JPH08504580A

JPH08504580A - 組換え型イヌ胃リパーゼ及び医薬組成物

Info

Publication number: JPH08504580A
Application number: JP6513895A
Authority: JP
Inventors: ブランシャード，クレール; ベニクール，クロード; ジュニアン，ジャン−ルイス
Original assignee: アンスティチュ・ドゥ・ルシェルシェ・ジュヴェナル
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-16
Publication date: 1996-05-21
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: DE69333351T2; EP0674714B1; JP4084411B2; US5807726A; DK0674714T3; AU703179B2; FR2699179A1; DE69333351D1; AU5702994A; CA2151381A1; PT674714E; ES2213147T3; WO1994013816A1; FR2699179B1; EP0674714A1; ATE256189T1; CA2151381C

Abstract

(57)【要約】遺伝子工学により産生されるイヌ胃リパーゼ（ＣＧＬ）及びこの組換え型ＣＧＬをコードするヌクレオチド配列。本発明は同様に、特に個体の生体内でのリパーゼ分泌の不足さらには欠如に関連する病気の治療において使用するための、医薬組成物の製造における前記組換え型ＣＧＬの利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換え型イヌ胃リパーゼ及び医薬組成物本発明は、イヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）及びリパーゼ活性をもつこのもののその他のポリペプチド誘導体をコードする核酸、ならびに特にこれらのポリペプチドの産生を目的とするそれらの利用に関する。本発明は同様に、これらの核酸によりコードされるポリペプチド及び医薬組成物におけるこれらのポリペプチドの利用をも目的としている。ＤＧＬは、アミノ末端（ＮＨ₂末端）にシグナルペプチドを含む前駆体の形で合成され、イヌの胃の基底粘膜（fundic mucosa）の正中細胞（median cells）により分泌される、約４９キロダルトン（KD）の分子量の約３８０個のアミノ酸（ＡＡ）の糖タンパク 75-83〕。この酵素は、いわゆる「前十二指腸」リパーゼのファミリーに属しており、その中のいくつかのメンバーはすでに精製され、場合によってはクローニングすらされている〔Docherty A．J．P．et al.，Nucl．Ac．Res．13（1985）1891-1903 ；Bodmer M.W．et al.，Biochem．Biophys．Act．909（1987）237-244; Moreau H．et al.，Biochem．Biophys．Act．960（1988）286-293;欧州特許第０１９１０６１号及び第０２６１０１６号］。長い間、膵臓により産生された酵素の作用のおかげで小腸レベルで食物脂質の加水分解が行われるということが、既定のこととして見なされてきた〔Bernard C.，C.R．Acad．Sci．28（1849）249- 253〕。しかしながら、観察事実から、トリグリセリドの加水分解は前十二指腸酵素によって胃の中で起こりうるということも示唆された〔Volhard, F., Z. Klin. Me d. 42（1901）414-429; Shonheyder，F.及びVolquartz, K. Acta Physiol. Scan d. 9 (1945) 57-67 〕。これらの酵素、特にイヌの胃リパーゼは、これらを哺乳動物の膵リパーゼと区別する酵素的及び物理化学的特性を有している。胃リパーゼと膵リパーゼの間のこれらの差異は、基本的に次の点に関するものである：すなわち、分子量、アミノ酸組成、ペプシン耐性、基質特異性、作用の至適ｐＨ、及び酸性環境内での安定性である。その上、インビトロでは、或る種の条件下で、長鎖トリグリセリドの加水分解に対する胃リパーゼと膵リパーゼの間の作用の相乗性を明らかにすることができる〔Gargouri, Y. et al., Biochem．Biophys. Act. 1006（1989）255-271 〕。患者が、膵臓の外分泌、したがって食物の加水分解に必要な酵素（アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ）を全面的に又は部分的に欠いている病理状態（嚢胞性繊維症、膵外分泌機能不全）がいくつか知られている。腸レベルでの、脂肪、特に長鎖トリグリセリドの非吸収は、これらの患者において脂肪便症の非常に重大な増大という形で現われ、又若い患者においては体重増加のきわめて著しい減速という形で現われる。これを補正するため、このような患者に対しては、食事の時にブタ膵臓抽出物が投与される。これらの抽出物の治療的効能は、ＤＧＬが長鎖トリグリセリドに対し作用特異性を有することから、ＤＧＬを同時に処方することによって明らかに改善し得る。のEur. J. Biochem. 201, 75-83, 1991 に掲載された記事の中で記載されている。イヌの胃からこの酵素を抽出することを可能にする方法も、この刊行物の中に記載されている。この方法は、基本的に、酸性水性媒質（pH２．５）による抽出をイヌの胃に施すことから成り、リパーゼ抽出物を水溶性塩の添加により沈殿させ、次に分子ふるい上でのろ過、そしてそれに続くイオン交換クロマトグラフィによる分離ならびにゲルろ過によって、リパーゼを含む溶出分画を回収する。これらの方法によって得られた精製ＤＧＬは、Laemmliの技術に従えば４９，０００ダルトンの分子量を有し、そのうち６，０００は糖に相当し、４３，０００はタンパク質に相当する。イヌの胃の調達が困難であるという明らかな理由から、実験室レベルでも工業的レベルでもこの方法の開発はことごとく妨げられている。このような理由で、イヌの胃の利用を回避し、ＤＧＬの大量生産を可能にする方法を見い出す必要性が生まれた。本発明はまさに、原料調達上のあらゆる問題を無くし、有利な原価でＤＧＬを工業規模で生産することを可能にすることを目的としている。本発明は、１９９１年１１月１３日に提出され、２６８３５４９という番号で公告されたフランス特許出願書の中に記載されたウサギの組換え型胃リパーゼのヌクレオチド配列に対応するプローブを用いた、ＤＧＬをコードする伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のクローニングの後に、このｍＲＮＡのヌクレオチド配列を本発明者が発見したことに由来する。本発明は、以下に凡例を示す図１〜１２を用いて、より特定的に例示される：図１：ウサギ、ヒト及びラットの胃リパーゼ前駆体の切断領域のポリペプチド配列、及びイヌ胃リパーゼのＮＨ₂ 末端配列（配列番号１１）との比較。図２Ａ：ＤＧＬの前駆体の切断領域をコードする、そのウサギ、ヒト、ラットの相同物（ホモログ）の比較に基づく縮重オリゴヌクレオチド（ＤＧＬ₁）の設計。図２Ｂ：オリゴヌクレオチドＤＧＬ₁（配列番号７）及びＤＰＬ₂（配列番号８）の配列。図３：クローン３．１２の地図。図４：ベクターｐB1uescript ＫＳ（＋）へのＤＧＬのクローニング及びｐＫＳＰＣＲへのクローン３．１２の「Ｈ」フラグメントのサブクローニングの図：クローンｐＫＳＤＧＬ１０の作製。図５：プラスミドベクターｐＲＵ３０３の制限地図。図６：プラスミドｐＲＵ３０３のＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列。図７：発現ベクターｐＲＵ３０３へのイヌ胃リパーゼのｃＤＮＡのサブクローニング及びプラスミドｐＤＧＬ５．３０３の構築。図８：成熟型ＤＧＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）。図９Ａ：成熟ＤＧＬのポリペプチド配列（配列番号３）。図９Ｂ：ＨＧＬ（ヒト胃リパーゼ）及びＤＧＬのポリペプチド配列の比較、及び相同性（％）の決定。図９Ｃ：ＲＬＬ（ラット舌リパーゼ）及びＤＧＬのポリペプチド配列の比較、及び相同性（％）の決定。図９Ｄ：ＲＧＬ（ウサギ胃リパーゼ）及びＤＧＬのポリペプチド配列の比較、及び相同性（％）の決定。図１０：プラスミドｐＤＧＬ５．３０３の構築のためのオリゴヌクレオチドプライマーＤＧＬ₂（配列番号９）及びＤＧＬ₃（配列番号１０）を用いた「ＰＣＲ」技術によるＤＧＬのｃＤＮＡのインビトロ突然変異誘発。図１１：プラスミドｐＤＧＬ５．