SU1646489A3 - Способ получени бычьего гормона роста - Google Patents
Способ получени бычьего гормона роста Download PDFInfo
- Publication number
- SU1646489A3 SU1646489A3 SU4027045A SU4027045A SU1646489A3 SU 1646489 A3 SU1646489 A3 SU 1646489A3 SU 4027045 A SU4027045 A SU 4027045A SU 4027045 A SU4027045 A SU 4027045A SU 1646489 A3 SU1646489 A3 SU 1646489A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- sequence
- pmon
- coding
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 230000006651 lactation Effects 0.000 claims description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 abstract description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 4
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001298245 Lauria Species 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000543375 Sideroxylon Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 101150003556 cul-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/184—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(21)4027045/13
(22)21002086
(31)704362
(32)22.05.85
(33)US
(46) 30.04.91. Бюл0 № 16
(71)Монсанто Компани (US)
(72)Гвен Грабовский Криви (US)
(53)575.224„2:577„2(048)(088.8)
(56)Proc. Nat l Acac, Sci, USA, 81, p. 5403-5407.
(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЫЧЬЕГО ГОРМОНА РОСТА
(57)Изобретение относитс к генетической инженерии и касаетс получени рекомбинантного бычьего гормона роста. Цель изобретени - повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимул ции лактации у коров. Бычий гормон роста получают путем конструировани рекомбинантной плазмидной ЛНК, кодирующей бычий гормон роста в результате выделени ДНК из плазмиды pGHex-I, встраивание кодона дл аланина вслед за ATG кодоном, реклонировани в плазмиду pBGFex-I, трансформации полученным ДНК штаммов Е„ coli с последующим выделением и очисткой конечного продукта. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.
в &
Изобретение относитс к генетической инженерии и касаетс получени рекомбинантного бычьего гормона роста .
Цель изобретени - повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимул ции лактации у коров0
Бычий гормон роста получают путем конструировани рекомбинантной штазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, в результате выделени кДНК из плазмиды pGHex-I, встраивани кодона дл аланина вслед за ATG кодоном, реклонировани в плазмиду р Ъ GHex-I, трансформации полученными рекомбинантными ДНК штаммов Е.со- li с последующим выделением и очисткой конечного продукта
Пример 1.
а) Кодирующую соматотропин, т.е. 6ГР (Л) последовательность ДНК, выдел ют из pGHex-I как фрагмент Хва и клонируют в сайт Хва модифицированного вектора Ml3mp8 (M13mp8/ /Хва). Хва рассекает в обоих концах кодирующую 6ГР (Л) последовательность ДНК, выреза таким образом полную кодирующую 6ГР (Л) последовательность . Плазмиду pBGHeJ( -I после обработки Лерментом I смешивают в присутствии ДНК-лигазы Т4 с РФ ДНК (РФ - репликативна Форма вектора) М13тр8/Хва1, линеаризованной при помощи эндонуклеазы рестрикции Хва, и обрабатывают щелочной еЬосЛатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота). Затем смесь инкубируют в течение ночи при
ЗЭ
С& -U
00
ы
14 С. Обработка щелочной дюсфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) предотвращает рециркул - ризацию вектора М13тр8/Хва1. Вставку кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК в вектор М13тр8/Хва1 с целью образовани рекомбинантного вектора M13mp8/BGHex-I первоначально контролируют образованием бесцветных бл - шек на культуре бактерий IM101 Е. со- 11, выращиваемой на среде 1 х УТ, использу процедуру покрыти м гким агаром, который содержит 10 мл 100 мМ ИГТГ (изопропил-($-В-тиогалактопира- нозида) и 50 мкл 2% (в/о) X-GAL (5- бром-4-хлор-3-индолил-й-В-галакто- пиранозида) в 3 мл верхнего агара, и осуществл ют трансфекцию упом нутым рекомбинантным вектором аналогично описанному Вставку кодирующей 6ТР(Л последовательности подтверждают при помощи рестрикции изолированной РФ ДНК рекомбинантного вектора ферментом Хва1, в результате чего получают Фрагмент в 590 пар оснований, содержащий , вставленную последовательность Фрагмент в 590 пар оснований идентифицируют при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном агаре. Все последующие фрагменты после обработки ферментами иденти- сЬицируют именно при помощи этой процедуры . Ориентацию вставленных кодирующих 6ГР (Л) последовательностей контролируют при помощи обработки РФ рекомбинатного вектора ферментами Smal и Find III. Если кодирующие последовательности наход тс в правильной З1 ориентации, в резуль- тате сечени этими ферментами рестрикции получают фрагмент в 207 пар оснований. Осуществл ют изол цию однонитевой (ОН) ДНК фага, вектор MISmpS/BGHg -I используют в качестве матрицы при сайт-специфическом мутагенезе .
