JPH02249487A - ヒツジ成長ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は組換えヒツジ成長ホルモン、組換えヒツジ成長
ホルモン遺伝子の製造、ならびに原核生物において高水
準のヒツジ成長ホルモンを発現し、精製するためのプラ
スミド発現ベクターの構成法に関する。

［従来の技術］ 成長ホルモン−ポリペプチドホルモン−は、脳下垂体前
葉において大型の前駆体分子として合成される。酵素に
よりシグナルペプチドが前駆体から除かれて、生物学的
に活性な成熟した形の成長ホルモンが得られる。一般同
化作用薬として十分に認識されている成長ホルモンは哺
乳動物その他のを推動物において多数の生理作用を促進
する。

これは骨格成長に関与する成長促進物質であり、かつ蛋
白質合成のボテンシエーターである。また成長ホルモン
はインシュリン増強特性を示し、弱い泌乳刺激作用を有
し、脂質代謝および凝血維持において重要な役割を果た
す。成長ホルモンに関してはある程度の種特異性があり
；たとえばウシ成長ホルモンはヒトまたはサルにおいて
は不活性であるが、ラットおよびヤギにおいては効果を
生じるであろう。

ヒツジ飼育産業に関しては、成長ホルモンの投与によっ
て体重増加が促進され、肉質が改良され、これによって
飼料転換率が高まる。これはたとえば出願中のオースト
ラリア特許出願第６２５２２／８６号明細書に示されて
おり、その記載全体をここに参考として引用する。しか
し、成長ホルモン投与の経済的に明らかな役割はヒツジ
飼育産業にとって適切であるが、有効な天然の下垂体由
来ヒツジ成長ホルモンの供給は需要をはるかに下回る。

生成物に種特異性があるとすれば、他の天然の成長促進
性ポリペプチド源は使用できない。しかし組換えＤＮＡ
技術の発達およびその後のこれらの応用によって、ヒツ
ジ成長ホルモンコード化ＤＮＡ配列の操作が可能になり
、原核生物、たとえば細菌においてこの蛋白質を高水準
で産生ずることが可能になった。

［発明の開示］ 従って本発明の目的は、先行技術に関連する難点のうち
１または２以上を克服し、または少なくとも軽減するこ
とである。特に本発明者らは後述の方法によって、良好
なヒツジ成長ホルモン活性をもつ組換えポリペプチドを
比較的大量に生産することができた。これらのポリペプ
チドは良好な生物学的活性をもち、インビボで天然ホル
モンの有効な代替品として使用しうる。

従って本発明による第１の観点においては、ヒツジ成長
ホルモン活性を有する組換えポリペプチドをコードする
相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）配列；および 適切なクローニングベクター を用意し； 上記のＤＮＡ配列とクローニングベクターをリゲートし
てＤＮＡ配列をクローニングベクター中へ配置し、分子
クローンを形成する ことを含む、分子クローンの製法が提供される。

こうして形成されたベクターは成熟ホルモンを包含する
ヒツジ成長ホルモンポリペプチドコード部位の完全なま
たは部分的なコピーを含み３′末終止コドンを越えて伸
びている。

ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列はヒツジ下垂体源されたポリアデニル化
メツセンジャーＲＮＡがら誘導される。

従って本発明の他の観点においては、 ヒツジ下垂体源を用意し−； これからポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡ（ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａ）を単離し、； 該ｍＲＮＡをオリゴｄＴブライマーの存在下に逆転写酵
素で処理して、第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成
し； ｍ　ＲＮ　ＡをＲＮエースＨにより酵素的に除去し、次
いでＤＮＡポリメラーゼＩにより第２　ｃ　ＤＮＡ鎖を
合成し；そして こうして得た二本鎖相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）をＴ４
　　ＤＮＡポリメラーゼと共に処理して、平滑末端分子
を形成する 予備工程を含む、ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列の製法が提供される。

ヒツジ下垂体からポリアデニル化ＲＮＡを単離する工程
はいずれかの適宜な方法で、たとえばグアニジンチオシ
アネート処理およびアフィニティクロマトグラフィーに
より行うことができる。

本発明に適したクローニングベクターは各種の原核生物
クローニングベクターから選ばれる。バクテリオファー
ジウィルスベクターλｇｔｌＯなどが適切であることが
認められた。

リゲーシコン工程はいずれかの適宜な様式をとりうる。

クローニング反応工程は合成ＤＮＡリンカ−の添加によ
るリゲーションによって行うことができる。この場合は
ＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列に対応するリンカ−を７４
　　ＤＮＡリガーゼにより、平滑末端ｃＤＮＡ分子のい
ずれの末端にも結合させる。

従って前記ｃＤＮＡを酵素ＥｃｏＲＩにより消化すると
、５’ＥｃｏＲＩ粘着性オーバーハング末端を備えたｃ
ＤＮＡが得られるであろう。

次いでこの分子をｇｔｌＯ中の和合性ＥｃｏＲＩＤＮＡ
部位にリゲーションによりクローン化し；次いでこのＤ
ＮＡをウィルス粒子に“インビトロ”でパッケージし、
次いでこれを用いて適宜な細菌に感染させて組換えｃＤ
ＮＡライブラリーを形成し、これからヒツジＧＨをコー
ドするｃＤＮＡを含む組換えクローンを選択することが
できる。

従って本発明の好ましい観点においては、分子クローン
は以下に述べるｏＧＨｌ−１２およびｏＧＨｌ−１４と
表示されるクローンから選ばれるバクテリオファージク
ローンである。

バクテリオファージクローンはバング（オーストラリア
）社、オーストラリア国ビクトリア・ノースメルボルン
、により維持されるコレクション中に維持されている。

バクテリオファージクローンｏＧＨ１２が好ましい。こ
のクローンは５′および３′末非翻訳配列を含めて、ヒ
ツジ成長ホルモンポリペプチドコード部位の完全なコピ
ーを含む。ｏＧＨｌ−１２の全ＤＮＡ配列が決定された
。ｏＧＨ１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および対応す
るアミノ酸配列を下記に示す。＋１の語は成熟ホルモン
のＮ末端の第１アミノ酸（Ａ：アラニン）を表わす。

５′ ＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧ
ＣＴＣＡＣＣＡＧＣＴＭＭＡＡＧＰＲ ＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＬＰ
ＷＴＱＶＶＧＡＦ ＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ
ＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＧ
ＧＴＧＧＧＣＧＣＣＴＴＣ＋１ ＰＡＭＳＬＳＧＬＦＡＮＡＶＬＲＡＱＨＬＨＱＣＣＡＧ
ＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣ
ＣＴＧＣＡＴＣＡＬＡＡＤＴＦＫＥＦＥＲＴＹ　　　Ｉ
　　　ＰＥＧＱＲＹＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣ
ＴＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＣＧＣＡＣＣＴＡＣＡ
ＴＣＣＣＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＳＩＱＮ
ＴＱＶＡＦＣＦＳＥＴＩＰＡＰＴＧＫＣＣＡＴＣＣＡＧ
ＡＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴ
ＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧ
ＣＡＡＧＮＥＡＱＱＫＳＤＬＥＬＬＲＩ　　　５ＬＬＬ
　　　Ｉ　　　ＱＳＡＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡ
ＡＡＴＣＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡＴ
ＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＴＣＷＬＧＰ
ＬＱＦＬＳＲＶＦＴＮＳＬＶＦＧＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧ
ＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣ
ＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡ
ＣＣＴＳＤＲＶＹＥＫＬＫＤＬＥＥＧ　　　Ｉ　　　Ｌ
ＡＬＭＲＥＣＧＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧ
ＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣ
ＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＧＡＧＬＥＤＶＴＰＲＡ
ＧＱ　　　Ｉ　　　ＬＫＱＴＹＤＫＦＤＴＣＴＧＧＡＡ
ＧＡＴＧＴＴＡＣＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＡ
ＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＴＴ
ＴＧＡＣＡＣＮＭＲＳＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＳＣＦＲ
ＫＡＡＡＣＡＴＧＣＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＴ
ＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＣ
ＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＧＤＬＨＫＴＥＴＹＬＲＶＭ
ＫＣＲＲＦＧＥＡＳＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＧＧＡ
ＧＡＣＧＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴ
ＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＦ ＴＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴ
ＧＴＴＧＴＴＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣ３′ この種のバクテリオファージベクターはヒツジ成長ホル
モン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
の安定な維持に有用なビヒクルであるが、真核生物遺伝
子を原核細胞中で発現するために選ばれたビヒクルでは
ないことを理解すべきである。真核生物遺伝子を原核細
胞中で発現する際には、ベクターにより形質転換された
原核細胞中で上記遺伝子が適正に発現するために、外来
遺伝子の転写および翻訳を制御する特定の調節配列を利
用する発現ベクターが必要である。

