KR100219970B1 - 재조합 비만 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비만 및 관련 질환 또는 질병의 치료, 예방 및 억제를 위한 동물 및 인간의 체중을 조절하는 단백질, 및 상기 생물학적으로 활성인 단백질을 정제되고 균질한 형태로 재조합에 의해 발현시키는 것에 관한 것이다.

Description

재조합 비만 단백질
제1도는 인간 ob 단백질의 두개의 클론, 즉 hob c11 및 hob c12의 개략도이며, 인간 ob cDNA 서열의 5' 및 3'에 위치한 제한 부위의 위치 및 유형을 도시한다.
제2도는 pLPPsOmpA mob 발현 벡터의 제작도이다.
제3도는 pLPPsOmpA hob1 발현 벡터의 제작도이다.
비만은 서구 사회에서 가장 흔한 영양 질환으로 보고되어 있다[Zhang, Y. et al., Nature 372, 425-432(1994)]. 10명의 미국인 성인중 3명 이상이 그들의 이상 체중보다 적어도 20% 넘게 체중이 나간다[Zhang, Y. et al., 상기 문헌]. 증가된 체중은 그것이 제2형 진성 당뇨병(즉, 인슐린 비의존성 진성 당뇨병), 고혈압 및 과지질혈증과 같은 중요한 의학적 이환상태와 관련되어 있으므로 공중 보건상의 문제이다[Grundy, S.M. 및 Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696(1990)]. 체중은 생리학적으로 조절되고, 비만(및 이와 관련된 질병 또는 질환)은 부분적으로 이러한 조절의 이상으로 인한 것이라는 증거가 있다[Zhang, Y. et al., 상기 문헌].
설치류에서, 살찐 표현형을 야기하는 7개의 단일 유전자 변이가 기술되었고 그중 다섯은 마우스에 존재한다. 이들 7개의 설치류 모델중에서, 가장 집중적으로 연구된 것은 1950년에 밝혀진 마우스의 obese(ob) 유전자 변이이다[Ingalls, A.M. et al., J. Hered. 41, 317-318(1950)]. 이 ob유전자 변이에 대해 동형 접합인 마우스는 사람의 병적 비만을 닮은 증후군의 일부로서, 심하게 살이 찌고, 제2형 진성 당뇨병이 발병하고, 섭식항진 및 대사저항를 나타낸다[Friedman J.M. et al., Genomics 11, 1054-1062(1991)]. 이 ob유전자는 마우스의 근위 염색체 6에 위치하고 지방조직에서 발현된 단백질(즉, ob단백질)을 코드한다[Zhang, Y. et al., 상기 문헌]. ob유전자 변이에 대해 동형 접합인 마우스는 이 ob 단백질을 거의 또는 전혀 생산하지 못하고, 따라서 체중 조절이 불완전하여 비만에 이르게 된다.
쥐 또는 인간 ob 단백질은, 체중을 조절하는 ob 단백질의 생산 및/또는 기능이 방지되거나 방해되는, 그들의 상응하는 obses(ob) 유전자가 결함 또는 변이된 환자에게 투여할 수 있다. 따라서, 이 단백질을 사람 및 동물에서 비만 및 그와 관련된 질환 및 질병을 억제, 예방 또는 치료하기 위한 호르몬-유사 물질로서 사용할 수 있다.
쥐 또는 인간 ob 단백질을 이러한 방식으로 사용하기 위해서는, 이 단백질들을 복강내, 정맥내, 근육내 또는 피하와 같은 다양한 경로에 의해, 빈번한 투여량으로 주사를 통해 투여할 수 있다 쥐 또는 인간 ob 단백질은 주사를 통해 빈번하게 투여되므로, 이 단백질을 바람직하게는 균질하게 정제되고, 오염 단백 물질을 포함하지 않고, 가용성이며 생물학적으로 활성인 형태로 재조합에 의해 발현시키는 것이 중요하다. 주사용 약제에 존재하는 오염물질이 종종 독성 부작용 또는 면역학적 역반응을 야기할 수 있다는 것은 당업자에게 공지되어 있다.
쥐의 ob 유전자 서열은 쟝(Zhang)등의 상기 문헌에 개시되어 있지만, 쥐 또는 인간 ob 단백질을 발현시키는 방법은 보고된 바 없고, 이 단백질들을, 그로부터 단백질이 균질하게 정제될 수 있는 생물학적으로 활성이고 가용성인 상태로 생산하는 방법은 더더욱 보고된 바 없다. 따라서, 쥐 또는 인간 ob 단백질을 균질하고, 가용성이며, 생물학적으로 활성인 상태로 발현 및 생산하는 것은 중요하며, 이는 본 발명의 목적이기도 하다.
재조합 인간 및 쥐 ob 단백질을 생물학적으로 활성이고 가용성인 상태로 발현시키고, 그 후, 제2형 진성 당뇨병, 고혈압 및 과지질혈증 등과 같은 비만 및 그와 관련된 질환 및 질병을 치료, 예방 또는 억제하기 위한 환자에게 주사하기에 적합한 균질성으로 정제할 수 있다는 것이 발견되었다.
본 발명에 따라, 먼저 대장균(Eschericia coli; E. coli)용 신규 발현 벡터를 제작함으로써 인간 및 쥐 ob 단백질을 재조합에 의해 생물학적으로 활성인 형태로 생산하고 균질하게 정제할 수 있다. 이 발현 벡터들은 프로모터 및 DNA 서열을 포함하며, 이 DNA 서열은 두 부분, 즉, 대장균의 외막 단백질 A(즉, sOmpA)의 시그날 펩타이드 및 인간 또는 쥐 ob 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코드한다. 본 발명에 따라, 생물학적으로 활성인 재조합 형태의 인간 및 쥐 ob 단백질을 생산하기 위한 다음 단계는 이 발현 벡터를 대장균 숙주에 삽입함으로써 융합 단백질의 효과적인 발현 및 페리플라즘 공간(periplasmic space; 즉, 대장균의 내부 및 외부 세포막 사이)으로의 전위가 이루어지고, 이때 시그날 펩타이드는 ob 단백질로부터 절단되어 ob 단백질을 가용성이고 생물학적으로 활성인 형태로 만든다. 다음으로, 숙주 대장균 세포를 한랭삼투 충격(cold osmotic shock)으로 처리하면 ob 단백질을 가용성이고 생물학적으로 활성인 형태로 세포가 없는 배지내로 효과적으로 분비되고, 이때 ob 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과를 순서대로 연속적으로 사용함으로써 균질하게 정제한다.
본 발명은 또한 1) sOmpA의 시그날 펩타이드 및 인간 또는 쥐 ob 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터; 2) 이러한 발현 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 생물; 3) 인간 ob 단백질을 코드하는 DNA 서열; 및 4) ob 단백질의 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 콘쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 재조합 인간 및 쥐 ob 단백질을 생물학적으로 활성이고 가용성인 상태로 발현시키는 방법, 및 이 단백질들을 동물 및 사람에게 투여하기에 적합한 정제되고 균질한 형태로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 쥐 ob 단백질의 발현 및 생산 방법은 쟝 등의 상기 문헌에 보고된 바와 같은 쥐 ob 유전자를 이용하여 이루어지며, 상기 유전자의 서열은 본 원에서 서열 번호:1로서 밝힌 702 염기쌍(bp) 뉴클레오티드 서열이다. 이 쥐 ob 유전자 서열은 뉴클레오티드 36의 시작 코돈에서 시작하고 뉴클레오티드 537의 정지 코돈에서 종료되고 3' 및 5' 양말단에 비번역 서열을 갖는 501 bp 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 포함한다. ORF는 뉴클레오티드 36부터 98까지 63bp 시그날 서열을 포함한다.
이 쥐 ob 유전자 서열(서열 번호:1)은 아미노산 서열이 길이가 167 아미노산이고 서열 번호:2의 밝힌 쥐 ob 단백질(및 그의 시그날 서열)을 코드한다. 서열 번호:2의 단백질에서, 처음 21개 아미노산은 쥐 ob 단백질의 시그날 서열을 나타낸다. 성숙 쥐 ob 단백질(시그날 서열이 없는)은 아미노산 22(Val)에서 아미노산 167(Cys)에 이르며 서열 번호:3으로 표시된다.
본 발명에 따른 인간 ob 단백질의 발현 및 생산 방법은 인간 ob 유전자를 이용하여 이루어지며, 상기 유전자의 서열은 본 원에서 서열 번호:4로서 밝힌 690 bp 뉴클레오티드 서열이다.
쟝 등은 상기 문헌에서 인간 ob 유전자를 쥐 ob 유전자에 매우 상동적이라고 보고하고, 1) 인간 지방 조직에서 유래된 클론들의 cDNA 라이브러리를 선별하고, 2) 인간 ob 유전자를 가진 클론들을 확인하고, 3) 인간 ob 유전자 서열을 단리하고 서열화하기 위해 사용될 수 있는, 쥐 ob 유전자에 대해 유도된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 통상적인 방법인 개시하고 있다. 통상적인 수단에 의해 서열을 확인할 때, 이 인간 ob 유전자 서열은 서열 번호:4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 확인된다.
쥐 ob 유전자와 같이, 인간 ob 유전자는 뉴클레오티드 37의 시작 코돈에서 시작하고 뉴클레오티드 538의 정지 코돈에서 종료되고 3' 및 5' 양말단에 비번역 서열을 갖는 501 bp 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. ORF는 뉴클레오티드 37부터 99까지 63 bp 시그날 서열을 포함한다.
이 인간 ob 유전자 서열(서열 번호:4)은 아미노산 서열의 길이가 167 아미노산이고 서열 번호:5로 밝힌 인간 ob 단백질 및 그의 시그날 서열을 코드한다. 길이가 167 아미노산인 이 단백질의 처음 21개 아미노산은 시그날 서열을 나타낸다. 성숙 인간 ob 단백질(시그날 서열이 없는)은 아미노산 22(Val)에서 아미노산 167(Cys)에 이르며 서열 번호:6으로 표시된다.
쟝 등은 상기 문헌에서 쥐 및 인간 ob 단백질들 사이의 84% 동일성을 보고한다. 쟝 등은 또한 상기 문헌에서 쥐 및 인간 단백질들의 변형체가 존재하며, 하나의 상기 변형체는 두 종에서 모두 글루타민 49의 결실을 특징으로 함을 보고한다. 쥐 지방 조직 및 인간 지방 조직으로부터 유래된 라이브러리에서 대략 30%의 cDNA 클론들이 코돈 49 결실을 가진다[Zhang, Y. et al., 상기 문헌].
하기 용어들은 다음과 같은 정의를 가진다:
쥐 ob 단백질(mob)은 그의 생물학적 특성이 비만 또는 그와 관련된 질환 및 질병을 치료, 억제 또는 예방하는 것과 관련된, 서열 번호:3의 단백질을 말한다. 상세하게는, 쥐 ob 단백질을 서열 번호:3의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖고, 또한 하기의 생물학적 활성을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 정의한다:
1) 헤일리 및 맥코믹(Haley and McCormick)의 방법(Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15(1957))을 이용하여, 단백질 또는 폴리펩티드를 대뇌실내(intracerebroventricular, ICV) 주사에 의해, 적어도 30그램의 체중을 갖는 16-18시간 금식한 성숙한 살찐 ob/ob 마우스에 20μg 이하의 투여량으로 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 급식 시험동안 섭식량을 비히클(vehicle)이 주사된 대조구 마우스에 비해 50% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED50); (b) ICV 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 50% 감소시킴(증체량 감소에 대한 ED50); 및 2) 단백질 또는 폴리펩티드를 복강내(intraperitoneal, IP) 주사에 의해, 적어도 30 그램의 체중을 갖는 금식하지 않은 성숙한 ob/ob 마우스에, 1주일 동안 새벽과 저녁녘의 3시간째에 1일 2회씩, 1일 총 20μg이하의 투여량으로 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 및 24시간 섭식량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED20); (b) 최소 IP 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시킨다(증체량 감소에 대한 ED20).
본 원에 사용된 용어 쥐 ob 단백질은, 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해서와 같이 고의로 또는 돌연변이를 통해 우연히 변형된 단백질들을 포함한다.
인간 ob 단백질(hob)은 그의 생물학적 특성이 비만 또는 그와 관련된 질환 및 질병을 치료, 억제 또는 예방하는 것과 관련된, 서열 번호:6의 단백질을 말한다. 상세하게는, 인간 ob 단백질을 서열 번호:6의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖고, 또한 하기의 생물학적 활성을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 정의한다:
1) 헤일리 및 맥코믹의 방법(상기 문헌)을 이용하여, 단백질 또는 폴리펩티드를 ICV 주사에 의해, 적어도 30 그램의 체중을 갖는 16-18 시간 금식한 성숙한 살찐 ob/ob 마우스에 20μg 이하의 투여량으로 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 급식 시험동안 섭식량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 50% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED50); (b) ICV 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 50% 감소시킴(증체량 감소에 대한 ED50); 및 2) 단백질 또는 폴리펩티드를 IP 주사에 의해, 적어도 30 그램의 체중을 갖는 금식하지 않은 성숙한 ob/ob 마우스에, 1주일 동안 새벽과 저녁녘의 3시간째에 1일 2회씩, 1일 총 20μg 이하의 투여량으로 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 및 24시간 섭식량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED20); (b) IP 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시킨다(증체량 감소에 대한 ED20).
본 원에 사용된 용어 인간 ob 단백질은, 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해서와 같이 고의로 또는 돌연변이를 통해 우연히 변형된 단백질들을 포함한다.
핵산 및 아미노산 서열들에 대해 모두 적용할 수 있는 실질적으로 상동인 이란, 예를 들어, 순 효과가 참조 및 주제 서열들간의 불리한 기능적 차이를 야기하지 않는 하나 이상의 치환, 결실, 또는 첨가에 의해 참조 서열과 달라진 변이 서열인 특정 주제 서열을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 95% 이상의 상동성, 동등한 생물학적 특성, 및 동등한 발현 특징을 갖는 서열들은 실질적으로 상동인 것으로 간주한다. 상동성을 결정하기 위해, 성숙 서열의 절단은 무시되어야 한다. 더 낮은 정도의 상동성, 비슷한 생활성(bioactivity), 및 동등한 발현 특징을 갖는 서열들은 실질적인 동등물로 간주한다. 일반적으로, 상동적인 DNA 서열들은 중간 정도로 엄증한 표준 하이브리드화 조건하에서 교잡(cross-hybridization)함으로써 확인할 수 있다.
