werden in eine Sterilisierungslösung gebracht [hergestellt durch Zusatz von Claforan (hergestellt von Hoechst) zu einer verdünnten MS-Lösung in einer solchen Menge, dass sich eine Endkonzentration von 200 μg/ml ergibt] und durch langsames Schütteln über 30 Minuten gewaschen. Nach 5 mal Wiederholen dieses Vorgangs wird die Feuchtigkeit auf einem sterilen Filterpapier eliminiert und die Explantate auf eine SIMC-Platte platziert, um 2 Tage Inkubation bei einer Lichtintensität von 6000 lux durchzuführen (Beleuchtungsperiode: 16 Stunden, Dunkelperiode: 8 Stunden).
  • 6-3-(4) Selektion transformierter Pflanzen
  • Die wie oben in 6-3-(3) inkubierten Explantate werden in eine SIMCS-Platte überführt (hergestellt durch Zusatz von Hygromycin B zu einer SIMC-Platte in einer solchen Menge, dass sich eine Endkonzentration von 4,6 U/ml ergibt) und unter den selben Bedingungen inkubiert, wie sie oben in 6-3-(3) eingesetzt wurden. Dann wurden sie in Intervallen von 1 Woche in eine frische SIMCS-Platte überführt. Transformierte Explantate wuchsen kontinuierlich und bildeten Callusse, während untransformierte braun wurden. Nach 2 Wochen wurden die Callusse der Transformanten grün und es bildeten sich Blätter nach ungefähr 1 Monat. Anschließend wurde diese Blätter rosettenförmig.
  • 6-3-(5) Regeneration transformierter Pflanzen
  • Die Basis einer Pflanze mit Rosettenblättern wurde mit einem Skalpell in der Weise geschnitten, dass kein Callus darin enthalten ist und in eine RIM-Platte überführt. Nach 8 bis 10 Tagen wurden Explantate einiger Wurzeln von ungefähr 2 cm in einen Rock Fiber Minipot überführt, der mit einer Zange in ein anorganisches Salzmedium eingetaucht wird [5 mM KNO3, 2,5 mM Kaliumphosphatpufferlösung (pH 5,5), 2 mM MgSO4, 2 mM Ca(NO3)2, 50 μM Fe-EDTA, 1000 × Mikronährstoffe (70 mM H3BO4, 14 mM MnCl2, 0,5 mM CuSO4, 1 mM ZnSO4, 0,2 mM NaMoO4, 10 mM NaCl, 0,01 mM CoCl2) 1 ml/l] und darin inkubiert. Nach Blühen und Frucht ansetzen wurden die Pflanzen in eine Erde überführt, die durch Mischen von Perlit und Vermiculit (hergestellt von TES) in einem Verhältnis von 1:1 und Eintauchen in ein anorganisches Salzmedium hergestellt ist. Nach ungefähr 1 Monat wurden ungefähr 1000 Samen pro Pflanze erhalten. Diese werden nachfolgend als T2-Samen bezeichnet.
  • 6-3-(6) Erhalt einer antibiotikaresistenten Pflanze
  • Ungefähr 100 Körner der T2-Samen werden nach dem selben Verfahren sterilisiert wie es oben in 3-(1) eingesetzt wurde und auf einer MSH-Platte ausgesät. Auf diese Weise keimten gegen Hygromycin B resistente Pflanzen in einem Verhältnis von ungefähr 3 : 1.
