JPS62259591A - Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタンパク質をコードするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クローニングベクター及び前記ベクターにより形質転換された細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）序 本発明はＨＵＳＩ−１型インヒビターの生物学的活性を
有するタンパク質をコードする哺乳動物のゲノムからの
、殊にヒトのゲノムからのＤＮＡ配列に関し、また組換
え体ＤＮＡ技術を用いるそのようなりＮＡ配列を含むベ
クターのクローニングおよび発現に関する。本発明はさ
らに、前記ベクターで形質転換した宿主生物および前記
形質転換宿主生物を用いるＨＵＳ　Ｉ−１型インヒビタ
ーの生物学的活性を有するタンパク質を製造する方法に
関する。本発明は最後にＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの
生物学的活性を有するタンパク質、およびそのようなタ
ンパク質を含む製剤組成物に関する。

（２）発明の背景 生体細胞および生物中で、酵素の活性は最初に酵素のド
ウノボ合成および化学修飾により調節される。細胞また
は生物の改変環境態および同時に高活性の特異性酵素に
対する速い適応が必要であるときに、常にこの酵素が多
量にドウノボ合成されることを意味しない。しばしば既
に存在する酵素のプールが活性化される。例えば消化酵
素（プロテアーゼ）がそれらの貯蔵形態、いわゆるチモ
ーゲンから活性プロテアーゼに転移される。必要なとき
に血液凝固因子が同様に不活性貯蔵形態から生物学的活
性形態に転移される。貯蔵酵素の公知活性化機構は特異
性ペプチダーゼによる開裂、プロティンキナーゼによる
リン酸化、ベシクルからの遊離およびアロステリック配
位子によるタンパク質立体配座の変更である。過度の上
記活性化反応および活性化酵素の長時間効果はこれらの
酵素の制御された分解または特異的阻害により防がれる
。例えば活性化プロテア−ゼの生物学的活性はしばしば
特異的プロティナーゼインヒビターにより阻害される。

過去数年中に種々のプロティナーゼインヒビターの臨床
および病因の関連が認められた（１．２）。

リソソームプロティナーゼインヒビターが敗血症、リウ
マチ型の慢性疾患並びに上肺系の疾患の療法に適するこ
とが認められた。しかし現在、これらの疾患の治療に使
用できたと知られるプロテイナーゼインヒビターは存在
しない。差当り、プロティナーゼインヒビターアプロチ
ニンが療法に使用されるだけである。アプロチニンは高
フィブリン溶解により生ずる術後出血の処置およびシヨ
・ツクの早期処置に使用される。

上記疾患の療法にはＨＵＳＩ（ヒトー精漿インヒビター
）−Ｉ型インヒビターが適当であることができよう。そ
れらはタンパク質である。ＩＩＩＩｓＩＩ型インヒビタ
ーの群の例はプロティナーゼインヒビターＨＵＳＩ−Ｉ
　ＣＵＳＩ−１（子宮頚分泌インヒビター）およびＢＳ
Ｉ（気管支分泌インヒビター）である。

ＨＵＳ　Ｉ−１はヒト精漿からの酸耐性プロテイナーゼ
インヒビターであり、グラニュロザイト（ｇｒａｎｕｌ
ｏｚｙｔ　）のりソソーム顆粒からのプロテア−ゼ例え
ばエラスターゼを阻害する。ＨＴＪ　Ｓ　１−Ｉは単に
他の細胞内または細胞外プロテア−ゼに対し低い阻害活
性を示す。その分子量は約１１．０００である。ＨＵＳ
Ｉｉの部分アミノ酸配列はフリップ（Ｆｒ１ｔｚ　）（
４，８）により発表された。

ＨＵＳ［−１のほかに、ヒト精漿中にさらに酸耐性プロ
ティナーゼインヒビター、すなわちＨＵＳＩ−ＩＴが存
在する（３）。その分子量は約６．５００である。ＨＵ
Ｓ　Ｉ−ＴおよびＨＵＳＩ−１１は全く異なる阻害スペ
クトルを有する。ＨＵＳＩ−１の阻害活性はトリプシン
およびアクロシンに限定されるけれども、ＨＵＳＩ−Ｔ
の最も顕著な性質はグラニュロザイトのりソソーム顆粒
からのプロテアーゼ例えばエラスターゼの特異的不活性
化である。その異なる生物学的活性のためにＨＵＳＩ−
■は従って非Ｔ（ＵＳ　Ｔ　−１型インヒビターである
。

酸耐性インヒビターＣＵＳＩ−１は子宮頚分泌物から分
離された（４）。ＣＵＳ　Ｔ　−１の分子量はＨＵＳＩ
−■とはソ゛等しい。さらにＨＵＳＩ−■およびＣＵＳ
　Ｉ　−１は同様の阻害スペクトルを有する。オソテル
ロニー免疫拡散試験においてＨＵＳ　Ｔ　−１およびＣ
ＵＳＩ−１は抗ＨＵＳＩ−■抗体と免疫交差反応を示す
（５，６）。最後に、ＨＵＳＩ−ＴおよびＣＵＳ　Ｉ−
１のアミノ酸分析は単に断片的に知られた限りはソ等し
い（４７）。

気管支分泌インヒビター（ＢＳＴ）は気管支分泌物から
分離された（４１．４４．４５．４６）。

ＢＳｒの初めの２５個のアミノ酸配列は（４１）に不完
全に発表された。ＢＳＴは約１０，０００の分子量を有
する。免疫試験において、ＢＳＩはウサギ抗ＨＵＳＩＩ
抗体と交差反応を示す（４７）。

−ＢＳＴは酸耐性であり、プロティナーゼロイコザイト
（Ｉｅｕｋｏｚｙｔｅ　）エラスターゼ、カナプシンＧ
１トリプシンおよびキモトリプシンを阻害する。

ＨＵＳ　Ｔ−夏型インヒビターの生物学的活性は実質的
に知られているけれども、今までのところ、これらのイ
ンヒビターはそれらが実質的に純粋な形態で十分な量入
手できなかったので治療目的に使用できなかった。

（３）発明の概要 従って本発明の基礎となる問題はＨＵＳＩ−１型インヒ
ビターの生物学的活性を有するタンパク質をコーディン
グするＤＮＡ配列を提供すること、およびそのようなり
ＡＮ配列を用いるＨＵＳＩ−夏型インヒビターの生物学
的活性を有するタンパク質を生物工学的方法により製造
することである。

この問題は哺乳動物のゲノムから、殊にヒトのゲノムか
ら誘導されるＤＮＡ配列を提供することにより解決され
、それは、好ましくは緊縮条件下に第４図および（また
は）第５図記載のＤＮＡ配列にハイブリッド形成し、ま
たＨＵＳ　Ｉ　−夏型インヒビターの生物学的活性を有
するタンパク質をコードする。

本発明におけるｒＨＵｓ　Ｉ−夏型インヒビターの生物
学的活性を有するタンパク質」という語はインヒビター
ＨＵＳＩ−Ｉ　ＣＵＳＩ−ＩまたはＢＳＩの生物学的活
性、すなわち、例えば天然タンパク質の免疫特性および
（または）天然タンパク質の特異的阻害性を有する融合
タンパク質および非融合タンパク質に関する。ＨＵＳ　
Ｉ−夏型インヒビターの生物学的活性を有する本発明の
タンパク質の阻害活性は後に酵素キモトリプシンの抑制
の測定により決定される。［緊縮条件下のハイブリッド
形成」および「普通のハイブリッド形成条件」という語
に関しては（２８）第３８７〜３８９頁およびボンナー
（Ｂｏｎｎｅｒ　）はか（２８）が参照される。一般に
Ｔ、−１５〜Ｔｍ−３０、好ましくはＴ、−２０〜Ｔ、
−２７が使用される。

ＨＵＳ　ｒ−Ｌ　ＣＵＳ　Ｉ−１およびＢＳＴのアミノ
酸配列の単に一部を含む融合タンパク質および非融合タ
ンパク質は本発明においてＨＵＳＩ−夏型インヒビター
の生物学的活性を有するタンパク質と称される。タンパ
ク質のアミノ酸配列の部分領域はまた「ドメイン」と称
される。

本発明の好ましい態様において、ＤＮＡ配列はＣＵＳ　
Ｉ　−Ｔタンパク質の生物学的活性を有するタンパク質
をコードする。本発明のさらに好ましい態様において、
ＤＮＡ配列は第５図に示されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードする。

本発明の殊に好ましい態様はＰｓｔＩフラグメントの形
態でｐＲＨ３１およびｐＲＨ３４中に含まれる第４図お
よび第５図に示されるＤＮＡ配列である。プラスミドｐ
ＲＨ３１およびｐＲＨ３４はドイツチェ・サムルング・
フェア・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｊｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ（ｒｌｓＭ）　）にそれぞれ寄託番号ＤＳＭ３６３
４およびＤＳＭ３６３５で寄託された。プラスミドｐＲ
Ｉ＋３１およびｐＲＨ３４またはそれらから誘導された
フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドはＨＵＳ　
Ｉ　−１型インヒビターの生物学的活性を有するタンパ
ク質、例えばＨＵＳＩ−１およびＢＳＴをコードする他
のＤＮＡ配列の同定および分離に対するプローブとして
適する。この結論は、今までのところ利用できるインヒ
ビターＨＵＳ　Ｔ−１およびＢＳＩの一次構造データが
不完全であるけれども大きい類似を示すので専門家には
可能である。これからＤＮＡレベルにおける高い配列同
族関係が予想される。この高い配列同族関係に基いて単
に１つの遺伝子が３つのインヒビターのすべてをコード
すること、および個々のインヒビターが組織特異性発現
生成物であることを排除できない。

好ましくは緊縮条件下の、前記ＤＮＡ配列の１つへのＤ
ＮＡ配列ハイブリッド形成もまた本発明の目的に適する
。該ＤＮＡ配列は天然、半合成または合成由来であり、
それらは突然変異、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠
失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド領域の逆位に
よる前記１′ｌＮＡ配列の１つに関し、それらはＨＵＳ
Ｉ−１型インヒビターの生物学的活性を有するタンパク
質をコードする。

本発明の主題はさらに前記ＤＮＡ配列のクローニングお
よび発現のためのベクターである。本発明において「ベ
クター」という語は例えばプラスミド例えばｐＢＲ３２
２４）ｐＵＣｌ　Ｂ、ｐＵＲ２９０、ｐＷＨ７０１およ
びｐＳＰ６、あるいはウィルスのゲノムおよびそのフラ
グメントまたは誘導体、例えばλファージまたはファー
ジＭ］３のゲノムに関する。本発明の発現ベクター中に
、発明のＤＮＡ配列が表現制御配列に適切に結合される
。

好ましい態様において遺伝子の５′端における表現ベク
ターは次の配列： ５　′へＡＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧへＣＴＡＴＧへ
＾ＧＴＣＣＡＧＣＧＧ　　３　　’ＧＣＣＴＣＣＡＣＡ
ＧＣＴＧＡＴＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣを有するＤＮ
Ａフラグメントを含む 本発明による表現制御配列（プロモーター系）として大
腸菌（口、　ｃｏｌｉ）　　ｆｆ１ａｃプロモーター、
大腸菌ｔｒｐプロモーター、大腸菌リポタンパク質プロ
モーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、λ
Ｐ、プロモーター、λＰＲプロモーター、酵母表現制御
配列または他の真核細胞表現規制配列を用いることがで
きる。本発明の殊に好ましいプラスミドはプラスミドｐ
ＲＨ３１（ＤＳＭ３６３４）およびｐＲＨ３４，（ＤＳ
Ｍ３６３５）である。他の殊に好ましいプラスミドはプ
ラスミドｐＲＨ３１、ｐＲＨ３４およびｐＲＨ１，８１
０（ＤＳＭ３９０５）で構築することができるプラスミ
ドｐＲＨ２４、ｐＲＨ２１およびｐＢΔ１７である。

さらに本発明の主題は前記ベクターで形質転換された宿
主生物である。好ましい宿主生物は種大腸菌（Ｂ、　ｃ
ｏｌｉ）の株、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または他の細菌、サツカロミセス・
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　）％他の顕微鏡約手真菌、動物またはヒト
細胞である。

本発明の主題はさらにＨＵＳＩ−１型インヒビターの生
物学的活性を有するタンパク質である。

本発明のタンパク質はＣＵＳＩ−１タンパク質の生物学
的活性を示す。殊に好ましい態様において、ＣＵＳＩＩ
タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質は第５図
に示されるアミノ酸配列を示す。

他の殊に好ましい態様において、ＣＵＳ　Ｉ　−１タン
パク質の生物学的活性を有するタンパク質は次のアミノ
酸配列： Ｐｒｏ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−八ｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　
］　ｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　］　−］Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−ＧＩ　ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ−１、ｅｕ　
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ｇ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−１
，ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇ　ｌ　ｙ
−Ｍｅ　ｔ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｃｙ
ｓ　−Ｖａ　ｌ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｏｎ。

