JPS6011557A - クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒツジ成長ホルモン（ＯＧＨ）の生合成を司る
クローン化ヒツジ遺伝子に関する。本発明は（１９） さらにクローン化ヒツジ遺伝子を含むプラスミドおよび
このようなプラスミドにより形質転換された微生物に関
する。

動物の成長ホルモンは、組織の成長を従進し且つ脂肪、
炭水化物、無機質の代謝のみならずタンパク質代謝の各
段階を制御する一連の同化タンパク質の一種である。一
般に、成長ホルモンは分子量が２２，０００ないし２４
，０００ダルトンの一本鎖の球状タンパク質である。成
熟ホルモンの長さは約１９０ないし２００アミノ酸残基
である。ニューヨーク、アカデミツクプレス発行、［ホ
ルモンと進化Ｊ　（Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｅｖｏ
ｌｕｔｉｏｕ）第２巻（１９７９）：Ｅ、Ｊ、バリント
ン著、成長ホルモン、プロラクチン。

および糖タンパクホルモンの比較生化学、参照のこと。

このようなホルモンは背椎動物では下垂体前葉あるいは
脳下垂体前葉により産生されている。

周知のように成長ホルモンは種特異的である。

さらに生物学的応答の不均一性（ｄｌｓｐａｒｉｔｉｅ
ｓ）に加えて、異なる種から得られる成長ホルモンは等
電点、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸残基およびアミ（２０
） ノ酸組成が異なる。

全アミノ酸配列に関する情報は、ヒト、ウシ。

ヒツジ、ウマ、およびラットの成長ホルモンについて得
られている。ナショナル・バイオメディカル・リサーチ
・ファウンデイション発行、　Ｍ、Ｏ，デイホフ著、タ
ンパク質の配列と構造の図譜（’Ａｔ１ａｓ’　ｑｆ　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ）　、第５巻補遺２（１９７６）、参照の
こと。これらの成長ホルモンはいずれもその主たるアミ
ノ酸配列において種間で配列が相同な長い連続部分（ｓ
ｔｒｅｔｃｈｅｓ　）をもつ保存性が非常に高いタンパ
ク質と思われる。

細胞内で天然に合成される場合は、これらのホルモンは
Ｎ末端が１シグナル”（ｓｉｇｎａｌ）あるいは、”ブ
レ”（ｐｒｅ）配列の分だけ延長され、このシグナルあ
るいはブレー列は新たに合成されたホルモンの小胞体膜
通過に関与する。１ブレ”ペプチドが最終的に切断され
ると成熟ホルモンとなる。

Ｎａｔｕｒｅ第２８３巻４３３〜４３８頁（１９８０）
Ｂ、Ｄ、ディビスおよびｐ、ｃ、タイ著タンパク質の膜
を通しての分泌機構（Ｔｈｅ　Ｍｅａｈａｎｉｓｍ　ｏ
ｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｓｅｒｅｔｌｏｎ　Ａｃｒｏｓｓ
　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、参照のことＯ成長ホルモンは
畜妾業にとっては特別に関心のあるものである。という
のは未成年期の動物の正常で均衡のとれた成長には成長
ホルモンが必要だからである。成長、促進効果は主とし
て、細胞内へのアミノ酸の膜診送を増進し、リボゾーム
レベルでのＲＮＡのタンパク質への翻訳を刺激すること
によシ、組織内のタンパク質としての窒素保有量を増加
させる能力による。成長ホルモンはさらに、成長に不可
欠な２つの条件である有糸分裂（ｍｉｔｏｔｉｃ）活性
と細胞分裂の増加をもたらす。食餌を成長ホルモンで強
化した動物は、組織タンパク質と塩類産生の増加の結果
、体重がさらに増加する。したがって成長ホルモンは、
家畜のカロリー摂取量を大して増加させることなく食肉
生産量を増加させるための手段として使用することがで
きる。

下垂体から成長ホルモンを単離する現在の方法は、商業
的規模の量の成長ホルモンを生産するには非実用的であ
る。このため、組換えＤＮＡ技術を利用する方法により
、妥当な費用で商業的規模の量の成長ホルモンを生産す
ることに力が注がれてきた。いくつかの種からの成長ホ
ルモンはバクテリア細胞内でのクローン化されそして表
現されており、これらの中にはヒト、ウシ、ラットの成
長ホルモンも含まれている。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２
５５巻、７５２１−７５２４頁、　Ｗ、Ｌペラ−ら著、
ウシ成長ｍ　ＲＮ　Ａに相補的なりＮＡの分子クローン
化： ５ｃｉｅｎｃｅ　、第２０５巻、６０２〜６０７頁（１
９７９）Ｊ、Ａ、マーシャルら著、ヒト成長ホルモン：
バクテリア内での相補的ＤＮＡクローン化と表現：　Ｎ
ａｔｕｒｅ。

第２７０巻、４８６〜４９４頁（１９７７）　、Ｐ。

Ｈ，シーバークら著、ラット成長ホルモンの構造遺伝子
のヌクレオチド配列とバクテリア内での増幅、を参照の
こと。

本発明はヒツジ成長ホルモン（本明細書においては場合
に応じてＯＧＨと略す）の遺伝子に関する。

成長ホルモンは種特異的なので、ヒツジ成長ホルモンは
ヒツジの食肉生産速度や飼有効率を高めるのに有効な唯
一の成長ホルモンとなる。ヒツジ族（２３） 長ホルモンを十分な量で得るために、本発明は分子生物
学における通常の技術を利用してヒツジ成長ホルモン遺
伝子を獲得し、これを生体内で増幅し、微生物培地内で
表現させることに関する。

５ｃｉｅｎｃｅ　、第１９６巻、１３１３頁（１９７７
）。

Ａ、ウルリツヒら著、およびＮａｔｕｒｅ、第２７０巻
、４８６頁（１９７７）　Ｐ、Ｉ（、シーバークら著を
参照のこと。

ヒツジのプレー成長ホルモンを産生ずる微生物を誘導す
る手法は、大きく次のような段階に分けられるが、その
各々については後でより詳しく説明する：（１）ヒツジ
下垂体からのヒツジプレー成長ホルモンのメツセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の回収と単離、　＋２＋ヒツジプ
レー成長ホルモンのｍＲＮｌｒ鋳型として用いる、相補
的ＤＮＡ（ｃ　ＤＮＡ　）の生体外での合成、（３）適
当なりローニングベクターへのｃＤＮＡの挿入と、その
クローニングベクターによるバクテリア細胞の形質転換
、ならびに（４）クローン化された遺伝子の回収と単離
。

ヒツジプレー成長ホルモンを司る遺伝子はヒラ（２４） ジのいずれの細胞の染色体にも存在するが、下記で考察
する理由によシ、ヒツジプレー成長ホルモンの遺伝子は
ヒツジ下垂体から最も容易に得られる。

真核細胞の遺伝子は細胞核の染色体ＤＮＡ中に含まれて
いる。この染色体ＤＮＡはクロマチンと呼ばれる凝集し
た（ｃｏｍｐａｃｔ）核タンパク質複合体として存在す
る。クロマチンから染色体ＤＮＡを遊離させそこから１
個の遺伝子を単離することは、このような遺伝子を得る
ための現実的な手段ではない。

その上、原核細胞の遺伝子と異なり、大部分の真核細胞
の遺伝子は、連続した構造配列ではなく、ＤＮＡの非情
報分節（イントロン）によシ分断された不連続な部分配
列から成る。このような遺伝子の原核細胞での転写およ
び翻訳は所望のヒツジプレー成長ホルモンとは全くかけ
離れた雑種タンパク質を生ずることもｓｂうるが、これ
ら遺伝子の転写および真核細胞内でのＲＮＡ転写物の処
理によシ非情報分節のないメツセンジーＲＮＡが得うレ
ル。