Олигонуклеотидную затравку, содержащую последовательность дл искомой мутации, используют дл затрав лени синтеза копии замкнутой кольцевой ДНК матрицы M13mp8/BGHex-I онДНК. Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы двунитевой (ДН) ДНК отдел ют от неполных колец и колец онДНК при помощи центрифугировани градиентом щелочной сахарозы . Замкнутые кольцевые молекулы днДНК используют дл трансформации
0 ,- о 5
Q
5
Е. coli IM101 и полученные в результате бесцветные бл шки помещают на фильтры Пэлл и просеивают, контролируют гибридизацию в меченную Р форму олигонуклеотидной затравки, использованной дл осуществлени сайт-специфического мутагенеза. Фильтры промывают при увеличивающихс температурах до тех пор, пока не исчезнет радиоактивно меченный сигнал с контрольного фильтра, который приготавливают с использованием фага М13пгр8/ /BGHgj-I. Промывку фильтров осуществл ют при комнатной температуре в 6 х SSC (0,9 М NaCl 0,09 М цитрата натри ) в течение 10 мин, затем при 50°С в 6 X SSC в течение 5 мин, а последующие промывки - при увеличении температуры на 5°С. Бл шки, которые гибридизировались с образованием меченной радиоактивным элементом олигонуклеотидной затравки при темпера- турах более высоких, чем контрольные фаги, считают несущими новую созданную кодирующую 6ГР (Л,Л) последовательность и называют положительными . Отдельные бесцветные бл шки отбирают из культуры трансформированных клеток IM101 Е. coli и выращивают , в 5 мл среды 2 УТ Јl,6% (в/о) триптона, 1,0% (в/о) экстракта дрожжей , 0,5% (в/о) NaClj в течение ночи при 37°С в услови х аэрации. ДНК фага затем нанос т п тнами на нитроцеллюлозу , подвергают гибридизации с затравкой, меченной радиоактивным элементом, и промывают при увеличении температуры, как указано выше. ДНК фага, которые имели температуру гибридизации выше контрольных бл шек M13mp8/BGHex-I, вл ютс потенциально положительными.
Потенциально положительные бл шки из обеих процедур выращивают и используют дл получени онДНК фага, анализируют последовательность онДНК, чтобы подтвердить, что она действительно несет кодирующую 6ГР (А,Л) последовательность. РФ ДНК М13тр8/ /BGHex-I (ala) тоже анализируют, отбирают при помощи анализа ферментом рестрикции Нае III с тем, чтобы убедитьс в присоединении кодона аланина после комплекса сигналов начала кодон метионина АТС, так как при создании кодона аланина образуютс дополнительные сайт-ограничени Нае III, частота присоединени кодона
аланина составл ет примерно 2% кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК.
б( Конструкцию кодирующей 6ГР (А,В) последовательности ДНК отбор и анализ последовательности осуществл ют аналогично описанному, но матрицей
вательность ДНК. Затем трансформированные Е. coli IM101 выращивают на среде 1 УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществл ют по образованию бесцветных бл шек аналогично описанному.
Вставку кодирующих сГР (Ф) после вл етс M13mp8/BGHex-I (ala), а олигону-довательностей ДНК подтверждают слеклеотидна затравка указана в табл. 1 Частота превращени кодона лейцина в кодон вал на составл ет примерно 10%„
В табл. 1 показано конструирова- .ние кодирующих соматотропин с К-кон- цевым аланином последовательностей.
в) Конструкцию кодирующей 6ГР (В) последовательности ДНК, отбор и анализ последовательности провод т аналогично описанному. При этом матрицей вл етс M13mp8/BGF -I, а олиго- нуклеотидна затравка используетс та же, что и при конструировании 6ГР (А,В). Частота превращени кодона лейцина в кодон валина составл ет примерно 10%.
Используют олигонуклеотидный сайт- специфический мутагенез, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР (Ф) последовательности ДНК.
