JPS58162599A - 雑種ｄｎａおよびそれにより調製される結合性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物の免疫機構は、特定の分る構造に対し非常に高
い特異性を有し、免疫グロブリンとして知られる蛋白性
化合物を産生ずる広汎な節力として特徴づけられる。す
なわち、これら蛋白質は特異的に特殊構造を補えうるよ
うな構造を有するために、高親和性をもった結合が生じ
る。このように、哺乳動物の免疫機構は、異分子、特に
は、微生物の膜表面の特異蛋白質、および毒物の侵入に
対し応答できることすなわち宿主に対し不利に作用する
ことなく侵入物の無毒化あるいはそれの破壊をもたらす
ことである。

免役グロブリンの防御機構は主としてガンマ−グロブリ
ン（ＩｙＧ）に由来する。本免疫グロブリンは約１５０
，０００ダルトンの糖蛋白質であり、重（刊鎖と軽（Ｌ
）＠のそれぞれ２本ずつからなる４本鎖構造を有する。

６鎖は、可変領域と定常領域とを有している。可変領域
は、免疫グロブリンの結合特異性に関係しており、一方
定常領域は抗体の親和性とは直接関係しない他の多くの
機能を有している。

多くの情況下で、免疫グロブリンよりも十分に小さいが
免疫グロブリンが有する特異性と郭和性をもった結合性
分子が願望されている。より小さい分子は哺乳類宿主に
おいてより短期間の滞在時間を提供しうる。さらには、
免疫グロブリンを他分子へ結合させる必要のある場合、
しばしば貴終生成物をできるだけ最小サイズにすべきで
ある。

また、より巨大な分子の機能を満たしているより小さい
分子を産生じうろことは多くの経済性がある。

多数の分子が高密度で一緒に保持されることが願望され
ろような情況が存在する。より小さく・分子であること
は、より狭い範囲により多くの分子を一度に搬入しうる
。さらにしま、結合分子がＤＮＡ混成法によって調製し
うる場合、ある本の１ま仙のポリペプチド類の広汎な種
類に対する本分子の結合部位と結合する機会を有す、そ
れ故にポＩＪ　イプチド鎖の一グ、“、ｊあるいは両端
において共有結合した結合分子を有しうる。

生体内で免疫グロブリンが診断、ある〜・は治療に用い
られる場合、異種遺伝子宿主あるいはモノクロナール抗
体由来の抗血清はイムノジエンでありうる。さらには、
他分子と抗体との接合がなされる場合、生じた接合は免
疫原および免疫グロブリンの定常領域あるいは他のいず
れかの部分に対する抗体を宿主に誘発しうる。

したがって、以上のような結合性分子から構成されかつ
、特殊な抗体あるいはリガンドに対し高い特異性を有す
るが完全免疫グロブリンにはなりきれずまた低分子が故
の多くの利点を有するような均一な組成物を調製しうる
方法を発展させることが重要である。

免疫グロブリンのＨおよびＩｄｌ上の可変領域について
の議論は、Ｅ３ｈａｒｏｎおよびＣｒ１ｖｏｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ（１９７６年発行）１５巻９頁１５９１−１
５９４゜ＲｏｓｅｎｂｌａｔｔおよびＨａｈｅｒ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　（１９７８年発行）１７巻９頁３８７７
−３８８２、およびＥａｒｌｙおよびＨｏｏｄ、　Ｇｏ
ｎｅｔ、ｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｔｎ！（１９８１年廃
行）６巻１頁１５７−１８８にお（・て見い出しうる。

細菌性クローン中でのマウス費疫グロブリンＬ鎖の部分
合成ばＡｒｎ５　ｔ　ｅ　ｒ等がＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　（１９８０年発行）８券頁２０５
５−２０６５において開示している。特殊な方法および
組成物に関する明細書から種々の参考文献が引用されて
いる。

したがって本発明はある免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ
鎖の可変領域に限定された均一なｉ、ｆｆｌ物として提
供された新規蛋白性化合物に関するものであり、この場
合これら化合物は、別個にあるいは共に既決のハプテン
部位において％髭な結合性によって抗体と化合物を形成
する。このような均一な組成物は、本質的には、既決の
りガントと特異結合性を有する免疫グロブリンの可変領
域の一部と少くとも同じアミノ酸組成だが、定常領域の
それは欠如した２本のポリペプチド鎖からなる特異結合
性組成物の形であり、この場合前記２本のポリペプチド
″′釦は、前記既決のリガンドに対し高親和性と特異性
とを有する化合物を形成するに係わる。

本ポリＡプチト５Ｉ１１は、遺伝子操作された微生物の
培養によって調製されうる。ＤＮＡ混成法を用いること
で、ｃＤＮＡではＬ鎖およびＨ釦の可変領域と無関係な
ヌクレオチド８類が除去される。除去操作されたｄｓ　
ｃＤＮＡは後に転写および翻訳のため宿主へ導入される
適当な表現Ｒフタ−へ挿入される。ここで生じる切断さ
れたＬ鎖およびｉｌｌは少くとも可変領域の大部分を限
定するとともに抗体あるいはりガント８のハプテン部位
において高親和性で特異結合できる化合物の形成に係わ
る。結合定数は、一般には１０　以上であり、通常は１
０６　より大きく、さらに好ましくは１０８以上であり
うる。

通例、Ｌ鎧およびＨ釦可変領域のポリはプチド錯は、リ
ガントゝへの結合に共に係わり５ろ。しかしながら、論
議中のりガントゝに対しもしも１本鎖が十分な結合親和
性を有するならば例外的に１本鎖が使用可能でありうる
。

別個にあるいは共同して本発明の組成物を提供する２本
鎖ポ、りはプチトゝは、免疫グロブリンの結合部位と類
似したレセプタ一部位を形成しうる。

本組成物は、個々の鎖ではＬ−ｒＦｖあるい＆’！Ｈ−
ｒＦｖとして表現されるｒＦｖとして留意されるべきで
ある。Ｌ−およびＨ−の名称は通常は軽および重をそれ
ぞれ意味するといえる；時おり、本２本論は同一すなわ
ちＬ鎖かあるいはＨ舒配列由来でありうる。本ｒ’ｆｒ
ｖのポリペプチド句は、一般に１２５アミノ酸残基より
少なく、より一般的には約１２０残基よりも少く、一方
６０残基以上、通常は約９５残基以上であるべきである
。望ましくは、Ｈ−ｒＦｖ　は、約１１０から１２５ア
ミノ酸残某、一方Ｌ−γＦｖ　は、約９５から１１５７
−ノ岬残基であるべきである。

アミノ酸組成は、含まれる特殊なイディオタイプに依存
して種々変化しうる。通常、約６０から７５アミノ酸残
基によって隔てられた少くともシスティン２残基が存在
するがジスルフィド結合（シスチンの形成）によって結
合されトゝメインの定義を与えるようになる。２本鎖は
通常免疫グロブリンのし鎖および１１の可変軸域イディ
オタイプの実質的複写物でありうるが、ある情況下では
、Ｌ鎖あるいはＨ鎖の可変部の糾合せでも十分でありう
る。

しばしば、一方または双方のｒＦｖｄは；例えば放射性
同位体、螢光物質あるいは毒素により、標識されるかあ
るいは、合成有機ポリマー類、多糖類、天然に存する蛋
白質あるいは他の非免疫原性物質のごとと生理学的に受
容される不活性支持体に結合されることが望ましい。

時として、例えばＣ−末端のシスティン残基において２
本鎖間で共有性架橋結合を与えることが所望されうる。

本２本鎖は通常定常領域の自由性を作製しうる；Ｊ領域
は部分的に、または全体的に存在しうるかまたは存在し
えない。Ｄ領域は通常、Ｈ−ｒ　Ｆ　ｖ　の転写におい
て関与されうる。

一般に、γＦＩＪのイディオタイプからイディオタイプ
に対して全アミノ酸の相対的に微少なパーセントが変化
するにすぎない。それ故に、相対的に不変の骨格を提供
する区域、言い換えれば、高度に変化しうる部位に変化
させうる区域が生じる。

ｒｆｒυのＣ−末端部位は、Ｎ−末端よりもより多様な
配列をもちうるし、さらには、本発明に基いて、天然の
Ｈ鎖およびＬ鎖より多様性をもつようにさらに修飾され
うる。合成オリゴヌクレオチドは、高度に変化しうる部
位において異るアミノ酸類をコード化する突然変異を誘
発するよう使用されうる。

ＤＮＡ混成法によるｒＦｖの調製は、最初は平易にその
後非常に詳細に記述されるであろう。

高結合力親和性を有する均一なｒＦｖを提供するため、
哺乳類免疫機構を出発点として使用しうる。

混成細胞あるいは他のモノクロナール抗体−産生細胞、
由来のｍ−ＲＮＡは単離された後、免疫グロブリンのＬ
鎖および／またはＨ鎖をコードするｃＤＮＡ転写物を調
製するに使用される。上下流両方向の配列に基いて、可
変領域とコードしたＤＮＡの出発（たぶん先頭部位を含
む）および終末部にお（・ては、少くともこれら配列に
対し補足的である短いＤＮＡ配列（オリゴヌクレオチド
）は初期の修復あるいは試験管内突然変異誘導に対して
無関係の脇側領域を除去するためおよび翻訳すべきコン
トロール信号を誘導するに用いられる。本試験管内突然
変異誘導は、ｃ　ＤＮＡ鎖の一方と異質複式で・あるオ
リゴヌクレオチドがＤＮＡｙｔ２リメラーゼ１０Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片と共に使用される。初期修復は、同一酵素と
共に均一複式のオリゴヌクレオチドゝを必要とする。本
過程は２度（便宜上、１度はコードストランドさらに１
度は非コートゝストランドでもって）既決された部位で
翻訳される調節信号を有する可変領域をコート８するｄ
ｓ　ＣＤＮＡを提供すべく運用される。本ｄｓ　ＣＤＮ
Ａは、例えばプラスミドのような適当なベクターへ自己
複製ができかつ複製、選択および表現に対し正確な制御
信号を有する混成ベクターを提供するべく導入される。

本混成ベクターはその後ｒＦｖのＨあるいはＬポリ啄プ
チド釦の可変領域を表現すべく適当な宿主へ導入され、
さらにポリペプチド類が単離される。

ｒＦｖのＨおよびＬ　、ｔ？１７　Ｒプチド組成物の可
変領域はその後ｒＦｖを形成するよう適当な培地に添加
される。

イディオタイプが変化することから、本発明の配列工程
では非常に多様な可変領域配列の取扱℃・が再伸、であ
る。また、ｄｓ　ＣＤＮＡおよびベクターレま、特には
促進因子として使用される制御信号として最大既刊用す
べく合せられうる。リポソーム結合部位および可変領域
開始コドンは、可変領域ポＩ）　ｋプチドの表現を最大
限利用で踵るよう正確に空間をつくられうる。