したがってｍＲＮＡは通常、所望の遺伝情報をその最も
得やすい形態、すなわち実際に成長ホルモンを合成する
細胞に由来する形で提供する。

下垂体前葉細胞は成年期のヒツジの下垂体から得られる
。下垂体前葉細胞で産生されるヒツジ成長ホルモンｍＲ
ＮＡｕヒツジ成長ホルモン遺伝子と相補的であり、以下
に述べるように相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成の際の鋳
型として使用できるものと考えられる。ｃＤＮＡ合成に
際してｍ　ＲＮＡを効率的に利用するためには、ｍＲＮ
Ａを細胞から比較的純粋な形で回収するのが有利である
。この回収には、目的のｍＲＮＡ　’ｅ細胞膜、タンパ
ク質、脂質、炭水化物、塩類、およびその他の細胞内に
存在するものから分離するのみならず、所望のヒツジ成
長ホルモン以外のタンパク質を合成するｍＲＮＡ分子か
らも分離することも包含される。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ。

第１８巻、５２９４〜５２９９頁（１９７９）。

Ｊ、Ｍ、チルギンら著、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、第１３巻、３６０３〜３６１５頁（１９７４）、Ｒ
，パルメタ−著に記載の操作法はヒツジ成長ホルモンｍ
ＲＮＡの回収に対して有利に使用することができる。Ｒ
ＮＡは本質的にＤＮＡよシも不安定であり、特に下垂体
細胞内に比較的高濃度で存在するりボヌクレアーゼによ
る分解をうける。このため、ｍＲＮＡの回収操作は一般
に存在する如何なるリボヌクレアーゼも急速に不活性化
する手段を使用する。

一般に、全ＲＮＡの回収は、リボヌクレアーゼ不活性化
物質の存在下で細胞を破壊することから始まる。細胞の
破壊は、細胞を溶解試薬にさらしたシ、凍結／融解２機
械的破壊などにより、あるいはこれらの適当な組み合わ
せにより行なうことがでキル。ヘパリンはりボヌクレア
ーゼ活性を阻害することがわかっている。

細胞破壊後、固形物を例えば低速遠心分離により除去す
る。ＲＮＡはこの結果生ずる透明化された溶液からポリ
ゾームＲＮＡとして回収される。ポリゾームＲＮＡは、
リボゾームが結合したＲＮＡであシ、またＲＮＡの翻訳
により、種々の長さの成長ホルモンタンパク質の部分類
を含んでいる。ポリゾームＲＮＡの回収は、この透明化
された溶液をショ糖勾配（たとえば５２％ショ糖溶液）
中で高速で遠心（２７） 分離することにより行なうことができるＯポリゾームＲ
ＮＡは遠心管の底にペレットとして回収できる。次いで
ポリゾームＲＮＡを緩衝液に懸濁し、タンパク質をフェ
ノールとクロロホルムの混合物で抽出する。抽出物の水
性相に塩を添加し、ポリゾームＲＮＡを低温（たとえば
−２０℃ないし一８０℃）でアルコールにより沈殿させ
る。

ヒツジ成長ホルモンｍＲＮＡをさらに精製するために、
アフイニテイφクロマトグラフイーヲ利用することがで
きる。ＯＧＨｍＲＮＡは３′端がポリアデニル化されて
いる（ｐｏｌｙ　ａｄｅｎｙｌａｔｅｄ）ため、オリゴ
（ｄＴ）−セルロース・アフイニテイ・クロマトグラフ
ィー［Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ＋
Ｂｉｏａｈｅｍ、Ｂｉｏ　−ｐｈｙｓ、、１７２．７４
　（１９７６）　〕によシ、３′端がポリアデニル化さ
れていないＲＮＡと容易に分離することができる。ポリ
アデニル化ＲＮＡは一般に全ＲＮＡの約１〜４チにすぎ
ない。ＯＧＨｍＲＮＡのそれ以上の濃縮は、連続ショ糖
密度勾配分画によシ行なうことができる。

ポリアデニル化ＲＮＡ　（および必要ならば中間体（２
８） 分画）の無細胞翻訳は、最終的なｍＲＮＡ調整物の完全
性とそのＯＧＩ（ｍＲＮＡ中の濃縮度を確認するために
利用できる。多数の無細胞翻訳系が考案されており、た
とえば小麦麦芽抽出物［Ｍａｒｔｌａｌ　、Ｊ、、ｅｔ
ａｌ、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、　
７４．１８１６　（１９７７））ｍＲＮＡ−依存性赤血
球溶解産物（Ｐｅｌｈａｍ、Ｈ，Ｒ，Ｂ−。

ａｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏａｈｅｍ、、６７２
４７（１９７６）　）などがある。回収単離されたＯＧ
ＨｍＲＮＡの翻訳゛は、ウサギ赤血球系（メリーランド
州ロックビルのＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓから入手可能）に放射活性ラベ
ルしたメチオニン（５５ｓ　−メチオニン）を添加した
中で行なうのが好ましい。この翻訳による生成物は、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動と螢光写真法により視覚化できる。ウサギ赤血球溶解
産物試験で最も高い活性を示すｍＲＮＡ画分は一緒にし
てｃＤＮＡ合成に利用することができる。

０ＤＮＡの調製には、元の染色体遺伝子の機能的配列と
同一のヌクレオチド塩基対配列をもつ二本鎖ＤＮＡを酵
素的に作り上げることが含まれる。上記に述べたように
、ＣＤＮＡは真核細胞遺伝子の非情報分節を含まず、し
かして究極的には原核細胞系で転写および翻訳すること
ができる。

ａ　ＤＮＡの合成には、鳥類の骨髄芽球症ウィルスの逆
転写酵素を用いる。この酵素はｍＲＮＡ鋳型上でのデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートからの一本鎖複製物
の合成を触媒する。Ｋａｃｉｅｕ、Ｄ、Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．Ｕ
ＳＡ、　７３．２１９１　（１９７６）参照（、ｍＲＮ
Ａのポリ（ｒＡ）尾部はオリゴ（ｄＴ）（ヌクレオチド
数的１２〜１８）をｃＤＮＡ合成のプライマーとして使
用することを可能とする。放射活性ラベルしたデオキヌ
クレオチドトリホスフエートを用いることによシ合成反
応の監視を容易にすることができる。一般に、この目的
には、５２Ｐ−ｄｃＴＰのような　Ｐ　含有デオキシヌ
クレオチドトリホスフェートが使われる。ｃＤＮＡの合
成は一般にｍＲＮＡ　、デオキシヌクレオチドトリホス
フェート、オリゴ（ｄＴ）および逆転写酵素を適当な緩
衝溶液中で一緒にすることにより行なわれる。この溶液
中にはさらに、完全長までの合成を促進するだめに少量
のアクチノマイシンＤとジチオスレイトールを加えてお
くのが好ましい。Ｋａｃｉｅｎ、ＩＬＬ、、　ａｔ　ａ
ｌ、　５ｕｐｒａ、参照。本溶液を高温、たとえば約４
０〜５０℃でｃＤＮＡ複製物の生成に十分な時間、たと
えば約５〜２０分間インキュベートする。

インキュベーション後、ｉｉにエチレンジアミン四酢酸
を加え、フェノール：クロロホルム（容積比１：１）で
抽出する。水性相をゲル濾過クロマトグラフィーで精製
し、溶出液中のｃＤＮＡ　−ｍＲＮＡ複合体をアルコー
ルで沈殿させる。

ｍＲＮＡは、本来ｃＤＮＡよシも不安定であシ、昇温、
たとえば約６０〜８０℃で約１５〜３０分間希水酸化ナ
トリウム（約０．１　Ｍ　）のようなアルカリ性溶液で
加水分解することができる。そのアルカリ性溶液を中和
し、アルコール沈殿すると一本鎖のａ　ＤＮＡ複製物が
生ずる。

