JPS63503309A - 心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 心　ナトリウムト　ペプチドレセプタータンパク肢歪分互 本発明は、心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク、天然型およ び合成レセプタータンパクの両者の生産方法、およびレセプタータンパクの使用 方法に関する。

光里■宜景 心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）は、＠乳動物の心房から抽出され 、ナトリウム排出増加、および血管弛緩に効力のあるポリペプチドである。Ｄｅ Ｂｏｌｄら、（１９８１）Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ。

２８：　８９−９４；Ｎａｐｉｅｒら、（１９８４）　Ａｎｎ、Ｒｅｐ、Ｍｅｄ 、Ｃｈｅｍ、　１９：２５３−２６２；Ｋａｎｇａｗａら、（１９８４）Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏａ＋＋ＩＩｕｎ、１１８　：１３１− １３９；Ｆｌｙｎｎら、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍｕｎ、１１７　：８５９−８６５；Ｎａｐｉｅｒら、（１９８４）Ｂ ｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１２０　：９８１− ９８８；Ｃｕｒｒｉｅら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３：６７−６９； 　Ｔｈ１ｂａｕｌｔら、　（１９８４）ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　１６７　：３５２ −３５６ＨＡｔｌａｓら、　（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９　ニア１７−７ １９゜これらのペプチドには、様々な名前（例えば、アトリオペプチンおよびカ ルディオナトリン）が与えられているが、ここではまとめて、八ＮＰとする。

これらのペプチドのクローン化ｃＤＮＡの配列より、該ペプチドは、前駆体タン パク（その構造が最近明らかとなっている）のカルボキシル末端領域に全て由来 することが決定されている。Ｙａｏ＋ａｎａｋａら、（１９８４）　Ｎａｔｕｒ ｅ　３０９　ニア１９−７２２ＨＭａｋｉら、　（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３ ０９ニア２２−７２４；　Ｏｉｋａｗａら、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ０９ニア２４−７２６；Ｓ　ｅ　ｉ　ｄ　ｍ、ａ　ｎ　ら、（１９８４）　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２２５　：３２４−３２６；Ｆｌｙｎｎら、　（１９８５）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ　２２８　：３２３−３２５゜サイズが異なるＡＮＰは、翻訳後プロセ ッシング、あるいは単離工程における人為的な分解によるためであると考えられ る。いくつかの合成ＡＮＰもまた。調製され、天然型ペプチドの生物学的特性の 全てを有することが示されている。５ｅｉｄａｈら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８旦２６４０−２６４４；Ｒ，Ｐ、Ｎｕ ｔｔら＋　ｉｎ　ＰＥＰＴＩＤＥＳ　１９８４（Ｕ、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ　ｌ ｉ。

１．９８５）Ａｔｌａｓら、（前出）。

ＡＮＰは、血圧恒常性、細胞外体液容積の制御、およびレニン−アンジオテンシ ン系と、他のホルモン系および神経伝達物質系とにおける高血圧効果に対する拮 抗剤として９重要な役割を果たしていることが示されている。ＡＮＰはラジオイ ムノアッセイにより血中に検出されている。Ｇｕ　ｔｋｏｗｓｋａら、　（１９ ８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｏｎ、　１２５　： ３１５−３２３；　Ｔａｎａｋａら、　（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｉ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２４　：６６３−６６８゜ＡＮＰの生物学 的効果は、細胞膜の特異的なレセプターに対するＡＮＰの結合により起きる。特 異的なレセプターの存在は２種々の腎臓。

副腎皮質、および血管組織中で証明されている。５ｃｈｅｎｋら（１）、（１９ ８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１４８８７−１４８９０；Ｖａｎｄ ｌｅｎら、　（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１０８８９−１ ０８９２ＨＭｉｓｏｎｏら、（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１３０　：９９４−１００１；Ｈｉ ｒｏｓａら、（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１３０　：５７４−５７９；Ｙｉｐ ら、（１９８５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：　５９４６−５９５０ＨＨｉｒａｔａら＋（１９８４） 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＮＰには生物学的活性効果があるので、血中でのＡＮＰのレベルを制御するこ とは、高血圧、ショックなどのような疾患を処置する治療のアプローチとなるで あろう。しかし、治療のプロトコルを確立するためには、＠乳動物の血液中にお けるＡＮＰレベルを測定する感度のよい定量法を使用することが必要である。そ のような定量法はまた。高血圧のような疾患の診断を行うためにも用いられ得る 。もし入手できるならば。

ＡＮＰレセプタータンパクは、これらの分析に容易に用いられ得る。現在の天然 型ＡＮＰおよび合成ＡＮＰ　、そしてその類似物は、　ＡＮＰレベルを増加させ ることにより体液容積および血管機能の調整に用いられ得るが、効果的な治療を おこなうには。

所望の細胞外体液容積および電解質恒常性を達成するために。

ＡＮＰレベルを減少させることが必要とされ得る。ＡＮＰレセプターの可溶画分 が、治療のために血清レベルのＡＮＰを減少させるために用いられ得る。

ＡＮＰレセプターを特徴付けるために種りの試みが行われてきているが、精製は なされていない。さらに、特徴付けを行うこのような試みにより矛盾する結果が 生み出されてきている。例えば＋　５ｃｈｅｎｋら（１）、（前出）Ｇ　Ｖａｎ ｄｌｅｎら、（前出）ＨＭｉｓｏｎ。

ら、（前出）；　Ｈｉｒｏｓｅら、（１９８５）、　（前出）；　Ｙｉｐら、（ 前出）を参照されたい。

最近の研究により、２つ以上のＡＮＰレセプターが存在し得ることが示唆されて いる。ｌｅｉｔｍａｎら＋（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｔｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　８８５ニア４−７５ＨＫｕｎｏら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２６１　：５８１７−５８２３（ラット肺からのＡＮＰ結合およびグア ニル酸シクラーゼ活性の共精製）。ＡＮＰレセプターに関して、この他に興味あ るのは９次の文献である：　Ｌｅｉｔｍａｎ　ら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｔ 、Ｃｈｅｍ、２６１　：１１６５０−１１６５５；　Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈら 、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　：１２９６０−１２９６４ ；　Ｈａｙａｓｈｉら、（１９８６）　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １９８５．ｐｐ、２７−３２；Ｈｉｒａｔａら＋（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１３２　：　９７１−９８４ｓＮａｐ ｉｅｒら、（１９８６）　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２ ４８　：５１６−５２２゜従って、精製ＡＮＰレセプタータンパクが入手でき、 そして。

組換え手段を用いてその生産を促進する遺伝子が入手できることが非常に望まし い。レセプタータンパクに対するモノクローン抗体も有効である。なぜなら、そ れらは、レセプタータンパクを特徴付け、レセプタータンパクを発現している付 加的な組織を同定し、そしてレセプターへのＡＮＰの結合を阻止するために使用 し得るためである。

ＡＮＰレセプターに関係しないいくつかのレセプター分子が。

これまでに単離され、精製されている：讐ｉｍａｌａｓｅｎａら、　（１９Ｂ５ ）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１０６８９−１０６９７　（ブタＬＨ／ ｈＣＧ　レセプター）；Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ　ら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：３３２７−３３３１　（インシ ュリン　レセプター）；　５ｃｈｎｅｉｄｅｒら、（１９８２）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７　：２６６４−２６７３　（ＬＤＬ　レセプター） 。

ｌＩＩと」丘 本発明の目的は、天然型および合成の、精製ＡＮＰレセプタータンパクを提供す ることにある。

本発明の他の目的は、天然型ＡＮＰレセプタータンパクの精製法を提供すること にある。

本発明のさらに他の目的は、　ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ分 子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は２組換えＤＮＡ法によりＡＮＰレセプタータンパクを 生産する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、　ＡＮＰ　レセプタータンパク上のエピトープに結 合する抗体、およびそのような抗体を生産する細胞系を提供することにある。

本発明のこれらの、および他の目的は、以下の実施態様の１またはそれ以上によ り達成される。

ある実施態様においては１本発明は哺乳動物の心房性ナトリウム排出増加ペプチ ド（ＡＮＰ）　レセプタータンパクサブユニットを含む細胞非含有組成物を指向 し、該レセプタータンパクサブユニットは、約６０．５００ダルトンの分子量を 有し、該組成物中のタンパクの最低約７５重量％を含有する。

他の実施態様においては１本発明は、　６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプターサブユ ニットとの実質的な相同性を有し、　ＡＮＰに結合するタンパクを指向している 。

さらに他の実施態様においては９本発明は、以下の事項を包含する天然型のＡＮ Ｐ　レセプタータンパクを精製する方法を指向している： （ｉ　）　ＡＮＰレセプターを有する哺乳動物細胞から調製される膜含有細胞画 分を与えること； （ｉｉ）ｍ膜画分中のＡＮＰレセプタータンパクをＣ＋ｚＥ＋ｓ界面活性剤を用 いて可溶化し、該ＡＮＰレセプタータンパクを含有する上清を調製すること：お よび （ｉｉｉ）該上清を、固定化ＡＮＰを含有するクロマトグラフィーカラムに、該 ＡＮＰ　レセプタータンパクが該固定化ＡＮＰに結合するような条件下で通過さ せ１次いで結合したＡＮＰレセプタータンパクを該カラムから溶離し、精製され たへＮＰレセプタータンパクを与えることによって、該上清がらＡＮＰレセプタ ータンパクを精製すること。

本発明はまた。　ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列を単離する 方法を具体化する。この方法は、以下の事項を包含する： （ｉ）＠乳動物の細胞源から調製されたＤＮＡライブラリーを与えること； （ｉｉ　）　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットの選択された領域との相同 性を有するアミノ酸配列のコドンを含むｃＤＮ＾またはオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いてハイブリダイゼーションすることによって、　該ＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングすること；および （ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドが選択的にハイブリダイズするＤＮＡ分子を１ ＤＮＡライブラリーから単離すること。

本発明の他の実施態様は２組換えベクターを含有する組成物であって、該ベクタ ーは６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有する アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列を含まない組換えベ クターを実質的に含有しない。

本発明の他の実施態様は、原核細胞および真核細胞のような細胞を指向しており 、それらの細胞は上記ベクターまたはＤＮＡ配列により形質転換されている。本 発明のさらに他の実施態様は、　ＡＮＰレセプターサブユニットを生産する方法 を指向し、その方法は、上記細胞をＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを含 むペプチドが発現される条件下で増殖させること、およびそれを回収すること、 を包含する。

本発明のさらに他の実施態様は、実質的に他の抗体を含有しない抗ＡＮＰレセプ タータンパク抗体、そのような抗体を生産する哺乳動物の永久増殖性細胞系、お よびそのような抗体によりＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法を指向する 。

■皿公皿単産脱里 第１図は、精製ＡＮＰレセプタータンパクに対する放射能標識化ＡＮＰ　（４− ２８）と種々のＡＮＰペプチドとの間の拮抗的結合を示す。

第２図Ａは、精製ウシＡＮＰ　レセプターにより決定されたＮ末端アミノ酸配列 、およびそれに対応し、　ｃＤＮＡライブラリーを調べるプローブとして用いら れる合成オリゴヌクレオチドを示す。

第２図Ｂは、　ＡＮＰレセプターＲＮＡ、および第２図Ａに示されるプローブを 用いて得たｃＤＮＡクローンの説明図である。

第３図は、ウシＡＮＰレセプターｃＤＮＡ配列、および予想されるアミノ酸配列 である。

第４図は、ウシＡＮＰ　レセプタータンパクのハイドロパシシティ（）Ｉｙｄｒ ｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の特徴を示す。

第５図は、ヒトＡＮＰレセプターｃＤＮＡ配列、および予想されるアミノ酸配列 である。

溌１ｊ」１■Ｔ礼呪 本発明は、使用し得る型の精製ＡＮＰ　レセプタータンパクを提供する。精製Ａ ＮＰ　レセプタータンパクによって、アミノ酸配列が決定され、核酸プローブが 設計され、そしてＡＮＰレセプター遺伝子がクローン化される。一般的には、　 Ａｔ１ａｓ　ら。

（前出）；　Ｙａｍａｎａｋａ　ら、（前出）ＨＭａｋｉら、（前出）ＨＯｉｋ ａｗａら、（前出）を参照されたい。一度クローン化されると、へＮＰレセプタ ー遺伝子は３合成ＡＮＰレセプタータンパクを生産するのに用いられ得る。例え ば、米国特許第４．４４０，８５９号；第４，４３６．８１５号；第４．４３１ ．７４０号を参照されたい。