Кодирующую сГР (Ф) последовательность ДНК в 590 пар оснований, содержащуюс на плазмиде PPGHex-I, вы- дел ют из этой плазмиды при помощи эвдонуклеазого сечени EcoRI и Hind III которые рассекают плазмиду в 5 -и 3 концах кодирующей сГР (Ф) последовательности . Рассеченную плазмиду pPGHex I смешивают с РФ ДНК М13тр9, который разрезают эндонуклеазами EcoRI и Hind III и предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции М13щр9. Затем в упом нутую смесь добавл ют ДНК-лигазу Т4. Благодар наличию отклон ющихс от нормы концов на РФ ДНК фага и кодирующей гГР (Ф) последовательности ДНК, образованных при использовании .двух различных Ферментов рестрикции, ДНК сГР (Ф) селективно вставл ют в РФ ДНК фага в правильной 51 ориентации . Затем осуществл ют трансформацию Е. coli IM101 в соответствии с описанием, приведенным выше дл M13mp8/BGHЈX I, при помощи рекомби- нантного вектора M13mp9/PGHex-I, несущего кодирующую сП5 («г) последо10
20
25
30
дующим образом. Выбирают бесцветные бл шки, а РФ ДНК М13шр9/РСНех-1 рас- секают эндонуклеазами EcoRI иHind III и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают J5 фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф)0 Зате Фаг M13mp9/PGHex -I размножают в Е0co li Ш101, выдел ют онПНК фага.
ДНК Ml3mp9/PGRex-I используют в качестве матрицы дл сайт-специфического мутагенеза, как описано выше, конструировани кодирующей 6ГР (А,Л) последовательности, использу специальную затравку (табл. 1), Частота присоединени кодона аланина, в данном случае ПСС, к кодирующей сГР (Ф) последовательности, составл ет примерно 12%. Получение кодирующей сГР (А) последовательности опдтверж- дают анализ последовательности ДНК.
Пример2. Получают три полипептида , соматотропины видов 6ГР (А, Л), 6ГР (А,В) и сГР (А).
Кодирующие 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В) 3 и 6ГР (В) последовательности ДИК, содержащиес на рекомбинантных векторах Mi3mp8/BGHex-I (ala), М13тпр8/ВОНе 1-1. (ala, val) и М13шр8/ /BGPe}C-I (val), соответственно исполь зуют дл замены кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК, содержащейс на плазмиде экспрессии pBGH х-1. Это осуществл ют при помощи переваривани соответствующих РФ ДНК М13 45 ферментом Хва1. Глазмиду экспрессии pBGFex-I переваривают эндонуклеазой Хва1, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции. Каждую из переваренных РФ ДНК смешивают с пере- ваненой ДНК рВОКех-1 и подвергают лигации в течение ночи при 14°С. . Полученные таким образом рекомбинант- ные векторы экспрессии, которые обозначают рМОМ 3209, pMON 3215 и рМОК 3214, несут кодирующие 6ГР (А,Л), ) и бг (В) последовательнос40
50
55
вательность ДНК. Затем трансформированные Е. coli IM101 выращивают на среде 1 УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществл ют по образованию бесцветных бл шек аналогично описанному.
Вставку кодирующих сГР (Ф) послеу-довательностей ДНК подтверждают сле0
0
5
0
дующим образом. Выбирают бесцветные бл шки, а РФ ДНК М13шр9/РСНех-1 рас- -V секают эндонуклеазами EcoRI иHind III и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают 5 фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф)0 Затем Фаг M13mp9/PGHex -I размножают в Е0coli Ш101, выдел ют онПНК фага.
ДНК Ml3mp9/PGRex-I используют в i качестве матрицы дл сайт-специфического мутагенеза, как описано выше, конструировани кодирующей 6ГР (А,Л) последовательности, использу специальную затравку (табл. 1), Частота присоединени кодона аланина, в данном случае ПСС, к кодирующей сГР (Ф) последовательности, составл ет примерно 12%. Получение кодирующей сГР (А) последовательности опдтверж- дают анализ последовательности ДНК.
Пример2. Получают три полипептида , соматотропины видов 6ГР (А, Л), 6ГР (А,В) и сГР (А).