  • 6-4 DNA-Extraktion und Southern-Hybridisierung
  • Die oben in 6-3-(6) gekeimten T2-Samen wurden in einen Rock Fiber Minipot überführt, der mit einer Zange in ein anorganisches Salzmedium eingetaucht wird, und mit einer Lichtintensität von 6000 lux (Beleuchtungsperiode: 16 Stunden, Dunkelperiode: 8 Stunden) bei einer Temperatur von 22°C inkubiert. Nach zwei Wochen wurde der oberirdische Teil mit einem Skalpell abgeschnitten und dann unmittelbar mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Dann wurde es in einem Mörser unter Zusatz von flüssigem Stickstoff gemahlen, so dass ein Pulver entsteht. Unmittelbar nach der Verdampfung des flüssigen Stickstoff wurden 3 ml/g einer DNA-Extraktionspufferlösung [200 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM EDTA-2Na, 1% Natrium-Lauroylsarcosinat, 100 μg/ml Proteine K (hergestellt von Boehringer)] dem Pulver zugesetzt, das in ein Röhrchen überführt wurde, das auf 60°C vorgewärmt wurde, und gerührt. Nach Verweilen bei 60°C über eine Stunde wurde die Mischung zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt. Dann wurde er mit einer Mischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (25:24:1) dreimal extrahiert und aus Ethanol ausgefällt. Das Fällungsprodukt wurde in einer TE-Pufferlösung aufgelöst [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA]. Auf diese Weise wurden 12 μg einer Genom-DNA aus ungefähr 1,7 g jeder Pflanze erhalten. Portionen von 1 μg der DNA wurde jeweils mit Restriktionsenzymen HindII und PstI gespalten, auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und dann einer Southern-Hybridisierung unterzogen.
  • Separat wurden Samen einer nicht transformierten WS-Pflanze gekeimt und eine DNA gleichermaßen aus den erhaltenen Pflanzen extrahiert. Nach Verdauen mit Restriktonsenzymen HindII und PstI wurde die DNA auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und dann einer Southern-Hybridisierung unterzogen. Eine Sonde zur Hybridisierung wurde konstruiert durch Markieren eines DNA-Segments von ungefähr 1 kbp amplifiziert und gereinigt wie oben im Beispiel 6-1, mit (α-32P)dCTP unter Verwendung des Random Primer DNA Labeling Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) nach dem Verfahren, das nachfolgend beschrieben wird.
  • Es werden 25 ng des oben genannten DNA-Segments und 2 μl eines Primers in ein Röhrchen gegeben und das Gesamtvolumen auf 5 μl eingestellt durch Zugabe von destilliertem Wasser. Nach Erwärmen auf 95°C über 3 Minuten wird die Mischung in Eiswasser abgeschreckt. Dann werden Portionen von 2,5 μl einer 10-fach konzentrierten Pufferlösung und einer dNTP-Mischung und 5 μl markiertes dCTP hinzugegeben und das Gesamtvolumen auf 24 μl eingestellt durch Zugabe von destilliertem Wasser. Nach Zugabe von 1 μl Klenow-Fragment wird die Mischung bei 37°C 3 Stunden lang inkubiert. Nach Inaktivieren des Enzyms wird die Mischung über 3 Minuten auf 95°C erwärmt und dann in Eiswasser abgeschreckt, um dadurch die Mischung thermisch zu denaturieren. Dann wird die gesamte Mischung zur Hybridisierung verwendet.
  • Die Southern-Hybridisierung wird gemäß dem Verfahren ausgeführt, das beschrieben ist in „Molecular Cloning a Laboratory Manual" herausgegeben von Maniatis et al., Kap. 9, Seiten 31-58, Cold Spring Harbor. Insbesondere wird jede DNA-Probe einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel unterzogen, mit einem Alkali denaturiert und über Nacht in Southern-Blotting auf eine Polyamidmembran aufgegeben (Hybond-N, hergestellt von Amersham). Dann wurde die DNA durch 5 Minuten Bestrahlen mit einem UV-Transilluminator (254 nm) fixiert. Die erhaltene Membran wurde dann einer Vorhybridisierung in 5 ml einer Vorhybridisierungspufferlösung unterzogen (5 × Denhardt-Lösung, 6 × SSC, 0,1% SDS, 10 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 50°C über 2 Stunden. Dann wurde eine Sonde hinzugefügt und Hybridisierung bei 50°C über Nacht durchgeführt. Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die Membran mit einer Waschlösung gewaschen, die 2 × SSC und 0,1 SDS enthält, bei Raumtemperatur zweimal 10 Minuten lang und dann mit der selben Waschlösung zweimal bei 50°C 30 Minuten lang. Die Membran wurde dann getrocknet und mit Licht in einer Kassette bestrahlt, die eine Röntgenfilm enthält (hergestellt von Kodak) bei -80°C über Nacht, um dadurch ein Autoradiogramm aufzunehmen.