３０３により形質転換されたE. coli（大腸菌）Ｗ３１１０Ｉ^qにおいて、ＩＰＴＧの不在下又は存在下で合成されたタンパク質の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析。図１２：プラスミドｐＤＧＬ５．３０３により形質転換されたE. coli Ｗ３１１０Ｉ^qに由来するタンパク質をナイロン膜上に「ウェスタン」式にトランスファーした後の、これらの細菌において合成されたＤＧＬの、特異的抗体を用いた免疫検出。かくして、本発明は、図８（配列番号１）に表されたＤＮＡフラグメントの全部又は一部分、より特定的には図８に表されているＤＮＡの位置１及び１１３７（配列番号２）にあるヌクレオチドによって限定されたＤＮＡフラグメントの全部又は一部分を含み、このＤＮＡフラグメントは図９Ａに表されているアミノ酸配列の位置１及び３７９（配列番号３）にあるアミノ酸により限定されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドが成熟ＤＧＬに対応することを特徴とする、あらゆる核酸に関する。上述の及び以下で用いるＤＧＬという表現は、イヌの胃粘膜又は前胃粘膜により分泌される全てのリパーゼのことを意味する。上述の核酸は、図８の位置１及び１１３７にあるヌクレオチドにより限定されたＤＮＡフラグメントの上流に、メチオニンをコードするＤＮＡフラグメント（より特定的にはＡＴＧ配列）をも含んでいてよい（配列番号４）。本発明は同様に、位置１１３７の下流にＳＴＯＰコドン、特に図８（配列番号６）の位置１１３８、１１３９及び１１４０にあるヌクレオチドにより限定されている配列で構成されているものを有する上述のＤＮＡフラグメントをも目的としている。ＤＧＬは、今日までに精製又はクローニングされてきた全ての胃リパーゼと同様、成熟タンパク質のポリペプチド配列に先行するシグナルペプチドから成る前駆体の形で合成される。一般的に、本発明は、上述のＤＮＡフラグメントの１つの上流に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、あらゆる核酸に関する。上述の二本鎖核酸と反対に、本発明は同様に、上述のＤＮＡフラグメントを構成する２つの相補的ヌクレオチド配列の一方又は他方で構成される一本鎖核酸をも目的とする。本発明は同様に、特に本発明に従ったＤＧＬのｃＤＮＡのクローニングについての以下の詳細な説明において言及されるハイブリダイゼーション条件下で、上述の一本鎖核酸とハリブリダイズすることのできるあらゆる核酸にも関する。本発明に従ったポリペプチドをコードし、かつ、遺伝暗号の縮重によって上述のヌクレオチド配列と異なっているヌクレオチド配列をもつ全ての核酸も同様に本発明の範囲内に入る。本発明の主題は、上記核酸に関して非相同のＤＮＡ分子内に挿入された、本発明に従った上述の核酸を含むことを特徴とする全ての組換え型核酸にもある。このため、本発明の主題は、より特定的には、本発明に従った核酸の上流にあって、その制御下で上記核酸の転写が行われうるようなプロモーター、ならびに上記核酸の下流にある転写終結シグナルをコードする配列を含んでいる、全ての組換え型核酸を目的としている。本発明は同様に、その複製にとって非必須の部位の１つに挿入された前述の組換え型核酸を含むことを特徴とする、全ての組換え型ベクター、特にプラスミド、コスミド又はファージタイプの組換え型ベクターにも関する。本発明に従った組換え型ベクターは、有利にも、その複製にとって非必須の部位の１つに、細胞性宿主での本発明に従った核酸の発現を促進し制御するために必要な要素、そしてより特定的には、細胞性宿主のポリメラーゼにより認識されるプロモーター、特に誘導可能なプロモーターを含んでいることを特徴とする。本発明は同様に、上述のような組換え型ベクターにより形質転換され、本発明に従ったｃＤＮＡ又は遺伝子の発現を可能にする調節要素を含む、原核生物又は真核生物タイプのあらゆる細胞性宿主にも関する。本発明に従った組換え型ベクターにより形質転換されうる細胞性宿主の一例としては、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞、バキュロウイルスタイプの組換え型ウイルスによる感染を受けうる昆虫細胞、Aspergillus niger又はory zaeのような糸状菌類、Saccharomyces cerevisiae又はKluyveromyces lactisのような酵母、ならびにE. coli（グラム陰性菌）又はB. subtilis（グラム陽性菌）のような細菌、を挙げることができる。本発明は同様に、以下ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術と呼ぶＤＮＡ鎖増幅技術による本発明に従った核酸の合成のために利用可能なＤＮＡ（又はＲＮＡ）のプライマーをも目的としている。この技術は、米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号ならびに欧州特許第２００，３６２号の中でより特定的に記載されている。本発明に従ったプライマーは、有利には、上述のＤＮＡフラグメントを構成する２本のストランドのうちの一方の３′及び５′末端に対応する約１５〜４０個のヌクレオチドで構成されている。本発明は同様に、本発明に基づく上述のＤＮＡフラグメントを構成する２本のストランドのうちの一方又は他方に由来するヌクレオチドプローブ、ならびに、特にＤＧＬが生物学的試料中に存在する可能性がある場合のその検出のための、これらのプローブの利用をも目的としている。有利には、本発明のプローブは、約１７〜２３個のヌクレオチドで構成されている。試料中のＤＧＬの存在の検出は、好ましくは、上述のプライマーを用いて試料中に存在しうるＤＧＬをコードするｍＲＮＡ又は遺伝子のコピーを増幅した後に実施される。このため、本発明は同様に、 − 場合によって、上述のとおりのプライマー、ならびにＤＧＬをコードするＲＮＡ又はＤＮＡの配列の増幅の実施に好適な媒質の調製のための試薬、 − 場合によっては特に放射性物質又は酵素により標識された、上述のとおりのヌクレオチドプローブ、ならびに上述のＲＮＡ又はＤＮＡ配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションの実施に好適な媒質の調製のための試薬、 − 前記配列とハイブリダイズしたプローブの検出を可能にする試薬、を含む、上述の検出方法を実施するためのキットにも関する。有利には、本発明のヌクレオチドプローブは、ＤＧＬをコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列と、ヒト胃リパーゼ（ＨＧＬ）及びウサギ胃リパーゼ（ＲＧＬ）をコードするものとの両方とハイブリダイズすることができる。かかるプローブは、ＨＧＬを含んでいる可能性のある生物学的試料の中にＨＧＬが存在する場合に、それをインビトロで検出する方法を実施するためにも利用可能である。このような検出方法は、上述の要領で実施され、生体内の胃リパーゼの過剰産生、又は逆にその産生不足、ひいては産生欠如に関係する病気のインビトロ診断を可能にする。本発明は同様に、一般的な遺伝暗号に従って上述の本発明に従った核酸に対応するポリペプチド、又はこれらの組換え型ポリペプチドのあらゆるフラグメント、又はこれらの組換え型ポリペプチドの単数又は複数のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は削除によって改変された全てのポリペプチドであって、かつこれらの改変されたポリペプチド又はフラグメントが上述の組換え型ポリペプチドの酵素的特性を保っている、ポリペプチド又はフラグメントをも目的としている。「組換え型ポリペプチド」というのは、有効な細胞性宿主の内部で適切な調節要素の制御下で対応するＤＮＡ配列の転写及び翻訳によって、遺伝子工学を通して産生されうるようなポリペプチド鎖を有するあらゆる分子のことである。従って、「組換え型ポリペプチド」という表現は、これらのポリペプチドがグリコシル化のような翻訳後修飾を受けている可能性を排除するものではない。「組換え型」という語は、ポリペプチドが遺伝子工学を通して産生されたこと、より特定的にはこのポリペプチドが宿主内で利用される発現ベクター内に予め導入された核酸配列のこの宿主内での発現の結果としてもたらされたという理由で遺伝子工学によって産生されたということを暗に意味している。ただし、この表現は、ポリペプチドが、異なる方法、例えばタンパク質合成のために従来利用されている方法に従った古典的化学合成による方法又はさらに大きいサイズの分子の分割による方法により産生される可能性を排除するものではない。