例えば患者の血清中のＡＮＰレベルを測定するために、拮抗結合分析においてレ セプタータンパク（天然型または合成の）を用いることができる。　ＡＮＰ　レ セプタータンパクは、天然型ＡＮＰの類似物がＡＮＰ　レセプターを結合する能 力もしくはＡＮＰレセプターを阻害する能力について試験する際にも非常に有用 である。　ＡＮＰレセプター結合部位のコンピューターモデルもまた。インビボ においてＡＮＰレセプター部位を阻害もしくはＡＮＰレセプター部位に結合する 新しい化合物を設計するためにも補助となり得る。

”心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク”または”ＡＮＰレセ プター”とは、あらゆる哺乳動物起源由来の天然型ＡＮＰレセプタータンパクを 意味する。ここで哺乳動物とは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ９　ヒツジ、ネズミ、 ラット。

ウサギ、ハムスター、およびヤギを包含するが、これらに限定されない。この用 語はまた９合成ＡＮＰ　レセプタータンパクつまり１組換え技術もしくは直接的 な化学合成により生産されたタンパクをも包含する。例えば、Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅ ｗｉｓら、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１　：１３４−１３９を参照さ れたい。ＡＮＰ　レセプタータンパク、種々の血管および腎組織の細胞膜におい て見出されるタンパクである。このような細胞および組成としては、腎臓皮質細 胞、血管内皮細胞、副腎皮質、副腎糸球体、および肺組織が包含されるが、これ らに限定されない。

本発明の好ましいレセプタータンパクは、大動脈平滑筋細胞のような血管組織に 由来する。血管ＡＮＰレセプタータンパクのクラスの例としては、ウシの大動脈 平滑筋細胞から単離されたレセプタータンパクがある（ウシの血管ＡＮＰ　レセ プター）。他の組織から単離されたこのクラスのＡＮＰ　レセプタータンパクは 、同じ構造を有する。ウシの血管ＡＮＰレセプタータンパクは、２つの実質的に 同一なタンパクのサブユニットを含む。ポリアクリルアミドの濃度が１０％のド デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）に よる分析により、この二量体の見かけの分子量が（非還元条件下において）１２ ５±１２ｋｄであり、そして、サブユニットの見かけの分子量が（還元条件下に おいて）　６０．５±６ｋｄであることが示される。

ウシ血管の精製天然型ＡＮＰレセプタータンパクをさらに特徴付けるために、レ セプターとしてのインビトロでの活性を研究した。５ｃｈｅｎｋら（ＩＩ）、（ 前出）、に記載されている次のＡＮＰペプチドが用いられた：　ＡＮＰ（４−２ ８）、ＡＮＰ（７−２８）、およびＡＮＰ（５−２５）。Ｂｉａｘ＋Ｋｉおよび Ｋｄは標準的な方法で算出された０例えば＋　５ｃａｔｃｈａｒｄ　（１９４９ ）　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋ｐｐ、６００−６７２を参照された い。ＡＮＰ　（４−２８）の種々のＡＮＰペプチドとの拮抗結合分析は第１図に 示される。結合データのコンピューター解析によれば、レセプター結合に対する Ｂｍａｘは５．７　（７５％レセプター活性）ｎｍｏ＋、／■タンパクであり、 　ＫＡは０．３ｎＭに等しい。これは、　ＡＮＰのレセプタータンパクに対する 化学量論数が１：３／サブユニツト、または０．７：　１　／ホロレセプターで あることに相当する。精製レセプタータンパクもまた。無傷の細胞中のＡＮＰレ セプターについて以前に記録されているのと同じ範囲（０，１〜１０．ＯｎＭ） の親和性を八ＮＰに対して示した。種々のＡＮＰペプチドに対する相対的Ｋｉ値 は９次のとおりである：ＡＮＰ（４−２８）　０．３ｎＭ；ＡＮＰ（７−２８） 　１．１ｎＭ；およびＡＮＰ（５−２５）　！、１２ｎＭ。

ウシ血管の天然型ＡＮＰレセプタータンパクもまた。アミノ酸分析に供された。

ウシ血管レセプターの部分的なＮ末端アミノ酸配列は、成熟型タンパクの２〜３ ２アミノ酸に対応する配列を与えた： 当業者は、所望であれば、標準的なタンパク配列決定法により、タンパクのカル ボキシ末端へと上記の配列を容易に延ばすことができる。より単純な方法は、レ セプタータンパクの遺伝子をクローン化して配列決定し、アミノ酸配列を与える ことである。

第３図のウシレセプターの完全なｃＤＮＡの解析により８成熟型レセプタータン パクは４９６アミノ酸のポリペプチドであり。

プロペプチドして発現していることが示されている。仮定される成熟型レセプタ ータンパクの分子量は約５６．０００である。

このことにより、天然型レセプタータンパクは、グリコジル化されているかもし れないことが示される。ヒトｃＤＮＡ　（第５図）は類似の構造を示す。

ウシ血管ＡＮＰレセプターのプロ配列は、成熟化の間においてレセプター前駆体 のＮ末端から４１アミノ酸が除去されることを示唆する。最初のＮ末端の２１ア ミノ酸は、非常に疎水的の性質を示す可能性のある膜透過シグナルを規定してい る。

Ｗａ　ｌ　ｔｅｒら、（１９８４）Ｃｅｌｌ　３８：５−８゜Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊ ｎｅ、（１９８３）Ｅｍ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３３　：１７−２１の一致した規則により、シグナルペプチダーゼにより開裂 する可能性の高い２つの部位が予想配列内にある。

一方は残基１８の後方であり、他方は残基３１の後方である。これらの部位と成 熟型Ｎ末端（Ｇｌｕ”）との間の残りの１０から２３残基は、レセプターの続い て起こるタンパク分解によるプロセッシングが、膜への移動中または堆積後のど ちらかで起こることを示唆している。これに関しては、　Ｇｌｕ”以前の配列（ 残基２２−４１）が親水性であり、４つのアルギニンを含むヘキサペプチドで終 わっていることが注目に値する。糖の付加し得る部位が３箇所存在する：Ａｓｎ ８２．２８９．および４６５゜膜透過ドメインに非常に近接してＣｙｓ４９６が 存在することは、この部位がホモダイマーのジスルフィド結合に対する部位にな りそうであることを示唆している。

ウシ血管ＡＮＰレセプター前駆体は、有意に疎水特性を有するいくつかの領域を 含んでおり、これは第４図のハイドロパシシティプロットから明らかである。２ ０アミノ酸を越える。

多（とも６つの疎水性領域が見出され得、そして、これらの初め（ＡＡ　１−２ １）はおそらくシグナルペプチドである。もう１つの他の極度に疎水性のある領 域（４７８−５００）は、非常に親水性のある２つの領域に隣接しており、膜透 過ドメインの候補となりそうである。Ｃ末端からこのドメインまでの領域は。

配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１ｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇで始まり、優れた膜アンカーとな り得る。ＡＮＰレセプターは、その負電荷の大部分が細胞外にある酸性分子であ り、そのリガンドが塩基性タンパクであるという事実を反映すると考えられる。

天然型のウシレセプターにおける特定のアミノ酸残基合量をさらに解析すると２ 表１に示されている結果が得られる。

この表においては、結果が５００残基あたりのアミノ酸残基の数（±２０％）で 表わされている（６０ｋｄサブユニツトあたり５００残基として計算）。

（以下余白） 表−土 アスパラギン酸（Ａｓｐ＋Ａｓｎ）　２７．０　１４．０”グルタミン酸（Ｇ１ ｕ＋Ｇｌｎ）　２１，３　３６．８セリン（Ｓｅｒ）　３２．１　３７．４グリ シン（Ｇｌｙ）　４７．５　４７．２ヒスチジン（Ｈｉｓ）　１０．３　１３． ２アルギニン（Ａｒｇ）　３８．７　３５．１スレオニン（Ｔｈｒ）　２６．２ 　２４．４アラニン（Ａｌａ）　５１．０　４８．０プロリン（Ｐｒｏ）　２５ ．２　２２．１チロシン（Ｔｙｒ）　２１．０　２５．０バリン（Ｖａｌ）　３ ７．７　３７．４メチオニン（Ｍｅｔ）　８．６　６．６イソロイシン（ｌｉｅ ）　３２．５　２７．２０イシン（Ｌｅｕ）　４８．７　５４．６フエニルアラ ニン（Ｐｈｅ）　２５．０　３０．０リジン（Ｌｙｓ）　３４．６　３６．２シ ステイン（Ｃｙｓ）　２．０　、　４．６精製レセプターのアミノ酸組成は、５ ００個のアミノ酸あたり４．６個のシスティン残基を有することを示し、これは 成熟レセプター中に存在することを予測された５個のシスティン残基とよ（一致 する。システィンが奇数個であることは、レセプターサブユニットを互いに結合 する分子間ジスルフィド結合を反映していることがわかる。

上記のデータは、天然型のレセプターを構成している２つのサブユニットが同一 であるか、あるいは実質的に同一（すなわち、９０％〜９５％の相同性を有する ）であることを示す。

これらサブユニットは同一であると予想され、このことは天然型のペプチド、　 ｃＤＮＡ、またはゲノムクローンをさらに配列決定することにより確かめられ得 る。

上記のデータは、ここで述べたＡＮＰレセプターがホモダイマーであり、天然型 のサブユニットは約６０．５００の分子量を有するが、グリコジル化されていな いサブユニットは約５６，０００の分子量を有することを示す。いくつかの証拠 は、約１２０，０００および７０，０００の分子量を有する天然型のＡＮＰ結合 タンパクも存在し得ること、そしてこれらタンパクの各々には異なった機能があ り得ることを示す。例えば、完全な還元条件下で見られる１２０ｋｄのポリペプ チドは、グアニル酸シクラーゼ活性と最も密接に関係している。ここで述べる６ ０．５ｋｄポリペプチドと異なり、切形のＡＮＰ類似物とはあまりよく結合しな い。

これは１２０ｋｄのレセプターがグアニル酸シクラーゼ活性の促進に関与し得る が、　６０．５ｋｄのレセプターは他の作用様式；例えばレセプターの排除、を 有することを示唆する。しかし。

出願人はこの仮説に束縛されることはない。分子量および活性が異なるにもかか わらず、観察されたＡＮＰレセプタータンパクの全ての種は同一遺伝子または実 質的に同様の遺伝子系統でコードされており、観察される違いは転写後または翻 訳後のプロセッシングの違いから生じ得る。

哺乳動物の血管の６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットのアミ ノ酸配列は、哺乳動物の種および異なる組織間で高度に保持されている。例えば 、ウシとヒトの配列は少なくとも約９５〜９７％の相同性を有する。ここで、ヒ トの配列は腎臓および胎盤のｃＤＮＡで決定されたものである。一般に、他の種 および／または組織から単離された天然型のＡＮＰレセプタータンパクサブユニ ット（または関連タンパクの結合領域）は、ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセ プタータンパクサブユニットと少なくとも約７５％のアミノ酸相同性を有してお り。

そして一般的には少なくとも約８５％の相同性を有する。相同性が約９０％から 約９５％あるいはそれ以上であり得る場合もある。従って、他の天然型のＡＮＰ レセプタータンパクは、相同性を有するタンパクサブユニットを含む。これらの 他の可溶化ＡＮＰレセプタータンパクは、高い親和性でＡＮＰペプチドを結合さ せる能力によって、さらに特徴付けられ得る。例えば。

ＡＮＰ（４−２８）は、　１０〜２０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下のＬ値を 有する。ＡＮＰレセプタータンパクは、ＡＮＰ（４−２８）に対して１ｎＭ以下 の相対的なに、値を有することが特に好ましい。

合成ＡＮＰレセプターはまた。ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセプターに対し て、アミノ酸組成に少し違いがある。例えば１発現ベクターを遺伝子操作する場 合１本質的ではない（すなわち、レセプター機能を損なわないような）領域にお けるアミノ酸残基の交換または除去は、しばしば都合のよい手段である。ＡＮＰ への結合親和性を変化させるためにアミノ酸配列を故意に変更することも望まし い。一般に１合成レセプタータンパク（４−２８）に対する親和性（Ｋ、）は、 　１０ｎＭ以下であるべきである。ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセプターに 対する合成レセプターのアミノ酸配列相同性は、少な（とも（例えば、融合タン パクにおけるように）除去または交換されない領域に対しては、一般に天然型の ＡＮＰレセプターについて上述した範囲内にある。