従って本発明のさらに他の観点においては、あらかじめ
定められた長さのＤＮＡ配列がそれから除かれた制限酵
素処理プラスミド発現ベクター；および ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポリペプチドま
たはその一部をコードし、単細胞生物中での転写および
翻訳のための調節要件を満たす合成末端配列 を含むＤＮＡ配列 を用意し；そして 上記ＤＮＡ配列を制限酵素処理プラスミド発現ベクター
にリゲートする ことを含む、ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポ
リペプチドをコードし、単細胞生物中で複製、転写およ
び翻訳されうる配列を有するプラスミドの製法が提供さ
れる。

本発明のこの観点における制限酵素処理プラスミド発現
ベクターは適切な型のものいずれであってもよい。二重
開始点型ベクターが好ましい。

二重開始点型ベクターは一方の複製開始点が低コピー数
のプラスミドの安定な維持に関与するのに対し、他方が
温度の変化により作動してクローン化した遺伝子の構成
性発現およびコピー数の増加を導くものである。従って
大規模培養におけるコピー数増幅および遺伝子発現の誘
導が比較的安価であり、かつ簡単である。

制限酵素処理プラスミド発現ベクターはプラスミドｐ　
Ｍ　Ｇ　１９７、すなわちｐ　Ｍ　Ｇ　４１１から形成
しうる（ヤリントン（Ｙａｒｒｌｎｇｔｏｎ）らのＧｅ
ｎｅ、　１９８４年。

に記載される）。ｐ　Ｍ　Ｇ　１９７はＡＵＧ開始コド
ンから１４塩基対上流にシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配
列を有する、ｔｒｐプロモーターからａｂｅｔ−胃液リ
パーゼ酵素を発現する二重開始点プラスミドである。

ｐ　Ｍ　Ｇ　１９７を修飾して、制限酵素処理プラスミ
ド発現ベクターを形成することができる。

ｐ　Ｍ　Ｇ　１９７はｐａｒ遺伝子座とｃ　１８５７配
列の間にあるＥｃｏＲ１部位を除去し、５ｅｔ−胃液リ
パーゼ遺伝子をＢｇｌＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片として排
除することによって修飾することができる。

適切な構造を得るためには、多工程を伴う方法が必要で
ある。このためには （１）成熟ヒツジＧＨポリペプチドの５′側のコード配
列に対応する合成オリゴヌクレオチドを合成して、Ｂｇ
ｌｌＩ部位中への制限酵素処理ｐＭＧ１９７のクローニ
ングを容易にすることが必要になる。さらに、オリゴヌ
クレオチドの合成のために選ばれたコドンは、関連ヒツ
ジＧＨアミノ酸を満たす一方、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
中に見出される最も豊富なｔＲＮＡに対応するものを表
現すべきである。

従って組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がヒ
ツジ成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の一部のみを
含み、合成５′末端配列および３′末端配列からなる場
合は、上記方法はさらにヒツジ成長ホルモンをコードす
る完全なＤＮＡ配列の残部を含む追加ＤＮＡ配列を用意
し；前記ＤＮＡ配列を合成５′末端配列と３′末端配列
の間の制限部位において開裂し：そして前記の追加ＤＮ
Ａ配列をこの制限部位にリゲートする ことを含む。

好ましくは２種の一般的な型のオリゴヌクレオチドのう
ち１種を前記ＤＮＡ配列の合成５′末端配列として用い
ることができる。たとえば２種の一般的型のオリゴヌク
レオチドはｏＧＨコード配列の最初の１４個のアミノ酸
をコードするＤＮＡを置換すべくデザインしうる。

ｏＧＨｃＤＮＡの５′末端翻訳領域は原核細胞内の小胞
体を越えてホルモンを輸送するための真核生物シグナル
配列を含む。成熟蛋白質をコードする配列はシグナルペ
プチドで利用される最初のヌクレオチドの７９塩基対下
流において開始するので、原核細胞発現系では真核生物
のシグナルペプチドを除かなければならない。成熟蛋白
質をコードする。ＧＨｃＤＮＡの５′末端はアラニンに
関するコドンＧＣＣから出発する。しかし細菌性発現に
は開始のためにコドンＡＴＧが必要である。これはメチ
オニンをコードし、従って細菌性発現により生成する成
熟蛋白質はアラニンではなくメチオニンで始まるであろ
う。この修飾を行った効果は分かっていないので、５′
末端を修飾するために２種の代替オリゴヌクレオチドを
調製した。これらはそれぞれＡＴＧ開始コドンを備えて
いる。一方のオリゴヌクレオチド対は成熟蛋白質のＮＨ
２末端に天然に見られるアラニンの前にメチオニンをコ
ードした。他方は最初４個のＮＨ２末端アミノ酸を除去
し、従ってアミノ酸患５、すなわち天然の最初のメチオ
ニンから出発する。これらはそれぞれｍｅｔ：　１−１
５およびａｉｅｔ　：５−１５と表示され、ｏＧＨアミ
ノ酸１−１５および５−１５をコードする。従って本発
明の他の観点においてはオリゴヌクレオチドＭｏｔｅｌ
−１５およびＭｏｔ：５−１５から選ばれるオリゴヌク
レオチド配列が提供される。

第１の型のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＭ
ｅｔａｌ−１５は５’　ＢｇｌＩＩ粘着末端、成熟ヒツ
ジ成長ホルモンポリペプチド中には見られないＮＨ２末
端メチオニン残基に対応する開始コドン（ＡＴＧ）、天
然ホルモン（成熟形）のアミノ酸１−１４に対応するコ
ドンを含み、ヌクレオチド１６０に見られるＨｇｌＡＩ
部位に対応する３′末オーバーハングにおいて終止する
。Ｍｅｔ：１−１５は下記の構造をもつ。

５°　°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３・５ｍｅｒ ３°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
膠＾ｃ５゜７ａｅｒ 第２のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＭθｔ
：５−１５は５’　ＢｇｌＩＩおよび３’ＨｇＩＡＩ双
方の粘着末端を含むが、天然メチオニン残基（アミノ酸
５、成熟ホルモン）に対応するコドンにおいて開始し、
アミノ酸６−１４に対応するコドンがこれに続、く。Ｍ
ｅｔ：５−１５は下記の構造をもつ。

２ｍｅｒ 上記オリゴヌクレオチド配列はＡＴＧコドンを備えてい
るほか、ベクター内の対応する部位にクローニングする
ために５′末端にＢｇｌｌＩ部位をも含む。さらにこれ
らのオリゴ体をデザインする際に、ｏＧＨアミノ酸配列
配列守した状態で大腸菌内に見出される最も豊富なｔＲ
ＮＡに対応するコドンが選ばれた。さらに考慮された点
は、メツセンジャーＲＮＡのリポソーム結合部位内の潜
在的二次構造を除くために−さもなければ転写に不利な
影響を与えるであろう−Ｇ−Ｃ塩基対の使用を最小限に
抑え、代わりにＡ−Ｔ塩基対を用いることであった。

両オリゴ体は３′末端がＨｇ１ＡＩ　　３’オーバーハ
ングで終止し、それぞれがこの部位を介してｏＧＨｃＤ
ＮＡの残部ヘリゲートすることが可能となった。

各種の調節要素が細菌性発現に付随し、これらが最終構
造中に存在しなければならない。これらは転写−プロモ
ーター領域の場合−または翻訳に影響を及ぼし、シャイ
ン拳ダルガノ（ＳＤ）部位およびＡＴＧ開始コドンを必
要とする。ｍＲＮＡ上の開始コドンＡＵＧはｆ−ｆｆｌ
ｅｔｔＲＮＡとの対合により開始に関与し、これにより
翻訳を促進する。細菌におけるｍＲＮＡの翻訳の効率は
リポソーム結合部位であるＳＤ配列、すなわち６〜８個
のプリンヌクレオチドの群の存在；およびこの部位とＡ
ＵＧ開始コドンの距離に決定的に依存する。発現ベクタ
ーを用いて真核生物蛋白質を効果的に発現するためには
、ＳＤ配列は通常はベクター自体に含まれる。ＡＵＧと
この部位の距離が重要であるので、ベクターはｃＤＮＡ
の５′末端がＢｇ１ｍ部位を介してリゲートした際に、
ＡＴＧがこの制限配列のすぐ下流にある場合はこのＡＴ
ＧはＳＤ配列から１４ｂｐの距離となるようにデザイン
された。これは各種真核生物蛋白質を二複製開始点ベク
ター（ｄｕａｌ　ｏｒｉｇｉｎ　ｖｅｃｔｏｒ）がら発
現するために最適であることが経験的に認められた。