本発明は同様に、生物学的に純粋な形の上述のポリペプチドも目的としている。「生物学的に純粋な」という表現は、一方では医薬組成物の製造に組換え型ポリペプチドを利用できるようにする純度を、又他方では夾雑物質、より特定的には天然の夾雑物質の欠如を意味すると考えるべきである。このため、本発明は、より特定的には、 − 図９Ａに表されているアミノ酸配列の位置１〜３７９（配列番号３）にあるアミノ酸によって限定され、遺伝子工学によって得られる成熟ＤＧＬに対応するポリペプチドであって、その分子量が、それを産生する宿主が上記ＤＧＬポリペプチド鎖に翻訳後修飾を行うか否かによって約４３，２００ダルトンから約５０，０００ダルトンまで変化する、ポリペプチド、 − 前に１つのメチオニンが先行するアミノ酸配列をもつ上述のポリペプチド（配列番号５）、に関するものである。有利には、本発明に従った上述のポリペプチド、より特定的には組換え型ＤＧＬは、Gargouriの方法（本発明についての以下の詳細説明の中にさらに特定的に記載されている）に従って基質として短鎖トリグリセリド（例えばトリブチリン）を用いて測定した場合にポリペプチド１mgにつき約５０Uから７５０Uの間、好ましくは２５０U以上の脂肪分解活性を有する。１単位(U)は、３７℃で１分あたり１μmolのＨ⁺イオン（つまり遊離脂肪酸の）を遊離させるために必要な酵素の量に相当する。長鎖脂肪酸に対する本発明に従った組換え型ポリペプチドの最大脂肪分解活性は、有利にも、３〜５のｐＨ値で得られる。本発明の組換え型ポリペプチドの別の有利な側面に従うと、それらの脂肪分解活性は、pH２で３７℃での１時間のインキュベーションの後も不変のままである。本発明は同様に、上述のようなポリペプチドの調製方法にも関し、この方法は、 − 適切な培地中で、上述のような組換え型ベクターによって形質転換された細胞性宿主を培養する工程、及び − 前記細胞性宿主により産生されたポリペプチドを、このポリペプチドをコードする配列の前にシグナル配列が先行し、かつ細胞性宿主が培地中にポリペプチドを分泌することができる場合には前記培地から直接（特に真核細胞及び酵母の場合）、又は細胞性宿主の溶解の後（特に細菌の場合）、回収する工程、という一連の工程を含む。場合によっては、回収工程の後には回収されたポリペプチドの精製工程が続き、特に細菌の溶解による回収の後にはポリペプチドの可溶化工程、そして次にその再生が続く。封入体の形で得られたポリペプチドの可溶化のための作用物質及び技術は、当業者にとって周知のものである。基本的には、可溶化剤は、尿素、N.K．Puri及び共同作業者によりBiochem．J．（1992）285，871-879に記載されているもののような実験的手順において利用される塩化セチルトリメチルアンモニウム又は塩化グアニジニウムのような第４級アンモニウムのハロゲン化物である。有利にも、すでに前述したとおり、産生が求められており、かつ宿主細胞を形質転換するために利用されるベクター内に挿入されている、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の前には、シグナル配列が先行しており、かくして宿主細胞の外への産生されたポリペプチドの分泌、及びこれらの宿主細胞の溶解を実施する必要なしに培地から直接これらを回収することが可能となっている。一例を挙げると、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞での成熟ＤＧＬの合成は、適切な発現ベクター中にＤＧＬ前駆体をコードする核酸を挿入することによって得ることができる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントの存在により、細胞の機構によって、小胞体の中でグリコシル化し、生物学的に活性な形で培地中にＤＧＬを分泌させることが可能となる。代替的には、昆虫細胞によるイヌ胃リパーゼの産生を、これらの細胞に感染することのできるバキュロウイルスタイプのウイルスのゲノム内の適切なプロモーターの後ろにＤＧＬ又はその前駆体をコードするｃＤＮＡを挿入することによって、得ることができる。 Saccharomyces cerevisiae又はKluyveromyces lactisのような酵母によりＤＧＬを産生させ、分泌させるためには、ｃＤＮＡ中で、ＤＧＬのシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを、酵母タンパク質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントにより置換することが好ましい。かくして得られた組換え型ｃＤＮＡを、次いで考慮対象の宿主のための特異的発現ベクターの中に導入する。かかる発現システムは、今や比較的一般的なものである。例えば、ヒト血清アルブミンの発現（欧州特許第０３６１９９１Ａ２号）又は子ウシキモシンの発現〔Van den Berg J.A．et al.，Biotechnology 8（1990）135-139〕を挙げることができる。 Escherichia coliは、培地中へのタンパク質分泌現象が著しく減少している、壁を有するグラム陰性菌である。真核細胞タンパク質のシグナル配列に類似したシグナルの存在のおかげで、一定数のタンパク質が細菌周辺質の中に蓄積される。これらのタンパク質としては、例えば遺伝子ｐｈｏＡ及びｍａｌＥの産物を挙げることができる。これらの遺伝子のいくつかの領域は、E．coliの周辺腔内に非相同タンパク質を産生させるために利用された。しかしながら、外来性タンパク質の細胞質内合成が、E．coliにおいて最もよく知られ、最も利用されているシステムであり続けている。プラスミドの構築を実現する際に実験から演鐸されたいくつかの規則を遵守することにより、目的のタンパク質の発現レベルを最適化することができる。最初に、ＤＧＬの成熟型部分をコードするｃＤＮＡ、すなわち、シグナルペプチドをコードするセグメントが備わっていないｃＤＮＡを、強力な細菌又はファージプロモーターの後ろに配置するのが適切である。細菌において外来性タンパク質が場合によっては有毒であるという問題を避けるため、好ましくは、化学物質（Ｌａｃ又はＴｒｐプロモーター）又は温度変化のような物理的因子（Ｐ_Lプロモーター及びｃＩ８５７リプレッサー）によって誘導可能なプロモーターを選択する。ｃＤＮＡは、その５′末端領域において、伝令ＲＮＡ上でのタンパク質合成の開始を規定するＡＴＧ配列に隣接していなくてはならない。このイニシエーターＡＴＧの前には、６〜１２塩基対の距離のところに、Shine-Dalgarno（シャイン−ダルガルノ）領域と呼ばれ、伝令ＲＮＡ上でリボソーム結合部位に対応している、プリンの豊富な領域が先行している。 Shine-Dalgarno領域とイニシエーターＡＴＧとの間にあるＤＮＡセグメントの配列は、伝令ＲＮＡ上の開始コドンＡＵＧのまわりの二次構造の要素を減少させるように、その組成を改変することができる。必要な改変がもたらされると、ベクターは適切な宿主の中に導入される。本発明は、本発明に基づくポリペプチドに対して向けられた抗体、より特定的には、ＤＧＬに対して向けられ、かつＨＧＬ及びＲＧＬをも認識することのできる抗体に関する。かかる抗体は、これらのポリペプチドを用いて動物を免疫し、その後形成された抗体を回収することによって得ることができる。当然のことながら、この製造はポリクローナル抗体に制限されているわけではない。これは又、一方では本発明の精製されたポリペプチドの１つに対して免疫された動物、特にマウス又はラットの脾細胞と、他方では適切な骨髄腫細胞とから、従来の方法により形成され得、かつ動物の免疫のために当初使用したポリペプチドならびにＨＧＬを認識するモノクローナル抗体を産生するその能力により選択され得るあらゆるハイブリドーマによって産生されたあらゆるモノクローナル抗体にも適用される。本発明は同様に、ＤＧＬ又はＨＧＬを含んでいる可能性のある生物学的試料の中のＤＧＬ又はＨＧＬを検出するか又はアッセイする方法を実施するための、これらの抗体の利用をも目的としている。本発明は、さらに特定的には、生体中でのリパーゼの過剰産生、又は逆に産生不足、さらには産生欠如に関連する病気のインビトロ診断方法の実施のための、これらの抗体の利用に関する。患者から採取された生物学的試料を用いて実施されるこのインビトロ診断方法には、この試料を入れる工程、そしてこの工程でＨＧＬ−抗体複合体が形成された場合にそれを検出する工程が含まれている。このため、本発明は同様に、 − 放射性物質又は酵素により有利にも標識づけされた上述のとおりの抗体、ならびにこれらの抗体とＨＧＬとの間の免疫学的反応の実現に好適な媒質を構成するための試薬、 − これらの抗体とＨＧＬとの間で形成された免疫学的複合体の検出を可能にする試薬、を含む、上述のインビトロ検出又は診断方法の実施のためのキットにも関する。