  • Durch die Southern-Hybridisierung erfasste Signalmuster eines untransformierten WS-Stamms (1), einer Transformante (2) mit pAX301 darin eingeführt, einer Transformante (3) mit pAX302 darin eingeführt und einer Transformante (4) mit einem Vektor pBI-H1-35S-IG allein darin eingeführt werden miteinander verglichen. Als Ergebnis werden spezifische Signale an Positionen von ungefähr 1 kbp (im Falle von Proben gespalten mit HindIII) und ungefähr 3 kbp (im Falle von Proben gespalten mit PstI) in beiden Transformanten (2) und (3) beobachtet zusätzlich zu den endogenen Signalen, die (1) bis (4) gemeinsam sind. Es wurde auf diese Weise bestätigt, dass eine DNA, die für Endo-XG-Transferase kodiert, sowohl in (2) wie in (3) integriert ist. Im Falle von Proben, die mit HindIII gespalten sind, wurden ferner spezifische Signale von ungefähr 10 kbp und ungefähr 20 kbp entsprechend in (2) und (3) beobachtet. In der Transformante (4) wurde ein Signalmuster ähnlich dem von (1) erhalten.
  • 6-5 RNA-Extraktion und Hybridisierung
  • Nach dem selben Verfahren wie oben in 6-4 beschrieben wurden die oberirdischen Teile von 30 gegen Hygromycin B resistenten Stämmen geschnitten und so 1,8 g eines Pflanzengewebes erhalten. Dann wurden ungefähr 500 μg einer RNA nach dem selben Verfahren herge stellt wie es oben in Beispiel 2-(1) eingesetzt wurde, mit der Ausnahme, das die Verfahrensweise unter Verwendung von Oligotex dT-30 weg gelassen wurde. Eine Sonde für Northern-Hybridisierung wurde nach dem Verfahren konstruiert, das nachfolgend beschrieben wird. Das 5'-Ende des oben genannten Primers ATX-S wurde mit 32P markiert, wobei ein MEGALABELTM Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wird, während das 5'-Ende eines Primers ATS-S mit Biotin markiert wird.
  • Unter Verwendung dieser beiden Primer wird PCR unter den selben Bedingungen durchgeführt, wie sie im obigen Beispiel 6-1 eingesetzt wurden, mit Verwendung der cDNA von ungefähr 1,3 kbp, die im obigen Beispiel 4-(2) erhalten wurde, als Templat. Dann wurden der Reaktionsmischung Avidinkügelchen (hergestellt von Dynal) zugesetzt und das PCR-Produkt aufgenommen. Nach thermischer Denaturierung des PCR-Produkts wurden die Avidinkügelchen aufgenommen. Als Ergebnis wurde die DNA, deren 5'-Ende mit 32P markiert ist, in die Lösung freigesetzt.
  • Die DNA-Sequenz wurde nach dem selben Verfahren bestätigt wie es oben im Beispiel 4 beschrieben wurde und auf diese Weise wurde eine Sonde mit einer Sense-DNA-Sequenz erhalten. Gleichermaßen wurde die obige Vorgehensweise wiederholt unter Verwendung eines Primers ATS-S, dessen 5'-Ende mit 32P markiert ist und eines anderen Primers ATX-S, dessen 5'-Ende mit Biotin markiert ist, und auf diese Weise wurde eine Sonde mit einer Antisense-DNA-Sequenz erhalten.