쥐 또는 인간 ob 단백질의 단편은 쥐 또는 인간 ob 단백질의 일부 또는 단편의 아미노산 서열을 갖고, 각각 쥐 또는 인간 ob 단백질의 생물학적 활성을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 쥐 또는 인간 ob 단백질의 단백질 분해에 의해 생산되거나 당분야의 통상적인 방법들에 의해 화학적 합성에 의해 생산된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
ob 단백질 또는 그의 단편은 인간을 포함하는 포유동물에 대한 단백질 또는 그의 단편의 투여가 포유동물에서 섭식량 및 증체 속도를 감소시킬 때 생물학적으로 활성이다. 인간 또는 쥐 ob 단백질의 그러한 생물학적 활성의 측정은 1종 이상의 포유동물, 특히 살찐 ob/ob 마우스에 대해 상기 목적으로 사용되는 통상적이고 공지된 시험들에 의해 수행할 수 있다. 상기 생물학적 활성을 증명하기 위한 이들 시험중 몇은 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이 ob/ob 마우스에서의 ICV시험에 따라 생물학적 활성을 측정하는데 있어서, 인간 또는 쥐 ob 단백질은 바람직하게는 20μg이하의 섭식량 감소에 대한 ED50 및 20μg이하의 증체량 감소에 대한 ED50을 갖는다. 다른 한편으로, 본원에 기술된 바와 같이 ob/ob 마우스에서의 IP시험에 따라 인간 또는 쥐 ob 단백질의 생물학적 활성을 측정하는데 있어서, 인간 또는 쥐 ob 단백질은 바람직하게는 20μg이하의 섭식량 감소에 대한 ED20 및 20μg이하의 증체량 감소에 대한 ED20을 갖는다. 일반적으로, 상술한 생물학적 활성을 나타내는 단편이 바람직하다.
레플리콘(Replicon)은 생체내에서 DNA 복제의 자율적 단위로서 기능하는, 즉, 자신의 제어하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
발현 벡터는 부착된 분절의 복제가 야기될 수 있도록 다른 DNA 분절이 거기에 부착될 수 있는, 플라스미드, 파아지 도는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘이다. 이는 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전 요소 또는 요소들, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(enhancer), (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종료 서열들의 집합체를 포함하는 전사 단위를 포함한다.
클론은 하나의 원래 길이의 DNA 서열로부터 유래되고 종종 플라스미드를 포함하는 유전 공학적 기술을 이용하여 세균 또는 바이러스에 의해 생산된 일군의 DNA 분자들이다.
시그날 서열은 발현될 단백질의 코딩 서열의 시작부분(5' 말단)에 위치한 핵산 서열이다. 이 시그날 서열은, 새로 합성된 단백질의 N-말단에, 숙주 세포가 단백질을 숙주 세포막쪽으로 또는 세포막을 통해서 전위시키도록 유도하는 시그날 펩타이드를 코드하고, 상기 시그날 펩타이드는 일반적으로 전위중 절단된다.
시작 코돈은 단백질의 코딩 서열 내에, 그리고 보통 5' 말단에 위치하는 일반적으로 ATG인 코돈이고, 단백질 서열의 첫번째 아미노산을 신호한다.
정지 코돈은 단백질의 코딩 서열 내에, 그리고 보통 3' 말단에 위치하는 넌센스(nonsense) 코돈이고, 성장하는 폴리펩티드 사슬의 종지룰 신호한다.
오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame; ORF)은 적절한 조절 서열의 제어하에 놓일 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 세포에서 아미노산 서열을 코드하는 이중쇄 DNA중의 코돈 트리플렛(triplet)의 선형 배열이다. ORF의 경계는 5'말단의 시작 코돈 및 3'말단의 정지 코돈에 의해 결정된다. 이는 "코딩 서열"로서도 역시 언급될 수 있다.
프로모터 서열은 세포내의 RNA 폴리머라제가 결합할 수 있고 하류(3' 방향)의 하나 이상의 구조 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 보통 시그날 서열 또는 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하고, 배경이상으로 검출될 수 있는 수준으로 폴리펩티드의 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 요소를 포함하도록 5'방향의 상류로 뻗어 있다.
코딩 서열 또는 ORF는 RNA 폴리머라제가 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 프로모터 서열의 제어하에 있다.
A(A는 단일 폴리펩티드임)를 포함하는 조성물은 통상적인 방법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔의 염색에 의해 검출되는 바와 같은 검출가능한 양의 오염 단백질 또는 다른 내인성 물질이 없을 때 A에 대해 균질하다. 본 발명의 목적을 위해 용어 '균질한"은 적어도 95중량%의 조성물이 단일 단백질 또는 폴리펩티드인, 단일 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 말한다.
하기 단계들은 인간 및 쥐 ob 단백질을, 그로부터 ob 단백질이 균질하게 정제될 수 있는, 다른 포유동물 단백질을 포함하지 않고 생물학적으로 활성이며 가용성인 무세포 상태로 재조합에 의해 발현시키는 방법을 개설한다. 이 단계들은 실시예에서 상세하게 예시된다.
1) 쥐 및 인간 ob 유전자의 획득
쥐 ob 단백질 및 그의 천연 시그날 서열을 코드하는 cDNA(서열 번호:1)은 쟝 등의 상기 문헌에 공개되어 있다. 이 쥐 cDNA는 통상적인 기술에 의해 올리고데옥시뉴클레오티드 DNA 프라이머를 사용한 PCR 기술에 의해 단리하고 증폭하였다. 이 DNA 프라이머 및 이들을 얻는 방법은 쟝 등의 상기 문헌에 기술되어 있다.
인간 ob 단백질 및 그의 천연 시그날 서열을 코드하는 cDNA(서열 번호:4)는 쥐 ob 유전자를 얻기 위해 쟝 등의 상기 문헌에서 사용된 것과 동일한 올리고데옥시뉴클레오티드 DNA 프라이머를 사용하여 얻는다. 통상적인 기술을 사용하여, 이 인간 cDNA는 인간 지방 세포 조직으로부터 유래된 RNA로부터 만들어진 람다 파아지 cDNA 라이브러리로부터 단리하였다.
인간 또는 쥐 ob cDNA는 cDNA 라이브러리로부터 뿐만 아니라, 다른 통상적인 방법, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 목적 세포로부터 정제된 게놈 DNA 또는 그의 단편을 클로닝함으로써도 얻을 수 있다. 이 절차들은 문헌[Sambrook et al., "DNA Cloning: A Practical Approach", Vol. Ⅰ and Ⅱ, D.N. Glover, ed., 1985, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.; Benton and Davis, Science 196, 180-182(1977); 및 Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 3961-3965(1975)]에 기술되어 있다. cDNA 라이브러리로부터 인간 또는 쥐 ob cDNA를 얻기 위해서는, 쥐 ob 유전자를 함유하는 쥐 지방세포로부터 단리된 폴리아데닐화 RNA의 역전사에 의해 제조된 프라이머를 사용하여, 벤톤과 데이비스의 방법(상기 문헌) 및 그룬스타인과 호그니스의 방법(상기 문헌)에 의한 통상적인 DNA 하이브리드화 기술에 의해 cDNA 라이브러리를 선별한다. 프라이머에 하이브리드화하는 클론들은 제한 엔도뉴클레아제 절단, 아가로즈 겔 전기영동 및 전기영동된 프라이머들을 포함하는 추가의 하이브리드화 실험("서던 블럿(Southern blots)")에 의해 분석한다. 쥐 cDNA 프로브에 하이브리드화한 몇몇 클론을 단리한 후, 한 클론의 하이브리드화 분절을 통상적인 기술에 의해 서브클론하고 서열을 확인한다.
게놈 DNA로부터 유래한 클론들은 코드화 영역외에 조절 및 인트론(intron) DNA 영역들을 포함할 수 있다:cDNA로부터 유래된 클론들은 인트론 서열들을 포함하지 않을 것이다. 게놈 DNA로부터의 유전자의 분자적 클로닝에서, DNA 단편들이 생성되고, 그중 몇몇은 목적 유전자를 코드할 것이다. DNA는 다양한 제한 효소들을 이용하여 특정 부위에서 절단할 수 있다. 다른 한편으로는, DNA를 절단하기 위해 망간의 존재하에 DNAse를 사용하거나, 예를 들어 음파처리에 의해 DNA를 물리적으로 자를 수 있다. 이어서, 선형 DNA 단편들을 아가로즈 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하지만 그것으로 한정되지는 않는 표준 기술에 의해 크기에 따라 분리할 수 있다.
근원이 무엇이든, 인간 또는 쥐 ob 유전자는 당분야의 공지 방법에 의해 유전자의 증폭을 위해 적당한 벡터내에 분자적으로 클론화될 수 있다. 어떠한 상업적으로 입수가능한 벡터도 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 cDNA는 pCDNA3 벡터로 삽입될 수 있고, 인간 cDNA는 pBluescriptSK-벡터로 삽입될 수 있다. 세균 숙주와 함께 사용하기에 적당한 벡터는 포웰즈(Pouwels) 등에 의해 문헌["Cloning Vectors:A Laboratory Manual", 1985, Elsevier, N.Y.]에 기술되어 있다. 대표적인, 그러나 비제한적인 예로서, 세균 용도로 유용한 클로닝 벡터는 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)로부터 유래된 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택가능한 표지(marker)와 세균의 복제 기점(replication origin)을 포함할 수 있다. 그러한 상업적인 벡터는, 예를 들어, pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(Promega Biotec, Madison, Wisc., USA)을 포함한다.
이들 상업적으로 입수가능한 벡터들에 삽입된 인간 또는 쥐 ob 유전자의 뉴클레오티드 서열은 당 분야에 공지된 방법에 의해, 표준 뉴클레오티드 서열분석 기술에 의해 확인할 수 있다.
인간 또는 쥐가 아닌 다른 종의 ob 단백질을 코드하는 다른 핵산도 본원에 사용할 수 있다. 따라서, 인간 및 쥐 ob 유전자와 관련하여 특정 DNA가 클론화되고 서열분석되었지만, 임의의 동물 지방세포도 잠재적으로 ob 단백질의 공급원으로서 사용할 수 있다.
2) 인간 및 쥐 ob 단백질을 위한 발현 벡터의 제작
상술한 바와 같은 방법에 따라 클론화된 인간 또는 쥐 ob 유전자를 인간 및 쥐 ob 단백질을 위한 발현 벡터를 각각 제작하기 위해 사용한다.
형질감염된 또는 형질전환된 대장균 숙주 세포에 의해 생물학적으로 활성인 인간 및 쥐 ob 단백질을 발현하기 위해서, 및 ob 단백질을 페리플라즘으로 분비하기 위해서, 신규 발현 벡터를 사용할 수 있다. 이 발현 벡터는 프로모터 및 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 포함한다. 융합 단백질은 두 부분, 즉, 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드(SOmpA)인 제1부분과 인간 또는 쥐 ob 단백질(그들 자신의 천연 시그날 서열 제외)인 제2부분으로 구성된다. 이 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열 역시 두 부분, 즉, sOmpA 펩타이드를 코드하는 제1부분과 쥐 또는 인간 ob 단백질(그들의 천연 시그날 서열 제외)을 코드하는 제2부분으로 구성된다. sOmpA 펩타이드를 코드하는 제1부분의 DNA 서열은 드 슈터(De Sutter) 등에 의해 문헌[Gene 141, 163-170(1994)]에 기술된 시그날 서열이고 서열 번호:7의 뉴클레오티드 서열을 가진다. 두 부분 DNA 서열의 제2부분은 쥐 또는 인간 ob 단백질을 코드하며 서열 번호:1 또는 서열 번호:4에서 각각의 천연 시그날 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 부분을 제외한 뉴클레오티드 서열을 각각 가진다.
서열 번호:7의 sOmpA 시그날 서열에 의해 코드되는 시그날 펩타이드는 드 슈터의 상기 문헌에 보고된 바와 같은 서열 번호:8의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 신규 발현 벡터는 프로모터 및 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 대장균 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 위해 적당한 통상적인 발현 벡터에 삽입함으로써 이루어진다.
본 발명에 따른 신규 발현 벡터를 제작하는데 있어서는, 대장균 숙주 세포에서 sOmpA 펩타이드와 ob 단백질을 포함하는 융합 단백질의 전사를 제어할 수 있는 한 어떠한 프로모터도 사용할 수 있다. sOmpA가 시그날 펩타이드로서 사용될 때에는 lac-오퍼레이터 프로머터(POlac) 및 지단백 프로모터(Plpp)를 모두 사용하는 것이 바람직하다. 대장균 내에서 그러한 발현을 위해 유용한 프로모터는 스터디어(Studier) 등에 의해 기술된 T7 RNA 폴리머라제 프로모터[J. Mol. Biol. 189, 113-130(1986)], 로어(Lauer) 등에 의해 기술되고[J. Mol. Appl. Gent. 1, 139-147(1981)] 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 ATCC 37121로서 입수할 수 있는 lacz 프로모터, 마니아티스(Maniatis)에 의해 기술되고["Moolecular Cloning:A Laboratory Manual", Cold Spring Habor 1982] ATCC 37138로서 입수할 수 있는 tac 프로모터, 알칼라인 포스파타제(phoA) 프로모터 및 괴델(Goeddel) 등에 의해 기술된 trp 프로모터[Nucleic Acids Research 8, 4057-4075(1980)]를 포함한다. 기타의 프로모터들이 대장균에서 발견되고 사용되어 왔으며, 숙련가가 그들을 본 발명의 발현 벡터내에 기능적으로 연결할 수 있도록 하는 그들의 뉴클레오티드 서열에 대한 세부설명이 공표되었다[Siebenlist et al., Cell 20, 269-281(1980)].
상세하게는, 발현 벡터는 a) 프로모터 서열, 및 b) 서열번호:3의 쥐 ob 단백질 또는 서열번호:6의 인간 ob 단백질과 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 포함한다.
다음으로, 이 신규 발현 벡터를 제작하는 방법을 기술한다. 이 방법은 실시예에 더욱 상세하게 기술되어 있고 제2도 및 3도에 묘사되어 있다. 우선, 인간 또는 쥐 ob 유전자(그의 천연 시그날 서열 제외)의 코딩 서열을 sOmpA 시그날 서열을 함유하는 플라스미드, 예를 들어, 플라스미드 pT10sOmpArPDI내로 혼입한다. 플라스미드 pT10sOmpArPDI 및 그의 구성 및 제조는 드 슈터 등의 상기 문헌에 기술되어 있다. 일단 상기 플라스미드 내로 삽입되면, 인간 또는 쥐 ob 유전자는 sOmpA 유전자와 융합하여 이 플라스미드 내에 "하이브리드 유전자 서열"을 만든다. sOmpA 유전자는 ob 유전자 코딩 서열의 5' 영역의 상류에 존재해야 한다. 그 후, 상기에 열거된 바와 같은 프로모터, 바람직하게는 지단백 프로모터(Plpp) 및 lac 프로모터-오퍼레이터(POlac)를 하이브리드 유전자 서열을 함유하는 이 플라스미드에 혼입하여 본 발명의 발현벡터를 제작한다. 이 발현 벡터의 두 개의 예를 pLPPsOmpA mob 및 pLPPsOmpA hob1으로 정하여 제2도 및 3도에 각각 나타낸다.