細胞からのＡＮＰレセプタータンパクの精製は、基本的な３つの段階を包含する ：細胞の調製、ＡＮＰレセプターの活性型かつ安定型での可溶化、およびアフィ ニティークロマトグラフィーによるレセプターの精製。好適な細胞の起源はウシ の大動脈平滑筋細胞である。なぜならば、これら細胞が細胞あたり約２５０．０ ００個のＡＮＰレセプター部位を有するからである。

培養細胞は、たいていの組織起源のものに比べて比較的プロテアーゼを含まない という、利点をさらに有する。これは活性なレセプタータンパクの安定化および 精製を容易にする。

ラット胎児の胸部大動脈平滑筋の細胞系Ａｌ０（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４７６）の ような、他の細胞系は当該分野で公知である。

好適な細胞系は、　Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、　（１９８２）　Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

１１３　：１９７−２０２に記載されているように、ウシ大動脈の移植片から確 立される。平滑筋細胞系は標準操作によりローラーボトルで増殖させることがで き、十分な細胞量が得られたら集める。集めた細胞を遠心分離で沈澱させて１次 いで例えば乳鉢と乳棒で摩砕することによりホモジナイズする。次いで。

レセプタータンパクは、カルビオケムーベーリング（サンディエゴ、　ＣＡ）か ら入手可能である界面活性剤Ｃ＋ｚＥａ　（オクタエチレングリコールドデシル エーテル）を用いて、このホモジナイズした細胞画分から可溶化する。ＣＩＺＥ ａに代えて多くの界面活性剤を試験した。しかし、ＡＮＰレセプター活性を実質 的に低下させることなくレセプタータンパクを可溶化する他の界面活性剤は存在 しなかった。

可溶化ＡＮＰレセプターは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製さ れる。アフィニティークロマトグラフィーによる種々の精製方法が当業者に公知 である。一般的には。

Ｃｏｏｐｅｒ、　ＴＯＯＬＳ　ＯＦ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、　ｐｐ、　２ ３４−２５４　（ジョンワイリー＆サンズ、　１９７７）を参照。ＡＮＰレセプ タータンパクを精製する一般的な方法は、以下の通りである：（１）可溶化した レセプター画分を、ＡＮＰペプチドが結合したカラムに通す、（２）このカラム を、レセプターがＡＮＰペプチドに結合して残存する解離条件下で洗浄する。（ ３）レセプター／　ＡＮＰ複合体を解離させる。そして（４）過剰のリガンドを 除去し、レセプターの結合活性を回復させる。　上記の操作で、血管のＡＮＰレ セプタータンパクが組成物のタンパク画分の少なくとも約７５〜８０％を含有す る精製された細胞非含有組成物が得られる。好ましくは、クロマトグラフィーの 条件を２組成物のタンパク画分が少なくとも約９０％のＡＮＰレセプタータンパ クを含有し、そして最適には少なくとも約９８％のレセプタータンパクを含有す るように選択する。細胞起源を選択することにより、ウシまたはヒトのような種 々のＡＮＰ　レセプタータンパクを調製し得る。一般的には、　ＡＮＩＭＡＬ　 ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙｉ。

１９８６　）を参照。

精製レセプタータンパクが得られれば、当業者に公知の種々方法のいずれかによ り容易に配列を決定し得る。例えば。

レセプタータンパクのアミノ酸配列は、エドマン分解を繰り返して行い１次いで ＨＰＬＣによるアミノ分析を行うことにより。

精製タンパクから決定し得る。アミノ酸配列を決定する他の方法もまた当該分野 に公知である。

アミノ酸配列が決定されたら、決定されたアミノ酸配列の一部分に対するコドン を有するオリゴヌクレオチドプローブを調製し、そしてこのプローブを用いて、 レセプタータンパクをコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリーをスクリー ニングする。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーの調製に関 する基本的方法、および核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニ ングは、一般の当業者に公知である。例えば、ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ　：第１ 巻（Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ’ＩＪｉＡ、　１９８５）；ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ 　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳＪ、）Ｉｉｇｇ ｉｎｓ　’＆、　１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨ ＥＳＩＳ　（Ｍ、Ｊ。

Ｇａｔｅｍ、１９８４）；　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｓｃｈ　＆ 　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＋ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯ ＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（１９８２）を参照。

まず最初にＤＮＡライブラリーを調製する。このライブラリーは、ヒトのような 選択されだ哺乳類に由来するゲノムＤＮＡライブラリーから成り得る。ヒトのゲ ノムライブラリーは当該分野で公知である。例えば、　Ｌａｗｎら、　（１９７ ８）　Ｃｅ１ｌ　１５：１１５７−１１７４を参照。ＤＮＡライブラリーは、逆 転写によりポリ−Ａ　ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から調製されたｃＤＮＡからも構 築し得る。例えば。

米国特許第４．４４６．２３５号；第４，４４０．８５９号；第４．４３３．１ ４０号；第４．４３１．７４０号；第４，３７０．４１７号；第４，３６３，８ ７７号を参照。

ｍＲＮＡはレセプタータンパクを発現することが知られている細胞系または組織 から単離される。ＡＮＰレセプタータンパクを発現している細胞系または組織は 当該分野で公知である。

ｃＤＮＡ　（またはゲノムＤＮＡ）は、ライブラリーの構築に適したベクターに クローン化する。好適なベクターは、ファージλのようなバクテリオファージベ クターである。適切なライブラリーの構築は、当業者の技術範囲内である。

ライブラリーが一度作成されたならば、ライブラリーを調べるためのオリゴヌク レオチドを調製し、所望のＡＮＰレセプタータンパク遺伝子を単離するのに用い る。オリゴヌクレオチドは適当ないずれかの方法により合成される。選択された 特定のヌクレオチド配列は、既知のアミノ酸配列をコードするコドンに対応する ようにレセプタータンパクから選択される。遺伝子コードは重複があるので、タ ンパクの特定の領域をコードする可能なヌクレオチド配列の全て、または適切な 数をカバーするいくつかのオリゴヌクレオチドを合成する必要がしばしばある。

このように、一般に好適には、コドンが高度に縮退しているアミノ酸を含まない 領域を基本として。

プローブの領域が選択される。しかし、ライブラリーを作成した哺乳動物に稀で あるコドンを有するプローブを調製する必要はない。ある状況下では、当業者は 、かなり長く、そして／または対応する核酸配列においてかなり高度に重複して いるアミノ酸配列の領域を包含するプローブを調製することが望ましいことを見 い出し得る。この長さおよび／または重複した領域がレセプタータンパクの大き な特徴であるならば。

特にである。完全な遺伝子、またはゲノムの本質的な部分をカバーするプローブ もまた適切であり得るが、これは期待される相同性の度合に依存する。例えば、 ウシ血管ＡＮＰレセプターのｃＤＮＡを、ヒトＡＮＰレセプタータンパクについ てヒトの遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために用いたのが。

そのような場合である。その遺伝子の異なった領域に対応する２つのプローブ（ または数組のプローブ）を１回のハイブリダイゼーシゴン実験に用いるのも望ま しいことであり得る。

自動化されたオリゴヌクレオチド合成は、多くのプローブ群の調製を比較的簡単 なものにした。一方、用いられるプローブの正確な長さは決定的に重要ではない が、一般には約１４から約２０塩基対のプローブが通常有効であることが当該技 術分野で認められている。約２５から約６０塩基対の、より長いプローブもまた 。使用され得る。

選択されたオリゴヌクレオチドプローブを、放射性ヌクレオチドまたはビオチン のようなマーカーを用いて、標準的な操作で標識する。次に標識化プローブの組 をスクリーニング工程に用いる。この工程は、標準的な技術に従ってライブラリ ーから単離した５ｓＤＮＡに１本鎖のプローブをハイブリダイズさせることから 成る。厳密なまたはゆるいハイブリダイゼーション条件のいずれが適当であるか は、プローブの長さ。

およびプローブがライブラリーと同一種に由来するか、または進化的に近い種に 由来するか遠い種に由来するかな・どのようないくつかの因子に依存する。適当 な条件の選択は、当業者の技術範囲内にある。一般には、　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣ ＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（前出）、を参照されたい。基本的に要求さ れることは、ハイブリダイゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起 こる様に十分厳密なことである；すなわち、ハイブリダイゼーションは非特異的 結合とは対立するものであり、十分な核酸相同性の程度（例えば、少なくとも約 ７０〜７５％）による。スクリーニングしたライブラリーのクローンがハイブリ ダイゼーション陽性であることにより一度同定されれば、制限酵素分析およびＤ ＮＡの配列決定により、特定のライブラリーの挿入断片がレセプタータンパクに 対応する遺伝子を含むことを確認し得る。

あるいは、ＡＮＰレセプターサブユニットのＤＮＡコード配列を、配列がＡＮＰ レセプタータンパクサブユニットのアミノ酸配列に対応するコドンを有する重複 したオリゴヌクレオチドから合成して調製し得る。このようなオリゴヌクレオチ ドを標準的な方法により調製し、完全なコード配列に組み立てる。

例えば、　Ｅｄｇｅ、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｒｅ　２９２ニア５６；　Ｎ ａｍｂａｔｒら、　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３　：１２９９；Ｊａｙ 　ら、（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５９　：６３１１を参照 されたい。

ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットに対応するコード配列を有するＤＮＡ分 子は、適当なベクターにクローン化し得る。

それによってＡＮＰレセプター遺伝子のコード配列を含まないベクター（例えば 、他のライブラリーのクローン）を実質的に含有しない組成物の状態が維持され る。多数のクローニングベクターが当業者には公知であり、適当なりローニング ベクターの選択は任意である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよ びそれが形質転換する宿主細胞には以下が包含される：バクテリオファージλ（ Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、　ｐＢＲ３２２（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）＋ｐＡｃＹｃ１７７ 　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、　ｐＫＴ２３０　（グラム陰性バクテリア）。

ｐＧＶ１１０６（グラム陰性バクテリア）　、　、）ＬＡＦＲＩ　（グラム陰性 バクテリア）　、　ｐＭＥ２９０　（非−Ｅ、　ｃｏｌｉグラム陰性バクテリア ）。

ｐＨＶ１４（Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｌ　 ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）。

ｐｌＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、　ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ ｅｓ）、アクチノファージψＣ３１（針匹■亜匹並）、ＹＩｐ５　（酵母）、　 ＹＣｐ１９　（酵母）、およびウシのパピローマウィルス（＠乳類細胞）。一般 にはＤＮＡＣＬＯＮＩＮＧ　：　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　＆ＩＩ、　（前出）　； 　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵ ＡＬ　（前出）、を参照されたい。

本発明のある実施態様では、ＡＮＰレセプタータンパク遺伝子からのコード配列 はプロモーター、リポソーム結合部位（細胞での発現のための）、および必要に 応じてオペレーター（ここではまとめてこれらを“制御”配列と呼ぶ）の制御下 におかれ、そのことによってレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列（ここ では“′コード”配列と呼ぶ）がベクターで形質転換された宿主細胞内でＲＮＡ に転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含み 得るか。

または含み得ない。このコード配列はまた。プロＡＮＰレセプター、または成熟 ＡＮＰレセプターに対応する配列のいずれかを含み得る。バクテリアでは、成熟 レセプタータンパクサブユニットは、好ましくはいかなるシグナルペプチドをも 有しないコード配列の発現により生産される。または、翻訳後のプロセッシング によりリーダー配列が除去される場合の系では、好ましくは、リーダー配列を含 むコード配列の発現により生産される。成熟タンパクの開始点およびシグナルペ プチドの終止点の決定は、成熟タンパクＮ−末端のアミノ酸配列から容易に決め られる（第２図）。レセプタータンパクはまた。異質のアミノ酸配列がＮ−末端 で発現する融合タンパクの形でも発現できる。例えば、米国特許第４，４３１． ７３９号；第４．４２５．４３７号を参照されたい。

組換えベクターは、レセプタータンパクコード配列が適当な制御配列と共に、ベ クター内に配置されるように構築される。つまり該制御配列に対するレセプター コード配列の位置と方向づけとが、該コード配列が制御配列の制御下で（すなわ ち、ＤＮＡ分子の制御配列に結合するＲＮＡポリメラーゼによって）転写される ような位置と方向づけとであるように構築される。この制御配列は、上述のクロ ーニングベクターのようなベクターへの挿入の前に、コード配列に連結され得る 。

または、上記コード配列は、既に制御配列および適当な制限部位を制御配列の下 流に有する発現ベクターに直接クローン化し得る。原核生物および酵母でのレセ プタータンパクコード配列の発現については、制御配列はコード配列に対して非 相同性である。宿主細胞が原核生物であれば、コード配列はイントロンを含まな い、つまりｃＤＮＡであることも必要である。