正確な配向性で可変領域コード配列を含む混成はフタ−
はそれを表現すべく適白な宿主へ形質転換のため使用さ
れる。ここで得られる形質転換体は、ベクター中に存在
する指標の強さによって選択され、その後クローン化し
てさらに群間される。

形質転換体によって産生されたポＩＪ　Ｋプチドは細胞
外へ分泌される場合、細胞と上清の分離により単離され
うる；あるいは本ハリ深プチドが分泌されない場合、形
質転換細胞シー分離、溶解され、その後ポリペプチドは
回収される。可変領域Ｊ＋）ペプチドを多、く含む分画
け、ゲル電気泳動、分別沈殿法、アフィニティークロマ
−トゲラフイー、高速液体クロマトグラフィーあるいは
これら類似法のような種々の通常の手法によって調製し
うる。いずれにしても、初期の溶解質、あるいは上清、
さもなくばそれらの濃縮分画について、免疫学的分析に
よって可変領域ポリ啄プチドの含有の有無が検討されう
る。

分泌されたＨ鎖あるいはＬ鎖は、以下のごとく単離され
うる。モノクロナール免疫グロブリンに対するポリクロ
ナール抗血清は、ＨａおよびＬ鎖決定基を認識する抗血
清を調製するため、全モノクロナール抗体で適当なを椎
動物を免疫し調製し５る。全免疫グロブリンあるいはＬ
鎖またはＨ鎖のみを認識する抗体類は十分に抗血清中の
他の抗体類から分離、精製されうる。免疫グロブリン全
体、あるいはＨ鎧またはＬ鎖のみの適当な支持体への共
有結合物を含有するアフィニティーカラムへ結合および
溶出させることで免疫グロブリン全体、あるいはＨ鎖ま
たはＬ鎖それぞれに対する抗体類は、本カラムへ結合す
るようになる。本カラムは変性され、さらに精製された
抗体類は回収されその後ｒＦυのＨ鎖またはＬｎを精製
するためのアフィニティーカラムを調製するため適当な
支持体へ結合される。

Ｌ釦またはＨ釦が分泌されない場合、ＬｍまたはＨ鎖に
対する適当なｄｓ　ｃＤＮＡを含有する形質転換された
微生物を液体培地で成育し、さらに清澄な溶解質が例え
ば微生物をリゾチームでＭＩＬ理し細胞膜を破壊した後
、遠心分離し上清を集めることで調製される。本溶解質
をその後、ポリクロナール特異血清を用いて上述のよう
に調製した免疫吸着アフィニティーカラムの中を通過さ
せる。結合した可変領域は本カラムから適当な変性用溶
媒で溶出される。ＨｇおよびＬｆｉそれぞれからの溶出
液は集められその後それぞれＬ−ｒＦｖおよびＨ−ｒＦ
ｖ　　を形成するようにポリペプチド類を性仙回復させ
る。性質回復のために、まとめた溶出液は、適当な緩衝
液に対し透析されうる。その後本混合液は適当なりガン
ト９−カラムを通過させることで精製されさらに結合し
た分子は、適当な変性用溶媒で溶出される。その後、可
変領域は既述のごとく種々の目的に用いられるｒＦｖｓ
溶液を提供すべく性質回復される。

本発明によれば、分子は免疫グロブリンの特異性を保持
したままに免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ鎖の可変領域
で２本領ポリペプチド類として提供される。定常領域が
欠如する場合、ｒＦｖｓは弱い免疫原でありそのために
投与されるべき宿主にとって異常遺伝子的である起源か
ら調製される。さらには、本ｒＦｖｓは不均一混合物と
いうよりはむしろ均一な混合物である（種々の長鎖な含
むと思われる不均一混合物１′！、酵素消化および酸処
理のような他の手法で調製されうる）。本発明の組成物
の均一性は一様な修飾および正確な治療効果を測定させ
ろようになる。さらには全免疫グロブリン由来のはプチ
ド鎖の混在物を含まないがこの場合免疫グロブリンが不
十分に分解されると免疫認識部位を保持するかあるいは
、新規免疫認識部位を被うことがない。最終的に多量の
所望するｒＦｖｓが高収率および高純度で調製されうる
。

さらには、本発明は、前記γＦｖｓをコード化するｄｓ
　ＤＮＡ配列を運搬する適当な形質転換された表現ベク
ターまたはプラスミド８を；当該はフタ−を運搬する形
質転換された宿主（たとえば大腸…またはクースト菌の
ごとき細菌）を；当゛該形質転換されたばフタ−やプラ
スミドの調製法を；さらには当該形質転換済の宿主の培
養により前記ｒＦｖｓの調製法を提供する。

本発明に基き形質転換された表現ベクターまたはプラス
ミド９は、既決のりガント９に対し特異性のある免疫グ
ロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の可変領域をコードするが前
記可変領域に対し不必要なアミノ酸残基をコードするヌ
クレオチドま欠如し、さらには前記ＤＮＡ配列の５′−
および３′−末端それぞれにおいて開始および終了コド
ンをもったｄｓ　ＤＮＡ配列を運搬する。

リガンドは、例えば酵素または表層蛋白質でありうる。

本ｄｓ　ＤＮＡ配列は、例えば約９５から１２５のアミ
ノ酸残基を有すはプチド鎖の可変領域特には、９５から
１２５アミノ酸残基を有すＬ鎖の可変領域または、約１
１０から１２５アミン酸残基を有す１ｌｌｆｉの可変領
域、さらには少くともＨ鎖のＤ領域をコード化すべきで
ある。

さらには、本発明は既決のりガンビに対し特異性のある
免疫グロブリンのＬ鎖またはＩｌｌの可変領域をコード
するが前記可変領域に対し不必要なアミノ酸残基に対し
てコートゝするヌクレオチドは欠如し、さらには前記Ｄ
ＮＡ配列の５′−および６′−未満それぞれにおいて開
始および終了コドンをもったｄｖ　ＤＮＡ配列を運搬す
る形質転換された表現ベクターあるいはプラスミド８の
調製法を提供する； 前記方法は、前記はプチド鎖をコードするｍＲＮＡから
前記り鎖またはＨ鎧の少くとも一方をコードするｄ♂ｃ
ＤＮＡを調製すること；前記可変領域に対し不必要なヌ
クレオチド配列を前記ｄｓ　ｃＤＮＡより除去しさらに
前記可変領域をコードし、ＤＮＡ配１列の５７−および
６′−未満それぞれの位置に開始および終了コトゝンを
与えて所望のｄｓ　ＣＤＮＡを生成すること； および前記ｄｓ　ＣＤＮＡ表現のための表現型ベクタ−
へ所望のｄ’ＣＤＮＡを挿入することからなる。

本開始および終了コトゝンは試験管内での突然変異誘発
によって調製できる。所望するならば、本方法は前記挿
入操作前に、前記ｄｓ　ｃＤＮＡ中の少くとも１個のヌ
クレオチドを他の異ったアミノ酸ヲ：Ｉ−）−ｊろコド
ンに変換するための置換工程を追加し５る。

本方法の特に好ましい実施態様（ま、以下のａ）からｆ
）の工程よりなる： ａ）定常領域と可変領域から構成され、前記可変領域は
約９５から１２５のアミノ酸残基を有する免疫グロブリ
ンのＬ鎖またはＨｅをコードするｄｓ　ｃＤＮＡを調製
する工程；該調製工程は前記軸をコードする７７１ＲＮ
Ａを倣離し、前記ｍＲＮＡの逆転写してｓ、９ｃＤＮＡ
を調製し、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを用℃・前記８８　
ＣＤＮＡに相補的なストランドを合成して前記り鎖およ
びＨ鎖をコードするコードストランド 記ストランドは前記コードストランドの５’−３’−配
向にお（・て前記免疫グロブリンの先頭配列、可変領域
および定常領域をコードするＤＮＡ配列を含んでおり；
そして前記ｄｓ　ｃＤＮＡをクローン化することからな
る； ｈ）前記クローン化ｄＥ　ＣＤＮＡがらコード化または
非コード化されたｓｓ　ＣＤＮＡストランドをもたらす
工程； さらにその後シま、工程ｃ）、　ｄ）　、ｅ）およびｆ
）をｄｅｃｆまたはｃｅｄｆの順で行なう＝Ｃ）先頭領
域および可変領域に対するコード配列の接合点での非コ
ードストランド 規定する開始コドンを保有した第１オリゴヌクレオチド
プライマーとを混成して第１複式を生成し、ついで本複
式を酵素的に処理し前記非コード化Ｊ？Ｓ　ＣＤＮＡに
対し相補的な５’−３’−配向の第１オリゴヌクレオチ
ドゞプライマーを延長し、さらに他配向の前記非コード
’ｓｓ　ｃＩ）ＮＡを前記第１オリゴヌクレオチドプラ
イマーと相補的な配列まで分解゛して所望のＮ−末端ｄ
８ｃＤＮＡを生成し；ｄ）可変領域および定常領域の接
合点 接合点をコードするＤＮＡ配列でのコードストラドと停
止アンチコドンを含む第２オリゴヌクレオチドプライマ
ーとを混成して第２複式を生成し、ついで本複式を酵素
的に処理し前記コートゝストランドに相補的な５’−３
’配向の第２オリゴヌクレオチドプライマーを延長し、
さらに他配向の前記コード化．ｐｓｃＤＮＡを前記第２
オリゴヌクレオチドプライマーと相補的配列まで分解し
て所望のＣ−末端ｄ．ｙ　ｃＤＮＡを生成し； Ｃ）得られた所望のＣ−またはＮ−末端ｄｓｃＤＮＡを
クローン化し； 得られた所望のＣ−またはＮ−末端ｄｓ　ＣＤＮＡをコ
ードおよび非コードストランドへ分離し：さら５には，
本工程がｄ）から続く場合、前記コードストランド９を
、また工程Ｃ）から続く場合、前言［４非コードストラ
ンドゝを利用することを含む；さらにｆ）得られた所望
のＮ−およびＣ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡをクローン化し；
ついで所望のＮ−およびＣ−末端ｄ！　ＣＤＮＡを転写
および翻訳の制御信号と密接な関係をもつ前記コード配
列を有す表現型ベクターあるいはプラスミドへ挿入する
ことから構成されている。