상기와 같은 플라스미드를 제작하기 위한 당 분야에 공지된 어떠한 방법 또는 절차도 본 발명에 사용할 수 있다. 또한, sOmpA 및 ob 유전자 서열들을 융합하고, 유전자 서열들을 적당한 플라스미드에 혼입하고, 프로모터를 혼입하여 본 발명의 발현 벡터에 이르는 순서는 중요하지 않다. 예를 들어, sOmpA 유전자 서열을 먼저 쥐 또는 인간 ob 유전자 서열에 직접 융합시켜 하이브리드 유전자 서열을 만들 수 있고, 그후 이 하이브리드 서열을 이미 거기에 혼입된 적당한 프로모터를 갖는 플라스미드에 삽입할 수 있다. 그렇지만, sOmpA 유전자 서열은 쥐 또는 인간 ob 유전자 서열의 5' 말단의 상류에 위치하여야 한다.
상기 신규 발현 벡터를 사용하여, 그리고 특히, sOmpA를 코드하는 시그날 서열을 사용하여, 쥐 또는 인간 ob 단백질은 페리플라즘 공간으로 전위될 수 있고, 거기에서 시그날 펩타이드가 적절히 절단되어 완전한 인간 또는 쥐 ob 단백질을 가용성이고 생물학적으로 활성인 형태로 만든다는 것이 발견되었다. 일단 이 페리플라즘 공간에 있던 ob 단백질은 숙주 세포에 한랭 삼투 충격을 가함으로써 다른 포유동물 단백질이 없는 세포외 환경으로 효과적으로 분비되고, 이때 ob 단백질을 생물학적으로 활성인 형태로 균질하게 정제할 수 있다.
3. 형질전환된 대장균 세포에서 인간 또는 쥐 ob 단백질의 발현
다음으로, 상술한 절차에 따라 제작된 발현 벡터들을 숙주 대장균 세포내로 삽입하여 대장균 세포를 형질전환시킨다. 영국 특허공개 제2055382A호에 기술된 대장균 K-12 균주 294(ATCC No. 31446)와 같은 임의의 대장균 균주를 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 다른 균주는 대장균 MC1061[Casadaban and Cohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207(1980)], 대장균 B, 대장균 X 1776(ATCC No. 31537), 및 대장균 W3110(ATCC No. 27325), 또는 다수가 유명 미생물 기탁기관에 기탁되어 있고 그로부터 입수할 수 있는 다른 균주들을 포함한다.
형질전환된 대장균 세포들을 적당한 세포농도까지 성장시키고 통상적인 방법에 의해 배양한다. 상기와 같이 형질전환된 대장균 숙주를 성장시키고 배양할 때, 본 발명의 발현 벡터는 효율적이고 효과적으로 쥐 또는 인간 ob 단백질이 발현되도록 하고 이 단백질들이 가용성이고 생물학적으로 활성인 형태로 숙주 대장균 세포의 페리플라즘으로 전위하도록 한다.
sOmpA 시그날 펩타이드(즉, 융합 단백질의 제1부분)은 융합 단백질이 페리플라즘으로 전위하는 동안 절단되어 다른 포유동물 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 생물학적으로 활성인 ob 단백질을 만든다. 상세하게, 다른 포유동물 단백질을 포함하지 않고 생물학적으로 활성인 재조합 인간 또는 쥐 obese 단백질의 제조 방법은 a) 프로모터 서열, 및 서열번호:3은 서열번호:6과 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 갖는 발현 벡터를 제작하고; b) 발현 벡터를 대장균 숙주 세포내로 삽입하여 대장균 숙주 세포를 형질전환시키고; c) 융합 단백질을 대장균 숙주 세포내에서 발현시키고; d) 대장균 숙주 세포를 한랭 삼투 충격 완충액으로 처리하여 다른 포유동물 단백질 및 시그날 펩타이드를 함유하지 않는 쥐 또는 인간 ob 단백질을 방출시키는 단계들을 포함한다.
형질전환된 대장균 세포의 페리플라즘에 있는, 재조합에 의해 생산된 가용성이고 생물학적으로 활성인 형태의 인간 또는 쥐 ob 단백질을 그후 균질하게 정제한다.
본원에 기술된 절차에 따라 세포 페리플라즘으로 전위된 재조합 인간 및 쥐 ob 단백질은 당분야에 공지되고 문헌[Koshland, D. and Botstein, D., Cell 20, 749-760(1980)]에 기술된 방법에 의해 숙주 세포에 한랭 삼투 충격을 가함으로써 세포외로 효과적으로 분비될 수 있다. 한랭 삼투 충격의 사용으로 ob 단백질은 다른 포유동물 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하지 않는 생물학적으로 활성인 상태로 대장균으로부터 방출된다.
상술한 절차에 따라, 형질전환된 대장균의 한랭 삼투 충격 후 삼투액에 위치한 인간 또는 쥐 ob 단백질은 생물학적으로 활성이고, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과의 조합을 사용하여 균질하게 정제할 수 다. 음이온 교환 및 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피는 임의의 순서로 수행할 수 있지만, 어느 하나의 사용은 반드시 겔 여과에 선행해야 한다.
음이온 교환 단계는 통상적인 수단에 의해 수행할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위해 바람직한 컬럼은 큐 세파로즈 패스트 플로우(Q Sepharose Fast Flow) 컬럼이다. 적당한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디에틸-(2-하이드록시프로필)아미노에틸(QAE) 그들은 함유하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트린, 셀룰로즈, 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 타입일 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피에 특히 유용한 재료는 DEAE-세파셀(Sephacel)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)이다. DEAE 그룹을 함유하는 매질이 사용될 때, 쥐 또는 인간 ob 단백질을 함유하는 추출물을 약염기성 pH, 예를 들어, pH 8.1로 사용한다. 결합된 쥐 또는 인간 ob 단백질은 트리스-HCl과 같은 적당한 완충액중의 염 구배를 적용함으로써 더욱 고도로 정제된 형태로 용출시킬 수 있다. 일반적으로, 구배의 특성은 소량의 재조합 단백질을 사용하는 예비 용출 실험에 의해 결정할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피가 정제의 제1단계로서 사용될 때, 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 통해 얻은 인간 또는 쥐 ob 단백질을 함유하는 물질은 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거친다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 소수성 그룹을 함유하는 대전되지 않은 베드(bed) 재료와의 소수성 상호작용의 서로 다른 강도에 근거하여 물질들이 분리되는 분리 기술이다. 전형적으로, 소수성 상호작용 컬럼을 우선 소수성 결합에 유리한 조건, 예를 들어, 높은 이온 강도하에 평형화한다. 시료를 용출시키기 위해 하향 염 구배를 사용할 수 있다.
임의의 소수성 상호작용 컬럼도 사용할 수 있다. 바람직한 소수성 컬럼은 페닐 세파로즈이지만, 부틸 세파로즈도 사용할 수 있다. 본 발명에 따라, 음이온 컬럼으로부터 용출된 재조합 쥐 또는 인간 ob 단백질을 함유하는 물질은 페닐 세파로즈와 같은 비교적 강한 소수성 겔을 함유하는 컬럼에 부하된다. 소수성 겔과의 소수성 상호작용을 촉진하기 위해, 예를 들어, 0.4M이상, 바람직하게는 0.4M의 황산 암모늄을 함유하는 용제를 사용한다. 이렇게 컬럼 및 시료를 50mM 트리스 완충액중의 0.4M 황산 암모늄으로 조정하고 시트를 컬럼에 가한다. 컬럼을 0.4M 황산 암모늄 완충액으로 세척한다. 이어서, 소수성 상호작용을 완화시키는 용제, 예를 들어, 감소하는 염 구배, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜, 또는 우레아로 ob 단백질을 용출시킨다. 바람직한 예는 컬럼을 트리스 완충액 및 20% 에틸렌 글리콜을 함유하는 트리스 완충액으로 연속하여 세척하는 것을 포함한다. 이어서, 트리스 완충액중 감소하는 황산 암모늄 농도 및 증가하는 에틸렌 글리콜 농도의 구배를 이용하여 ob 단백질을 컬럼으로부터 용출시킨다. 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 단계들을, 임의의 순서로, 공동으로 연속하여 사용함으로써 인간 또는 쥐 ob 단백질을 일상적으로 약 90%의 순도로 얻을 수 있다.
겔 여과 크로마토그래피 단계는 상술한 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 단계들 후에 사용하고, 임의의 통상적인 겔 여과 절차에 의해 수행할 수 있다. 마지막에 사용된 소수성 상호작용 컬럼 또는 음이온 교환 컬럼으로부터 용출된 ob 단백질은 10,000의 컷-오프(cut-off) 분자량을 가진 막(AMICON-YM10 membrane)을 이용하여 작은 부피로 농축 및 투석할 수 있다. 농축된 물질은 G100-세파덱스(Sepadex)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)와 같은 겔 여과 매질을 함유하는 컬럼에 부여할 수 있다. 이어서, ob 단백질을 SDS-PAGE를 이용한 표준 기술에 의해 그의 분자량을 근거로 하여 다른 오염물질로부터 분리할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 및 여과를 공동으로 연속하여 사용함으로써 인간 또는 쥐 ob 단백질을 일상적으로 95%의 순도로 얻을 수 있다.
정제된 쥐 또는 인간 ob 단백질의 N-말단 아미노산 서열분석은 당분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 램리(Laemli, U.K.)의 방법[Nature 227, 680-685(1970)]에 따른 전기 이동(electrotransfer), 또는 마쓰다이라(Matsudaira, P.)에 의해 기술된 절차[J. Biol. Chem. 262, 10035-10038(1987)]에 의해 실행할 수 있다 내부 서열분석 역시 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행할 수있다. 예를 들어, (니트로셀룰로즈 상의) M 밴드를 엔도프로테이나제 라이신 C(endoproteinase Lysine C)로 절단하여 펩타이드 단편을 생성한 후 HPLC 시스템으로 분리할 수 있다.
본 발명의 정제된 인간 및 쥐 ob 단백질의 생물학적 활성은, 주사에 의해 인간 환자 또는 쥐에게 ob 단백질을 빈번하게 투여하는 것이 주사하지 않은 대상 또는 대조구에 비해 감소된 섭식량 및 감소된 증체속도를 야기하는 것과 같은 것이다.
본 발명에 따라 수득하여 정제한 인간 및 쥐 ob 단백질 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 일상적인 방법, 예를 들어, 실시예 13 및 16에서 상세하게 기술한 바와 같이 헤일리 등의 절차(상기 문헌)에 따라 ob/ob 마우스에서 반복된 또는 1회의 대뇌실내(ICV) 주사에 의해 시험할 수 있다. 이 ICV시험에 근거하여, 섭식량을 감소시키기 위한 ED50 및 증체량을 감소시키기 위한 ED50을 결정할 수 있다. 또한, 정제된 인간 및 쥐 ob 단백질 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 실시예 15에 상세하게 기술한 바와 같이 ob/ob 마우스에서 반복된 IP 주사에 의해 측정할 수 있다. 이 IP 시험에 근거하여, 섭식량을 감소시키기 위한 ED20 및 증체량을 감소시키기 위한 ED20을 결정할 수 있다.
본 발명에 따라 수득하여 정제한 인간 및 쥐 ob 단백질 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Muurahainen, N. E. et al., Am. J. Physiol. 260, 672-680(1991)]에 기술된 방법에 따라, 또한 실시예 14 및 17에 상세하게 기술한 바와 같이, ob 단백질을 살찐 인간 시험대상에게 IV 투여한 후의 시험 식사 섭취량의 감소를 식염수 대조구의 IV 투여와 비교하여 측정하는 방법에 의해 인간에서 역시 측정할 수 있다. 다른 한편으로, 증체 속도를 감소시키는 (예를 들어, 체증 감소를 유도하는) 본 발명의 정제된 쥐 및 인간 ob 단백질의 능력을 실시예 18에 상세하게 기술된 바와 같이, 문헌[Drent, M. L. et al., Int. J. Obesity 19, 221-226(1995)]의 방법에 따라 살찐 인간 시험 대상에 대한 반복된 IV 투여에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따라 정제하였을 때, 본 발명의 쥐 및 인간 ob 단백질은 하기의 생물학적 활성을 갖는다:
1) 헤일리 및 맥코믹의 방법(상기 문헌)을 이용하여, 적어도 30그램의 체중을 갖는 16-18시간 금식한 성숙한 살찐 ob/ob 마우스에 20μg 이하의 투여량으로 대뇌실내(ICV) 주사에 의해 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 급식 시험동안 섭식량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 50% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED50); (b) ICV 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 50% 감소시킴(증체량 감소에 대한 ED50); 및 2) 적어도 30그램의 체중을 갖는 금식하지 않은 성숙한 ob/ob 마우스에, 1주일 동안 새벽과 저녁녘의 3시간째에 1일 2회씩, 1일 총 20μg이하의 투여량으로 복강내(IP) 주사에 의해 투여할 때, 단백질 또는 폴리펩티드가 (a) 5시간 및 24시간 섭식량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시키고(섭식량 감소에 대한 ED20); (b) 최소 IP 주사후 24시간동안 증체량을 비히클이 주사된 대조구 마우스에 비해 적어도 20% 감소시킴(증체량 감소에 대한 ED20).
또한, 상기 체중 및 섭식량 감소는 20μg이하 미만의 투여량에서, 특히, 이 단백질들이 균질하게 정제된 경우 심지어 1μg이하의 ICV투여된 투여량 수준에서도 일어난다.
