JPS63240799A - 組換えポリペプチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はブタの成長ホルモン活性を有する組換えポリは
プチト９を、この種のポリペプチドをコードする合成り
ＮＡ配列を含む単細胞生物の培養により製造すること；
この種の生物を調製するための組換えＤＮＡ技術；特異
的プラスミドベクター；およびブタ成長ホルモン活性を
有する特異的ポリペプチドを含有する獣医学的組成物に
関する。

成長ホルモン（ポリはプチト９ホルモン）は下垂体前葉
において、より大型の前駆分子として合成される。天然
ではこの前駆分子が開裂による処理を受けて、このホル
モンの生物学的に活性な形態を与える。一般的な蛋白同
化作用物質として周知の成長ホルモンはライフサイクル
全般にわたって無数の生理学的作用を促進する。その名
称が意味するように、これは骨格の成長に関与する成長
促進物質および蛋白合成の増強物質である。成長ホルモ
ンはインシュリン増強作用をも示し５弱い乳腺刺激活性
をもち、脂質の代謝およびホメオスターシスの維持にお
いても役割を演じる。

ある程度、成長ホルモンは種特異性である。たとえばウ
シのホルモンはヒトおよびサルにおいては不活性である
が、ラットおよびヤギにおいては効果を生じるであろう
。

養豚においては、成長ホルモンの投与により体重増加が
促進され、屠殺体の質が改良され、これにより飼料転化
率が高められる。経済的見積りによれば、ブタを成長ホ
ルモンで処置することにより、生産の効率および経費と
共に食肉の質が改良されろことが示されている。残念な
がら天然のブタ下垂体ホルモンの供給はその需要に達せ
ず、種特異性による制限があり、他の天然同族体を代替
品として安価に使用することはできない。

組換えＤＮＡ技術および細菌を利用して、確立された方
法に従って同族ポリペプチドを製造することによって、
不足を避けることはできる。しかしこの種の方法には一
定の固有の欠点がある。その１つは、真核細胞のＤＮＡ
は一般に細菌におけろ発現に不適当である点である。そ
れがしばしば非コード部位またはイントロンを含み、こ
れらが遺伝子を妨害するからである。この現象は細菌性
ゲノムには見られない。他の問題は真核細胞と原核細胞
の調節配列の不適合性に由来する。

従って本発明の目的は、先行技術に関連する１または２
以上の難点を克服し、または少なくとも軽減することで
ある。特に本発明者らは、後述の方法を用いて、良好な
ブタ成長ホルモン活性をもつ比較的大量の組換えポリに
プチドを製造することができた。これらのポリペプチド
は良好な活性をもち、天然ホルモンに対する有効な代替
品としてインビボで使用できる。

従って本発明の一観点によれば。

１１（ａｌブタ成長ホルモン活性を有するポリペプチド
をコードし５かつ単細胞生物において複製。

転写および翻訳されうるＤＮＡ配列を含む組換えプラス
ミド発現イタター、ならびに（ｂｌ単細胞生物を用意し
； ２）上記組換えプラスミド９発現ベクターを上記単細胞
生物に、形質転換、形質導入またはトランスフェクショ
ンから選ばれろ方法により導入し；３）得られた生物を
培養し； ４）上記ＤＮＡ配列によりコードされろ組換えポＩＪ　
Ａプチドを発現させ；そして所望により５）上記ポリペ
プチドを培養物から単離する工程を含む、ブタ成長ホル
モン活性を有する組換えポリペプチドの製法が提供され
ろ。

本発明方法において、単細胞生物は原核生物、たとえば
細菌の菌株、たとえば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の菌株
であってもよい。大腸菌の菌株である大腸菌ＤＨ１が特
に適切であることが認められた。

本発明のこの観点に用いろ組換えプラスミド発現ベクタ
ーは、後記の方法により調製されろ適切なはフタ−のい
ずれであってもよい。特に有用なベクターには、のちに
詳述するようにｐＧＨ９３５、ｐＭＧｇ　３６．　ｐＧ
Ｍ９３９およびｐＭｃ９４０　が含まれる。この種の発
現ベクターは本発明の他の観点をなす。

本発明方法はここに定める組換えポリペプチドｐＧＨ（
ｍｅ　ｔ　１−１９０　）およびｐＧＨ（４−１９０）
の製造に特に好適である。

本発明方法の工程（１）　−（４）は周知の方法、たと
えば後記実副列に記載されるものにより行うことができ
ろ。工程（５）に従ってポリペプチド生成物を単離した
い場合も、常法を採用することができる。

たとえば細胞を破裂させたのち（たとえば細胞溶解によ
り）、たとえばイオン交換、アフイニテイもしくは分粒
樹脂を用いるクロマトグラフィーにより、および／また
は沈降法、たとえば遠心分離により、または他の既知の
ポリにプチド精製法により、ポリペプチドな単離するこ
とができる。

組換えホリハプチドが不溶性凝集体として発現されてい
る場合、および／または変性されている場合、常法によ
り、たとえば国際特許出願Ｗ。

８３１０４４１８号、英国特許第２１３８（１０）４号
および欧州特許第２２６４４８号明細書に記載されろ方
法により、可溶化および／または復元させることかでき
る。

本発明方法の工程（３）に用いるために特に有用な生物
には大腸菌の菌株、特に組換えプラスミド発現ベクター
ｐＭＧ　９３５．　ｐＭＧ９３６．　ｐＭＧ９３９およ
びｐＭＧ　９４０のうち１種を含む大腸菌ＤＨＩが含ま
れる。この種の菌株はその変異体１組換え体および遺伝
子工学による誘導体と共に本発明の他の観点をなす。

本発明方法により製造される特に有用な組換えポリ投プ
チドにはブタ成長ホルモン変異体ｐＧＨ（ｍｅｔｌ−１
９０）およびｐＧＨ（４−１９０）　　が含まれる。こ
れらの組換えポリペプチドは両者とも天然ホルモンに比
べて予想外に良好なインビボ活性をもち、動物、特にブ
タにおいて、たとえば屠殺体の質を改良し、および／ま
たは体重増加を促進するために用いることができる。こ
の方法に使用するためには、　ｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１
９０　）　　およびｐＧＨ（４−１９０）を動物に獣医
学的配合物の形で投与することができろ。

従って本発明の他の観点によれば、ｐＧＨ（ｍｅｔｌ−
１９０）またはｐＧＨ（４−１９０）およびそれらの獣
医学的に受容できる塩類から選ばれるブタ成長ホルモン
活性を有する組換えポリペプチド。

ならびに獣医学的用途に受容できるキャリヤー１種また
は２種以上からなる獣医学的組成物が提供される。

こコテ用いるｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０　）　　とい
う語は、天然のブタ成長ホルモンのアミノ酸配列を含み
、さらにＮ末端においてメチオニン残基により置換され
た組換えポリペプチドを意味する。ｐＧＨ（４−１９０
）という語は、天然のブタ成長ホルモンのアミノ酸配列
を含むが、ただし最初の３個のＮ末端アミノ酸（Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−Ａｐａ−）が存在しないポリペプチド９を意
味する。

ｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０　）　　およびｐＧＨ（４
−ｔ　９０　）の獣医学的に受容できる塩類には酸また
は塩基の塩類、たとえば無機酸塩、たとえば塩酸塩、ま
たは無機塩基塩、゛たとえばアルカリ金属（たとえばナ
トリウム）塩が含まれろ。

本発明による組成物は経口用、直腸用または非経口用（
埋込み用を含む）に適した形状を含めて。

投与に適したいかなる形状をもとることができる。

経口投与のためには１組成物はたとえば常法により調製
された液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤（たとえば水性
緩衝液中）、または固体組成物、たとえば錠剤もしくは
カプセル剤の形をとることができる。非経口用としては
、組成物はたとえば注射に適した形状、たとえば所望に
より調剤用物質、たとえば懸濁化剤、安定剤、可溶化剤
、および／または分散助剤を含有する水性または油性の
ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤の形状をとること
ができろ。

本発明による組成物において、有効成分の濃度はたとえ
ば処置すべき動物の性質および目的とする効果に応じて
異なるが、一般に０．０１〜０．２■／ＫＬｉ（生体重
）７日の有効成分量を投与するのに十分な量が用いられ
るであろう。

本発明による組成物は常法により調製することができ１
本発明の他の観点によれば、アリコート量の、ｐＧＨ（
ｍｅｔ　１−１９０　）またはｐｃＨ（４−１９０）お
よびそれらの獣医学的に受容できろ塩類から選ばれるブ
タ成長ホルモン活性を有する組換えポリにプチドを獣医
学的用途に受容できるキャリヤー１種または２種以上と
合わせることよりなる、獣医学的組成物の製法が提供さ
れる。