水洗の好ましい実施態様は； Ａ）定常領域と可変領域からなり、前記可変領域は約９
５から１２５のアミノ酸残基を有する免疫グロブリンの
Ｌ鎧またはＨ釦をコードするｄｓｃＤＮＡを調製する工
程；ここで、・該ｄｓ　ｃＤＮＡ調製工程は、前記軸を
コードするｍＲＮＡを単離し；前記ｍＲＮＡを逆転写し
て８８　ＣＤＮＡを生成し；前記８８　ＣＤＮＡと相補
的なストランドゝをＤＮＡ，ｔ？リメラーゼによって合
成して前記り鎖またはＨ鎖をコードするコードストラン
ド 生成し；そして、前記ｄｓ　ｃＤＮＡをクローン化する
ことからなり、前記コートゝストランド８は、前記コー
ドストランド ブリンの先頭配列、可変領域および定常領域をコードす
るＤＮＡ配列を含有している； Ｂ）クローン化したｄＥ　ＣＤＮＡをコードおよび非コ
ードストランド 鎖またはＨ鎖の可変領域と接する部位をコードする部分
を少くとも除去し；ついで可変領域を表現する開始部位
を矧定する開始コドンを有する第１オリゴヌクレオチド
ゝプライマーをＪしコードストランドに対し混成するこ
とによって第１複式を生成し、この場合、前記オリゴヌ
クレオチドプライマーは、先頭領域のコートゝ配列と相
補的であるか、または先頭領域および可変領域の接合点
をコードするＤＮＡ配列と部分的に相補的であり、かつ
前記接合点附近では非相補的開始コドンを有する：とし
て得られた本複式を酵素的に処理し前配非コート’ｓｓ
　ｃＤＮＡに対し相補的な５’−３’配向の第１オリゴ
ヌクレオチビプライマーを延長し、さらに他配向の前記
非コードＳ、？ＣＤＮＡを前記第１オリイヌクレオチド
プライマーと相補的な配列まで分解して所望のＮ−末端
ｄＥ　ＣＤＮＡを生成し；得られた所望のＮ−末端ｄＥ
　ＣＤＮＡをクローン化し： 得られた所望のＮ−末端ｄ！　Ｃ’ＤＮＡをコードおよ
び非コードストランドに分離し；コード化ストランドに
対して終止コドンを含み前記可変領域および定常領域の
接合点附近の配列と相補的第２オリゴヌクレオチドプラ
イマーとを混成させることによって第２複式を生成し、
この場合前記終止アンチコドンは前配枡合点のものであ
りかっそれにより前記可変領域の末端で停止コドンを導
入でとろ；そして得られた複式を酵素的に処理し前記コ
ード化ストランドに相補的な５’−３’配向の第２オリ
ゴヌクレオチドプライマーを延長し、さらに他配向の前
記コード化ｔｏ　ｃＤＮＡを前記第２オＩＩ　＝ヌクレ
オチド９プライマーと相補的配列まで分解して前記免疫
グロブリンの定常領域を含まないＬＭおよびＨ鎖の可変
領域をコードする所望のＮ−およびＣ−末端ｄｓ　ｃＤ
ＮＡを生成し； 得られた所望のＮ−および−Ｃ−末端ｄ！　ＣＤＮＡを
クローン化し； 更に、前記の所望のＮ−およびＣ−末端ｄ、９ｃＤＮＡ
を転写および翻訳の制御信号と密接な関係をもつ前記コ
ード配列を有す表現ベクターある℃・はプラスミドへ挿
入することから構成されている。

第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記先頭配列のＮ
末端の非コードストランドを有する均一複式でありうる
か；前記可変領域をコードするＤＮＡ配列のＮ末端の開
始コドンを導入すべく前記先頭配列と可変領域配列間の
接合点で混成されうる。少くとも１個のオリゴヌクレオ
チドプライマーは部分的にでも前記ＤＮＡストランドと
相補的である。

不法では前記挿入操作前に前記所望のＮ−およびＣ−末
端ｄｊｔ　ＣＤＮＡへ独特の制限リンカ−を結合させ、
さらに酵素的に前記リンカ−を分解することによって結
合末端をもたらす追加工程を含む。

各混成工程後のクローン化は前記初期および第２オリゴ
ヌクレオチド配列をもつクローンの選択、前記ｄｓ　Ｃ
ＤＮＡを含むＤＮＡの分離および前記ｄ、ｓ　ｃＤＮＡ
の再クローン化の追加工程をおこなし・うる。

本発明の原理および細目は蛋白質あるいは酵素ポＩＪ　
＜プチド鎖の所望部位に対してのみコードするｄｓ　ｃ
ＤＮＡ配列を運搬し、かつ前記ＤＮＡ配列の５′および
６′−末端の各々において開始および終止コドンを備え
た形質転換された表現ベクターあるい１まプラスミドの
調製へ応用されうる；この方法は： 前記蛋白質あるいは酵素に対しコード化するｍＲＮＡか
らｄｓ　ＣＤＮＡを調製し；前記ポリペプチドＳ鎖の所
望した部分に対し不必要なヌクレオチド配列を前＝ｒｄ
ｓ　ＣＤＮＡより除去しさらに前ｉＦ　４リペプチド鎖
の所望部分をコード化し、そしてＤＮＡ配列の５′−お
よび６′−未満のそれぞれの位置に開始および終止コト
９ンを与えることによって所望のｄｓ’　ＣＤＮＡを生
成し、 更に前記ｄｓ　ＣＤＮＡ表現のための表現型ベクターへ
所望のｄｓ　ｃＤＮＡを挿入することからなる。

本発明の前述した特徴、特に工程α）からｆ）シまそれ
ぞれに応じて適応させ５る。

本発明の主要な特徴は、本質的に既決りガンビに対し特
異性のある免疫グロブリンＬ鎖またはＨ鎖の可変部の少
くとも一部のアミノ酸配列からなる結合性ポリハプチド
の製造方法であり、このとき前記アミノ酸配列は、類似
ポリ投プチドの強（・結合特異性を有している、 該製造方法は： 前記り鎖またはＨ鎖の少くとも一方をコード化するｄｓ
　ｃＤＮＡを前記録をコードするｍＲＮＡがら調製し； 前言己可変領域に対し不必要なヌクレオチド配々１１を
前記ｄｓ　ｃＤＮＡから除去し、さらにＤ　Ｎ　Ａ　？
Ｓｉ’、列の５７−および６′−未満それぞれの位置に
開始および停止コドンを与えて前記可変領域をコードす
る所望のｄｓ　ｃＤＮＡを生成し； 前記ｄ　ｓ　ＣＤ　Ｎ　Ａ表現のための表現ベクターへ
所望のｄｓ　ｃ；ＤＮＡを挿入し、かつ前記所望のｄ９
ｃＤＮＡを含む前記表現はフタ−で宿主を形質転換する
こと； 前記形質転換された宿主を成育させ、斯くして、前記り
鎖およびＨＩ４の一方の結合性ポＩＪ　Ａプチドを表現
し：さらに 前記結合性ポリペプチド９を分離することから構成され
る。

本発明のもうひとつの特徴は本質的に既決りガントに対
し特異性のある免役グロブリンＬ４Ｆ！またはＨ鎖の可
変領域の少くとも一部のアミノ酸配列からなる結合性ポ
リペプチドの製造方法であり、このとき前記アミノ酸配
列は類似ポリ深プチドの強い結合特異性を有している： 該製造方法は、 前記免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の可変領域をコー
ト８するｄｓ　ＤＮＡ配列を保持するが前記可変領域に
対し不必要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチドは
欠如しておりさらに前記ＤＮＡ配列の５７−および６′
−末端の各々において開始および終止コトゝンを備えた
形質転換された表現ベクターかプラスミドで形質転換さ
れた宿主を成育することからなる。

つぎに混成りＮＡ法によるｒＦｖの調製をより詳細に述
べる。

■、適当なりＮＡ配列の単離 ＤＮＡ配列の調製にあたり、可変領域をコード化する遺
伝子源が必要とされる。本可変領域はＩｙＡ、工、！７
Ｄ、ＩｙＥ、１１Ｇ、またはＩ　ｙＭ、最っとも一般的
には１．！７Ｍ　　およびＩｙＭ　　に求められる。

このことは適当なを髄動物、通常は飼育動物、さらに最
も好都合にシまマウスを免疫することで調製しうる。本
免疫法は、通常イムノジエンを宿主である哺乳動物へ１
回または通常は２ないし６週間の間隔をおいて注射する
こｙで実施しうる。通常、最終投与６日後に、牌臓が摘
出されさらに混成細胞を提供するための細胞融合に用い
るべく拒縄胞にまで解離される。

イムノジエンは、格好の抗原になりえるか、あるいはハ
プテンが存在する場合には、抗原に対するハプテンの抗
原性接合物となりうる。

混成細胞を調製するため、牌臓細胞は融合試薬例えばＰ
ＥＧ６０００を用いる通常の状況下で種々の種間または
棟内骨髄肺細胞、特には、５Ｐ−２１０、ＭＳ−１、そ
の他のようなマウス細胞と融合され、その後ＨＡＴ　　
選択培地へ懸濁される。その後生存細胞をマイクロタイ
ター筒中で成育させさらにｎ「望の決定部位に対する抗
体産生を免疫学的に分析する。

抗体の分析法は周知技術であり、さらに通常、放射性同
位元素、螢光物質、酵素あるいは角供物で標識された種
々の抗原あるいはハプテンが使用されうる２つの抗体の
うちひとつが支持体に結合し、残りが標識された抗体を
用いるサン１イツチ法のような他の手法もまた使用しう
る。陽性と評価されたマイクロタイター筒中の細胞は限
界希釈によるかある（・は軟寒天培地中でクローン化さ
れる。その後得られるクローン化細胞系は、適当な栄尊
培坤中で増殖される、さらに必要なら液体窒素中で凍結
保存されうる。

所望のモノクロナール抗体を提供する特定の細胞系の選
別後、該細胞は増殖される。通常、該細胞は１リツトル
の培養液中で約１×１０　細胞／ｍｅの密度まで増殖さ
れうる。該細胞は、その後遠心分離により収めさらに溶
解される。

所望するＤＮＡ配列を得るために−ま、可変領域を示す
遺伝子かあるいは可変領域を示すｍＲＮＡが指標にされ
うる。ゲノムＤＮＡを用いる場合の難点は、イントロン
によって可変領域をコードする配列が分離される場合に
これらが並置されることにある。正常なエクソンを含む
ＤＮＡ断片が学齢され、イントロンが切除され、さらに
固有の順および方向をもってエクソンが接合されねばな
らない。通常本性は難しい故にｍＲＮＡを用いる別法が
選択される方法でありうる。

ｍＲＮＡが使用される場合、細胞はＲＮａｓｅが阻害さ
れた条件下に溶解される。転性ｍＲＮＡ１ま、イントロ
ンを含まないという利点を有しておりそのためヌクレオ
チド配列は可変領域全体に対し連続する。ｍＲＮＡの場
合、逆転写の不完全性に由来する困難性（しかしそれは
最小限にしりるが）に直面させられた。第１工稈はｍＲ
ＮＡの蛍離である。

通常ポリアデニル化された７７１ＲＮＡはオリゴ゛（ｄ
Ｔ）セルロースカラムによって仙のＲＮＡより分離可能
である。本ｍＲＮＡ混合物は、他のＲＮＡと分離して得
られる。その後免疫グロブリンのＨＱおよびＬ鎖ポリペ
プチドをコードするｍＲＮＡの存在シま適正な遺伝子の
ＤＮＡ一本鎖との潴成によって分析されうる。好都合に
は、ＬｉおよびＨ４１ｉ定常仙域をコードする配列はプ
ローブとして使用しうる、この場合該配列は、手近かな
供給源（たとえばＥａｒｌｙ　　およびＨｏｏｄ　、遺
伝子工学、Ｓｅ　ｔ　ｔ　ｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄ
ｅｒ編集、第３巻、ｐｌｅｎｕｍ出版、ニューヨーク、
１９８１年発行１５７−１８８頁、参服）より調製可能
である。