상기에 기술하고 실시예에서 상세하게 설명한, 인간 및/또는 쥐 ob 단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위한 생물학적 분석은 ob 단백질의 단백질 분해, ob 단백질에 대한 부분 DNA 서열의 재조합 단백질 발현에 의한 화학적 합성, 또는 당업자에게 공지된 다른 수단에 의해 생산된 상기 단백질의 단편의 생물학적 활성을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 본 발명의 쥐 및 인간 ob 단백질은, 비치환되거나 한 말단의 하나의 하이드록실 그룹이 저급 알킬 그룹으로 에스테르화함으로써 치환된 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜호모폴리머와 결합할 수 있다. 이 콘쥬게이트는 ob 단백질을 안정한 형태로 만들고 단백질의 반감기를 개선한다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머로부터 형성된 이 콘쥬게이트의 사용은 체내에서 ob 단백질의 활성의 반감기를 증가시키는 수단을 제공한다. 더욱이, 이 콘쥬게이트는 체내에서 치료적 ob 단백질의 안정성 및 순환 시간을 증가시킬 뿐만 아니라 ob 단백질의 면역원성도 감소시키는 또 다른 잇점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이 PEG 결합된 ob 단백질은 인간 체내에서 쉽게 흡착될 수 있고, 혈액계에서 증가된 흡수율을 제공한다.
ob 단백질에 콘쥬게이트된 바람직한 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머는, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 분자와 모노- 또는 폴리-PEG결합할 수 있는 단백질을 생산하기 위해 약 15 내지 60kDa의 분자량을 가진다. 바람직한 경우, ob 단백질은 모노-또는 디-PEG 결합하여 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 단위체와 함께 콘쥬게이트를 형성하고, 콘쥬게이트중의 이 단위체는 15 내지 60kDa, 가장 바람직하게는 35 내지 45kDa의 총분자량을 가진다. 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 출발물질은 서로 다른 분자량을 가진 서로 다른 호모폴리머들의 혼합물로서 시판되므로, 일반적으로 콘쥬게이트는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 콘쥬게이트의 혼합물(조성물)로서 생산된다. 상술한 분자량은 이렇게 생산된 ob 콘쥬게이트들의 혼합물의 평균 분자량이다. 이 혼합물들은 필요에 따라 HPLC를 포함하는 컬럼 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 의해 각각의 콘쥬게이트로 분리할 수 있다. 그렇지만, 치료를 위해서는 일반적으로이 콘쥬게이트를 혼합물로서 사용한다.
폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 폴리머[PEG]는 임의의 통상적인 수단에 의해 ob 단백질의 자유 N-말단 아미노산을 통해 단백질에 부착되어 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 콘쥬게이트를 형성하도록 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜을 ob 단백질에 부착시키는 방법은 이용가능한 다수의 공지 방법중 임의의 것일 수 있다. 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜은 단백질의 N-말단 아미노산을 통해서 뿐만 아니라 ob 단백질상의 다양한 리신(lysine) 잔기를 통해서도 공유 결합할 수 있다.
또한, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머들은 이관능성(di-functional) 또는 다관능성(poly-functional) 연결 그룹에 의해 ob 단백질에 콘쥬게이트될 수 있다. 모노-폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머 콘쥬게이트를 생산하는데 있어서는, 이관능성 링커를 사용하고, 호모폴리머는 이 링커의 하나의 관능기에 결합하는 반면, ob 단백질의 N-말단 아미노산 뿐만 아니라 리신 그룹은 이 링커의 다른 관능기에 결합할 수 있다. ob 단백질과 결합된 트리- 또는 폴리-[폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜] 폴리머는 삼관능성 또는 다관능성 링커를 사용하여 형성할 수 있다. 호모폴리머는 ob 단백질에 부착되어 있는 링커의 나머지 하나의 관능기로 둘 이상의 상기 관능기에 결합할 수 있다. 이 링커들 가운데 아민 및 카복시 관능기를 갖는 다관능성 링커들이 있다. 아민 그룹은 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜의 관능화된 하이드록시 그룹과 결합하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 카복시 그룹은 ob 단백질상의 아민 그룹과 결합하여 아미드 결합을 형성하고 글리콜상의 관능화된 하이드록시 그룹과 결합하여 에스테르를 형성할 수 있다. ob 단백질과 PEG 사이의 콘쥬게이트를 형성하기 위해 사용할 수 있는 다양한 유형의 연결 그룹중에는 미합중국 특허 제4,902,5021호; 5,034,514호; 4,609,5462호; 5,122,614호; 및 4,847,325호에 개시된 것들이 있다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에 따르면, 하기 식 Ⅰ-A 및 Ⅰ-B의 콘쥬게이트가 제공된다.
및
상기 식에서, P는 본원에 기술된 쥐 또는 인간 ob 단백질이고, n 및 n'는 모든 PEG단위체의 평균 분자량이 15 내지 60kDa이고 콘쥬게이트의 총 분자량이 30 내지 80kDa가 되도록, 그들의 총계가 300 내지 1200인 정수이고, R 및 R'는 저급 알킬이다.
식 Ⅰ-A 및 Ⅰ-B의 화합물들은 식 Ⅱ-A Ⅱ-B의 공지된 폴리머 물질을 본 발명의 쥐 또는 인간 ob 단백질과 축합시킴으로써 제조할 수 있다:
및
활성화된 에스테르를 아민과 반응시켜 아미드를 형성하는 임의의 통상적 방법도 사용할 수 있다. 상술한 반응에서, 예시된 석신이미딜 에스테르는 아미드 형성을 야기하는 이탈기이다. 식 Ⅱ-B의 화합물을 이용하여 식 Ⅰ-B의 화합물을 생산할 때, 본 발명의 쥐 또는 인간 ob 단백질과의 반응은 식 Ⅱ-A의 화합물이 식 Ⅰ-A의 화합물로 전환되는 것과 관련하여 기술한 것과 동일한 방법으로 수행한다. 단백질과의 콘쥬게이트를 생산하기 위한 식 Ⅱ-A의 화합물과 같은 석신이미딜 에스테르는 문헌[Monfardini et al., Bioconjugate Chem., 6, 62-69(1995)]에 기술되어 있다.
식 Ⅰ-A의 화합물의 경우에, 15 내지 60kDa, 바람직하게는 35 내지 45kDa의 PEG단위체의 총 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트를 생산하기 위해, n과 n'의 합계는 300 내지 1500이다. 식 Ⅰ-A의 바람직한 태양에서 n 및 n'는 약 800 내지 1200이고, n과 n'의 평균 합계는 850 내지 1000이다. 일반적으로, 식 Ⅰ-A 및 Ⅱ-A의 화합물에서 n'에 대한 n의 바람직한 비율은 0.5 니지 1.5이고, 0.8 내지 1.2가 바람직하다. 식 Ⅰ-B의 화합물의 경우, 15 내지 60kDa, 바람직하게는 35 내지 45kDa의 총 평균 분자량을 가진 300 내지 1500PEG 단위체를 갖는 화합물을 생산하기 위해, n은 바람직하게는 300 내지 1500이다. 바람직한 태양에서, n은 약 850 내지 1000이다.
본 발명에 따라 제조된 인간 또는 쥐 ob 단백질은 당 분야의 공지 방법에 의해 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클과 함께 주사에 적당한 약학 조성물로 제조할 수 있다. 임의의 통상적인 담체 물질도 사용할 수 있다. 담체 물질은 장내, 경피 또는 비경구적 투여에 적당한 유기 또는 무기 물질이다. 적당한 담체는 물, 젤라틴, 아라비아 고무, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 식물유, 폴리알킬렌-클리콜, 와셀린 등을 포함한다. 또한, 약학 제제는 다른 약제학적으로 활성인 약품들을 포함할 수 있다. 향미제, 방부제, 안정제, 유화제, 완충액 등과 같은 추가의 부가제들을 약제학적 혼합의 허용된 관례에 따라 첨가할 수 있다. 본 발명의 균질한 ob 단백질을 조제하기 위해 바람직한 담체는 인간 혈청 알부민, 인간 혈장 단백질 등이다.
인간 또는 쥐의 재조합 균질 ob 단백질 또는 이들의 혼합물의 투여는 살찐 인간 및 동물에서 감소된 섭식량 및 체중 감소를 일으킨다. 따라서, ob 단백질의 투여는 체중 조절에 중요한 이 단백질을 보충한다. 인간 또는 쥐 ob 단백질을 함유하는 약학 조성물은 체중의 비정상적 변동을 단독으로 또는 제2형 진성 당뇨병과 같은 불리한 의학적 질병 또는 질환의 일부로서 겪고 있는 인간 또는 동물 환자에게 다양한 수단에 의해 투여하기에 효과적인 농도로 조제할 수 있다. 주사에 의한 다양한 투여 기술을 사용할 수 있고, 이는 피하, 정맥내 및 복강내 주사를 포함한다. ob 단백질의 평균량은 다양할 수 있고, 특히, 자격있는 내과 의사 또는 수의사의 추천 및 처방에 근거하여야 한다.
본 발명에 따라 제조된 인간 또는 쥐 ob 단백질은 ob 단백질 수용체를 동정하는 선별 방법에도 역시 사용할 수 있다.
이하 실시예는 본원을 어떠한 방법으로든 제한하는 것이 아니다.
[실시예 1]
[인간 ob cDNA의 수득]
인간 지방세포 조직으로부터 유도된 RNA로부터 제조된 상업적으로 구입가능한 람다 파지 cDNA 라이브러리("클론테크(Clontech)사)를 스크리닝함으로써 인간 ob cDNA를 수득하였다. 이 라이브러리로부터 하이브리드화(hybridization)를 통해 인간 ob cDNA에 해당하는 약 2.5킬로염기 단편을 각각 함유하는 두개의 람다 파지를 수득하였다. 이 기법에 의해, 상기 두개의 클론, 즉 hob1 cDNA 및 hob2 cDNA을 동정하였다. 상기 인간 ob 유전자를 스트라타진(Stratagene)사로부터 구입가능한 플라스미드 벡터 DNA pBluescriptSk-내로 서브클론하였다. 생성된 상기 인간 ob 유전자 서열 함유 벡터를 pBluescriptSk-hob1 및 pBluescriptSk-hob2로 명명하였다.
상기 pBluescriptSk-hob1 및 pBluescriptSk-hob2중의 인간 ob 유전자 서열은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 입증되었다. 뉴클레오티드 서열분석으로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 상기 인용한 쟝(Zhang, Y)에 의해 발표된 바와 같이 서열번호:4에 의해 코드화된 인간 ob 단백질에 해당하였다. 상기 pBluescriptSk-hob1는 hob1 cDNA의 정지 코돈후에 T-C변이를 가졌다. 상기 변이는 다음과 같이 hob1의 뉴클레오티드 서열에 존재한다고 예견되는 StuⅠ 제한 부위의 손실을 야기하였다.
pBluescriptSk-hob1 중의 상기 변이는 인간 ob cDNA 서열의 정지 코돈 다음에 위치하기 때문에 상기 인용한 쟝(Zhang, Y)의 문헌에서 발표된 인간 ob 단백질의 아미노산 서열의 변화를 야기하지 않는다.
pBluescriptSk-hob2에 존재하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 있어서는, 이 플라스미드가 인간 ob cDNA 서열의 정지 코돈 다음에 위치한 StuⅠ 제한 부위를 갖는다는 사실이 제한 효소 분석에 의해 입증되었다.
pBluescriptSk-hob1이 정지 코돈 다음의 StuⅠ 제한 부위에 변이를 갖는다는 사실외에, pBluescriptSk-hob1은 또한, hob2 cDNA에는 없는, hob1 cDNA에서 ORF 다음에 EcoRⅠ 제한 부위를 갖는다(제1도 참조).
[실시예 2]
[쥐 ob 단백질(mob)용 플라스미드의 제작]
상기 쟝 등의 방법에 의해 서열번호:1의 쥐 ob cDNA를 수득한 후, 이를 미국 캘리포니아 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen)사에서 시판하는 pCDNA3 벡터내로 삽입하였다. 그렇게 수득된 쥐 ob 유전자를 사용하여 쥐 ob 단백질(mob)의 발현을 위한 발현 벡터 pLPPsOmpA-mob를 제작하였다. 이 발현 벡터 및 그의 제작 과정은 제2도에 상세히 나와 있다.
상기 제작 과정의 제1단계는 sOmpA 유전자로부터의 시그날 코딩 서열을 쥐 ob 단백질(mob)의 성숙한, 즉, 천연 시그날 서열이 없는, 코딩 영역에 융합시키는 것이다. pCDNA3 벡터에 삽입된 성숙 쥐 ob 단백질을 코드하는 501 bp의 DNA 단편을 벤트(Vent) DNA 중합효소 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabds)사), 발린(성숙 mob중의 제1아미노산) 코드화 코돈의 제1뉴클레오티드로 시작하는 전방향(forward) 프라이머(프라이머 1)(상기 쟝 등의 문헌 참조) 및 mob의 정지 코돈을 함유하는 mob의 영역에 해당하는 역방향 프라이머(프라이머 2)를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 상기 벡터로부터 증폭시켰다. 프라이머 2는 또한 Hind Ⅲ 제한 부위에 해당하는 서열을 함유하였다.
증폭된 501 bp DNA단편을, 아가로즈 겔 전기 영동법에 의해 정제하고 T4 폴리뉴클레오티드 키나제("뵈링거(Boehringer)"사 제품)를 사용하여 인산화한 다음, 제한 효소 HindⅢ로 절단하여 상기 프라이머 2의 위치에서 5'돌출 말단을 생성시켰다. 수득된 단면은 쥐 mob를 코드하는 cDNA의 제1뉴클레오티드에 해당하는 비접착(blunt) 말단 및 절단된 HindⅢ 부위에 해당하는 5' 돌출 말단을 가졌다.
이어서, 상기 슈터(De Sutter, K.) 등의 방법에 의해 수득한 sOmpA 플라스미드 pT10sOmpArPDI를 mob 유전자에 응합하여 pT10sOmpAmob 플라스미드를 생성시켰다. 이를 수행하기 위해, 본 분야에서 공지된 방법(Sambrook, J. et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 의해 제한 효소 NaeⅠ 및 HindⅢ로 미리 절단된 pT10sOmpArPDI벡터 DNA 내로, T4 리가제(뉴잉글랜드 바이오랩스 사)를 사용하는 연결법(ligation)에 의해 mob 단편을 클로닝하였다. pT10sOmpArPDⅠ 플라스미드는 플라스미드 p714(문헌 (Parker and Wiley, Gene 83, 117-1034(1989) 참조)로부터 유도하였다. 이 플라스미드는 sOmpA 서열에 융합된 성숙 랫트 단백질 이황화물 아이소머라제(rPDI) cDNA를 코드하는 cDNA를 함유하였다.
sOmpA중의 마지막 코돈(알라닌)을 성숙 rPDI의 cDNA중의 제1코돈(글리신)에 융합시키는 것은 NaeⅠ 제한 부위를 생성시켰으며, NaeⅠ에 의한 절단 후에, sOmpA 서열중의 마지막 코돈과 rPDI 서열을 코드하는 cDNA 중의 제1코돈을 비접착 말단으로서 분리하였다.