Кодирующие 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В) и 6ГР (В) последовательности ДИК, содержащиес на рекомбинантных векторах Mi3mp8/BGHex-I (ala), М13тпр8/ВОНе 1-1. (ala, val) и М13шр8/ /BGPe}C-I (val), соответственно используют дл замены кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК, содержащейс на плазмиде экспрессии pBGH х-1. Это осуществл ют при помощи переваривани соответствующих РФ ДНК М13 5 ферментом Хва1. Глазмиду экспрессии pBGFex-I переваривают эндонуклеазой Хва1, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции. Каждую из переваренных РФ ДНК смешивают с пере- ваненой ДНК рВОКех-1 и подвергают лигации в течение ночи при 14°С. . Полученные таким образом рекомбинант- ные векторы экспрессии, которые обозначают рМОМ 3209, pMON 3215 и рМОК 3214, несут кодирующие 6ГР (А,Л), ) и бг (В) последовательнос0
0
5
ти ДНК соответственное, Затем Е. со- li W 3110 подвергают трансформации .смесью, содержащей pMON 3209 или pMON 3215, или pMON 3214, или pBGFex-I, и выращивают в бульоне Лауриа (БЛ), содержащем 1% (в/о) триптона, 0,5% (в/о) экстракта дрожжей и 0,5% (в/о) NaCl, а также 12,5 мкг/мл тетрациклина и200мкг/мл ампициллина. Штамм Е. coli W 3110 с плазмидой pMON 3209 задепонирован под номером АТСС 53024,, Штамм Е„ coli W 3110 с плазмидой pMON 3215 задепонирован под номером АТСС 53022„ ТрансЛорма цию осуществл ют следующим образом. Приблизительно 50 мл культуры Е. coli W 3110 выращивают в среде БЛ до ОП600 0,60„ Клетки извлекают в виде таблетки и вновь суспендируют в 10 мл буфера А, содержащего 25 мҐ трис, рН 7,6, и .10 мМ NaClc Затем клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в 1 мл бу Ьера А, в который добавл ют 14 мл буфера В, содержащего 25 мМ трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 50 мМ CaClz, и суспензию инкубируют на льду в течение 30 мин. Далее клетки извлекают в дюрме таблетки и вновь суспендируют в 3 мл буфера В. Порцию в 0,2 мл суспендированных клеток вновь смешивают с 0,t мл буфера В и 0,1-0,5 мкг рекомбинантным вектором экспрессии (pMON 3209 или pMON 3215, pMON 3214 или ВГ-Нех-1) и инкубируют на льду в
lex
течение 60 мин., Затем инкубированную смесь нагревают на 1 мин при 37°С, после чего добавл ют 3 мл среды БЛ. Далее полученную в результате смесь инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в 300 мл среды БЛ и выращивают на пластинках с БЛ, содержащих вышеназванные антибиотики. Далее отбирают стойкие колонии и выдел ют ДНК векторов экспрессии pMON 3209, pMON 3215, рВСНех-1 и рМОИ 3214. ДНК pMON 3209, pMON 3215, рВГ-Рех-1 и pMON 3214 анализируют на наличие фрагмента Хва в 590 пар оснований и фрагмента Kind III/Smal в 200 пар оснований, подтверждающих наличие кодирующих 6ГР (А,Л), 6ГР (В) и 6ГР (А,В) последовательностей ДНК в правильной ориентации Далее плазмиды экспресси pMON 3209 и pltON 3215 анализируют при помощи анализа эндонуклеазами
0
5
0
5
0
5
0
5
рестрикции (Пае III) с тем, чтобы убедитьс в присутствии нового сайта Нае III, образовавшегос при присоединении кодона ГСС (аланина). Фрагмент Хва в 590 пар оснований из векторов pHON 3209, рМОК 3214 и pMON 3215 анализируют на состав последовательности с тем, чтобы подтвердить присутствие в этих векторах экспрессии кодирующих дл 6ГР (А,Л), 6ГР (Е) и 6ГР (А,В) последовательностей ДНК„
Отдельные колонии Е. coli W 3110, несущие плазмиды pMON 3209, pHON 3214, BOHejt-I или pMON 3215, помещают в 5 мл БЛ, содержащего 12,5 мкг/мл тетрациклина, и выращивают в течение ночи при 37°С при аэрации. После чего 0,5 мл каждой культуры используют дл выращивани отдельно на 25 мл среды М9, содержащей (на 1 л среды) 100 мл солей (70 г , 30 г КНгР04, 5 г NaCl, 10 г ТР4С1 на 1000 мл общего объема), 1,2 мл 1 М раствора MgSO., 0,25 мл 0,1%-ного В4 , 12,5 мл 20%-ного (в/о) раствора глюкозы , 0,025 мл 1 М раствора СаС1, дополненной 0,5% (в/о) казаминовых кислот и 6,25 мкг/мл тетрациклина и содержащейс в 250-миллиметровой колбе. Каждую культуру выращивают при 37°С в услови х аэрации до тех пор, пока ОП600 (оптическа плотность в диапазоне 600 нм) не достигнет х 1,0. Далее 0,2 мл извлекают из каждой упом нутой колбы и отдельно подвергают лизированию в буфере додецил- сульфатнатри (ДСН) полиакриламид- ного гелевого электрофореза (ПАГЭ) и и анализируют методом ДСН-ПАГЭ„ Протеины с молекул рным весом 22000 дальтон в высоких концентраци х получают в культуре Е. coli W 3110 дл обеих генетических конструкций, Клетки культуты Е. coli W 3110, несущие плазмиду pBR322, не продуцируют протеин в 22000 дальтон, который св зываетс с антителами антисоматотропи- на.