適正な會疫グロブリンに対しｍＲＮＡがコードシている
か否かシま、ウサギ網状赤血球の無細胞抽出物を用いた
試験管内翻訳（Ｐｅｌｈａｍ　　およびＪａｃｋｓｏｎ
。

Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　（１９７６年発行
）６６巻；頁２４７−２５６＞によって検討できる。生
じる翻訳生成物は、その後所望のはプチド鎖の１ないし
それ以上の部位に特異性を有する抗体、例ゼばウサギ抗
（マウスエｙｃ、）を用いて単離されうろ。

このとき本はプチトＳ鎖はマウス免疫グロブリンより由
来する。

本免疫沈降物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
ってさらに分析され、そのうえ本複合体の存在は、Ｓ、
オウレウス蛋白質Ａ、Ｒ／因子またはこれら類似物のよ
うな抗原−抗体複合体に対する放射性受容体を用いるこ
とで検討される。さらにＲＮＡ吸収混成法（寒天ゲル上
でのｍＲＮＡ配列ｊ品の溶解、該ｍＲＮＡのニトロセル
ロースフィルターへの移転、８０℃での焼き付けおよび
放射活性プローブの試験）は、さらに適正なｍＲＮＡが
存在するようにするため行れうる。

所望するｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡの粗混合物は、以
下の如くに処理されうる。全長ｃＤＮＡが得られる可能
性を高めるため、Ｏｋａ　ｙａｍαおよびＢｅｒｇがＨ
ｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　　（１９８２１Ｆ−）
　テ開示シ？、：方法を使用しうる。別法と１．てＥｆ
ｓｔｒαｄｉａｄｉｓオヨびＶｉｌｌａ　−Ｋｏｍａｒ
ｏｆｆが１９７９年発行の遺伝子工学：原理と方法、第
１巻、ＳｅｔｔｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ編隼、
ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ出版頁１５−３６、あるい
はＳｔ　ｅ　ｔ　ｎｍｅ　ｔ　ｚ　等が１９８１４発行
Ｃｅ１ｌ　２４巻頁１２５−　１３４において開示した
方法が使用されうる。ｃＤＮＡの第１ストランドはビー
ルス逆転写酵素を使用しオリゴ−（ｄＴ）　　−プライ
マーの存在下調製される。その後第２ストランドゝは逆
転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片ま
たはＴ　４ｚ　＋）メラーゼを用い調製されうる。その
後必要ならば、牛じたｄｓ　ＣＤＮＡシま後にクローン
化されうるｄｓ　ｃＤＮＡを得るべく単一ストラントゝ
化さｈた部分を除去するためＳ１ヌクレアーゼのような
単一ストランド一特異性ヌクレアーゼによって処理され
うる。

−への導入 φ疫グロブリンのＬ鎧およびＨ４１Ｔｈを産生ずるため
にばｄｓ　ｃＤＮＡの増殖あるい）ま表現するような広
範囲なばフタ−が使用されうる。適白な制限部位を有す
るばフタ−は適当なエンドヌクレアーゼで分解される。

ｍＲ，ＮＡ　　の逆転写によって調製されるｄｓ　ｃＤ
ＮＡ　ｋまリゲーテイングリンカー、末端トランスフェ
ラーゼによる処理あるいは、仙の手法によって互い違い
（相補的な）あるいは平滑末端を提供すべく修飾されう
る。本はフタ−は、形質転換体の選別のため１．２ない
しそれ以上の指標をもちうる。望むべくは、ベクターは
、多様な指標のひとつにおいて特有の制限部位をもつべ
きである、その場合本形質転換体は一指標の表現および
他の指標の表現の不在によって選別さねうる。

殺菌抵抗性、生長因子要求性変異体の補充性、ウィルス
免疫性またはこれら類似性のごとき種々の指標が使用さ
れうる。

適当な宿主、通常細菌例えば大隣菌、枯草菌、Ｓ、セル
ビシアエなどが７７１ＲＮＡより調製したｄｓＣＤＮＡ
と通常の手法によって形質転換され、さらに該形質転換
体は、癩天プレート上に拡散培養され特殊な指標に基い
て選別される。ここで生じろコロニーは制限電気泳動パ
ターン、＃識はプローブへの混成あるいはその他の通常
方法によって選別される。例えばＨａｎαｈαルおよび
Ｍｅｓｅｌｓｏｎ（１９８０年発行）ＧｅｒＬｅ１０巻
頁６３−６７を参照。コロニー混成法が一方法として使
用されろとき、形質転換体はコロニーを形成させるため
固型培地上で増殖させる。コロニー由来の細胞は、ニト
ロセルロースレプリカフィルターへ転移サレさらに転移
細胞はさらに増殖させるためインキュベーション、溶解
、乾燥さらに約８０°Ｃで暁き付けられる。該レプリカ
フィルターは、その後適当な放射性同位元素で標識され
たプローブと混成される。種々の哺乳類免疫グロブリン
の定常領域に存在する結合部位決定因子のプローブは、
簡単に獲得できる。本コロニーは、特別な免疫グロブリ
ンの性質、あるいは同グロブリンに存在しうる異った決
定部位に基いてプローブ化されうる。

プローブ類と混成する宿主コロニー類、すなわちＬ鎖か
あるいはＨ鎖のいずれかをコート５するＤＮＡを有する
宿主コロニー類が選ばれその後選択圧力下で培養増殖さ
れる。選択圧力を保持するために、使用されるベクター
は、殺菌、特には抗生物質抵抗性を有していることが所
望される。該宿主増殖のため十分に時間をかけた後、該
宿主細胞は、通常遠心分離で集められる。その後混成プ
ラスミド″’ＤＮＡは公知の方法（例えばＣｔａｎｓａ
ｌｗｓ等がＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７９年発
行１４０巻、頁１０６−１！＋３の方法）で分離されう
る。

分離されたプラスミド”ＤＮＡはその後制限酵素消化お
よびＤＮＡ配列分析によって特徴づけら糺る。これら分
析法は、分離したｃＤＮＡクローン類は可変部を、かつ
任意には、所望する免疫グロブリンのＬ錯およびＨ鎖の
先頭配列を完全にコード化して（・ることを保証する。

さらには、可変領域、先頭配列およびフランキング配列
の制限図をもつことによって、ベクターへの挿入および
インタレストホリペプチドの表現のためのＤＮＡ配列の
適当な修飾を考慮させるようなりＮＡ断片の切除に対し
適当な制限部位が決定されろ。隔世１１部位の適当な位
置において特定の制限部位が得られぬ場合、可変領域お
よび、任意には無傷の先頭配列を有す断片の選別を伴っ
た部分消化が使用しうる。５′および６′−フランキン
グ部位の間隔が長すぎる場合、Ｂａ１３１を用い消化時
間を変化させることでこれらの間隔は種々に短くされう
る。

さらにはＨ鎖およびＬ鎖可変領域のＣ−末端部位をコー
ドするＤＮＡ配列を知ることによつ（停止コト５ンをＣ
−末端において以下に示すような試験管内変異誘発法に
より導入し５る。本ｃＤＮＡは５′および６′脇側を有
する可変領域をコートゝする切片を提供すべく適当な隋
素（類）によって制約されている。本切片は例えばゲル
電気泳動、密度勾倍遠心法などによって精製される。所
望する切片は単離されその後その２本ストラン白１通常
煮沸して分離されろ。別法として、無傷ｃＤＮＡプラス
ミドの所望しないストランドゞはニックさらには分解さ
れる。

合成の単ストランド８オリゴヌクレオチビ（ＤＮＡオリ
ゴマー）は通常合成法によって調製される、この場合該
オリゴヌクレオチドは少くとも約１２ヌクレオチド、よ
り一般的には約１５ヌクレオチドを、通常は約５０ヌク
レオチドより少く一般にはろ０ヌクレオチド９より少い
ヌクレオチドをもちうるがこれ以上長いオリゴマーは必
要とされない。

ここで合成したＤＮＡオリゴマーが異質複式として用い
られる場合、非相補ヌクレオチドｋｉｆｉ常混成ストラ
ンドに相補的な少くとも約６個より一般的には少くとも
約６個のヌクレオチドによって通常接している。本異質
複式ＤＮＡオリコ゛マーは、例えば先頭配列と可変領域
間あるいは可変領域と定常領域間での重要な結合部また
はその付近と相補的でありうる。本ＤＮＡオリゴマージ
ま本質的に可変領域配列のコード化（Ｉセンス１）スト
ランドと相補的であるべきだが、該可変領域のＣ−末端
において終末コドンをコードするよう変化させられるべ
鎗である。すなわち、１ＤＮＡオリゴマーは、Ｌ鎖およ
びＨＩＭの可変領域とＤ−１Ｊ−あるいはＣ一部との結
合部、特にシまＤ−またはＪ−領域におけるかあるいに
’４こわらの中間、またはＪ−領域およびＣ−領域の結
合部に含まれるアミノ酸あるいは、アミノ酸など以外の
コートストラントゝと相補的であるべとである。可変領
域配列にシまあるいは可変部Ｃ−末端の全アミノ酸を含
まないよう調製されるポリペプチド８中でいくつかの変
更がなされるべきである。

過剰量のＤＮＡオリゴマーは、十分にストリンジェント
な混成条件下に制限断片の変性ストランドと結合される
。しかるに、Ｃ末端の所望するアミノ酸において表現の
終了を確保するべく１個ないしそれ以上の停止コト９ン
が提供されている限りにおいて該ＤＮＡオリゴマーは、
特にコートゝ化ストランビの相補部位に対し異質複式で
ある。

所望のストリンジンジーの水準における混成に十分時間
をかけた後、十分量の４個のデオキシヌクレオチドは、
ＤＮＡポリメラーゼｌのＫｌｅｎｏｗ断片と共に結合部
に相加される。可変部の配列および５′−フランキング
配列のいずれがをコードする相補的ストランドは、ＤＮ
Ａオリゴマーが結合するストランドと相補的配列をもた
らすプライマーの酵素的延長によって合成される。合成
オリゴヌクレオチドとの混成部に対し６′に位置する該
コートゝ化ストランド上の１本−ストランドＤＮＡ配列
シマ、ＤＮＡｙｔリメラーゼの３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性によって分解される。このようにしてＬ鎖お
よびＨ＠に連合した可変領域および上流脇側領域を特に
コードするようなｄｇ　ＣＤＮＡが得られる。Ｈ鎖およ
びＬ鎖の各々は■、ＤまたはＪ−領域における既決コド
ンの表現を停止するようコード化される。