HindⅢ 부위는 rPDI를 코드하는 cDNA의 말단에 존재한다. 따라서, HindⅢ에 의한 상기 플라스미드의 추가의 절단은 rPDI cDNA의 주요 부분을 분리하고 PCR단편의 말단 중의 하나와 상용성인 5'돌출 말단을 생성시켰다. rPDI를 코드하는 cDNA가 성숙 마우스 ob를 코드하는 cDNA로 치환된 생성 플라스미드를 pT10sOmpAmob로 칭하였으며, 제2도에 나타내었다.
연결된 DNA를 표준 일렉트로포레이션(electroporation)법을 사용하여 대장균 균주(E. coli strain) MC1061에 도입하였으며, 수득된 콜로니를 제한 효소 분석법에 의해 쥐 ob DNA의 존재를 확인하기 위해 스크리닝하였다. 클론 pT10sOmpAmob는 sOmpA를 코드하는 서열에 융합된 성숙 쥐 ob 단백질을 코드하는 서열을 갖는다.
이어서, 상기 pT10sOmpAmob에서 대장균에서의 mob의 발현을 지단백질 프로모터(Plpp)와 lac 프로모터-오퍼레이터(operator)(POlac)의 조절하에 두었다. 이를 위해, 하이브리드 유전자 sOmpA-mob 서열을 상기 슈터 등의 문헌에서 기술한 표준 방법에 의해 플라스미드 pT10sOmpAmob에서 플라스미드 벡터 pLPPsOmpArPDI로 이동시켰다. 상기 pLPPsOmpArPDI 플라스미드는 앞에서 이미 언급한 바와 같이 플라스미드 p714로부터 유도하였다(문헌 (Parker and Wiley, Gene 83, 117-134(1989) 참조). 이 단계를 위해 플라스미드 pT10sOmpAmob DNA를 제한 효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하였다. sOmpA-mob를 코드하는 DNA를 함유하는 단편을, 플라스미드 pLPPsOmpArPDI내로 연결시키고, 이로부터 제한 효소 XbaⅠ 및 HINDⅢ에 의해 절단함으로써 sOmpA-rPDI를 코드하는 DNA가 미리 제거된다. 생성된 플라스미드는 pLPPsOmpAmob로 명명하였다.
[실시예 3]
[쥐 ob 단백질의 대장균 (MC1061)에서의 발현]
쥐 ob 단백질의 대장균에서의 발현은 다음과 같이 수행하였다. 상기 실시예 2에 따라 제작된 pLPPsOmpAmob 플라스미드를 일렉트로포레이션법에 의해 대장균 균주 MC1061 내로 삽입하였다. 상기 플라스미드 pLPPsOmpAmob를 함유하는 대장균 세포(MC1061)를 카베니실린 (carbenicillin) 항생제("비챰 (Beecham)"사)(100μg/ml)로 보충된 루리아-버타니아(Luria-Bertania) 배지("디프코 래보러토리즈(Difco Laboratories)"사 제품)에서 28℃로 밤새 배양하였다. 30ml의 상기 배양액을 접종원으로 사용하여(100배 희석) 동일 배지에서 28℃로 밤새 배양하였다. 상기 배양액을 이어서 상기 배지에서 100배 희석하여 3L로 만들어(예를 들면, 1L용량의 삼각플라스크 중의 0.5L 6개), 뉴브룬스위크(New Brunswick) 공기 진탕기(300rpm)에서 28℃로 A600의 밀도가 0.3 내지 0.5에 이를 때까지 약 4시간 동안 진탕하였다. 이때, lac 프로모터는, 상기 슈터 등의 문헌에 기술된 바와 같이, 2mM 최종 농도의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)(Boehringer사 제품)를 첨가함으로써 유도하였다. 상기 세포를, 세포 밀도가 1.3 내지 1.5의 A600에에 이를 때 까지 28℃에서 약 5시간 동안 배양하였다. 다음으로, JA10 로터(벡크만(Beckman) 원심분리기 모델 J2-21 또는 J2-21M)에서 4℃에서 6분간 6750rpm(8000×g)으로 원심분리함으로써 세포들을 수거하였다. 상기 코쉬랜드 및 봇스타인의 문헌에 기술된 바와 같이, 상등액을 제거하고, 세포 펠렛을 재빨리 250ml의 얼음 냉각된 삼투 충격 완충액(100mM 트리스--HCl, pH 7.4, 20% 수크로스, 10mM EDTA 함유)에 재현탁시킨 후 얼음 상에서 10 내지 20분 동안 항온처리하였다.
다음으로, 상기 현탁액을 원심분리기의 플라스틱 관으로 옮겨 JA202 로터에서 4℃에서 8200rpm(8000×g)으로 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 재빨리 120ml의 얼음냉각된 물에 세게 진탕하면서 재현탁시킨 후 10분 동안 더 얼음위에서 항온처리하였다. 이어서 현탁액을 JA20 로터에서 6분간 4℃에서 11,500rpm(16,000×g)으로 원심분리한 다음 페리플라즘 분획에 해당하는 상등액(삼투 충격 유체)을 수거하였다(약 120ml). 아지드화 나트륨 및 Tris-HCl(pH 7.5)을 각각 최종 농도 0.05% 및 50mM로 가하였다. 쥐 ob 단백질을 함유하는 삼투 충격 유체를 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
[실시예 4]
[쥐 ob 단백질의 대장균 (MC1061)에서의 발현]
루리아-버타니아 배지를 보충하는데 사용된 항생제가 카베니실린이 아니라 트리아실린(100μg/ml)인 것을 제외하고는 상기 실시예 3에 기술된 고정에 따라 쥐 ob 단백질의 발현을 수행하였다.
[실시예 5]
[대장균 삼투 유체로부터의 쥐 ob 단백질의 정제]
실시예 4에 따른 냉동된 삼투 충격 유체 120ml에 함유된 쥐 ob 단백질을 하기와 같이 정제하였다. 쥐 ob 단백질을 함유하는 삼투충격 유체 120ml를 해동한 후 JA20로터에서 4℃에서 16,000rpm으로 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 이어서 상등액을 직접, 50mM 트리스(Tris)-HCl(pH 7.5) 완충액으로 미리 평형화된 30ml 베드(bed) 부피의 Q-세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow)("파마시아(Pharmacia)"사 제품)을 함유하는 컬럼에 부하하였다. 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 세정한 후, 0.1M NaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 mob 단백질을 용출시켰다.
다음으로, 상기 Q-세파로스 패스트 플로우 함유 컬럼으로부터 용출된 물질에 고체 (NH4)2SO4를 1.0M의 최종 농도로 가하고, 1.0M(NH4)2SO4를 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 미리 평형화된 7.5ml 베드 부피의 부틸-세파로스 패스트 플로우(Butyl-Sepharose Fast Flow)("파마시아"의 제품)을 함유하는 컬럼에 부하하였다. 1.0M(NH4)2SO4를 함유하는 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 세정한 후, 용출제를 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액 중의 1.0M(NH4)2SO4로부터 물 중의 20% 에틸렌글리콜까지 구배를 주어 mob 단백질을 용출시켰다. mob 단백질은 구배의 거의 끝에서 상기 부틸-세파로스 패스트 플로우 컬럼으로부터 용출되었으며, 대부분의 오염물질들은 훨씬 빨리 용출되었다. 상기 단계에서의 mob 단백질의 순도는 은-염색된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (PAGE)으로 평가할 때 90%였다.
상기 부틸-세파로스 패스트 플로우 함유 컬럼으로부터 용출된 물질중의 mob 단백질을 이어서 겔 투과 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 이글 위해, 쥐 ob 단백질을 4℃에서 8MC 농축 장치("아미콘(Amicon)"사 제품)을 사용하여 YM10("아미콘"사 제품) 멤브레인 상에서 1ml의 부피로 농축하고, 인산염으로 완충된 식염수로 미리 평형화된 39ml G100-세파덱스(Sephadex)("파마시아"사 제품)를 함유하는 컬럼(1.0cm×50cm)에 부하하였다. 이어서, mob 단백질을 함유하는 분획을 합하여 단백질을 YM10 멤브레인 상에서 농축하였다. 이 단계에서, mob 단백질은 PAGE 및 은-염색법으로 평가할 때 95% 이상의 순도를 가졌다. SDS-PAGE는 Mr 15,000에서 단일 단백질 밴드를 나타내었다.
[실시예 6]
[쥐 ob 단백질의 서열 분석]
상기 실시예 2, 3, 4 및 5의 과정에 의해 수득 및 정제된 쥐 ob 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 상기 램리(영국)의 방법에 따라 분석하였다. 전기영동된 단백질을 바우(Bauw, G) 등의 문헌(J. Biol. Chem. 7, 194-196(1988))에 기술된 바와 같이 폴리(4-비닐 N-메틸피리디늄 요오다이드)-피복된 유리 섬유 시이트에 전기이동시킨 후, 멤브레인으로부터 Mr 15,000의 단백질 밴드를 절단하여 120A 온-라인 페닐티오하이단토인 아미노산 분석기가 장착된 470A 기상 서열분석 장치(sequenator)("어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)"사 제품) 상에서 에드만 분해법에 의해 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 상술한 과정에 의해 쥐 ob 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 얻어졌으며, 이것은 서열번호:3의 성숙 쥐 ob 단백질에 해당하는 Val-Pro-Ile-Gln이었다.
[실시예 7]
[인간 ob 단백질 (hod)용 발현 벡터의 제작]
실시예 1의 과정에 따라 수득된 인간 ob 유전자를 사용하여 인간 ob 단백질의 발현을 위한 발현 벡터 pLPPsOmpAhob1를 제작하였다. 이 제작 방법은 상기 실시예 2에서 기술한 pLPPsOmpAmob의 제작 방법과 유사하였으며, 제3도에 상세히 나와 있다. 전체 성숙 인간 ob 코드화 서열을 함유하는 DNA단편을 완성하기 위해 세 단편의 연결이 필요하였다.
상기 제작과정의 제1단계에서는 성숙 인간 ob 단백질의 제1아미노산 (발린)을 코드하는 코돈의 제1뉴클레오티드로 시작하는 hob 뉴클레오티드 서열을 OmpA로부터의 시그날 코딩 서열(sOmpA)에 융합시켜 sOmpA 서열이 hob 뉴클레오티드 코딩 서열의 5' 말단의 상부에 있게 하였다. 이 DNA 단편은 플라스미드 pBluescriptSK-hob1, 벤트 DNA 중합효소, 및 두개의 프라이머를 함유하는 PCR 혼합물에서 증폭에 의해 수득하였다. 전방향 프라이머(프라이머 1)는 성숙 인간 ob 단백질의 제1아미노산을 코드하는 코돈의 제1뉴클레오티드로 시작하였으며, 역방향 프라이머(프라이머 2)는 정치 코돈을 함유하는 인간 cDNA의 서열을 함유하였다. 증폭 반응은 성숙 인간 ob 단백질을 코드하는 서열을 함유하는 501bp의 DNA단편을 생성시켰다. 이 DNA 단편의 5' 말단을 이어서 T4폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화한 다음 제한 효소 HindⅢ로 절단하여 성숙 hob를 코드하는 cDNA의 제1뉴클레오티드에 해당하는 비접착 말단(프라이머 1에 해당하는 위치) 및 절단된 HindⅢ부위에 해당하는 5'돌출 말단을 가진 353bp DNA 단편을 생성시켰다. 상기 353 bp DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동법에 의해 정제한 다음, 제한 효소 NaeⅠ 및 HindⅢ로 미리 절단된 pT10sOmpArPDI 플라스미드내로 클로닝하였다. 생성된 pT10sOmpAhob1 플라스미드(부분적)는 sOmpA를 코드하는 서열에 융합된 성숙 인간 ob 단백질의 일부(아미노 말단 부위)를 코드하는 DNA 단편을 갖는다.
제2단계에서는, 인간 ob 단백질의 카복시 말단, 즉 단편 2를 코드하는 DNA 서열을 성숙 hob의 아미노-말단 부위를 코드하는 DNA 단편에 연결시켰으며, sOmpA에 융합된 전체 성숙 hob서열을 코드하는 생성 단편을 플라스미드 pLPPsOmpArPDI로 옮겨 지단백질 프로모터 및 lac프로모터-오퍼레이터의 조절하에 성숙 인간 ob 단백질을 대장균에서 발현시켰다. 이를 위해, 플라스미드 pT10sOmpAhob1(부분적)을 제한 효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동법에 의해 hob의 400 bp DNA 단편 1(단편 1)을 단리하였다. 이어서, 플라스미드 pBluescriptSK-hob1을 HindⅢ 및 EcoR1에 의해 절단하고, 아가로스 겔 전기영동법에 의해 450bp(단편 2)을 단리하였다. 최종적으로, 플라스미드 pLPPsOmpArPDI를 XbaⅠ 및 EcoRⅠ로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동법에 의해 벡터 단편(단편 3)을 단리하였다. 이어서, DNA 단편 1, 2 및 3을 서로에게 연결하고 연결 혼합물을 대장균 균주 MC1061내로 도입하였다. 최종 플라스미드 제작체 pLPPsOmpAhob1을 함유하는 콜로니를 성숙 인간 ob 단백질의 발현 및 분비에 사용하였다.
[실시예 8]
[인간 ob 단백질의 대장균 (MC1061)에서의 발현]
상기 실시예 7에 따라 제작된 pLPPsOmpAhob1을 사용하여 인간 ob 단백질 발현용 대장균 균주 MC1061을 형질전환시켜 대장균 숙주세포의 페리플라즘(periplasm)에서 가용성의 생물학적으로 활성인 형태로 인간 ob 단백질을 발현시켰다. 상기 대장균 숙주세포내로 플라스미드를 삽입하는 것은 일렉트로포레이션법에 의해 수행하였다. 상기 플라스미드 pLPPsOmpAhob1을 함유하는 대장균 세포(MC1061)를 카베니실린 항생제("비챰"사 제품)가 보충된(100μg/ml) 루리아-버타니아 배지("디프코 래보러토리즈"사 제품)중에서 28℃에서 적절한 밀도로 배양한 후, 상기 슈터 등의 문헌에 기술된 바와 같이, 2mM 최종 농도의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)("뵈링거"사)를 첨가함으로써 lac프로모터를 유도하였다. 상기 세포를, 세포 밀도가 A6001.3에 이를 때까지 더 배양하였다. 이어서, 원심분리(4℃에서 800×g)함으로써 세포들을 수거하고, 세포 펠렛을 재빨리 얼음 냉각된 삼투 충격 완충액(100mM 트리스-HCl, pH 7.4, 20% 수크로즈 및 10mM EDTA함유)에 재현탁시킨 후 상기 코쉬랜드 및 붓스타인의 문헌에 기술된 바와 같이 얼음 상에서 10분 동안 배양하였다.