Бактерии, несущие плазмиды pMON 3209, pMON 3214, рВПНех-1 и pMON 3215, хран т следующим образом. Каждую колонию культуры Е. coli W 3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (pMON 3209 или рМШ 3215, pMON 3214 или pBGHex-I), выращивают в течение ночи при 37°С в 5 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина при аэрации. Порцию в 1 мл каж
дои культуры после выращивани в течение ночи добавл ют отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина и выращивают до достижени ОПбООв1,0. Затем клетки из каждой колбы собирают центрифугированием при ускорении 6000 х g при 4°С в течение 5 мин таблетки. Отдельно суспендируют с о- ва в 12 мл БЛ плюс 7,5% (в/в) ДМСО и очень быстро замораживают на сухом льду порци ми в t мл„ Далее клетки хран т в холодильнике с жидким азотом . 10 мкг очищенной ДНК плазмиды хран т при -80°С.
Кодирующую сГР (А) последовательность , содержащуюс на рекомбннант- ном векторе M13mp9/PGHex-I Cala), используют дл того, чтобы заменить кодирующую 6ГР (Л) последовательность ДНК, содержащуюс на модифицированном векторе экспрессии Модифицированный вектор экспрессии pBGHex-if вл етс вектором экс- прессии pBGHe)(-I, в котором сайт ограничени EeoRI, расположенный вверх от промотора триптофана (ptr p), удален. Модифицированный вектор экспрессии pBGHex-I конструируют при помощи частичного переваривани ферментом EcoRI pBGHex-I с последующей обработкой нуклеазой SI с тем, чтобы удалить липкие концы Вектор
pBGHav-I после рестрикции подверга
ют рециркул ризации с использованием
/ДНК-лигазы Т4, а затем используют дл трансформации культуры Е. со- li JM101. Все это осуществл ют в соответствии с описанным ранее. ДНК плазмиды из каждой колонии анализируют на наличие фрагмента EcoRI/ /Hind III в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР (А) последовательность , и Фрагмента EcoRI/ /Pst I в 1050 пар оснований, несущего последовательность ptr p. Удаление этого EcoRI сайта рестрикции упрощает сайт-специфическую вставку специального сайта кодирующей сГР (А) последовательности в вектор экспрес- сии pBRHex-I в правильной ориентации. Рекомбинантный вектор экспрессии, полученный таким образом, в дальнейшем обозначают pMON 3213. Смесь, содержащую рМШ 3213, используют дл трансформации культуры Е. coliW3110, затем трансформированные клетки выращивают и подвергают селекции:Куль5
0
„
тура Е„ coli W 3110, содержаща pMON 3213, депонирована под номером АТСС 53023. Замену кодирующей сГР (Л) последовательности кодирующей сГР (А) последовательностью в векторе экспрессии pBGHe)(-I под- (тверждают при помощи выделени ДНК pMON 3213 и последующем сечении упом нутого вектора экспрессии эндону- клеазамн EcoRI и Hind III и получают фрагмент в 590 пар оснований, а сечение с использованием Нае III показывает присутствие дополнительного Нае III фрагмента рестрикции, который образуетс из-за присутстви кодона аланина в кодирующей сГР (А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение присутстви кодирующей сГР (А) последовательности ДНК в векторе экспрессии рМШ 3213 получают при помощи частичного анализа последовательности фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований
Экспрессию кодирующей сГР (А) последовательности ДНК и продуцирование сГР (А) в культуре Е. coliW3110 .осуществл ют прм помощи тех же приемов , которые были описаны ранее и использовались при получении 6ГР (А, Л) и 6ГР (А,В). Аналогичным образом получают высокие концентрации протеинов в 22000 дальтон что устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ. Клетки Е. coll W 3110, несущие вектор эксперссии pMON 3213, хран т так же, кик описано ранее и используют дл получени в больших количествах сГР (А) (ферментацию осуществл ют в 10-100-литровых емкост х. Содержание протеина сГР (А) в реакторе-ферментации емкостью 100 л составл ет приблизительно I г/л бульона.