その後得られた異質複式平滑−末端ｄｆｆｉｃＤＮＡ断
片は所望する部位での停止コドンを有したＬ　Ｉｌｌ　
、ｔ；よびＨＱ町変領域をコードする均一複式ｄｓ　ｃ
ＤＮＡを調製するのに使用される。好都合には、核平滑
末端断片は、既述の方法例えば可変領域配列中に存在し
ない制御部位をコート９するリンカ−へ結合させるか、
例えばポリＧまたはポＩＪ　Ｃ尾部を付けるか、あるい
は直接挿入するかによって修飾される。したがってリン
カ−の制限部位へ結合後の断片は、相補的末端を有する
適当なベクターへ挿入しうると、さらに所望するならば
リンカ一部位での制限によって回収しうる。該リンカ−
は適当なりガーゼ、例えばＴ４リガーゼによって平滑−
末端断片と結合され、さらに生じる合成された断片はベ
クターの相補性末端にアニールされ結合末端を有するよ
り短い断片の提供を制限される。

本ベクターは挿入する可変領域コード配列を有する形質
転換体の増殖および好都合な分離を満たしている。細菌
または他の宿主中での増殖のために７）ＢＲ３２２、ｐ
ＳＣｌｏｌ、７）ＲＫ２９０．２μｍプラスミド、その
他のような多くのベクターが存在する。結合末端をもつ
より短い断片の該ベクターへのアニールはＤＮＡオリゴ
マーカ異質複式を誘導する場合；このときＤＮＡ配列は
誤った組合せとなる以外相補的ＤＮＡ配列をもった混成
プラスミドを供給することになる。該混成プラスミド（
誤った組合せ配列を含む）は、宿主において二種のプラ
スミヒ分子、ひとつは元の配列を有し他のひとつば金床
ＤＮＡオリゴマー由来の”所望の１あるいは１変異部位
１配列を有す、を複製し生成するといえる。したがって
、形質転換コロニーの各々は、小さい（約２ｍ（）培養
系で生育され、その後プラスミドＤＮＡは公知の手法で
単離され、さらに該１所望の１配列を複製する個々のク
ローンを供給するべく第２期形成転換に使用される。

該クローンは１紙吸収混成法、あるいは例えば可変領域
配列の１尾部付着１に用いる合成りＮＡオリゴ゛マー標
識合成りＮＡオリゴヌクレオチドとのフローピング、あ
るいは他の好都合な手法によって選別されうる。このよ
うにして、適当な制限部位によってフランクされたｄｓ
　ｃＤＮＡおよび既決部位での停止コトゝンを有すプラ
スミドゝ類が得られる。

コード化ストランド９０６′−末端（Ｃ−末端アミノ酸
を規定する）が規定されており、さらにコード化ストラ
ンドの５′一部位（ポリはプチド・のＮ−末端を規定）
がついで規定される。もちｈん、２つの末端が特定の順
序で修飾されることは元来好都合なことのひとつである
；稟実該２末端は、６′−末端での変異部位をもつ結合
部をコートゝするストランドの５′−末端でプライマー
回復が用いられる場合には同時に修飾されうる。

表現を得る宿主の性状、さらに宿主が先頭配列をポリＲ
プチド分泌の分泌信号として２識しそれを除去するかど
うかに依存して種々の用法が展開されうる。もしも該宿
主がこのことをし得ないならば、該先頭配列をコードす
るＤＮＡ配列は、可変領域をコードするコードストラン
ド 末端における開始コドンを供給するよう除去されるべき
であり；その後短縮された該ストランドは既決プロモー
ターおよびリポソーム開始位置がコントロフルされるよ
うな方法で表現ベクターへ挿入されうる。

先頭部位の配列あるいは可変領域Ｎ−末端をコードする
配列に基いて、均一あるいは異質複式に対する種々のオ
リゴヌクレオチドが調製されうる。

本先頭配列が保持される場合、プライマーＩＪ　Ｓアは
、コードストランド８の５７−フランキング配列を除去
するのに用いられる。Ｎ−末端のプライマーリペアがＣ
−末端突然変異誘発と同時に行なわれる場合には、オリ
ゴヌクレオチド９で複製されたコート８ストランドゝを
ＤＮＡポリメラーゼで処理し、得られたダブルストラン
ドＤＮＡを次いで５’−３’ーシングルストランドエキ
ソヌクレアーゼで処理して５′−フランキング領域を除
去し、そして、リガーゼで処理して複製ストランドゝの
Ｎ−末端オリゴヌクレオチドへの共有結合を形成させる
。

先頭配列が除去される場合、試験管内突然変異誘発は、
可変部をコードするＤＮＡ配列Ｎ−末端での開始コトゝ
ン（　ＡＴＧ，　Ｎ−ホルミル−メチオニン［ｆ−ｍｅ
ｔ〕　　に対して）を誘導するに用いられる。

所望するｄｓ　ｃＤ．ＮＡの回収および試験管内突然変
異を進行させるためには、別の方法が用いらねうる。有
用な制限部位がコード部位から隔っているならば、プラ
スミド９は、適当な制御Ｐ工／ドヌクレアーゼで、つい
でダブル−ストランド９エキソヌクレアーゼ、例えばＢ
α１３１で分解されうろ。ここで生じるｄｓ　ＣＤＮＡ
はクローン化されさらに該正常配列は上述のごとく適当
に選別および修飾されうる。もし本コードストランド コード脇側部位が短すぎる場合、エンドヌクレアーゼで
分解され好都合な制限部位が得られるか、あるいはエキ
ソヌクレアーゼで例えばＢａｌ・３１で分解されうろ。

オリゴヌクレオチド８が非コートゝ（ナンセンス）スト
ランドに相補的でありかつ５′−未満（プライマーリに
ア）あるいは開始コドンを含むことを除いて、６′−末
端を修飾するべく上述の手法を繰り返すことで、可変部
をコードするＤＮＡ配列の５７−末端シま、尾部をつけ
られうる。通常、本オリゴヌクレオチドは、プライマー
リペアに対し均−初代化しかつ試験管内突然変異誘発に
対し異質複式化する。このようにして、免疫グロブリン
のＬ鎖およびＨｆ！ＩＩ双方の可変領域を規定するため
正確に定位置化された開始および停止コドンを有する１
所望の”ｄｓ　ＣＤＮＡが得られる。ここで生じる平滑
末端ｄｓ　ｃＤＮＡは、例えばリンカ−類の添加によっ
てｄｓ　ｃＤＮＡに対し合成されかつばフタ−中に存在
する制御信号に対し特有の間隔をもって表現ベクターへ
挿入される相補的末端を供給するため修飾されうる。

該ｄｓ　Ｃ’ＤＮＡは表現のためのベクターへ挿入され
るよう整っている。本ｄｓ　ＣＤＮＡの複製にもっばら
関係している初期はフタ−類とは区別して、本段階で用
いられるばフタ−は、転写および翻訳のための制御信号
類の存在が必要である。他の転写制御信号配列と同様に
、オば°レーター、アテヌエイターあるいはアクチベー
ターのような適当なプロモーターを有するベクターが選
択される。また、制御信号支配下の部位において可変部
をコードするｄｓ　ｃＤＮＡ導入に対し少くとも１個の
挿入部位の存在を決定するためには、該ベクターシま少
くとも配列決定されている。

既に開示した如くに、転写制御信号と共に、翻訳制御信
号、主としてリポソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１
ｇａｒｒＬｏ配列、”Ｓ−Ｄ”）および開始コトゝン（
”ｆ−ｍｅｔ　　コドンＷ）が存在する。本Ｓ−Ｄ配列
および開始コト８ンは、正確な空間、通常約６から１２
塩基対によって離れた空間に存在すべきである。該Ｓ−
Ｄ配列は、ベクター上の挿入位置の近位附近に存在し、
さらに例えばＳ−Ｄ配列および該Ｓ−Ｄ配列由来の制限
部位附近を供給するオリゴヌクレオチドゝの合成によっ
て該可変領域コートゝ配列と結合されうる。別法として
、該Ｓ−Ｄ配列は、既述のごとく試験管内突然変異によ
り導入されうる。本コートゝ配列は、開始コトゝンとの
間で絹み立てられる必要がある。

種々の手法を選択するにあたり、以下のような考慮がさ
れるべきである、すなわち可変領域コード配列および脇
側部位中での特殊制限部位の存在と非存在；ベクターへ
のｄｌ　ＣＤＮＡ配列の挿入および可変領域ホリハプチ
ドの表現をさせるベクター類の有用性：高収率で表現お
よび単離をさせる宿主の有用性；および先頭部位を開裂
するための分泌信号を開織する宿主の能力などである。

したがって種々のイディオタイプの各々についての各状
況では、可変領域および脇側領域をコードするＤＮＡ配
列の少くとも制限部位地図を作製する必要が生じうる。

該ベクター末端および挿入される配列が同様である場合
、該配列が正確か不正確方向へ挿入されたかどうかを検
査する必要が生じる。挿入後生じるクローン化プラスミ
ドの遺伝地図作製によって、正しい方位の可変領域配列
を有するそれらプラスミド類が選別される。

上記用法は、多くの価値ある利益をもたらす。

ポリペプチド鎖類は同一の配列および鎖長を含む均一組
成として調製される。ｒＦｖを形成するポリ啄プチドは
糖類を含みえず、かつ均一および糖を含まないという特
徴により、いっそう均一に標識かつ修飾されうる。この
ようにして、生成物は均一かつ再生産性物として得られ
る。したがって該生成物は、生成物の不均質ス啄りトル
に起因する予期しない反応に対し比較的関連性が小さく
・ことがら哺乳類宿主に対し信頼して投与しうる。

以下の実施例において本発明を例証するがこれによって
本発明を制限するものではない：実験の部 以下の記述は、代表的リガンドの１例としてジニトロフ
ェニルリガンＰについて示唆スる。使用するイディオタ
イプの多様性の故に、種々の段階では該方法を特殊な制
限部位や独特の態様の存在に対応するため若干の修飾を
必要とされるが、主題の方法は、いかなるリガント８に
対しても有用でありうることを理解すべきである。

実　　　施　　例 ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に対するモノクーロナール
抗体の調製 ｐＨ約１０．５の緩衝化した水性溶媒に１Ｑ　ｒｒｖｎ
ｏｌｅノ２，４−ジニトロはンゼンスルフオネー）　（
Ｅｉｓｅｎ等、Ｊ、Ａ、Ｃ：、Ｓ、７５巻（１９５６年
発行）頁Ａ３８６を参照）および０．０１　ｍｍｏｌｅ
ギイホールリンベント貝ヘモシアニンを加え、さらに本
混合物を室温で２０時間振とうする。本溶液はその後連
続交換された０、　６　Ｍ　ＮａＣ／！に対し透析され
ついで残漬は、免疫法に使用するため単離される。