本発明は同様に、胃リパーゼの産生レベルに影響を及ぼすか又は及ぼさない単数又は複数の病気を患っている個体又は健康な個体によって摂取された動物性又は植物性油脂の吸収を容易にすることを目的とし、特に経口的に利用できる医薬組成物を得るための、上述の単数又は複数のポリペプチドの利用にも関する。特にこれらの組成物は、油脂の吸収メカニズムを変える医療を受けている患者、或いは高齢者において有利に利用される。本発明は、さらに特定的に言うと、生体内のリパーゼ産生の不足、さらには欠如に関連する病気、より特定的には嚢胞性繊維症及び膵外分泌機能不全のような病気の治療を目的とする薬剤を得るための、上述の単数又は複数のポリペプチドの利用を目的としている。本発明は同様に、場合によってはリパーゼ活性をもつその他の単数又は複数のポリペプチドと組合わせて、薬学的に受容可能な賦形剤と組合わせた形での、本発明に従った少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物をも目的とする。本発明に従った医薬組成物は、好ましくは経口投与可能であり、特にゼラチンカプセル、錠剤又は溶解用散剤の形を呈している。人間の場合の一日の投薬用量は、有利には、好ましくは主要な食事の時に配分して、約４００ｍｇ〜約１，２００ｍｇ、つまり食事一回につき約１３０ｍｇ〜約４００ｍｇである。本発明は同様に、特に固体支持体上に固定された形での、酵素による生物的変換（例えば酵素的加水分解、エステル交換）の実施のための、本発明に従った上述のとおりのポリペプチド又はその他全ての哺乳動物胃リパーゼ及びそれらの誘導体の利用にも関する。本発明の核酸の調製に関しては、特に以下の方法のうちの１つに従って、化学的に行うことができる。化学的手段による本発明の核酸（最大２００のヌクレオチドを含む）の適切な調製様式には、以下の工程が含まれている： − Bioorganic Chemistry 4；274-325，1986に記載されている自動化されたβ −シアンエチルホスホルアミダイト法を用いてＤＮＡを合成する工程、 − かくして得られたＤＮＡを適切なプラスミドベクターにクローニングし、適切なプローブを用いてハイブリダイゼーションによりＤＮＡを回収する工程。２００ヌクレオチド以上の長さの核酸の、化学的手段による調製様式は、以下の工程を含んでいる： − Proc．Nat．Acad．Sci．USA 80；7461-7465，1983の中に記載されている原理に従った天然のポリペプチドのアミノ酸リンケージ（連鎖）と相容性のある配列をもつ種々の制限部位をその端部に備えた、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを組立てる（アッセンブリー）工程； − かくして得られたＤＮＡを適切なプラスミドベクターにクローニングし、適切なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより求める核酸を回収する工程。本発明は、本発明に従った組換え型ベクターの構築及びＤＧＬ産生のためのそれらの利用についての以下の詳細説明を用いて、さらに特定的に例示される。ＲＮＡ調製物は、イヌの胃の基底領域から分離した粘膜から調製した。オリゴ −ｄＴセルロースカラム上でのアフィニティクロマトグラフィにより単離した伝令ＲＮＡを、特定の酵素、すなわちラウス肉腫ウイルスの逆転写酵素及びE．col i のＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を利用して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換した。ある種の修正の後ベクターｐＵＣ１８にこのｃＤＮＡを導入し、細菌E．coliＭＭ２９４を形質転換するためにこの組換え型分子を利用した。放射性物質で標識されたウサギ胃リパーゼのｃＤＮＡを含むプローブを用いて、インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーションにより、形質転換体クローンをスクリーニングした。オートラジオグラフィの後、ハイブリダイゼーション実験の際の陽性シグナルに対応する細菌コロニーを単離し、それらの細胞質中に存在するプラスミドＤＮＡを増幅し、精製した。得られたクローンをスクリーニングした後、クローン３．１２を選択し、配列決定した。このクローンは、１２０１塩基対のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサートを含んでおり、このインサートは、それ自体制限部位ＰｓｔＩにより２つの等しくない部分Ｈ及びＬに分割される。完全なｃＤＮＡを含むクローンを明らかにすることは、この段階ではできなかった。成熟型のイヌのリパーゼをコードするｃＤＮＡを含むクローンを単離するためには、補足的な技術を利用した。出発調製物に由来するｍＲＮＡの分画を、逆転写酵素と、予め単離され配列決定されたクローン３．１２に含まれるｃＤＮＡの３′末端配列から得たオリゴヌクレオチドプライマーＤＰＬ₂（図２Ｂ）とを用いて、一本鎖ｃＤＮＡに変換する。ＤＧＬの成熟型部分をコードするｃＤＮＡを次に得、Ｔａｑポリメラーゼと、上述のとおりのＤＰＬ₂ならびにヒト胃リパーゼ及びウサギ胃リパーゼ、ラット舌リパーゼの５′末端ヌクレオチド配列とＤＧＬの既知のＮＨ₂末端タンパク質配列との比較に基づいて設計されたＤＧＬ₁という２つのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、ＰＣＲ方法により増幅する。かくして得られた二本鎖ｃＤＮＡを、ある種の修正の後にベクターｐBluescri pt ＫＳ（＋）中に導入し、この組換え型分子を利用して細菌E．coliＭＭ２９４を形質転換した。形質転換体クローンは、インサートのどちらかの側にあるベクターｐBluescript ＫＳ（＋）の配列の部分に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＣＲによりスクリーニングした。７００塩基対のインサートを含むクローンｐＫＳＰＣＲを選択し、配列決定した。これと並行して、制限酵素ＰｓｔＩによる消化の後、以前に得られたクローン３．１２のｃＤＮＡのインサートの「Ｈ」フラグメントを、ＰｓｔＩによって線形化したプラスミドｐＫＳＰＣＲ中に挿入する。成熟イヌ胃リパーゼをコードするｃＤＮＡを含むクローンｐＫＳＰＣＲ１０が得られる。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析により、分子量が４３２２２ダルトンで３７９ＡＡのタンパク質に対応する１１３７ヌクレオチド（ＮＴ）のオープンリーディングフレームを明らかにすることができた。その他の前十二指腸リパーゼのヌクレオチド配列との比較〔Docherty，A．P． J．et al．（1985）前掲書中；Bodmer，M．W．et al．（1987）前掲書中；Morea u，H．et al．（1988）前掲書中〕により、コーディング領域内で、ＨＧＬとは８４．７％、ＲＬＬ（ＲＡＴＬＬ）とは７５．７％、そしてＲＧＬとは８１％の相同性が明らかになっている。代替的には、第２の方法を、成熟ＤＧＬをコードするｃＤＮＡを含むクローンを得るために利用することが可能である。オリゴ−ｄＴカラム上でのアフィニティクロマトグラフィにより単離され、特定の酵素（ラウス肉腫ウイルスの逆転写酵素及びE．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ）の利用によりｃＤＮＡに変換された、イヌの胃粘膜から抽出したｍＲＮＡが、成熟ＤＧＬ又はその前駆体の全ｍＲＮＡに対応する場合、かくして得られたｃＤＮＡを、ある種の修正の後、ベクターｐＵＣ１８中に導入し、この組換え型分子を、宿主細胞、好ましくは細菌又は酵母を形質転換するのに利用することが可能となる；形質転換体クローンは、ウサギ胃リパーゼに由来するプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。オートラジオグラフィの後、ハイブリダイゼーションの際の陽性シグナルに対応する宿主細胞のコロニーを単離し、これらの細胞の細胞質中に存在するプラスミドＤＮＡを増幅し、精製する。有利にも、この第２の方法において利用される一般的クローニング技術は、前述の方法において使用されたものと同じである。一般的クローニング技術：伝令ＲＮＡの精製、プラスミドＤＮＡの抽出と精製、制限酵素による消化、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上での電気泳動、ＤＮＡフラグメントのアガロースゲルからの電気溶出、E．