이어서, 상술한 바와 같은 원심분리에 의해 세포를 다시 수집하고, 세포 펠렛을 얼음냉각된 물에 재현탁시킨 후 10분 동안 얼음위에서 배양하였다. 현탁액을 이어서 5분간 16,000×g으로 원심분리한 다음 상등액(삼투 충격 유체)을 수거하였다(약 120ml). 아지드화 나트륨 및 트리스-HCl(pH 7.5)을 각각 최종 농도 0.05% 및 50mM로 가하였다. 인간 ob 단백질을 함유하는 삼투 충격 유체를 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
[실시예 9]
[인간 ob 단백질의 대장균 (MC1061)에서의 발현]
루리아-버타니아 배지에 보충된 항생제가 카베니실린이 아니라 트리아실린(100μg/ml)인 것을 제외하고는 상기 실시예 8에 기술된 과정에 따라 인간 ob 단백질의 발현을 수행하였다.
[실시예 10]
[대장균 삼투 유체로부터의 인간 ob 단백질의 정제]
실시예 9의 삼투 충격 유체 중의 인간 ob 단백질을 정제하기 위해, 상기 유체에 NaCl을 0.1M의 최종 농도로 가하고, 이어서 유체를 직접, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 미리 평형화된 30ml 베드 부피의 Q-세파로스 패스트 플로우("파마시아" 제품)를 함유하는 컬럼에 부하하였다.
다음으로, 상기 Q-세파로스 패스트 플로우 함유 컬럼으로부터 용출된 유출 물질에 고체 (NH4)2SO4를 1.0M의 최종 농도로 가하고, 혼합물을, 1.0M(NH4)2SO4를 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 미리 평형화된 7.5ml베드 부피의 부틸-세파로스 패스트 플로우("파마시아" 제품)을 함유하는 컬럼에 부하하였다. 1.0M(NH4)2SO4를 함유하는 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 세정한 후, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액 중의 1.0M(NH4)2SO4로부터 물 중의 20% 에틸렌글리콜까지 구배를 주어 hob 단백질을 용출시켰다. hob 단백질은 구배의 거의 끝에서 상기 부틸-세파로스 패스트 플로우 컬럼으로부터 용출되었으며, 대부분의 불순물들은 훨씬 빨리 용출되었다. 상기 단계에서의 hob 단백질의 순도는 은-염색된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (PAGE)으로 평가할 때 90%였다.
상기 부틸-세파로스 패스트 플로우 함유 컬럼으로부터 용출된 물질중의 hob 단백질을, 이어서 겔 투과 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 이를 위해, 인간 ob 단백질을 4℃에서 8MC 농축 장치("아미콘"사 제품)을 사용하여 YM10("아미콘") 상에서 1ml의 부피로 농축하여, 인산염으로 완충된 식염수로 미리 평형화된 39ml G100-세파덱스("파마시아")를 함유하는 컬럼 (1.0cm×50cm)에 부하하였다. 이어서, hob 단백질을 함유하는 분획을 합하여 단백질을 YM10 멤브레인 상에서 농축하였다. 이 단계에서, hob 단백질은 PAGE 및 은-염색법으로 평가할 때 95% 이상의 순도를 가졌다. SDS-PAGE는 Mr 15,000에서 단일 단백질 밴드를 나타내었다.
[실시예 11]
[대장균 삼투 유체로부터의 인간 ob 단백질의 정제 ]
실시예 9의 삼투 충격 유체 중의 인간 ob 단백질을 정제하기 위해, 하기 사항들을 제외하고는 상기 실시예 10의 과정을 사용하였다: 유출 물질에 고체 (NH4)2SO4를 가하기 전에 실시예 9의 삼투 충격 유체와 관련하여 하기 단계를 수행하였다.
실시예 9의 삼투 충격 유체 중의 인간 ob 단백질을 직접, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 미리 평형화된 30ml 베드 부피의 Q-세파로스 패스트 플로우("파마시아" 제품)을 함유하는 컬럼에 부하하였다. 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 세정한 후, 0.1M MaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 hob 단백질을 용출시켰다.
[실시예 12]
[인간 ob 단백질의 서열 분석]
상기 실시예 7 내지 11의 과정에 의해 수득 및 정제된 인간 ob 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 상기 램리(영국)의 방법에 따라 분석하였다. 전기영동된 단백질을, 상술한 바우 등의 문헌에 기술된 바와 같이, 폴리(4-비닐 N-메틸피리디늄 요오다이드)-피복된 유리 섬유 시이트에 전기이동시킨 후, 멤브레인으로부터 Mr 15,000의 단백질 밴드를 절단하여 120A 온-라인 페닐티오하이단토인 아미노산 분석기가 장착된 470A기상 서열 분석 장치("어플라이드 바이오시스템"사 제품)상에서 에드만 분해법에 의해 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 상술한 과정에 의해 얻어진 인간 ob 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 서열번호:6의 성숙 인간 ob 단백질에 해당하는 Val-Pro-Ile-Gln이었다.
[실시예 13]
[쥐 ob 단백질의 생물학적 활성:ob/ob 마우스에 대뇌실내 주사(ICV)]
실시예 5에 따라 정제된 성숙 쥐 ob 단백질의 생물학적 활성을 하기와 같이 ICV 방법을 사용하여 결정하였다. 상기 할리-맥코믹 방법을 기준으로 중간선의 2mm측면; 대천문에 대하여 0.6mm; 2mm 아래의 좌표를 사용하여, 마취된 암컷의 살찐 ob/ob 마우스(6 내지 13주령)의 뇌의 횡방향 공동내로 주입 캐뉼라(cannula)를 삽입하였다. 상기 캐뉼라의 말단은 귀금속 나사 및 치과용 시멘트를 사용하여 두개골 위에 올려놓았다. 상기 쥐를 개별적으로 플라스틱 우리에 수용하여 음식 및 물을 자유롭게(단, ICV 주입 전날 밤은 제외) 주었다. 매일 매일의 음식 섭취량 및 체중 차이로 평가할 때 수술에서 회복한 후, 마우스를 하기 시험 용액 중의 하나의 1㎕대뇌실내(ICV) 주사에 따르는 몇가지 경우에 대해 연구하였다.
1) 인공 CSF;
2) 박테리아 대조 용액;
3) ob 단백질(0.6 내지 1㎕/마우스); 또는
4) 주입 안함.
각 마우스에 상기 시험 용액 중의 하나를 주입(ICV) 한 다음에는 1㎕의 인공 CSF를 주입하여 캐뉼라를 세척하였다. 이 실험을 위한 상기 박테리아 대조 용액은 대장균 박테리아에 삽입된 플라스미드에 쥐 ob 유전자가 없다는 것을 제외하고는 상기 실시예 2 내지 4에 기술한 과정과 동일하게 처리 및 제조한 샘플이었다.
마우스는 ICV주사전 18시간 동안(밤새) 금식시켰다. 마우스를 가볍게 억제하여, 하나의 미리 보정된 폴리에틸렌(PE) 관(PE20)으로 고정된 10㎕의 해밀턴(Hamilton) 시린지를 사용하여 시험 용액 1㎕를 횡방향 뇌실에 위치한 캐뉼라에 주입하였다. 이어서, 마우스를 바로, 미리 칭량된 양의 펠렛화된 마우스 먹이를 포함하는 먹이 접시 및 물병이 있는 시험 우리에 넣었다. 마우스를 육안 관찰하여 다음 7시간 동안의 음식 섭취량을 측정하였다. 음식 섭취량의 측정은 ICV주입후 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 및 7시간대에서 수행하였다. 각 동물의 체중을 ICV주사전과 24시간 후에 측정하였다. 몰리(Morley, J. E.)등의 문헌(American J. Physiol. 253, 516-522(1987))에 따라 2시간 금식된 마우스에서 10μg 뉴로펩타이드 Y의 ICV주입후 2시간동안의 섭식량이 증가되는 것으로 성공적인 캐뉼라 배치가 입증되었다.
상기 기술한 ICV시험의 결과는 하기와 같다:
A. 섭식량의 감소
ICV주사후 처음 30분 동안에 거의 모든 마우스는 약간의 휴지기 후에 약 0.5그램을 섭취하여 소비하였다. 주사가 투여되지 않거나 인공 CSF를 투여받은 마우스는 이후 6.5시간 동안 계속 섭취하여, 7시간의 누적시간에서의 섭취량이 3.2g이 되었다(표 1). 반면, ob 단백질 ICV처리된 마우스는 처음 30분 동안의 섭취후에 다시 섭취하지 않았다. 따라서, 이들의 누적 섭식량은 이후의 6.5시간 동안 약 0.5g으로 억제되어 유지된다(표 1). 비히클 대조용액 ICV를 투여받은 마우스도 30분 후 섭취를 중단하였으나 6 내지 7시간 사이에 다시 섭취하기 시작하였다.
B. 증체량 감소
비히클 대조구가 주사된 마우스의 24시간 동안의 체중 변화는 인공 CSF가 주사되거나 주사가 투여되지 않은 마우스에서와 비교하여 약간 감소하였다(표 1). 그러나, ob 단백질이 주사된 마우스의 체중의 변화 백분율은 거의 0으로 비히클 대조구가 주사된 마우스와 비교할 때 현저하게 감소되었다(표 1).
C. 결론
재조합 마우스 ob 단백질의 직접 투여(마우스당 1㎕중의 1.1㎕으로 뇌에 투여)의 관찰된 효과는 지속적이었고, 암컷 ob/ob 마우스의 섭식량 및 증체량에서 현저한 감소가 있었다. 이는 ob 단백질이 접적으로 뇌에 작용할 수 있음을 증명하며 복강내에 투여한 경우의 ob 단백질의 효과와 일치하였다. 상기 실시예는 또한 본 발명에 따라 박테리아에서 발현된 암컷 비만 ob/ob 마우스 중의 재조합 마우스 ob 단백질의 생물학적 활성을 확인한다.
*는 ob 단백질과 인공 대뇌 척수액(CSF) 그룹간의 현저한 차이를 나타낸다(p0.05).
**는 대조구의 백분율을 나타낸다.
[실시예 14]
[ob/ob 마우스중의 쥐의 ob 단백질 정맥 투여(IV)의 생물학적 활성]
실시예 2, 3, 4 및 5에 따라 수득되고 정제된 쥐의 ob 단백질의 생물학적 활성은 비만 ob/ob 마우스 중의 정맥주사(IV)에 의해 하기와 같이 시험되었다.
문헌[Mokhtarian A., et al., Physiol. Behav., 54, 895-898(1993)]의 방법에 따라 펜토바르비탈 마취하에 수컷 및 암컷 비만 ob/ob 마우스(6-13주)에 만성 경정맥 캐눌라를 이식하였다. 마우스는 12시간 명암 주기의 일정한 환경조건하에서 플라스틱 우리속에서 개별적으로 사육되었다. 매일 전체의 체중을 측정하고, 멸균 헤파린/식염수 용액(0.9% 식염수 중의 50U/㎕ 용액)≤0.1㎕을 이틀에 한번 주입하여 캐눌라의 개방성을 확인하고 유지시켰다. 증체량으로 확인하여 수술에서 완전히 회복된 후, 상기 마우스를 16 내지 18시간 동안(밤새) 단식시켰다. 다음날 아침, 마우스의 체중을 측정하고, 시험전의 순응을 위하여 45분 동안 시험 우리에 방치시켰다. 물은 연속적으로 공급되었다. 마우스 ob 단백질(0.1ml 중의 3μg) 또는 부피의 비히클 대조구 또는 식염수 용액(9%)을 정맥 주사하였다. 각성 상태의 마우스를 가볍게 억제하고, 0.5㎕ 인슐린 시린지를 사용하여, 헤파린/식염수 0.05㎕ 및 시험 용액 0.1㎕를 차례로 주사하였다. 각각의 주사는 3일 이상의 간격을 두고 수행되었다. 이어서, 마우스 사료의 펠릿을 포함하는 미리 칭량된 페트리 접시가 있는 시험 우리에 마우스를 위치시켰다. 마우스를 시각적으로 관찰하고, IV주사 이후 7시간 동안 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 및 7시간에서의 섭식량을 측정하였다. IV주사 직전 및 24시간 이후에 체중을 측정하였다. 2그룹의 별도의 캐눌라 삽입된 마우스(ob/ob 마우스 11마리 및 야윈 마우스 12마리)를 5개의 개별적인 시험에 사용하였다. 대부분의 마우스에는 마우스 ob 단백질 및 하나 또는 2개의 대조구 주사를 평행되는 순서로 투여되었다. 마우스 ob 단백질을 2가지의 다른 제제로 본 실험에 사용하였다. 본 원에 보고된 데이터는 이들의 개별적인 반복의 결과의 조합이다.
A. 결과
상기 실험의 결과는 하기와 같다.
IV주사후 처음 30분 동안에 모든 비만 및 야윈 마우스는 약간의 휴지기 후에 약 0.3 내지 0.5그램을 섭취하여 소비하였다. 식염수 및 비히클 대조구를 투여받은 비만 마우스의 섭식량은 실험 전체에 걸쳐서 증가하였다. 비히클 대조구를 주사한 비만 ob/ob 마우스의 누적 섭식량은, 식염수를 주사하고 유사하게 단식시킨 비만 마우스의 섭식량과 상이하지 않았다. 반면, 재조합 ob 단백질을 주사한 비만 ob/ob 마우스의 섭식량은 현저하게 감소되었고, 대조구의 57%로 억제되어 유지되었다(표 2). 7시간의 관찰 기간 동안에 비히클 대조구 및 ob 단백질 그룹에서 행동에 대한 다른 영향은 관찰되지 않았다. 예상한 바와 같이, 마우스 ob 단백질의 단일 IV투여량의 제한된 작용 지속기간 때문에 주사 24시간 후의 증체량은 처리 그룹사이에 서로 상이하지 않았다(표 2).
B. 결론
상기 결과는 재조합 마우스 ob 단백질이 비만 ob/ob 마우스에서 IV투여(3μg/마우스) 후 누적 7시간 동안의 섭식량을 현저하게 감소시킴을 증명한다. 비만 ob/ob 마우스에서 섭식량을 감소시키는 재조합 마우스 ob 단백질의 능력은 이후의 비만 ob/ob 마우스에서의 반복되는 IP주사에서 얻어지는 결과와도 일치한다. 상기 실시예는 또한 박테리아에서 발현된 암컷 비만 ob/ob 마우스 중의 마우스 ob 단백질의 생물학적 활성을 확인한다.
데이타는 평균 ±평균의 표준 오차로 나타내었다.
n은 각각의 마우스의 수를 나타낸다.
*는 ob 단백질과 인공 대뇌 척수액(CSF) 그룹간의 현저한 차이를 나타낸다(p0.05).