  • Die Northern-Hybridisierung wurde nach dem folgenden Verfahren ausgeführt, das in „Molecular Cloning", Kap. 7, Seiten 39-52 wie oben zitiert beschreiben ist. Die ganze oben extrahierte RNA wurde einer Elektrophorese auf Agarosegel (1%) mit Formaldehyd unterzogen, in einer Lösung von Ammoniumacetat neutralisiert und dann über Nacht in Northern-Blotting auf eine Polyamidmembran aufgegeben (Hybond-N) aufgegeben. Dann wurde die RNA durch 5 Minuten Bestrahlen mit einem UV-Transilluminator (254 nm) fixiert. Diese Membran wurde dann einer Vorhybridisierung in 20 ml einer Vorhybridisierungspufferlösung unterzogen (50% Formaldehyd, 0,65 M NaCl, 0,1 M Na-Pipes (pH 6,8), 5 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 42°C über 3 Stunden. Danach wurde die Membran über Nacht bei 42°C einer Hybridisierung in 20 ml Hybridisierungslösung unterzogen [50% Formaldehyd, 0,65 M NaCl, 0,1 M Na-Pipes (pH 6,8), 5 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 100 μg/ml Lachssperma-DNA], die die mit 32P markierte Sonden enthält, wie sie oben beschrieben wurden. Dann wurde die Membran mit einer Waschlösung, die 2 × SSC und 0,1% SDS enthält, viermal bei 50°C 10 Minuten lang gewaschen. Die Membran wurde dann getrocknet und mit Licht in einer Kassette, die eine Röntgenfilm enthält, bei -80°C über Nacht bestrahlt, um dadurch ein Autoradiogramm aufzunehmen.
  • Wenn eine Sonde mit einer Sense-DNA-Sequenz verwendet wird, wird kein Signal in den oben genannten (1), (3) und (4) beobachtet, aber die Transformante (2) zeigte eine Bande von ungefähr 1 kbp, die anzeigt, dass eine Antisense-RNA einer Endo-XG-Transferase gebildet wurde. Wenn hingegen eine Sonde mit einer Antisense-DNA-Sequenz verwendet wird, werden Banden von 1 kbp in allen (1) bis (4) beobachtet. Darunter zeigt die Bande von (3) ein intensives Signal im Vergleich zu (1). Hingegen zeigte (2) ein weniger intensives Signal. Auf diese Weise wurde gefunden, dass die Expression von Endo-XG-Transferase auf der Transkriptionsebene durch Einführen von pAX302 verstärkt wird, aber auf der Transkriptionsebene durch Einführen von pAX301 unterdrückt wird.
  • Beispiel 7: Bildung einer Tabaktransformante
  • 7-1 Konstruktion von Plasmiden pTX301 und pTX302
  • Ausgehend von der Sequenz eines Gens, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll, wurden vier Primer TOMXSP, TOMXAP, TOMSAP und TOMSSP jeweils dargestellt durch SEQ ID Nr. 24, 25, 26 und 27 im Sequenzprotokoll konstruiert und synthetisiert. Die Primer TOMXSP und TOMSSP sind solche, worin eine Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms XbaI und SacI an der 5'-Stelle eines Sequenz hinzugefügt wird, die den Basen Nr. 46 bis 66 in SEQ ID Nr. 18 im Sequenzprotokoll in Richtung 5' → 3' entsprechen, während die Primer TOMSAP und TOMXAP solche sind, worin eine Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms SacI und XbaI an der 5'-Stelle eines Sequenz hinzugefügt wird, die den Basen Nr. 921 bis 941 in Richtung 3' → 5' entsprechen.