選択した宿主細胞が哺乳動物細胞であるならば、制御配列はレセプタータンパク コード配列に対し非相同性または相同性であり、コード配列はイントロンを含む ゲノムＤＮへまたはｃＤＮＡであり得る。ゲノムまたはｃＤＮＡコード配列のい ずれも酵母で発現し得る。

多（の原核生物用の発現ベクターが当該技術分野で公知である。例えば、米国特 許第４．４４０．８５９号；第４，４３６．８１５号；第４．４３１．７４０号 ；第４，４３１，７３９号；第４．４２８．９４１号；第４．４２５．４３７号 ；第４．４１８，１４９号；第４，４１１，９９４号：第４，３６６．２４６号 ；第４．３４２．８３２号を参照されたい。さらに、英国特許明細書ＧＢ第２． １２１．０５４号；ＧＢ第２，００８，１２３号；ＧＢ第２．０００７．６７５ 号；およびヨーロッパ特許明細書第１０３，３９５号もまた参照されたい。

しかし、好ましい発現ベクターは、真核生物系で用いられるベクターである。例 えば、共同出願である１９８５年１２月１６日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ第８０９． １６３号を参照されたい。その開示内容はここに述べられている。酵母発現ベク ターは当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４．４４６．２３５号； 第４，４４３．５３９号；第４，４３０，４２８号を参照されたい。さらに、ヨ ーロッパ特許明細書筒１０３．４０９号；第１００．５６１号；第９６．４９１ 号もまた。

参照されたい。その他の好ましい発現ベクター系はｐＨ５１であり、このベクタ ーはチャイニーズハムスターの卵巣細胞を形質転換する。このベクターの利用は 、共同出願である１９８５年１２月４日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、第８０４　、６ ９２号に記載されており、その開示内容はここに述べられている。

組換えＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを、上記の発現ベクターで形質転 換された宿主細胞を、ＡＮＰレセプタータンパクが生産される条件下で、増殖さ せることにより生産し得る。次いで、ＡＮＰレセプタータンパクを宿主細胞から 単離し、精製する。発現系がＡＮＰレセプタータンパクを増殖培地に分泌する場 合には、レセプタータンパクは細胞を含まない培地から直接精製し得る。分泌を 行わせるには、一般的にレセプターの膜結合部分に対応するコドンを欠失させる 必要がある。レセプタータンパクが分泌されない場合は、これを細胞溶解産物か ら単離する。適当な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の技術範囲内にあ る。

天然型または合成のＡＮＰレセプタータンパクのいずれも。

ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体生産に使用し得る。ポリクロ ーナル抗体が所望である場合には、精製レセプタータンパクが選択された哺乳類 （例えば、マウス。

ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫するのに用いられる。免疫した後の動物から血 清を集め、公知の操作に従って処理する。

レセプタータンパクのほかに種々の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する 組成物は、該組成物をＡＮＰレセプターが結合しているカラムに通すことにより 、抗−ＡＮＰレセプタータンパク抗体ではない抗体を実質的に含まないものとす ることができる。洗浄後、ＡＮＰレセプターに対するポリクローナル抗体をカラ ムから溶出させる。モノクローナル抗−ＡＮＰレセプタータンパク抗体もまた当 業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体生産 の一般方法論は公知である。永久抗体生産性細胞系もまた。Ｂリンパ球の発癌Ｄ ＮＡによる直接の形質転換、またはエプスタイン・バー・ウィルスでのトランス フェクションのような融合以外の方法で創製し得る。例えば、　Ｍ、　５ｃｈｒ ｅｉｅｒら、　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　（１９８０）　；Ｈ ａｍｍｅｒｌ　ｉｎｇ　ら、　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡ ＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ　（１９８１）　；　Ｋｅｎｎｅｔ ｔら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＢＳ（１９８０）を参照されたい 。

ＡＮＰレセプタータンパク（天然型または合成の）を、モノクローナル抗体生産 のために永久増殖化したＢ−細胞の起源細胞を免疫する際に、抗原として用いる ことにより、レセプタータンパク分子の異なった部位でエピトープを認識するモ ノクローナル抗体のパネルを得ることが可能である。レセプタータンパクの結合 領域におけるエピトープをＬ’Ｑ’ｔｈする抗体は。

抗体とＡＮＰとの間の拮抗分析で容易に同定し得る。このような抗体は、ＡＮＰ ペプチド結合に関連した生理学的応答を促進することなく、インビボにおいて該 抗体がＡＮＰのレセプターへの結合を阻害し得れば、治療効果を有する可能性が ある。

レセプタータンパク上の部位を認識する抗体も有用である。

例えば、細胞溶解産物または醗酵培地からのＡＮＰレセプタータンパクの精製、 およびレセプタータンパクの特徴付けにおいて有用である。一般に、当該分野で 公知であるように、抗ＡＮＰレセプター抗体は、カラムまたはラテックスビーズ のような固体支持体に固着（固定化）シ、レセプタータンパクを含有する溶液と 接触させ、該溶液から分離する。次いで、固定化抗体に結合したレセプタータン パクを溶出させる。

以下の実施例は例示の目的のみのために示すものであり。

いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

（以下余白） 実ｌｌ吐１ この実施例は、血管組織のＡＮＰレセプタータンパクの精製およびその物性的特 徴付けを目的としている。

ウシ大動脈平滑筋（ＢＡＳＭ）細胞系はＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒらにより最初に 確立され、　（１９８２）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１３　：１９７ −２０２に記載されている。この方法に従って確立され０−２と名付けられたウ シ大動脈平滑筋細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ ）、　１２３０１パークローン　ドライブ、ロックビル、メリーランド、Ｕ、Ｓ 、Ａに受託番号ＣＲＬ−９０８８で寄託されている。組織培養物中における初期 増殖とそれに続くクローニングの後、蓄積した細胞を液体窒素で凍結させた。Ａ ＮＰレセプタータンパクの精製に用いる細胞は、この細胞を４〜１５代にわたっ て継代培養した後に得た。この細胞は１００個のローラーボトル（各８５０ａｆ ｉ　）中に１５％ウシ血清とダルベツコの改変イーグル培地を入れた標準条件下 で増殖させた。５ＩｉＭ　ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　５ ０−で２回すすぐことにより細胞をローラーボトルから回収した。次いで、１０ μｇ／ｌｎｌのエラスターゼおよび２５μｇ／ｍｆｌのコラゲナーゼを含有する 同様の緩衝液をそれぞれのローラーボトルに添加した。一様に回転させて８〜１ ０分間インキュベーションした後、遊離した細胞をプールして水中に移し、ウシ 血清を５％（Ｖ／Ｖ）になるまで添加した。この細胞を５．ＯＯＯＸｇで１０分 間、４°Ｃで遠心分離した。沈澱を２５０ｄのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁し、同 様に遠心分離した。この沈澱を４°Ｃのホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭ　）リ スＨＣ１，ｐＨ７，５；　５ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ；　１１００ＯＩ　ＮａＣｌ： 　０．２５Ｍスクロース；０．１ｗＭフェニルメチルスルホニルフルオライド； ２５μｇ／ｄアプロチニン；２５μｇｏｄロイペプチン）３０Ｉｄにもう一度再 懸濁した。

細胞を水中で、すりガラス乳棒を１０回通してホモジナイズした。ホモジナイズ した細胞を１００．０００Ｘ　ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。その沈澱を ホモジナイズ用緩衝液に再懸濁し、上述のように再びホモジナイズした。この物 質を再び１００．０００　Ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離した。最終的に得ら れた沈澱を１０Ｊｄのホモジナイズ用緩衝液に再懸濁し、タンパク含有量をブラ ッドフォードの方法で測定した。（１９７６）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

７２：２４Ｂ−２５１゜膜は、ホモジナイズ用緩衝液を添加することにより、５ ■タンパク／ｒｄとなるように調整した。この画分のレセプター結合活性は、　 ５ｃｈｅｎｋら＋（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２７　：４３３−４４２に記載されているように、 　”’Ｉ−ＡＮＰ（２−２８）を用いて検出した。この両分により示される濃度 −依存結合は、精製のこの段階で８０％の細胞表面レセプター活性が残存してい ることを示唆していた。

ＡＮＰレセプター活性を示す膜画分を当量のＰＢＳ／ＥＤＴＡで希釈し。

次いでＣＩ！Ｅｌｌ界面活性剤（２０■／−）を含有する溶液をＣ，ｔＦｉｓの 最終濃度が４■／ｄとなるまで１０分間以上かけて徐々に添加した０次いで、こ の溶液をＬＯＯ，０ＯＯＸ　ｇで１時間、４°Ｃで遠心分離し、上清を保持した 。上述したような結合に関する研究によると、膜における全ＡＮＰ結合部位の６ ５％がこの方法により可溶化された。この調製物の可溶化したＡＮＰレセプター は、極めて安定であり、４°Ｃで２週間または一２０″Ｃで３力月間保存した後 も結合活性の変化しないことが認められた。

親和性マトリックスは、製造業者により記述されているように４０■のヒトＡＮ Ｐ（４−２８）を４ｄのアフィーゲル１０（バイオ−ラド）に結合させることに より調製した。可溶化したＡＮＰレセプターを１０ｍＭ　ＣａＣ１□およびＭｇ Ｃ１ｚで調整し、０．２μ台フィル（ター（ＧＥ型、ミリボア）に通して濾過し た。この濾液をＡＮＰ−アガロースカラムにより、流速０．５ｄ／ａ＋ｉｎ、　 ２１°Ｃでクロマトグラフした。このカラムは、結合用緩衝液（１００ｎＩＭ　 ）リスＩｆＣ１゜ｐ）！７．５０；　１００ａ＋Ｍ　ＮａＣｌ；　４　ｍｇ／ｌ ｄ　Ｃ＋ｚＥ＊；　１０ｏ＋Ｍ　ＣａＣ１ｚ：および１０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ）を 用いて、溶出液がＡｔ５ｏ＝０．０００となるまで洗浄した。次いで、６．０ｄ の溶離緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム。

ｐＨ５，ｏＯ：　１０抛Ｍ　ＮａＣ１：　４　ｍｇ／　！ＩＩＣ＋Ｊａ；　１０ ｍＭ　ＣａＣ１ｚ：１０ｎＭ　ＭｇＣｈ）を添加し、そしてその溶出液は水中に 移し、直ちに３７％（Ｖ／Ｖ）アセトンとなるように調整した。この溶液を４． ０００Ｘｇで１゜分間、４°Ｃで遠心分離し、上滑を完全に吸引除去した。沈澱 は３．０　ｍの結合用緩衝液に再懸濁し、純度、レセプター結合活性、およびア ミノ酸配列について分析した。

還元条件下および非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％のポリアクリ ルアミド濃度）により分析を実施した。非還元条件下では、　１２５ｋｄに単一 のタンパクバンドが見られた。精製されたレセプターを１０ｍＭジチオスレイト ールで処理した。

このジチオスレイトールはシスチンをシスティンに還元する試薬であり、この処 理の結果、　６０．５ｋｄに単一のタンパクバンドが認められた。このデータは 、　ＡＮＰ　レセプタータンパクが本質的に純粋であり、大動脈平滑筋細胞由来 の活性レセプターカシスルフィド結合により結合された２つの同一サブユニット からなる二量体であることを示している。

種々のＡＮＰペプチドに対する”Ｉ−ＡＮＰ（４−２８）の精製レセプターへの 拮抗的結合を第１図に示す。試験したＡＮＰペプチドは、　ｈＡＮＰ（４−２８ ）、　ｈＡＮＰ（７−２８）およびアトリオペブチンＩを包含していた。ガンマ −メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＲ）は負のコントロールとして用いた。

結合に関するデータのコンピューター分析（プログラムＲ５−１；Ｂｏｌｔ、Ｂ ｅｒａｎｅｋ＆Ｎｅｗｍａｎ。

ボストン、　ＭＡ）は、レセプター結合に対するＢ。Ｘが５．７ｎｍｏｌ／■タ ンパク（ｋ４・０．３ｎＭ）であることを示した。これは、レセプタータンパク に対するＡＮＰの化学量論が１：３ｋｄサブユニツト、または０．７：１．０／ ホロレセプターであることに対応する。

ＡＮＰペプチドを用いた別の研究を実施した。　ＡＮＰ　（４−２８）について は０．３ｎＭ、　ＡＮＰ（７−２８）については１．１ｎＭ、そしてＡＮＰ（５ −２５）については１１−１２ｎという相対的なに、値は、前に報告した細胞表 面のレセプターについてのデータと一致している。