たとえば組換えポリペプチドを常法により適宜なキャリ
ヤーと混合もしくはブレンドするか、またはこれに懸濁
もしくは溶解することができる。

本発明方法に用いるプラスミド発現はフタ−は下記の方
法により得られる。これらの方法は一般に第１系列の工
程において、ブタ成長ホルモン活性をもつポリにプチド
をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターの調
製法を記載しており。

これらは有用な貯蔵ビヒクル（ｓｔｏｒａｇｅ　ｖｅｈ
ｉｃｌｅ）である。第２系列の工程はこれらの貯蔵ビヒ
クルを用いて５本発明方法に使用するプラスミド発現は
フタ−を構成することを示している。

以下ノ方法は高水準（７）　ｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９
０　）およびｐＧＨ（４−１９０）を発現しうるプラス
ミド発現はフタ−に特に有用であるが、他のブタ成長ホ
ルモン変異体を発現するベクターの調製にも一般に適用
できろ。

従って本発明の他の観点によれば、 ブタ成長ホルモン活性を有するポリペプチド９をコード
するＤＮＡ配列、およびプラスミドにフタ−を用意し； そしてこれらのＤＮＡ配列およびプラスミドベクターを
リゲートさせてＤＮＡ配列をプラスミドベクター内に配
置する（ｄｅｐｌｏｙ）ことを含む、ブタ成長ホルモン
活性を有するポリペプチド９をコードするＤＮ八へ置を
含む組換えＤＮＡプラスミドの製法が提供される。

こうして調製された組換えＤＮＡプラスミドバクターは
ブタ成長ホルモンポリはプチドミード部位の完全なコピ
ーを含み、構造遺伝子の終止コドンを越えた部位に３′
非翻訳配列を含むことができる。

ブタ成長ホルモン活性を有するポリペプチド９をコード
するＤＮＡ配列はｍＲＮＡから、すなわちｃＤＮＡとし
て誘導しうる。ｍＲＮＡ、たとえばポリアデニル化ｍＲ
ＮＡは適宜な組織源から得られ、たとえばブタ下垂体組
織から単離される。従って本発明の他の観点においては
、 ブタ成長ホルモンポリはプチビをコードするｍＲＮＡを
ブタ下垂体組織から入手し。

このｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補的な第１鎖および第
２鎖を有するｃＤＮＡ配列を調製することを含む、ブタ
成長ホルモン活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列の製法が提供されろＯ ブタ下垂体組織からのポリアデニル化ＲＮＡの抽出はグ
アニジンチオシアネート処理を採用したのちクロマトグ
ラフィー抽出することにより行うことができる。

本発明のこの観点によりｍＲＮＡからｃＤＮＡ　　を調
製する工程には プライマーオリゴｄＴをｍＲＮ　Ａにアニーリングさせ
； このｍＲＮＡを逆転写酵素で処理してｃＤＮＡの第１鎖
を形成させ； ｃＤＮＡの第１鎖をＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片
で１次いで逆転写酵素で処理して、第１鎖上にｃＤＮＡ
の第２鎖を形成させ； その生成物を処理して第１鎖と第２鎖の間の共有結合を
開裂させる ことが含まれろ。

開裂工程は適宜な酵素、たとえばヌクレアーゼＳ１によ
り行うことができろ。

二重鎖ＤＮＡをクローニングするためのプラス、？　Ｆ
Ｊ　＜フタ−は適宜な型のもの、たとえばプラスミド９
ベクターｐＢＲ３２２である。クローニング工程はいか
なる形態をとってもよい。ホモポリマーティリング／ア
ニーリング法を採用しうる。この場合、プラスミド発現
ベクターを修飾し、オーバーハングした３′側延長部を
形成してもよい。たとえばｐＢＲ３２２を制限酵素Ｐｓ
ｔ　　１で消化することができろ。！ラスミド〈フタ−
ｐＢＲ３２２はグアニジン残基（ヌクレオチドゝ約１５
個）によりテイル形成していてもよい。

同様にＤＮＡ配列はターミナルトランスフエラ−ゼを用
いてシトシン残基によりテイル形成することもできる。

ｐＧＨ配列を含むベクターを同定するためには、適切な
宿主細胞、たとえば大腸菌をベクターで形質転換し、挿
入ＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された細胞を適
宜な手段（たとえば抗生物質に対する耐性）により選択
し、ベクターＤＮＡがｐＧＨ特異特異性ポリヌクレオチ
ドロブローブトハイブリダイズ能力によって挿入ｐＧＨ
配列を同定することができる。

従って本発明の他の観点においては、のちに詳述するｐ
ＧＨ３，ｐ（１，Ｈ４およびｐＧＨ２９から選ばれる組
換えＤＮＡプラスミド９が提供される。

プラスミドｐＧＨ２９が特に好ましい。後記のように、
これらのプラスミドはそれぞれ３′未終止コドンを越え
て広がるブタ成長ホルモンポリペプチドコード しかし、この種の組換えＤＮＡプラスミドはブタ成長ホ
ルモン活性を有するポリペプチド９をコードするＤＮＡ
配列にとって有用な貯蔵ビヒクルを提供するが、ベクタ
ーは原核宿主細胞におけるこの種の真核細胞遺伝子の発
現を制御および促進するために付加的な原核宿主適合性
オにレータ−配列を必要とすること，すなわちベクター
は原核宿主細胞に適合性の発現ベクターでなげればなら
ないことは理解されるであろう。従って外来遺伝子が形
質転換された細胞およびそれらの子孫において適正に発
現されるのを保証するためには．適正な複製、転写およ
び翻訳信号がプラスミド上に正確に配列されていなけれ
ばならない。

従って本発明の他の観点においては。

制限処理プラスミド上現にフタ−，ならびにブタ成長ホ
ルモン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列またはその一部であって。

その５′末端に単細胞生物における複製，転写および翻
訳のための調節要件を満たす合成配列を含むＤＮＡ配列
を用意し； そして上記ＤＮＡ配列を上記プラスミド発現ベクター中
に，該ＤＮＡ配列の複製、転写および翻訳が起こりうる
位置にリゲートさせることを含む，ブタ成長ホルモン活
性を有するポリペプチドをコードシ，かつ単細胞生物に
おいて複製，転写および翻訳されうるＤＮＡ配列を含む
組換えＤＮＡプラスミド発現ベクターの製法が提供され
る。

本発明のこの観点による制限プラスミド発現ベクターは
いかなる適切な型のものでもよい。公開された英国特許
出願第２１３６８１４Ａ号明細書に記載された種類の二
原点ベクターが好ましい。

二原点Ｒクターは低コピー数においてプラスミドを安定
に維持する役目をもっ一複製原点を含み。

一方，複製が温度その他の手段の変化により開始される
他方の原点はクローニングされた遺伝子の構成合成を目
的とする。従って大規模培養におけるコピー数増幅の誘
導が比較的安価にかつ簡単に行われる。

プラスミド発現イタターｐＭＧ１９７，すなわちｐＭｃ
．４１１（７）誘導体（Ｇｅｎｅ．　　１　９　８　４
年、ヤラントンら、および英国特許第２１３６８１４Ａ
号明細書に記載）は本発明のこの硬点により組換えＤＮ
Ａプラスミド発現ベクターを調製するための出発材料プ
ラスミドとして用いられる。ｐＭＧ１９７はｔｒｐプロ
モーターからｍｅｔ−胃液リパーゼ酵素を発現する二原
点プラスミドであり．これはＡＵＧ開始コドンから１４
塩基対上流にシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列をもつ。

ｐＭｆ：、１９７をたとえばｐａｒ座と０１８５７配列
の間のＥｃｏＲ１部位を欠失させることにより。

またｍｅｔ−胃液リパーゼ遺伝子をＢａｌ■−ＥｃｏＲ
１断片として排除することにより修飾して、制限プラス
ミド発現Ｒクターを形成することができる。

本発明のこの観点による組換えＤＮＡプラスミド発現ベ
クターは二工程法により調製できる。

従って，ＤＮＡ配列が合成５′末端配列および３′末端
配列を含む、ブタ成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列
の一部のみを構成する本発明のこの観点の好ましい形態
においては、本方法はさらにブタ成長ホルモンをコード
する配列の残部を構成する付加的Ｉ）ＮＡ配列を用意し
； 前記ＤＮＡ配列を合成５′末端配列と３′末端配列の間
にある制限部位において開裂させ、そして付加的ＤＮＡ
配列を上記制限部位にリゲートさせる ことよりなる。

好ましくは２種の一般的な型のオリゴヌクレオチド９の
うちの１種を上記ＤＮＡ配列の合成３′末端配列として
用いることができる。たとえば２種の一般的な型のオリ
ゴヌクレオチドはｐＧＨコーミー配列の最初の１７個の
アミノ酸（３’　Ａｐａ１部位において終止する）をコ
ードするＤＮＡを置換すべくデザインすることができる
。