一本鎖ｃＤＮＡ複製物は５′−ポリ（ｄＴ）尾部を有し
、且つ３′末端ヘアピン構造を有し、複式ＤＮＡの短い
セグメントとなっていることが明らかにされている（、
　Ｅｆｓｔｒａｔｌａｄｌｓ、Ａ、、ａｔ　ａｌ、、Ｃ
ｅ１ｌ、　７　、２７９（１（３１） ９７６）参照。この３末端ヘアピン構造は相補的ＤＮＡ
鎖の合成のだめのプライマーとして作用しうる。この相
補的ＤＮＡ鎖の合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレナ
ラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｋｌｅｎｏｍ、ｆ（、、ｅｔ
　ａｌ、。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２３７１　（１９７
７）を逆転写酵素とおきかえること以外、本質的にはｃ
ＤＮＡＤＮＡ複製色合成の条件で行なわれる。この操作
により再生される二本鎖ｃＤＮＡは、一本領ｃＤＮＡ複
製物の３′末端ヘアピン構造から生ずる３′末端ループ
をもつ。この３末端ループは、基本的にＵｌ　１ｒｉｃ
ｈ。

Ａ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ、の方法を用いて、酵素
Ｓｌヌクレアーゼによる分解で切断することができる。

Ｓ１ヌクレア一ゼ分解物をフェノール−クロロホルムで
抽出した後アルコールにより水性相からｃＤＮＡを沈殿
させることができる。

上記の方法により得られる二本鎖ｃＤＮＡは、適当なり
ローニングベクターにこれを挿入し、この修飾されたク
ローニングベクターで適切な宿主細胞を形質転換するこ
とによって生体外で増幅するのが石片１）である。適当
なりローニングベクターと（３２） しては種々のプラスミドおよびファージがあり、このよ
うな増幅方法には一般にプラスミドの方が好ましい。ク
ローニングベクターの選択基準としては、その大きさ、
宿主細胞内での複製能力９選択可能な遺伝子の存在、お
よび遺伝子の挿入部位の存在などがある。大きさについ
て、ベクターは大きな遺伝子の挿入を可能にし、また不
要な巨大分子の産生のために細胞内の多量の栄養とエネ
ルギーを転用させたシすることのないように比較的小さ
い方が有利である。ベクターはまた遺伝子挿入後も機能
を保持している完全なレプリコンを包含する。このレプ
リコンは好ましくはプラスミドの望ましい複製様式、す
なわち１細胞当シの複製数を多数にするか１こにするか
、おるいはある制御可能な数にするかを指定する。１つ
またはそれ以上の表現型特性、好ましくは抗生物質に対
する抵抗性を規定する遺伝子があると、形質転換体の。

選別を容易にする。挿入部位は有利には制限エンドヌク
レアーゼに対する固有の制限部位である。

これらの基準金てを満たすクローニングベクターがプラ
スミドｐＢＲ３２２でちる□　Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ、、
ｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ　２　、９５　（１９７７）参照
。このプラスミドは小型で（約２．８　Ｘ　１０６　ド
ルトン）、アンピリジン抵抗性（ａｍｐ）およびテトラ
サイクリン抵抗性（ｔｅｔ）に関する遺伝子を担い、大
腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）内でリラックス（ｒｅｌａｘｓｄ
）複製をうける。本プラスミドはまた、エンドヌクレア
ーゼＰｓｔ　１に対して唯１つの制限部位をもち、これ
はａｍｐ遺伝子内にある。好都合にはａＤＮＡはホモポ
リマー末端法によシ本プラスミドに挿入できる。Ｎｅｌ
ｇｏｎ、Ｔ、、ａｔａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８．４１　（１９８０）参照。

ホモポリマー末端、たとえばポＩＪｄＣを、末端デオキ
シヌクレオチジル転移酵素の存在下で適当なデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェートたとえばｄＣＴＰと反
応させることによシヒツジプｖ　−成長ホルモンｃＤＮ
Ａの３末端水酸基に付加する［：Ｃｈａｎｇ、Ｌ、Ｍ、
Ｓ、、　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈａｍ、、　
２４６９０９（１９７１）参照〕。この結果生ずる完全
長のポリｄＣ末端付加ｃＤＮＡ分子をＮｏｒｇａｒｄ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、亜７６６５〜７６７２　（１９８０）に
記載の方法により中性ショ糖勾配にかけて大きさを測定
する。プラスミドはＰｓｔ　Ｉのような適当なエンドヌ
クレアーゼで分解することにより開環し、相補的ホモポ
リマー末端、たとえばポリｄＧを上記と同一のホモポリ
マー末端付加方法、たとえばｄＧＴＰを使って開環した
プラスミドの３′末端水酸基に付加する。必要ならば、
末端付加反応は反応系に放射活性標識をしたデオキシヌ
クレオチドトリポスフエート、たとえば［５，）Ｉ］ｄ
ＣＴＰや（：　’Ｈ）　ｄ　ＧＴＰを用いることにより
監視することができる。一般に、本反応は約１０〜２０
このヌクレオチドの長さの末端が生ずるまで行なう。末
端付加されたｃＤＮＡとプラスミドは、たとえばフェノ
ール抽出とそれに続くアルコール沈殿などにょシ回収す
る。この２つの”末端付加された”（ｔａｉｌｅｄ）Ｄ
ＮＡ種を、該２つの種の緩衝液をインキュベートするこ
とによりアニールするとヒツジプレー成長ホルモン遺伝
子を含む組換型プラスミドが生ずる。

適当な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のａｍｐ’、ｔｅｔｓ株
（たとえばＨＢＩＯＩ株）は、基本的にＬｅｄｅｒｂｅ
ｒｇ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−（３５） １ｏｇｙ、１１９１０７２　（１９７４）に記載の方法
を用いて組換型プラスミドにより形質転換できる。

形質転換体はテトラサイクリンを含む標準的Ｌ−肉汁上
で典型的に生育する。テトラサイクリン含有培地で生育
したコロニー試料をアンピリジンを含有する第二の培地
に移す。ｐＢＲ３２２プラスミドは細胞にテトラサイク
リン抵抗性を賦与することから、テトラサイクリン含有
培地で生育したコロニーはこのプラスミドを含んでいる
ことになる。

他方、ＰｓｔＩ部位はｐＢＲ３２２プラスミドのアンピ
リジン抵抗性遺伝子内に存在するため、この部位に遺伝
子を挿入するとアンピリジン抵抗性は破壊される。この
結果、ｔｅｔ’、ａｍｐｓコロニーのみが後続の分析用
のために選別される。

一般に、このような方法により数百ないし数千の潜存的
なヒツジ成長ホルモンクローンが生ずる。

グルンスタインーホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ）のその場での雑種形成法の変法を用いて、
ａｍｐ’　−ｔｅ　ｔｒバクテリア形質転換体を０ＧＨ
−含有配列に関して選別する□　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、
Ｍ。、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

（３６） Ｓｅｔ、、ＵＳＡ、ユ２．３９６１〜３９６５（１９７
５）参照。グルンスタインーホグネス法によｌ）、ＯＧ
Ｈ遺伝子を含むコロニーを同定するには、放射活性標識
したＤＮＡプローブを使用する。０ＧＩ（遺伝子含有組
換体を明確に選択するのに使用できる４種のプローブは
、適性度の順に次のものである、ｆｌｌＰ３２標識した
他種由来の動物成長ホルモンＤＮＡ　、　＋２１　Ｐ”
’標識した精製ＯＧＨｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ　−、ｆ
ａｌ　Ｐ”’標識した精製ＯＧＨｍＲＮＡ、ｆ４）Ｐ３
２標識したＯＧＨ遺伝子と相同の配列を共有する合成り
ＮＡプローブ。

ＯＧＨクローン候補物を選別するには、各コロニー（又
はコロニ一群）由来のＤＮＡ　ヲニトロセルロースフィ
ルターの分離帯に固定し、変性する。プローブ溶液を雑
種形成条件下でここに作用させる。

雑種形成しなかったプローブをフィルターから洗浄する
と、プローブと雑種形成したＤＮＡ　ｉ含むコロニーが
オートラジオグラフィーによシ同定される０ 陽性のクローンは、適当な生育培地で成長させることに
より、プラスミドＤＮＡを抽出する細胞を多量に獲得す
ることができる。プラスミドＤＮＡは、細胞破壊とそれ
に引続くフェノール抽出とアルコール沈殿の如き、従来
の技術を使って抽出する。