**는 대조구의 백분율을 나타낸다.
[실시예 15]
[쥐의 ob 단백질의 생물학적 활성:ob/ob 마우스에서의 IP반복 주사]
실시예 2 내지 5에 따라 수득되고 정제된 마우스 ob 단백질의 생물학적 활성은 비만 ob/ob 마우스 중의 복강내 주사(IP)에 의해 하기와 같이 시험되었다.
3그룹의 6마리의 암컷 비만 ob/ob 마우스가 시험되었다. 마우스는 12시간 명암 주기의 일정한 환경조건하에서 플라스틱 우리속에서 사육되었다(3마리/우리). 24시간 섭식량 및 체중을 매일 측정하였다. 환경 조건에의 순응 기간 및 매일의 처리 및 주사 후에, 마우스를 3개의 처리 그룹으로 나누었다. 각각의 마우스는 처리일 동안에 하기의 시험 용액 0.1ml를 매일 2회(명암 주기의 암흑기 시작 조금 전 및 암흑기 시작 후 3시간) 투여하였다:
1) 식염수(0.9%)
2) 박테리아 대조 용액; 또는
3) 마우스 ob 단백질(3μg/0.1ml).
박테리아 대조용액은 대장균에 삽입시킨 플라스미드에서 마우스 ob 단백질이 부재함을 제외하고는, 마우스 ob 단백질을 수득하고 정제하기 위하여 실시예 2 내지 4에 제시된 방법에 따라 동일하게 처리되고 제조된 시료였다. 마우스는 5일 동안 하루에 2회 처리되고, 2일 동안은 처리되지 않았다. 각각의 우리의 섭식량은 각각의 처리일의 최초의 IP 주사후 2, 3, 5 및 24시간에 측정되었다.
A. 결과
[섭식량의 감소]
1주일의 실험 동안에 식염수 및 박테리아 대조용액이 주사된 마우스에서의 섭식량은 상이하지 않았다(표 3). 그러나, ob 단백질 6μg이 주사된 6마리의 마우스에서의 섭식량은 실험 전체를 통해서 감소하였다. 섭식량의 감소는 박테리아 용액 및 식염수 대조용액과 비교하여, ob 단백질이 투여된 마우스 그룹에서 처리일에 최초의 주사 후 2, 3, 5 및 24시간 후에 관찰되었다.
[증체량의 감소]
식염수 그룹의 용액의 -0.9±0.2g 및 박테리아 대조 그룹의 0.7±0.4g과 비교하여, ob 단백질 그룹의 5일의 처리기간 동안의 누적 증체량은 -3.3±0.7그램이었다.
[결론]
상기 실시예는 박테리아에서 발현된 재조합 쥐의 ob 단백질을 매일 2회 IP주사(6μg/마우스/일)하는 경우 식염수 및 박테리아 대조구 처리된 ob/ob 마우스와 비교하여 처리된 암컷 ob/ob 마우스에서 섭식량이 현저하고 지속적으로 감소하며 증체율이 현저히 감소함을 증명한다. 상기 결과는 본 발명에 따라 박테리아에서 발현된 쥐의 ob 단백질이 생물학적으로 활성을 가지며, 유전적 비만 ob/ob 마우스에서 비만치료 효과를 지님으로 증명한다. 표 3에서, 2 및 5시간의 결과는 평균 매일 섭식량이며, 24시간 결과는 5일 동안의 누적 섭식량이다.
데이타는 각 그룹의 6마리의 ob/ob 마우스에 대한 평균 ±평균의 표준 오차로 나타내었다. 섭식량은 최초로 IP주사한지 2, 5 및 24시간후의 처리한 5일 동안의 우리의 세 마리 마우스에 대한 평균 누적량이다. 증체량은 처리 5일 동안의 누적 변화이다.
*는 ob 단백질과 비히클 그룹간의 현저한 차이를 나타낸다(p0.05).
[실시예 16]
[인간 ob 단백질의 생물학적 활성:]
[ob/ob 마우스에서의 대뇌실내(ICV)주사]
ob/ob 마우스에서의 대뇌실내(ICV) 주사에 의한 인간 ob 단백질의 생물학적 활성은 하기의 시험용액을 사용함을 제외하고는 실시예 13에서와 동일한 방법으로 결정되었다:
1) 0.1% 마우스 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 실시예 11에서 제조된 재조합 인간 ob단백질(0.05μg); 및 (2) 비히클 대조용액으로서의 0.1%(w/v) 마우스 혈청 알부민을 함유하는 PBS(알부민 대조구).
A. 섭식량의 감소
ICV주사후 처음 30분 동안에 거의 모든 마우스는 약간의 휴지기 후에 약 0.5그램을 섭취하여 소비하였다. 주사가 투여되지 않은 마우스는 이후 6.5시간 동안 계속 섭취하여, 7시간의 누적시간에서의 섭식량이 1.8g이 되었다(표 4). 알부민 대조 용액 ICV를 투여받는 마우스도 30분 후 섭취를 중단하였으나 3 내지 7시간 사이에 다시 섭취하기 시작하였다. 반면, 인간 ob 단백질 IVC 처리된 마우스는 처음 30분 동안에 현저하게 적은양(0.2g)을 섭취하였고, 이후 6.5시간 동안에 매우 적은 양을 섭취하였다. 따라서, 이들의 누적 섭식량은 이후의 6.5시간 동안 약 0.4g으로 억제되어 유지되었다(표 4).
B. 증체량 감소
비히클 대조구가 주사된 마우스의 24시간 동안의 체중 변화는 인공 CSF가 주사되거나 주사가 투여되지 않은 마우스에서와 비교하여 약간 감소하였다(표 4). 그러나, 인간 ob 단백질의 주사된 마우스의 체중의 변화 백분율은 거의 0이었다(표 4).
C. 결론
재조합 인간 ob 단백질을 뇌에 직접 투여(마우스당 1㎕중의 0.05μg)한 경우에 관찰된 효과는 지속적이었고, 암컷 ob/ob 마우스의 섭식량 및 증체량에서의 현저한 감소는 ob 단백질이 직접적으로 뇌에 작용함을 증명하며 복강내에 투여한 경우의 ob 단백질의 효과와 일치하였다. 상기 실시예는 또한 암컷 비만 ob/ob 마우스에 대한 박테리아에서 발현된 인간 ob 단백질의 생물학적 활성을 확인한다.
데이타는 평균 ±평균의 표준 오차로 나타내었다.
n은 각각의 마우스의 수를 나타낸다.
*는 인간 ob 단백질과 인공 대뇌 척수액(CSF) 그룹간의 현저한 차이를 나타낸다(p0.05).
**는 대조구의 백분율을 나타낸다.
[실시예 17]
[비만 인간 시험대상 중에서의 ob 단백질의 생물학적 활성:]
[IV투여 후의 시험 섭식량의 감소]
실시예 7 내지 11에 따라 수득되고 정제된 쥐 ob 단백질 및 인간 ob 단백질의 생물학적 활성은 인간에 IV투여한 후의 시험 섭식량을 측정하여 하기와 같이 결정되었다.
상기 문헌[Muurahainen, N. E. et al.]의 방법을 사용하여, 섭취실험에서 고정의 칼로리 함량을 지닌 시험식을 야윈 지원자 및 비만인간 지원자에 제공하였다. 식사를 제공하기 적어도 1시간 전에, 팔꿈치 앞쪽 또는 전완 정맥에 내에 IV 카테터를 위치시키고, 헤파린 제어로 개방을 유지시켰다. 식사 제공 15분 전후 및 시험 식사의 최종단계에서 가시적으로 유사한 공복율을 얻었다. 이어서, 식사 제공 20분 전에 앞서서 마우스 또는 인간 ob 단백질 또는 식염수를 정맥 투여하였다. 각각의 시험 대상들은 만족할때까지 시험 음식을 마음대로 먹도록 지시되었다. 각각의 시험자들에 의해 섭취된 시험 음식의 양을 측정하였다. 이어서, 각각의 시험자는 인간 ob 단백질(0.5mg/kg 체중), 쥐 ob 단백질(0.5mg/kg 체중) 또는 식염수를 투여받았고, 상기 조건에서의 섭식량의 차이를 계산하였다. 인간 또는 쥐 ob 단백질 그룹에서, 20% 이상의 섭식량 감소가 있었다.
[실시예 18]
[인간 비만자에서 ob 단백질의 생물학적 활성:]
[반복 IV 투여에 의한 체중 감소 유도]
실시예 7 내지 11에 따라서 수득되고 정제된 쥐 및 인간 ob 단백질의 생물학적 활성은 하기의 방법에 따라서 ob 단백질의 반복적인 IV 투여이후의 체중감소를 측정하여 결정되었다.
상기 트렌트(Drent, M. L., et al.)의 방법을 사용하기 위약 제어 이중 블라인드 체중감소 시험을 수행하였다. 체중지수(body mass index, BMI)가 27보다 큰 비만자들의 체중을 측정하고 2 내지 4주간의 시험기간동안에 1500Kcal의 식사를 하도록 하였다. 시험기간 말기에 체중이 적어도 1Kg이상 감소된 비만자들은 시험기간동안의 체중감소에 맞도록 무작위로 2개의 처리그룹으로 분류하였다. 비만자들은 6주 이상 동안, 인간 또는 쥐 ob 단백질(0.5mg/kg 체중) 또는 위약(식염수)을 매일 IV 투여받았다. 매주 체중을 기록하였다. 6주의 처리후, 인간 또는 쥐 ob 단백질을 투여받은 비만자들은 위약 그룹 보다 현저한 체중 감소를 보였다.
[실시예 19]
A. 대장균 세포로부터의 폴리에틸렌 글리콜 결합된 ob 단백질의 제조
실시예 8에 기술된 바와 같이 제조된 대장균 세포 펠릿 50g을 재현탁 시키기에 앞서서 5mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.5) 11에 현탁화시켰다. 현탁액을 37℃에서 15분 동안 배양시키고, 추가의 5mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.5) 11로 희석하였다. 이어서, 균질기의 전력을 50%로 고정시켜 15분 동안 현탁액을 균질화시켰다. 현탁액을 8,000rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리시켜 청정화시켰다. 펠릿은 제거하였다. 전도도가 1.8mS가 되도록 상등액을 물로 희석시키고, Q-세파로즈 속성 플로우(강 음이온성 이온 교환수지) 200ml로 충진되고 50mM 트리스-HCl(pH 8.5)로 미리 평형화시킨 칼럼상에 직접 가하였다. 평행 완충액으로 세척한 후, 100mM NaCl을 추가로 함유한 동일한 평형 완충액을 사용하여 흡착된 ob 단백질을 용출시켰다. 염화 나트륨 함유 평행 완충액으로 칼럼을 처리한 후 수득한 용출액은 Q-세파로즈 용출물로 명명하였다.
Q-세파로즈 용출물에 고체 NaCl을 가하여 최종 전도도가 82mS가 되도록 하였다. 이어서, 상기 용출액을 부틸-세파로즈 패스트 플로우 200ml로 충진되고 1M NaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.5)로 미리 평형화시킨 소수성 상호작용 칼럼(HIC)상에 직접 가하였다. 평형 완충액으로 흡착되지 않은 물질을 세척하고, 흡착된 ob 단백질을 50mM 암모늄 아세테이트(pH 6.9)로 용출시켜 HIC 용출액을 제조하였다. 역상 HPLC에 의해 HIC 용출액 중의 ob 단백질의 순도가 95%인 것으로 결정되었다. 정제된 ob 단백질을 크기분리 멤브레인(YM-10)을 사용하여 3.7mg/ml이 되도록 농축시켰다. 상기 크기분리 멤브레인은 10,000 달톤 이상의 분자량을 지닌 분자를 보유하는 멤브레인이다. 상기 농축 단계후에, 크기분리 멤브레인을 사용하여 ob 단백질을 100mM 보레이트 완충액(pH 8.0)에 투석여과시키고, 이를 ob 저장 용액으로서 사용하였다.
B. 인간 ob 단백질의 PEG결합
PEG결합 반응을 수행하는데 있어서, 평균 분자량이 40kDa이고, R이 CH이고, R이 CH이고, n과 n'의 합이 820 내지 1040사이(평균:약 930)인 일반식(Ⅱ-A)의 PEG-NHS시약을 미합중국 알라바마주 헌츠빌 소재의 쉬어워터 폴리머스(Shearwater Polymers)사로부터 구입하여 사용하였다. 상기는 n과 n'의 비가 약 1.0인 일반식(Ⅱ-A)의 PEG-NHS 시약의 혼합물이며, 상기 혼합물 중의 n과 n'합은 820 내지 1040단위이고, 이 혼합물중의 PEG사슬의 평균 분자량은 약 20kDa으로 시약의 평균 분자량은 약 40kDa이고, 이 혼합물중의 n과 n'의 합의 평균은 930이되었다. A에서 제조된 3.7mg/ml의 정제된 인간 ob 단백질 저장 용액 2mg 또는 0.54ml(125nmole ob 단백질)에, PEG-NHS시약 용액 250nmole을 가하였다. 상기 용액은 1mM HCl중의 100mg/ml PEG-NHS시약 용액 10mg 또는 0.1ml로 구성된다. 100mM 보레이트 완충액(pH 5.0)을 가하여 총 반응 혼합물이 0.67ml가 되도록 하였다. 단백질 대 시약의 최종몰비는 1:2였다. 상기 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 교반시키고, 빙초산 1㎕을 가해 최종 pH가 4.5가 되도록 하여 반응을 정지시켰다. 수득된 반응 혼합물(0.67ml)를 물로 희석하여 27ml의 용액으로 제조한 후, 이를 카복시 메틸화된 양이온 교환수지(미합중국 매사추세츠주 프래밍검소재의 퍼셉티브즈(Perseptives)사) 1.7ml를 함유하는 칼럼상에 가하였다. 칼럼은 3.3μM HEPES/MES/아세트산 나트륨(pH 5.0)으로 평형화시켰다. 희석된 반응 혼합물을 컬럼에 가고, 흡착되지 않은 PEG-NHS시약을 세척하여 제거하였다. 흡착된 PEG-결합된 ob 단백질 및 결합되지 않은 ob 단백질을 각각 15 칼럼 부피의 80, 150 및 500mM NaCl 염농도 단계 구배를 이용하여 용출시켰다. 상기 용출액을 21ml씩 차례로 모집하고, 각각의 분획의 시료를 SDS-PAGE분석하였다. 상기 분석에 의해, 용출액은 고도의 PEG 결합물, 목적하는 분지된 모노-PEG-ob(PEG-ob) 및 결합되지 않은 ob 단백질로 분류되었다. 상기 각각의 분획을 상기 분류에 따른 푸울(pool) 및 목적하는 분지된 모노-PEG-ob(PEG-ob)를 함유하는 제2의 푸울로 분리하였다. 상기 목적하는 단백질은 n과 n'의 합이 약 820 내지 1040이고, 그 평균이 약 930이고, R 및 R'이 CH이고, 각각의 PEG 사슬의 평균 분자량이 약 20kDa인 일반식(Ⅰ-A)의 구조를 가졌다. PEG결합된 생성물은 약 56kDa의 평균 분자량을 가진다. YM 10 멤브레인을 사용하여 PEG-ob를 함유하는 푸울을 3.7mg/ml로 농축하였다. YM 10은 10,000달톤 이상의 분자량을 지닌 분자를 보유하는 크기 분리 멤브레인이다. 크기 분리 단계 이후에, 농축된 물질을 PBS 완충액(pH 7.3)에 투석여과시키고, -20℃에 동결 저장시켰다. 상기 저장된 생성물은 n과 n'의 합이 약 820 내지 1040이고, 각각의 ob 사슬의 평균 분자량이 약 20kDa인 일반식(Ⅰ-A)의 PEG 결합된 ob 단백질이다. 상기 ob 단백질 중의 PEG 단백질 결합 혼합물의 평균 분자량은 생성물은 약 56kDa였다.