第１の型のオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチ
）”ｍｅｔ　１−１７は１位にメチオニンを示し、これ
にブタ成長ホルモンの最初の１７個のアミノ酸をコード
する配列が続くコトゝンを含む。選ばれたコドンはアミ
ノ酸をコードするが、好ましくは大腸菌内に見出される
最も豊富なｔ、ＲＮＡ（転移ＲＮ　Ａ　）に対応する。

第２の型のオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチ
ド”ｍｅｔ４−１７は同様にデザインされたが、ｐＧＨ
の最初の３個のアミノ酸すなわちＰＨＥ。

ＰＲＯ，ＡＬＡをコードするＤＮＡを含まなかった。こ
の遺伝子からの転写はメチオニン、すなわち普通はｐＧ
Ｈポリにプチド鎖の第４位を占めるアミノ酸に対するコ
ドンから開始されるであろう。

これら２種のオリゴヌクレオチドの塩基配列は遺伝的コ
ードの拘束の範囲内で選ぶことができろ。

遺伝子発現を最大限にするためには大腸菌において高水
準で発現する。宿主に好まれるコドンを選ぶのが好まし
いことが認められた。さらにコンピューター分析を行っ
てメツセンジャーＲＮＡのリポソーム結合部位内におい
て潜在的二次構造の部位を探索し、これを除去すること
もできる。この二次的実施の一部として、Ｇ−Ｃ塩基対
を可能な場合にはＡ−Ｔ塩基対で置換することができる
。

大腸菌の高度に発現された外被（Ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ）蛋白質に対する遺伝子は著しく　Ａ／Ｔに富
むプロモーター領域からなる。転写の制御に関与するこ
れらの領域はメソセンジャーＲＮＡをＤＮＡ鋳型からコ
ピーするＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する。

さらに、翻訳効率を指令する５′側配列も著しくＡ／Ｔ
に富むことが認められている。シャイン−ダルガノ配列
と開始ＡＴＧの間の領域は二次構造の不安定化に影響を
もち、これによりリポソームの結合、およびメソセージ
に沿った後続の翻訳を容易にすると考えられる。

合成できる個々のオリゴヌクレオチドの例は下記のもの
である。

ω　　の　　　　　　ω　　の 従って本発明の他の観点においては、ブタ成長ホルモン
活性を有するポリ纜プチビをコードするＤＮＡ配列また
はその一部を含み、このＤＮＡ配列が５′末端に単細胞
生物における複製、転写および翻訳のための調節要件を
満たす合成配列により置換されたセグメントを含むプラ
スミド発現ベクターが提供される。

調節配列は前記のように先の特異的配列を含むｍｅｔ　
１−１７オリゴヌクレオチト９およびｍｅｔ４−１７オ
リゴヌクレオチドがら選ぷことができる。

従って前記のようにＢｇｌ　ｉｔ　−ＥｃｏＲ１断片を
除いた制限処理ｐＭ０１ｇ７と共に用いるために。

上記合成オリゴヌクレオチドゝ配列をｐＧＨ２９がら誘
導されたＤＮＡ配列の八ｐａ　Ｉ　−ＥｃｏＲ１断片に
リゲートさせることができる。これはｐＧＨのアミノ酸
８８−１９０をコードするＤＮＡからなる。従って本発
明はさらに他の緩点においては。

のちに詳述するｐＭＧ９３３およびｐＭＧ９３４から選
ばれろ中間体プラスミド発現ベクターが提供される。こ
れらの中間体プラスミド発現ベクターは先に詳述した合
成ｍｓｔ　１−１７オリゴヌクレオチト９およびｍｅｔ
、４−１７オリゴヌクレオチドを取込む。

こうして形成された合成配列を制限処理した発現ベクタ
ー（Ｂｇｌ　ｎ　−ＥｃｏＲ１）に結合させることがで
きる。

ブタ成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の残りの断片
（アば）酸１８−８７をコードする中間部分のＤＮＡか
らなる）を次いで取込ませることができる。プラスミド
発現ベクターｐｃＨ２ｇのＡｐａ（消化物から小型のＡ
ｐａ　ｒ　−Ａｐａ　［断片を単離する。中間体プラス
ミド発現ベクターｐ　Ｍ　Ｇ　９３３またはｐＭＧ９３
４をＡｐａ　Ｉ　　制限部位において開裂させ、上記の
ＡｏａＩ−Ａｐａｌ断片をこれにクローニングして、そ
れぞれｐＭＧ９３５およびｐＭ０９３６を得ることがで
きる。

こうして形成された組換えプラスミド発現ベクターを用
いて適切な宿主細胞を形質転換し、この形質転換された
宿主細胞を培養して、前記のブタ成長ホルモンポリにプ
チドを発現させることができる。

ここに詳述したプラスミド９およびプラスミド発現ベク
ターを含む大腸菌の見本はブンゲ（オーストラリア）非
公開会社（Ｂｕｎｇｅ　Ｐｔｙ、　Ｌｔ、ａ、）細胞コ
レクション（オーストラリア：ビクトリア、ノース　メ
ルボルン　フレミングトンロー１”８７−８９）に保管
されている。

ここで以下の実施例を参照しながら本発明をより十分に
説明する。ただしこれらの例は説明のためのものにすぎ
ず、上記の本発明の一般性を限定するものとみなすべき
ではない。

実砲例１ 成長ホルモンはブタ下垂体蛋白質の主要部分を構成し、
ｐＧＨに対するメツセンジャーＲＮＡも豊富であり、総
量ＲＮＡのほぼ２５％を占める（ジョン・エム・ニルソ
ンら、　Ｊ、　ＢｉＯ２，Ｃｈｅｍ。

２５８（１９８３））。　ｐＧＨをコードするｃ　ＤＮ
Ａクローンを得る方法はｍＲＮＡ集団全体なｃＤＮＡ合
成用鋳型として用い、ｃＤＮＡクローン集団からブタＧ
Ｈ遺伝子を含むものを選択することである。要約すると
、これは下記よりなる。

（１）　　グアニジウムチオシアネート法、およびオリ
ゴ（ａ’ｒ）セルロース上でのクロマトクラフィーを採
用してポリＡ含有ＲＮＡを成豚下垂体から抽出する。

（２）逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ１のクレ
ノー断片の双方を用いてｃＤＮＡを合成する。

（３）Ｐｓｔｔ　制限処理ｐＢＲ３２２およびホモポリ
マーアニーリング法を採用して大腸菌ＨＢ　１０１　ｒ
ｅｃＡ中へクローニングする。

冷凍したブタ下垂体前葉をガラステフロンホモジナイザ
ー内でＱ、　５　ｍｌの５Ｍグアニジンチオシアネート
、１％サルコシル、２０ｍＭ−ＥＤＴＡ。

１％（ｖ／ｖ）’ｌ−メルカプトエタノール、５０ｍＭ
トリス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，０）中においてホモジナイズ
した。ホモジナイゼーション緩衝液を追加してホモジネ
ートを最終容積約３．５　ｍｌとなし、０．１Ｍ・ＥＤ
ＴＡを含有する５、７　Ｍ−ＣｓＣυ（ｐ！−１７，０
）　　１．２ｄ上にスピンコ５Ｗ５０．１遠心管内にお
いて積層し、３６．ＯＯＯｒｐｍ　　で２０℃において
１７時間遠心分離した。上層液をパスツールピペットで
慎重に除去し、ＲＮＡベレットを滅菌水０．５　ｒｎｌ
に室温で溶解したのち６０℃で３０秒間インキュベート
シタ。ＲＮ　Ａヲ−２０’　テ０．１容量の２Ｍｒｎ酸
カリウム（ｐＨ５）および２．５容量の９５％エタノー
ルの添加により２回沈殿させた（チンギンら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８．５２９４　（１９７９）　　
の変法）。

メツセンジャーＲＮＡ、より詳細にはポリアデニル化Ｆ
ＩＮＡをオリゴｄｔ（ｄＴ−セルロース）上でのクロマ
トグラフィーによりＲＮＡ種の混合物から単離すること
ができる。オリゴ−ｄｔ（ｄＴ−セルロース）７７型は
ファルマシアかう購入すれた。この樹脂を無菌の装填用
緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＧｆｌ　　（ｐＨ７，６）
、０．５　Ｍ−ＮａＣＪ　、ＴｍＭ・ＥＤＴＡ、０．１
％５ＤＳ）中で平衡化し、１．０ｒｎｌをカラムに注入
した。カラムをａ）滅菌水、ｂ）０．１Ｍ−ＮａＯＨ１
５ｍＭ−ＥＤＴＡおよびＣ）滅菌水それぞれで、３回（
またはカラム流出液のｐｏが８よりも低くなるまで）洗
浄した。次いで無菌の装填用緩衝ｅ、５容量をカラムに
導通した。ＲＮＡは滅菌水に懸濁し、６５℃で５分間熱
処理することにより調製された。等容量の２×装填用緩
衝液をＲＮ’Ａ試料に添加し１次いでこれを室温にまで
放冷したのちカラムに装入した。カラム流出液を採取し
、６５℃に５分間加熱し、冷却し、再びカラムに装入し
た。次いでカラムをカラムの５〜１０容量の装填用緩衝
液、次いでカラムの４容量の２０ｍＭトリスＨＣＲ（ｐ
Ｈ７，６）、０．１　Ｍ−ＮａＧｌ。