このＤＮＡは、たとえば１％寒天ゲルでの電気泳動やシ
ョ糖勾配沈降法により分離してその挿入配列の長さを評
価することができる。Ｋｌｅｌｎ、Ｒ，Ｄ、ｅｔａｌ、
。

Ｐｌａｓｍｉｄ、第３巻、８８〜９１頁（１９８０）参
照。

塩基射的５００と以上の挿入配列を含むプラスミドＤＮ
Ａを、制限遺伝子地図作製とＤＮＡ塩基配列決定用に選
択する。

クローン化されたプレー〇ＧＨ遺伝子を含む、上記の操
作で得られた培養細胞は、アメリカ合衆国イリノイ州ペ
オリア（Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ
）の米国農務省北部地方研究所（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅａｅａｒｃｈ　Ｌａｂ−
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にＮＲＲＬ　Ｎｏ、　Ｂ　−１５
０６０として寄託されている。クローン化プレー〇ＧＨ
遺伝子含有挿入の部分的制限地図を図面の第１図に示す
。挿入は８０８塩基対から成シ、５′末端と３′末端に
非暗号領域をもつ。プレー〇ＧＨ遺伝子は４９から６９
９番目１での塩基対の領域で記述され、成熟ＯＧＨ遺伝
子は１２７から６９９番目までの塩基対で記述される。

挿入物のヌクレオチド配列は、Ｓａｎｇｅｒ、ｅｔ　ａ
ｌ。

Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、ＵＳＡ、　７４　
、５４６３〜５４６７（１９７７）に記載の方法または
Ｍａｘａｍ、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ
ａｄ。

５ｃｉＵＳＡ、７４，５６０〜５６４（１９７７）に記
載の方法によシ決定することができる。このヌクレオチ
ド配列を図面の第２図に示す。図は非暗号領域と暗号領
域の５′−→３′鎖を、これらの遺伝子により特定され
るアミノ酸配列と並べて示す。第２図および本明細書の
他の部分で使用する場合の略語は以下の標準的意味を有
する： Ａ＝ニブオキシアデニ ル＝チミジル Ｇ＝ニブオキシグアニ ル＝ニブオキシシトシ ルＬＹ　＝グリシン ＡＬＡ　＝アラニン ＶＡＬ　＝バリン （３９） ＬＥＵ　＝ロイシン ＩＩＪ−インロイシン ５ＥＲ−セリン ＴＴ（Ｒ−スレオニン ＰＨＥ　＝フェニルアラニン ＴＹＲ＝チロシン ＴＲＰ　＝　）リブトファン ＣＹＳ−シスチイン ＭＥＴ−メチオニン ＡＳＰ　＝アスパラギン酸 ＧＬＵ　＝グルタミン酸 ＬＹＳ　＝リジン ＡＲＧ　＝アルギニン ＨＩＳ　＝ヒスチジン ＰＲＯ−プロリン ＧＬＮ　＝グルタミン ＡＳＮ　＝アスパラギン 遺伝暗号の縮退のため、遺伝子のヌクレオチド配列は実
質上具なりうろことが察知されよう。たとえば、適当な
コドン−アミノ酸対応が観察され（４０） たならば、遺伝子の一部または全部を化学的に合成して
、アミノ酸配列は保持したままで第２図に示すものとは
異なるヌクレオチド配列をもつＤＮＡを作ることができ
うる。プレー〇ＧＨ遺伝子のヌクレオチド配列とタンパ
ク質のアミノ酸配列が決定されていることにより、本発
明の遺伝子は特定のヌクレオチド配列に限定されるもの
ではなく、遺伝暗号の許容する全ての変更を含む。

本発明は、ＯＧＨ遺伝子を含む組換ＤＮＡのバクテリア
宿主として大腸菌の使用に関連して述べであるが、熟練
した分子生物学者であれば、シュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　）属のような他のグラム陽性バクテリ
ア、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のようなグラム陽
性バクテリア、酵母やカビ類のよりなよシ高等の単細胞
生物をＯＧＨ遺伝子あるいはその一部のクローニングお
よび／または表現に使用できることが推察されよう。

本発明をさらに以下の実施例に関して説明する、ただし
これらの実施例は本発明を限定することを意図するもの
ではない。

実施例■ 新鮮なヒツジ下垂体（雌雄混合）を屠殺後１時間以内に
採取し、液体窒素中でただちに凍結させた。ポリシーＬ
　ＲＮＡ　’ｚ　Ｖａｓｌｅｔ　Ｃｔ　ａｌ、、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２８５゜６７４〜６７６（１９８０）に記載の
方法の変法に従って調製した。下垂体前葉組織数１を水
中で０．２５　Ｍ　ＫＣＬ、０．０２５Ｍ　ＭｇＣｌ２
．０．０５　Ｍ　）リスＨＣ１ｐＩ（７，４、０，５チ
ＮＰ４０Ｆシクロヘキシミド２００μｆ／ｍｌ　、ヘパ
リン２５０μｆ々ｌから成るホモジナイズ用緩衝液中で
ホモジナイズした。組織はまずはじめにハサミで刻んで
細片化し、ついでＶｉｒｔｉｓ４５ホモジナイザーで７
０にセットして５分間ホモジナイズした。ホモジネート
を１５　ｍｌ　Ｃｏｒｅｘ■管に移し、４℃で１５．０
００　ＲＰＭで３０分間遠心分離した。ポリゾームは、
低速遠心の上清をＮＰ４０とヘパリン中のシクロヘキサ
ミドが欠除したホモジナイズ用緩衝液中で、５２係シヨ
糖の２．５ｍ１ｌクツシヨン（ｃｕｓｈｉｏｎ）を通し
て、４℃にて２８０００ＲＰＭで８時間、Ｂｅ　ｃｋｍ
ａｎ　ＳＷ２８０−ターで遠心分離することにより調製
されるベレットとして捕集した。上清を吸引し、ベレッ
トを再び５０ｍＭ）ＩＪスＨＣ４ｐＨ９、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、　１５０　ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　１％ドデシル硫酸
ナトリウム（ｓｎｓ）から成る抽出用緩衝液４　ｍｌに
懸濁した。プロティ、ナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）
Ｋを濃度２５０μｙ／ｍｌとなるように添加し、混合物
を３７℃にて３０分間インキュベートした。ポリソーム
ＲＮＡ　（ｚフェノール−クロロホルム系テ２回抽出し
、−２０℃でａ　Ｍ　Ｎａ０Ａｃを１／１ｏ容、９５φ
エタノールを２容添加することによシ沈殿させた。

実施例■ ポリゾームＲＮＡからのポリアデニル化ｍＲＮＡの調製
ポリ（Ａ）　＋　ｍＲＮＡは、オリゴｄ　（Ｔ）セルロ
ーズカラム（■）への雑種形成によシ得られた。カラム
は１０ｍＭト　リスＨＣ４ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　、０．１　％ＳＤＳ、　４００　ｍＭ　ＮａＣ１お
よび１０係グリセロールの組成をもつ結合用緩衝液で平
衡化し、実施例■のポリゾームＲＮＡ調製物全量を５回
カラムにかけた。

非結合ＲＮＡはカラム容積の数倍量の結合用緩衝液（４
３） で溶出した。１０ｍＭ）リスＨＣ４（ｐＨ７０４）、１
　ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳの組成をもつ溶出
用緩衝液を用いて結合したポリ囚＋ＲＮＡ　’ｉカラム
から洗浄し、前記と同様にして沈殿させた。以下にオリ
ゴｄＴカラムクロマトグラフィーの方法をよｐ詳細に述
べる。