ｏＧＨｃＤＮＡの３′非翻訳末端はポリＡシグナル配列
および約２００ｂｐのアデニンヌクレオチドをＥｃｏＲ
Ｉ部位の前に含む。コード部位のすぐ下流に、すなわち
最後のコーディングトリブレットの次に終止コドンＴＡ
Ｇがあり、そして他の１個はさらに４０ｂｐ下流に、ポ
リＡシグナルの前にある。

従って本発明の他の観点によれば、 ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリペプチドをコード
し、単細胞生物中で複製、転写および翻訳されうるＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、および 単細胞生物 をｍ意し； 上記の組換えプラスミド発現ベクターを形質転換、形質
導入またはトランスフェクションから選ばれる方法によ
り上記の単細胞生物内へ導入し：得られた生物を培養し
； 上記ＤＮＡ配列によりコードされる組換えポリペプチド
を発現させ；そして所望により該ポリペプチドを培養物
から単離する 工程を含む、ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポ
リペプチドの製法が提供される。

本発明方法によれば、単細胞生物は原核生物、たとえば
大腸菌の菌株など、細菌の菌株である。

大腸菌ＤＨＩおよび大腸菌ｌＢ５９２が特に適切である
ことが認められた。

この観点の本発明に用いられる組換えプラスミド発現ベ
クターは前記方法により調製された適切なベクターのい
ずれであってもよい。特に好ましいベクターにはＰＭＧ
ｏＧＨ１およびｐＭＧｏＧＨ２が含まれる。

本発明方法はここに記載する組換えポリペプチドｏＧＨ
１−１９１およびｏＧＨ５−１！Ｈの製造に特に好適で
ある。

本発明方法の工程（１）〜（４）は周知の方法、たとえ
ば後記の実施例に記載した方法により実施することがで
きる。工程（５）に従ってポリペプチド生成物を単離す
ることが望まれる場合も常法が用いられる。たとえば細
胞溶解により細胞を破壊したのち、ポリペプチドの単離
をイオン交換、アフィニティもしくはサイジング樹脂を
用いるクロマトグラフィーにより、および／または沈降
法、たとえば遠心分離により、またはポリペプチドの精
製に関する他の既知の方法により行うことができる。

組換えポリペプチドが不溶性の凝集体として発現し、お
よび／または変性されている場合、可溶化および／また
は再生を常法により、たとえば国際特許出願公開ＷＯ３
３１０４４１８号、英国特許第２１３８００４号および
欧州特許第２２６４４８号明細書に記載の方法により行
うことができる。

本発明方法の工程（３）に用いるのに特に有用な生物に
は大腸菌、特に組換えプラスミド発現ベクターｐＭＧｏ
ＧＨ１およびｐＭＧｏＧＨ２のうち一方を含む大腸菌ｌ
Ｂ５９２が含まれ、これらの菌株は突然変異体、組換え
体およびそれらから遺伝子工学的に処理された誘導体は
本発明の他の観点をなす。

発現水準はプラスミドのコピー数°に正比例する。

ヒツジ成長ホルモンはｔｒｐプロモーターから構成性発
現し、従ってｏＧＨｃＤＮＡから産生されるｏＧＨの最
終量は細胞内のコピー数により決定される。従って、約
４コピーのｐＭＧｏＧＨを有する誘導されていない細胞
においては一定量の“漏出（ｌｅａｋａｇｅ）”がある
が、これは目的とする未誘導バイオマスにまで細胞が増
殖した時点で問題を生じないことが示された。２００ｆ
ｌの発酵で誘導前にＯ，Ｄ、−１０７が得られた。

本発明方法により製造された特に有用な組換えポリペプ
チドにはヒツジ成長ホルモン変異体ｏＧＨ１−１９１お
よびｏＧＨ５−１９１が含まれる。

双方の組換えポリペプチドとも天然のホルモンと比べて
予想外に良好なインビボ活性を有し、動物、特にヒツジ
およびウシにおいて、たとえば肉質の改良および／また
は体重増加の促進に用いられる。

このために用いるには、ｏＧＨｌ−１９１およびｏＧＨ
５−１９１を動物用医薬配合物の形で動物に投与するこ
とができる。

従って本発明の他の観点によれば、ｏＧＨｌ　−１９１
またはｏＧＨ５−１９１およびそれらの動物用として受
容できる塩類から選ばれる組換えポリペプチドを、動物
用として受容できるキャリヤー１種または２種以上と共
に含有する動物用医薬組成物が提供される。

ここで用いるｏＧＨｌ−１９１という語は、天然のヒツ
ジ成長ホルモンのアミノ酸配列を備え、さらにＮ末端の
余分のメチオニン残基は以下に記載するようにして除去
された組換えポリペプチドを意味するものとする。ｏＧ
Ｈ５−１９１という語は、天然のヒツジ成長ホルモンの
アミノ酸配列を備え、ただし最初の４個のＮ末端アミノ
酸（Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）が存在しないポ
リペプチドを意味するものとする。

ｏＧＨｌ−１９１および０ＧＨ５−１９５の動物用とし
て受容できる塩類には、酸または塩基の塩、たとえば無
機酸の塩、たとえば塩酸塩、または無機塩基の塩、たと
えばアルカリ金属塩、たとえばナトリウム塩が含まれる
。

本発明による組成物は経口、直腸内または非経口（埋込
みを含む）用として適した形態を含むいずれかの投与に
適した形態をとることができる。

経口投与用としては組成物はたとえば常法により製造さ
れた液剤、シロップ剤または懸濁剤−たとえば水性緩衝
液中−または固体組成物、たとえば錠剤もしくはカプセ
ル剤の形態をとることができる。非経口用としては組成
物はたとえば注射に適した形態、たとえば所望により配
合助剤、たとえば沈殿防止剤、安定剤、可溶化剤および
／または分散助剤を含有する水性または油性ビヒクル中
の懸濁剤、液剤または乳剤の形態をとることができる。

本発明による組成物においては、有効成分の濃度はたと
えば処置すべき動物の特性、および目的の効果に応じて
異なるであろうが、一般には０．０１〜０．２ｍｇ／ｋ
ｇ・生体重７日の有効成分用量の投与を容易にするのに
十分な量で用いられるであろう。

本発明による組成物は常法により製造することができ、
本発明の他の観点においては、ｏＧＨｌ−１９１または
ｏＧＨ５−１９１から選ばれるヒツジ成長ホルモン活性
を有する組換えポリペプチドおよびそれらの動物用とし
て受容できる塩類の適量を動物用として受容できるキャ
リヤー１種または２種以上と組合わせることによりなる
、動物用医薬組成物の製法が提供される。

前記のように、ヒツジおよびウシにおいて組換えヒツジ
成長ホルモンによる補助的成長ホルモン水準によって、
背部脂肪の厚さ、脂肪および赤身の割合、または赤身の
中心領域により評価して、肉質が改良される一所望によ
り飼料転換効率の改善を含めてｍ；とが見出された。

動物の健康に対して不都合な影響は認められず、これは
動物の身体組織をすべて病理学的に検査することにより
確認された。

従って本発明の他の好ましい観点においては、去勢され
ていない雄、雌、去勢された雄のヒツジおよびウシより
なる群から選ばれる動物：外来性組換えヒツジ成長ホル
モン、それらの同族体、誘導体または断片を用意し、そ
して上記動物に約３５〜１００　ｋｇの生体重において
開始して、動物が雌または去勢された雄である場合は用
量が約０．０６〜０．１０ｍｇ／ｋｇ・生体重／口とな
り；動物が去勢されていない雄である場合は用量が約０
．０１〜０．１５ａ＋ｇ／ｋｇ・生体重７日となるべく
、あらかじめ選ばれた生体重において、動物の性別に応
じてあらかじめ選ばれた一定の用量で上記の外来性組換
えヒツジ成長ホルモンを投与することを含む、肉質およ
び飼料転換効率を改良すべく動物を処置する方法が提供
される。