１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．１　％ＳＤＳで洗浄した。ポリ
アデニル化ＲＮＡをカラムの２〜３容童の無菌１０＋ｎ
Ｍｌ−リス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ
、０．０５％ＳＤＳで溶離し、３Ｍ酢酸ナトリウムおよ
びエタノールで沈殿させた。はレットを滅菌水に懸濁し
、−７０℃に保存した。ポリアデニル化ＤＮＡを溶離し
たのち２６０　ｎｍにおける光学濃度を読取った。

コピーＤＮＡの合成 選択後にポリアデニル化ｍＲＮＡを二重鎖ｃＤＮＡ　　
に転化し、細菌性プラスミドに挿入した（“分子クロー
ニングについての実験室用ガイド“による−マニアチス
ら（１９８２年）コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリーズ）。簡単に述べると、これは逆転写酵素（
ＲＮＡ依存性ＤＮＡ、ｄリメラーゼ）により第１鎖を合
成し；ＲＮＡ鋳型をアルカリ消化により除去し；逆転写
酵素およびＤＮＡポリメラーゼ１（クレノー断片）の双
方により第２鎖を合成し；最後にヌクレアーゼ−８１を
用いる酵素消化によりヘアピンループを除く（第１鎖と
第２鎖を共有結合させる）ことによる。

ｃＤＮＡの酵素合成を行う前に４１月Ａｌ　＋　ＲＮ　
Ａの結合性を（アガロース　ホルムアルデヒド）ゲル電
気泳動により調べた。合成はポリアデニル化ｍＲＮＡ約
１０μ９、　ヌクレオチド（ａＴＴＰ。

ａｃＴＰ、ｄＡＴＰ、ａＧＴＰ）各５０ピコモル、およ
び１（１０）ｍＭ水酸化メチル水銀１μ旦を混合するこ
とにより開始された。この混合物を室温に１０分間保持
して全長ｍ　ＲＮ　Ａ鋳型の収率を高めた。逆転写酵素
を添加する前に７（１０）ｍＭ・２−メルカプトエタノ
ール２μ旦を添加して、逆転写酵素の作用を抑制するこ
とが知られている水銀イオンを封鎖した。ＲＮＡの分解
を抑制するためにＲＮａｓｉｎ　　１μρ　（約２５単
位）をも添加した。

混合物をさらに１５分間室温に保持したのち逆転写酵素
４０単位（２μ立）を添加し、４２℃で３時間インキュ
ベーションを続ケた。０．５Ｍ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０
）　２／ｊｆｌ　オ、Ｊ：び１５０ｍＭ−ＮａＯＨ２５
μ氾の添加により反応を停止した。

ｍＲＮＡ鋳型は６５℃で１時間のインキュば一ジョンに
際して加水分解された。３Ｍ酢酸ナトリウムおよび無水
エタノール中で一７０℃においてエッＲンドルフ遠心分
離機により１０分間回転させることによってＤＮＡを沈
殿させ、Ｒレットを乾燥させた。

第２鎖の合成 ＤＮＡの全長コピーを確実に作成するために。

第１鎖鋳型からの第２鎖の合成はＤＮＡポリメラーゼを
逆転写＃素と共に用いて行われた。両酵素は鋳型に添っ
て異なる地点に止まる（Ｓｔａｌｌ）ので。

それらの併用によって配列全長を読取る機会が増すＯ 乾燥した第１鎖ｃＤＮＡベレツトを滅菌水５０μＵに再
懸濁し、特答量の２×第２鎖用緩衝液（０，２Ｍ−ＨＥ
ＰＥｓ（ｐＨ６，９）；２０ｍＭ−ＭｇＧ　Ｑ　２　；
５　ｍ　Ｍジチオトレイトール；０．１４−ＫＣＱ：　
１ｍＭ−ｄＴＴＰ；１ｍＭ−ｄｃＴＰ；１ｍＭ、ｄＡＴ
Ｐ；１ｍＭ−ｄＧＴＰ）を添加した。

反応はＤＮＡ４リメラーゼ１のクレノー断片４０単位を
添加することにより開始され、１５℃で２０時間維持さ
れた。２０時間の経過後に０．５Ｍ・ＥＤＴＡ２．Ｏμ
氾の添加によりＤＮＡ、ｔサメラーゼ１を不活化した（
ＥＤＴＡは活性酵素複合体の重要な成分である二価マグ
ネシウムイオンをキレート化する）。試料を等容量のフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、ｄｓ　　ｃＤＮＡを
セファデックスＧ−５０上でのクロマトグラフィーによ
り、取込まれていないａＮＴＰから分離した。ＤＮＡを
３Ｍ酢酸ナトリウムおよび無水エタノールにより一７０
℃で沈殿させ、次いで滅菌水４０μｌに再懸濁させ、ｃ
ＤＮＡ２０μ旦を採取し、これにＩＭ　ト’Ｊス−ＨＣ
ｆｆ１（ｐＨ８，３）　５　ｐａｌ　、　　ＩＭ　−Ｋ
ＧＱ７１１Ｑ、２５０ｒｎＭ−Ｍｆｆ１２２μＱ、２０
ｍＭ（ａＡＴＰ、ａＴＴＰ、ａＧＴＰ、ａＣＴＰ）２５
μ氾、７（１０）ｍＭ・２−メルカプトエタノール２μ
Ｑ。

水７μ立および逆転写酵素２μｆｌ　（４０単位）を添
加した。反応混合物を４２℃で１時間インキエベートし
、次いでＱ、５Ｍ−ＥＤＴＡ２．Ｏμ旦の添加により反
応停止した。混合物を等容量のフェノールおよびクロロ
ホルムで抽出し、次いでセファデックスＧ−５０上でク
ロマトグラフィー処理して、取込まれていないａＮＴＰ
を除去した。ＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムおよびエタノ
ールにより一７０℃で沈殿させた。

第１鎖および第２鎖の合成が終了した時点で画鋲は一本
鎖ループにより共有結合している。これはヌクレアーゼ
−８１を用いる消化によって容易に除かれる。二重鎖ｃ
ＤＮＡ約０．５μ９を５０μＵ（１’）　１　ｍ　Ｍ　
トリス−ＨＣ：ｆｆ１（ｐＨ７，６）、　　０．１ｍＭ
−ＥＤＴＡに懸濁した。１０μＵのＩＯＸヌクレアーゼ
Ｓｌ用緩衝液（２Ｍ−Ｎａ（Ｊ、０．５Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，５）　、　　１０　ｍＭ−ＺｎＳＯ４，５
％グリセロール）を添加し、反応混合物を滅菌水で１（
１０）μＵとなした。５単位のヌクレアーゼＳ１を添加
することにより反応を開始し、３７℃で３０分間継伏し
たのち、酵素を０．５　ｍＭ　−ＥＤＴＡｌｌｍｌによ
り不活化した。

ヌクレアーゼＳ１を用いる消化により、種々のオーバー
ハング配列を含む二重鎖配列が得られた。

大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片（２単位）
および４種のデオキシリボヌクレオチビ（２５ｍＭ原液
）を用いて修復することにより。

各断片を平滑末端となした。セファデックスＣ−５０上
でのクロマトグラフィーにより、ＤＮＡを取込まれてい
ないヌクレオチドから分離した。

二重鎖ＤＮＡのクローニング ｐＧＨｅＤＮＡはターミナルトランスフェラーゼにより
シトシン残基でテイル形成したホモポリマーである。ヌ
クレオチビ約１５個の鎖長につき酵素清度および時間を
判定した。同様にプラスミドベクターｐＢＲ３２２を制
限エンドヌクレアーゼＰｓｔ、ｉ（これはオーバーハン
グした３′末端延長部を形成する）で消化し、グアニジ
ン残基（約１５ヌクレオチド″）でテイル形成した。