を有する。

他の殊に好ましい態様においてＣＵＳ　Ｉ　−Ｉタンパ
ク質の生物学的活性を有するタンパク質は次のアミノ酸
配列； Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｔ
ｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍ
ｅｔ４．ｅｕ−八ｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｈ
ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ｃｙｓ−１，ｙｓ−Ａｒｇ−八５ｐ−Ｌ、ｅｕ−Ｌｙ
ｓ−ＣｙＳ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−シミｌ−３ｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＯＨａを有する。

本発明のタンパク質は、好ましくは実質上純粋なタンパ
ク質である。

本発明はさらに、前記形質転換した宿主生物の１つを普
通の栄養培地中で培養し、場合により遺伝子生成物の発
現を誘発し、培養から、すなわち培養細胞からおよび（
または）普通培地から発現生成物を分離し、場合により
発現生成物をさらに制御酸加水分解条件下に処理して部
分加水分解し、ゲルクロマトグラフィーにより水解物か
ら所望の生物学的活性タンパク質を分離することを含む
前記タンパク質の製造方法に関する。それらの用途によ
り、得られたタンパク質を好ましくはクロマトグラフィ
ー、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは高
性能液体クロマトグラフィー（）（Ｐ　Ｌ　Ｃ）あるい
はこれらの方法の組合せによりさらに精製することがで
きる。

本発明により製造されたタンパク質およびタンパク質フ
ラグメントは、特に慢性気管支炎、慢性頚部炎症の治療
、並びに過剰の粘液分泌に関連する他の慢性炎症過程お
よびそれから生ずる急性緊急状態の治療に適する。それ
らはさらにシジックの初期治療および、例えば高フィブ
リン分解に基く術後出血の治療に通ずる。相応して、Ｈ
ＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物活性を有するタンパク
質有効量並びに普通の担体および（または）希釈剤およ
び（または）アジュバントを含む製剤組成物もまた本発
明の主題である。治療にはＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビター
の生物学的活性を有するタンパク質は無菌等張溶液の形
態で、筋肉内、静脈内または皮下注射により炎症領域に
、場合により注人により投与することができる。本発明
において、スプレーの形態の製剤組成物または吸入製剤
が好ましい。それらは活性成分の気管支の管および肺の
疾患部への直接適用により気道の疾患の治療に殊に適す
る。

（４）発明の説明 異質タンパク質を合成できる宿主生物を構築するために
多くの実験段階を行なうことが必要である。最初に所望
タンパク質の生合成に対する情報をもつ遺伝子を同定し
て分離する。遺伝子の同定および分離には種々の方法が
ある。例えばＣｌｌ５Ｌ−■タンパク質の生物学的活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の分離にば
、まず１ｌｔｌＳ１〜Ｉタンパク質の部分タンパク質配
列データに基く合成オリゴヌクレオチドの２つの混合物
を調製する。これらのオリゴヌクレオチドは６個のアミ
ノ酸をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ　）するＤＮＡ配列に
相補性である（第１図ＲＨ１およびＲＨ２参照）。

ＣＵＳＩ−Ｉ、ＨＵＳＩ−１（４８）およびＢＳＩ（４
１）の−次構造に関する不完全なデータを基にして適当
なオリゴヌクレオチド混合物を合成することができなか
った。アミノ酸配列の公知データに対しトリプシンフラ
グメント、ブロモシアノフラグメントまたはＮＨ２末端
の化学的に不均一な混合物を基にして得られた（４８）
。そのように得られた部分配列はさらに本発明により決
定されたＣＵＳ　Ｉ　−１タンパク質のアミノ酸配列か
ら３０％以上偏位する。アミノ酸の配列中の既に１つの
簡単な不正確に決定されたアミノ酸がこのアミノ酸配列
から誘導されるオリゴヌクレオチドプローブの作用を生
じないことができることは十分に立証されている。（４
８）中には例えばＲＨ２の領域中のアミノ酸配列がＣｙ
ｓ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ　−Ｍｅｔ−Ｃｙｓである
と記載されているが、しかしこの領域中の本発明により
決定されたアミノ酸配列はＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−〇
ｌｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓである（第４図参照）。

本発明によれば、ｃＤＮＡライブラリーは合成オリゴヌ
クレオチドの前記混合物を用いてスクリーンされる。こ
れらのｃＤＮＡライブラリーは出光物質としてヒト頚部
組織からｍＲＮＡで調製された。本発明によるｃＤＮＡ
ライブラリー調製の出発物質として、またヒト肺の上部
気道（死後１０時間にとった剖検物質）の組織からのｍ
ＲＮＡを用いることができる（７）。供与組織から分離
されたｍＲＮＡは常法で相補性ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）分
子の合成に使用され、それは最後にプラスミドｐＢＲ３
２２のＰｓｔＴ部位に挿入される。そのように調製され
たｃＤＮＡ分子で宿主生物、例えば大腸菌に１２Ｄ）１
１、を形質転換し、常法でテトラサイクリンを含む寒天
平板上で培養する。ｃｕｓ　ｒ−■タンパク質の生物学
的活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を
有するプラスミドを含む形質転換宿主細菌のコロニーは
ハイブリッド形成実験、いわゆるコロニーハイブリッド
法で同定される。この実験には、レプリカニトロセルロ
ースフィルターを寒天平板上に成長する細菌コロニーか
ら調製する、サヤ−（Ｔｈａｙｅｒ）　（８）参照。

レプリカニトロセルロースフィルターを次いでワリス（
Ｗａｌｌａｃｅ　）　（９）に従い２つの前記オリゴヌ
クレオチド混合物でハイブリッド形成する。陽性コロニ
ーから、組換え体ｃＤＮＡ含有プラスミドを分離する。

プラスミド中のｃＤＮＡ挿大の太ささが決定され、適当
な大きさの挿入体を有するプラスミドはｃＤＮＡ挿人体
のＤＮＡ配列の分析により一層詳細に確認される。従っ
て組換え体プラスミドｐＲＨ３１が分離される。それは
ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３４で寄託されている。さ
らに頚部組織試料のｍＲＮＡからプラスミドｐＲＨ３１
のＤＮＡ配列から誘導されたオリゴヌクレオチドで調製
したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ハイブ
リッド形成中のプローブとして作用させることにより組
換え体プラスミドｐＲＨ３４を分離する（第４図、ＲＨ
５参照）。絹換え体プラスミドｐＲＨ３４の挿入体のＴ
）ＮＡ配列を決定すると、このプラスミドがＣＵＳ　Ｔ
　−Ｔタンパク質をコードする全領域を含むことを知る
ことができる。組換え体プラスミドｐＲＨ３４はＤＳＨ
に寄託番号ＤＳＭ３６３５で寄託された。

プラスミドｐＲＨ３１およびｐＲＨ３４中に含まりＡ れるｃＤＮＡ配列の援助で次に発現ベクターが構築され
る。最初の組換え体プラスミドｐＲＨ２４は中間体とし
て作用する組換え体プラスミドｐｉ１１１８１０から調
製される。組換え体発現プラスミドｐＲＨ２４はＣＵＳ
Ｉ−■タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質を
コードするプラスミドｐＲＨ３４の領域、並びにシャイ
ンーダルガルノ配列および翻訳由来をともに含む合成り
ＮＡフラグメントを含む。Ｍｉ換え体発現ベクターｐＲ
Ｈ２４から誘導された発現生成物は第５図に示される全
アミノ酸を含む。

さらに組換え体発現プラスミドｐＲ，）Ｉ２１が調製さ
れる。このため、５ａｕＩ［ＩＡフラグメントがプラス
ミドｐＲＨ３１から切り出され、プラスミドｐＵＲ２９
０のＢａｍＨＩ制限部位中へ挿入される。

そのように構築された組換え体発現プラスミドｐＲＨ２
１から誘導された発現生成物はＮ末端がβ−ガラクトシ
ダーゼのアミノ酸配列からなり、５９Ｃ−末端アミノ酸
がＣＵＳＩ−１タンパク質の最後の５９アミノ酸に相当
する融合タンパク質である（第５図参照）。５８アミノ
酸の長さを有するポリペプチドを常法で、この発現生成
物からアスパラギン酸−プロリン結合の酸加水分解によ
り（例えば１０〜７０％の酢酸またはギ酸、好ましくは
約３０％酢酸または７０％ギ酸で、約１０〜３０℃の範
囲内の温度、好ましくは室温で、２０〜４０時間処理す
ることにより）分離する。

次いでゲルクロマトグラフィーにより精製する。

この５８アミノ酸の長さを有するポリペプチドはＣＵＳ
Ｉ−Ｔタンパク質の生物学的活性を有する第５図に記載
されるタンパク質のＣ−末端ドメインに相当する。

プラスミドｐＢＡ１７は他の組換え体発現プラスミドと
して構築される。このためＢａｍＨＩ／Ｈ４ｎｆＴフラ
グメントがプラスミドｐＲＨ１８１０から切り出され、
末端を満たした後発現プラスミドｐＳＰ６に連結される
。発現プラスミドは連結のためにＨｉｎｄｌ［Ｉ開裂並
びに次のムングビーン（Ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアー
ゼおよびアルカリ性ホスファターゼによる処理により調
製される。生じた組換え体発現プラスミドｐＢＡ１７か
ら得られる発現生成物は５９個のアミノ酸からなる。そ
の配列は第５図中の５９Ｃ−末端アミノ酸の１つに相当
する。発現生成物ばＣＵＳ　Ｉ　−Ｔタンパク質の生物
学的活性を示す。

相当する形質転換した宿主生物による前記タンパク質の
発現は免疫沈殿１０により、またはウェスターンプロッ
ト（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）分析１１．１２により示
される。発現生成物の生物学的活性はプロティナーゼキ
モトリブシンの阻害により決定される。

図面には次のように示される： 第１図：　ＨＰＬＣにより精製し、トリプシンによるタ
ンパク質の酵素開裂により得られた天然ＣＵＳ　Ｔ−１
タンパク質のフラグメントのアミノ酸配列。

合成オリゴヌクレオチドの２混合物が誘導された配列領
域はＲＨＩおよびＲ，Ｈ２と称される。それらはアンダ
ーラインされている。

第２図ニブラスミドｐＲＨ３１の制限地図。

組換え体プラスミドｐＲＨ３１が制限部位、Ｐ−Ｐｓｔ
ＩＸＥ＝ＥｃｏＲＬ　Ｂ＝ＢａｍＨＴ、Ｈ−Ｈｉｎｄｕ
、とともに示される。黒バーはｃ　ＤＮＡ挿人体を示し
、口中の矢はテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ’）
および中断アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ’）を示す
。

第３図ニブラスミドｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入の配列化
方策の図式。

黒バーはプラスミドｐＲＨ３１の５００ｂｐ−ＰｓｔＩ
フラグメントを示し、黒矢はそれぞれの場合において配
列反応に相当する。白色非充填矢はＣＵＳＩ−１をコー
ドするｃＤＮＡＤＮＡ上人体上を示す。

第４図ニブラスミドｐＲＨ３１のＣＵＳ　Ｉ　−Ｉ−ｃ
ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列。

二重鎖ＤＮＡ配列が示される。ＣＵＳＩ−１配列の読取
り枠はｃＤＮＡ挿入体の５’（Ｇ：Ｃ）ホモポリマー尾
の直後に始まる。読取り枠は３文字記号で示される９０
個のアミノ酸をエンコードする。さらに停止コドンＴＧ
Ａの後に１７８個のｒ 塩基が示される。

第５図；プラスミドｐ　ＲＨ３４のＣＵＳ　Ｔ−１−ｃ
ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列。

二重鎖ＤＮＡ配列が示される。ＤＮＡ配列から誘導され
たアミノ酸が３文字記号で示される。位置５９〜１３３
のヌクレオチドはＣＵＳＩ−Ｉタンパク質のシグナルペ
プチドをエンコードする。

第６図：ｐＲＨ１８０７（プラスミドｐ　ＲＨ３４のＣ
ＵＳ　Ｔ−Ｔ　ｃＤＮＡフラグメントを含む）のＰｓｔ
Ｉ挿入の配列化方策。

各矢は配列実験を示す。

Ｈ＝ＨｉｎｄｌＨ１Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。

第７図：調節可能プロモーターλＰＬの３′端にＣＵＳ
　Ｔ−Ｔ遺伝子をもつ発現ベクターｐ　ＲＨ２４の構築
図式。

ａＩｌｌｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子Ｎ−ＣＵＳｌ−
１：ｃｕｓｒ−ｒ−Ｎ末端をコードするＤＮＡフラグメ
ント Ｃ−ＣＵＳ　［−１：　ＣＵＳ　Ｉ　−Ｔ−Ｃ末端をコ
ードするＤＮＡフラグメント ０ＬＰ、、　　：バクテリオファージλの左オペレータ
ーおよびプロモーター領域 ＳＤ　　：シャインーダルガルノ配列またはリポソーム
結合部位 制限エンドヌクレアーゼの略号： Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、　Ｈ＝ＨｉｎｄｌＴ
Ｉ、Ｈａｅ＝Ｈａｅ■、Ｐ＝ＰｓｔＩ　５ｐｈ＝Ｓｐｈ
ｌ。

第８図ニブラスミドル　ＲＨ３４の制限地図。

組換え体プラスミドｐＲＨ３４が制限部位、Ｐ　＝　Ｐ
ｓｔ　Ｔ、Ｅ＝ＥｃｏＲＴ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ　Ｈ＝Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ、Ｈａｅ＝ＨａｅＩＩＩとともに示されてい
る。