好ましくは組換えヒツジ成長ホルモンはｏＧＨｌ−１９
１およびｏＧＨ５−１９１から選ばれる。

好ましくは処置される動物はヒツジである。

好ましい形態においては、組換え成長ホルモンの投与は
約１５〜５０ｋｇの生体重において開始される。

好ましい開始範囲内においては、肉質の改良はより長期
間にわたって改良されるものと本質的に等しい。飼料転
換効率の相対的改良が大きい点が注目される。

肉質の改良は赤身含量の総体的増加および赤身含有割合
の増大として判定することができ、これは総体的成長速
度、同化作用またはそれら双方の増大に起因すると考え
られる。

油身に対する赤身の割合の増大は同化作用および油身含
壷低下の双方に起因すると思われる。

詳細には本発明者らは意外にも、ＧＨの用量、処置の開
始時期、処置期間、食餌によるエネルギー供給、−およ
び動物の性別の間に従来予想されなかった重要な相互作
用があることを見出した。

雌および去勢された雄のヒツジおよびウシにおいて肉質
が改良されたのは特に予想外であった。普通はこれらは
去勢されていない雄より脂肪がつきやすく、肉質が劣る
からである。

本発明者らの研究から、本発明による処置は対照と比較
して処置動物において成長速度を高めることが示された
。さらに肉質が大幅に改良され、ＧＨで処置した動物に
よる飼料利用がより効果的である結果として動物の飼料
消費がより低い。適量を越えるＧＨ用量においては成長
速度はそれ以上高められなかった。これは食欲抑制作用
が制限因子となるためと思われる。

本発明の他の観点においては、 去勢されていない雄、雌、去勢された雄のヒツジおよび
ウシよりなる群かも選ばれる動物、外来性組換えヒツジ
成長ホルモン、それらの同族体、誘導体または断片 を用意し； 上記動物に一般に一定の用量の外来性組換えヒツジ成長
ホルモンを投与し；その際動物が雌または去勢された雄
である場合は月旦は約０．０６〜０．１ｍｇ　／　ｋｇ
・生体重７日であり、処置が屠殺前約２５日間続けられ
；動物が去勢されていない雄である場合は用量は約０．
１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ・生体重７日であリ、処置が屠
殺前約２０日間続けられることを含む、畜肉の脂肪含量
を低下させる方法が提供される。

特に好ましい形態においては、投与は徐放性側形で、た
とえば埋込みベレットまたは注入ペレットまたは注入用
乳剤の形で行われる。

上記方法によって肉質が大幅に改良されるが、組換え成
長ホルモンの使用は単位用量の合成ブタ成長ホルモンを
普通は約３０日間以上、毎日投与する必要があるため、
きわめて経費および時間がかかる。

従って本発明の他の観点においては、 去勢されていない雄、雌および去勢された雄のヒツジお
よびウシよりなる群から選ばれる動物；外来性組換えヒ
ツジ成長ホルモン、それらの同族体、誘導体または断片 を用意し；そして 上記動物に、あらかじめ選ばれた生体重において、動物
の性別に応じてあらかじめ選ばれた一般に一定の用量の
上記外来性組換えヒツジ成長ホルモンを、少なくとも１
日置きに投与することを含む、肉質および／または飼料
転換効率を改良するための動物の処置法が提供される。

意外にも、投与の周期性を変更することにより、対照と
比較して成長行動が有意に改良されることが見出された
。理論によって拘束されることは望まないが、投与周期
の変更が脂肪組織および筋肉組織に対する組換え成長ホ
ルモンの相対的な抗脂質合成作用および蛋白質合成刺激
作用をそれぞれ変化させるという仮説が立てられる。さ
らに、高い用量の合成成長ホルモンを毎日投与すること
によって、脂質合成および飼料摂取はこれらに伴う成長
速度改良が一般にごくわずかであり、しばしば検出不可
能となる程度にまで抑制されるという仮説が立てられる
。

周期性を２，３または４日口毎に、すなわち１゜２また
は３日置きの投与に変更することにより、他のホルモン
（インシュリン様発育因子１）によって媒介される蛋白
質合成刺激作用は維持されるが、目的とする抗脂質合成
作用は低下すると仮定される。

より好ましくは、用量は外来性組換えヒツジ成長ホルモ
ン約１０ｍｇを２．３または４日目毎に、約ｌＯ〜３０
日間、より好ましくは３０日まで投与するものである。

成長速度を最大限にするためには、約１０ａ＋ｇの量を
２０目毎に投与することが特に好ましい。４日目毎に投
与しても対照と比較して有意の成長速度改善が得られる
が、より頻繁に投与した場合と同一の程度ではない。し
かし対照と比較して飼料転換効率は４日目毎の投与法に
よっても改良される。

本発明のさらに好ましい観点においては、用いられるあ
らかじめ選ばれた一般に一定の用量は先行技術において
普通に用いられる用量と比較して少ない。

たとえば約１０ｍｇ／日の用量が業界全体の標準である
場合、用量をこの標準伝の約５０％以下にまで低下させ
ることができる。意外にもこのような用ｍ低下が上記の
高用合の対照と比較して成長速度に対し同様な、むしろ
高められた効果を示すことが見出された。さらに、飼料
転換効率も有意に改良される。

従って、用量および投与周期の変更を組合わせて採用す
ることにより、組換え成長ホルモンが成長速度、飼料転
換効率および肉質（脂肪量など）に与える相対的効果を
変更することができる。

従ってこの処置を異なる型（遺伝子型および性）の動物
、−ヒツジおよびウシを含む−に適応させることができ
る。

従って本発明のさらに好ましい観点においては、その後
、上記外来性組換えヒツジ成長ホルモンを高められた用
量で毎日、さらにあらかじめ選ばれた期間投与し続ける ことを含む、被処置動物の成長効果をさらに高める方法
が提供される。

特に好ましい形態においては、 外来性組換えヒツジ成長ホルモンを動物に最初は約４〜
８ｍｇの用量で１，２または３０置きに約１０〜２５日
間投与し；そして その後、６〜ｌｈｇの高められた用量で毎日、さらに約
５〜１５日間投与し続ける。

意外にも、上記の投与方式によって成長速度および飼料
転換効率が全成長期間にわたってさらに著しく改良され
、−刃組換え成長ホルモンを毎日投与する後期によって
脂肪貴がさらに著しく減少し、従って屠殺前の肉質が著
しく改良されることを見出した。

好ましくは最初の処置期間は約５〜１５日間、より好ま
しくは１５〜２０日間である。後期の連日投与はさらに
約５〜１５日間、より好ましくは１０日間行うことがで
きる。

上記処理法は組換えヒツジ成長ホルモン、それらの同族
体、誘導体または塩類の供給源約３．３〜８．６■ｇ／
ｍｌの緩衝水溶液を含む動物用医薬組成物を用いて行わ
れる。

本発明の好ましい観点においては、組換えヒツジ成長ホ
ルモンは持続性放出剤形で提供することができる。持続
性放出を与える適切なデリバリ−システムはいずれも採
用できる。従って本発明は少なくとも部分的に可溶性の
キャリヤーそれに埋封された多数の、少なくとも部分的
に可溶性のマイクロカプセル、および 該マイクロカプセル内の有効量の組換えヒツジ成長ホル
モンまたはそれらの同族体、誘導体、断片もしくは塩類 を含有する持続性動物用製剤を提供する。

持続性放出型動物用製剤の少なくとも部分的に可溶性の
キャリヤーは高分子製品であってもよい。

高分子製品は埋込み剤または大丸薬（ｂｏｌｕｓ）の形
をとりうる。

組換え成長ホルモンのアジュバントとして作丹するポリ
マーを使用しうる。水溶性ポリマーを用いることができ
る。ポリマー製品は動物体内に侵入したのち約８〜２４
時間以内に崩壊することが好ましい。ポリビニルピロリ
ドン型のポリマーを使用しうる。ポリビニルピロリドン
ポリマーまたはコポリマーを用いることができる。ポリ
マーは選ばれたデリバリ−システムの衝撃に耐えるのに
十分な耐衝撃性をもつべく選ばれなければならない。