二重鎖ｃＤＮＡおよび直鎖化したプラスミド９ＤＮＡを
下記に従って処理した。

滅菌水５５μＵに懸濁したＤＮＡを等容量の２×テイル
形成用緩衝液（０，４Ｍカコジル酸カリウム、５０ｍＭ
トＩＪスーＨ（Ｊ（ｐａｌ６．９）、　　４ｍＭジチオ
トレイトー／１／％１　ｍＭ　−ＧｏＣＱ２　、２　ｍ
Ｍ（３Ｈ）ａＧＴＰ（プラスミド”ＤＮＡ用）または２
ｍＭ（３Ｈ）ｄＣＴＰ　（ｃＤＮＡ用）、　５（１０）
８９７ｍ１ＢｓＡ）に添加した。１０μ旦アリコートを
用いて約１５ヌクレオチドの付加に必要な期間を判定し
た。残りの線状プラスミドＤＮＡを３７℃で１０分間イ
ンキエベートした。０℃に冷却したのち０．５Ｍ・ＥＤ
Ｔ　Ａ　（ｐＨ８）　１０μｉを添加することにより反
応を停止した。等容量のフェノールおよびクロロホルム
中に抽出したのち、ホモポリマーチイル形成りＮＡ？：
セファデックスＧ−１０’０（ＩＸアニーリング用緩衝
液中で平衡化：　Ｉ　Ｍ−Ｎａ（Ｊ。

０．１Ｍ）リス−ＨＣＱ（ｐＨ７，８）、１　ｍＭ　−
ＥＤＴＡ）上でのクロマトグラフィーによって低分子量
不純物から分離した。

ベクターＤＮＡおよびｐＧＨｃＤＮＡを混合し、３Ｍ酢
酸ナトリウムおよびエタノールにより一７０℃で沈殿さ
せた。乾燥ＤＮＡを５０μＱのリガーゼ用緩衝液（３０
ｍＭ）す、ｘ、　−Ｈｃ、（（ｐ）１３　）。

４　ｍ　Ｍ−Ｍ％Ｊ！２．１．２　ｍＭ　−ＥＤＴＡ、
　１．０　ｍＭ　・ジチオトレイトールおよび５０μ９
７ｍ１・ＢＳＡ）に再懸濁させた。反応はＴ　４　　Ｄ
　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ（ファルマシア）２μυにより触
媒され、１０℃で１６時間継続された。反応混合物２５
μＵアリコートを下記に従って大腸菌ＨＢＩＯＩ中へ形
質転換した。

１（１０）μＱのＬブロス（１％酵母エキス、１％トリ
プトン、０．５１ＮａＣρ）に−夜培養した細菌培養物
（大腸菌ＨＢＩＯＩ）１ｒｎｌを接種した。細胞を３７
℃で３時間、振とうプラットフォーム上で増殖させた。

３時間後に細胞を冷却し、卓上遠心分離機中で４℃にお
いて５分間回転させ、上層液を廃菓した。細胞を５０ｍ
１の氷冷した無菌の５０　ｍ　Ｍ−ＧａＧ　ｌ　２およ
び１０ｍＭトリ、ｘ、−Ｈ（Ｊ（ｐｉ（８）の溶液に再
懸濁し、水中に１５分間保持した。次いで卓上遠心分離
機中で回転させることにより細胞を収穫し、６．５　ｍ
ｌの氷冷した無菌の５０　ｍＭ−Ｃａ（Ｊ２および１０
ｍＭトリス−ＨＧＩ（ｐＨ８）の溶液に再懸濁し、０．
２ｒｎｌアリコートを予冷した試験管に分注した。これ
らの細胞を４℃に２４時間保存して形質転換の効率を高
めた。

２４時間経過後に、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｄ、（ｐＨ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ）に再懸濁したプラ
スミドＤＮＡを細胞に添加し、混合し、氷上に３０分間
保持した。次いで細胞およびＤＮＡに４２℃で２分間の
熱衝撃を与えた。Ｌブロス１、Ｏｍｌを各試験管に添加
し、３７℃で３０分間インキュベートした。この期間中
に細菌は回復し。

抗生物質耐性を発現し始めた。３０分後にテトラサイク
リンまたはアンピシリンを補充した寒天平板上に系列希
釈液１（１０）μρを展延した。

無傷のプラスミドｐＢＲ３２２を含む細囚細胞はすべて
アンピシリンおよびテトラサイクリン上で増殖するが、
ｐＧＨｃＤＮＡがｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にクロー
ニングされた組換えプラスミドを含む細菌細胞はテトラ
サイクリン上でのみ増殖する。アンピシリン耐性はこの
組換えにより失われるからである。テトラサイクリン上
でのみ増殖したコロニーをさらに、全ブタ下垂体ポリＡ
＋ＲＮＡから合成された一重鎖放射性標識付きｃＤＮＡ
プローブを用いてスクリーニングした（ブタ成長ホルモ
ンのメツセージはポリアデニル化ＲＮＡの約２５％に関
与する）。これに基づいて、より高度に標識されたコロ
ニー乞選択した。

テトラサイクリン耐性コロニーをニトロセルロースフィ
ルターディスク上に順に配置した。細胞壁をアルカリ性
条件下で溶解してＤＮＡを放出させ。

次いでこれを８０℃で２時間の熱処理によりフィルター
に固定した。放射性標識したブタ下垂体ｃＤＮＡをフィ
ルターと共に３７℃で１６時間インキエヘートした。フ
ィルターを２×ＳＳＣで洗浄し、乾燥させ、オートラジ
オグラフィー処理した。陽性のコロニーを単離し、多数
の４および６塩基切断酵素を用いて制限分析を行った。

部分制限マツプを文献中の配列データと比較しく第１図
）。

ｐＧＨクローンを選択した。これら３種の陽性クローン
（ｐＧＨ３，ｐＧ′Ｈ４およびｐＧＨ２９）のうちプラ
スミドｐＧＨ２９（第２図）が後続の操作に最適である
ことが認められた。ｐＧＨ２９は３′未終止コドンを越
えて伸びたブタ成長ホルモンｃＤＮＡの全コピーを含ん
でいた。

二原点ベクターｐＭＧ１９７中へのクロズタ成長ホルモ
ンｃＤＮＡをプラスミ）’　ｐ　Ｍ　Ｇ１９７（第３図
）にリゲートする前に、この梗りターを修飾して、真核
細胞遺伝子ｐＧＨｃＤＮＡの５′末端に融合しうる適宜
な原核細胞調節配列を含有させろことが必要であった。

一般にゲノム真核細胞ＤＮＡのｃＤＮＡは。

（内生原核細胞ＤＮＡの場合）遺伝子の効果的な転写お
よび翻訳を保証するのに適した調節信号を保有しない。

この欠点は宿主細胞株の好ましいコドン利用に適しかつ
特異的制限部位を含むべ（調製しうる合成オリゴヌクレ
オチドの設計により克服できる。

ｐＧＨ遺伝子の５’　Ａｐａ　Ｉ　　制限部位にリゲー
トすべ（デザインされた２組のオリゴヌクレオチド９は
、用いる三原点プラスミド中においてｐＧＨｍｅｔ（１
−１９０）およびｐ（、Ｈ（４−１９０）の双方を発現
する必要があった。これらはホスホトリエステル化学に
より合成された（ベイチルら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｏｓ、　１　（Ｌ　５６０５−５６
２０）。

ｃＱＶ３　　　　　　　　ω　　の ｔｎ　　　　（ｖ′）　　　　　　　　ｕつ　　　Ｏつ
２、　　ｐＧＨｃＤＮＡをｐＭＧ１９７に挿入する方法
ハイズＩＪ　、ドブタ成長ホルモンポリペプチド９を発
現するためのはフタ−は下記に従って構成された。

各合成オリゴヌクレオチド（Ｂｇｌ　ｎ　−Ａｐａ　Ｉ
　）をキナーゼ処理し、リゲートさせ、次いでＡｐａ　
１およびＢｇｌｎで制限処理した。適正な断片をアガロ
ースゲルから単離し、次いでｐＧＨ２９から誘導したＡ
ｐａ　Ｉ　−Ｅｃ　ｏＲ１断片（アミノ酸８８−１９０
をコードする）にリゲートさせた。線状化した断片をＢ
ｇｌ　ｎ　−ＥｃｏＲ１制限処理した発現ベクター（Ｂ
ｇｌ　ｎ　−ＥｃｏＲｌ　）に結合させ、大腸菌株ＤＨ
１中に形質転換し、増幅し１選択した。この中間体はｐ
ＧＨ遺伝子の５′および３′　両末端を含むが。

ｐＧＨのアミノ酸１８−８７をコードする中間部分を欠
如していた。ｐｃＨ２ｇのＡｐａ　Ｉ消化物から小型の
Ａｐａ　Ｉ　−Ａｐａ　Ｉ断片（約２（１０）　ｂｐ、
　アミノｍｔｓ−ｓ７をコートする）を単離し、中間体
ベクターのＡｐａ　１部位にクローニングし、これによ
りブタ成長ホルモン遺伝子が完成した（第４図）。２種
の発現プラスミドｐＭＧ９３５　（ｍｅｔｌ−１９０ｐ
ＧＨ）およびｐＭＧ９３６（４−１９０ｐＧＨ）を与え
る適正な配列のプラスミドが同定された。これらのプラ
スミドを大腸菌ＤＨＩ宿主菌株中に形質転換し、アンピ
シリン補充Ｌ−グロス培地中で増幅したのち、制限分析
およびサンガー法による配列決定によって構造を調べた
。