Примерз Соматотропные полипептиды , синтезированные в культуре Е„ coli, подвергают очистке из неочищенных солюбилиэированных светопреломл ющих тел, содержащих один из 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В), met - 6ГР (В), met - 6ГР (Л) или сГР (А) при помощи иммуноадсорбентной хроматографии0 Все три вида соматотропина, очищенные при помощи иммуноадсорбентной хроматографии, имели чистоту, превышающую 95%. Этот факт устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ с использованием 1 мг очищенного протеина на 7,5-15%-ном (в/о) градиентном геле. Концентрации протеинов очищенных ви
П16
дов 6ГР определ ют при помощи известного анализа с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии „
Протеины, очищенные при помощи хроматографии, основанной на принципе иммунного средства, дл использовани в анализе на N-концевую последовательность , подвергают диализу до полного удалени воды, а затем лио- филизируют„ Перед выполнением анализ fr-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендируют в буфер бикарбоната аммони , содержащий 50 мМ бикарбоната аммони плюс 0,1% (в/о) ДСН, и подвергают диализу против того же буфера с тем, чтоб удалить остаточные трис/оксиметил/ /аминометан/трис/ и глицин,
Б табл. 2 приведены результаты анализа N-концевой последовательностей дл нескольких препаратов полипептидов 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В), met - 6ГР (В), met - 6ГР (Л) и сГР (А). Количество протеина с N-концевым мети онином приведено в процентах от общего содержани соматотропина в пробе . Дл определени количества ме- тионина используют два метода. При помощи непр мого метода количество NHv-met-ala-рЪе... в преобладающей попул ции NH2 ala-pheoо о вычисл ют исход из различий в lag-сигналах. Так как эта процедура зависит от некоторой оценки нормального запаздывани дл последовательности, которое измен етс от цикла к циклу, она вл етс лишь весьма грубой оценкой дл содержащейс последовательности NH -ala-phe... Пр мой метод, содержащий реакцию молекул рной деградации Эдмана, заключаетс в сравнении мощности сигналов от PTH-tnet относительно PTH-ala после отделени PTH-met от химического шума с использованием высокоразрешающей 1 жидкостной хроматографии (ВРЖХ). В частности, реакци деградации Эдмана заключаетс во взаимодействии N- концевой аминокислоты с реагентом, который отсекает эту аминокислоту, и в ее последующем высвобождении в форме РТН-производНого этой аминокислоты . Последн процедура будет давать хорошие оценки (%) дл met-ala- phe... в том случае, если загр знение свободной аминокислотой вл етс низким.
5
0
5
489
.
0
5
0
5
0
11
Степень обработки N-концевого ме- тионина варьирует в клетках от ферментации к ферментации, но всегда происходит в не менее 80% от всех молекул соматотропина.
Пример40 В табл„ 3 показано изменение надоев молока, вызванное инъекцией солюбилизованных видов 6ГР коровам Из полученный данных видно, что 6ГР (А,В) и met-бГР стимулируют надои молока в гораздо более значительной степени, чем соответствующие им (содержащие лейцин) аналоги 6ГР (А,Л) и met-бГР (Л). Кроме того, испытываемые валиновые 6ГР- виды при совместном сопоставлении с лейциновым бРР-видами дают в ста тистическом смысле (,02) более значительный прирост надоев молока
Исследование провод т следующим образом.
Коровам породы Холетеин в период их второго и третьего триместра лактации дают 5 мл раствора бикарбоната натри (рН 9,8+0,5), только (контроль ) или содержащего примерно 25 мг 6ГР (А,В), 6ГР (А,Л), met - 6ГР (В) или met - 6ГР (Л) в дальнейшем все эти смеси вместе именуютс испытуемыми соматотропинами), ежедневно . Все испытуемые соматотропины и контрольные пробы примен ют парентерально при помощи внутримышечной инъекции в полусухожильную мыцщу ежедневно в течение 21 дн . Фиксируют ежедневный удой каждой коровы, начи- на за шесть дней до первой ежедневной инъекции и на прот жении 21 дн , в течение которых делали инъекции„ Анализируют каждую жирность, содержание протеинов в молоке и соматические клетки Результаты, представленные в табл. 3, указывают, что увеличение надоев молока, полученное при применении 6ГР (А,В) к коровам, примерно на 50% выше, чем полученное при использовании 6ГР (А,Л) и примерно на 17% выше при применении met - 6ГР (В),чем при применении met - 6ГР (Л).