他の標準的な配合成分をポリマーマトリックスに含有さ
せることができる。この種の配合成分には充填剤および
エキステンダーが含まれる。ポリマーマトリックスはさ
らに他の有効成分を含有しうる。抗生物質、栄養補給剤
、浸漬液（ｄｒｅｎｃｈ）なども含まれる。。

ポリマー製品はいずれかの適切な様式で成形しうる。ポ
リマー製品は射出成形法により成形することができる。

前記のようにこの観点の本発明によれば持続性放出型埋
込み剤は、キャリヤーに埋封された多数の、少なくとも
部分的に可溶性のマイクロカプセルをさらに含有する。

これら多数のマイクロカプセルはポリマー製剤中にその
重合工程中に装入することができる。あるいは成形工程
でマイクロカプセルを装入することもできる。たとえば
ポリマー製品は錠剤成形法により目的の形状に圧縮成形
することができる。

打錠機を使用しうる。マイクロカプセルとポリマーは成
形前に混合される。

マイクロカプセルはいずれかの適切な、少なくとも部分
的に可溶性のポリマー材料から製造することができる。

ポリエステルポリマーを使用しうる。−ヒドロキシ酸お
よびそれらの誘導体が好ましい。

好ましい観点においては、マイクロカプセルは比較的低
い分子量を有する、グリコール酸、乳酸、それらの誘導
体、またはそれらの混合物の第１ポリマーまたはコポリ
マー、および比較的高い分子量を有する、グリコール酸
、乳酸、それらの誘導体、またはそれらの混合物の第２
ポリマーまたはコポリマーから形成しうるｉより好まし
くは、多数の生物分解性マイクロカプセルは少なくとも
２種の粒径に形成される。

さらに好ましい観点においては、多数の生物分解性マイ
クロカプセルには、比較的短期の分解速度、中期の分解
速度、もしくは比較的長期の分解速度をもつマイクロカ
プセル、またはそれらの混合物が含まれる。前記のよう
に、分解速度、そしてそこに内包される生理活性成分の
放出速度は、異なるポリ甘−の組成物を用いることによ
り、および／または用いるポリマーの分子量を変えるこ
とにより変化させることができる。

組換えヒツジ成長ホルモンはいずれかの適切な方法でマ
イクロカプセルに封入することができる。

カプセル封入法には、ポリエステルまたはコポリエステ
ルと組換えヒツジ成長ホルモンを適宜な溶剤中で混合し
；そしてポリエステルを沈殿させることが含まれる。

たとえば組換えポリペプチドを適宜常法によりキャリヤ
ーと混合もしくはブレンドし、またはキャリヤーに懸濁
もしくは溶解することができる。

本発明を下記の実施例につきより詳細に記述する。ただ
し以下の記載は説明のためのものにすぎず、前記の本発
明の一般性に対する限定ととるべきではない。

実施例　１ 方法および結果 プラスミドｐＭＧｏＧＨ１の構成法を第２図に模式的に
示す。

（１）　　発現ベクターｐ　Ｍ　Ｇ　１９７の調製最終
発現構造体はｃＤＮＡを宿主中に安定に保持し、かつ効
果的な転写および翻訳を行いうるにの適したベクターを
含む。これらの機能はプラスミド発現ベクターｐ　Ｍ　
Ｇ　１９７により与えられる。ｐ　Ｍ　Ｇ　９３９−セ
ルチク社のブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の発現コードす
るｐ　Ｍ　Ｇ　１９７の誘導体−を塩類媒質である制限
酵素処理用緩衝液、５０ｄ争Ｎ　ａ　Ｃ１ｌ　、　　１
０ｍＭ）リス、　　Ｃ９ｐＨ１，５，ＬＯｍＭ・ＭｇＣ
，Ｑ　　、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中でＥ
ｃｏＲＩおよびＢｇｌＩｒにより制限酵素処理した。次
いでこれをウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）
によりホスファターゼ処理した。ホスフェート基の除去
によってベクター自体の再すゲーションが最小限に抑え
られる。主ベクター断片をｐＧＨｃＤＮＡから０．８％
低融点（ＬＭＴ）プガロースゲル電気泳動により精製し
た。６．５キロ塩基対（ｋｂ）アガロースの切片をゲル
から切取り、５０℃での溶融によりＤＮＡを溶出させ、
ドライアイス中でフェノールにより抽出した。水相に含
まれる制限ベクターｐ　Ｍ　Ｇ　１９７をキアゲン（Ｑ
ＩＡＧＥＮ）により洗浄した。

調製 ５′末ＨｇｉＡＩ部位にリゲートさせるべくデザインさ
れた２対の異なるオリゴヌクレオチドをホスフォトリエ
ステル化学によりブレサテク社（南オーストラリア、ア
ゾレード）において合成した。

５“ＧＡＴＣＴＡ！汀胃叩ＡＧＣＴＡ　　　　　　　　
　　　　　ＡＡ印ロπ正ゴ３゛５ｍｃｒ ３　’　　　ＡＴＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＴＣＧＡＴＡＣ
ＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＩＩ；ＡｍＡ
Ｃ５７ｍｃｒ ５’ＧＡＴＣＴＡ　　　　　　　−ＡＡ［ｈｃｒ ３°　　　ＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＡ
ＡＧＣＧＡＴｒＧＣＧＡＣ２ｍａｒ ５“ Ｍｅｔｌ−１５は５５ｉｅｒと４７ｉｅｒからなり、下
記により構成された。３方向リゲーシヨンの効率を最大
限にするために、５５ｉｅｒオリゴ体を相補的４７ｍｅ
ｒにアニールする前にキナーゼ処理した。これらのオリ
ゴ体がなおりｇ１１１部位を介して２量体を形成する可
能性はあったが、三重リゲーションの各成分のリン酸化
パターンによりこれらが適正な順に組立てられるチャン
スが増大した。

５５ｉｅｒを３７℃で２時間、　１０ｍＭトリス、　　
ＣＮ　　ｐＨ７，５゜１０ｄφＭｇＣ９、ｌｈＭｌｌＤ
ＴＴ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位を用いる
１ｍＭ・ＡＴＰ中においてキナーゼ処理し、６５℃で１
０分間インキュベートし、室温にまで徐々に放冷するこ
とにより４７ｉｅｒにアニールした。アニールしたオリ
ゴ体を酢酸アンモニウム／エタノール沈殿して、取込ま
れなかった３２Ｐを除去し、１０ｍＭ　）リス、Ｃｌｐ
Ｈ８゜１ｍＭ＋１ＥＤＴＡ、、（ＴＥ）！、：再懸濁し
て、リゲートしうる状態となった。同様に、Ｍｅｔ：５
−１５オリゴヌクレオチドダイマーを、初めに４０ｍａ
ｒオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、続いて３０ｍ
ｅｒオリゴヌクレオチドにアニールすることによって調
製した。

（ｉｉｉ）ｏＧＨｃＤＮＡの調製 ｏＧＨ１２をＨｇ１ＡＩおよびＥｃｏＲＩで制限酵素処
理しく１５０ａ＋Ｍ・Ｎ　ａ　ＣＤ　、　１０ｍＭ）リ
ス、　　Ｃ９ｐＨ８，ｏ　、　１０＋ａＭ番Ｍ　ｇ　Ｃ
１、１０ｍＭメルカプトエタノール、　１１００ｔ１／
　ｍｌ　　Ｂ　Ｓ　Ａ中）、アミノ酸１６−１９１に相
当する６５０ｂｐ断片を放出させた。これをＬＭＴ　　
ｉ％アガロース電気泳動により精製し、８５０塩基対（
ｂｐ）を含むアガロース切片をゲルから切取り、６０℃
で１０分間溶解させた。これをドライアイス中でフェノ
ールにより抽出し、カイゲンにより洗浄した。

リゲーションはＩＯＩＭ　）リス、　　ＣＩ　ｐＨ７，
５，１０ｍＭ・ＭｇＣＮ　２　、５０ｍＭ−Ｎａ　Ｃ，
Ｑ　、　１ｈＬ　ＤＴＴ、　１畦・ＡＴＰ中で１２℃に
おいて一夜、ベクターに対し約１０倍過剰モル濃度のｏ
ＧＨｃＤＮＡおよび５′オリゴヌクレオチドダイマー末
端を用いて、ＳＵ　　Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼの存在下
に行われた。