  • Ungefähr 1 ng (1 μl) der im obigen Beispiel 4-(3) erhaltenen cDNA wurde in ein 0,5 ml Röhrchen als Templat gegeben. Zu dieser Probe werden 10 μl 10 × PCR-Pufferlösung zugesetzt, die in einem Gene AmpTM Kit enthalten sind, 16 μl 1,25 mM dNTP-Mischung, 2,5 U Ampli TaqTM DNA-Polymerase, Portionen von 1 μl von 0,1 μg/μl der Primer TOMXSP und TOMSAP und sterilisiertes destilliertes Wasser in einer solchen Menge, dass das Gesamtvolumen auf 100 μl eingestellt wird. Nach weiterer Zugabe von Mineralöl wurde die Mischung einer PCR unterzogen. Die Reaktion wurde durchgeführt durch 25 mal Wiederholen eines Zyklus (94°C 30 Sekunden lang, 37°C 2 Minuten lang und 72°C 1 Minute lang). Danach wurde PCR auf die selbe Weise unter Verwendung der Primer TOMSSP und TOMXAP ausgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung durch Ethanolausfällung aufkonzentriert, mit XbaI und SacI gespalten, gereinigt und dann in eine Stelle zwischen der Restriktionsenzymstelle XbaI und SalI eines binären Vektors pBI-H1-35S-IG subkloniert.
  • Ein Plasmid mit einem darin eingesetzten DNA-Segment, das unter Verwendung eines Paars Primer TOMXSP und TOMSAP amplifiziert wurde, wird pTX301 genannt, während ein anderes Plasmid mit einem darin eingesetzten DNA-Segment, das unter Verwendung eines Paars Primer TOMSSP und TOMXAP amplifiziert wurde, pTX302 genannt wird.
  • Unter Verwendung dieses Plasmids pTX301 wurde ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die so erhaltene Transformante wurde Escherichia coli JM109/pTX301 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4223 hinterlegt. Andererseits wurde unter Verwendung des Plasmids pTX302 ein Escherichia coli JM109 Stamm transformiert. Die so erhaltene Transformante wurde Escherichia coli JM109/pTX302 genannt und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology in Japan unter der Registriernummer FERM BP-4224 hinterlegt.
  • 7-2 Einführung von pTX301 und pTX302 in Agrobacterium
  • Unter Verwendung von 20 ng Portionen der Plasmide pTX301 und pTX302 wurde ein Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Stamm nach dem selben Verfahren transformiert wie es oben in Beispiel 6-2 eingesetzt wurde. Separat wurde ein Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Stamm unter Verwendung von pBI-H1-35S-IG allein als Kontrolle transformiert. Nach Reinigung wurden diese Transformanten entsprechend LBA4404/pTX301, LBA4404/pTX302 und LBA4404/pBI-H1-35S-IG genannt.
  • 7-3 Herstellung einer Pflanzentransformante
  • Die Einführung in Tabak wird nach dem Blattscheibenverfahren durchgeführt. Es werden Blätter von Tabak SR-1 Stamm, die steril gezüchtet wurden, genommen und mit einem sterilisierten Skalpell in Blattscheiben (ungefähr 1 cm2) mit Äderung geschnitten. Portionen von 200 μl der LBA4404/pTX301, LBA4404/pTX302 und LBA4404/pBI-H1-35S-IG Stämme, die im obigen Beispiel 7-2 erhalten wurden, wurden in einem LB-Medium über Nacht inkubiert, in eine sterilisierte Petri-Schale gegeben, die 5 ml eines Murashige-skoog (MS) Mediums enthält und die Blattscheiben wurden mit einer sterilisierten Zange darin überführt. Nach Vermischen durch Drehen der Petri-Schale wurde die Petri-Schale mit Paraffinpapier abgedichtet, um dadurch das Verdampfen von Feuchtigkeit zu verhindern und man lässt 3 Tage im Dunkeln bei 28°C stehen, um dadurch Co-Inkubation zu bewirken. Danach wurden die Blattscheiben in eine andere Petri-Schale überführt, die 20 ml des MS-Mediums enthält, und überschüssiges Agrobacterium wurde durch Drehen der Petri-Schale abgewaschen. Nach dreimaligem Wiederholen dieses Vorgangs und Eliminieren überschüssiger Feuchtigkeit mit einem Papiertuch, wurden die Blattscheiben auf ein festes MS-Medium platziert, das Kanamycin, Hygromycin und Carbenicillin und 0,2 μg/ml 1-Napthalenessigsäure und 1 μg/ml Benzyladenin als Pflanzenhormone enthält, in solcher Weise, dass die Blätter umgekehrt liegen. Dann werden die Scheiben in einem Pflanzeninkubator (Modell CFH-300, hergestellt von Tomy Seiko Co., Ltd.) in einem Zyklus mit Beleuchtungsperiode von 12 Stunden und Dunkelperiode von 12 Stunden bei 26°C inkubiert. Nach 4 Wochen wurden die Callusse so weit wie möglich mit einer Rasierklinge abgeschnitten. Dann wurden die so erscheinenden Knollen aus der Scheibe geschnitten und in ein MS-Medium platziert, das Kanamycin, Hygromycin und Carbenicillin enthält, und darin unter den selben Bedingungen inkubiert. Nach 2 Wochen wurden wurzelnde Pflanzen in eine Erde überführt, die Torfmull und Vermiculit (3:2) enthält, und in einem Pflanzeninkubator gezüchtet.