coliの形質転換、のような分子生物学の従来の方法は、文献の中で記載されている〔Maniatis，T．et al.，「分子クローニング；実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Labolatory Manual）、第２版」，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Ausub el，F.M．et al．（編）「分子生物学における現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」，John Willey and Sons，ニューヨーク，1987〕。「ランダムプライミング」は、Feinberg及びWogelsteinによって記載されている方法に従って行う〔Anal．Biochem．（1983）132：6；Anal．Biochem．（1984 ）137：266〕。酵素は、Boehringer社又はNew England Biolabs社から入手し、供給業者が勧奨する条件下で利用する。アッセンブリーすべきＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲル上での電気泳動によりそのサイズに従って分離し、電気溶出により精製し、エタノールにより沈殿させる。ＤＮＡフラグメントの連結は、アッセンブリーすべき各片が平滑末端をもつか付着末端をもつかに応じて、適当な緩衝液中で４℃又は１６℃でＴ₄ ＤＮＡリガーゼの存在下で行う。ＤＮＡの配列決定は、ジデオキシヌクレオチド法〔Sanger，F．et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，74（1977）（5463-5467）〕に従って、「Ｔ７シーケンシング」キット（Pharmacia）を用いて行う。特異的ＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、ＰＲＥＭIIIＬＥＰScientificの器具を用いて、「ポリメラーゼを触媒とする連鎖反応」、つまりＰＣＲ方法〔Sa iki，R．K．et al.，Science 220（1985）1350-1354〕に従って行う。ＰＣＲ反応又は配列決定反応においてプライマーとして利用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置ＰＣＲ−ＭＡＴＥ３９１型（Applied Biosystems）を用いて合成し、利用する前に高性能液体クロマトグラフィによって精製する。組換え型ＤＮＡ分子は、以下の株のE．coliのコンピテント細胞を形質転換するために利用する： − ＭＭ２９４〔F^-，endAl，hsd R17(r_k ^-mk⁺)，supE44，thi-1，relAl〕、又は − Ｗ３１１０Ｉ^q〔F’Tra D36，Laq I^q，_-(1acZ)M15，pro⁺〕。 Birnboin及びDoly［Birnboim，H.C．及びDoly，J．Nucl．Ac．Res．7（1979） 1512-1523〕により記載されたアルカリ溶解方法から誘導されたプロトコールに従って、アンピシリン耐性形質転換菌からプラスミドＤＮＡを抽出する。培地にイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した後に細菌E．coli Ｗ３１１０Ｉ^qで合成されたイヌ胃リパーゼの免疫検出は、抗ＤＧＬモルモット抗体及びペルオキシダーゼによる発現剤キットImmunoPure ABC（Pierce ）を用いてナイロン膜上への免疫ブロッティング法によって行う。ＤＧＬの調製については、制限的な意味のない形であるが、細菌E．coliＷ３１１０Ｉ^qにおけるＤＧＬの発現についての以下の例によって有利にも示されている。リパーゼの調製方法には、以下に詳述する複数の工程が含まれる。第１工程：イヌ胃リパーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング１．１イヌの胃基底粘膜の伝令ＲＮＡの単離及び精製組織を、塩化リチウム及び尿素を含む緩衝液〔Auffray，C．and Rougeon，F. ，Eur．J．Biochem．107（1980）303-314〕中で挽いた後、全ＲＮＡを、塩化リチウムでの選択沈殿によりＤＮＡから分離する。次いで、ＲＮＡに夾雑しているタンパク質をフェノール抽出によって除去する。３′ＯＨ末端がポリアデニル化されている伝令ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロースカラム上でのクロマトグラフィによりリボソームＲＮＡから分離する（Maniatis T．et al.，前出）。かくして、組織１グラムにつき伝令ＲＮＡ約７５マイクログラムが得られる。１．２イヌの胃基底粘膜から抽出された伝令ＲＮＡの調製物中のＤＧＬをコードする伝令ＲＮＡの検出イヌの胃リパーゼを均質になるまで精製し、そのＮＨ₂末端ポリウサギリパーゼ前駆体をコードするＤＮＡから成るプローブを、得られた調製物中のＤＧＬをコードするｍＲＮＡの存在を確認するために利用する。「ノーザン」タイプのハイブリダイゼーション実験を実施する。イヌの胃の伝令ＲＮＡの試料２０μｇを、グリオキサール及びＤＭＳＯの存在下で６０℃で変性させ、次に、１０ｍＭリン酸緩衝液、pH＝７中、１％アガロースゲル上での電気泳動により、ｍＲＮＡをサイズに従って分離する〔Thomas，P．Proc．Natl．A cad．Sci．USA，77（1980）5201-5205〕。電気泳動の後、供給業者が推奨するプロトコールに従って、ナイロン膜（Biod yne，PALL）上に伝令ＲＮＡをトランスファーする。ウサギリパーゼに対応するｃＤＮＡフラグメントを「ランダムプライミング」によって標識する。以前に得られた膜を、１０ng/mlの放射性プローブを含む、５×ＳＳＣ緩衝液−５×デンハルト（Denhardt’s）−５０mMリン酸ナトリウム、pH＝６．５−０．１％ＳＤＳ−５０％ホルムアミドの中で、３７℃で３６時間、個別にハイブリッド形成させる〔Ausubel，F．et al．（編）、前出）。使用する温度には、ＲＧＬ及びＤＧＬの間に存在しうる配列の相同性を考慮に入れる。約１７００ヌクレオチドのｍＲＮＡが放射性プローブとハイブリダイズする。１．３イヌの胃のｍＲＮＡからの相補的ＤＮＡの合成及びベクターｐＵＣ１８への挿入二本鎖ｃＤＮＡの合成は、５０単位のＡＭＶ逆転写酵素、１００ngのオリゴ− ｄＴプライマー及びE．coliＤＮＡポリメラーゼＩの存在下で、４μｇのｐｏｌｙＡ⁺ＲＮＡを用いて実施する。このＤＮＡの一分画を、予め酵素ＰｓｔＩによって線形化されたベクター及びｃＤＮＡ上にそれぞれ付加されたオリゴ−ｄＧ及びオリゴ−ｄＣテイルを介してベクターｐＵＣ１８中に挿入する〔Gubler，U．and Hoffman，B．J.，Gene 25（ 1983）263-269〕。このハイブリッド分子を、コンピテント細菌E．coliＭＭ２９４を形質転換するために利用する。形質転換体の選択は、５０mg／リットルの割合でアンピシリンを含む固体栄養培地（ＬＢ−寒天）上に形質転換産物をプレーティングすることによって行う。１．４ＤＧＬをコードするｃＤＮＡの単離形質転換に由来する細菌コロニーを、ナイロン膜（Biodynｅ，PALL）上に移し、供給業者によって推奨される方法に従って溶解させる。この作業の結果、コロニーに含まれている細菌及びプラスミドＤＮＡが変性され、膜上に固定される。まず室温で、次に６５℃で、３×ＳＳＣ緩衝液−０．１％ＳＤＳ中で数回洗浄した後、フィルターを、６×ＳＳＣ緩衝液−１０×Denhardt’s−０．１％ＳＤＳ中で６５℃で２時間予備ハイブリッド形成させ、次に、「ランダムプライミング」により³²Ｐで標識されたウサギプローブを緩衝液１ｍｌにつき０．５μciの割合で含む同じ緩衝液中で、５０℃でハイブリッド形成させる。２４〜４８時間オートラジオグラフィに付す前に、まず室温で２×ＳＳＣ緩衝液−０．１％ＳＤＳ中で、次に５０℃で同じ緩衝液中で、フィルターを洗浄する。ウサギプローブを用いて２シリーズのフィルター上でコロニーのスクリーニングを行う。かくして、クローン３．１２が得られる（図３）。１．５特異的オリゴヌクレオチドＤＰＬ₂によるｃＤＮＡの合成及びベクターｐBluescript ＫＳ（＋）への挿入１．５．ａ．特異的オリゴヌクレオチドＤＰＬ₂によるｃＤＮＡの合成前述のクローン３．１２の中に含まれるｃＤＮＡの３′の配列に対応する、ＤＧＬに特異的な合成オリゴヌクレオチドＤＰＬ₂１００ngと、ＡＭＶ逆転写酵素５０単位の存在下で、５μｇのpolyＡ⁺ＲＮＡから、一本鎖ｃＤＮＡの合成を行う。