Ｍｏｔ：　１−１５を用いるリゲーション（ｌ　ｉｇａ
ｔ　１ｏｎ）反応の例を以下に示す。

−・・・・・・・・・・・−［Ｆ］□ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　ＢｇｌｌＩ　　ＢｇｌＩＩ　
　　　　Ｈｇ１ｌ［Ｆ］□ Ｈｇ１Ａ　　Ｉ プラスミドｐＭＧｏＧＨ１の制限地図を第２図に示す。

受容能力をもつ大腸菌ＤＨ１細胞を以下の方法により票
製した。細胞をルリア培地（Ｌ　Ｂ）中で０．Ｄ、０．
３となるまで培養し、３０００　ｇで採取した。細胞ベ
レットを０，４容量の冷却した５０ｍＭ・Ｃａ　ＣＤ　
２に再懸濁し、４０分間氷上に放置した。

次いでこれらを１５０　ｇで遠沈し、０．０４容量の５
０１・ＣａＣ，Ｑ２に再懸濁し、４０分間氷上に保持し
たのちｐＭＧｏＧＨ２リゲーション生成物で形質転換し
た。

リゲーション生成物を徐々に受容能力をもつ大腸菌に添
加し、氷上に２０分間放置し、次いで４２℃で９０秒間
の熱ショックを与えた。細胞をＬＢ中で４５分間増殖さ
せて抗生物質耐性マーカーを発現させ、アンピシリン（
Ａｍｐ）選択下にＬＢ平板上に接種した。これらの平板
を３０℃で一夜増殖させた。

（ｖｌ）形質転換細菌のオリゴヌクレオチドスクリーニ
ング 形質転換体をレプリカ平板培養し、これにより誘導され
ていない、および誘導された形質転換体をスクリーニン
グし、比較した。マスタープレートからアマジャム・ハ
イボンドフィルター上に写しとり、マスタープレートと
関連した向きに配置した。第２フイルターを第１フイル
ターに乗せ、両者を２枚のガラス板の間に入れた。第２
フイルターは第１フイルターと関連した向きに配置され
た。これらのフィルターを新鮮なＬＢ　　Ａ■ｐ平板上
にコロニー側を上に向けて乗せ、３０℃で微生物コロニ
ーが再増殖するまでインキュベートした。

次いで１組のフィルターを４２℃で３０分間インキュベ
ートし、次いで３７℃に移して３時間インキュベートし
た。この過程で誘導が形成された。次いで両組のフィル
ターを同等に処理した。

これらのフィルターを５０ｄ　トリス、Ｃｌｐｌｌｇ、
０．　１ｍＭ壷　ＮａＣ１、１ｍＭ・　ＥＤＴＡ、　　
０．１％ＳＤＳ中で４２℃において１時間、予備洗浄し
た。これ　らを次いで５ｘ　　５ＳＰＥ　（０，７５Ｍ
ＮａＣρ、　０．０５Ｍ　　Ｎａ、Ｈ２ｐｏ４”Ｈ２Ｏ
。

０．００５Ｍ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）、５ｘデンハ
ルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）溶液（０，５％ポリビニル
ピロリジン、０．５％ウシ血清アルブミン、０．５％フ
ィコール４００）、　　０．５％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　２
０Ｍｇ／　ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で６５℃において
４時間プレハイブリダイズした。放射性同位元素で標識
したプローブは、マニアチス（Ｍａｎｌａｔｉｓ）らに
よって“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｌｎｇ、　Ａ　１
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　”　（Ｃｏｌｄ
　ＳｐｒｊｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社
、ニーニーヨーク）に記載されているように、５５ｍａ
ｒオリゴヌクレオチドと１７ｍａｒ　（後記参照）とを
７３２ｐ−標識ＡＴＰ　（アマシャム　ｐｔｙ、　Ｌｔ
ｄ、）とキナーゼ処理することによって調製した、フィ
ルターをまず上記プレハイブリダイゼーション溶液中で
６５℃において一夜、３２Ｐ　　５５ｍｅｒにつきスク
リーニングした。他方のプローブは必要になるまで４℃
に保存された。

５°ＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡ　３°　ｏＧ
ｆ−１１７−ｍｏｒフィルターを０．１ｘ　　Ｓ　Ｓ　
Ｃ１０，１％　ＳＤＳ中で６５℃において４回洗浄し、
Ｘ線フィルムに一夜露光した。フィルターを蒸留水中で
３０分間煮沸して上記プローブをストリップし、６５℃
で一夜、ｏ　ＧＨ３２Ｐ　１７−　ｍｅｒと再ハイブリ
ダイズした。

フィルターを５ｘ　　５ＳＣ１０，Ｌ％ＳＤＳ中で４回
−４５℃で２回、５０℃で２同一洗浄した。これらを−
夜露光した。

両プローブにつき陽性の信号を与えた６個のコロニーを
１０ｍ１のＬＢ　　Ａｍｐ中へ採取し、３０℃で増殖さ
せた。これらの培養物を２００ｍ１のＬＢ　　Ａｍｐ培
養物への接種に用い、グリセリン原液を乗せ・−７０℃
に保存した。大量培養物を３０℃で中間対数期（０，Ｄ
、　−０，５）にななるまで増殖させ、ＤＮＡおよび蛋
白質分析用試料を採取した。次いでこれらを４２℃で３
０分間誘導したのち、３７℃で４時間増殖させた。再び
試料を採取した。

精製 誘導されていない、および誘導された大腸菌ＤＨＩ培養
物から５ＤＳ−アルカリ溶解法により組換えＤＮＡを単
離した。この方法では、細胞を溶解し、１％５ＤＳ１０
．２ＭφＮａＯＨ中でＤＮＡを変性した。５Ｍ酢酸カリ
ウムの添加により小型のプラスミドＤＮＡは再生しうる
が、染色体ＤＮＡはこれらの条件下で完全に再生するに
は大きすぎる。清澄スピンにより細胞残層がベレット化
し、可溶性核酸は溶液中に残される。これらをイソプロ
パツール沈殿させ、ＤＮＡをＣｓ　Ｃｆｌ濃度勾配によ
りＲＮＡから精製分離する。誘導はアガロースゲル電気
泳動によって、より高いＤＮＡ収率として証明された。

精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌｆｆに
より制限酵素処理することによって、５個のクローンが
６５０ｂｌ）ｏＧＨの挿入配列を保有することが証明さ
れた。

非誘導および誘導培養物からの細胞ベレットを電気泳動
用緩衝液に再懸濁し、試料を２個の等しい１２％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上で走行させた。一方はクマ
シー染色し、他方はウェスタン・プロット分析法（後記
参照）により免疫反応性成長ホルモンの存在につき分析
した。染色したゲルは精製ｏＧＨと同伴泳動した蛋白質
の有意の誘導がないことを示した。

した。これらのフィルターをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）／１％ツウィーン１０．５％ＢＳＡ中にプロットし、
次いでｐＧＨ２１−５１に対するビオチニル化モノクロ
ーナル抗体と共にＰＢＳ／ツウィーン／ＢＳＡ中でイン
キュベートした。

次いでこれをビオチン部分を介してＰＢＳ／ツウィーン
／ＢＳＡ中で、セイヨウワサビ拳ペルオキシダーゼに結
合したアビジンと反応させた。

このプロットをジアミノベンジドおよび過酸化水素で発
色させ、抗体に結合したｐＭＧｏＧＨ２が以下の発現操
作のために大腸菌ｌＢ５９２中へ形質転換すべく選ばれ
た。Ｍｅｔ：　１−１５と５−１５リゲ一シヨン反応と
に由来する形質転換体はモノクローナル抗体に結合し、
そしてさらなる発現操作のために大腸菌ｌＢ５９２に形
質転換されることが選択された。

電気泳動した蛋白質をニトロセルロース上にエレクトロ
ブロッティングし、下記に従って処理シークエナーゼ（
ＳＥＱＵＥＮＡＳＩＥ：　ｕ、　ｓ、バイオケミカル社
）を用いその使用説明書に従って使用し、そしてプラス
ミド鋳型と共に用いるために改質されたサンガー法によ
り、Ｃｓ　Ｃ１精製ｐＭＧｏＧＨプラスミドＤＮＡの配
列を決定した。４０ｍｅｒ。