貯蔵溶液および材料： オリゴｄＴ結合用緩衝液（ＩＸ）　：　１０ｍＭ　）リ
スＨＣ１（ｐＨ７，６）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０
．４Ｍ　ＮａＣ２，（０，１％ＳＤＳ　）オリゴｄＴ結
合用緩衝液（２Ｘ）　：　１０ｍＭ　）リスＨＣ１（ｐ
Ｈ７，４）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．８ＭＮａＣ６，（０
，１’Ｘ５ＤＳ）オリゴｄＴ溶出用緩衝液：１０ｍＭ）
リスト１０７（ｐＨ７，４）１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　＋　
（０，１％ＳＤＳ　）。

操作法： （１１沈ｊＪＱｌ、たＲＮＡのベレットはエタノールを
充分に抜取シ、オリゴｄＴ溶出用緩衝液に再び懸濁し、
２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。Ａ　２６
０／２８０は約２のはずであり、Ａ２６０が１．０はＲ
ＮＡ濃度４０μｔ／ｍＡ　に相当する。

（２）　次にとのＲＮＡ溶液を溶出用緩衝液で濃度が５
（４４） 〜１０■ｈＱなるように調整し、６５℃で５分間加熱し
た後急冷し等容量の２ＸオリゴｄＴ結合用緩衝液と混合
した。

（３）　とのＲＮＡ溶液を予めカラム容積の５倍量のＩ
ＸオリゴｄＴ結合用緩衝液で洗浄しておいたオリゴｄＴ
カラム（直約０．９　ａｎＯカラム内に約２ｒ）でクロ
マトグラフィーにかけた。カラムは約１０〜１５ｄ／ｂ
ｒの速度で溶出した。

（４）　カラム溶出液はもう一度循環させ、次いで１ポ
リＡ’ＲＮＡとしてエタノール中に保存した。

（５１次にオリゴｄＴカラムｔカラム容積の５〜８倍量
のＩＸオリゴｄＴ結合用緩衝液で洗浄した後、ＲＮＡを
カラム容積の２〜３倍量の溶出用緩衝液で溶出し、ギル
ソン（Ｇｌｌｍｏｎ）フラクションコレクターによシ２
５〜３５滴ずつの分画で採取した。ＲＮＡは一般に第１
６〜２５番目の分画に溶出された。

（６）各分画の殴光度全測定し、　ＵＶ吸収性物質をプ
ールしてＩＸオリゴｄＴｎＭ’ポリＡ＋ＲＮＡ’を製造
した。

（７）　この段階で、プールしたＲＮＡ分画は、ポリＡ
＋　ＲＮＡをさらに精製するために再びオリゴｄＴセル
ロースカラムでクロマトグラフィーにかける（ステップ
７ａ）か、或いはエタノールで沈殿させ使用時１で保存
するか、またはオリゴｄＴセルロースでさらに精製した
（ステップ７ｂ）： （ａ）　再クロマトグラフィー： ステップ（６）の後、プールした分画の容積を測定し、
６５℃で５分間加熱した後急冷し、等容量の２Ω−リゴ
ｄＴ結合用緩衝液で希釈した後、カラム容積の数倍量の
溶出用緩衝液および結合用緩衝液で充分に洗浄しである
前記と同じオリゴｄＴカラムにかけた。次いでＲＮＡは
ステップ３，４．５および６と同様の方法で処理し、酢
酸ナトリウムを濃度０．３Ｍまでおよび９５％エタノー
ルを２．５容添加する（−２０℃〜−８０℃）ことによ
り沈殿させた。

（ｂ）　再クロマトグラフィー後のエタノール沈殿ニス
テップ０の彼、操作を停止したい場合は、ＲＮＡ溶液を
酢酸ナトリウムで濃度３Ｍとし２．５倍の９５％エタノ
ールを加えた。−２０℃で少なくとも２時間後、ＲＮＡ
１ｌＯ０００Ｘｆで１５分間遠心することによりペレッ
ト化し、７０％エタノールで２回洗浄しエタノール分を
切った。ＲＮＡはステップ（１）から始めてこのように
処理したがボ！ｊＡ−＋−ＲＮＡ　の初期濃度は約１■
／！ＩＩ／！または以下と推定された。

（８）　オリゴｄＴカラムは使用後、カラム容積の２〜
３倍量の０．Ｉ　Ｎ　ＫＯＨまたは０−Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈｆ通すことによシ清浄にした。次いで、カラム容積の
５〜７倍量の０．０２％ナトリウムアジドを含むオリゴ
ｄＴ結合用緩衝液で洗浄し、室温で保存した。

ポリ（Ａ）十ＲＮＡ　の完全性は、アメリカ合衆国メリ
ーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、’）のＢｅｔｂｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販さ
れている　Ｓ−メチオニンを添加したウサギ赤血球細胞
不合系での翻訳によシ検査した。この翻訳による生成物
はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドケル電気
泳動および螢光写真法によシ視覚化した。

実施例■ （４７） 調製 ヒツジ成長ホルモンｍＲＮＡは実施例■のポリ（Ａ）＋
ＲＮＡから、（１１５％−２０％ショ糖勾配にかける前
に、ＲＮＡを８０℃で２分間加熱し、次いで水中で急冷
したこと；（２）遠心ｆ　Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４０　
ｏ−ターで２２℃にて、３０．ＯＯＯＲＰＭで２０時間
行なったことを除き、Ｎｉ１ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、（
Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅａｅａｒｅｂ　８　、
１５６１〜１５７３頁（１９８０）に記載されていると
同様にして分離した。エタノールで沈殿した０、５−分
画中に存在するＲＮＡをウサギ赤血球系中で翻訳させ、
生成物をゲル電気泳動法および螢光写真法によシ視覚化
した。ＯＧＨｍＲＮＡ　を含む分画をプールした。

実施例■ 二本鎖ｃＤＮＡ　の合成 一本目ｃＤＮＡ鎖合成のための貯蔵溶液および材料０．
５Ｍ　）リスＨＣ２，ｐ）１８．３１．４Ｍ　ＫＣｌ ０．２５Ｍ　ＭｇＣｌ２ ０．０５Ｍ　ｄＡＴＰ、ｐＨ７，０ （４８） ０．０５Ｍ　ｄＧＴＰ、ｐＨ７，０ ０，０５Ｍ　ｄＣＴＰ、ｐＨ７，０ ０，０５Ｍ　ｄＴＴＰ、ｐＨ７，０ （−”’Ｐ　：ｌ　ｄｃＴＰ　、４　０　０　Ｃ１／ｍ
ｍｏｌ　、１　ｍｃｉ／ｍ／（Ａｍｅｒｓｈａｍ）０、
ＯＩＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）オリゴ（ｄＴ）
　１２〜１　Ｂ’　２５０μｆ／ｄ（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｅｂ） アクチノマイシンＤ　、５００μＦ／／Ｉ＋７！（Ｃａ
ｌｂｌｏｃｂａｍ）０．２Ｍエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム（ＥＤＴＡ）。

ｐ）１８．０ 鳥類の骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素、約１０　、００
０単位１１ｎｔ　（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｏｕｒｃ
ｅｓ　Ｂｒａｎｃｂ、ＶｌｒａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ　Ｐ
ｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｅ−ｅｒ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅから入手） 緩衝液および塩類溶液は全て加圧滅菌した。この他の溶
液は滅菌したガラス−蒸留水を用いて調製し、滅菌容器
内に保存した。貯蔵溶液は全て凍結保存した。

操作法： ｅＤＮＡ合成のだめの鋳型として、実施例■におけるよ
うにして単離したｍＲＮＡを用いた。合成過程を追跡す
るために、［Ｐ：］　ｄＣＴＰのような放射活性マーカ
ーを用いた。放射活性化合物は、窒素の気流で溶媒をと
ばしながら凍結乾燥するかあるいは５ａｖａｎｔ　５ｐ
ｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒで乾燥した
。

ｍＲＮＡ１１１ｆｌに対し［”’Ｐ）ｄＣＴＰ　５μＣ
Ｉを比活性４００Ｃ１／ｍｍｏｔ　で用いた。乾燥した
材料を０．１ｍＭト　リ　ス　ＨＣｔ（ｐＨ８、３）　
、１４０ｍＭ　ＫＣｔ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２１ｍＭ　
ｄＡＴＰ　、　１ｒｎＭ　ｄＣＴＰ　、　１ｍＭ　ｄＧ
ＴＰ　、　１ｍＭ　ｄＴＴＰおよび０．４ｍＭ　ＤＴＴ
から成る２Ｘ反応混合物に溶かした。