黒バーはｃＤＮＡ挿入の位置を示し、円内の矢はテトラ
サイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ’）および破壊アンピシ
リン耐性遺伝子（ａｍｐ”）の位置を示す。

第９図ニアミノ酸配列分析が生ずる興味ある観点。

配列の２つのシフトを無視すると分子中に存在する全シ
スティン残基が、タンパク質を２つに分け、それらを相
互の上に記したときに重ねることができる（アミノ酸１
〜５４と５５〜１０７）。

さらに、隣接アミノ酸がシスティン残基に関してしばし
ば保存されることが認められる。この観察に対して２つ
の異なる説明が存在する：（ｉ）ＣＵＳ　Ｉが２つのほ
ぼ等しくたたまれたインヒビター活性セグメント、すな
わちトリプシンに対するものとロイコザイトエラスター
ゼまたはキモトリプシンに対するもの、を含むことがで
きる。

（ｉｉ）タンパク質はおそらく存在するドメインからの
遺伝子コードのレベル上で形成され、従って両ドメイン
が互いに無関係に生じた。

第１０図：β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として
部分ＣＵＳ　Ｉ−Ｉ配列の発現に対するクローニング方
策。

黒バーは部分ＣＵＳ　Ｉ−１配列を、非充填バーはβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を表わし、円内の
矢はテトラサイクリル耐性遺伝子（ｔｅｔ’）またはア
ンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ’）を示す。

Ｐ＝ＰｓｔＩ、５＝Ｓａｕ３Ａ、Ｅ＝ＥｃｏＲ１，、Ｈ
＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、ｐ＝１ａｃプロモ
ーター、ｏ＝Ｉａｃオペレーター。

第１Ｉ図：Ｃ−末端ＣＵＳ　Ｉ−１ドメイン（−ＣＵＳ
　Ｔ−Ｔ第２ドメイン）の発現のための発現ベクターｐ
ＢＡ１７の構築図式。

静ｐｒ−アンピシリン耐性遺伝子 Ｐｔａｃ　　＝ｔａｃプロモーター Ｔｅｔ’−不活性テトラサイクリン耐性残基遺伝子 ｒｒｎＢＴ＋Ｔｚ−リポソームＲＮＡ遺伝子の転写ター
ミネータ−シグナル 用いた次の略号は次の意味を有する： Ａｓ、ａ　　　５７８ｎｍにおける吸収ＤＴＴ　　ジチ
オトレイトール Ｂｉｓ　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミド ｂｐ　　　　塩基対 Ｄ　　　　ドルトン ＤＢ　（ｒ）ＥＡＥ）　　ジエチルアミノエチルｄｓｃ
ＤＮＡ　　　二重鎖ｃＤＮＡ ｄ　ＮＴＰ　　デオキシヌクレオシド−５′−三リン酸 ＥＤＴＡ　　エチレンジアミン四酢酸 ＩｇＧ　　　免疫グロブリン Ｔ　ＰＴＧ　　イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド Ｌ２ｐ　　　相対質量３２のリンの同位体ＲＰＭ　　回
転毎分 ４１２３　　　相対質量３５の硫黄同位体ＳＤＳ　　ド
デシル硫酸ナトリウム ５ｓｃＤＮＡ　　　−重鎖ｃ　ＤＮＡ ＴＰＥＧ　　　ｐ−アミノフェニル−■−チオーβ−Ｄ
−ガラクトピラノシド Ｔｒｉｓ　　　）リスヒドロキシメチルアミノメタンＵ
　　　酵素活性の単位 サルコシン　Ｎ−ラウリルサルコシン α−（”Ｐ）　−ｄＣＴＰ　　　αリン酸残基中に同位
体３２ｐを有するデオキシシチジル−５′−三リン酸 ＬＢ培地　１０ｇ／＃酵素消化カゼイン〔ジグ；１ｚ マ（Ｓｉｇｍａ　）　）　、５　ｇ／　ｌｌ酵母エキス
（シグマ）　、８　ｇ／　１Ｎａｃｌｌ、　ｐｔ１７．
５に調整。

実施例において、下記の方法および示した物質が使用さ
れる。物質および方法はさらにマニアティス（Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　）ばか２８に記載されている。

Ｎ）酵素 制限エンドヌクレアーゼ〔ベテスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｈ
ｏｒａｔｏｒｙ）（ＢＲＬ））およびＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼ〔バーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））並びに仔つシ腸アルカリ性ホ
スファターゼ（バーリンガー・マンハイム）、Ｔ４−ポ
リヌクレオチドキナーゼ（バーリンガー・マンハイム）
およびムングビーンヌクレアーゼ〔ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　）　）は商業的に入手でき、製造者の
指図書に従って使用される。末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼ（Ｂ　ＲＬ）はセクション（ｖｉ
ｉ）記載のように使用される。大腸菌ｒｌＮＡポリメラ
ーゼ（ＢＲＬ）、リボヌクレアーゼ）Ｔ（ＢＲＬ）並び
にＡＭＶ逆転写酵素（ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　
５ｃｉｅｎｃｅ）は（１３）に従って使用される。大腸
菌ポリメラーゼ■　（フレノウフラグメント）（バーリ
ンガー・マンハイム）は（１４）記載のように使用され
る。

（ｉｉ）微生物 グラム陰性およびグラム陽性株、例えば大腸菌またはバ
シラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌ
ｉｓ）の株はともにＣＵＳＩＩの生物学的活性を有する
タンパク質の発現のための微生物として使用できる。Ｃ
ＵＳＩ−１の生物学的活性を有するタンパク質に対する
構造遺伝子を含む適当なベクターとともに真核生物例え
ばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｔｖｉｓｊａｅ）あるいは哺乳動物細胞
に対する通常の発現系も同様に使用できる。本発明によ
れば大腸菌株Ｋｌ　２ＭＣ１０６１λ１５（ＤＳＭに寄
託番号ＤＳＭ３６３１で寄託）が完全天然ＣＵＳ　Ｔ　
−１タンパク質の直接発現に使用される。その遺伝子型
は次のように規定することができる：ａｒａＤ１３９、
Δ（ａｒａ　、　Ｉｅｕ　）７６９７、ΔＩａｃ　　Ｘ
　７４、ｇａｌ　　Ｕ−、ｇａｌ　　Ｋ−、ｈｓｒ　−
、、ｈｓｍ　”″、ｓｔｒ　Ａｓ本発明によれば大腸菌
株に１２ＪＭ１０１　　Ｃアメリカン・タイプ・カルチ
ャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　　（Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ）に寄託番号ＡＴＣＣ３３８７６で寄託）がβ−ガラ
クトシダーゼとＣＵＳ　Ｉ　−Ｉタンパク質のＣ−末端
ドメインとの間の融合タンパク質の発現に使用される。

その遺伝子型は次のように規定することができる：Δ（
Ｉａｃ　ｐｒｏ　）　、ｔｈｉ　、　Ｓｔｒ　Ａ、　Ｓ
ｕｐ　Ｅ、　ｅｎｄ　Ａ。

ｓｂｃ　Ｂ、ｈｓｄ　Ｒ−、Ｆ’ｔｒａ　、　Ｄ３６、
ｐｒｏ　ＡＢ。

ＩａｃＴｇ、２６Ｍ１５゜合成ｃＤＮＡの挿入後（実施
例１（Ｃ）参照）に得られた組換え体プラスミドの分離
には大腸菌に１２ＤＨＩ　　（ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴ
ＣＣ３３８４９で寄託）が使用される（１７）。その遺
伝子型は次のとおり規定することができる：Ｆ−、ｒｅ
ｃ　Ａｌ、ｅｎｄ　ＡＩ、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ　−１
、ｈｓｄ　Ｒｌ　７　（ｒｘ−、ｍＫ”　）、５ｕｐＥ
４４、ｔｅｌＡＩ。プラスミドおよびλファージのプロ
モーターＰＬを含む新に構築された組換え体プラスミド
を分離するために、大腸菌に１２野生型Ｗ６菌を初めに
形質転換する。これらの宿主細菌中でλＰＬプロモータ
ーは絶えず温度耐性λリプレッサーによりブロックされ
る。大腸菌に１２野性型Ｗ６はＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ
３６３２で寄託された。

（ｉｉｉ　）ベクター 大腸菌の形質転換には、次の公知プラスミドが使用され
る。それらの若干は市販されている。

ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３１３４４、（２３）、ファル
マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｐｒｅｆｂｕｒｇ）
　］ｐＵｃ１８　（ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３４２４で
寄託、（２４）、ファルマシア （Ｐｈａｒｍａｃｊａ　、　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）ｐＵＲ
２９０（ＤＳＭ３４１７、（２５））ｐＷＨ７０１（Ｄ
ＳＭ３６３３、（２６））大腸菌に１２ＪＭＢ９中のｐ
ＲＫ２４８ｃＩｔｓ（ＡＴＣＣ３３７６６、（２７）、
（４９））ｐｓｐｅ　（ＤＳＭ３９０４）　、およびｐ
ＲＨｌ　８１０　（ＤＳＭ３９０５）。

当業者はまた当業者に知られた宿主生物との関連で本発
明に使用できる他の適当なベクターに明るい。

（ｉｖ）ゲル電気泳動 ＤＮＡの長さにより、アガロースまたはポリアクリルア
ミドゲルがＤＮＡフラグメントの分離に使用される。５
ｏｏｂｐ以上のＤＮＡフラグメントはＴＡＲ緩衝液（４
０ｆｉＭ−Ｔｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８，３，２ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡ）中の１〜１．２％アガロースゲルで、５ｏｏｈ
ｐ以下のＤＮＡフラグメントはＴＢＥ緩衝液（６０１Ｍ
−Ｔｒｉｓ−塩基、６０ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡＳ
ｐＨ８，３）中の５％ポリアクリルアミドゲル〔アクリ
ルアミド／ビスアクリルアミド（Ｉｌｌ））で分離され
る。ｃＤＮＡの分離のための変性アガロースゲル電気泳
動は例えばマクドネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）ほか（１
９）による１、２％アルカリ性アガロースゲル中で行な
われる。

ｍＲＮＡの電気泳動分離は１．４％アガロースゲルおよ
び１５ｍＭ水酸化メチル水銀で行なわれる。

試料は電気泳動にかけ、ベイレイ（Ｂａｉｌｅｙ）はが
（２０）の方法により変性することができる。５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の分離にはレム
リ　（Ｌａｅ＋ｍｍｌ＋　）　　（２１）の方法が使用
される。

（ｖ）ゲル溶離法 １．０００ｂｐ以下のＤＮＡフラグメントの調製分離は
５％ポリアクリルアミドゲル中で行なわれる。

フラグメントの溶離はマクサム・アンド・ギルバー）（
２２）に従って行なわれる。そのように分離されたフラ
グメントをそれぞれサブクローニングおよび配列分析に
用いた。

（ｖｉ）ＲＮＡの分離 ヒト組織からの全ＲＮＡはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）はか（２８）の方法により分離される。全ＲＮＡの
抽出の次にＣｓＣＩｔ−勾配遠心分離し、ＤＮＡを分離
する（２９）、このため５．７　Ｍ−ＣｓＣＩ２３　ｍ
　Ａ、１００ｍＭ−ＥＤＴＡを１６ｍＡベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ　）　−Ｓ　Ｗ　２７遠心分離管に入れ、
ＲＮＡ溶液（１％Ｎ−ラウリルサルコシン中３〜４■核
酸、５ｍＭ−Ｔｒｉｓ−■ＣＩｌ、　ｐｌ＋７．５．１
１ＩＩＭＥＤＴＡ。

４ｇ／４ｍｊ２ＣｓＣｊり　４ｍｊ２で覆い、ベックマ
ン５Ｗ−２７０−ター中で１５℃で１７．０００ｒｐｍ
で１７時間遠心分離にかける。ＲＮΔ沈降物をＴＥ緩衝
液（ＩＱ　ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ５ｐＨ８，０，１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、エタノールで沈殿させ、
最後にアビブほか（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ）　
　（３０）に従いオリゴ（ｄＴ　）セルロース（タイプ
９、ファルマシア）によるボ’Ｊ　（Ａ”　）ｍＲＮＡ
の強化のためにクロマトグラフィーにかける。ｍＲＮＡ
を溶離液からエタノールで沈殿させ７０％エタノール中
に一７０℃で保持する。ｍＲＮＡ分離物の生存力はウサ
ギ網状赤血球リゼイト中の試験管内翻訳により（セクシ
ョン（ｘｖｉ　）参照）、または変性ゲル電気泳動によ
り調べることができる。そのように分離されたｍＲＮＡ
は次いでｃＤＮＡ合成およびノザンプロット（Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）分析に使用される。

（ｖｉｉ）　ｃ　Ｄ　ＮΔ合成 相補性−重鎮または二重鎖ＤＮＡはガブラー（Ｇｕｂｌ
ｅｒ　）ほか（１３）に従って合成される。合、３　ソ 成層率はα−［”Ｐ）−ｄＣＴＰの挿入によりスクリー
ニングし、生じたｃＤＮΔＤＮＡ長さは１．２％アルカ
リ性アガロースゲルおよび放射性標識標準ＤＮＡ分子に
より決定される。ｃＤＮＡの３′末端のオリゴ（ｄＣ）
ホモポリマーによるテーリングは次の条件下に全量４０
μｌで行なわれる：１００ｍＭ−に一カコジレート、ｐ
Ｈ７，２，１０ｍＭ−ＣｏＣＣ，１ｍＭ−ＤＴＴ、　５
００　μＭ　ｄ　ＣＴＰ。