該ＤＮＰイムノジエン１００μｇは、Ｑ、１　ｍ７の完
全あるいは不完全フロイントゝアジュバントおよび投与
１回分あたり０．１ＮのＰＢＳとともに懸濁液とされる
。１群６匹のＢＡＬＢ１０マウスは、１週間の間隔で上
記投与量を４回注射される、この場合投与方法は、足前
および鼠径部皮下注射と同様静脈注射である。最初の投
与は完全フロイント８アジユバントで残り６回分は不完
全フロイントゝアトバントと共に投与される。最終投与
６日後に、マウスは殺されさらに牌臓は摘出されモノク
ロナール抗体形成に使用される。

ＳＴ）　　２１０−Ａｇ　１４骨髄腫細胞（Ｓｈｕｌｍ
ａｎ等（１９７８年発行）　Ｎａｔｕｒｅ　２７６巻：
頁２６９−２７０）の６×１ｏ　個と牌臓細胞５×１ｏ
７個を組み合せ融合が実施される、さらに該混合物は、
２００ｇで５分間遠心分離された後、ＰＥＧ１５００の
５０％ダルベコ変法イーグル培地（Ｆｌｏｗ社）溶液Ｑ
、　６　ｍｌに徐々に懸濁される。６７℃で１分後、２
０７ｆｆ１１７）Ｒ培地（６ｏｍＭへにス（Ｆｌｏｗ社
）を補充したＲＰＭＩ　１６１４０培地（Ｇｉｂｃ。

社）を徐々に添加する。その後本細胞は、遠心分離され
、ついで１０％牛脂仔血清（Ｇｉｂｃｏ社）を補充した
Ｒ培地（ＲＦ培地）２０ｍｌに懸濁されさらに本懸濁液
は、Ｑ、　８ｍｌのＲＦ培地を含有したウェル２００個
にそれぞれ分注される。また該ウェル１００個には、マ
ウス腹腔浸出細胞２×１０５個ヲ含ム。２４時間インキ
ュベーション後、ＨＡＴ培地を補充したＲＦ１ｍ／が各
ウェルに添加される。

２〜６日毎に、１　ｍｌの該培地は、新鮮ＲＦ＋ＨＡＴ
培地で交換される。Ｚ週間後増殖が認められる細胞は、
リジンの３５８−２，４−ジと′トロフェニルスルフア
ンアミドを用いて免疫グロブリン産生゛が試験される。

該活性を示したクローンは、必要に応じて抗ＤＮＰを供
給すべくソフト寒天培地で平板培養されクローン化され
る。

別法として、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ等が（１９８０年発
行）　Ｊ、ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、１５１巻：頁１０７１−
１０８７で開示した方法が使用され５る、該方法では、
Ｅ（ＩＡ希釈液（Ｔ）Ｈ７，６のＰＢＳの１％ＢＳＡ、
０．００５　ＭＥＤＴＡおよび０．１　％　ＮａＮ３溶
液）を含むミクロタイタープレート中の個々のウェルに
牛血清アルブミンで置換されたＤＮＰが添加され（５０
μｌ、　０．０５ｍｚ／ｍｌ）、さらに該混合物はその
まま１時間インキュベーションされる。その後種々の希
釈度の試験用あるいは標漁抗血清（２０μｌ／ウエル）
が添加されさらに１時間インキュベーシーンされる。Ｒ
ＩＡ希釈液で６回洗浄後、　　ニー標準抗マウス免疫グ
ロブリン（約２×１０　　ｃｏｍ／ウェル）が添加され
さらに該混合物は１時間インキュイージョンされる。そ
の後平板は該ＲＩＡ希釈液で３回洗浄、乾燥、さらにオ
ートラジオグラフィーで検討される。

所望した抗体の存在と確認する上記２法は、共に周知で
ある。細胞はその後限界希釈法かあるいはソ”ｙト寒天
中でクローン化され、さらに得られるクローン化された
細胞系は、増殖されその後必要が生じるまで液体窒素中
に存在される。

使用にたえるクローン化細胞系の１系列に由来した細胞
は、１リツトルの培地巾約１×１０　細胞／ｍｌになる
まで増殖される。該細胞は、遠心分離で集められさらに
１グラムの細胞は５５ｍ１容量ｙｙツｐ−一エルベエー
ム型ホモジナイザー管中の１０ｍ１のグアニジンチオシ
アネート貯蔵液（４Ｍ−５０９のグアニジンチオシアネ
ート、２．５　ｍｌのＴ）Ｈ７，０の１Ｍクエン酸ナト
リウム、Ｑ、　７　ｍｌ！のメルカプトエタノールおよ
びＱ、　５　ｍｌのＳｉｇｍａ社製６０係アンチフオー
ムＡを合せ室温で全量１００ｍ１に調製）に加えられ、
直ちに直径１８ｍｍのＴ　ｉ　ｓ　ｓｕｍ　ｉ　ｚｅ　
ｒ　ホモジナイザー（Ｔｅｋｍａｒ工業社製）で最大速
度で６０−６０秒間ホモジナイズされる。

ここで得られるホモジネートは５ｏｒｖａｌ　スイング
型ローターを用いて１０℃、８，０００　ｒａｍにて１
０分間遠心分離される。上清はフラスコへ移され、さら
にｐＨを７から５へ下げるための０．０２４容量（ホモ
ジナイズしたときの元の容量に対して）の１Ｍ酢酸およ
び０．７５容量の無水エタノールと混合される。該フラ
スコは、蓋をされさらに十分に振とうされついで一２０
℃で一昼夜貯蔵されその後読物質は一１０℃にてＨＢ４
０−ターを用い６．００　Ｏｒ＋：＋ｍで１０分間遠心
分離される。

ここで生じる堅固なベレットは分離後０．５容量の緩衝
化遠酸グアニジン貯蔵液（７，５Ｍ、５ｍＭジチオスレ
クトール中で中ｆＤ後Ｔ）８７．０に０．２５容量の１
Ｍクエン酸す）　ＩＪウムで緩衝化）中で激しく振とう
し懸゛濁される。該標品ははレットを完全に分散させる
ため６８℃水浴中で、しばらく温められ、ついで０．５
容量エタノールに溶解した０、０２５容量（塩酸グアニ
ジンの容量に対して）の１Ｍ酢酸を添加し沈殿させられ
る。該溶液は少くとも６時間−２０℃を維持されその後
遠心分離される；生じたはレットは、上述のように塩酸
グアニジンに再懸濁されさらに再沈殿される。再沈殿物
質は６，０００　ｒｐｍで５分間遠心分離される、さら
にこれ以後の全反応は滅菌操作で実施される。

本最終にレットは、空温でエタノールに分散され、過剰
の塩酸グアニジンを抽出するため細かくされその後６．
００　Ｏｒｐｍで５分間遠心分離される。

エタノールは窒素ガス気流を用いて蒸発され、さらに残
ったＲＮＡ−、’レットは、元の細胞１グラムあたり１
　ｍｌの滅菌水に激しく振とうし溶解される。

１０℃、１３．００　Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離後
、ＲＮＡを含有する上清は、傾斜法で集められる。

全ＲＮＡを完全抽出するため、不溶性物質は、Ｑ、５　
ｍｌの滅菌水で２回再抽出され、該抽出物は、１０℃１
３．００　Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離されるその後
読水溶液はまとめられ［１，１容量の２Ｍ酢酸カリウム
／酢酸、ｐＨ５および２容量のエタノールと混和された
後−２０℃で一夜放置される。

本ＲＮＡは、エタノール懸濁液から、ＨＢ４０−ターを
用いＣｏｒｔｅｘチューブ中で一１０℃、２１］、００
０　ｒｐｍで２０分間遠心分離し沈殿される。

ここで得られる投レットは９５％エタノールで十分に洗
浄、窒素ガスで乾燥されさらに１　ｍｌ　／　４９細胞
の割合に１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．２係ＳＤＳに溶解される。本ＲＮＡ−！！レ
ットを溶解後、１／９″容量の５　Ｍ　Ｎａ（Ｊが添加
されさらに該溶液はオリゴ（ｄＴ）カラム（乾燥重量約
ｏ、ｓｇのＴ３等級、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ社）に充当される。本カラムはＱ、　５
　Ｍ　Ｎａｐ／！、１Ｑｍ）リス、１　ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７，５，０，２係ＳＤＳ溶液で十分に洗浄され
その後Ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐ
Ｈ７，５，０，０５％ＳＤＳ液で溶出される。溶出パタ
ーンは、λ２６０で追跡する。ＵＶ吸収のある分画は、
集められさらに酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５およ
び２．５容量のエタノールの添加によって沈殿される。

乾燥されたベレットを、５０μｌ（１容量）の１０μｌ
Ｍ）リス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解し、９
容量のＤＭＳＯを添加後、直ちに１容量の緩衝化Ｉ　Ｍ
　ＬｉＣ１（Ｉ　Ｍ　Ｌｉ（Ｊ、　５０　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　　２．０係ＳＤＳ、１０ｍＭ）リス、ｐＨ６，５
）を添する。本溶液は５分間５５℃で加熱後、１００容
量の結合緩衝液（’０．５　ＭＮａＣＣ１０ｍＭ　　）
　リス、１　ｍＭ　　ＥＤＴＡＱ、２％５ＤＳ）が添加
されさらに同緩衝液で緩衝化したオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラムに再充当され上述のように溶出される。

モノクロナール免疫グロブリンＨ鎖およびＬＨポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡの存在は、適当なＨおよびＬ
鎖遺伝子のＤＮＡクローンを使用する混成選別法によっ
て検証される。このときの原法は、ＥａｒｌｙおよびＨ
ｏｏｄが遺伝子工学（１９８１午発行）第６巻、Ｓｅｔ
ｌｏｗおよびＨｏｌｌａｎｄｅｒ編集、Ｐｌｅｎｕｍ出
版社、頁１５７−１８８に開示されて〜・る。ＤＮＡ７
’ローブは公表されたアミノ酸配列あるいはＤＮＡ配列
に基いて合成されうるか、ＥａｒｌｙおよびＨｏｏｄが
上記水中で報告した種々の供源より得ることができる。

本ＤＮＡプローブは１０倍標準クエン酸液中で変性、中
和されかつニトロセルロース１紙（５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒおよび５ｃｈｕｅｌｌＢＡ−８５−Ｒ５９７参照）に
５ｏｕｔｈｅｒｎがＪ０Ｍｒ＋１゜Ｂｉｏｌ、（１９７
５年発行）９８巻：頁５０６−５１７で開示した方法に
基き結合される（米国特許第４．３０２，２０４号も参
照）。該プローブは、６５％ホルムアミド”７１３ｍＭ
２°Ｒス緩衝液ＤＨ６、Ａ　／　Ｑ、　４　Ｍ　ＮａＣ
Ｊの最終容１ｉｏｏｐｌ中で５５℃２時間６０μｇのｍ
ＲＮ　Ａと混成される。本反応混合物は、小遠心管中で
１Ｄ秒間回され、渦動され、再び回された後、静かに１
紙へ再懸濁すべく渦動される。本混合物は、約１時間５
０℃で、静かに撮とうしつつインキュベートされろ。反
【ム混合物は、その後除去されさらに１紙が６０°Ｃ〕
に保持された１ｒｎ／、の０．１５ＭＮａＣＪ１０．１
５Ｍクエン酸ナトリウム１０．５％ＳＤＳで１０回洗浄
される。洗浄緩衝液を添加後悔に、該チューブは、数秒
間ずつ渦動される。１紙はその後１ｍｌの１１１ｍＭト
リス、ｐＨ７，８，２ｍＭ　ＥＤＴＡ　で２度洗浄ｇｔ
ｔさらにチューブは６０℃で５分間インキュは一トされ
その後溶液は、吸引により除去される。