この溶液を水中に保持した。この溶液にｍＲＮＡ　（最
終濃度５０μｆ／ゴ）、オリゴ（ｄＴ）　１２〜１８（
２５μ？殉）、アクチノスイシンＤ（４０μ２ｋ）　、
　ＡＭＶ逆転写酵素（８００単位／−）を加え、混合液
を水で２倍に希釈した。水中で５分間おいた後、この反
応混合物を４６℃で１０分間インキュベートした。イン
キュベーション後、ＥＤＴＡを最終濃度２５ｍＭまで添
加した。該溶液を等容量のフェノール：クロロホルム（
溶積比１：１）で１回抽出し、水性相を１０ｍＭ）リス
ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　
０．１Ｍ　ＮａＣ１で平衝化したセファデックスＧ−１
００カラム（０，７Ｘ　２０ｚ）でクロマトグラフィー
にかけた。排出した体積中のｃＤＮＡを０．１容の３Ｍ
　Ｎａ０Ａｃと２容の９５％エタノールを添加して沈殿
させた（−２０℃〜−８０℃）　。ｍＲＮＡ部分を除去
するため、ベレット化した複合体を３００μｔの０．１
Ｍ　ＮａＯＨに溶かし７０℃で２０分間インキュベート
した。本溶液を水中で冷却し３０μｔの帆ＩＮ　ＨＣ／
、で中和した。ｃＤＮＡは前記と同様にして再沈殿させ
た。

料 ｎ・５Ｍリン酸カルシウム、　ｐＨ７，４０、５Ｍ　Ｎ
ａＣｔ２ ０．１Ｍ　ＤＴＴ ０．０５Ｍ　ｄＡＴＰ　、　ｐＩ（７，００，０５Ｍ　
ｄＧＴＰ　、　ｐＨ７，００，０５Ｍ　ｄＣＴＰ　、　
ｐＨ７，００，０５Ｍ　ＴＴＰ　、　ｐＨ７，０ う ［−Ｈ：］　ｄＣＴＰ　、２２　Ｃ１／ｍｍｏｌ　、　
１ｍＣ１／７（Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ）大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（Ｋｌｓｎｏｗ断片）、約（５１） １０００単位／ｒｎｅ（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）　８１ヌクレアーゼ緩衝液：　０．１６７
Ｍ　酢酸ナトリウムｅ　ｐＨ４−５：５ｍＭ　ＺｎＣｌ
２ 操作法： １番目の鎖が放射活性標識しであるので、２番目の鎖は
標識する必要はなかった。０．２Ｍ　！Ｊン酸カルシウ
ム、　ｐＨ７，４、２０ｍＭ　ＮａＣｔ２　、２ｍＭ　
ＤＴＴ　。

ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ　およびＴＴＰ
の各０．４ｍＭずつから成る２Ｘ反応混合物を調製し、
水中に保持した。

この溶液に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ
断片を含むｃＤＮＡ溶液を加え（最終濃度１００単位／
−）、水で２倍に希釈した。本溶液を１５℃で２時間以
上インキュベートした。この溶液を１晩インキユベート
するのが好都合であった。インキュベーションａ、　Ｅ
ＤＴＡを２５ｍＭまで加え、溶ｉを等容量のフェノール
：クロロホルム（容積比１：１）で１回抽出し、水性相
を１０ｍＭ）リスＨＣｔ、　ｐＨ８，０、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡおよび０．１Ｍ　ＮａＣｔで平衝化したセファデッ
クス０１００カラム（Ｑ、’７　Ｘ　２０ｃｒｎ）でク
ロマトグラフィーにかけた。排除分画中のＤＮＡ（５２
） を前記と同様にしてエタノールで沈殿させた。

この段階で、ｄＳ　ｅＤＮＡはヘアピンループを含んテ
ィた。−重鎖のループはアスペルギルス・オリザエ（Ａ
ｓｐｅｒｇ目ｌｕｇ　ｏｒｙｚａａ）　Ｓ　１ヌクレア
ーゼによシ分解して除去した。ｄｓ　ｃＤＮＡを水に溶
かし０．２０容の５ｘ　８１緩衝液を加えた。適当量の
Ｓ１ヌクレアーゼを加え、溶液を３７℃で２０分間イン
キュベートした。添加した酵素の量は、各酵素調製物の
活性が相互に異なるので、各酵素調製物ごとに経験的に
決定した。この操作はｄｓ　ｅＤＮＡからのＴＣＡ−沈
殿量の減少を測定することによシ行なった５１−４解を
うｆｆたｅ　ＤＮＡをフェノール：クロロホルムで一回
抽出し、水性相を前記と同様にエタノールで沈殿させた
。

実施例Ｖ 測定 二本鎖ｅＤＮ−Ａはａｓ　ｃＤＮＡの３’−ＯＨ末端に
一重鎖ホモポリマー末端を付加し且つベクターの３’−
ＯＨ末端に相補的ホモポリマー末端を付加することにヨ
シ、クローニングベクターに挿入した。次いで２つの末
端付加された分子をアニールとした。

貯蔵溶液および材料： １．４Ｍカコジル酸カルシウム、０．３Ｍ）ＩＪス。

ｐＨ７，６（１０倍希釈によりｐＨ７，２となる）１５
　ｍＭ　ＣｏＣｌ２ １０ｍＭ　ＤＴＴ ４ｍＭ　ｄＣＴＰ　、ｐＨ７，０ 操作法： ｄＳ　ａＤＮＡの大きさを測定することによシ３′−末
端の濃度を正確に推定することが可能となる。３′端部
にｄ　ＣＭＰ残基を添加した後、酸沈殿可能な材料に［
Ｈ］ｄＣＴＰ　を取込ませた。元のｅ　ＤＮＡ合成に使
用したｍＲＮＡ　１　ｌｉｔに対し、［Ｈ］　ｄＣＴＰ
　を２．５μ口の割合で使用した。放射活性物質を乾燥
し、反応混合物に再溶解した。二本鎖ｃＤＮＡを適当量
ずつの貯蔵溶液に溶解し、最終濃度を以下のようにした
：　０．１４Ｍカコジル酸ナトリウム、　０．０３Ｍ　
）リス。

ｐＨ７，２：１ｍり　ＤＴＴ　；　０．１ｍＭ　（Ｈ３
ｄｃＴＰ　（Ｉ　Ｃ１／ｍｍｏｌ　）　：１．５ｍＭ　
ＣｏＣｌ２　、２Ｘ　１０　Ｍ　３’−末端。ＣｏＣｌ
２を含まぬ溶液を３７℃に温め、そこにＣｏＣｌ２を加
えた。

末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（Ｃｈａｎｅ　Ｌ
。

Ｍ、Ｓ、＠ｔ　ｍｌ、、Ｊ、ＢＩｏｌ　Ｃｈｅｍ、、２
４６．９０９（１９７１）の方法によシ精製）を最終濃
度１００単位／−まで添加した。反応は３７℃で５分間
行なわせた。

この時点で、試料の１部をとシ酸沈殿可能な材料への（
８３ｄＣＴＰの取込み量を測定した。もし十分な長さの
末端が付加されていない場合は、再び反応溶液を３７℃
において望ましい時間だけ反応させた。最高の形質転換
効率は、ホモポリマー末端の長さが約１０〜２０　ｄＣ
ＭＰ残基のときに得られた。望ましい長さの末端が生成
した時、　ＥＤＴＡを加えた（最終濃度１０ｎＭ）。本
溶液をフェノール：クロロホルム（容積比ｌ：１）で１
回抽出し、水性相をエタノールで沈殿させた。