２５μｇの精製ＡＮＰ　レセプターは、繰り返しエドマン分解法にかけ１次いで アプライド　バイオシステムダ４フ０Ａ気相タークネーター（ｇａｓ−ｐｈａｓ ｅ　５ｅｑｕｎａｔｏｒ）にょるＨＰＬＣを用いたアミノ酸分析を行った。分析 は唯一のアミノ酸配列を示した。

この配列およびこの配列に対応するヌクレオチド配列を第２図Ａに示す。

実施ｔＬ この実施例は、ウシＡＮＰレセプターの完全コード配列を得るためのプロトコル を意図する。

プローブは、実施例■で推論されたＡＮＰレセプター〇Ｎ−末端配列に基づいて 設計された。配列は第２図Ａに示す。オリゴヌクレオチド配列は３′から５′で 表されている。プローブは、　（１）２４倍に縮退した工４ヌクレオチドのプロ ーブ、　（２）４８倍に縮退した１４ヌクレオチドのプローブ、および（３）５ １ヌクレオチドのプローブであり、ウシの好適なコドン選択を用いて設計されて いる。４つの異なった型のプローブ３は、セリンに対してＴＣＸコドンの代わり にＡＧＡ／Ｇコドンが用いられた場合、および真核生物のゲノムにおいて表現さ レルシヌクレオチドであるＣｐＧがレセプターの０ＩＲＮＡ中に存在しない場合 に調製された。従って、枠で囲んだヌクレオチドは両方の位置に八が存在するか 、または両方の位置にＧが存在するかのいずれかであることを示している。星印 は、５１ヌクレオチドのプローブと得られたレセプターｃＤＮＡの配列とにおい て一致していない箇所を示している（第２図Ａを参照）、ハイブリダイゼーショ ン用プローブを合成しくアプライド　バイオシステムズ　モデル３８０ａ）　、 ゲル電気泳動法により精製し、そして［γ”Ｐ　］　ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼとを用いて放射標識した。

ｃＤＮＡは、　ＢＡＳＭ細胞から以下のように調製した。膜結合性ポリゾームは 、実質的に［５ｅｂｂａｔｎ、Ｒ，ら（１９８３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

Ｚ祁−：　３２９４−３３０３　］の記載に従ってＢＡＳＭ細胞から精製し、２ 末鎖ｃＤＮＡは、　Ｌａｎｄら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　９　：２２５１−２２６６の方法により合成した。セファクリル５４００ 　（ファーマシア）で分画したｃＤＮＡは　ＥｃｏＲＩアダプターに連結させ、 λｇｔｌｏにクローン化した［Ｗｏｏｄら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１２： ３３０−３３３コ。約９×１０ｂの組換え体ファージのライブラリーを得た。プ ラークを取り出すには、５１ヌクレオチドのプローブを組み合わせて用いて、　 ２０％ホルムアミドに６　Ｘ５ＳＣ（０，９Ｍ　ＮａＣ１，０，０９Ｍクエン酸 ナトリウム）、１０％デキストラン硫酸、０．１％ＳＯＳ、　５　Ｘデンハート 溶液（それぞれ０．１％のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、および フィコール）、および１００μｇ／ｒｒｄｌの酵母リポソームＲＮＡを加えた溶 液中で、初期温度５５°Ｃ９その後４０°Ｃに下げて一晩放置してハイブリダイ ゼーションを行うことによりスクリーニングした。−ハイブリダイゼーションの 徴候が陽性であるクローンは、プローブ１およびプローブ２にハイブリダイゼー ションすることにより確認し、プラークを精製した。約３００，０００プラーク から２つのクローン（ｐＡＮＰＲｃ−１およびｐＡＮＰＲｃ−２）が得られた。

配列の一部をＭ１３法、　Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ″７４：５４６３−５４６９；　Ｍｅｓｓｉｎｇら（ １９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２６９−２７６により決定した後、別のプローブ （縮退していない２４ヌクレオチド）を調製し、同じｃＤＮＡライブラリーから クローンｐＡＮＰＲｃ−４，１２，１３，１４および１５を得るために使用した 。ｐＡＮＰＲｃ−６を得るためにはｐＡＮＰＲｃ−４配列を基本とするプローブ を用い、　ｐＡＮＰＲｃ−９および１０を得るためにはｐＡＮＰＲｃ−６配列を 基本とするプローブを用いた。種々のプローブで検出されたｃＤＮＡライブラリ ーにおけるＡＮＰ　レセプタークローンの全頻度は、　２０．０００個あたり約 １個であった。

ＡＮＰレセプターのｃＤＮＡクローンは、第２図Ｂに整理した配列として示す、 　ＡＮＰレセプターをコードしている部分（オーブンリーディングフレーム）を 太い線で示すとともに、その下方にそれぞれのクローンの配列を示す。破線は配 列の分析が不完全な領域を示している。全体的には、これらクローンはｍＲＮＡ の配列の３５５８ヌクレオチド以上を明らかにしている。

オーブンリーディングフレームは１６１１ヌクレオチドの長さである。これは第 ２図ＡのＮ−末端アミノ酸配列をコードする枠内部分を含んでいる。クローンｐ ＡＮＰＲｃ−２，ｐＡＮＰＲｃ−１２，およびｐＡＮＰＲｃ−１５の５′末端の 配列は同一であるが、　ｐＡＮＰＲｃ−１３およびｐＡＮＰＲｃ−１４の５′末 端の配列は、それぞれ４および３ヌクレオチドだけ異なっている。ＡＮＰ　レセ プターｍＲＮＡの５′末端は、このように４６５個の非コードヌクレオチドを有 することがわかる。約１５００ヌクレオチドの非コード３′末端配列が得られ、 その５００個以上のヌクレオチドはさらに部分配列およびｐＡＮＰＲｃ−９のマ ツピングにより特定されている。ｎ＋ＲＮＡの３′末端を示すポリ（Ａ）配列を 有するクローンは存在しないが、ポリ（Ａ）配列となり得る２つの付加的シグナ ル（ＡＡＵＡＡＡ）が２４４０および３１９７ヌクレオチドに存在する。それゆ え、レセプターは大きな（＞４０００ヌクレオチド）ｏ＋ＲＮＡの５′末端をコ ードすることがわかる。これはポリペプチドに対する他のレセプターのｍＲＮＡ の構造に類似している。

ＡＮＰレセプター全体をコードする領域を有するクローンは。

ｐＡＮＰＲｃ−１およびｐＡＮＰＲｃ−４に共通のＮｃｏ　Ｉ制限部位を利用し て。

この両者を結合することにより、　ｐＧＥＭｌ（プロメガ　バイオチク）で構築 した。得られたクローンｐＡＮＰＲｃ−１／４は、　２２９０塩基対のＤＮＡ挿 入断片を有しており、　該ＤＮＡ挿入断片は、完全なオーブンリーディングフレ ーム、２３３ヌクレオチドの５′末端の非コード領域、および１９０ヌクレオチ ドの３′末端非コ一ド配列を有する。３′プラスミド／ｃＤＮＡ連結体をＥｃｏ ＲＩで制限分解し９次いでＳＰ６ボリメラーゼで転写することにより。

約２３００ヌクレオチドの合成ＲＮＡを得た。塩基数はアガロースゲル電気泳動 により決定された。

レセプターの一次構造は、すべてのクローンの配列の分析により決定された。ｃ ＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を第３図に示す。右端の番号は配列に おけるヌクレオチドの位置を示す。プレプロレセプターの予想されるアミノ酸配 列は、連続したコード領域のコドンの下部に示す。ＭＥＴ　（００１）で始まる アミノ酸番号を示す。異なるクローン間においていくつかの単一ヌクレオチドの 相違が示されたが、これら相違のうち４つはコード領域にあった。ヌクレオチド ５５２．１０１０．１４３６゜および１５５８は、それぞれｐＡＮＰＲｃ−２で はＧであり、　ｐＡＮＰＲｃ−１ではＣであり、　ｐＡＮＰＲｃ−４では八であ った。この頻度は逆転写酵素と関連した誤りの頻度（Ｇｕｉｄｏｎら（１９８３ ）　ＭｅｔｈＪｎｚｙａ＋ｏ１．１０１　：３７０−３８６）に類似しているの で、これらの違いはクローニングの産物であると思われる。第３図の配列は、そ れぞれの位置で少なくとも２つのクローンが一致することを示している。

可能性のあるシグナルペプチダーゼ分解部位（ム）、および成熟レセプター〇Ｎ −末端開始部位（↓）を示す。可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は枠で囲 み、推定される膜通過領域は下線で示す。３′末端の非コード領域において可能 性のあるポリ（Ａ）付加的シグナルには、上に線を施す。

オーブンリーディングフレームの５３８コドンは、ウシＡＮＰレセプターの一次 構造を決定する。ＡＮＰレセプターの前駆体ポリペプチドは、このように５９． ７４４ダルトンの分子量を有する５３７アミノ酸から構成されると予想される。

第３図において開始コドンとして示されるＡＴＧは、開始コドンであり得るさら に４つのＡＴＧが先行するが、後者の４つは、それぞれのリーディングフレーム における終止コドン、およびいずれのフレームにおいてもありそうにない連続し たオリゴフェニルアラニンをコードするＴに富んだ領域が後に続く。Ｋｏｚａｋ 　（ＣＣＡ／Ｇ　ＣＣ）、　（１９８６）　Ｃｅ１１４４：２８３−２９２によ り定義されたように。

良好な翻訳開始シグナル（ＧＣＡＣＧ）は、予想されたＡＴＧに先行し、このＡ ＴＧは単離されたレセプター〇Ｎ−末端配列と同じオリゴペプチド配列のフレー ム内にある。レセプターの前駆体について予想されるサイズは、　ｃＤＮＡを鋳 型として用いて合成したＲＮＡのインビトロでの翻訳産物の観察されたサイズ（ Ｍｒ〜５８．０００）と非常に良く一致する。そして、精製されたレセプターの アミノ酸組成もまた予想される配列と良く一致する。結局、配列の特徴は、レセ プターに関する公知の特徴および予想される特徴と一致する。

レセプターにおけるアミノ酸配列のハイドロパシシテイは。

ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１−Ｂｉｏｌ、１ ５７　：１０５−１３２の方法により計算した。局部的なハイドロバシシティの 値は、残基ｘ−９からｘ＋９までについて平均した値であって、第４図に示すよ うに残基Ｘ（アミノ酸番号）に対してプロットした。正の値は疎水性領域を示し ており、負の値は親水性の領域を示す。レセプタータンパクの概略図を参考のた めに下に示す。黒く塗りつぶした領域はそれぞれ予想されるシグナル配列および 膜通過配列を示す。点を描いた領域はシグナルペプチダーゼがおそら（切断する 領域を示し、空白の領域はレセプターが成熟する間に除去される付加的なアミノ 酸を示す。

レセプターにおける参照の配列は、システィン（Ｃ）およびＡｓｎ−Ｘ−５ｅｒ ／Ｔｈｒの可能性のあるグリコジル化部位（ＣＨＯ）である。

Ｅ、ｃｏｌｉ　（ｐＡＮＰＲｃ−１）は、微生物の寄託に関するブタペスト条約 に基づき、　１９８６年５月５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、 　１２３０１　パークローン　ドライブ、ロックビル、ＭＤ　２０８５２．Ｕ、 Ｓ、Ａ、に寄託した。この寄託に対して受託番号６７１０５が授与されている。

第２図Ａおよび第３図に示されている配列と、寄託されたクローンｐＡＮＰＲｃ −１に含まれる配列との間の不一致に対して、後者はその範囲を含むように管理 されている。

亥ＩＬＬ 以下の実施例は、完全なヒトＡＮＰレセプターをコードする配列のクローニング を説明する。

ヒトＡＮＰレセプターのクローンを得るために、ヒトの腎臓のｃＤＮＡライブラ リーを、ウシのクローンのニックトランスレーションされたコード配列（１，４ ｋｄ断片：　ｐＡＮＰＲ−１）を用いてスクリーニングした。スクリーニングさ れた約１×１０６個のうち、４つが陽性であった。これらのうちの３つは、独立 した１０９６ｂｐ　（クローン１−１−１）　、　９２５ｂｐ　（クローン１２ −１−２）、およヒ８１３ｂｐ（クローン１６−１−１）の重複クローンであり 、ウシのクローンの１０８３ｂＰＴｉＪ域および２１２１ｂＰ領域と相同性を有 していた。

ウシのクローンの配列と比較すると、クローン１−１−１は１８７３の位置に３ ｂｐの欠損があり、示した３つのクローンは全て３′末端の非翻訳領域に同一の １２ｂｐ挿入部分を有する。３つのクローンは、いずれもｔｉｃｏＲ１部位で終 わっており、ポリＡティルを有していない。