１〜２ｍｇ／ｍＡ　ｃＤＮＡ、６００Ｕ／ｍＡ末端デオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ。反応混合物を
２０℃で５０分間インキュベートし、反応をＥＤＴＡの
添加（最終濃度２０ｍＭ）により停止させる。０．３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液からエタノールで沈殿させた後、沈
殿したｃＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！５ｐｔ１３．０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ）中に懸濁さ
せ、ｐｓｔｒ−開裂３′−オリゴ（ｄＧ）テールプラス
ミドｐＢＲ３２２で７１イブリツド形成する（　１００
ｍＭ−ＮａＣｊｌ！、　１０ｍＭ　＝Ｔｒｉｓ　−’ｔ
ｌｃ　Ｉｉ　、　ｐＨ７、８、Ｑ、　１ｍＭ−ＥＤＴＡ
、　０．１〜０．３ｎｇ／μｊ！　ｃＤＮＡ、　１．２
ｎｇ／μβプラスミドＵ ＤＮＡ）。ハイブリッド形成にはこの混合物を次いで６
５℃で５分間、５６℃で４５分間、４３℃で４５分間お
よび室温で１５分間インキュベートする。次いでそれを
形質転換に直接使用する（セクション（ｉｘ）参照）。

（ｖｉｉ）ノザンプロット分析 ＲＮＡを変性ゲル電気泳動にかけ、トーツス（Ｔｈｏｍ
ａｓ）　　（３１）に従いニトロセルロースフィルター
に移す。前ハイブリッド形成および５′−標識オリゴヌ
クレオチドとのハイブリッド形成は（９）記載のように
行なうことができる（セクション（ｘｉ）参照）。非特
異的に結合したオリゴヌクレオチドはハイブリッド形成
後ニトロセルロースフィルターの洗浄により、例えばフ
ィルターを室温で１５分間、ＳＳＣ緩衝液（９００ｎ＋
Ｍ−ＮａＣｊ！、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
，０）中の融点の２℃下で３分間洗浄することにより除
去することができる。融点はサグス（Ｓｕｇｇｓ　）ほ
か（３２）に従って算出される。

（ｉｘ）大腸菌の形質転換およびプラスミドの分離ドウ
ノボ合成したｃＤＮＡを含む組換え体プラスミド（実施
例１（Ｃ）参照）による形質転換のため大腸菌に１２Ｄ
Ｈ１のコンピテント細胞をハナハ７　（ｌｌａｎａｈａ
ｎ　）　　（１７）に従って調製する。大腸菌に１２種
ＪＭＩＯＩ、Ｗ６およびＭｃ１０６１の細胞をマンデル
ほか（Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　ｌｌｉｇａ　）　（３３
）に従い形質転換する。プラスミドＤＮＡは（３４）記
載の方法に従い１１培養から調製される。プラスミドの
迅速分析はホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ　）ほか（３５）に
従って行なわれる。

（Ｘ）オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドはホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈ
ｏａｍｉｄｉｔｅ　）法（３６）により合成される。

オリゴヌクレオチドは、例えばシャントン・ハイパーシ
ル（Ｓｈａｎｄｏｎ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　）　ＯＤ　Ｓ
　（登録商標）（粒径５　ｐ　ｍ　％カラムサイズ４．
６Ｘ２５０ｍｍ）上の逆相クロマトグラフィーにより精
製する。トリチル基を８０％酢酸で除去した後、生成物
を再び上記カラム物質上でクロマトグラフィーにかけ、
５′端に標識した後２０％ポリアクリルアミド中で分析
する（セクション（ｘｉ）参照）。この方法により２つ
のオリゴヌクレオチド混合物、すなわちＲＨＩおよびＲ
Ｈ２が合成される。これらのオリゴヌクレオチド混合物
はともにプローブとして使用される。２混合物中のオリ
ゴヌクレオチド分子の配列はＨＵＳ　Ｉ　−１タンパク
質のトリプシンフラグメントの適当なアミノ酸配列から
誘導される（第１図参照）。これらのフラグメントのア
ミノ酸配列はマチレイト（Ｗ、　Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ　
）　　（５０）に従って決定された。単に若干のトリプ
シンフラグメントおよび若干のブロモシアノフラグメン
トの分析により公知ＨＵＳ　Ｉ−１配列を補正すること
により、本発明のオリゴヌクレオチド混合物に到達する
ことが可能になった。オリゴヌクレオチド混合物はいわ
ゆる「混合プローブ」、すなわち遺伝子コードの退化に
暴く規定された位置中で異なるオリゴヌクレオチドの混
合物である（９）。

通常の「混合プローブ」の不利益はＨＰ　Ｌ　Ｃによる
オリゴヌクレオチドの高精製により、並びにそ　Ｏ の定量的３２ｐリン酸化により補うことができた。

オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ１はＣＵＳ　Ｉ−１タン
パク質のトリプシンフラグメントＴ２のアミノ酸配列に
相当する（第１図参照）。従って、オリゴヌクレオチド
混合物は各１７塩基の長さを有する１６種の異なるオリ
ゴヌクレオチドを含む。

配列は次のとおりである。

３’ＡＡＧΔＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＣ，５’Δ　　
ＡＣＡ オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２はＨＵＳＩ−■タンパ
ク質のトリプシンフラグメントＴ３のアミノ酸配列に相
当する（第１図参照）。従って、各１７塩基の長さを有
する３２種の異なるオリゴヌクレオチドが合成される。

それらは次の配列を有する： 化学合成オリゴヌクレオチドおよび二重鎖脱リン酸化Ｄ
ＮＡフラグメントのリン酸化は酵素Ｔ４−ポリヌクレオ
チドーキナーゼで２０〜５０μβ反応体積（５０ｍＭ−
Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！　、　ｐＨ９，５，２Ｏｎ＋Ｍ−
ＭｇＣＩ！ｔ　、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、　１０〜２０ｐｍ
ｏ１５’−０１１端基質、８μｌ１ｒ−（”Ｐ）　−Ａ
ＴＰ（〜８，０００Ｃｊ／ｍｍｏ＋）　、０．２Ｕ／、
１７４！Ｔ４−ポリヌクレオチド−キナーゼ〕中で行な
われ、次に非転化γ−（”Ｐ）−ＡＴＰが調製用ゲル電
気泳動、次にゲル溶離およびＤＥ５２（ジアミノジエチ
ルセルロース）〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　］
上のイオン交換クロマトグラフィーにより分離される。

ＤＮＡ制限フラグメントの５′−突出端をフォルケルト
（Ｖｏｌｋｅｒｔ　）はか（１４）に従って相補性α−
（３２ｐ］−デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在
下に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメン
トで満たすことができる。組込まれないα−Ｃ″２Ｐ）
−ｄＮＴＰ、はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　
Ｇ　−５０上のゲルパーミェーションクロマトグラフィ
ーにより分離され、溶離画分を減圧下に濃縮する。

（ｘｉｉ）　　ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ分子の配列はマクサム・アンド・ギルバー　）　
（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　＞　　（２２
＞に従って決定される。

（ｘｉｉｉ）β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の精
製 ＣＵＳＩ−１−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は
ウルマン（ＩＪＩＩｍａｎｎ　）　　（３７）に従って
アフィニティークロマトグラブイ−により精製される。

（ｘｉｖ）　　タンパク質のニトロセルロースフィルタ
ーへの移動 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離されたタンパ
ク質はトウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）はか（１２）ニ従いニ
トロセルロースフィルターに移すレル。

（ＸＶ＞ＣＵＳＩ−１阻害試験 ＣＵＳＩ−Ｉの生物学的活性を有するタンパク質の活性
はトリプシン（３８）およびキモ）　ＩＪプシン（３９
）の阻害の測定により示される。

（ｘｖｔ）ｍＲＮＡの無細胞翻訳 網状赤血球リゼイト中のｍＲＡの無細胞翻訳はペルハム
（Ｐｅｌｈａｍ）はか（４０）に従って、放射性標識ア
ミノ酸として］　２００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を有す
る３５３−メチオニンを用いて行なわれる。

実施例は発明の例示である。

実施例１ 部分ＣＵＳ　Ｔ　−ｌタンパク質−特異性ｃＤＮＡクロ
ーンのクローニングおよび６ ｆａｌ　ｍ　ＲＮ　Ａの分離および確認全ＲＮＡまたは
ｍＲＮＡをヒｌ−頚部組ｖ＠（生検物質）からセクショ
ン（νｉ）記載のように分離する。約１．６〜２．２■
の全ＲＮＡが１４〜１７ｇの頚部組織から得られる。オ
リゴ（ｄＴ）−セルロース（タイプ９、ファルマシア）
でアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（八＋
）−ｍＲＮＡを強化後、２０〜２５　／ｊ　ｇ　ｍＲＮ
Ａ／■全ＲＮＡが得られる。これは約２．０〜２．５％
ｍＲＮＡの収率に相当する。変性アガロースゲル中のゲ
ル電気泳動分析によりＲＮＡが分離中に分解しないこと
が示される。相当する結果はまたウサギ網状赤血球リゼ
イト中の全およびポリ　（Ａ”″）　−ｍＲＮＡの試験
管内翻訳から得られる。

…１ｃＵｓＩ”ｌタンパク質−特異配列の検出のための
合成オリゴヌクレオチドによる分離したｍＲＮＡのノザ
ンプロット分析 ノザンプロット分析は頚部ｍＲＮＡ分離物中の特異ｍＲ
ＮＡ配列の確認のために行なわれる。

アミノ酸Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−＾ｓｐ
　−ＧｌｙをコードするｍＲＮＡと相補性であるオリゴ
ヌクレオチド混合物ＲＨＩ（第１図参照）はハイブリッ
ド形成プローブとして作用する。ハイブリッド形成中に
得られたニトロセルロースフィルターにＸ線フィルム〔
「コダソク　（Ｋｏｄａｋ　）Ｘ　−ｏ　−ｍａｔ　−
ＡＲＪ　）にさらすことにより特異性シグナルが検出さ
れる。オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２で陽性シグナル
が認められなかったけれども、混合物のオリゴヌクレオ
チド配列の１つは後に（配列化後）右配列であると示さ
れた。

ハイブリッド形成ｍＲＮＡ種の分子の大きさをＤＮＡ標
準分子と変性ゲル中で比較するとハイブリッド形成ｍＲ
ＮＡの長さが約６５０〜８００塩基であることが認られ
る。

ｆｃｌプラスミドｐＢＲ３２２によるｃＤＮＡライブラ
リーの調製 ４〜６μｇのポリ　（Ａ”　）−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合
成の出発物質として用いる。−重鎖ｃＤＮＡは約２８０
ｎｇ（約７％）である。合成−重鎖ｃＤＮＡ分子は約４
００〜２．５００ヌクレオチドの大きさを有する。２８
０ｎｇの５ＳｃＤＮＡから、約２７０ｎｇの二重鎖ｃＤ
ＮＡが第２鎖を合成するときに得られる。従って、二重
鎖合成の収率は約５０％である。ｃＤＮＡ分子の３′端
がホモポリマー（ｄＣ）ｐ、Ｗ域でテーリングされる。

得られたｃＤＮＡ分子はハイブリッド形成反応中に、Ｐ
ｓｔＩ開裂され３′端にホモポリマー（ｄＧ）６３Ｖ域
でテーリングされたプラスミドｐＢＲ３２２の分子に付
加する。付加生成物は大腸菌に１２Ｉ））１１の形質転
換に使用される。次いで形質転換細胞をテトラサイタリ
ン耐性およびアンピシリン感受性について選択する。用
いた毎ｎｇｃＤＮＡ当り１２０形質転換細胞（１２，０
００形質転換細胞／１００ｎｇｄｓ１００ｎ、）が得ら
れる。テトラサイタリン耐性およびアンピシリン感受性
形質転換細胞またはコロニーの割合は約８０％である。

これらの形質転換細胞は貯蔵培養（培地：ＬＢ培地、１
０ｇ／β酵素消化カゼイン（シグマ）、８ｇ／ｌ１Ｎａ
（Ｊ　、ｐＨ７，５，５ｇ　／　７！酵母エキス（シグ
マ）、２０Ｉｇ／ｍＩ！、テトラサイクリン、２０％グ
リセリン）としてミクロタイタープレート（９８ウエル
／プレート）中で培養し、−２０℃で保つ。

１ｄｌｃＵｓｌＩタンパク質特異性ｃＤＮＡによる紺換
え体プラスミドの同定 上記のように得られた６、０００形質転換細胞の分析の
ため、コロニーハイブリッド形成がオリゴヌクレオチド
混合物ＲＨＩで行なわれる。

オリゴヌクレオチド混合物の活性は０．８μＣｉ／ｐｍ
ｏ＋の比活性でハイブリッド形成体積巾約１×１０’ｃ
ｐｍである。Ｘ線フィルムをハイブリッド形成中に得ら
れたフィルターの各−７０℃で、２補強スクリーンの存
在下に１２時間さらす。