  • 7-4 DNA-Extraktion und Southern-Hybridisierung
  • Blattgewebe von oben in 7-3 gezüchteten Pflanzen wurden mit einem Skalpell geschnitten und daraus eine Genom-DNA nach dem selben Verfahren wie es oben bei 6-4 beschrieben wurde, hergestellt. 10 μg der Genom-DNA wurden mit einem Restriktionsenzym PstI vollständig verdaut, auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und dann einer Southern-Hybridisierung unterzogen wie oben in 6-4 angegeben. Eine Sonde für die Hybridisierung wurde durch Markieren eines DNA-Segments von ungefähr 930 bp hergestellt, die wie oben in Beispiel 7-1 amplifiziert und gereinigt wurde, mit 32P nach dem selben Verfahren wie es oben in 6-4 eingesetzt wurde.
  • Als Ergebnis zeigten Tabakpflanzen mit darin eingeführten pTX301 und pTX302 eine zusätzliche Bande zu denen, die erkennbar der Endo-XG-Transferase zuzuordnen sind, oder eine Bande mit einer hohen Signalintensität, die sich von anderen Banden im Vergleich zu der mit pBI-H1-35S-IG und der untransformierten deutlich unterscheidet. Diese Ergebnisse beweisen, dass ein Gen, das für Endo-XG-Transferase der Tomate kodiert, in die Tabakpflanze mit pTX 301 und pTX302 darin eingeführt, eingebracht wurde.
  • 7-5 RNA-Extraktion und Hybridisierung
  • Blattgewebe von oben in 7-3 gezüchteten Pflanzen wurden mit einem Skalpell geschnitten und daraus eine RNA nach dem selben Verfahren wie es oben bei 6-5 beschrieben wurde, hergestellt. Danach wurde eine Sonde für Northern-Hybridisierung nach dem selben Verfahren hergestellt wie es oben bei 6-5 beschrieben wurde. Eine Sonde mit einer Sense-DNA-Sequenz wurde unter Verwendung von TOMXSP konstruiert, dessen 5'-Ende mit 32P markiert ist, und TOMSAP, dessen 5'-Ende mit Biotin markiert ist, während eine andere Sonde mit einer Antisense-DNA-Sequenz unter Verwendung von TOMSAP konstruiert wurde, dessen 5'-Ende mit 32P markiert ist, und einem Primer TOMXSP, dessen 5'-Ende mit Biotin markiert ist. Dann wurde Northern-Hybridisierung nach dem selben Verfahren vorgenommen wie es oben in 6-5 beschrieben wurde.