ＲＮＡは、１紙を６００μｌの二回蒸留、滅菌水中で６
０秒間煮沸することでＲＮＡ−ＤＮＡ混成体より溶出さ
れ、その後メタノール／ト８ライアイス浴中で急速−凍
結される。氷上で融解後、水（ＲＮＡを含有している）
は、新しいチューブへ移されついでついで酢酸ナトリウ
ムが最終濃度０．２Ｍになるよう調製され、さらに２０
１１，９の牛胸腺ｔＲＮＡを加える、ＲＮＡは、−２０
℃で２．５容量のエタノールで沈殿され、さらに翻訳さ
れる直前にＲＮＡは、４℃で１０分間１２．０００４９
で遠心分離された後沈殿物は７０４）エタノールで２度
洗浄されついで滅田下に乾燥される。

次いで溶出されたｍＫＮＡはウサギ網状赤血球の無細胞
溶解物、例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ
ｒ社の市販品翻訳キットと試験管内で翻訳され、その後
蛋白合成は、該キットの指示に従って確認しつる。

その後、１部は試験管内翻訳溶解物中にお゛いて表現は
成物量に対し大過剰のモノクロナール抗体とインキュベ
ーションされる。本抗体：抗原化合物は、その後固定Ｓ
、オウレウスと共に沈殿させられさらに該沈殿物は、０
．０５Ｍトリス、ｐＨ８，３，０，４５Ｍ　ＮａＣｌを
含む０．５％ＮＰ４０中で６度洗浄、さらに１％β−メ
ルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７，５中で煮沸される、ついで５−２０％
グラジェント５ＤＳ−ｙｔ？リアクリルアミドゝゲル上
で１２５■でマーカーのゾロムフェノールブルーがゲル
の下端から溶出してからさらに１時間電気泳動される。

その後ゲルは乾燥、固定されさらに免疫グロブリンＬ鎖
およびＨ鎖をコードするｍＲＮＡの存在を確認するため
コダックＸ−Ｒフィルム上でオートラジオグラフィーを
実施される。本ｍＲＮＡ混合物はその後Ｏｋａｙａｍａ
および１３ｅｒｇがＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌ
ｌ＋」ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　１９８２１Ｅ　２月
発行頁１６１−１７０で記述した方法に従ったダブルス
トラン）ＳＣＤＮＡの収集の調製に使用されろ。最初、
ベクタープライマーおよびオリーｆｄＧ−尾部化リンカ
ーＤＮＡの調製法が記述されるであろう。

ａＯＯμｇの７）ＢＲ３２２−８Ｖ４０　（図単位０．
７１−０．８６）ＤＮＡは、６７℃で７００単位のＫｐ
ｎＩ　エンドゝスクレアーゼによって５ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７，５）、　６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６ｍＭＮａ
ｐ／、６ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび０．１〜
／　ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む反応混合
液（０，４ｍ１）中で分解される。５時間後、該分解は
、４０μｌの０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ＤＨ８，０）お
よび２０．μ１０１０％ＳＤＳにより停止され：該混合
物は水飽和のフェノール−クロロホルム（１：１）（今
後フェノール−ＣＨＣ７１！３　と指示）で（蛋白質除
去のため）抽出されさらにエタノールでＤＮＡが沈殿さ
れる。

末端当り約８０を越えることなく平灼６０の尾部をもつ
泊−ポリマーｄＴ残清は、ＫｏｎＩエンドゝスクレアー
ゼにより産生された末端に対し以下のごとく仔牛胸腺末
端デオキシスクレオチジルトランスフエラーゼと共に付
加される二本反応混合液（０，２ｍ／）は、緩衝液とし
ての１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム−３０ｍＭ）リス
−塩酸（ｐＨ６，８）、その他１ｍＭＣＯＣｌ２、［］
、１１ｍＭジチオスレイトール０．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ
、ＫｐｎＩ　ｘン）”スフレアーゼ消化ＤＮＡおよび４
００単位の末端デオキシスクレオーチジルトランスフエ
ラーゼを含有する。６７℃で６０分処理後、該反応は、
２０μｌの０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）およ
び１０μｌの１０ｑｂＳＤＳで停止され、さらＶｃＤＮ
Ａは、フェノール−ＣＨＣｌ３で数回抽出後エタノール
沈殿法によって回収される。その後ＤＮＡは、１０７７
１’Ｍトリス、塩酸（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭｇＣ１
２，２部ｍＭＫ（Ｊ、１ｍＭジチオスレイトールオよび
０、１　ｍｌ　／　ｍｌ濃度のＢＳＡの溶液０．２　ｍ
／！中１中華７単 時間分解される。

Ｔ）ＢＲろ２２　　ＤＮＡ　複製の起源およびアンピシ
リン抵抗性を与える遺伝子を含有する巨大ＤＮＡ断片は
、アガロース（１％）ゲル電気泳動で精製されさらにガ
ラス粉末法（ＶｏｑｅｌｓｔｅｉｎおよびＧ１１ｌｅｓ
ｐｉｅ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９７９年発行。

７６巻：頁６１５−６１９）の改良法でゲルより回収さ
れる。

ａＴ−尾部をもつＤＮＡはさらにオリゴｄＡ−セルロー
スカラムへの吸着および溶出により以下のごとくさらに
精製される：ＤＮＡは１　ｍＭＥＤＴＡおよびＩＭＮａ
Ｃｌを含む１　ｍｌ（ｒ）　Ｉ　ＱｍＭ　トＩＪ　、ｘ
、−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）に溶解され、０℃まで冷
却されさらに同緩衝液で緩衝化されたオリゴｄＡ−セル
ロースカラム（０，６Ｘ２．５函）に０℃で充当される
。本カラムは、０℃において同緩衝液で洗浄されついで
富温で水により溶出される。溶出されたＤＮＡ（１，ｉ
μｇ）は、エタノールで沈殿させ、ついで１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む１［］ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，１）１
００μｌに溶解される。

オリイｄＧ−尾部をもつリンカ−ＤＮＡは、１００μ９
のｐＢＲ３２２−８Ｖ、！１０（図単位０．１９−　［
１，３２）を１２０単位のＰｓｔＩエンドゝスクレアー
ゼを用いて６７７１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ１４）、６ｍ
ＭＭｇＣＩ２，６７７１Ｍ２−メルカプトエタノール、
５０　ｍＭ　ＮａＧ／およびＱ、１　ｍｇ　／　ｍＡ濃
度のＢＳＡを含有するＱ、　２　ｍ／！中で分解して調
製される。６７℃で１．５時間後、本反応混合物はフェ
ノール−〇ＨＣ／！３で抽出されついでＤＮＡがアル７
−ルで沈殿させる。その後１Ｏ−１５ｄＧ残清の尾部が
ａＴＴＰの代りにａＧＴＰを含む以外上述反応混合液と
同−液（５０μ／）中で６０単位の末端デオキシスクレ
オチジルトランスフエラーゼにより各末端に付加される
。６７℃で２０分後本混合物からフェノール−ＣＨＣ７
？３で抽出されたＤＮＡはエタノールで沈殿された後２
０ｍＭトリス−塩酸（ＤＨ７ｉ）、７　ｍｋＡ　ＭｇＣ
Ｊ２．、、６０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊおよび０．１〜／ｍｌ
濃度のＢＳＡの含有液５０ｐｌ中で５０単位のＨｉｎｄ
　ＩＩＩエンド８スクレアーゼにより３７°Ｃにて１時
間消化される。小オリ＝／ａＧ−尾部をもつリンカ−Ｄ
ＮＡは、アガロース（１，８％）電気泳動により精製さ
れさらに上述の如く回収される。

本反応混合物（１０μＩりは、５０ｍＭ）リス−塩酸（
ｐＨ８，３）　、　８　ｍＭ　ＭｇＧ／！２．３０　ｍ
ＭＫＣ／！、［１，５ｍＭジチオスレイトール、各々２
ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰおよび　Ｐ−
ｄｃＴＰ（８５０ｃｐｍ／ｎｍｏｌ　）、０，２μｇの
ｍＲＮＡ（プライマー末端に対し約２−６倍過剰）、１
．４μｇのベクター−プライマー　Ｄ　Ｎ　Ａ　（０，
’７　ｐｍｏｌｅプライマーエンド）および５単位の逆
転写酵素を含有する（ポリＡｍＲＮＡとベクター−プラ
イマーＤＮＡとのモル比は約１，５：１から６：１に分
布する）。

ＣＤＮＡ合成は、逆転写酵素の添加で開始されさらに６
７℃で２０分間続けられる。この時間でａＣＴＰ取込率
は一定になりさらにプライマーの６０Ｌ：ｌｊ以上がＣ
ＤＮＡ合成に利用される。該反応は１μｌの０．２５　
ＭＥＤＴＡ（ＤＨ８，０）および０５μｌの１０％ＳＤ
Ｓ添加で停止され＝１０μｌのフェノール−ＣＨＣｌ３
が添加され後膣溶液は散じく渦動されさらに遠心分離さ
れる。１０／１４の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび４０μ
ｌのエタノールが該水層に添加され、ついで本溶液は１
５分間ドライアイスで冷却され、冷却中に沈殿した未反
応デオキシヌクレオシド９トリホスフエート類を溶解す
るため静かに振とうしながら室温へ戻された後エツベン
ドルフ小遠心管を用い１０分間遠心分離される。ここで
生じた啄レットは１０μｌの１　ｍＭＥＤＴＡを含む１
０ｍＭ）リス−塩酸（Ｔ）Ｈ７，３）で溶解後、４０μ
ｌのエタノールで再沈殿後さらにエタノールで洗浄され
る。

ｃ、［）ＮＡ：　ｍＲＮＡプラスミド９を含むＲレット
は、１　ｍＭ　ＧｏＣＡ２．０．１７７１Ｍ　ジチオス
レイトール、０．２μｇのポリＡ、６６μＭ３２Ｐ−ｄ
ＣＴＰ（６０００ｃｐｍ／ｐｍ○１）および１８単位の
末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを含む
１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム−ろＱｍＭ）リス−塩
酸（ｐＨ６，８）緩衝液１５μ７！に溶解される。本反
応は、末端当り１０から１５残基の付加を可能にするた
め６７℃で５分間行われその後１．５μｌの０．２５　
Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）および０，７５μｌの１０
４ＳＤＳで停止される。該反応混合液は１５μｌのフェ
ノールＣＨＣｌ！３で抽出されさらに１５μｌの４Ｍ酢
酸アンモニウムと混合され、ついでＤＮＡは、６、Ｏμ
ｌのエタノールで沈殿、再沈殿された後さらに最終Ｒレ
ットはエタノールで洗浄される。