陽性シグナルが検出される。相当する形質転換細胞の貯
蔵培養から出発し、ｐＲＨ３１と称される組換え体プラ
スミドが０．５　Ａ培養［ＬＢ培地、１０ｇ／ｊ！酵素
消化カゼイン（シグマ）、１０　ｇ／　７！ＮａＣｌ１
．５　ｇ／　ｌｌ酵母エキス（ジグ？）　、ｐｔ＋７．
５．２０Ｉｇ／ｍｊ！テトラサイクリン〕から調製され
る。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＴ、
　ＢａｍＨＩ並びにＨｉｎｄ　■の使用により組換え体
プラスミドｐＲＨ３１の制限地図が得られる（第２図参
照）。ｃＤＮＡ挿入体は５００ｂｐの長さを有する（第
２図参照）。

プラスミドｐＨＲ３１はＤＳＭに寄託番号３６３４で寄
託された。

（ｅ）ｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入体の配列分析マクサム
・アンド・ギルバート（２２）に従う配列化のためにプ
ラスミドｐＲＨ３１からのＰｓｔＩフラグメント（５０
０ｂｐ）をプラスミドｐＵｃ１８中へ再クローンする。

このためｐＲ■３１のＤＮＡｌ０μｇを制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔ１３０Ｕで開裂し、アガロースゲル上で
調製的に分離し、得られた５ｏｏｂｐフラグメントをゲ
ルから溶離する。さらにプラスミドｐＵｃ１８のＤＮＡ
ｌ０μｇを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで開裂し、
脱リン酸し、フェノールおよびジエチルエーテルで抽出
し、最後に０．３ｍｏｌ酢酸ナトリウム溶液からエタノ
ールで沈殿させる。次のＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応には
０．２　ｐｍｏｌのプラスミド１）ＮＡおよび０．４　
ｐｍｏｌのＰｓｔＩフラグメントを用いる。得られた組
換え体ＤＮＡ分子を大腸菌Ｉ（１２ＩＭ１．０１の形質
転換に用いる。アンピシリンを含むＬ　Ｂ平板（１０ｇ
／ｌカゼイン、８　ｇ／ｊ２Ｎａ（Ｊ！、　５　ｇ酵母
エキス、１００μｇ　／　ｍ　１！アンピシリン）上で
選択を行なう。アンピシリン耐性形質転換細胞中に含ま
れる組換え体プラスミドはプラスミド迅速分析（こより
確言忍される。ｐＲＨ３１のｐｓｔｒフラグメントを反
対配向で含む組換え体プラスミドｐＲＨ１８１およびｐ
　ＲＨ１，８２が得られる。

第３図に示される配列化方策はこれらのプラスミドの構
築から生じ、それは単に容易なりＮＡ配列化のための補
助構築として作用する。配列化（２２）により決定され
たプラスミドｐ　ＲＨ３１の５００ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉフ
ラグメントのヌクレオチド配列が第４図に示される。配
列は２０（ｄ、　Ｇ　）−残基で５′一端で出発する。

その後に２７３ｂｆ）にわたって延びる読取り枠が続く
（第４図、位置２５〜２９７参照）。この読取り枠は９
０個のアミノ酸をコードし、停止コドンＴＧＡで終る（
第４図参照）。ヌクレオチド配列から、オリゴヌクレオ
チド混合物ＲＨＩのオリゴヌクレオチドがヌクレオチド
配列の位置２０８〜２２４と相補性であること、および
オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２のオリゴヌクレオチド
がヌクレオチド配列の位置２４７〜２６３と相補性であ
ることを知見できる。停止コドンＴＧＡにはさらに１７
８ｂｐが続く。ヌクレオチド配列の分析はＣＵＳＩ−■
タンパク質のＮ末端セグメントをコードする領域がヌク
レオチド配列中に含まれないこと示す。

実施例２ 全ＣＵＳ　Ｔ　−Ｔタンパク質をコードするｃｒｌＮＡ
フラグメントによる　　え　プラスミド」（ａｌオリゴ
ヌクレオチドＲＨ５の合成ＣＵＳ　Ｔ　−Ｉタンパク質
をコードする全領域を含むｃＤＮＡフラグメントを分離
するためにオリゴヌクレオチドＲＨ５をホスファミグイ
ト法（３６）に従って合成する。オリゴヌクレオチドＲ
Ｈ５は２０塩基の長さを有する。それは第４図に示され
るコーディングＤＮＡ鎖の位置３１〜５０と相補性であ
り、次の配列を有する：オリゴヌクレオチドＲＨ５を放
射性標識し、ｃＤＮＡフラグメントがその５′端に少く
ともプラスミドｐ［（３１の５′−末端領域を含む組換
え体プラスミドを含む形質転換細胞を新ＣＤＮＡライブ
ラリー中で同定するためにプロブとして使用される。

…）ＣＵＳＩｉタンパク質の全コーティング’ｐＴ４　
ｈｌによる組換え体プラスミドを含む新ｃＤＮＡ遺伝子
ライブラリーの調製 プラスミドｐＢＲ３２２を用いる大腸菌中の新ｃＤＮＡ
ライブラリーを調製するためＣＵＳＴ−Ｉタンパク質を
コードするｍＲＮＡを分離する。このためヒト頚部組織
からの全ＲＮＡ２５０μｇを、その大きさにより１５ｍ
Ｍ水酸化メチル水銀を含む変性１．４％「低融点（ＬＭ
Ｐ）Ｊアガロース中で電気泳動的に分離する（セクショ
ン（ｉｖ　）参照）。約７００〜８５０塩基の長さを有
するｍＲＮＡ約１０μｇがこのゲルから抽出により分離
される。このｍＲＮＡ４μｇをｃＤＮＡ合成に用い（セ
クション（ｖｉｉ）参照）、大腸菌に１２ＤＨ１中へ導
入する（セクション（ｉｘ）参照）、５３μｇ二重鎖ｃ
ＤＮＡを有する４、　３００形質転換細胞が得られる。

形質転換組ζ　Ｇ 胞は５′標識オリゴヌクレオチドＲＨ５とのコロニーハ
イブリッド形成により分析される（実施例２（ａ）参照
）。ハイブリット形成溶液中のオリゴヌクレオチドの活
性は０．７２μＣｉ／ｐｍｏｌの比活性で２　Ｘ　１０
’ｃｐｍ　／ｍｌである。１２形質転換細胞が分離され
、その組換え体プラスミドはオリゴヌクレオチドＲＨ５
とハイブリッド形成する。形質転換細胞の貯蔵培養のア
リコートで組換え体プラスミドを調製し、Ｐ　ｓｔｒ、
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＴ［ｌによる制限開裂により
地図が作られる。これらのプラスミドの１１個がプラス
ミドｐＲＨ３１とほぼ同様の制限パターンを有し、すな
わちそれらは各３８０ｂｐの１つのＢａｍＨＩ　／　Ｐ
ｓｔ　Ｉフラグメントおよび約１２５ｂＰの１フラグメ
ント、並びに約２９０ｂｐの１つのＨｉｎｄＴＩＴ／Ｐ
ｓｔＩフラグメントおよび約２ｏｏｂｐの１フラグメン
トを含む。ＰｓｔＴフラグメントの長さはそれぞれの場
合に約５００ｂｐである。′１つのプラスミドのみが異
なる制限地図を示し、すなわちそれは２８５ｂｐの１つ
のＯ ＢａｍＨＩ　／　Ｐｓｔ　Ｉフラグメントおよび約２７
５ｂｐの１フラグメント、並びに約４５０ｂｐの１つの
Ｈ４ｎｄＴＩｆ／ＰｓｔＴフラグメントおよび約１０５
ｂｐの１フラグメントを含む。偏位組換え体プラスミド
の挿入体の長さは約５５０ｂｐである。この組換え体プ
ラスミドはｐ　ＲＨ３４と称される。

その制限地図は第８図に示される。プラスミドｐＲＨ３
４はＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３５で寄託された。

ｉＣ１組換え体プラスミドｐＲＨ３４の挿入体のヌクレ
オチド配列 ｐＲＨ３４からのＰｓｔＴ−ｃＤＮＡフラグメントおよ
びｐＲＨ３４からの両ＢａｍＨＩ　／　Ｐｓｔｒフラグ
メントはＤＮＡをＰｓｔＩまたはＰｓｔＩとＢａｍＨＩ
で開裂し、アルカリ性ホスファターゼで処理した後プラ
スミドｐｔｒｃｔｓのＤＮＡ中でサブクローンする。そ
のように構築したＤＮ＾配列分析のだめの補助構築物で
ある組換え体プラスミドはｐ　ＲＨ１８０７（ＰｓｔＩ
フラグメン））　、ｐＲＨ１８０８（Ｎ−末端ＢａｍＨ
Ｔ　１ＰｓｔＴフラグメント）およびｐＲ＋（１８０９
（Ｃ−末端ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメント）と称さ
れる。サブクローンしたＤＮＡフラグメントの配列はマ
クサム・アンド・ギルバート（２２）に従って分析する
。組換え体プラスミドの配列化方策は第６図から知るこ
とができる。

ｐＲＨ３４からのｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチド
配列は第５図に示される。それは位置２５〜３０８のｐ
ＲＨ３１のｃＤＮΔＤＮＡの配列に等しい（第４図参照
）。しかし、ｐ　ＲＨ３４のｃＤＮＡ挿入体は５′一端
で１８４ｂｐ長い。これらの１４３ｂｐはｍＲＮ八と相
補性の配列に相当し、４１ｂｐはＰｓｔＩ制限部位を含
むｄＣＴＰによるｃＤＮＡのホモポリマーテーリングに
由来する。

＋１ アミノ酸５ｅｒ＝Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−ＰｈｅはＨ
ＵＳＩ−１インヒビターのＮ−末端と同定された。アミ
ノ酸コドンは分離されたＤＮＡ配列の５′−末端ヌクレ
オチドから推論すると読取り枠のこの部分中に停止コド
ンが８忍められない。従って、読取り枠中に出現するＡ
ＴＧは開始に関与し、ＣＵＳＴ−１タンパク質の出発を
コードする。

さらに、分泌タンパク質のシグナルペプチド構造は稀に
２５個のアミノ酸より長い。シグナルペプチド間の制限
部位および相当する天然タンパク質は最もしばしばアミ
ノ酸アラニン、セリンおよびグリシンの後に認められ、
従って、配列Ｇ１ｙ−８ｅｔが全く普通である。

頚部分泌物からのヒトＣＵＳ　Ｉ　−１タンパク質の一
次構造は従って１０４個のアミノ酸からなる。決定され
たヌクレオチド配列によりエンコードされるアミノ酸配
列は、本発明以前に単に不完全に知られた気管支杭ロイ
コプロテアーゼのＮ−末端アミノ酸配列（４Ｉ）に実質
的に等しい。

実施例３ 易　−のＣＵＳ　Ｔ　−１タンパク　の楚央（ａ）調節
可能λＰ１プロモーターの下流に全Ｃｌｌ５Ｌ−ＴｃＤ
ＮＡを含む発現プラスミドの構築開始するために、ＲＨ
６およびＲＨ７と称さコ　ソ れる２つの合成オリゴヌクレオチドを合成する。

それらは互いに相補性であり、最適リポソーム結合部位
（４２）に対する配列、５ａｌｌおよびＥｃｏＲＴ制限
部位並びに位置１〜位置１４のＣＵＳ　Ｉ　−ｒのコー
ディング領域のヌクレオチド配列をもつ。両オリゴヌク
レオチドを酵素Ｔ４−ポリヌクレオチドーキナーゼで５
′−末端をリン酸化し、１２％ポリアクリルアミドゲル
中で調製的に電気泳動的に分離し、ゲルから溶離し、Ｄ
Ｅ５２でクロマトグラフィーにかける。次のセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−５０上のゲルパーミ
ェーションクロマトグラフィー後、各オリゴヌクレオチ
ド１０ｐＬＩｌｏ＋を混合し、９０℃で変性し、室温で
徐冷することにより相互にハイブリッド形成させる。こ
の方法で次の二重鎖ＤＮＡフラグメントが得られる：第
２分離放分はプラスミドｐＲＨ３４の２１０ｂｐ　（Ｈ
ａｅＩＩＩ／　ＢａｍＨＩ　）フラグメントであり、そ
れはさらにＮ−末端領域をコードする。このため、プラ
スミドｐＲＨ３４，１０μｇを制限エンドヌクレアーゼ
ＨａｅｌｌｌおよびＢａｍＨＩで開裂し、５％ポリアミ
ドゲル中で電気泳動的に分離する。２１０ｂｐフラグメ
ントを次いでポリアクリルアミドゲルから溶離する。プ
ラスミドｐＲ８１８０７（第６図）は第３成分として、
従ってベクターとして作用するく第７図）。このため、
このプラスミド１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲ，Ｉおよび
ＢａｍＨＩで開裂する。ベクターフラグメントをアルカ
リ性ホスファクーゼで処理し、次いでフェノールで抽出
し、エタノールで沈殿させる。３成分を連結するため（
第７図）、合成オリゴヌクレオチドｌｐｍｏｌを互いに
／’％イブリッド形成させ、Ｎ−末端ＨａｅＴＩＩ　−
ＢａｍＨＩフラグメントＱＪｐｍｏｌおよびベクターＤ
ＮＡ０．０３ｐｍｏｌと混合し３０μβの反応体積で５
ＵＴ４−ＤＮＡリレガーゼで互いに連結させる。大腸菌
に１２株ＪＭ１．０１を形質転換に使用する。得られた
形質転換細胞のプラスミドを放射性標識オリゴヌクレオ
チドＲＨ６でハイブリッド形成することによりスクリー
ニングする。さらにＳａｌ　Ｉ、　ＥｃｏＲＩｉ；よび
ＢａｍＨＩに対する制限部位を調べ、相当するフラグメ
ントの長さを決定する。正しい新に構築されたプラスミ
ドはｐＲＨ１８１０（ＤＳＭ３９０５）と称される（第
７図）。