３２ａ＋ｅｒおよび１７ａ＋ｅｒをブライマーとして用
いて、ＢｇｌＩＩおよびＨｇｌＡＩ部位を通る配列を決
定し、リーディングフレームを確認した。

７ｍａｒ ←−−〜〜−３’　−５’ ２Ａｅｒ ←−−〜−−３’　　　　　５’ ５′３′〜〜−〜〜→ ０ｍｅｒ ＢｇｌＩＩ　　　Ｈｇ１Ａ　Ｉ　　　　　　　ＥｃｏＲ
ＩｐＭＧｏＧＨプラスミドＤＮＡを０．２ＭφＮａＯＨ
中で室温において５分間変性し、１．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム／エタノール中で沈殿させた。プラスミドＤＮＡ３
■対オリゴヌクレオチドブライマー０．５ピコモルを８
７℃で２０分間アニールした。３５Ｓ放射性標識反応を
室温で５分間実施し、４２℃、５分間で終止させた。試
料を７０℃で１０分間変性させ、５％アクリルアミド配
列決定用ゲルに負荷した。

ゲルを１０％酢酸／１０％メタノール中で３０分間固定
し、乾燥させたのち、フィルムに一夜露光した。

プラスミドｐＭＧｏＧＨ１およびｐ　Ｍ　Ｇ　ｏ　Ｇ　
Ｈ２の配列を第３図に示す。

（ｘｉｉ）大腸菌ｌＢ５９２の形質転換およびｏＧＨの
発現 Ｃｓ　Ｃｊ２精製ｐＭＧｏＧＨ１プラスミドＤＮＡによ
り大腸菌ｌＢ５９２細胞を形質転換した。細胞はＰＥＧ
−二価カチオン法により調製された。

この方法で細胞をＯ，Ｄ−ＯＪになるまで増殖させた。

次いでこれらを５００ｇで１０分間ベレット化し、ｌ／
１０容量の冷却した形質転換および保存用溶液（ＴＳＳ
）に再懸濁した。ＴＳＳはｌＯ％ｗ／ｖＰ　Ｅ　Ｇ　−
８０００，５％ｖ／ｖＤ　Ｍ　Ｓ　０　、２０＋ｅＭ　
・ＭｇＣＮ２　　（ｐＩ１６．５）を含有するＬＢから
なる。

１００μｇの細胞を形質転換用プラスミドと共に氷上で
３０分間インキュベートした。０．９ｍｌのＴＳＳを添
加し、形質転換用細胞を３７℃で１時間振とうして抗生
物質耐性を発現させたのち、ＬＢ　　Ａｍｐ（１００■
／　ｍｌ　）寒天平板上に接種した。平板を３０℃で一
夜インキユベートした。前記と同様に非誘導および誘導
コロニーのレプリカリフトをハイボンド（ｌ１ｙｂｏｎ
ｄ）上に形成し、３２Ｐ放射性標識５５ｍｅｒによりス
クリーニングした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄
の条件は大腸菌ＤＨＩ形質転換体につき述べたものと等
しかった。

すべてのコロニーがプローブとハイブリダイズし、３個
を１０ｍ１のＬＢ　　Ａｍｐ中へ採取し、３０’Ｃで一
夜増殖させた。これらを大規模培養物の接種に用い、前
記のようにグリセリン保存培養物を調製した。ＤＮＡお
よび蛋白質の分析は大腸菌ＤＨＩにつき示した方法に従
って行われた。

誘導培地からの蛋白質のクマシー染色は、３コロニーす
べてにつき精製ｏＧＨと同伴泳動した蛋白質のわずかな
増加を示した。ウェスタン・プロット分析は２１−５１
抗体を結合しうる蛋白質の有意の誘導を示した。ＤＮＡ
および蛋白質のデータはｏＧＨの真の発現を示し、ｏＧ
Ｈｌ−１９１ｐ　ＭＧ　ｏ　Ｇ　Ｈ１形質転換体がバン
グ（オーストラリア）社により２００ｍ１の発酵槽中で
増殖され、ｏＧＨｌ−１９１が精製され、可溶化された
。

実施例　２ 生物活性 大腸菌中の組換えプラスミドから誘導されたヒツジ成長
ホルモンを生物活性につき試験した。

この蛋白質１００ｇ／日を下垂体切除したラット８匹／
群に４０間にわたって注射した。最後の注射の２４時間
後にラットを層殺し、右脛骨を摘出した。

骨を洗浄し、中央矢状面の近位末端で分割した。

前端軟骨を周囲の骨から分離したのち、硝酸銀で染色し
た。結果を増加率（％）で表わす。

平均 増加率（％） −ｖｅ対照： ｏｌ−１９１： 対照 ｖｅ ５．３４ 下垂体切除う ＭＧｏＧＨ 組換え体 ｏｌ　−１９１ ８，７３ ６３％ ット＋食塩緩衝液 １からの組換えＧＨ 実施例　３ 組換えｏＧＨｌ−１９１用Ｎ−末端アミノ酸配列組換え
ｏＧＨｌ−１９１（最終段階に逆相高性能液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を含む方法を用いる誘導ｐＭＧ
ｏＧＨ”　Ｉ　ＢＭ３９２体から精製）を、自動エドマ
ン（Ｅｄｍａｎ）減成を用いるＮ−末端アミノ酸配列法
により分析した。組換え蛋白質の初めの３０個のアミノ
酸配列は以下のとおりであった。

Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−３ｃｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｏ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｎ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｏ−Ｌｙｓ ２５：　２６５−２７０１゜驚いたことに、予想された
Ｎ−末端メチオニン残基はなかった。組換えｏＧＨｌ−
１９１におけるＮ−末端メチオニン残基の除去は細菌の
メチオニルアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）〔これは、オ
ラニン残基に結合したＮ−末端メチオニンを有効に開裂
する（サビン（Ｓａｂｌｎ）ら、Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　７：　７０５−７０９．　（１９８９）））の
作用によって取り除かれると考えられる。従って、組換
えホルモンは、成熟した下垂体由来の、ヒツジ成長ホル
モンと同一である。