末端付加した二本鎖ｃＤＮＡを、Ｎｏｒｇａｒｄ、ａｔ
　ａｌ。

の概説（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｂｅｍ、、２５５．７６６５
〜７６７２（１９８０））にしたがって中性ショ糖勾配
で大きさを決定した。ｄＢ　ｃＤＮＡを蒸留水に溶かし
、冷却した１２−の５％−２５％ショ糖勾配（５０ｍＭ
　ト（５５） リスＨＣｔ、　ｐＨ７，５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）の上
に重層した。

本勾配は、Ｂｓｃｂｍａｎ　ＳＷ　４０　ローターにょ
シ５℃にて３９．ＯＯＯＲＰＭで１７．５時間遠心した
。大きさの標準物質としてＴａｑ　ｌエンドヌクレアー
ゼで分離したプラスミドＰＢＲ３２２ＤＮＡを含む第２
の勾配も同時に遠心した。勾配は次のようにして分画し
分析した：　（ａ）　Ｔａｑ　１分解ｐＢＲ３２２勾配
：各０．５ゴずつの分画に、５■のｔＲＮＡ（Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ　）　、　１／１゜容の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　、　
２容の９５％エタノールを加え、−２０℃〜−８０℃で
沈殿させた。このＤＮＡ　ｅペレット化し真空中で乾燥
する。このベレットを試料用緩衝液（０，０９Ｍ）リス
ｐＨ８−５ｓ　０−０９Ｍ　＊　”　Ｍ　ｔ４０ｍＡ　
ＥＤＴＡ　、　５　Ｘ　／リセｏ−／Ｌ’、　０．０２
５Ｘキシレン・シアツール、０・０２５％ブロムフェノ
ールブルー）に再懸濁し、８％アクリルアミド（ＴＨＥ
）水平スラブゲルで電気泳動を行なった。臭化エチジウ
ムで着色したゲルの写真をと、９．６００塩基対よシ大
きいＤＮＡを含む帝を同定した。（ｂ）　ｄｓ　ｃＤＮ
Ａ勾配−各１ｒｎｌずつの分画から１００μｔをとシ１
３−の計数用螢光物質に加えた。次いで各分画に１０（
５６） 岬のｔＲＮＡ（Ｅ、ｃｏ口）、　１／１０容の３ＭＮａ
０Ａｃを加え、−８０℃で２．５容の９５Ｎエタノール
によシ沈殿させた。６００塩基対よシ大きいｄｓ　ｏＤ
ＮＡを含む分画（Ｔａｑｌで分解したｐＢＲ３２２ゲル
情報によシ示される）のみを後続の段階に使用した。

実施例■ 雑種プラスミドの調製 オリゴｄ　（Ｇ）末端をＰｓｔＩ　（実施例Ｖに示した
操作で線形化された１）ＢＲ３２２）に加えた。オリゴ
（ｄＧ）末端付加ｐＢＲ３２２ＤＮＡと一定の大きさの
オリゴ（ｄＣ）末端付加ｄｓ　ｃＤＮＡを希釈して、１
０ｍＭ）リスＨＣｌｐＨ７，５、１００ｍＭ　ＮａＣｔ
、　２−５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液中で等モル濃度と
なるようにした。これらのＤＮＡを７０℃で１０分間ア
ニールし、ついで室温まで一晩かけて徐冷した。

実施例■ 形質転換 組換型プラスミドを、レーダーバーブ（Ｌｅｄｌｒｂａ
ｒｇ）とコ−ｘ　ｙ　（Ｃａｂｅｎ　）の方法（Ｊ、Ｂ
ａａｔ、、　１１９　、１０７２（１０７４））にした
がってＥ、ｃｏｌ：ＨＢＩＯＩへ導入した。

形質転換体を標準ＬＢ（Ｌ−肉汁）−テトラサイクリン
（１５■／−）プレート上で３０℃にて２日間生育させ
た。コロニーをＬ　Ｂ　−ａｍｐ　（５０ｙｎｙ／ｍｌ
　）　プレート上に移し、表現型を決定した。アンピリ
ジン感受性コロニーのみを後続の分析に使用した。

実施例■ ニック（ｎｉｃｋ）翻訳ウシ成長ホルモン断片（１９８
２年１１月１８日）に出願された米国特許出願第４４２
．５８４号の記述にしたがって調製）を、実施例■で製
造した形質転換体の中からＯＧＨクローンを同定するた
めの選別用プローブとして用いた。ウシ成長ホルモンの
遺伝暗号の約半分を含む内部Ｐｓｔ−Ｉ　ＤＮＡ断片ｆ
、、Ｈａｎｓｅｎ、Ｊ、Ｎ、、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ
ｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１６，１４６〜１５１（１
９８１）のアクリルアミドゲル法を使ってｐＧＸ１２（
１１から単離した。本断片を蒸留水に再懸濁し、Ｒｌｇ
ｂｙ、Ｐ、Ｗ、Ｓ、。

ａｔ　ｍｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｓ　１１３　ｔ２３７〜２５１（
１９７７）のニック翻訳法に従ってＰ３２標識した。ニ
ック翻訳断片は、雑種形成混合物（実施例■）に添加す
る直前に、１００℃で５分間インキュベートすることに
よ）変性した。

実施例■ 形質転換体は、Ｇｒｕｎａｔｓｉｎ、Ｍ、ｅｔ　ａｉｍ
によシ最初に記述された方法（ＰＮＡＳ、７２．３９６
１〜３９６５（１９７５）］の変法にしたがってコロニ
ー雑種形成用として調製した。ＤＮＡ結合フィルターを
、Ｗａｂｌ＠ｔａＬ１の示す方法（ＰＮＡＳ、−７６、
３６８３〜３６８７　（１９７９）　〕のように硫酸デ
キストランおよびホルムアミドの存在下で雑種形成させ
た。フィルターは６ｘＳ８Ｃ（２０ｘ＝３Ｍ　ＮａＣ２
：０．３ＭＮａ５ｕｔｒａｔｅ　）　：ｌｘ　Ｄｓｎｂ
ａｒｄｔ’ｓ溶液（１０ｘ＝ｏ−２ＸＢＳＡ：０−２Ｘ
　ＰＶＰ−４０：０．２Ｘフイコール）；ガ２ス・ジャ
ー中の０、ｌＸ５ＤＳ　中にて４２℃において６０分間
ゆるやかに渦かくはんしつつ予備雑種形成を行にった。

次いで２番目の予備雑種形成を、５０％ホルムアミド、
　５　ｘ　Ｓ　８　Ｃ、５ｘ　Ｄ＠ｎｈａｒｄｔ’ａ溶
液、５０　ｍ　Ｍ　ＮａＰＯｑｐＨ６・５．ＩＸグリシ
ン１９５μｆんのサケ精子ＤＮＡ変性物で８−／フィル
ター中で４０℃で２時間緩や（５９） かに渦かくはんしつつ行なった。実施例■で述べたニッ
ク翻訳Ｐ　標識ＢＧ）ｌ　ＤＮＡ　プローブヲ、５０％
ホＡ／ムアミド、５　ｘ　ＳＳＣ、ｌｘ　Ｄｓｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ溶液。

２０ｍＭ　ＮａＰＯｌ　ｐＨ６，５、１０Ｘ硫醒デキス
トラン、１００μｆ／−のサケ精子ＤＮＡ変性物を含む
雑種形成混合物（１０ｃｐｍ／フィルター）に加え、緩
やかに渦かくはんしつつフィルターを４２℃で１８時間
インキュベートした。フィルターを室温にて２ｘＳＳＣ
。