発現プラスミドを構築するため、ベクターｐＷＨ７０１
（２６＞１０μｇをＥｃｏＲＩおよび５ｐｈＩで開裂し
、脱リン酸し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿
させる。プラスミドｐＲＨ１８１０からＥｃｏＲＩ　−
３ｐｈ　Ｉフラグメントを調製するため、ＤＮＡ　１０
μｇをＢｃｏＲＴおよび５ｐｈＴで開裂する。生じた５
２５ｂｐフラグメントをゲル電気泳動により５％ポリア
クリルアミドゲルでベクターから分離し、ゲルから溶離
する。次いでＱ、３ｐｍｏｌのベクターｐＷＨ７０１お
よびｌｐｍｏｌのＥｃｏＲｌ−３ｐｈ　Ｉ　７ラグメン
トを互いに連結し、大腸菌に１２野性型Ｗ６へ案内する
。生じた形質転換細胞のプラスミドをプラスミド迅速分
析および次のアガロースゲル電気泳動により確認する。

組換え体発現プラスミドは挿入のない発現プラスミドよ
り２８０ｂｐ長い。新同定組換え体発現プラスミドはｐ
ＲＨ２４と称され、次の発現実験に使用される。第７図
に組換え体発現プラスミドｐＲＨ２４の構築図式が示さ
れる。

ｆｂ１発現プラスミドｐ　ＲＨ２４によるＣＵＳＩＩｃ
ＤＮＡの大腸菌Ｋｌ　２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８ｃ
ｌｔｓ中の発現（１５，２７）宿主菌株単独はλ−溶原
でなく、すなわち、それはλｃＩリプレッサーを含まな
い。温度感受性リプレッサーλｃｒ８５７に対する遺伝
子情報はプラスミドｐＲＫ２４８　ｃｌｔｓｌに局在化
され、それはまた宿主細菌にテトラサイクリン耐性を与
える（２７）。３０℃で、λＰ１．Ｐｔプロモーター写
が完全に抑圧される。４２℃で温度感受性ｃ１８５７リ
プレツサーがその不活性化形態中に存在し、Ｐｔプロモ
ーターの下流にある遺伝子が転写される。この大腸菌に
１２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８　ｃａｔｓを組換え体
発現プラスミドｐＲＨ２４で形質転換する。λＰＬＰｔ
プロモーター流にあるＣＵＳＩ−１遺伝子の発現を誘発
するため、Ｌ　Ｂ培地（２０μｓ／ｍｌテトラサイクリ
ン、５０／７ｇ／ｍｌｌアンピシリン）２００ｍ７Ｉに
大腸菌に１２ＭＣ１，０６１／ｐＲＫ２４８　ｃＩｔｓ
／ｐＲＨ２４の一夜培養３ｍｌを接種し、２８°Ｃで０
．７　Ａ　５７８単位／ｍｌの細胞密度まで培養する。

次いで培養をさらに４２℃で振とうする。タンパク質分
析を行なうため、発現の誘発前および誘発開始後種々の
間隔で細胞試料をとり、細胞（約１×１０９細胞）をＩ
Ａ５，１１単位当りに満たし、３分間１２，０００ｇで
遠心分離し、細胞沈降物を、さらにプロセッシングする
まで一２０℃に凍結する。

実施例４ 大腸菌に１２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８ｃＴｔｓ／ｐ
ＲＨ２４中のＣＵＳＩ−■タンパク質重１１びＪＬムＺ
バクｊ］旧朋１９確認−−−一一一一（ａｌラビット抗
ＨＵＳ　Ｉ−１抗血清との免疫交差反応試験 細胞沈降物を６０μｌ破壊緩衝液（５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、　ｐｌ（８，０，１１Ｍ−ＥＤＴＡ、　　２
％トリトン−Ｘ−１００）中に再懸濁し、４０μｌ還元
緩衝液（４％ＳＤＳ、４０％β−メルカプトエタノール
、２０％グリセリン、０．１％ブロモフェノールブルー
）を加える。次に試料を１００℃で５分間、次いで超音
波浴中室温で５分間、再び１００℃で５分間インキュベ
ートする。細胞破壊体積２０μｌを１３．５％５ＤＳ−
ポリアクリルアミド中で電気泳動的に分離し、免疫検定
のタメにニトロセルロース上に移す。ニトロセルロース
フィルターを、フィルター上の非特異的結合部位を飽和
するために「ブロッキング」緩衝液（５０ｎ＋Ｍ−Ｔｒ
ｉｓ−１（Ｃｊ！　、　ｐｌ　７．４．２００ｍＭ−Ｎ
ａＣｌｌ　、　０．０５％ツイーン２０．１．５％ゼラ
チン）で３７℃で１時間インキュベートする。

ウサギ抗ＨＵ　Ｓ　ｒ−１抗血清（「ブロッキング」緩
衝液中１：６００希釈）を第１抗体反応に用い（インキ
ュベーション：室温で２時間）、ヒツジ抗つサギＴｇＧ
−ペルオキシダーゼ結合体を第２抗体として用いる。ホ
ースラディソシ、：Ｌ　（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペ
ルオキシダーゼの基質反応をジアミノベンジジンで行な
う。

（ｂ）大腸菌中に発現されたプロティナーゼインヒビタ
ーの阻害活性試験 誘発（誘発開始６時間後）、および非誘発細胞試料を破
壊し、試験した。細胞沈降物（ＩＡ６，８単位細胞）を
５０μｌのリゾチーム破壊緩衝液（５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩｔ　、　ｐｉｆ　８．　Ｏｌｌ　ｍＭ−Ｅｒ）
ＴＡ、１■／ｒｒ＋１リゾチーム）中に懸濁し、室温で
１０分間インキュベートし、１５０μｌの５０　ｍＭ−
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｔ　、　ｐｉｆ　８．０．１ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡで希釈し、超音波浴中で室温で５分間インキュベ
ートする。非誘発および誘発細胞の粗抽出物のそれぞれ
２０μｌおよび８０μｌをキモトリプシン試験（３９）
で阻害活性について試験す６　只 る。試験結果は表１に示される。

表　　　　１ 大腸菌中に発現されたＣＵＳＩ−■ タンパク質の阻害活性の検出 ２０−＋　　　　　９９．２ ３Ｑ　　　　　　−＋　　　　　８９．７２　０　　　
　　　　　　　　　＋９　１．　２８０　　　　　　＋
　　　　　　　　　５６．４大腸菌からのキモトリプシ
ン非誘発粗抽出物の活性と比較すると、誘発細胞の細胞
抽出物による阻害がそれぞれ８％および３７％高い。

実施例５ 大腸菌に１２ＭＭ１０１中のβ−ガラクターゼ融合タン
パク質としてＣ−末端ｃｕｓｒ−ｒドメインの発現 第９図から知見できるように、ｃｕｓｒインヒビターの
構造は遺伝子内重複により形成される２つのドメインか
らなるタンパク質分子と記載することができる。大腸菌
中のＣ−末端ドメインの発現のために、Ｃ−末端の５９
個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列がプラスミドｐＵ
Ｒ２９０（２５）のβ−ガラクトシダーゼのＣ−末端を
エンコードするＤＮＡ配列で正しい読取り枠中に連結さ
れる。クローニング図式は第１０１ｍに示される。

プラスミドｐＲＨ３１，１０Ｍｇを制限エンドヌクレア
ーゼ５ａｕ３Ａで開裂し、５％ポリアクリルアミドゲル
中で調製的に分離し、３２０ｂｐＣＵＳＩ−１部分フラ
グメントをゲルから溶離する。ｐＵＲ２９０（１０Ｍｇ
）を酵素ＢａＩＩＩＨＩで開裂し、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理し、３２０ｂＰフラグメントで連結する。

第３の連結ＤＮＡをＣａＣｌ　を処理大腸菌に１２．７
Ｍ１０１細胞に導入する。クローンはＬＢ−ａｌｌｌｐ
ｌｌｌ様（１０ｇ／＃酵素消化カゼイン（シグマ）、８
ｇ／ｌＮａＣ１，５ｇ／７！酵母エキス（シグマ）、Ｉ
ＩＩＨ７，５，１００μｇ　／　ｍ　１アンピシリン）
上で選択する、ＣＵＳＩ−１部分フラグメントの２配向
が組換え体プラスミド中に可能であるので、プラスミド
迅速分析を次の１ｉｎｄＴＩｒ制限で行なう。プラスミ
ドが１６５ｂｐＨｉｎｄｌｌ［フラグメントを含むクロ
ーンをさらに分析する。これらのプラスミドの１つがｐ
　ＲＨ２１として示される。融合タンパク質発現の導入
のため、１００μｇ　／　ｍ　Ｉ！チアンシリンを含む
１００■Ｌ　Ｂ培地に、プラスミドｐＲ１＋２１で形質
転換した一夜培養からの大腸菌に１２ＪＭＩ　Ｏ１菌を
接種する。培養を３７°Ｃでインキュベートし、細胞成
長を５７８μｍでモニターする。

０．５の光学密度（５７８μｍ）で培養を５００μｎ。

ＩＴＰＴＧに調整し、さらに３７℃でインキュベートす
る。融合タンパク質の導入は時間に依存し、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析する。導入後、最初
に排他的にＣＵＳ　Ｔ　−１−β−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質が、後にまたβ−ガラクトシダーゼが形成
される。抗−ＣＵＳ　１−■抗体との免疫反応を示すた
めに、ＳＤＳゲル上で電気泳動的に分離した大腸菌粗抽
出物のタンパク質をニトロセルロースに移動させる。融
合タンパク質の特異的検出のためウェスターンプロット
分析を実施例４（ａ）記載のように行なう。融合タンパ
ク質は次のように分離し、精製する＝（３７）に従い、
Ｔ　ＰＴＧアナロゴンＴＰＥＧをＣＨ−セファロースに
結合させる。ＣＵＳＩ−■−β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を精製するために、プラスミドｐ　ＲＨ２１
を含む種大腸菌に１２ＪＭ１０１を５０μｇ／ｍ＃アン
ピシリンを有する１　＋２　Ｌ　Ｂ培地中で培養し、培
地を０．５ｍｎ＋ｏｌｌＰＴＧに調整することにより０
．５Ａｓｔｓ単位／ｍｌの細胞密度で誘発させる。１時
間後読発相を、培養を４℃に急冷することにより停止さ
せる。細胞を沈降させ（５，５ｇＭｆｔ、湿性）、溶解
緩衝液（２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ、　　ｐＨ７，
４，２０ｍＭ　−ＭｇＣ７！、　、２０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理により破壊
する。粗抽出物を約２０ｍｇ／ｍ＃タンパク質濃度およ
び１．６　ｍｏｌ　ＮａＣ＋２に調整し、ＴＰＥＧ−セ
ファロース−クロマトグラフィにかける。カラム物質を
＋１ ２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−Ｈ（１！、ｐＨ７，４，１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ−Ｍｇｃｐ、　、
１．６　ＭＮａＣｌ！で洗浄した後、ＣＵＳ　ｒ−Ｔ−
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を１００ｍＭホウ
酸ナトリウム、１．０ｍＭβ−メルカプトエタノール、
ｐＨ１０で溶離する。クロマトグラフィーはβ−ガラク
トシダーゼ活性の測定（４３）によりモニターする。１
１培養が８■の純ＣＵＳＩ−１−β−ガラクトシダーゼ
（９０％）を生じた。さらに精製融合タンパク質がまた
抗ＨＵＳｒ−Ｔ抗体と反応することが示された。

Ｃ−末端ＣＵＳ　Ｉ−Ｉドメインを開裂するため、その
ように精製された融合タンパク質を１０％または３０％
酢酸あるいは７０％ギ酸に溶解する。

酸感受性アスパラギン酸−プロリン結合の存在（ＣＵＳ
［Ｉのアミノ酸配列参照）が室温で２４〜３６時間の反
応後にＣ−末端ＣＵＳ　Ｉ　−Ｔドメインの４０〜６０
％の除去を生ずる。この酸処理後、この完全なＣＵＳ　
Ｔ　−ｒドメインをＧ−７５でゲル濾過により分離し、
精製することかできる。