約０．５　Ｘｌ０６個のヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーは、２８個のヌクレオ チドからなる２つのオリゴヌクレオチド（ヒトの配列の１１１９−１１４７ｂｐ および１１６６−１１９４ｂｐ）と、り０−７ｌ−１−１（ｐＡＮＰＨＲｃ２） のニックトランスレーションされた２４３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／　Ｓａｃ　Ｉ断片 とを用いてスクリーニングする場合、ウシのクローンの９６〜１７３２ｂｐｅＪ 域と相同性を有する１つの独立した１６３６ｂｐクローン（クローン４−２）を 与える。このクローンは、ウシのクローンと比較すると、　５５０ｂｐの位置に １２ｂｐの挿入部分を有し得る。

完全なコード配列を有するヒトのレセプタークローンｐＡＮＰＨＲＣ４は、クロ ーン４−２　（ｐＡＮＰＨＲｃｌ）の約１２５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｓａｃ　Ｉ 断片およびクローン１２−１−２（ｐＡＮＰＨＲＣ３）の約７００ｂｐ　Ｓａｃ 　Ｉ　／ＥｃｏＲＩ断片を、　ＥｃｏＲＩで消化し、　ＣＩＰで処理したベクタ ーｐＵｃ９に連結することにより調製される。第５図は、このヒトのレセプター クローンの配列を示す。この配列は、５′末端の非翻訳領域。

シグナル配列、開始Ｎｅｔ、コード領域、３′末端の非翻訳領域、そしてウシの 配列とのアミノ酸の差異を有する。

Ｅ、ｃｏｌｉ（ｐＡＮＰＨＲｃｌ）およびＥ、ｃｏｌ　ｉ　（ｐＡＮＰＨＲＣ３ ）は、微生物の寄託に関するブタベスト条約に基づき、　１９８７年５月８日に アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。これらの寄託に対して、 それぞれ受託番号６７４０１および６７４０２が授与されている。第５図に示さ れている配列と、これらの寄託されたクローンに含まれる配列との間の不一致に 対して、後者はその範囲を含むように管理されている。

実隻開Ｎ ここに述べられているＡＮＰ　レセプターが、　ＡＮＰ結合を示すことが知られ ている組織部分に見出されることを以下に示す。

クローン化された配列が、　ＡＮＰ　レセプターを有することが知られている組 織および細胞において発現されたがどうかを調べるために、ノーザンプロット分 析を行った。細胞系は。

１０％Ｃ）２とともに１０％ウシ胎児血清を含有するダルベツコの改変イーグル 培地中、３７°Ｃで集密的となるまで増殖させた。

ポリ（Ａ）　ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアナート法＋　Ｃｈａｒｇｗｉｎ ら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：５２９４−５２９９により単離し、引続 きオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーを行った。ＲＮＡは、５０’Ｃ でホルムアミドおよびホルムアルデヒドで変性させ９次いでホルムアルデヒドを 含有する１、４％アガロースゲルで分離し。

ニトロセルロースに移した。このフィルターは、　５０％ホルムアミドに５ｘｓ ｓｃを加えた溶液中で、ニックトランスレーションにより放射活性としたｐＡＮ ＰＲｃ−１挿入ＤＮＡにハイブリダイズさせた。フィルターを０．１％ＳＤＳを 加えたＩｘｓｓｃ中、６５°Ｃで洗浄し、オートラジオグラフィーにがけた。

クローン化された配列との相同性を有するポリ（１）含有ＲＮＡは、　ＡＮＰレ セプターを有する３つのウシ初代細胞系における別々の種として存在する。これ ら３つの細胞系は、大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）　、副腎皮質細胞（ＢＡＣ）、お よび大動脈平滑筋細胞（ＢＡＳＭ）であって、　ｃＤＮＡクローンはこれらの細 胞から誘導された。

腎臓および副腎組織はどちらもＡＮＰレセプターを発現するので、これらの組織 から単離したポリ（Ａ）　ＲＮＡを分析した。ウシ腎１１ｉ　ＲＮＡは９本質的 に同一のパターンを示す分画された乳頭および皮質のクローン化された配列との 相同性を有する別々のＲＮＡ種を有することが見出された。これらの結果は、　 ＵＶ−フォトアフィニティ標識化の研究と一致し、　Ｍｒ〜６０．０００のＡＮ Ｐ結合サブユニットが腎臓の糸球体および腎髄質集合管内部の領域の両方に存在 するということを示す。し力）しなめえら。

この分析では副腎全体から得たＲＮＡ中にレセプターのメツセージを検出するこ とが出来なかった。

ノーザン分析の結果は、培養細胞内に少な（とも４種類の別々のＲＮＡ種が存在 するということである。ＢＡＣ細胞およびＢＡＥ細胞のＲＮＡにおいて明白であ る主要なレセプターＲＮＡ　Ｌよ。

長さが約８０００ヌクレオチドであるが、約３１００ヌクレオチドのＲＮＡも検 出され、約４０００ヌクレオチドと約５０００ヌクレオチドの小さなバンドも見 られる。８０００ヌクレオチドのＲＮＡは、スプライシングされていないｐｒｅ −ｍＲＮＡではない。というのは。

このＲＮＡが、核ＲＮ＾を除去するために分画されたＲＮＡに見出されるからで ある。小さいＲＮＡは別々の分解産物でもなし）ようである。というのは、これ らのＲＮＡが、５′末端とポリ（Ａ）テイルの両方を有するからである。このこ とは、これらのＲＮＡが、５′コード領域または３′コード領域に対するプロー ブを用いて同様に検出され、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーに より単離されたという事実から明らかである。

ＡＮＰレセプターｍＲＮＡの不均一性は、異なる遺伝子の選択的スプライシング または転写の結果であり得る。異なる遺伝子種は、ハイブリダイゼーション洗浄 の厳密性を増加させることによっては区別され得ないので、それらは比較的拡散 した遺伝子の産物ではない。また、ヒト組織では単一のｍＲＮＡ種（約５６００ ヌクレオチド）のみが検出されていることがわかっているので、ウシにおけるレ セプターｍＲＮＡの不均一性は機能的に重要な意味があるのかどうか疑わしい。

レセプターｍＲＮＡ間で遺伝子種の長さの不均一性が頻繁に観察されるが、これ 番よ。

ＩＬ−２レセプターａ＋ＲＮＡについて示されているように、３′末端の非コー ド領域の長さの相違によるものであり得る。上記データ、およびＡＮＰ　レセプ タークローンの３′末端の非コード領域における２つの可能性のあるポリ（Ａ） 付加シグナＪしの存在は、　ＡＮＰレセプターｍＲＮＡの長さの相違が３′末端 の非コード領域の長さの相違によるものであるということを示唆している。

（以下余白） 実新Ｉ津ｙ この実施例では、異種哺乳類動物細胞における組換えＡＮＰレセプターの発現、 およびへＮＰレセプターｍＲＮへのインビトロでの転写について述べる。

ｐＡＮＰＲｃ−１／４が実際にＡＮＰレセプターをコードしていることを証明す るために、異なった系（ツメガエル（ｋ匹匹と）の卵母細胞）において特異的な ＡＮＰ結合誘発能力をテストした。

ｐＡＮＰＲｃ−１／４からのレセプターコード配列をｐＧＥＭＩ（プロメガ。

マジソン、訂）にクローン化し、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを調製した。

卵母細胞の調製および注入は、実質的にＧｕｒｄｏｎら（１９８３）、　Ｍｅｔ ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：３７０−３８０．に記載された方法により行 なった。典型的には、各卵母細胞に５０ｎ　１の合成ＲＮＡを含む５０ｎ　ｌを 注射し、修正パース生理食塩水中で２１゛Ｃにて４８時間インキュベートを行な った。粗製膜を調製し、レセプター結合バッファー（２■／　ｍｌ　Ｃｌ２Ｅｌ ＋、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇｃｔ、。

１０ｍＭ　ＣａＣ］□および１００＋ｎＭ　）リス：　ＨＣｌ、ｐＨ７，５）に 溶解させた。

０．５ｄの膜懸濁液〔１０ｎｇのタンパクと、２　ＸＸ１０５ｃｐの（＋２５ｔ ）ｒＡＭＰ　（Ｉ　Ｘ］、Ｏ’ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）および標識されていないＡＮ Ｐ類似物の指示された濃度とを含有する〕を２１°Ｃにて３０分間インキュベー トした後に、結合を測定した。反応を終結させ、結合物からアセトン（最終濃度 ４０％ｖ／ｖ）沈澱により、Ｔｉ離のタンパクを分離した。標識していないリガ ンドが存在しない場合の計数値は２０４８±３７４ｃｐｍであり、他方、非特異 的結合（２０ｎＭ　ｒＡＮＰの存在下で結合させたときの計数値）は５９２±８ ９ｃｐｍであった。ボンベシン（ベニンシュララボス）は、１００μＨにおいて さえも結合に関しての効果はなかった。

注入しない、もしくは擬似物を注入した卵においては、膜において、低レベルで 非特異的結合が検知されただけであった。しかし９合成ｍＲＮＡが注入された卵 母細胞の可溶化膜において、放射標識ＡＮＰの飽和性特異的結合は証明されなか った。

ｒＡＮＰ　（４−２８）　、および切形の類似物であるｒＡＮＰ　（４−２８） を結合に用いた。実験で得られた見かけのＩ、は２両者の類似物においていずれ も０．２７ｎＭであった。ボンベシン（無関係のテトラデカペプチド）が結合に 競合しなかったため、結合はＡＮＰ類似物に特異的であった。ｐＡＮＰＲｃ−１ ／４のＡＮＰレセプターコード領域のインビトロでの転写および、それに続く、 細胞を含まない網状赤血球ライゼート中での翻訳により次のことが証明された。

つまり、　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により判定されるように２ 合成ＲＮへは２機能性ｍＲＮＡをコードするＭｒ〜５８，０００のポリペプチド であることが証明された。

尖旋開且 この実施例は、実施例■、■または■により得られたコード配列の発現に有用な プロトコルについて述べる。

上述のように、ＡＮＰレセプタータンパクをコードするｃＤＮ＾クローンは１種 々の宿主において組換え体タンパクを生産するのに最も都合よ（用いられる。し かし、＠乳類系における発現が最も好ましい。なぜなら、天然に生産されるタン パクがプロセッシングされるのに類似して、宿主は、翻訳後ブロセッシングを行 うことができるためである。従って、　ｃＤＮＡまたはゲノム配列が使用され得 る。

完全長のｃＤＮＡ　（実施例■または■）またはゲノム（実施例■）　ＡＮＰレ セプターをコードするクローンが、宿主ベクターに挿入されるために、調製され る。クローン化された挿入物は。

該挿入物がそれ自身にＥｃｏＲＩ部位を有する場合には、　ＥｃｏＲＩで部分分 解し、切断される。必要に応じて、他の適当な酵素が用いられ得、該挿入物にＥ ｃｏＲＩ　リンカ−が供給される。次に、切断された挿入物は、後述のように、 宿主ベクターｐＨ３１に組み込まれる。

プラスミドｐＨ５１は、挿入されたＤＮＡを哺乳類宿主中で発現させるのに適切 である。このプラスミドは、　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｉｎら。

（１９８２）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９９：８０２）からのｈＭＴ−ＩＩ配列の８ ４０ｂｐを含有する。この８４０ｂｐは、ｈｌ’１Ｔ−ＩＩ遺伝子の一７６５位 の旧ｎｄＩ［［部位から＋７０のＢａｍ旧切断部位におよぶ。ｐＨ５１を構築す るために。

プラスミドｐ８４ＨをＢａｍＨＩで完全に分解し、エキソヌクレアーゼＢＡＬ− ３１で処理し、末端のヌクレオチドを除去し２次に旧ｎｄ■で分解した。所望の ５４ｏｂｐ断片をｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａら、　（１９８２）。

Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６８）　（Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉおよび１ｌｉｎｃＩＩ分 解で開環させたもの）に連結させた。この連結混合物を、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ ＢＩＯＩを形質転換してＡｍｐＲとするのに使用し、そして、候補となるひとつ のプラスミド（１１）ＩｓＩと命名する）を単離し、ジデオキシ法で配列決定し た。ｐＨ５１は、ポリリンカー（都合のよい制限部位を含む）の上流に、ｈＭＴ −Ｉ［制御配列を含む。