  • Als Ergebnis zeigten, wenn eine Sonde mit der Sense-DNA-Sequenz verwendet wurde, die Tabaktransformanten mit pBI-HI-35S-IG und pTX301 darin eingeführt und die untransformierte keine Bande, während die mit pTX302 darin eingeführt eine entsprechende Bande zeigte. Wenn hingegen eine Sonde mit der Antisense-DNA-Sequenz verwendet wurde, zeigten die Tabakpflanze mit pBI-HI-35S-IG darin eingeführt und die untransformierte entsprechende Banden, während die eine mit pTX301 darin eingeführt eine Bande einer erhöhten Intensität zeigte. Die Tabakpflanze mit pTX302 darin eingeführt zeigte nur eine schwache Bande. Diese Ergebnisse beweisen, dass eine mRNA des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, durch Einführen von pTX301 verstärkt wird. Außerdem wurde bestätigt, dass die Antisense-RNA des Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, gebildet wurde, so dass die Expression des endogenen Endo-XG-Transferasegens durch Einführen von pTX302 unterdrückt wird.
  • Effekte der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine Endo-XG-Transferase, die für den Transfer von XG-Molekülen verantwortlich ist, die im Wachstumsmechanismus der Pflanzenzellwand von Bedeutung ist, und ein Gen, das für das Enzym kodiert, zur Verfügung gestellt. Ferner wird ein Verfahren zum Klonen eines Gens, das für Endo-XG- Transferase kodiert, ein Verfahren zum Herstellen von Endo-XG-Transferase unter Verwendung des Gens und eine Antisense-DNA und eine Antisense-RNA eines Gens, das für Endo-XG-Transferase kodiert, auch hierbei zur Verfügung gestellt. Außerdem wird ein Verfahren zum Beeinflussen der Expression von Endo-XG-Transferase, ein Verfahren zum Regulieren der Morphologie einer Pflanze und ein Verfahren zum Transferieren von XG-Molekülen zur Verfügung gestellt.
  • SEQUENZPROTOKOLL FÜR SEQ ID NO 1 bis 27
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Claims (19)

  1. Isoliertes Gen, das ein Polypeptid kodiert, das Endoxyloglucantransferaseaktivität besitzt, wobei das isolierte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Gen mit der in einer der SEQ ID Nr. 15 bis 19 dargestellten Sequenz; und (b) einem Gen, das mit einem Gen aus (a) unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: Lösung: 5 × Denhardts Lösung 6 × SSC, 0,1% SDS, 10 μg/ml Lachssperma-DNA, Hybridisierung: Inkubation bei 50°C über Nacht.
  2. Verfahren zur Klonierung eines Gens, das eine Endoxyloglucantransferase kodiert, umfassend das Verwenden eines beliebigen der Gene nach Anspruch 1 als Sonde.
  3. Antisense-DNA eines Gens, das eine Endoxyloglucantransferase kodiert, umfassend eine DNA mit einer Sequenz, die komplementär zur Sequenz des Gens nach Anspruch 1 ist, wobei die genannte DNA wenigstens 15 Basen lang ist.
  4. Antisense-DNA nach Anspruch 3, umfassend eine DNA mit der durch eine der SEQ ID Nr. 1 bis 5 in der Sequenzauflistung repräsentierten Sequenz.
  5. Antisense-DNA eines Gens, das eine Endoxyloglucantransferase kodiert, umfassend eine RNA mit einer Sequenz, die komplementär zur Sequenz des Gens nach Anspruch 1 ist, wobei die genannte RNA wenigstens 15 Basen lang ist.
  6. Antisense-RNA nach Anspruch 5, umfassend eine RNA mit der durch eine der SEQ ID Nr. 6 bis 10 in der Sequenzauflistung repräsentierten Sequenz.
  7. Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA, wobei eine DNA-Sequenz, die von einem Gen nach Anspruch 1 erhalten wird, mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zellen in einer solchen Weise funktionieren kann, dass die Antisense-RNA eines Gens, das eine Endoxyloglucantransferase kodiert, durch Transkription gebildet wird.
  8. Verfahren zur Steuerung der Expression einer Endoxyloglucantransferase, umfassend das Einführen der Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA nach Anspruch 7 in eine Pflanze.