最後に、ここに示した本発明の精神から逸脱することな
く各種の他の修正および／または変更を行いうろことを
理解するべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は発現プラスミドｐＭＧｏＧＨ１およびｐ　Ｍ　
Ｇ　ｏ　Ｇ　Ｈ２の構成法を示す。 第２図はｐＭＧｏＧＨの制限地図を示す。 この配列は、ヒツジ下垂体由来の成熟ヒツジ　　　第３
図はＰＭＧｏＧＨ１およびｐＭＧｏＧＨ２成長ホルモン
のＮ−末端と同一であった（フエ　　の５′末コ一ド配
列およびフランキングベクタールナンデス（Ｐｅｒｎａ
ｎｄｅｘ）ら、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　ｔ、ｅｔｔｅｒｓ　
　　配列を示す。 図蘭の浄書（内容に変更なし） Ｅｃｏ尺１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポリペプチ
   ドをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列；および 適切なクローニングベクター を用意し； 上記のＤＮＡ配列とクローニングベクターをリゲートし
   てＤＮＡ配列をクローニングベクター中へ配置し、分子
   クローンを形成する ことを含む、分子クローンの製法。 ２、組換えポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ配列
   が成熟ホルモンを包含するヒツジ成長ホルモンポリペプ
   チドコード部位の完全なまたは部分的なコピーを含み、
   ３′末終止コドンを越えて伸びている、請求項１に記載
   の方法。 ３、ヒツジ下垂体源を用意し； これからポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
   Ａ）を単離し、； 該ｍＲＮＡをオリゴｄＴプライマーの存在下に逆転写酵
   素で処理して、第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成
   し； ｍＲＮＡをＲＮエースＨにより酵素的に除去し、次いで
   ＤＮＡポリメラーゼ I により第２ｃＤＮＡ鎖を合成し
   ；そして こうして得た二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＴ４　
   ＤＮＡポリメラーゼと共に処理して、平滑末端分子を形
   成する予備工程を含む、請求項２に記載の方法。 ４、あらかじめ定められた長さのＤＮＡ配列がそれから
   除かれた制限酵素処理プラスミド発現ベクター；および ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポリペプチドま
   たはその一部をコードし、単細胞生物中での転写および
   翻訳のための調節要件を満たす合成５′末端配列を含む
   ＤＮＡ配列 を用意し；そして 上記ＤＮＡ配列を制限酵素処理プラスミド発現ベクター
   にリゲートする ことを含む、ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポ
   リペプチドをコードし、単細胞生物中で複製、転写およ
   び翻訳されうる配列を有するプラスミドの製法。 ５、制限酵素処理したプラスミド発現ベクターが二重開
   始点型ベクタープラスミドｐＭＧ１９７から誘導される
   、請求項４に記載の方法。 ６、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がヒツ
   ジ成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の一部のみを含
   み、合成５′末端配列および３′末端配列からなる場合
   に、さらに ヒツジ成長ホルモンをコードする完全なＤＮＡ配列の残
   部を含む追加ＤＮＡ配列を用意し；前記ＤＮＡ配列をそ
   の合成５′末端配列と３′末端配列の間の制限部位にお
   いて開裂し；そして上記の追加ＤＮＡ配列をこの制限部
   位にリゲートする ことを含む、請求項５に記載の方法。 ７、合成５′末端配列が ５′ＢｇｌII粘着末端、成熟ヒツジ成長ホルモンポリペ
   プチド中には見られないＮＨ＿２−末端メチオニン残基
   に対応する開始コドン（ＡＴＧ）、天然ホルモン（成熟
   形）のアミノ酸１−１５に対応するコドンを含み、ヌク
   レオチド１６０に見られるＨｇｉＡ I 部位に対応する
   ３′末オーバーハングにおいて終止する第１オリゴヌク
   レオチド；ならびに ５′ＢｇｌIIおよび３′ＨｇｉＡ I の双方の粘着末端
   を含むが、天然メチオニン残基（アミノ酸５、成熟ホル
   モン）に対応するコドンにおいて開始し、アミノ酸６−
   １５に対応するコドンがこれに続く第２オリゴヌクレオ
   チド から選ばれるオリゴヌクレオチドより形成される、請求
   項６に記載の方法。 ８、ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリペプチドをコ
   ードする、ｐＭＧｏＧＨ１またはｐＭＧｏＧＨ２から選
   ばれるプラスミド発現ベクター。 ９、ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリペプチドをコ
   ードし、単細胞生物中で複製、転写および翻訳されうる
   ＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、およ
   び 単細胞生物 を用意し； 上記の組換えプラスミド発現ベクターを形質転換、形質
   導入またはトランスフェクションから選ばれる方法によ
   り上記の単細胞生物内へ導入し；得られた生物を培養し
   ； 上記ＤＮＡ配列によりコードされる組換えポリペプチド
   を発現させ；そして所望により 該ポリペプチドを培養物から単離する 工程を含む、ヒツジ成長ホルモン活性を有する組換えポ
   リペプチドの製法。 １０、単細胞生物が大腸菌ＤＨ１および大腸菌ＩＢ３９
   ２から選ばれる菌株の大腸菌である、請求項９に記載の
   方法。 １１、ヒツジ成長ホルモン活性を有するポリペプチドを
   コードするＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベク
   ターがＰＭＧｏＧＨ１またはｐＭＧｏＧＨ２である、請
   求項１０に記載の方法。 １２、ヒツジ成長ホルモン活性を有する、ｏＧＨ１−１
   ９１またはｏＧＨ５−１９１およびそれらの獣医科用と
   して受容できる塩類から選ばれる組換えポリペプチドを
   、動物用として受容できるキャリヤー１種または２種以
   上と共に含有する動物用医薬組成物。 １３、去勢されていない雄、雌、去勢された雄のヒツジ
   およびウシよりなる群から選ばれる動物；外来性組換え
   ヒツジ成長ホルモン、それらの同族体、誘導体または断
   片 を用意し；そして 上記動物に約３５〜１００ｋｇの生体重において開始し
   て、動物が雌または去勢された雄である場合は用量が約
   ０．０６〜０．１０ｍｇ／ｋｇ・生体重／日となり；動
   物が去勢されていない雄である場合は用量が約０．０１
   〜０．１５ｍｇ／ｋｇ・生体重／日となるべく、あらか
   じめ選ばれた生体重において、動物の性別に応じてあら
   かじめ選ばれた一定の用量で上記の外来性組換えヒツジ
   成長ホルモンを投与する ことを含む、肉質および飼料転換率を改良すべく動物を
   処置する方法。 １４、組換えヒツジ成長ホルモンがｏＧＨ１−１９１お
   よびｏＧＨ５−１９１から選ばれる、請求項１３に記載
   の方法。 １５、投与が生体重約１５〜５０ｋｇにおいて開始され
   る、請求項１４に記載の方法。 １６、去勢されていない雄、雌、去勢された雄のヒツジ
   およびウシよりなる群から選ばれる動物、外来性組換え
   ヒツジ成長ホルモン、それらの同族体、誘導体または断
   片 を用意し； 上記動物に一定の用量の外来性組換えヒツジ成長ホルモ
   ンを投与し；その際動物が雌または去勢された雄である
   場合は用量は約０．０６〜０．１ｍｇ／ｋｇ・生体重／
   日であり、処置が屠殺前約２５日間続けられ；動物が去
   勢されていない雄である場合は用量は約０．１〜０．１
   ５ｍｇ／ｋｇ・生体重／日であり、処置が屠殺前約２０
   日間続けられる ことを含む、畜肉の脂肪含量を低下させる方法。 １７、組換えヒツジ成長ホルモンがｏＧＨ１−１９１お
   よびｏＧＨ５−１９１から選ばれる、請求項１６に記載
   の方法。 １８、去勢されていない雄、雌および去勢された雄のヒ
   ツジおよびウシよりなる群から選ばれる動物；外来性組
   換えヒツジ成長ホルモン、それらの同族体、誘導体また
   は断片 を用意し；そして 上記動物に、あらかじめ選ばれた生体重において、動物
   の性別に応じてあらかじめ選ばれた一般に一定の用量の
   上記外来性組換えヒツジ成長ホルモンを、少なくとも１
   日置きに投与する ことを含む、肉質および／または飼料転換効率を改良す
   るための動物の処置法。 １９、外来性成長ホルモンが１、２または３日置きに投
   与される、請求項１８に記載の方法。 ２０、組換えヒツジ成長ホルモンがｏＧＨ１−１９１お
   よびｏＧＨ５−１９１から選ばれる、請求項１９に記載
   の方法。 ２１、用量が、外来性組換えヒツジ成長ホルモン約１０
   ｍｇを２、３または４日目毎に、約１０〜３０日間投与
   するものである、請求項２０に記載の方法。 ２２、去勢されていない雄、雌、および去勢された雄の
   ヒツジおよびウシよりなる群から選ばれる動物； 外来性組換えヒツジ成長ホルモン、それらの同族体、誘
   導体または断片 を用意し；そして 上記動物に、あらかじめ選ばれた生体重において、上記
   外来性組換えヒツジ成長ホルモンを、最初はあらかじめ
   選ばれた一般に一定の、低い用量においてあらかじめ選
   ばれた期間投与し、 その後、上記外来性組換えヒツジ成長ホルモンを高めら
   れた用量において毎日、さらにあらかじめ選ばれた期間
   投与し続ける ことを含む、肉質および／または飼料転換効率を改良す
   るための動物の処置法。 ２３、外来性組換えヒツジ成長ホルモンを動物に最初は
   約４〜８ｍｇの用量で１、２または３日置きに約１０〜
   ２５日間投与し；そして その後、６〜１０ｍｇの高められた用量で毎日、さらに
   約５〜１５日間投与し続ける ことよりなる、請求項２２に記載の方法。 ２４、外来性組換え成長ホルモンを動物に最初は１また
   は２日置きに約１０日間投与し；そしてその後毎日、約
   １０日間投与し続ける ことよりなる、請求項２３に記載の方法。 ２５、少なくとも部分的に可溶性のキャリヤー、それに
   埋封された多数の、少なくとも部分的に可溶性のマイク
   ロカプセル、および 該マイクロカプセル内の有効量の組換えヒツジ成長ホル
   モンまたはそれらの同族体、誘導体、断片もしくは塩類 を含有する、持続性放出型動物用製剤。 ２６、製剤が埋込み剤または大丸薬であり、少なくとも
   部分的に可溶性のキャリヤーが動物体内に侵入したのち
   約８〜２４時間以内に分解する水溶性ポリマーである、
   請求項２５に記載の持続性放出型動物用製剤。 ２７、ポリマーがポリビニルピロリドンポリマーまたは
   そのコポリマーである、請求項２６に記載の持続性放出
   型動物用製剤。