上記にて調製したＡＮＰレセプターサブユニットコード配列を、　ＥｃｏＲＩ分 解ｐＨ５１に連結し、連結混合物はＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を形質転換し Ａｍｐ”とするために用いた。成功裏に得られた形質転換体は、制限分析によっ てスクリーニングされる。所望のプラスミドを含む菌株、　ｐＭＴ−ＡＮＰｒを さらに増殖させて。

大量のプラスミドＤＮＡを調製する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）のに１細胞を、　Ｆ１２培地およびＤＭ Ｅ培地の１：１の混合物（ウシ胎児血清を１２％の割合で含有する）で培養する 。被感染能力を有する細胞をｐ？ＩＴ−＾ＮＰｙおよびｐＳＶ２　：　ＷＥＤ（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、（１９８２）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、工：３２７−３４１）により共形質転換する。ｐＳＶ２：ＮＥＯは 、ネオマイシン類似物Ｇ４１８に対する耐性を与える機能性遺伝子を含有する。

形質転換においては、５００ｎｇのｐＳＶ２−ＮＥＯおよび５ｌｇのｐＭＴ−Ａ ＮＰｒを、直径１６ｍｍのディツシュ中の細胞（Ｗｉｇｌｅｒら、　＜１９７０ ）　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７−７８５のプロトコルによるリン酸カルシウム−Ｄ ＮＡ共沈澱物中）に加える。このとき、該ＤＮＡに４時間さらした後、１５％の グリセロールと２分間インキュベートして°′ショック”を与える。１日後に、 この細胞を１■／ｄの６４１８と処理し、　Ｇ４１８抵抗性コロニーのプールを 得る。このプールはＡＮＰレセプターの産生について検定され、クローンが取り 出される。

ｐＭＴ−ＡＮＰｒの遺伝形質を安定に有する成功裏に得られた形質転換体を、ク ローン分離株を得るために、低密度で播種する。

これらの分離株を、ＡＮＰレセプター産生の簡便な検定のため。

１０−　’Ｍ塩化亜鉛にさらした後、マルチウェルプレートで増殖させる。ＡＮ Ｐレセプターの定量は、抗血清に対する標準ＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定法に より行なわれる。上記抗血清は、標準的な方法を用いて、適当なＡＮＰレセプタ ータンパクに対して調製される。所望のＡＮＰレセプターを大量に生産するクロ ーン分離株が選択される。

適切な条件下でＡＮＰレセプターを生産することが示される細胞を２次に、１０ ％のウシ胎児血清が加えられた基本培地にｌ／１０量で加え、−夜インキユベー トする。次に、塩化亜鉛をＩ　Ｘｌ０−’？から３　Ｘｌ０−’Ｍの範囲の濃度 で加えて、ＡＮＰレセプターの産生を誘発する。ＡＮＰレセプターのレベルは、 　ＺｎＣ１□が２Ｘ１０−’ＦＩ　という最適の誘発条件下において、７〜１０ 日間で上昇する。

必要に応じて、培地中に分泌されるＡＮＰレセプターは、天然型タンパクに対す るのと同様の上述の方法により、もしくは当該分野で既知の他の標準的な方法に より精製され得る。

ス呈拠■ この実施例では、原核細胞系においてＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを コードする。イントロンを持たない配列を発現するためのプロトコルを提供する 。

発現に都合のよい宿主ベクターはｐＫＴ５２である。このｐＫＴ５２は、“ｔｒ ｃ”プロモーターと、それに続＜　ＡＴＧ開始コドンとを有する。ｐＫＴ５２の 構築は、共同出願である米国特許出願第６１６．４８８号（１９８４年６月１日 出願）に開示されており、その内容はここに述べられている。簡単に述べれば、 このｔｒｃ”プロモーターは、上流部分にｔｒｐプロモーターを、そして下流の オペレーターを含む領域にはｌａｃプロモーターを有する。

そして、この’　ｔｒｃ”プロモーターは１本来は、容易に入手し得る２つのプ ラスミド（ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドおよびｌａｃプロモーターを 有するプラスミド）から調製された。ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩ［カセットと してｔｒｃプロモーターを構築するために、ハイブリッドプロモーターを有する 中間体プラスミドｐＫＫ１０−０を調製した。

ｐＫＫｌｏ−０を調製するために、　ｐＥＡ３００（Ａｍｍａｎら、　（１９８ ３）Ｇｅｎｅ２５：１６７−１７８）をＰｖｕ　ＩｆおよびＣ１ａ　Ｉで分解し 、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）の存在下でｄＣＴＰのみを用いて充填した。

次に、マングービーンヌクレアーゼを用いて分解し、大きなベクター断片を単離 した。このベクター断片は、上流部分にｔｒｐプロモーターを有する。この断片 を５ｓｂｐの平滑末端化Ｈｐａ　Ｉｆ　／Ｐｖｕ　Ｉ［分解物に連結する。ここ で上記平滑末端化Ｈｐａ　ＩＩ　／Ｐｖｕ　ＩＩ分解物は、　ｐＧＬｌｏｌをＰ ｖｕ　ＩＩおよびＨｐａ　■により分解し、　ｄＧＴＰおよび標識化ｄＣＴＰの 存在下で修復することにより調製されたｐＧＬｌｏｌ　（Ｌａｕｅｒら、（１９ ８１）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、土：１３９−１４７）から 切り出された。この断片はｌａｃオペレーター領域を有する。これら２つの平滑 末端断片の連結生成物がｐＫＫｌｏ−０であった。

Ｂａｍ旧部位をｐＫＫｌｏ−０のｔｒｐ／ＬＡＣ（ｔｒｃ）プロモーター／オペ レーターの上流に挿入した。この挿入は、　ＥｃｏＲＩによって分解し、クレノ ーで充填し、　ＢａｍＨＩ　リンカ−５’　−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’を挿 入することによりなされた。得られたプラスミド、　ｐＫＫｌｏ−１をＰｖｕ　 ＩＩで分解し、Ｎｃｏｌリンカ−５′−八ＣＣＡＴＧＧＴ−３’に連結し。

Ｎｃｏ　Ｉで分解し、充填し、そして次に、Ｐｓｔｌおよび旧ｎｄｌＩ［部位を 含む二本鎖リンカ−（５’−ＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ−３’および その相補体である２つの相補オリゴヌクレオチドとして示される）に連結した。

この連結混合物を、　Ｅ、　ｃｏｌｉを形質転換してＡＩＩＩｐＲとするために 使用した。単離されたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよび旧ｎｄＩＩ［で分解 する。電気泳動により得られたＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ｍの小断片はｔｒｃプロ モーターを含む。

ｐＫ１５２を完成させるために、　ｔｒｃプロモーターを含むＢａｍＨＩ／Ｈｉ ｎｄＩ［断片を、　ｐＫＫｌｏ−２（Ｂｒｏｓｉｕｓ、（１９８４）　Ｇｅｎｅ 　２７：１６１ｌ６１−１７２）（Ａ遺伝子および複製の起点を含む）のＢａｍ ＨＩ／）ｆｉｎｄ　Ｉ［１分解により得られる大断片へ連結した。得られたプラ スミドｐＫＫ２３３−１をＰｖｕ　Ｉで完全に分解し９次にＢｇｌ　Ｉで部分的 に分解し、　３ｓｏｂｐのＰｖｕ　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｉ断片に連結する。、この３ ６０ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｉ断片は、アンピシリン耐性遺伝子に相当す る部分を有するが。

ｐＬｌｃ８からのＰｓｔＩ部位を欠く。この連結混合物を、　Ｅ、ｃｏｌｉを形 質転換するのに用いた。そして形質転換体を、スクリーニングし、ｔｒｃプロモ ーターの隣のＰｓｔＩ部位がただひとつ存在するものを選択した。ρＫＫ２３３ −２　（これは上記条件に合致する）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　ＩＩで分解し 、　ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰで充填する。そしてこれを再連結し、正確な構造の ｐＫＴ５２　（所望のｔｒｃプロモーター、下流のＡＴＧ開始コドン、および下 流のＮｃａｌ。

ＰｓｔＩおよび旧ｎｄ１１１部位を有する）を得た。

発現ベクターの構築については、レセプターをコードするｃＤＮＡを、　Ｅｃｏ ＲＩまたは他の適当な酵素を用いた分解による切り出しにより、そして必要に応 じて適当な断片を修飾することにより得られる。ｐＫＴ５２に挿入するために３ ′末端が調製される。この３゛末端は、終止コドンの下流を都合のよい制限部位 において切断し、そしてＰｓｔｌまたは旧ｎｄＩ［［リンカ−を供給することに より調製される。５”末端は、コード配列の内部を切断し９合成りＮＡを用いて 欠失コドンおよびＮｅｏ　１部位を補充することにより、または、突然変異誘発 によりＮｃｏ　１部位を適切に配置することにより調製される。得られるＮｅｏ 　Ｉ　／Ｈｉｎｄ　ｍまたはＮｅｏ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ断片を９次に、ＮｃｏＩ ／旧ｎｄｌｕ分解ｐＫＴ５２またはＮｃｏ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ分解ｐＫＴ５２に 連結すると、ＡＮＰレセプターをコードしＡＴＧ開始コドンを有するｃＤＮＡが リーチングフレーム中に得られる。

バクテリアにおける発現については、得られたベクターは。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１または他の適当な宿主細胞をＡｍｐ”に形質転換 するのに用いられる。そして、形質転換された細胞を１次に、１ｍＭのＩＰＴＧ を含むＭ９培地で３〜５時間にわたり増殖させ。

０、Ｄ、を０．２〜０．５とする。（ここで、　ＩＰＴＧは、ｌａｃオペレータ ーにより制御される制御配列についての標準的な誘発物質である。−）次に、こ の細胞を回収し、音波処理によりもしくは５％トリクロロ酢酸との処理により溶 菌させる。そして。

細胞抽出物を所望のＡＮＰレセプタータンパクについての検定を行なう。レセプ タータンパクは、天然型タンパクに用いられる方法、もしくは当該分野で知られ る他の方法により、上記抽出物から精製される。

実上開■ この実施例では、ヒトゲノムライブラリーをプローブし。

ＡＮＰレセプタータンパクをコードするクローンを得る方法に１１５７−１１７ ４に記載されているように、λＣｈａｒｏｎ　４Ａに組み込んで調製する。ｃＤ ＮＡ挿入物のウシ血管ＡＮＰレセプターをコードする部分（実施例■）を、プロ ーブとして用いるために調製する。この部分は、　ｐＡＮＰＲ−１がらｃＤＮＡ を切り出し、単離された挿入物またはそのある部分をニックトランスレーション することにより、調製される。ｃＤＮＡプローブを、実施例■で５１ヌクレオチ ドのプローブについて述べたのと同じように。

約１００万個の組換え体ファージを含むフィルターにハイブリダイズさせる。実 施例■と異なるのは、ハイブリダイゼーション混合物がホルムアミドを４０％の 割合で含み、そしてフィルターを４５゛ｃで一定に一夜保ったことである。これ らのフィルターを次ニ、０．１％ＳＤＳを含む２　Ｘ５ＳＣテロ５°ｃにて１時 間にわたり洗浄する。ヒトＡＮＰレセプター配列を含む組換え体ファージは、プ ローブに強くハイブリダイズするファージである。

関連するレセプター遺伝子もまた。同様のハイブリダイゼーションおよび洗浄条 件を用いることにより同定され得る。

ここで異なるのは、ハイブリダイゼーションの温度が３５°Ｃであり、洗浄温度 が５０°Ｃである点である。ゲノムＡＮＰレセプクー遺伝子を含み強くハイブリ ダイズする陽性のものが残留する。他方、より弱くハイブリダイズするプローブ は関連するレセプターであることが示される。

もし陽性のものが認められない場合には、適当なスクリーニングの条件を決める のを補助するために、サザンハイブリダイゼーションが使用され得る。第１に、 サザンハイブリダイゼーションは、■レーンあたり１ｏｕｇのヒトＤＮＡを用い て行なわれる。このヒトＤＮＡは９種々の制限酵素（例えば、　ＥｃｏＲＩ＋Ｐ ｖｕ　■、　ＢａｍＨＩおよび旧ｎｄＩ［［）で分解されている。次に、フィル ターに、最も苛酷でない条件（３０％ホルムアミド）でハイブリダイズさせ、上 述の苛酷でない方の洗浄条件（５０”Ｃ）で洗浄する。サザンハイプリダイゼー ションのレーンが、バックグラウンドを越えるはっきりとしたハイブリダイゼー ションの条痕を示さないときには、複数個のバンドが出現するまで、洗浄の温度 を調整する（６５’Ｃまで）。あるバンドは強く、そしであるバンドは弱い。こ れらは、それぞれ相同性レセプターに対する遺伝子および関連するレセプターに 対する遺伝子を示す。サチン法において先に行なったものよりも高濃度（例えば ４０％）のホルムアミドがハイブリダイゼーション混合物に含有され、これを先 のサチン法に用いられた温度で洗浄すると、低バツクグラウンドでありより強い バンドだけが現れる明瞭なバンドが得られる。より弱いバンドがまだ現れるなら ば、ホルムアミドをさらに高密度１例えば５０％。