配列決定はＭ１３ファージ中にサブクローニングされた
ｐＧＨプラスミドの制限処理断片を用いるサンガーのジ
デオキシ法により行われた。ｐＧＨプラスミドのうち１
種、ｐＭＧｇ　３６　（ｐＧＨ４−１９０）のみを完全
に配列決定した。大部分のｐＧＨ配列は両構造に共通だ
からである。従って他方のｐＧＨプラスミド”、１）Ｍ
Ｇ９３５（１）ＧＨｍｅｔｌ−１９０）はｐＧＨ遺伝子
ノ５′末端ノミヲ、ジャンクション断片によって配列決
定した。

データの分析 ２種の制限酵素消化は、ＤＮＡ０両鎖を画鋲決定するた
めに必要なオーバーラツプ断片すべてを含む必要があっ
た。この遺伝子はＨｐａＩとＥｃｏＲｌの制限部位間に
位置する（第５図参照）。消化Ｉｆ　Ｉ　ＩＩ　　はＨ
ｐａ　Ｉ　、　Ｓｍａ　ＩおよびＥｃｏＲｌ　　を用イ
タ三重消化であり、これにより約４７０　ｂｐおよび約
３（１０）　、ｂｐの２種のｐＧＨ遺伝子断片を与えた
。

消化ＩＩ　２　ＩＩはＨｉｎｄｌｌｌおよびＡｐａ　Ｉ
を用イル二重消化であり、約２２０　ｂｐｌｌ　（１０
）０　ｂｐの３種のｐＧＨ関連断片を与えた。３種の断
片はすべてゲルから精製され、３１ヌクレアーゼ処理し
て平滑末端断片にされた。次いでこれらの断片を、あら
かじめＥｃｏＲＶおよびホスファターゼで処理されたノ
ζクテリオファージＭ１３ベクター中にクローニングし
た。各クローンを配列決定して、３（１０）塩基対まで
の配列を求めた。オーバーラツプ制限処理断片を選択し
て、画鋲につき完全なりＮＡ配列を得た。

得られた配列は４４６位においてＡからＧへの塩基１個
の変化を除いて１文献中のものと一致した（第６図）。

しかしこの変化によって蛋白質の配列は変わらない。両
コト９ン（ＣＡＡまたはＧＡ（１）ともグルタミン酸を
与えるからである。ＤＮＡ配列におけるこの相違はｐＧ
Ｈ遺伝子における対立因子の変異を反映したものと思わ
れる。

同じ制限酵素消化をｐＭＧ９３５について行った。ただ
し第５図において＊＊および＊＊＊のマークを付した断
片のみをクローニングし、配列決定した。＊＊＊のマー
クを付した断片を配列決定したのはこれらがｐ　Ｇ　Ｈ
（ｍｅｔｌ　−１９０）　遺伝子の異なる５′末端をカ
バーするからであり、一方＊＊のマークを付した断片は
ｐＭＧ９３６において認められた塩基の変化がｐＭＧ９
３５にも存在することを確認するために配列決定された
。集成した配列データは４４６位における塩基の変化を
含めて予想どおりであった。

大腸菌における異種蛋白質生成物の蓄積水準を高めるた
めに種々のＤＮＡ操作法が報告されている。これら種々
の方法は大部分が遺伝子発現量の増加を目的とし、遺伝
子の５′末非コ一ト９部位に焦点を合わせたものである
。プロモーター配列に対する変更のほかに５メツセンジ
ヤーＲＮＡの構造を変える変更も行うことができる。こ
れらの変更はリポソームがメンセンジャーＲＮＡと相互
作用する様式に影響を与え、メツセンジャーＲＮＡから
蛋白質への翻訳が開始される速度を変化させる。

特に、１６　Ｓ　ＩＪボソームＲＮＡの３′末端に相補
的な配列（シャイン−ダルガノ配列）と構造遺伝子の開
始地点におけるＡＴＧコドンとの距離を変えることは、
遺伝子の発現に著しい影響を与える（ロバーツら、Ｐ、
Ｎ、Ａ、Ｓ、、米国、７６．７６０−７６４．１９７９
）。遺伝子の発現を最大限にする方法についてのより十
分な記述はオールドおよびブリムローズ、遺伝子操作の
原理、第３版、１３８−１８２頁、１９８５年に見られ
る。

高度に発現される大腸菌遺伝子におけろシャイン−ダル
ガノからＡＴＧ（５Ｄ−Ａ’ｒＧ）の距離は一般に６〜
１２塩基である。最適配列を予測するのは容易ではない
。メツセンジャーＲＮＡの立体配座も発現水準を決定し
、この立体配座はメツセンジャーＲＮＡのリボンーム結
合部位の上流および下流双方の配列間の水素結合によっ
て決定されるからである。これには蛋白質の構造遺伝子
内の配列が含まれる。

最良の配列を決定するための最も効果的な方法は一連の
関連プラスミドに作成し、これらを蛋白質蓄積の最高水
準につきスクリーニングするものである。

ｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０）およびｐＧＨ（４−１９
０）を発現する本来のプラスミドを特にこの種の一群の
プラスミドの構成を容易にすべくデザインした。両者と
も本来は１４塩基対の５Ｄ−ＡＴＧ距離を有していた。

ｐＭＣ９３５およびｐＭＧ９３６を構成するために用い
た合成オリゴヌクレオチドは酵素Ｃ１ａ　　ＩおよびＢ
ｇｌ　　ＩＩ　　に対する特異的制限酵素開裂部位を有
する配列を含んでいた。

シャイン−ダルガノ配列　　　　　　　ｐＧＨの第１コ
ドン］　　２　３　４　５　６　７　８　９１０１１１
２１３１４ＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡＣＡＴＡ
Ｃ５’Ｃ１ａ　ＩＢｇｌ　１１ これらの酵素は発現プラスミドの二重鎖ＤＮＡを非対称
的に開裂させ、−重鎖領域を残す。これらは除去するか
（Ｓｌヌクレアーゼを用いて）、またはフィルインする
ことができる（ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片を
用いて）。処理されたＤＮＡを次いでリゲートさせて、
５Ｄ−ＡＴ（：、５〜１２塩基対を含む一連のプラスミ
ドを得ることができる。１回消化したのちフィルインす
ると、５Ｄ−ＡＴＧが延長されるであろう。従ってフィ
ルイン反応は２種の酵素消化が行われた場合にのみ採用
される。Ｎ、　Ｂ、最適化をそれぞれプラスミドｐＭｃ
　９３５およびｐＭＧ　９３６について行った。プラス
ミドｐＭＧ９３５　（ｍｅｔ　１−１９０　）およびＩ
）ＭＧ９３６　（４−１９０）はリパーゼコード配列か
らの余分なＥＣ０ＲＩ断片を含むことが認められた。こ
れを除いてそれぞれｐＭＧ９３９およびｐＭＧ９４Ｑを
得た。これらのシラスミドのｐＧＨ遺伝子または発現配
列は変化しなかった。

行った酵素処理のすべての組合わせおよびそれらの予想
生成物の全リストを第７図に示す。

ＤＮＡポリメラーゼ１フイルインによる。切断部位の一
重鎖延長部のフィルインは通常は正確であるが、Ｓ１ヌ
クレアーゼ消化ははるかに制御しにくい。Ｓ１ヌクレア
ーゼは一重鎖特異性酵素であり両方向に作用する。−重
鎖末端が除かれると。

残りの二重鎖は消化されないはずである。しかし各連鎖
は水素結合によって相互に保持されているにすぎないの
で、末端塩基が水素結合の破断および熱力学的平衡状態
における再生に伴って消化される傾向がある。その結果
、特に末端塩基対がＡ：Ｔである場合には余分な残基が
除去される可能性がある。この対はＧ：Ｃ対における３
本の結合に比べて２本の水素結合をもつにすぎないから
である。

第８図および第９図はｐＭ０９３９またはｐＭＧ９４０
を用いて、プラスミｌ−″を修飾し、母体プラスミドと
異なる５Ｄ−ＡＴＧ距離を含む、他の本発明によろプラ
スミドを得るプログラムを示す。

５ナノモルの組換えｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０）を装
入してＡＢＩ蛋白質シーケンサ−において２４回の分ｊ
＋１行った。結果は先に発表されてい、ｂｐＧＨ配列と
一致した（プラスＮ末端Ｍｅｔ）。

Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　（Ｘ＝不明）ＰＴＨ−ｍｅｔパ
ックグラウンドを無視できる場合は初期サイクルの分析
におけ−ＰＴＨメチオニンビークの大きさから、またパ
ックグラウンド″ヲ差引いたＰ　Ｔ　Ｈ−Ｌｅｕピーク
の大きさから、ある程度のＩ＋下調べ１１判定を行うこ
とができる（Ｎ末端蛋白分解を示す）。この判定は、２
％以下のｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０）分子が１個のア
ミノ酸残基を失っているというものであった。パックグ
ラウンド９が差引かれていないＰＴＨ−アラニンピーク
から得た他の判定は、約５％の分子が１個のアミノ酸を
失っているというものであったが、これはバックグラウ
ンドを差引いていないため過剰判定であると思われる。

蛋白質の発現 ｐＭＧ９３５／大腸菌ＤＨ１およびｐ　Ｇ　Ｈ９３６／
犬腸菌ＤＨ１の小規模培養？：３０’Ｃで１．５時間増
殖させた。プラスミドコピー数の増幅および遺伝子発現
は温度を４２℃に移行させることにより誘導された。誘
導の前および後に１時間毎に試料を取出し、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミド９ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での電
気泳動により分析した。クーマシー・メルーで染色した
のち、ｐＧＨｍｅｔ、（１−１９０）　およびｐＧＷ（
４−１９０）の双方につき適正な見掛は分子量をもつ熱
誘導可能な蛋白質が有意水準認められた。ｐＧＨ蛋白質
の水準は誘導の７時間後に最高水準に達した。これらの
バンドは相当する５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルをｐＧＨ特異性
モノクローナル抗体２１−５１にょリウエスタンプロッ
ト分析することによって、成長ホルモンであることが確
認された。

生物活性 大腸菌において組換えプラスミドから誘導されたブタ成
長ホルモンを５ブタ下垂体から単離された天然のブタ成
長ホルモンと比較した。等量の蛋白質？：４日間にわた
って下垂体切除ラッ）　（ＰｖＧ）に注射した。最後の
注射の２４時間後にラットを層殺し、右脛骨を摘出した
。骨を洗浄し、近位末端で矢状面において分割した。硝
酸銀で染色したのち、置端軟骨を周囲の骨から区別する
ことができる。結果を増加率チとして表わす。

対　照　　　　　　　組換え体 −ｖｅ　　　＋ｖｅ　　　４−１９０　　１−１９０平
均　１．７　　４．４　　．３．９　　４．１増加率　
　０　　　１５８チ　　　１２９％　　　１４１％−ｖ
ｅ対照：下垂体切除ラット＋緩衝液＋ｖｅ対照：下垂体
切除ラット＋天然ＧＨ４−１９０：ｐＧＨ９３６からの
組換えＧＨｌ−１９０ｐＧＨ９３５からの組換えＧＨ最
後に、ここに概説した本発明の精神から逸脱することな
く他の種々の修正および／または変更をなしうろことを
理解すべきである。

実施例２ ｐＧＨ（ｍｅｔ　１−１９０　）およびｐＧＨ（４−１
９０）の調製 ｔａ）　　発酵 グリセリン（１５９／ｎ　）、（ＮＨ４）２Ｓ○４（５
，０９，１）、ＮａＨ２ＰＯ２（６，２４ｇ／ｆｉ　）
および微量元素溶液（２（ｌｌ／Ｒ）を含有する培地６
Ｑを１０ｆｆｉの発酵槽中で滅菌した。

この培地に、ｐＭＧ９３５を含む大腸菌細胞の振とうフ
ラスコ培養物２ｏｏ＋＋ｔｌを接種し、３４℃で通気攪
拌下に増殖させた。水酸化アンモニウム溶液により一を
７０に制御した。無菌グリセリンを一定時間毎に添加し
て、発酵時間全体にわたって過剰状態を維持した。

１０時間後に、培養温度を４２℃に１０分間高め、次い
で３８℃に冷却することにより、ｐｃＨの産生が誘導さ
れた。この温度をさらに６時間維持した。

最終的バイオマスは乾燥細胞重量２６９／ρであり、位
相差顕微鏡検査により細胞内に封入体が示された。細胞
な（ツクマンＪ６遠心分離機により５（１０）０　ｒｐ
ｍで１５分間、１１ボトル中で遠心分離することにより
収穫し、必要時まで一１３℃に保存した。

第２回の発酵を等しい条件下で、ただしｐＭ０９３６を
含む大腸菌細胞を用いて行った。

細胞投−ストの試料〔（ａ）節に従って調製した大腸菌
ｐＭＧ９３５およびｐＭＧ９３６）をリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７，５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｏ、５Ｍ−ＮａＣＱ、０．
１ｍＭ−ＰＭＳＦを含む）３９０１４’に懸濁させた。

フレンチプレスセル〔８４に９／ｃ１ｒＬ２　（１２ｏ
。

ｐｓｉ）で１回〕を用いて細胞を溶解した。細胞溶解に
際して放出されたＤＮＡを消化するために約１ｍ９のＤ
Ｎアーゼ■を各懸濁液に添加した。

細胞ホモジネートを５（１０）　Ｏｒｐｍ　　で３５分
間遠心分離し、封入体を部分精製した形で回収した。

バレット（１３９）を１６０ｍ１のリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，５ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．５Ｍ−ＮａＣｆ
！、、０．１ｍＭ−ＰＭＳＦ？：含Ｗ）Ｋ再懸濁Ｌ、再
び遠心分離した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐＧＨは（レット
中に存在することが示された）ののち上層液を廃棄した
。

ｐＧＨ（４−１９０） 細胞ホモシネ−ＭＹ　１２．（１０）　Ｏｒｐｍで５分
間遠心分離した。ベレット（１（Ｎｔ）’ｒトライトン
ーＸ−１（１０）で数回洗浄し、上層液を廃棄した。

ｐＧＨ封入体を含み、（１１）節において調製された各
バレットを５０ｍＭ・トリス（ｐＨ８，９）、７Ｍグア
＝ジン−ＨＣｕ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０’ＯｍＭ・２
−メルカプトエタノールＣ７ｍ１／９　・投レフト）に
可溶化した。澄明化したのち各溶液２８ｍ１をあらかじ
め５０ｍＭ・トリス（ｐＨ８，９）。

７Ｍ、グアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭ　−ＥＤＴＡ。

５０ｍＭ・２−メルカプトエタノールで平衡化したセフ
ァクリル８３（１０）カラム（２，２Ｘ８５ｃＩＩＬ）
上でクロマトグラフィー処理した。ｐＧＨ（４−１９０
）の場合は２回の操作を行った。各カラムからの溶出液
を分画採取し、２８０　ｎｍにおける吸光により監視し
た。カラム画分のアリコートを２５ｍＭ・トリ、（−Ｈ
ＣＪ！（ｐＨ７）、　８Ｍ尿素。

０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール中へ透析
し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

目的とするポリベプテビを含む両分をプールし、各プー
ルを２０倍過剰の１５ｍ＋Ｍ・トリス−ＨＣｌ（ｐ）１
９）、７Ｍ尿素、５０ｍＭ・２−メルカプトエタノール
（４回変換）に対して透析した。残留物（ｐ’ＧＨ（ｍ
ｅｔ　１−１−１９０）５０またはｐＧＨ（４−１９０
）１８０ｒｎｌ）をｌ　Ｍ　−ＨＣＪで−７に調整した
のちＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２）カラム（４，４Ｘ
’ｌ　１ｃＴＬ）に施した。イオン交換マトリックスは
１５ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ（ｐｌ（７）、７．５Ｍ尿素、
５０ｍＭ・２−メルカプトエタノールで平衡化した。ピ
ークすなわち蛋白質はマトリックス床容積の２倍量の平
衡化用緩衝液にまりカラムから溶離された。このピーク
はｐＧＨを含むことが５ＤＳ−ＰＡＧＥにより示された
。ゲル走査により、ｐＧＨ（ｍｅｔ　１．−１９０）は
約９５％の純度であるのに対しｐＧＨ（４−１９０）は
わずか４５％の純度であることが示された。これは恐ら
＜ＤＥ５２カラムの過剰装填によるものであろう。

従ってこの物質はさらに第２のＤＥ５２工程によって精
製された。

イオン交換クロマトグラフィーかもプールした画分はビ
スキング（ｖｉｓｋｉｎｇ）　　チューブを用いて２５
倍過剰の２５ｍＭ）リス（１））１１０）、１％（ｗ／
ｖ）マンニトール（３回交換）に対して透析された。各
蛋白質は変性剤および還元剤をこうして緩徐に除去する
ことにより復元された。

透析された両分を次いで２ｒｎｌのアリコートに分割し
、液体窒素中で凍結させ、−７０℃に保存した。これら
の画分の蛋白質濃度をパイオーラド蛋白質アッセイによ
り測定Ｌ／−５９５ｎｍ　で吸光度を読取った。約１（
１０）〜の復元ブタ生成ホルモン（ｍｅｔ、１−１９０
）が細胞ペースト１３９（湿潤重量）から得られた。復
元４−１９０ｐＧＨ１６Ｗ／が細胞に一スト２６Ｓｔ（
湿潤型ｔ）から得られた。