発現Ｃ−末端ＣＵＳＩＩドメインのアミノ酸配列は次の
とおり読み取る： Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−へｒｇ−へｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　
Ｉ　ｙ−１，ｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ　−１、ｅｕ
−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｍｅ　ｔ−八５ｐ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−へｒｇ−へｓｐ−［、ｅ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅ
　ｔ−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｙｓ　−５ｅｒ−Ｃｙｓ
−Ｖａ　Ｉ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−ＶａＩ−Ｌｙｓ−八Ｉａ
−ＯＨ０ この配列は全ＣＵＳ　Ｔ−１タンパク質の位置５０〜１
０７と等しい。

実施例６ 大腸菌に１２ＪＭ１０１中のＣ−末端ＣＵＳＩ−■ドメ
インの発現□−−−−− 実施例５から知見できるように、Ｃ末端Ｃｌｌ５Ｉ−■
ドメインを大腸菌に１２ＪＭＩＯ１中にβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパク質として発現できる。第１１図に示
されるように、Ｃ−末端５９アミノ酸をエンコードする
ｃＤＮＡを、Ｃ−末端ＣＵＳ　Ｉ−Ｉドメインを生タン
パク質として発現させるために読取り枠中にプラスミド
ｐｓＰ６のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子のシグナル
配列に連結させる。プラスミドｐＳＰ６はＤＳＭに寄託
番号ＤＳＭ３９０４で寄託された。

プラスミドｐＲＨ１８６０，３０ｐｇをＢａｍ１１１お
よびＨｉｎｆＩで開裂する。ＤＮＡフラグメントを８％
ポリアクリルアミドゲル中で分離する。Ｃ−末端ドメイ
ンをコードする１７５ｂｐＣＵＳＩ−Ｉ−ＤＮＡフラグ
メントをゲルから溶離する。

突出ＤＮＡ端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメ
ントにより満たす。プラントエンドを有する１８２ｂｐ
二重鎖ＤＮＡ分子が得られる。

ベクターｐＳＰ６．３μｇを制限エンドヌクレアーゼ）
（ｉｎｄＩｌｒで開裂する。突出−重鎮ＤＮＡ端をムン
グビーンヌクレアーゼで分解し、５′−末端リン酸残基
をアルカリ性ホスファターゼで除去する。

そのように処理したベクター０．３μｍｏｌをＣ−末端
ＣＵＳ　Ｔ　−ｌ−ＤＮＡフラグメントｌ　ｐｍｏｌで
連結する。株大腸菌に１２ＤＨＩの形質転換コア　ζ ンピテン）（１７）細胞を、得られた連結生成物の１／
２で形質転換する。クローンをＬＢ−Ａ＋ｇｐ寒天平板
上で選択する。４クローンをオリゴヌクレチオドＡＨ１
２とのコロニーハイブリッド形成により同定する。クロ
ーンのプラスミドＤＮＡは用いたプローブと相補性のＤ
ＮＡ配列を含む。オリゴヌクレチオドＡＨ１２はＣＵＳ
ＴＩ−ｃＤＮＡクローンのヌクレチオド配列２４１〜２
５８と相補性である。それは配列： ５　’　ＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣ３’を
有する。

プラスミド迅速分析並びにＤＮＡのＨ４ｎｄＩ［＋およ
びＢａｍＨＩによる開裂により、クローンは挿入体とし
て５４０ｂｐＤＮＡフラグメントを含むと同定される。

このＤＮＡフラグメントはプロモーター領域Ｐｔａｃ　
、アルカリ性ホスファターゼの、Ｃ−末端ＣＵＳＩ−１
ドメインに対するｃ　ＤＮＡ配列のシグナルペプチド配
列からなる。そのように構築されたプラスミドはｐＢＡ
１７と称される。

次いでコンピテント大腸菌に１２ＪＭ１０１細胞を構築
発現プラスミドｐＢＡ１７のＤＮＡで形質転換する。Ｃ
−末端ＣＵＳ　Ｉ−１ドメインを発現するため、ＬＢ−
ＡＩＩｌｐ培地２５０ｍｌ１に、得られた形質転換細胞
を接種する。次いでインキュベーションを３７℃で行な
う。細胞成長を５７８ｎｍにおける濁りの測定によりモ
ニターする。０．９７の光学密度で、発現を誘発するた
めにＩ　ＰＴＯを０．５ｍＭの最終濃度に加える。ＩＡ
Ｓ。単位細胞のアリコートを発現の誘発前後に種々の時
間でとり（第■表参照）、１２，０００ｇで３分間遠心
分離し、細胞沈降物を一２０℃で貯蔵する。発現生成物
は次の配列で５９個のアミノ酸を有する：Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−八ｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈｒ−
Ｔｙｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−八ｓｎ−Ｐｈｅ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−＾ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−八ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　Ｉｙ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａ　］　−］５ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＬｙｓＡｌａ−ＯＲ０大腸菌中に
発現されたＣ−末端ＣＵＳ　Ｉ−１トメイ ン キモトリプシン阻害試験（３９）を実施例４記載のよう
に行なう。キモトリプシンに対する大腸菌阻抽出物の阻
害活性の増加を時間に依存してモニターする。それぞれ
の場合に大腸菌リゼイト（１００μ７りの半分を阻害活
性について試験する。結果は表■に示される。

表−１ ２０，６２４９０ ２４）５１，８８７５ ３２，００７７ １４，８３６７ ２６、５７６７ ３７，２４６７ ４９，５６６４ ５８，００６７ ６１０、６６６０ ２１１６、９６３７ 表■にブダペスト条約に従って寄託した微生物が示され
る。

表■ Ｂ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＭＣ１０６１ＤＳＭ　　　３
６３１８、　　ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＪＭＩＯＩ　　
　　　　　　八ＴＣＣ３３８７６Ｂ、　ｃｏｌｉ　　Ｋ
１２　　Ｄｌｌｌ　　　　　　　　　　　八ＴＣＣ３３
８４９巳、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｗ６　　　ＤＳＭ　　
　３６３２ｐＢＲ３２２八Ｔ［ｌ：Ｃ３１３４４ ｐＵｃ１８　　　　　ＤＳＭ　　　３４２４ｐＵＲ２９
０ＤＳＭ　　　３４１７ １］１１１１＋７０１　　　　　　　　　　ＤＳＭ　　
　　　　３６３３ｐＲＫ２４８ｃＴｔｓ　　　　　　　
　　　　　　　　八ＴＣＣ３３７６６ｐＲＩＩ３１　　
　　　ＤＳＭ　　　３６３４ｐＲＨ３４ＤＳＭ　　　３
６３５ ｐＳＰ６　　　　　ＤＳＭ　　　３９０４ｐＲＩ１１．
８１０　　　　　ＤＳＭ　　　３９０５皇１じり吠 （１）　Ｂｏｄｍｅｒほか、　Ｓｃｈｗｅｉｚ、　ｍｅ
ｄ、　Ｗｓｃｈｒ、、　　１４４．１３５９〜１３６３
　　（１９８４） （２）　　Ｌｅｗｉｓ＋　　Ｄ、八、、　　Ｂ！ｏｃｈ
ｅｍ、　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　　３　３％１７０
５〜１７１４．（１９８４） （３）　５ｃｈｉｅｓｓｌｅｒ、　Ｉｌ、ほか、　Ｂａ
ｙｅｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｖ、プロティナーゼインヒビター
ズ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）。

（Ｆｒ１ｚ、　　Ｉｌ、、　　Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ、　
　Ｉｌ、、　　Ｇｒｅｅｎｅ、　　Ｌ、Ｊ、。

Ｔｒｕｓｃｈｅｉｔ、　　［！、　　［）、　　ｐｐ、
　１４７〜１５５゜Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、
　Ｂｅｒｌｉｎ　　（１９７４）（４）　Ｗａｌｌｎｅ
ｒ、　Ｏ，ａｎｄ　Ｆｒ１ｔｚ、　　Ｈ，、ｆｌｏｐｐ
ｅｒ−３ｅｙｌｅｒ’ｓＺ、　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　　３５５．　７０９〜７１１（５）　Ｐｒ
１ｔｚ、■、ほか（１９７５）ニブロチアーゼおよび生
物学的制御（Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ　　）（Ｒｅ１ｃｈ、　　Ｅ
−＋　　Ｒｉｆｋｉｎ、　　Ｄ、Ｂ、　　ａｎｄ　Ｓｈ
ａｗ。

Ｌ＆ｉ）　　、　　７３７〜７６６．　　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （６）　Ｗａｌｌｎｅｒ、　０．ほか；生物体液のプロ
タイド（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ）（Ｐｅｔｅｒｓ。

Ｈ−編）　、　　２３．　１７７〜１　Ｂ　２．　　Ｐ
ｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、　　０ｘｆｏｒｄ　　（１
９７５）（７）　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、ほか、
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、±１゜５２９４〜５２９
９　　（１９７９） （８）　Ｔｈａｙｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、　　９８．　６０〜６３　　（１９７９
） （９）　Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、　ほか、　Ｎｕｃ
ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　９゜８７９〜８９４
　　（１９８１） （１０）　Ｃ１ａｒｋ、　１．、ほか、　Ｍｅｔｈ、　
Ｉ！ｎｚｙｍｏ１．＋　　６８＋４３６〜４４２　　（
１９７９） （１１）Ｇｅｒｓｈｏｎｉ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄ　Ｐａｒａ
ｄｅ、Ｇ、Ｅ、、Ａｎａｌ。

Ｒｉｏｃｈｅｍ、、　　ｌ　３１．　１〜１５　（１９
８３）（１２）　Ｔｏｗｂ（ｎ、　ｔｌ、ほか、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、−７＼−ヲ６．　　４３５０　〜４３５４　　
　（１９７９）（１３）　Ｇｕｂｌｅｒ、　　Ｕ、　ａ
ｎｄ　ｌｌｏｆｆｍａｎ、　　Ｒ６Ｊ、、　　Ｇｅｎｅ
、　２５　。

２６３〜２６９　　（１９８３） （１４）　Ｖｏｌｋａｅｒｔ、　Ｇ、ほか：分子遺伝学
の進歩（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　）＋　ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、
　Ｂｅｒｌｉｎ、　　２５５〜２５７　（１９８４）（
１５）　Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｃ
ｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　ＪｏＭｏｌ。

Ｂｔｏｌ、、１３８．　１７９〜２０７　　（１９８０
）（１６）　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ほか、　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　９゜３０９〜３２１　
　（１９８１） （１７）　Ｈａｎａｈａｎ、　ｎ、ｌ　Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、＋　　１６６゜５５７〜５８０　　（１９
８３） （１８）　ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、　Ｍ、Ｗ、ほか、　Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋１１０、　１１９　　（１
９７７） （１９）　　Ｂａ１ｌｅｙ、　　Ｊ、Ｍ、　　ａｎｄ　
Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　　Ｎ、、　　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　７０．　７５〜８５　　（１９
７６）（２０）　　Ｌａｅｍｍｌｉ、　　Ｕ、に、、　
　Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７．　６８０〜（２１）　　
Ｍａｘａｍ、　　八、Ｍ、　　ａｎｄ　　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ、　　Ｗ、、　　Ｍｅｔｈ。

Ｈｎｚｙｍｏｌ、、６５，４９９〜５８０　　（１９８
０）（２２）　Ｂｏｌｉｖｅｒ、　Ｆ、ほか、　Ｇｅｎ
ｅ、　　２．　９５〜１１．３（２３）　Ｙａｎｉｓｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，ほか、　Ｇｅｎｅ、　　３３゜
１０３〜１１９（１９８５） （２４）　Ｒ１１ｔｈｅｒ、　　１１．、　　Ｍｉｉｌ
ｌｅｒ−ｔｌｉｌｌ、　　Ｒ８＋　　ＲＭＲＯ−Ｊ、。

２．１７９１〜１７９４　　（１９８３）（２５）Ｃ，
Ｇａｔｚ＋　　Ｔｔｌ　Ｄａｒｍｓｔａｒｔ＋　　Ｄｉ
ｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ＋８９〜９３（１９８５） （２６）　Ｂｅｒｎａｒｄ、　Ｈ，Ｕ、ほか、　Ｇｅｎ
ｅ、　　５．　５９〜７６（２７）　Ｍａｎｉａｔｉｓ
、　Ｔ、ほか：分子クローニング：研究室マニュアル（
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　　八１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　）＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ。

１９４　　（］　９８２）　　；　　Ｂｏｎｎｅｒ、　
Ｔｊ、ほか、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　　８１．　１２３　（１９７３
）（２８）　Ｇ１１ｓｉｎ、　Ｖ、ほか＋　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ＋上１゜２６３３（１９７４，） （２９）　八ｖｉｖ、　　Ｈ，ａｎｄ　　Ｌｅｄｅｒ、
　　ｐ、Ｉ　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　　６９．　　１４０８　　（
１９７２）（３０）　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、Ｓ、、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
。

７７．５２０１　　（１９８０） （３１）　Ｓｕｇｇｓ、　Ｓ、Ｖ、ほか、精製遺伝子を
用いる発生生物学（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｕｒｉｆｉｅｄｇｅｎｅｓ
（Ｄ、　　Ｂｒｏｗｎ　　ｄＭ）　　＋　　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　　ＮｅｗＹｏｒｋ、　　６
８３　（１９８１） （３２）　Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ、　ａｎｄ　）Ｉｉｇａ
、＾＋ｌ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