フェノール−クロロホルムでの溶液の抽出及びアルコールでの沈殿の後、得られたペレットを２０マイクロリットルの蒸留水に溶かす；次いで、適切なベクターにクローニングされるように、図２Ｂに示すプライマーＤＧＬ₁及びＤＰＬ₂を用いて「ＰＣＲ」技術により、溶液中の一本鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ＤＮＡに変換する。上述の利用されるＤＧＬ₁プライマーは、１２の配列の混合物で構成され、これらの配列の各々は、図２Ａ及び図２Ｂに表されているＤＧＬ₁プライマーの下に示された位置で、２つのヌクレオチドＴがヌクレオチドＣによって置換され得、１つのヌクレオチドＧがヌクレオチドＴ又はヌクレオチドＡによって置換され得る、ということを考慮に入れて、ＤＧＬ₁を表すために考えられる組合せの１つに対応している。１．５．ｂ．ベクターｐBluescript ＫＳ（＋）への挿入酵素ＰｓｔＩによる消化の後、制限酵素ＳｍａＩ及びＰｓｔＩにより消化されたベクターｐBluescript ＫＳ（＋）の中に、７００bpのｃＤＮＡフラグメントを挿入する。連結に由来する組換え型分子を、コンピテント細菌E．coli ＭＭ２９４を形質転換するために利用する。形質転換体の選択は、５０mg／リットルのアンピシリンを含む固体栄養培地（ＬＢ−寒天）上に形質転換産物をプレーティングすることによって行う。かくしてクローンｐＫＳＰＣＲが得られる。１．５．ｃ．プラスミドＫＳＰＣＲへのクローン３．１２の「Ｈ」フラグメントの連結制限酵素ＰｓｔＩによりクローン３．１２を消化する：ＤＧＬのｃＤＮＡの３′領域に対応するクローン３．１２の８５０塩基対のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ「Ｈ」フラグメントを、予めＰｓｔＩ酵素により線形化されたプラスミドｐＫＳＰＣＲ中に挿入する。これらの工程全体を図４に示す。１．６クローンｐＫＳＤＧＬ１０からのｃＤＮＡの単離「ＰＣＲ」によるスクリーニングの後、クローンｐＫＳＤＧＬ１０を選択した〔C．Blanchard and C．Benicourt，Boehringer，月、No.8．p6〕。プラスミドｐＫＳＤＧＬ１０の制限酵素による切断は、それが１．５ｋｂのインサートを含むことを示している。このプラスミドを、その詳細な分析及びその配列決定を目的として１リットルの細菌培養を用いて調製する。クローンの配列決定は、Sangerの方法により二本鎖ＤＮＡについて行う〔Sang er，F．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．74（1977）5463-5467〕。ｃＤＮＡの完全な配列は１５２８個のヌクレオチドを有し、図８に示されている。ヌクレオチド１からヌクレオチド１１３７に至るオープンリーディングフレームが、３７９ＡＡのタンパク質をコードしている。このタンパク質の配列を図９Ａに表す。このタンパク質は、ウサギ胃リパーゼと８１％の相同性を有している（フランス特許第９１，１３９４８号）。第２工程： Escherichia coli（大腸菌）でＤＧＬを発現させるためのプラスミドの構築２．１発現ベクターの選択 E．coliでＤＧＬを発現させるために選択されたベクターは、Ｔａｃタイプのプロモーター及び転写ターミネーターを含む１６０bpの合成ＤＮＡフラグメントがｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位とＮｄｅＩ部位の間に挿入されているプラスミドである〔Bolivar，F．et al.，Gene 2（1977） 95-113〕。ベクターｐＲＵ３０３の制限地図を図５に示し、ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を図６に示す。２．２プラスミドｐＤＧＬ５．３０３の構築これまでになされてきた徹底的な研究にもかかわらず、細菌内での非相同タンパク質の発現レベルと、この同じタンパク質の伝令ＲＮＡの５′末端領域のヌクレオチド配列との間には、相関関係を打ちたてることがほとんどできなかった。しかしながら、数多くの観察事実から、組換え型細菌におけるより高い発現レベルをもたらし得るいくつかの経験的法則を演鐸することができるようになった。これらの「法則」のうち、次のものを挙げることができる： − ６〜１２ヌクレオチドという、Shine-Dalgarno領域とＡＵＧイニシエーターとの間の距離、 − プリンが豊富なShine-Dalgarno配列（ＡＧＧＡ）、 − Shine-DalgarnoとＡＵＧイニシエーターとの間の最少限の二次構造、 − Shine-Dalgarno配列とＡＵＧイニシエーターとを含む伝令ＲＮＡの領域内の二次構造（二本鎖）の欠如。 E．coliにおけるＤＧＬのような特定の非相同タンパク質のより良い発現レベルをもたらし得るｍＲＮＡの５′非コーディング領域のヌクレオチド配列を規定することを可能にする分析プログラムに、かかる制約条件を考慮に入れることができる。図１０に示されている特異的合成プライマーＤＧＬ₂及びＤＧＬ₃を用いて、又「ＰＣＲ」遺伝子増幅技術により、ＤＧＬの成熟型部分をコードするｃＤＮＡを、翻訳開始ＡＴＧコドンの後ろに位置させ、それを発現ベクターｐＲＵ３０３の制限部位ＢｇｌIIとＳａｌＩの間に挿入できることになるようなヌクレオチド配列の間に置く。構築物ｐＤＧＬ５．３０３の中に、ＤＧＬをコードする配列の直ぐ上流にＡＴＧコドンが存在することから、得られる組換え型タンパク質は、全体的又は部分的に、そのＮＨ₂末端に１つのメチオニンを有することになる。構築図を図７に示す組換え型プラスミドｐＤＧＬ５．３０３は、E．coli ＭＭ２９４株において得、その後、非相同タンパク質の発現のために頻繁に利用されるE．coli Ｗ３１１０Ｉ^q株に移した。この株は、トランスファー不能なエピソームＦ′上にあるリプレッサーＬａｃＩ^qの遺伝子を含む；細菌内で大量に合成されたリプレッサーは、ラクトースタイプのプロモーターの制御下に置かれた全ての遺伝子の発現を抑える。第３工程：E．coliにおけるＤＧＬの発現宿主E．coliＷ３１１０Ｉ^qにプラスミドｐＤＧＬ５．３０３を導入した。このプラスミドにより形質転換された細菌を、Ｍ９グルコースの存在下で培地中で培養する（Maniatis，T．et al.，前出）。対数増殖期の間に、イヌ胃リパーゼの発現を、最終濃度２mM のＩＰＴＧを添加することによって誘導する。３７℃で４時間の後、細菌を収穫し、遠心分離し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する。その後、ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中で、１００℃で１０分間、細菌を溶解する。変性条件下での電気泳動ゲル上でのタンパク質の分析により、リパーゼに対応している可能性のあるタンパク質バンドを検出することができる。タンパク質は、図１１に示すように、この技術によって検出されうるようなレベルで発現される。培地に対するＩＰＴＧの添加によって誘導されたこのタンパク質がまさにＤＧＬに対応していることを確認するため、化学的作用物質によって誘導した及び誘導していない、プラスミドｐＤＧＬ５．３０３によって形質転換された細菌の培養に由来するタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりサイズに従って分離した後、ナイロン膜上へトランスファーする。１つの酵素つまり西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体を介入させる比色反応により、ＤＧＬと抗ＤＧＬ抗体との間の複合体を検出することができる。結果を図１２に示す。 Escherichia coli菌の細胞質内で封入体の形で産生させるのではなく、イヌ胃リパーゼは、有利にも、タンパク質ｏｍｐＡのＮＨ₂ 末端に存在するもののようなシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントの下流で、物理的又は化学的作用因子により誘導可能なプロモーターの制御下に、適切なベクター内に成熟型酵素をコードするｃＤＮＡを挿入することによって、細菌周辺腔中に分泌させうる（Movva N．R．et al．J．Biol．Chem．256：27-29 ，1980）。イヌ胃リパーゼは同様に、後の精製を可能にするStaphylococcus aureusのプロテインＡとの可溶性融合タンパク質の形でEscherichia coli中で合成させることもできる。この目的で、成熟型リパーゼをコードするｃＤＮＡを、凝固因子Ｘａの認識部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇをコードするＤＮＡフラグメントを導入するために予め改変されたベクターｐＲＩＴ２Ｔ（Nilsson B．