г
Claims (2)
- Формула изобретениСпособ получени бычьего гормона роста, включающий получение кДНК, кодирующей бычий гормон роста, встраивание кДНК в бактериофаг, трансформацию полученными рекомбинантными фагами штаммов Escherichia coli, отбор клонов, содержащих рекомбинант- ные плазмиды с геном бычьего гормона, выделение рекомбинантных плазмид и встраивание кДНК из этих плаэмид в вектор экспрессии с последующей трансформацией полученной плазмидой экспрессии штаммов Е. coli, отбором .трансформированных штаммов, культивированием в питательной среде, выделением и очисткой конечного продукта , отличающийс тем, что, с целью повышени биологической активности бычьего гормона роста вpGH(A) 51 CCAGTGMTTCTATGGCCTTCCCAGCTATG M13mp9/PGHey-IПробаКоличество протеина с N-концевым метионином проведено в пересчете на проценты от общего содержани сома- тотропина в пробе. Данные дл протеина, очищенного после проведени двух отдельных ферментации .отношении стимул ции лактации у коров , фрагмент кДНК, выделенный из плазмиды pGHex-I, с помощью сайт- специфического мутагенеза встраивают кодон дл алаиина вслед за АТС кодо- ном и полученный модифицированный фрагмент реклонируют в плазмиду pBGHfrj{-I вместо последовательности ДНК, кодирующей BGH (L).
- 2. Способ по п„ 1, отличающийс тем, что бычий гормон представл ет собой BGH (A,V).Таблица 1pMON 3213Таблица 2N-концевой метионин , %Непр мой I Пр мой1Примечание,, Значени приведены в пересчете по методу наименьших квадратов (в килограммах) на корову (в день) молокл с нормализованной жидкостью в 3,5% жира.Таблица 3
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/704,362 US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | Production of proteins in procaryotes |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4830848/13A Division RU2072393C1 (ru) | 1985-02-22 | 1990-08-20 | Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1646489A3 true SU1646489A3 (ru) | 1991-04-30 |
Family
ID=24829151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4027045A SU1646489A3 (ru) | 1985-02-22 | 1986-02-21 | Способ получени бычьего гормона роста |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US4861868A (ru) |
| SU (1) | SU1646489A3 (ru) |
| ZA (1) | ZA861323B (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5037806A (en) * | 1985-02-22 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Biologically active method using somatotropins |
| US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| US5141922A (en) * | 1985-02-22 | 1992-08-25 | Monsanto Company | Biologically active proteins and a method for their use |
| US5244882A (en) * | 1987-03-12 | 1993-09-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs, and compositions |
| US5104806A (en) * | 1987-03-12 | 1992-04-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs encoding dna |
| HUT71885A (en) * | 1992-07-08 | 1996-02-28 | Monsanto Co | Process for preparing a composition containing benzimidazoles for treatment stomach ulcer in swine |
| US5932439A (en) * | 1995-11-13 | 1999-08-03 | Monsanto Comapny | Escherichia coli K-12 strains for production of recombinant proteins |
| AU4860200A (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-23 | Monsanto Technology Llc | Dna construct for regulating the expression of a polypeptide coding sequence in a transformed bacterial host cell |
| DE19943177C2 (de) * | 1999-09-09 | 2002-10-24 | Dieter Jenne | Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven Varianten |
| KR20090007504A (ko) | 2000-02-24 | 2009-01-16 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 소마토트로핀의 지속적인 방출을 위한 비수성 주사제제들 |
| KR20030023878A (ko) | 2000-06-26 | 2003-03-20 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 소마토트로핀의 지속적인 방출을 위한 계면활성제 함유비수성 제제들 |
| US6664234B1 (en) | 2000-06-30 | 2003-12-16 | Monsanto Technology Llc | Non-aqueous injectable formulation preparation with pH adjusted for extended release of somatotropin |
| US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| US8680050B2 (en) * | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
| CN102348715B (zh) | 2009-02-03 | 2017-12-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| US8133916B1 (en) * | 2009-03-10 | 2012-03-13 | Amelgo, LLC | Control of milk production and mammary involution |
| US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| WO2023233034A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Recombinant expression of myeloid-derived growth factor |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3842063A (en) * | 1971-06-03 | 1974-10-15 | Lilly Co Eli | Polypeptides from bovine,ovine,human and porcine pancreas |
| US4056520A (en) * | 1972-03-31 | 1977-11-01 | Research Corporation | Clinically active bovine growth hormone fraction |
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US4571421A (en) * | 1979-11-05 | 1986-02-18 | Genentech, Inc. | Mammalian gene for microbial expression |