に調整することができる。

従って、＠乳類動物のゲノムライブラリーは、上述のサザンハイプリダイゼーシ ョン法により規定された適当な条件によりスクリーニングされ得る。上記スクリ ーニングで単離されたＡＮＰレセプタータンパクのゲノムコード配列は９次に。

実施例■で述べられている発現のプロトコルに用いられ得る。

尖旌拠■ この実施例は、ＡＮＰレセプタータンパクに対するモノクローナル抗体の生産に 有用なプロトコルを提供する。

ハイブリドーマは、抗原により刺激されたＢ細胞から１組織培養により調製され 得る。まず、胸腺細胞−調整培地を調製する。４〜６週令の遺伝子導入マウス（ 例えばＢａ１ｂ／ｃおよびＣ５７）の２つの胸腺を、標準培地（１：１．　ＤＭ ＥＭ：ＲＰＭＩ培地に１％（ｖ／ｖ）の割合でＮｕｔｒｉｃｙｔｅ＠　（Ｅｎｚ ｙｍｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）が加えられた培地〕中でインキュベートする。４８時間イ ンキュベートした後、この培地を２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離し、細胞ベ レットを廃棄する。一般的な方法については、　Ｌｕｂｅｎ　ら、（１９８０） 、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１７：６３５−６３９を参照されたい。

胸腺−調整培地１部を２次に、Ｎｕｔｒｉｃｙｔｅ■が加えられた標準培地２部 と合併し、最終容量を約ＬＭとする。

次に、精製ＡＮＰレセプタータンパク０．０５〜１．０ｄｇを加える（実施例Ｉ ）。この混合物を次に、　ＣＯ２−加湿インキュベーター内で３７°Ｃにて９６ 時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、標準的な方法により 、活性化Ｂ細胞を適当な相手（例えば、　Ｐ３Ｘ６３八ｇ８．へ５３またはＳｐ ２１０−Ａｇ１４　）と融合させて、ハイブリドーマを生産する。例えば、　Ｋ ｏｈｌｅｒら、（１９７５）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４８５−４９８を参 照されたい。成功裏に得られたハイブリドーマを、所望のモノクローナル抗体の 産生について１通常の方法により、スクリーニングを行なう。例えば、米国特許 第４，５６２．００３号を参照されたい。

尖旌炎Ｘ この実施例は、サンプル（例えばヒトの血液）中のＡＮＰ活性を測定する定量法 を提供する。

純粋なレセプターの凍結試料（実施例Ｉ）を適当な緩衝液（例えば、　１００ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ＋　ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ］、　１０ｍＭ　ＣａＣ１， 。

１０ｍＭ　ＭｇＣｚ＋　２ｍｇ／ｄ　Ｃ＋ｚＥｓ）で希釈し、　”’Ｉ−ＡＮＰ 結合部位約０．５ｐモルに相当する量を試験管に分注する。次に、　”５ｌ−Ａ ＮＰ（４，ＯｎＭ、比放射活性−２００ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）を含む約０．５ｄの 結合緩衝液を加える。種々の濃度の未標識ＡＮＰ（０，０５〜１００．ＯｎＭ） を使用して、標準曲線を描く。次に、未標識のＡＮＰＯ代わりに未知の試料を加 える。遊離リガンドからのレセプター結合！２５１−ＡＮＰの分離は１次のよう にして行なう。つまり、アセトンを加えて（最終容量を３７％シ／ｖ）、４°Ｃ にて５００Ｘｇで１０分遠心分離し、上清を吸引することにより行なう。これら の試験管はγ線計数装置で計数され得、標準競合曲線が作成され得る（第１図参 照）。

上記実施態様の修正は明らかに容易であり、当業者の技術範囲内にある。本発明 の権利は、クレームの範囲のみにより限定される。

ＦＩＧ、　１ 、、、無８ｐ舒　８　優　８　起　８　ま　δ　ヨ　葺ｒ−ｍ　（Ｎ　Ｆ’ｌ　 Ｍ　＜　Ｉ／ｌ　ψ　ψ　へ　ψ　０　■　−−−ｇ２　ｇ　２　８Ｆｌ：ｌ　 ｏ　２　８　Ｅ　５＜　２　８ｇｗ５＜ＮＦ’＋　４　１１ｆｆｉ　い　ψ　へ 　の　ロ　■　Ｑ　＋ｌ　−ａｎ起８ρｏ４８ま８℃８訳に８３８圀 Ｉ＋１４　＋ｔｆｆｉ　ｔｏ　Ｆ＋　８　ｅｏ　Ｏｔ　Ｏ０−１−Ｊ　Ｆ’ｌ　 ｍ　４　＋／１Ｉ＼イドロノ？シシカ ＦＩＧ、　５−１ １０　２０　３０　４ＯＳｏ　６０　７０Ｇ八ＡＴ７ＣＯＣＡＴ　ＧＧＴＣＧＡ ＣＴＡＣＡＣＧＣＣＣλ人入τ　λ入ＧＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣ丁八ＡへＣ入入　 入へＴＡＧＣ丁＾丁へ@丁ＧＴ＾丁へ入ＡＣＧ ＧＡＧＧＯＣＧｋＡｒ　Ａ？Ａ丁八Ｃへ＾Ｇ丁　＾丁ＡＴＡＴＡＴＡＴ　ＧＴＡ ？Ａ丁丁ＡＣＡ　ＣＡＣＧＣＡＣＡＧＧ　ＴＴＴ＾ＣＡＣＣbＧ　Ｇ丁Ｇ入ＡＣ ？Ｔ丁丁 〒Ｃ丁丁’ｒＴＴｃＴＴ　ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＡＡＧ ｋｋｋＡＡＣτ　＾Ｇ丁Ｇ＾Ｃ八へ丁Ｇ　ＣＡＧ入Ｇ入入Ｇf＾　ＣＧＣＴＴＣ ＣＴＣ丁 ＣＴ＾丁ＣＴＴＴＴＧ　ＧＣ（、ＣＡＴＴＡＧＴ　ＧＡＡＧＧＧＧＧ丁＾　丁丁 Ｃ？Ａ？丁ＴＴＧ　ＴＴＡＡＡＧＣＧＣＣＣｋＡＧＧＧＧＡbＣＧＧＧＭＣＣＴ ＴＧ ２９０　３００　３１０　３２０、　３３０　３４０　３５０ＧＡＧＡＧＡＡＧ ＡＧ　ＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡ　ＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧ　ＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧ　 ＧＣＡＧＡＧＧＧＣＧ　ＡＧＴＣＧＧＣＧfＣＧＧＣＧ＾ＧＧＧＣＡ λＧＣＴＣ丁丁丁ＣＴ　ＴＧＣＧＧＣＡＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ 　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＣＡＣＴ　ＴＴＣＴＣＣＣＣＧ　ＴfＣＧ丁＾ ＭＥＴ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　 ５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｖａ１Ｃ丁＾　ＣＴＣＧ（ｉＣＴＧＧ　ＧＣＧ　ＴＴ ＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡｃｅ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＴ　 ＧＧＣＧＧＣＬ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　丁ｔｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　１．、ｅｕ　 ムｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　丁ｈｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｖ≠戟@ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ ４〕４　４１１９　５０４ ＧＧＣＧＧＣＧＧＴ　ＧＧＣＧＣＧ　ＧＧＣ＾ＴＡ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＡ　ＣＧ ＣＣＡＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＣＧＴＧ　ＣＣＧＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ@Ｖａｌ　Ｐｔ。

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Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）レセプタータンパ クサブユニットを含む細胞非含有組成物であって， 該レセプタータンパクサブユニットが約６０，５００ダルトンの分子量を有し， 該組成物中のタンパクの最低約７５重量％を含有する，組成物。
2. ２．前記レセプタータンパクサブユニットがウシＡＮＰレセプタータンパクサブ ユニットである請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．前記レセプタータンパクサブユニットがヒトＡＮＰレセプタータンパクサブ ユニットである請求の範囲第１項に記載の組成物。
4. ４．前記レセプタータンパクサブユニットが合成ＡＨＰレセプタータンパクであ る請求の範囲第１項に記載の組成物。
5. ５．タンパク結合心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）を含む細胞非含 有組成物であって、 該タンパクが，（ｉ）哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユ ニットと，アミノ酸配列に関して少なくとも約７５％の相同性を有し，（ｉｉ） 二量体の形で可溶化された場合に１０ｎＭまたはそれ以下のＡＮＰ（４−２８） に対する結合親和性を示し，そして（ｉｉｉ）該組成物中のタンパクの最低約７ ５重量％を有する，組成物。
6. ６．天然型のＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法であって： （ｉ）ＡＮＰレセプターを有する哺乳動物細胞から調製される膜含有細胞画分を 与えること； （ｉｉ）該膜画分中のＡＮＰレセプタータンパクをＣ１２Ｅ８界面活性剤を用い て可溶化し，該ＡＮＰレセプタータンパクを含有する上清を調製すること；およ び （ｉｉｉ）該上清を，固定化ＡＮＰを含有するクロマトグラフィーカラムに，該 ＡＮＰレセプタータンパクが該固定化ＡＮＰに結合するような条件下で通過させ ，次いで結合したＡＮＰレセプタータンパクを該カラムから溶離し，精製された ＡＮＰレセプタータンパクを与えることによって，該上清からＡＮＰレセプター タンパクを精製すること，を包含する方法。
7. ７．ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列を単離する方法であって ： （ｉ）哺乳動物の細胞源から調製されたＤＮＡライブラリーを与えること； （ｉｉ）ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットの選択された領域との祖同性を 有するアミノ酸配列のコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブ リダイゼーションすることによって，該ＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ること；および （ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドが選択的にハイブリダイズするＤＮＡ分子を該 ＤＮＡライブラリーから単離すること，を包含する方法。
8. ８．組換えベクターを含有する組成物であって，該ベクターが哺乳動物の６０． ５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有するアミノ酸配列 をコードするＤＮＡ配列を含み， 該ＤＮＡ配列を含まない組換えベクターを実質的に含有しない，組成物。
9. ９．哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性 を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子であって， 該アミノ酸配列をコードしないＤＮＡ分子を含まない，ＤＮＡ分子。
10. １０．選択された宿主細胞を形質転換し得る組換えＤＮＡベクターであって， 哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有 するアミノ酸配列をコードするＤＮＡコード配列を含み， 該コード配列が，該ベクターによって形質転換される宿主細胞内で転写されるよ うに，該ベクターにおいてＤＮＡ制御配列に関連して位置決めされている，組換 えＤＮＡベクター。
11. １１．前記宿主細胞が原核生物細胞である請求の範囲第１０項に記載のベクター 。
12. １２．前記宿主細胞が真核生物細胞である特許請求の範囲第１０項に記載のベク ター。
13. １３．請求の範囲第１１項に記載のベクターによって形質転換された原核生物細 胞，またはその子孫。
14. １４．請求の範囲第１２項に記載のベクターによって形質転換された真核生物細 胞，またはその子孫。
15. １５．請求の範囲第１２項に記載のベクターによって形質転換された哺乳動物細 胞，またはその子孫。
16. １６．ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを生産する方法であって， 請求の範囲第１３項に記載の細胞を，ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを 含むペプチドが発現される条件下で増殖させること，および 該ペプチドを回収すること，を包含する方法。
17. １７．ＮＮＰレセプタータンパクサブユニットを生産する方法であって， 請求の範囲第１４項に記載の細胞を，ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを 含むペプチドが発現される条件下で増殖させること，および 該ペプチドを回収すること，を包含する方法。
18. １８．抗ＡＮＰレセプタータンパク抗体を含有し，他の抗体を実質的に含有しな い組成物。
19. １９．請求の範囲第１８項に記載の抗体を生産する哺乳動物の永久増殖性細胞系 列。
20. ２０．ＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法であって：（ａ）該レセプター タンパクを含有する溶液を与えること；（ｂ）該溶液を，請求の範囲第１１項に 記載の固定化抗ＡＮＰ抗体と接触させること； （ｃ）該接触工程の後に，該溶液から該固定化抗体を分離すること；および （ｄ）該分離工程の後に，該固定化抗体からＡＮＰレセプタータンパクを回収す ること，を包含する方法。