■、１５９〜１６２　（１９７０） （３３）　１ｌａｒｄｉｅｓ、　　Ｓ、Ｃ，ほか、　　
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２５４　。

５５２７〜５５３４　　（１９７９） （３４）　　ｌｌｏｌｍｅｓ、　　Ｄ、Ｓ、　　ａｎｄ
　　Ｑｕｉｇｌｅｙ、　　Ｍ、　　八ｎａ＋。

、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１１４，１９３〜１９７　　
（１９８１）（３５）　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、ｔ
ｌ、、　　化学的および酵素的遺伝子合成（Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ）（）ｌ、Ｇ、　　Ｇａ５５ｅｎ、　　
人、　　ｆａｎｇ　　ｉ、！＞　　、　　１　　版、　
　ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（
１９８２）（３６）　Ｕｌｌｍａｎｎ、　Ａ、、　Ｇｅ
ｎｅ、　　２９　、２７〜３１（３７）　Ｐｒ１ｔｚ、
　１．ほか：酵素分析法（Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒｅ
ｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ　　八ｎａｌｙｓｅ　　）（
Ｈ，Ｉｌ、　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　　絹）。

３版、　１１０５　、　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、
　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（３８）　ＤｅｌＭａｒ、　　Ｂ、
Ｇ、　　ほか、　Ａｎａｌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　９
９　。

３１６〜３２０．（１９７９） （３９）　Ｐｅｌｈａｍ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｊａｃ
ｋｓｏｎ、　Ｒ，、Ｊ、、　Ｂｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　５ユ、２／１７〜２５６　（１
９７６）（４０）　Ｋｌａｓｅｎ、　Ｂ、Ｃ，ａｎｄ　
Ｋｒａｍｐｓ、　Ｊ、Ａ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍ、、　Ｉ　
２８．　２８５〜２８９（４１）　Ｇｕａｒｅｎｔｓ、
　　ｌ７．ほか、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２０９　。

１４２８〜１４３０　　（１９８０） （４２）　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｉｔ１１分子生物学実
験（ＩＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：ｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒしａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ
１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、　　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ。

（４３）　０ｈｌｓｏｎ、　　Ｋ、　　ほか、　　Ｈｏ
ｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’　ｓ　　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　３５７．　１２
４１〜１２４４（１，９７７） （４４）　ｔｌｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、　　Ｋ、　　
ほか、　　１ｌｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’　ｓＺ、　　
Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　３６２　、　１
３６９〜（４５）　　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｃ，Ｂ、　　ａ
ｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　　Ｄ、Ａ、、　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｊ、、　　２２５．　４６’３〜４７２　　（１９８５
）（４６）　５ｃｈｉｅｓｓｌｅｒ、　Ｉｔ、　　ほか
、ヒト多形核球の中性プロティナーゼ（Ｎｅｕｔｒａｌ
　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｏｆｌｌｕｍａｎ　　Ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｎｕｃｌｅａｒ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
ｓ　　）（Ｈａｖｅｍａｎｎ、　　Ｋ、　　ａｎｄ　　
Ｊａｎｏｆｆ、　　八、　　絹）、１９５〜２０７　、
　　Ｕｒｂａｎ　ａｎｄ　Ｓｃｌｖａｒｚｅｎｂｅｒｇ
、　　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

Ｍｕｎｉｃｈ　　（１９７Ｂ） （４７）　Ｆｒ１ｔｚ、　Ｈ，：壮健および疾患中のタ
ンパク質分解（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏ
ｎ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄＴｌｉｓｅａｓｅ　）
＋　Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ　７５　。

３５１〜３７９．発行Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ
。

！！１ｓｖｉｅｒ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｔ（ａｌｌａｎｄ　
（１９８０）（４Ｂ）　Ｂｅｒｎａｒｄ、　）１．−Ｕ
、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙｌＩｌｏ＋、、　　６
８゜４８２〜４９２　（１９７９） （４９）　Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ、　Ｌ、タンパク質化学
ニオケル近代的方法（Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　）（Ｔｓｃ
ｈｅｓｃｈｅ、　Ｉｉ、　Ｉ）　、　　２６７〜３０２
　、　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ、　Ｂｅｒ
ｌｉｎ、　Ｎｅｕ　Ｙｏｒｋ

【図面の簡単な説明】

第１図はＨ’ＵＳＩ−Ｉのトリプシンフラグメントのア
ミノ酸配列を示す図であり、 第２図はプラスミドｐＲＨ３１の制限地図であり、 第３図はプラスミドｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入の配列化
方策を示す図式であり、 第４図はプラスミドｐＲＨ３１のＣ１ＪＳｌ−ＴのｃＤ
ＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を示す図であり、 第５図はプラスミドｐＲＨ３４のＣＵＳＩ−Ｉ−ｃＤＮ
Ａフラグメントのヌクレオチド配列を示す図であり、 第６図はｐＲＨ１８０７のＰｓｔＴ挿入の配列化方策を
示す図であり、 第７図は発現ベクターｐＲＨ２４の構築図式であり、 第８図はプラスミドｐ　ＲＨ３４の制限地図であり・ 第９図はｃｕｓ　ｒ−ｒインヒビターの遺伝子的重複に
対する相同アプローチを示す図であり、第１０図はβ−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質として部分ＣＵＳＩ−
１配列の発現に対するクローニング方策を示す図であり
、 第１１図はＣ−末端ＣＵＳＩ−■ドメイン（−ＣＵＳ　
Ｉ−１第２ドメイン）の発現のための発現図面の；予相
：（内容に変更なし） ｉｇ−１ １５Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−Ａｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０　　　　　　　　１５ＡＡＣＡ ヒー−ＲＨ１＋ ＡＡ　　　　Ｇ ■ 〔 ＋　ＲＨ２＋ Ｔ４　　Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−ＡｌａＦｌｇ、　４ ｆｉＡＧＧ［Ｔ［ＴＧ［１ＡＧＴＣ［：Ｔ［ｉ［ＴＣＴ
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ＡＡＡＧＧＴＧＧＧＴ　Ｃ［Ｔ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｔ　（ｉ
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　　４０３ＡＧＧ＾ＧＧＡＡＡ［ＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡ
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Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　　　　４４８Ａ［Ｇ
ＧＴＣＡＡ［ＴＡＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＡ　ｃ　ｃ　ｃ
　ｃ　ｃ　ｃ　ｃ　ｃ　ｃ　ｃ　ｃ　［（Ｃ［［ｃ　ｃ
　ｃ　［：　　　　１，９３ＴＧＧＧＧＧＧ（ｉＧＧ（
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ＧＴＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣ（ｉＡＡＴＴＧＧＧＧ［１Ｔ
ＣＡ［（ｉＴＴ［Ｇ［Ａ［Ｔ［ｉＡＡ［ＴＴｃ＾６６＾
（ｆｉｃＡＡＡＧＧ（ｉ［ｉＡ［Ａ［ＴＴＴ［（ＧＡ（
ｉＡ［ＴＥＡ（ｉＧＡ［ｆｉＡ［ｉＡ［ＡＡ（ｉＡ（Ｔ
Ｔ（ｉ（ｉ［Ｔ［（Ａ［［［（［［［５４１Ｔ［Ｔ（ｉ
ＡＡＣ〔（ｉＡ（ｉ［１Ｔ（ｉ（ｉｆｉ（ｉ［ｉ［ｉ（
ｉ［ｉＦｉｇ−１０ Ｆｉｇ−１１ 昭和　　年　　月　　日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物のゲノムから、殊にヒトのゲノムから、
   誘導されること、第４図および（または）第５図記載の
   ＤＮＡ配列にハイブリッド形成すること、およびＨＵＳ
   Ｉ− I 型インヒビターの生物学的活性を有するタンパ
   ク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
2. （２）ＨＵＳＩ− I 型インヒビターの生物学的活性を
   有するエンコーデッドタンパク質がＣＵＳＩ− I タン
   パク質の生物学的活性を有することを特徴とする、特許
   請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列。
3. （３）第５図に示されるアミノ酸配列を有するタンパク
   質をコードすることを特徴とする、特許請求の範囲第（
   ２）項記載のＤＮＡ配列。
4. （４）組換え体プラスミドｐＲＨ３１（ＤＳＭ３６３４
   ）中にＰｓｔ I フラグメントとして含まれる第４図に
   示される配列を有することを特徴とする、特許請求の範
   囲第（２）項記載のＤＮＡ配列。
5. （５）組換え体プラスミドｐＲＨ３４（ＤＳＭ３６３５
   ）中にＰｓｔ I フラグメントとして含まれる第３図に
   示される配列を有することを特徴とする、特許請求の範
   囲第（２）項または第（３）項項記載のＤＮＡ配列。
6. （６）特許請求の範囲第（１）項〜第（５）項のいずれ
   か一項に記載のＤＮＡ配列にハイブリッド形成し、天然
   、半合成または合成由来であり、突然変異、ヌクレオチ
   ド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌ
   クレオチドセグメントの逆位による特許請求の範囲第（
   １）項〜第（５）項のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列
   に関し、ＨＵＳＩ− I 型インヒビターの生物学的活性
   を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、Ｄ
   ＮＡ配列。
7. （７）配列、 ５′ＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＡ
   ＧＴＣＣＡＧＣＧＧ３′ＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡ
   ＴＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣを有するＤＮＡフラグメ
   ント。
8. （８）特許請求の範囲第（１）項〜第（７）項のいずれ
   か一項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組換
   え体クローニングベクター。
9. （９）表現制御配列に適切に連結させる特許請求の範囲
   第（１）項〜第（７）項のいずれか一項に記載のＤＮＡ
   配列を含むことを特徴とする、組換え体発現ベクター。
10. （１０）表現制御配列が大腸菌ｌａｃプロモーター、大
    腸菌ｔｒｐプロモーター、大腸菌リポタンパク質プロモ
    ーター、λＰ＿ＬプロモーターまたはλＰ＿Ｒプロモー
    ター、酵母表現制御配列および他の真核細胞表現制御配
    列から選ばれることを特徴とする、特許請求の範囲第（
    ９）項記載の組換え体ベクター。
11. （１１）プラスミドｐＲＨ３１（ＤＳＭ３６３４）。
12. （１２）プラスミドｐＲＨ３４（ＤＳＭ３６３５）。
13. （１３）プラスミドｐＲＨ１８１０（ＤＳＭ３９０５）
    。
14. （１４）プラスミドｐＲＨ２４。
15. （１５）プラスミドｐＲＨ２１。
16. （１６）プラスミドｐＢＡ１７。
17. （１７）特許請求の範囲第（８）項〜第（１６）項のい
    ずれか一項記載の組換え体ベクターの１つにより形質転
    換されたことを特徴とする宿主生物。
18. （１８）種大腸菌の株、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕ
    ｂｔｉｌｉｓ）または他の細菌、サッカロミセス・セレ
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）、他の顕微鏡的小真菌、動物またはヒト細胞で
    あることを特徴とする、特許請求の範囲第（１７）項記
    載の宿主生物。
19. （１９）ＨＵＳＩ− I 型インヒビターの生物学的活性
    を有するタンパク質。
20. （２０）ＣＵＳＩ− I 型インヒビターの生物学的活性
    を有するタンパク質。
21. （２１）第（５）図に示されるアミノ酸配列を有するこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第（２０）項記載のタ
    ンパク質。
22. （２２）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】。 を有することを特徴とする、特許請求の範囲第（２０）
    項記載のタンパク質。
23. （２３）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】。 を有することを特徴とする、特許請求の範囲第（２０）
    項記載のタンパク質。
24. （２４）特許請求の範囲第（１７）項または第（１８）
    項に記載の宿主生物を普通培地中で培養し、場合により
    遺伝子生成物の発現を誘発させ、培養から形成された発
    現生成物を分離し、場合により発現生成物を制御酸加水
    分解により処理し、所望の生物学的活性タンパク質フラ
    グメントをゲルクロマトグラフィーにより水解物から分
    離することを特徴とする、特許請求の範囲第（１９）項
    〜第（２３）項のいずれか一項に記載のタンパク質を製
    造する方法。
25. （２５）ＨＵＳＩ− I 型インヒビターの生物学的活性
    を有するタンパク質、並びに普通の担体および（または
    ）希釈剤および（または）アジュバントを含む製剤組成
    物。
26. （２６）スプレーまたは吸入製剤とした、特許請求の範
    囲第（２５）項記載の製剤組成物。
27. （２７）慢性気管支炎、頚部の慢性炎症、過剰粘膜分泌
    による慢性炎症過程および生ずる緊急状態並びに高フィ
    ブリン溶解に基く術後出血の治療、並びにショックの早
    期治療処置のためのＨＵＳＩ− I 型インヒビターの使
    用。
28. （２８）慢性気管支炎、頚部の慢性炎症、過剰粘膜分泌
    による慢性炎症過程および生ずる急性緊急状態、高フィ
    ブリン溶解に基く術後出血の治療、並びにショックの早
    期治療処置法であって、上記疾患を患う患者に、ＨＵＳ
    Ｉ− I 型インヒビターの生物学的活性を有するタンパ
    ク質を前記症状の根絶に十分な量で投与することを特徴
    とする方法。