生成物を証明するためにさらに分析を行った。

（ｉｖ）　　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて１組換えｐＧＨ調
製物が正確な分子量のものであり、凝集物たとえば二量
体を含まないことを証明した。セファロース１２０カラ
ム（３０Ｘ１、ＯｃｒｒＬ）を１（１０）ｍＭ）リス−
Ｈ（Ｊ　（ｐ＋４８．３　）で平衡化し、既知の分子量
範囲の標準品で検量した。ｐＧＨにつき下記の溶出時間
が得られた。

標準ｐＧ、Ｈ２７，７分 組換えｐＧＨ（ｍｅｔｌ−’１９０）　　２７．５分組
換えｐＧＨ（４−１９０）　　　　２７．０分混合注入
　　　　　　　　　　　　２７２分いずれの場合も単一
のピークが認められた。このカラムがｐＧＨ二量体を分
離しうろことが、ｐＧＨ二量体と同じ分子量、すなわち
４４，（１０）０ダルトンをもつ卵アルブミンを用いて
証明された。

ＦＰＬＣピーク画分の分子量の指定はＳＤＳ　−ＰＡＧ
Ｆ、により確認された。

（Ｖ）２２Ｋｄの物質がｐＣＨ関連であることを確認す
るために、ｐＧＨ％異性マウスモノクローナル抗体２１
−５１を用いてウェスタン・プロッティング分析を行っ
た。各組換えポリハブチト９および標準品の１５チ還元
ＳＤＳ、ｔ？リアクリルアミドゲルをニトロセルロース
フィルター上に電気溶離し、ｐＧＨマウスモノクローナ
ル抗体でプローブ処理した。次いでこれを家兎抗マウス
ポリクローナル抗体でグローブ処理し、　　■標識付き
蛋白質Ａを用いて検出した。得られたオートラジオグラ
フは２２Ｋｄバンドへの結合を示した。組換え物質はこ
の基準によれば少なくとも標準品程度には純粋であった
。

（Ｖｌ）放射性レセプタの結合を調べて、ｐ　Ｇ　Ｈ（
ｍｅ　ｔｌ−１９０）の生物活性に関するインビトロ証
明を得た。

標準ｐＧＨを　Ｉ　標識し、妊娠した家兎肝臓膜と共に
一夜インキエベートした。レセプタを遠心分離し、ベレ
ットをγ線計数器により計数することによって結合を調
べた。無標識標準ｐＧＨによる標準ｐＧＨによる標識の
置換は用量依存性であツタ。組換えｐＧＨ（ｍｅｔ　１
−１９０）も　　Ｉ−ｐ（、Ｈと置換することが示され
、組換えポリ啄プテビがレセプタ部位に対して標準ｐＧ
Ｈと競合することが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＧＨｃＤＮＡの部分制限マツプである（縮尺
に従わない）。 第２図はプラスミド’ｐＧＨ２９（ｐＢＲ３２２中のｐ
ＧＨｃＤＮＡ）である。 第３図はプラスミドｐＭＧ１９７（基本発現はフタ−）
である。 第４図は完成したブタ成長ホルモン遺伝子である。 第５図はｐＭＧ９３６におけるｐＧＨ遺伝子の配列決定
法を示し、＊は文献中の配列と異なる塩基の部位、＊＊
および＊＊＊はｐＭＧ９３５においても配列決定された
領域を表わす。 第６図はｐＧＨ遺伝子のヌクレオチド９配列を示すＯ 第７図は５Ｄ−ＡＴＧ距離の短縮による発現最適化のた
めに行われた酵素処理の組合わせおよび生成物を示す。 第８図および第９図は修飾されたｐＧＨ構造（ｍｅｔｌ
−１９０）および（４−１９０）を示す。 （外４名） 図面の浄ｒＪ（内容に変更会し） ＦＩＧ、１ ＦＩｏ、　４ ０１１　　　　　ルｕ２ 山１．　！３１．　　　　　　　　　　　　　５，６．
　　　　　　　　　　１２ｆＪ３１２．８１．　　　　
　　　　　　　　　１０，１１，１２．１３　　　　　
　１０山１．　Ｋｌｅｎｏｗ　＋　１Ｊ３１２．　Ｗｉ
ｅｎｏｗ　　　　７，８，９　　　　　　　　　１１０
１１、　Ｋｌｅｎｏｗ　＋　ＢｓＬＬ２．　ｓｌ　　　
　　　７．Ｊ９，１０，１１，１２，１３　　　７に、
４１１．９１　＋　比１１２．　Ｋｌｅｎｏｗ　　　　
　　５，６，７，８．９　　　　　　　９−１．　Ｓｌ
　＋　江２．９１　　　　　　　５，６，７，８，９，
１０．１１，１２　　　５ＦＩＧ、７ （Ｐｆｔ、ｎ叶嵯）　　（ｙｔｙ朴瓜別口、１１．　Ｓ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　　　１
１　　　　　　ｐＭＧ９３９−１２＋５，６１　　　　
　　　＋５．６．７１！ＩＪＪＩ、ＰｏＬｌｌ ＋　　　　ｌ　　　　　　　　　　　　　１１　　　　
　　　　１１　　　　　　ｐＭＧ９３９−１Ｌｌ１ｇ１
２．　　Ｐｏ１ｌｌ　　　　　　　　　　　（７，８，
９１＋７，８．９＋鋸［１２９１１０８ ＋１０．１１，１２，１３１　　（１０，１１，１２，
１３，１４ｐＭＧ９３９−１０＋９旺１！１５） 口Ｊｕｌ、　　９１　１　　　　　　　　　　　　　９
　　　　　　　　　　９　　　　　　ｐＭＧ９３９−０
９÷　　　ｌ　　　　　　　　　　　（５，６，７，８
，９１（５，６，７，８，９）シロλ、Ｐｏ１ｌ） （４１１，Ｐｏ１Ｌｌ　　　　　　　　　　　７　　　
　　　ｋ＞１ｔ２ｔ　　　ｐＭＧ９３９−０７＋ｌ（７
，８，９４０，１１゜ Ｂ９１２　！ｌ＋１　　　）　　　　　　　　　　　　
　　１２．１３１０Ｊ１１．！３１１　　　　　　　　
　　　　　　　５、　　　　　　）　　　　　　　　　
　　　　　（５，６，７，８，９，１０ｋ）１１土二更
ブ劃Ｅ　　　　　　ｐト１Ｇ９３９−０５比扛２．Ｓｌ
　　ｌ　　　　　　　　　　　　１１，１２，１３）手
続補正書 １．事件の表示 昭和６３年特許願第１８４８７号 ２、発明の名称 組換えポリペプチドの製法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　バング・　（オーストラリア）・プロプライア
タリ−拳リミテッド　　　　　　　　（外１名）４、代
理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補
正の対象

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）１）（ａ）ブタ成長ホルモン活性を有するポリペ
   プチドをコードし、かつ単細胞生物において複製、転写
   および翻訳されうるＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド
   発現ベクター、ならびに（ｂ）単細胞生物を用意し； ２）上記組換えプラスミド発現ベクターを上記単細胞生
   物に、形質転換、形質導入またはトランスフェクション
   から選ばれる方法により導入し； ３）得られた生物を培養し； ４）上記ＤＮＡ配列によりコードされる組換えポリペプ
   チドを発現させ；そして所望により５）上記ポリペプチ
   ドを培養物から単離する工程を含む、ブタ成長ホルモン
   活性を有する組換えポリペプチドの製法。
2. （２）ブタ成長ホルモン活性を有する組換えポリペプチ
   ドがｐＧＨ（ｍｅｔ１−１９０）またはｐＧＨ（４−１
   ９０）である、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）組換えプラスミド発現ベクターがｐＭＧ９３５、
   ｐＭＧ９３６、ｐＭＧ９３９またはｐＭＧ９４０から選
   ばれる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）単細胞生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株であ
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）単細胞生物が大腸菌ＤＨ１である、特許請求の範
   囲第４項に記載の方法。
6. （６）ｐＧＨ（ｍｅｔ１−１９０）またはその獣医学的
   に受容できる塩類、ならびに獣医学的用途に受容できる
   キャリヤー１種または２種以上からなる獣医学的組成物
   。
7. （７）ｐＧＨ（４−１９０）またはその獣医学的に受容
   できる塩類、ならびに獣医学的用途に受容できるキャリ
   ヤー１種または２種以上からなる獣医学的組成物。
8. （８）プラスミド発現ベクターｐＭＧ９３５、ｐＭＧ９
   ３６、ｐＭＧ９３９またはｐＭＧ９４０。
9. （９）特許請求の範囲第８項に記載のベクターを含む大
   腸菌細胞。
10. （１０）プラスミドベクターｐＧＨ３、ｐＧＨ４または
    ｐＧＨ２９。