[실시예 20]
[PEG 결합된 인간 ob 단백질의 생물학적 분석시험:]
[ob/ob 마우스에서의 단일 IP주사]
[방법]
2그룹의 6마리의 비만 암컷 ob/ob 마우스가 시험되었다. 마우스는 12시간 명암 주기의 일정한 환경조건하에서 플라스틱 우리속에서 사육되었다(3마리/우리). 24시간 섭식량 및 체중을 매일 측정하였다. 환경 조건에의 순응 기간 및 매일의 처리 및 주사 후에, 마우스를 2개의 처리 그룹으로 나누었다. 각각의 마우스에 실험 제1일(명암 주기의 암흑기 시작 직전)에 하기의 시험 용액 0.1ml를 1회 투여하였다:식염수(0.9%); 실시예 19A에서 제조된 인간 ob 단백질 저장용액(30μg/0.1ml); 실시예 19에 기술된 바와 같이 제조된(인간 ob 단백질 없이 동일하게 처리되고 정제된) PEG 결합된 대조 용액 또는 PEG 결합된 ob 단백질(30μg/0.1ml). 마우스는 제1일에 단 1회 주사되었다. 각 우리의 섭식량 및 각 마우스의 체중은 다음 사흘동안 및 제6일에 측정되었다.
[결과]
A. 섭식량의 감소
1회 처리일 및 이후의 2일 동안에 식염수 및 PEG 결합 대조 용액이 주사된 마우스에서의 매일 섭식량은 상이하지 않았다(표 5). 그러나, 처리일에 인간 ob 단백질 및 PEG 결합된 인간 ob 단백질 30μg이 주사된 6마리의 마우스에서의 섭식량은 식염수 및 PEG 결합 대조용액이 주사된 경우와 비교하여 감소하였다(5.2, 8.2vs. 11.9, 11.4g). 인간 ob 단백질이 주사된 마우스의 섭식량은 대조용액 수준으로 희귀한 반면, PEG 결합된 인간 ob 단백질이 주사된 마우스의 섭식량은 실험일 이후 동안에 감소된 채로 유지되었다. PEG 결합된 인간 ob 단백질의 1회 주사 48시간 후에도 섭식량의 감소가 관찰되었다. 3일간의 실험일 동안의 누적 24시간 섭식량은, 식염수 및 PEG 결합 대조 그룹과 비교하여 PEG 결합된 ob 단백질에서는 49%로 크게 감소하였다.
B. 증체량의 감소
1회 처리일 및 이후의 2일 동안에 식염수 및 PEG 결합 대조 용액이 주사된 마우스에서의 체중변화량은 상이하지 않았다(표 6). 그러나, 처리일에 인간 ob 단백질 및 PEG결합된 인간 ob 단백질 30μg이 주사된 6마리의 마우스에서의 체중은 식염수 및 PEG 결합 대조용액이 주사된 경우와 비교하여 감소하였다(-0.9, -0.7vs. 0.1, 0.3g). 인간 ob 단백질이 주사된 마우스의 체중은 대조용액 수준으로 희귀한 반면, PEG 결합된 인간 ob 단백질이 주사된 마우스의 체중은 실험일 이후 동안에 계속 감소되었다. PEG결합된 인간 ob 단백질의 1회 주사 48시간 후에도 체중 감소가 계속 관찰되었다. 6일간의 실험일 동안의 누적 체중 변화량은, ob 단백질 그룹에서의 0.4g, 식염수 그룹에서의 0.7g 및 PEG 결합 대조 그룹의 1.1±0.2와 비교하여 -1.6g이었다(표 6).
[결론]
이 실시예는 PEG 결합된 인간 ob 단백질(30μg/마우스)의 1회의 IP주사가 식염수 및 PEG 결합 대조구 처리된 ob/ob 마우스에 비해 처리된 암컷 ob/ob 마우스의 상당하고 지속된 섭식량 감소 및 상당한 체중 감소를 3일에 걸쳐 일으킨다는 것을 증명한다. 이 결과는 PEG 결합된 인간 ob 단백질이 지속되고 효능있는 생물학적 활성을 가지고, 유전적으로 살찐 ob/ob 마우스에 대해 기대되는 비만 치료 효과를 가진다는 것을 입증한다.
데이타는 각 그룹당 6마리의 ob/ob 마우스에 대한 평균이다. 섭식량은 제1일에 1회의 IP주사후 각 실험일에 세마리 마우스의 우리에 대한 매일의 섭식량의 평균이다. PEG 결합된 ob 단백질 그룹에서만 매일의 섭식량이 지속적으로 감소하는 사실에 주목해야 한다.
데이타는 각 그룹당 6마리의 ob/ob 마우스에 대한 평균이다. 섭식량은 제1일에 1회의 IP주사만을 맞는다. 체중의 변화는 각 실험일에 체중의 변화이다. PEG 결합된 ob 단백질 그룹에서만 지속적인 체중 감소가 있음을 주목해야 한다. 표에서 ND는 측정하지 않았음을 의미한다.
[서열표]
(1) 일반적 정보:
(ⅰ) 출원인:
(A) 성명:에프. 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
(B) 주소:그렌자헤르스트라쎄 124
(C) 도시:바젤
(D) 주:BS
(E) 국가:스위스
(F) 우편번호:CH-4070
(G) 전화:061-688 42 56
(H) 팩시밀리:061-688 13 95
(I) 텔렉스:962292/965542 hlr ch
(ⅱ) 발명의 명칭:재조합 비만(ob) 단백질
(ⅲ) 서열의 수:8
(ⅳ) 컴퓨터로 판독가능한 형태:
(A) 메디아 타입:플로피 디스크
(B) 컴퓨터:애플 매킨토시
(C) 작업 시스템:시스템 7.1(매킨토시)
(D) 소프트웨어:워드 5.0
(2) 서열번호:1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:702 염기쌍
(B) 형:핵산
(C) 쇄의 수:일본쇄
(D) 형태:직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류:cDNA
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:1:
(2) 서열번호:2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:167 아미노산
(B) 형:아미노산
(C) 쇄의 수:관계없음
(D) 형태:모름
(ⅱ) 서열의 종류:펩타이드
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(2) 서열번호:3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:146 아미노산
(B) 형:아미노산
(C) 쇄의 수:관계없음
(D) 형태:모름
(ⅱ) 서열의 종류:펩타이드
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:3:
(2) 서열번호:4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:690 염기쌍
(B) 형:핵산
(C) 쇄의 수:일본쇄
(D) 형태:직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류:cDNA
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:4:
(2) 서열번호:5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:167 아미노산
(B) 형:아미노산
(C) 쇄의 수:관계없음
(D) 형태:모름
(ⅱ) 서열의 종류:펩타이드
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:5:
(2) 서열번호:6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:146 아미노산
(B) 형:아미노산
(C) 쇄의 수:관계없음
(D) 형태:모름
(ⅱ) 서열의 종류:펩타이드
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:6:
(2) 서열번호:7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:63 염기쌍
(B) 형:핵산
(C) 쇄의 수:이본쇄
(D) 형태:직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류:(게늄) DNA
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:7:
(2) 서열번호:8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 길이:21 아미노산
(B) 형:아미노산
(C) 쇄의 수:관계없음
(D) 형태:모름
(ⅱ) 서열의 종류:펩타이드
(ⅲ) 추정서열:아니오
(ⅳ) 안티-센스:아니오
(ⅹⅰ) 서열:서열 번호:8:

Claims (38)

  1. 서열번호:6을 포함하는 균질한 생물학적 활성 인간 비만(obese) 단백질 또는 상기 단백질의 생물학적 활성을 갖는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 또는 단편의 생물학적 활성이 포유 동물에서 식품 섭취 및 증체속도를 감소시킴을 특징으로 하는 단백질 또는 단편.
  3. 다른 포유동물 단백질을 함유하지 않는, 서열번호:6을 포함하는 재조합 생물학적 활성 인간 비만 단백질 또는 상기 단백질의 생물학적 활성을 갖는 그의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질의 생물학적 활성이 포유 동물에서 식품 섭취 및 증체속도를 감소시킴을 특징으로 하는 단백질 또는 단편.
  5. 서열번호:3을 포함하는 균질한 생물학적 활성 쥐 비만 단백질 또는 상기 단백질의 생물학적 활성을 갖는 그의 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 또는 단편의 생물학적 활성이 포유 동물에서 식품 섭취 및 증체속도를 감소시킴을 특징으로 하는 단백질 또는 단편.
  7. 다른 포유동물 단백질을 함유하지 않는, 서열번호:3을 포함하는 재조합 생물학적 활성 쥐 비만 단백질 또는 상기 단백질의 생물학적 활성을 갖는 그의 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질의 생물학적 활성이 포유 동물에서 식품 섭취 및 증체속도를 감소시킴을 특징으로 하는 단백질.
  9. a) 프로모터 서열, 및 b) 서열번호:3의 쥐 ob 단백질 또는 서열번호:6의 인간 ob 단백질, 및 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코드하는 DNA 서열을 포함하는, 대장균 숙주 세포에서 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 lac-프로모터 오퍼레이터 및 지단백 프로모터로 구성된 발현 벡터.
  11. 서열번호:3의 쥐 비만 단백질 또는 서열번호:6의 인간 비만 단백질, 및 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  12. (a) sOmpA 펩타이드를 코드하는 서열번호:7의 sOmpA유전자 서열인 제1부분; 및 (b) 서열번호:3의 쥐 ob 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호:6의 인간 ob 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열인 제2부분을 포함하는 DNA 서열.
  13. 제9항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균 숙주 생물.
  14. a) 프로모터 서열, 및 서열번호:3 또는 서열번호:6과 대장균의 외막 단백질 A를 위한 시그날 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코드하는 DNA서열을 갖는 발현 벡터를 제작하는 단계; b) 발현 벡터를 대장균 숙주 세포내로 삽입하여 대장균 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; c) 융합 단백질을 대장균 숙주 세포내에서 발현시키는 단계; 및 (d) 대장균 숙주 세포를 한랭 삼투 충격 완충액으로 처리하여 다른 포유동물 단백질 및 시그날 펩타이드를 함유하지 않는 쥐 또는 인간 ob 단백질을 방출시키는 단계를 포함하는, 다른 포유동물 단백질을 함유하지 않는 생물학적 활성 재조합 인간 또는 쥐 비만 단백질의 생산 방법.
  15. 서열 번호:4를 포함하는 인간 ob 유전자 서열.
  16. 인간 또는 쥐 비만 단백질을 포함하는 삼투액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 시키는 것을 포함하는, 균질한 생물학적 활성 재조합 인간 또는 쥐 비만 단백질의 생산 방법.
  17. 제1항의 인간 ob 단백질에 연결된 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리프로필렌 글리콜의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물로서, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 단위체의 평균 분자량이 15kDa 내지 60kDa인 조성물.
  18. 하기 일반식 Ⅰ-A의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물:
    상기 식에서, P는 제1항의 인간 ob 단백질이고, n 및 n'는 300 내지 1500의 합계를 갖는 정수이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량은 15kDa 내지 60kDa이고, R 및 R'는 저급 알킬이다.
  19. 제18항에 있어서, n 및 n'의 합계가 800 내지 1200이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량이 35kDa 내지 45kDa인 조성물.
  20. 하기 일반식 Ⅰ-B의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물:
    상기 식에서, P는 제1항의 인간 ob 단백질이고, n은 300 내지 1500의 합계를 갖는 정수이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량은 15kDa 내지 60kDa이고, R은 저급 알킬이다.
  21. 제20항에 있어서, n이 약 850 내지 1000이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량이 35 내지 45kDa인 조성물.
  22. 제1항의 인간 ob 단백질 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  23. 제17항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  24. 제14항의 방법에 의해 제조된 균질한 생물학적 활성 재조합 인간 또는 쥐 ob 단백질.
  25. 제1항의 인간 ob 단백질을 인간이 아닌 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간이 아닌 포유동물의 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제 방법.
  26. 제17항의 조성물을 인간이 아닌 포유동물게게 투여하는 것을 포함하는, 인간이 아닌 포유동물의 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제 방법.
  27. 제5항의 쥐 ob 단백질에 연결된 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리프로필렌 글리콜의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물로서, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 단위체의 평균 분자량이 15kDa sowl 60kDa인 조성물.
  28. 하기 일반식 Ⅰ-A의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물:
    상기 식에서, P는 제5항의 쥐 ob 단백질이고, n 및 n'는 300 내지 1500의 합계를 갖는 정수이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량은 15kDa 내지 60kDa이고, R 및 R'는 저급 알킬이다.
  29. 제28항에 있어서, n 및 n'의 합계가 800 내지 1200이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량은 35kDa 내지 45kDa인 조성물.
  30. 하기 일반식 Ⅰ-B의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물:
    상기 식에서, P는 제5항의 쥐 ob 단백질이고, n은 300 내지 1500의 합계를 갖는 정수이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량은 15kDa 내지 60kDa이고, R은 저급 알킬이다.
  31. 제30항에 있어서, n이 약 850 내지 1000이고, 상기 조성물중 상기 콘쥬게이트내의 폴리에틸렌 글리콜 단위체의 평균 분자량이 35 내지 45kDa인 조성물.
  32. 제5항의 쥐 ob 단백질 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  33. 제18항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  34. 제20항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  35. 제27항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  36. 제28항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
  37. 제30항의 조성물 및 상용가능한 약학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는 비만 및 관련된 질환의 치료, 예방 및 억제를 위한 약학 조성물.
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