０．１％ＳＤＳ中で１０分間ずつ３回、５０℃にて０．
１ｘＳＳＣ、０，１％ＳＤＳ中で１０分間ずつ２回洗浄
した。

陽性は水気をとったフィルターをＫｏｄａｋＸＲ−５フ
イルムに補力スクリーンによシ８０℃で１晩露出するこ
とによシ視覚化した。

実施例Ｘ プラスミドＤＮＡを各陽性クローンから抽出し、Ｈａｉ
ｌｉｎｇ、ｅｔ　ａｌｅ　の方法（Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ＋　１４゜１２３５（１９７４））にしたがっ
て作成した１％寒天ゲルで電気泳動を行なった。５００
塩基対よシ大きい挿入物を含むプラスミドＤＮＡ’！ｒ
、後続の（６０） ＰｓｔＩ　およびＡｖａＩを用いた制限エンドヌクレア
ーゼ分解による分析用に選択した。最大の挟入物を含む
プラスミドはＳａｎｇｅｒの方法（ｓｕｐｒａ）によシ
塩基配列を決定し、プレー〇ＧＨ遺伝子全長を含むもの
と判定し、ＮＲＲＬ　ＮＯ，Ｂ−１５０６０と命名し寄
託した。

【図面の簡単な説明】

第１図はクローン化プレーヒツジ成長ホルモン遺伝子含
有挿入物の部分的制限遺伝子地図である。 第２図は挿入物の塩基配列である。 特許、出願人　ジエネックス・コーポレイション図面の
浄書（内容に変更なし） の ＦＩＧ、　２ １ α万α刀αβαおｃＮｏＪＫｒ、ＮテＣＡＧαπ国ｒα
ズ弘Ｃに℃πスロαゴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧ　ＣＣ
Ｔ　＝ｒＣＣＴＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＭ　ＧＧＴ　Ｇ
ＣＣＡＣｒ　ＧＣＡ　ＧＴＧＣＣＣＡＣＴ　ＧＴＣＣＴ
Ｔ　ＴＣＣＴＡＡ　ＴＡＡ　ＭＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　Ａ
ＴＴ　ＧＣＡ　ＴＣＧ　（：手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　特願昭５９−７６７３６号２、発明の
名称 クローンヒツジ成長ホルモン遺伝子 ３、補正をする者 名　称　ジエネツクス・コーホレイＶ″（ン５、補正命
令の日付 昭和５９年７月３１日 （１） ６、補正の対象 図　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）単離されたヒツジ成長ホルモン遺伝子。 （２）　単離されたプレーヒツジ成長ホルモン遺伝子０ （３）　下記のデオキシリボヌクレオチド配列：（３） 式中、アミノ末端から始めてイ端から３′端へのＤＮＡ
   鎖（ｓｔｒａｎｄ）および各トリプレットが暗号化する
   アミノ酸が示されておシ、そして各トリプレットにおい
   て、 Ａはデオキシアデニルであシ、 ＴＶｒ、チミジルであシ、 Ｇはデオキシグアニルでアリ、 Ｃはデオキシシトシルでアシ、 ＸはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであシ、 ＹはＴまたはＣであり、 ＹがＣである時、２はＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、 ＹがＴである時、２はＡまたはＧであシ、ＨはＡ、Ｔま
   たはＣ ＱはＴまたはＡであシ、 ＱがＴである時、ＲはＣであシ且つ５ｌｄＡＸＴ。 ＣまたはＧであシ、 ＱがＡである時、ＲはＧであシ且つＳはＴまたはＣであ
   シ、 ＭはＡまたはＧであシ、 （４） ＬはＡまたはＣであり、 ＬがＡである時、Ｎｌｌ′ｉ：Ａ″！！たはＧであシ、
   ＬがＣである時、ＮはＡ、Ｔ、、ＣまたはＧであシ、 Ｇ１７はグリシン、 Ａｌｍはアラニンであシ、 Ｖａｌはバリンであシ、 Ｌｅｎはロイシンであり、 １１ｅはイソロイシンであシ、 Ｓｓｒはセリンであシ、 Ｔｈｒはスレオニンであシ、 Ｐｈａ　ハフェニルアラニンでアシ、 Ｔｙｒはチロシンであり、 Ｔｒｐはトリプトフミンであシ、 Ｃｙｓはシスティンであシ、 Ｍｅｔはメチオニンであシ、 Ａｓｐはアスパラギン酸であシ、 Ｇｉｎはグルタミン酸であシ、 Ｌｙｓはリジンであシ、 Ａｒｇはアルギニンであシ、 １Ｆ（ｉｓはヒスチジンであシ、 Ｐｒｏはプロリンであシ、 Ｇｉｎはグルタミンであシ、 Ａｉｎはアスパラギンである、 から成る特許請求の範囲第１項記載のヒツジ成長ホルモ
   ン遺伝子。 （４）　下記のデオキシリボヌクレオチド配列：（７） （８） 式中、アミノ末端から始めてイ端から３′端へのＤＮＡ
   鎖および各トリブレットが暗号化するアミノ酸が示され
   ており、そして略語は特許請求の範囲第３項で定義した
   とおりである、 から成る特許請求の範囲第２項記載のヒツジプレー成長
   ホルモン遺伝子。 （５）　下記のデオキシリボヌクレオチド配列：？−１
   （Ｃり　？−１−Ｃ，Ｉ　Ｃ％３　Ｃ５（５Ｃ％ｌ　Ｃ
   ！ｌ　Ｑ　ｃＱ　ＧＬ＋　（Ｊ　ｃｖ’）　−ＣＪ　ｔ
   ｎ　（り　（Ｊ　Ｗ　Ｗ−（１１） 式中、アミン末端から始めて５′端から３′端へのＤＮ
   Ａ鎖およびトリプレットが暗号化するアミノ酸が示され
   ており、そして略語は特許請求の範囲第３項で定義した
   とおりである、 から成る特許請求の範囲第１項記載のヒツジ成長ホルモ
   ン遺伝子。 （６）　下記のデオキシリボヌクレオチド配列：（１２
   ） （１３） （１４） 式中、アミノ末端から始めてイ端から３′端へのＤＮＡ
   鎖および各トリブレットが暗号化するアミノ酸が示され
   ており、そして略語は特許請求の範囲第３項で定義した
   とおりである、 から成る特許請求の範囲第２項記載のヒツジプレー成長
   ホルモン遺伝子。 （７）　下記のデオキシリボヌクレオチド配列：（１５
   ） （１６） 式中、アミノ末端から始めて５′端から３′端・＼のＤ
   ＮＡ鎖および各トリプレットが暗号化するアミノ酸が示
   されており、そして略語は特許請求の範囲第３項で定義
   したとおシである、 から成る特許請求の範囲第２項記載のヒツジプレー成長
   ホルモン遺伝子。 （８）　ヒツジ成長ホルモンを暗号化するデオキシリボ
   ヌクレオチド配列から成る原核生物内での複製能力を有
   するプラスミド。 （９）特許請求の範囲第１項、第３項、第４項。 第５項、第６項および第７項のいずれかに記載のヒツジ
   成長ホルモン遺伝子から成る原核生物内での複製能力を
   有するプラスミド。 叫　前記原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌａｈｉｍ）
   の生物である特許請求の範囲第９項記載のプラスミド。 Ｉ　特許請求の範囲第９項記載のプラスミドにより形質
   転換された微生物。 ＋１３　大腸菌属微生物である特許請求の範囲第１１項
   記載の微生物。 （１１大腸菌（ｃａｌｌ）種の微生物である特許請求の
   範囲第１２項記載の微生物。 ０４　同化可能な炭素、窒素および必須無機塩類源と生
   長因子を含む水性栄養培地で、ヒツジブレー成長ホルモ
   ン産生条件下に、原核生物中で複製可能で且つヒツジブ
   レー成長ホルモンを暗号化するデオキシリボヌクレオチ
   ド配列をもつプラスミドにより形質転換された該原核生
   物を培養し、かくして産生されたヒツジブレー成長ホル
   モンを回収することを特徴とするヒツジブレー成長ホル
   モンの産生方法。 ０！９　原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ　
   ｃｏｌｔ）である特許請求の範囲第１４項記載の方法。 αｅ　前記原核生物がＮＲＲＬ　Ｎｏ、　Ｂ　−１５０
   ６０と実質的に類似のものである特許請求の範囲第１５
   項記載の方法。 同　大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）株ＮＲＲＩ、　ＮＯ，Ｂ−
   １５０６０の生物学的に純粋な培養物。