et al．EM BO J．4：1075-1080，1985）の中に挿入する。かくして産生された融合タンパク質は、ＩｇＧ−セファロースカラム（Pharmacia）上でのアフィニティクロマトグラフィにより、細菌の細胞質のその他のタンパク質から分離することができる。カラムの溶出の後、融合タンパク質をＸａ因子により切断する。この加水分解産物を、プロテインＡを保持するＩｇＧ−セファロースクロマトグラフィに改めて付し、かくして可溶性形態で純粋な状態のイヌ胃リパーゼを得ることが可能となる。同様に、培養中の哺乳動物細胞からイヌ胃リパーゼを得ることも可能である。そのためには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの制御下に、プラスミドｐＣＤＮＡＩ−Ｎｅｏ（Invitrogen社）のような適切なベクター中にこのリパーゼの前駆体をコードするｃＤＮＡを挿入するか、或いは又、同一タイプのベクター中に、ただしウサギ胃リパーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントの下流に、成熟型リパーゼをコードするフランス特許出願第２，６３３，５４９号）。構成的にウイルスＳＶ４０のＴ抗原を発現するサルの腎細胞ＣＯＳ−７の中にかかる組換え型プラスミドを導入することにより、培地中にイヌ胃リパーゼを一時的にかなりの量で産生させることが可能となる。構成的にイヌ胃リパーゼを発現する細胞株は、ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）中に２つの組換え型プラスミドのうちの１つを導入し、これらのプラスミド上にネオマイシンのようなアミノグリコシドに対する耐性遺伝子が存在することから抗生物質Ｇ４１８又はジェネチシン（geneticin）を用いて選択圧力を加えることによって、得ることができる。組換え型ＤＧＬ、特にＷ３１１０Ｉ^q （ｐＤＧＬ５．３０３）の培養に由来する細胞ライセートからの組換え型ＤＧＬの活性の検出は、基質としてトリブチリンを用いて、Gargouriらの方法〔Gastroenterology 91 （1986）265-275〕により行う。以下では、組換え型ポリペプチドの比活性を測定する実験条件について喚起する。比活性は、酵素活性とミリグラム単位で表された試料中のタンパク質の量との比として定義される。リパーゼ活性は、利用される基質がトリブチリンであるY ．Gargouriの滴定法（前出）によって測定する。検定は、６という一定のpHで３７℃の温度で、０．１N水酸化ナトリウムによって、リパーゼの作用で遊離されたブチル酸を中和することから成る。これらの試験条件下で、酵素活性は、試験に付された産物の作用によって１分間で遊離される酸のマイクロモル数に対応する。実際には、試験は、３７℃の恒温に保たれた滴定用セル内に次のものを導入することから成る： − トリブチリン：０．５０ml − ウシ血清アルブミン及びタウロデオキシコール酸ナトリウムの等張液１４．５０ml（組成：１００mgウシ血清アルブミン、２mMタウロデオキシコール酸ナトリウム、１リットルに至るまでの充分な量の０．９％ＮａＣｌの等張溶液）。電磁式撹拌下で、自動滴定計を用いて、０．１N水酸化ナトリウムを添加することにより混合物をpH６にする。この値にpHを安定化させた後、正確に測定した０．５〜１mlの検定すべき酵素化合物の水溶液を添加する。これらの実験条件下で、pHを６に２分間維持するのに必要な０．１N水酸化ナトリウム溶液の量によって、前述のとおりのリパーゼ活性の計算が可能となる。脂肪分解活性は、同様に、製造業者の説明書に記されている、１，２−０−ジラウリル−ラック−グリセロ−３−グルタル酸レゾルフィン（Boehringer）のような色原性基質を用いた方法によっても測定可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１２月３日【補正内容】請求の範囲１．図８（配列番号１）に表されているＤＮＡフラグメントの全部又は一部分、より特定的には図８に表されているＤＮＡの位置１〜１１３７（配列番号２）にあるヌクレオチドによって限定されたＤＮＡフラグメントの全部又は一部分を含み、このＤＮＡフラグメントは図９Ａに表されているアミノ酸配列の位置１〜３７９（配列番号３）にあるアミノ酸により限定されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドがイヌの胃リパーゼに対応することを特徴とする核酸。２．位置１〜１１３７にあるヌクレオチドによって限定されているＤＮＡフラグメントの上流に、メチオニンをコードするＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項記載の核酸（配列番号４）。３．請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメントの１つの上流に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸。４．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載のＤＮＡフラグメントを構成する２つの相補的ヌクレオチド配列の一方又は他方を含むことを特徴とする核酸。５．遺伝暗号の縮重により請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載のヌクレオチド配列と異なっているヌクレオチド配列を有する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸。６．請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の核酸が該核酸に対して非相同のヌクレオチド配列内に挿入されて含まれることを特徴とする組換え型核酸。７．請求の範囲第１項〜第５項記載の核酸の上流に位置するプロモーターを含み、このプロモーターの制御下で、前記核酸の転写が実施され得、さらに、前記核酸の下流に位置する転写終結シグナルをコードする配列をも含むことを特徴とする、請求の範囲第６項記載の組換え型核酸。８．請求の範囲第６項又は第７項記載の組換え型核酸を、複製にとって非必須の部位の１つにおいて含んでいることを特徴とする、特にプラスミド、コスミド又はファージタイプの組換え型ベクター。９．細胞性宿主において請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の核酸の発現を促進し制御するのに必要な要素、より特定的には細胞性宿主のポリメラーゼにより認識されるプロモーター、特に誘導可能なプロモーターを、複製にとって非必須の部位の１つにおいて含んでいることを特徴とする、請求の範囲第８項記載の組換え型ベクター。 10．請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の核酸の発現を可能にする調節要素を含む、請求の範囲第８項又は第９項記載の組換え型ベクターにより形質転換された、原核生物又は真核生物タイプの細胞性宿主。 11．請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の核酸によってコードされることを特徴とするポリペプチドであって、イヌ胃から抽出及び精製された分子量４９，０００ダルトンのＤＧＬ以外のポリペプチド。 12．一般的な遺伝暗号に従って請求の範囲第１項記載の核酸に対応し、図９Ａに表されているアミノ酸配列（配列番号３）の位置１〜３７９にあるアミノ酸によって限定される、請求の範囲第１１項記載のポリペプチド。 13．一般的な遺伝暗号に従って請求の範囲第２項記載の核酸に対応し、かつ、図９Ａの位置１〜３７９にあるアミノ酸により限定され、そのＮＨ₂末端にメチオニンが先行しているアミノ酸配列（配列番号５）で構成されている、請求の範囲第１１項記載のポリペプチド。 14．請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれか１項記載の組換え型ポリペプチドのフラグメント、又はこれらの組換え型ポリペプチドの単数又は複数のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は削除によって改変されたポリペプチドを含み、これらのフラグメント又は改変されたポリペプチドが上述の組換え型ポリペプチドの酵素的特性を保っていることを特徴とするポリペプチド。 15．