| US4425437A (en) * | 1979-11-05 | 1984-01-10 | Genentech, Inc. | Microbial polypeptide expression vehicle |
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| SE453510B (sv) * | 1980-12-29 | 1988-02-08 | Toyo Jozo Kk | Peptid for analys av humant paratyroidhormon |
| JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
| US4880910A (en) * | 1981-09-18 | 1989-11-14 | Genentech, Inc. | Terminal methionyl bovine growth hormone and its use |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| EP0085036A1 (en) * | 1982-01-18 | 1983-08-03 | Monsanto Company | Method for improved bovine milk production |
| US4670393A (en) * | 1982-03-22 | 1987-06-02 | Genentech, Inc. | DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein |
| US4423037A (en) * | 1982-05-13 | 1983-12-27 | The General Hospital Corporation | Inhibitors of peptide hormone action |
| GB2121054B (en) * | 1982-05-25 | 1986-02-26 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| US4745069A (en) * | 1982-05-25 | 1988-05-17 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
| US4673641A (en) * | 1982-12-16 | 1987-06-16 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Co-aggregate purification of proteins |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| GR79124B (ru) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4521409A (en) * | 1983-10-03 | 1985-06-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of growth hormone to enhance ruminant mammary development |
| US4549986A (en) * | 1983-12-23 | 1985-10-29 | The Salk Institute For Biological Studies | Human CGRP |
| DE3585170D1 (de) * | 1984-03-06 | 1992-02-27 | Lilly Co Eli | Expressionsvektoren fuer rinderwachstumshormonderivate. |
| DE3588249T2 (de) * | 1984-08-16 | 2004-05-06 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methode zur Herstellung von menschlichen Wachstumshormonen |
| US4795706A (en) * | 1985-01-31 | 1989-01-03 | Eli Lilly And Company | Novel expression control sequences |
| US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| US5037806A (en) * | 1985-02-22 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Biologically active method using somatotropins |
-
1985
- 1985-02-22 US US06/704,362 patent/US4861868A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-21 ZA ZA861323A patent/ZA861323B/xx unknown
- 1986-02-21 SU SU4027045A patent/SU1646489A3/ru active
-
1992
- 1992-11-12 US US07/975,205 patent/US5399489A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-10 US US08/402,088 patent/US5744328A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-24 US US09/066,288 patent/US6210928B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6210928B1 (en) | 2001-04-03 |
| US4861868A (en) | 1989-08-29 |
| ZA861323B (en) | 1987-02-25 |
| US5399489A (en) | 1995-03-21 |
| US5744328A (en) | 1998-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1646489A3 (ru) | Способ получени бычьего гормона роста | |
| US5470719A (en) | Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides | |
| EP0047600B1 (en) | Bovine pre-growth and growth hormone | |
| RU2129606C1 (ru) | ШТАММ ESCHERICHIA COLI JM 105, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ПЛАЗМИДОЙ PAE12, - ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PAE12, ЛИНИЯ КЛЕТОК С127 МЫШИ, ТРАНСФИЦИРОВАННАЯ ПЛАЗМИДОЙ PD BPV-ММТ NEO αАЕА75-ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pd BPV-MMT Neo αAEA75 | |
| KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
| JP3207416B2 (ja) | ソマトトロピン・アナログ類 | |
| US6229003B1 (en) | Production of bovine growth hormone by microorganisms | |
| AU634517B2 (en) | Somatotropin analogs | |
| EP0193515B1 (en) | Method for obtaining biologically active bovine and porcine growth hormone and composition comprising biologically active porcine growth hormone | |
| JPH07108221B2 (ja) | レンニンの製造方法 | |
| DD153393A5 (de) | Verfahren zur reinigung von nucleotidsequenzen | |
| US6316004B1 (en) | Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals | |
| JPS63240799A (ja) | 組換えポリペプチドの製法 | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| KR960016704B1 (ko) | 소마토트로핀 암호화 cDNA, 발현 벡터 및 숙주 | |
| JP2591713B2 (ja) | アシネトバクター・カルコアセチカスからの酵素ムタロターゼの製造のためのｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子および方法 | |
| EP0285361A2 (en) | Purification of apase-1 1 and retrieval of the nematode resistance gene | |
| Takasaki et al. | Cloning and sequence analysis of a snake, Atractaspis engaddensis gene encoding sarafotoxin S6c | |
| JPS62226998A (ja) | ヒトカルシトニン前駆体ペプチド及びその製造方法 | |
| WO1987001708A2 (en) | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation | |
| DE3220333C2 (ru) | ||
| EP0443790B1 (en) | Growth hormone-like glycoproteins | |
| CA1302321C (en) | Preparation of polypeptides | |
| KR860001922B1 (ko) | 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 | |
| JPH0272878A (ja) | 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いたグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: MM4A Effective date: 20040222 |