  9. Verfahren zur Regulierung der Morphologie einer Pflanze, umfassend das Einführen der Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA nach Anspruch 7 in die Pflanze, um so die Expression einer Endoxyloglucantransferase zu steuern.
  10. Nichthumane Zellen, in die die Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA nach Anspruch 7 eingeführt ist.
  11. Pflanze, in die die Kassette zur Bildung einer Antisense-RNA nach Anspruch 7 eingeführt ist.
  12. Kassette zum Exprimieren einer Endoxyloglucantransferase, wobei ein Gen nach Anspruch 1 mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zellen in einer solchen Weise funktionieren kann, dass die Expression der Endoxyloglucantransferase möglich wird.
  13. Verfahren zur Steuerung der Expression einer Endoxyloglucantransferase, umfassend das Einführen der Kassette zum Exprimieren einer Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 12 in eine lebende Pflanze.
  14. Verfahren zur Regulierung der Morphologie einer Pflanze, umfassend das Einführen der Kassette zum Exprimieren einer Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 12 in die Pflanze.
  15. Nichthumane Zellen, in die die Kassette zum Exprimieren einer Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 12 eingeführt ist.
  16. Pflanze, in die die Kassette zum Exprimieren einer Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 12 eingeführt ist.
  17. Verfahren zur Herstellung einer Endoxyloglucantransferase, umfassend das Inkubieren einer Pflanze oder von Zellen, die mit einem Gen transformiert ist sind, das eine Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 1 kodiert, und Gewinnen der Endoxyloglucantransferase aus der Kultur.
  18. Isolierte und gereinigte Endoxyloglucantransferase, die durch ein Gen nach Anspruch 1 kodiert ist.
  19. Verfahren zum Übertragen von Xyloglucanmolekülen, umfassend das Trennen einer D-Glucosyl-Verbindung in einem Xyloglucanmolekül und Verbinden des resultierenden reduzierenden Endes des Xyloglucanmolekülsegments mit D-Glucose des nicht reduzierenden Endes eines anderen Xyloglucanmoleküls durch die Verwendung einer isolierten und gereinigten Endoxyloglucantransferase nach Anspruch 18.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9323225D0 (en) * 1993-11-10 1994-01-05 Unilever Plc Novel plant enzyme
KR100424844B1 (ko) * 1995-03-30 2004-07-05 다카라 홀딩즈 가부시키가이샤 식물프로모터 및 이 프로모터를사용한 유전자 발현방법
EP0868559B1 (de) * 1995-12-21 2003-05-14 Novozymes A/S Verwendung von xyloglucanendotransglycosylase
AUPO069996A0 (en) 1996-06-27 1996-07-18 Australian National University, The Manipulation of plant cellulose
AU6205198A (en) * 1997-02-26 1998-09-18 Novo Nordisk A/S Microbial xyloglucan endotransglycosylase (xet)
AU736192B2 (en) * 1997-07-27 2001-07-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Transgenic plants of altered morphology and the isolated arabidopsis thaliana endo-1,4-beta-glucanase gene, promoter and protein
GB9720038D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Nickerson Biocem Ltd Control
EP1082017B1 (de) * 1998-05-29 2005-03-09 Novozymes A/S Verfahren zur verwendung von xyloglukan endotransglukosylase zur herstellung von backwaren, teigwaren oder dampfbrot, und teige und backmittel enthaltend xyloglukan endotransglykosylase
WO2015134729A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
WO2015134737A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
WO2015134773A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for functionalizing and linking materials
MX2016011413A (es) 2014-03-05 2017-02-28 Novozymes As Formulaciones que comprenden xiloglucano polimérico como portador para agentes agronómicamente beneficiosos.
US10123535B2 (en) 2014-03-05 2018-11-13 Novozymes A/S Compositions and methods for improving post-harvest properties of agricultural crops

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL81737A (en) * 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5034323A (en) * 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes

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