請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか１項記載のポリペプチドの調製方法であって、 − 適切な培地中で請求の範囲第１０項記載の細胞性宿主を培養する工程、及び − 前記培地から直接に又は細胞性宿主の溶解の後に、前記細胞性宿主によって産生されたポリペプチドを回収する工程、という一連の工程を含むことを特徴とする方法。 16．請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか１項記載の少なくとも１つのタイプのポリペプチドを、場合によってはリパーゼ活性をもつ単数又は複数のその他のポリペプチドと組合わせて、薬学的に受容可能な賦形剤と組合せて含んでいることを特徴とする、医薬組成物。 17．胃リパーゼの産生レベルに影響を及ぼすか又は及ぼさない単数又は複数の病気を患う個体又は健康な個体が摂取した動物性又は植物性油脂の吸収を容易にすることを目的とする薬剤を得るための、請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか１項記載の単数又は複数のポリペプチドの利用。 18．生体内のリパーゼ産生の不足又は欠如に関連した病気、より特定的には嚢胞性繊維症及び膵外分泌機能不全症のような病気の治療を目的とする薬剤を得るための、請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか１項記載の単数又は複数のポリペプチドの利用。 19．特に固体支持体上に固定された形で、（加水分解、酵素的エステル交換のような）酵素による生物的変換反応を実施するための、請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか１項記載の単数又は複数のポリペプチドの利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 9/20 8827−4Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジュニアン，ジャン−ルイスフランス国、エフ―92310 セブレ、アヴニュ・エフェール、36

Claims

【特許請求の範囲】１．図８（配列番号１）に表されているＤＮＡフラグメントの全部又は一部分、より特定的には図８に表されているＤＮＡの位置１〜１１３７（配列番号２）にあるヌクレオチドによって限定されたＤＮＡフラグメントの全部又は一部分を含み、このＤＮＡフラグメントは図９Ａに表されているアミノ酸配列の位置１〜３７９（配列番号３）にあるアミノ酸により限定されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドがイヌの胃リパーゼに対応することを特徴とする核酸。２．位置１〜１１３７にあるヌクレオチドによって限定されているＤＮＡフラグメントの上流に、メチオニンをコードするＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項記載の核酸（配列番号４）。３．請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメントの１つの上流に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸。４．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載のＤＮＡフラグメントを構成する２つの相補的ヌクレオチド配列の一方又は他方を含むことを特徴とする核酸。５．請求の範囲第４項記載の核酸とハイブリダイズしうることを特徴とする核酸。６．遺伝暗合の縮重により請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載のヌクレオチド配列と異なっているヌクレオチド配列を有する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸。７．請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の核酸が該核酸に対して非相同のヌクレオチド配列内に挿入されて含まれることを特徴とする組換え型核酸。８．請求の範囲第１項〜第６項記載の核酸の上流に位置するプロモーターを含み、このプロモーターの制御下で、前記核酸の転写が実施され得、さらに、前記核酸の下流に位置する転写終結シグナルをコードする配列をも含むことを特徴とする、請求の範囲第７項記載の組換え型核酸。９．請求の範囲第７項又は第８項記載の組換え型核酸を、複製にとって非必須の部位の１つにおいて含んでいることを特徴とする、特にプラスミド、コスミド又はファージタイプの組換え型ベクター。 10．細胞性宿主において請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の核酸の発現を促進し制御するのに必要な要素、より特定的には細胞性宿主のポリメラーゼにより認識されるプロモーター、特に誘導可能なプロモーターを、複製にとって非必須の部位の１つにおいて含んでいることを特徴とする、請求の範囲第９項記載の組換え型ベクター。 11．請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項記載の核酸の発現を可能にする調節要素を含む、請求の範囲第９項又は第１０項記載の組換え型ベクターにより形質転換された、原核生物又は真核生物タイプの細胞性宿主。 12．請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の核酸によってコードされることを特徴とする、ポリペプチド。 13．一般的な遺伝暗合に従って請求の範囲第１項記載の核酸に対応し、図９Ａに表されているアミノ酸配列（配列番号３）の位置１〜３７９にあるアミノ酸によって限定される、請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 14．一般的な遺伝暗合に従って請求の範囲第２項記載の核酸に対応し、かつ、図９Ａの位置１〜３７９にあるアミノ酸により限定され、そのＮＨ₂末端にメチオニンが先行しているアミノ酸配列（配列番号５）で構成されている、請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 15．請求の範囲第１２項〜第１４項のいずれか１項記載の組換え型ポリペプチドのフラグメント、又はこれらの組換え型ポリペプチドの単数又は複数のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は削除によって改変されたポリペプチドを含み、これらのフラグメント又は改変されたポリペプチドが上述の組換え型ポリペプチドの酵素的特性を保っていることを特徴とするポリペプチド。 16．請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項記載のポリペプチドの調製方法であって、 − 適切な培地中で請求の範囲第１１項記載の細胞性宿主を培養する工程、及び − 前記培地から直接に又は細胞性宿主の溶解の後に、前記細胞性宿主によって産生されたポリペプチドを回収する工程、という一連の工程を含むことを特徴とする方法。 17．請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項記載の少なくとも１つのタイプのポリペプチドを、場合によってはリパーゼ活性をもつ単数又は複数のその他のポリペプチドと組合わせて、薬学的に受容可能な賦形剤と組合せて含んでいることを特徴とする、医薬組成物。 18．胃リパーゼの産生レベルに影響を及ぼすか又は及ぼさない単数又は複数の病気を患う個体又は健康な個体が摂取した動物性又は植物性油脂の吸収を容易にすることを目的とする薬剤を得るための、請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項記載の単数又は複数のポリペプチドの利用。 19．生体内のリパーゼ産生の不足又は欠如に関連した病気、より特定的には嚢胞性繊維症及び膵外分泌機能不全症のような病気の治療を目的とする薬剤を得るための、請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項記載の単数又は複数のポリペプチドの利用。 20．特に固体支持体上に固定された形で、（加水分解、酵素的エステル交換のような）酵素による生物的変換反応を実施するための、請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項記載のポリペプチド又は哺乳動物のその他全ての胃リパーゼ及び誘導体のうちの単数又は複数のポリペプチドの利用。