本ベレットは７　ｍＭ　ＭｇＣ／　２．６　ＱｍＭ　Ｎ
ａｐ／および０．１　ｍＱ／ｍｌ　ＢＳＡを含有する２
０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液１０μｌに溶解された後２，
５単位のＨｉｎｄ　ｍエンドヌクレアーゼで６７℃にお
いて１時間分解される。該反応は、１μｌの０．２５　
ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）オヨヒ０．５１’（ｌ　０１
０４８ＤＳで停止された後、混合液は、フェノール−Ｇ
ＨＣ，？で抽出され、１０μ１０４Ｍ酢酸アンモニウム
が添加されさらにＤＮＡは４０μｌのエタノールで沈殿
される。ここで得られるベレットはエタノールで洗浄さ
れ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　　を含むＩＱｍＭ）リス−塩
酸（ＤＨ７，３）１０μｉに溶解された後６μｌのエタ
ノールが一２０℃で保存する間凍結防止のため添加され
る。

１μｌのＨｉｎｄ　ｌｌｌ−エンドゝヌクレアーゼで分
解したオリゴｄＣ−尾部をもつｃＤＮＡ：　ｍＲＮＡプ
ラスミド”　（０，０２ｐｍｏｌ　）は、１０ｍＭ　　
トリス−塩酸（ｐＨ７’５　）、ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、
０．１　ＭＮａＣ／および０．０１１　ｎｍｏｌのオリ
ゴａＧ−尾部をもつリンカ−ＤＮＡＣ本量は、ダブルス
トランド”ＣＤＮＡ　　。

ｍＲＮＡ量および前工程のＨｉｎｄ　ＩＩＩエンドスク
レアーゼ分解の結果残る断片に対し等量モルである）を
含む混合液（１０μｉ）中で６５℃にて２分間インキュ
ベーションされ、ついで４２℃で６０分ざらに０℃に冷
却される。該混合液（１０μｌ）は、ＡｍＭ　ＭｇＣＡ
ｚ、ＩＱｍＭ　硫安１．［１，ＩＭＫ（Ｊ、　５０μｊ
ｊ／ｒｎｌＢｓＡおよび０．１ｍＭβ−ＮＡＤを含む２
０ｍＭｈリスー塩酸（ｐＨ７，５）テ１００μｌに調製
される：さらに０．６μＩの大腸菌ＤＮＡリガーゼが添
加されその後本溶液は、１２°Ｃで一夜インキユベーシ
ョンサレる。

ダブルストラン）’ＣＤＮＡ：ｍＲＮＡストランドゝを
置換するべく、本合成混合物は、各々４０μＭ０４種デ
オキシスクレオチビトリフオスフエート類、３．１５　
ｍＭ　β−ＮＡＤ、０．ＡＰ９の追加分の大腸菌ＤＮＡ
リガーゼ、０，３μｇの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ、
および１単位大腸菌リボヌクレアーーｔ！′Ｈを含有す
るよう調製される。本混合物（１０４μｌ）は最適リペ
ア合成およびニック翻訳を促進するために１２℃でつい
で室温でそれぞれ１時間インキュベーションされる。本
反応は０，９−の冷ｉ［１ｍＭ）ＩＪスス−酸（ｐＨ７
，３）の添加で停止され、さらにそのＱ、　１　ｍｌが
０℃で保存される。

形質転換はＣｏｈｅｎ等がＰＮＡＳ　ＵＳＡ（１９７２
年発行）６９券：頁１１１Ｑ−２１１４で記述した方法
を若干変更して用い実施される。大腸菌に１２（ＨＢ　
１０１系）は２０ＷＬｌの標準り一肉汁中、６７℃でλ
６００での吸光度０．５まで増殖される。細胞は遠心分
離により集められ、５　Ｑ　ｍＭ　ＣａＣ／！２を含有
するＩＱｍＭトーリス−ＨＣ／（ＤＨ７，３）１　［１
ｒＩＬｉに懸濁されついで０℃で５分間遠心分離される
。

該細胞は２ｍｌの上記緩衝液に再懸濁され０℃で５分間
再びインキュベーションされる；その後、０、２　ｍｌ
の細胞懸濁液は［１，１ｍｌのＤＮＡ溶液と混合されさ
らにＤ″Ｇで１５分間インギュベーションされる。該細
胞を６７℃で２分間さらに室温で１０分間保った後、０
．５ｍ／！に標漁り一肉汁を添加し、さらに該培養液は
３７℃で６０分間イ”ンキュベーションされその後５０
μ９／ｍｌアンピシリンを含む寒天平板上のニトロセル
ロースフィルター上で平板培養される。３７℃で１２−
２４時間インキュベーション後、大腸菌形質転換体は、
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎお、及びＨｏｇｎｅｓｓの方法に基
いた該フィルター上でのコロニー混成法によってＬおよ
びＨ鎖ＣＤＮＡの存在が検査される。数千の形質転換体
は、６枚のレプリカニトロセルロースフィルター円板上
で増殖され、アルカリで溶解されさらに、免疫グロブリ
ンのＨおよびＬ鎖定常部に対し既述したプローブ類と混
成される。免疫グロブリンＨおよびＬ鎖をコードスる遺
伝子のクローンは同定される。混成信号陽性のコロニー
は５０μｊｊ／ｒｎｌ　　のアンビ０シリン含有り一肉
汁１リットル中で増殖され、ついでそのプラスミド５Ｄ
ＮＡ類は積属的方法（Ｇｕｎｓ−ａｌｕＢ　筑、Ｊ、Ｂ
ａｃｔ、（１９７９年発行）１ａ（１巻貝ＩＱ６−１１
６）により単離される。

細胞は既述のように溶解され、本溶解物は遠心・分離に
よって清澄化されついで清澄な分解物は等量の水で希」
され島。リボヌクレアーゼＡを５０μｇβｉ濃度に添加
し、３７℃で１時間処理後、本分解物はＴＥ緩衝液（１
ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１９ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７，９）で飽和されたフェノール０．６容量で抽出され
る。遠心分離（１６，（１００ｇ、４℃、１０分間）後
、該水層は移し換えられＩ　Ｍ　Ｎａｐ／に調製されさ
らにＤＮＡは２容量のエタノールで沈殿される。−２０
℃で数時間放置後ＤＮＡは、遠心分離（１０，０Ｏｊ９
’、　ｄ’（”、、２０分間）で沈殿、乾燥後［ＴＥ緩
衝液に溶解される。

その後各ＣＤＮＡは、制限地図化されさらに通常の手法
にて配列分析される。それ故制限地図はクローニングお
よび表現するため・に可響部をコードする。？ＤＮＡの
その後の操作をさせるべく得られる、Ｍａｘａｍおよび
Ｇ１１ｂｅｒｔがＭｅｔｂｏｄｓ　ＥｎＺｙｍｏｌ。

（１９８０律発行）６５巻：頁Ａ９９−５６０でおよび
Ｓａｎ、ｇｅｒ等がＪ、Ｍｉｌ、Ｂｉｏｌ−（１９８０
年発行）１４３巻：頁１６１−１７８で記述した方法が
それぞれ使用される。完全可変部および先頭配列をサー
トゝするＬ鎖およびＨ鎖に対するこれらＣＤＮＡクロー
ン類は、以下の操作のために選別される。

本主題の方法は、ＭＯＰＣＡｌのに一鎖（Ｌ鎖）および
骨髄腫細胞５１０７のＨ鎖の単離、配列分析および操作
により例証されるであろう。

下図はＭＯＰＣ７ｉｌのに一鎖配列であるが、先頭部、
可等部および定常部をコート９する該配列がギャップで
分離されており、定常部については最初の１６アミノ酸
が示されているのみである（　Ｓｅｉｄａｍａｎ等、”
　Ｎａｔｕｒｅ　”　（１９７９年発行）２８０巻：頁
３７０−３７５］： Ｕｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　ＧｌｙＧＡＧ
　ＡＴｒ　ＴＴｒ　ＧＧＣＴｒＣｍ　ｍ　ＣＩＴＣｍ　
ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＧＧＴ下図は、骨髄腫細胞５１０７の
Ｈ＠酊変剖のスクレオチト９配列であるが、先頭部可変
部および定常部はギャップで分離されさらに定常部につ
いては初めの９アミノ酸のみを描写する（　Ｅａｒｌｙ
等（１９８０＆発行）、Ｃｅ１１．１９巻：頁９８１−
９９２）： ＤＮＡ配列および制限地図に基き、上ニー１部位はコー
ドストランドの一１１０塩基対位およびＬｌｌｆｉをコ
ート８するＣＤＮＡの終末部位から下流において見い出
される、一方通常のＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限部位は、先頭
部から上流およびＨ４１１のコードストランドよびＨ鎖
可変部の該先頭部位およびコード配列は配列に関係なく
示したエンドヌクレアーゼ類１（より認識される。

単離されたプラスミドＤＮＡ類は、これまでの方法に従
って各々のエンドヌクレアーゼにより分解されさらにこ
こで得られる断片類は２％寒天ゲル（　Ｓｅａｋｅｍ社
）、１　５ｃｍｘ　１　５（−ｒｒＬＸ　Ｏ．２ＣｒＩ
Ｌ）−１００Ｖで２時間の電気泳動で精製される。標準
蛋白質類を用いて、おおよみの分子量がバントゝの位置
から検討される。本ゲルスライスはそのまま１、５ｍｌ
容量のエラはントゝルフ遠心管へ移し、ビライアイス−
エタノール浴中で急速な凍結融離を２度繰り返し、さら
にそのまま５分間遠心分離（　１５，０００ｒｐｍ）Ｌ
ついで上清が回収される、本上清は６倍希釈ＳＳＣ中で
ＤＮＡを変性させ同時にシンプルストランドを得るべく
煮沸されついで０°Ｃまで冷却される。

ＤＮＡ配列に基き、Ｌ鎖およびＨａの可変領域配列の非
コートゝ（抗−センス）ストランドゝの各々の短い配列
と少くとも部分的に相補的であるＤＮＡオリゴマーが調
製される。本オリゴマーは開始部位コト９ン（　ＡＴＧ
，　Ｎ−７オルミルーメチオニン［ｆ−ｍｅｔｌをその
５′−末端で有しており、さらにプライマーリにアに対
する先頭配列のＮ−末端での下流ヌクレオチド８類と相
補的であり；あるいは、その末端中間のｆ−ｍｅｔ　　
コドンをさらに試験管内突然変異誘発に対する可変部の
６′−末端コード配列と相補配列を有している。本オリ
ゴマーは、Ｉ　ｔａｋｕｒａらがＪ．Ｂｉｏ，Ｃｈｅｍ
；（　１　９　７　５年発行）１５０巻：頁４５９２で
記述した方法に従って容易に調製される。

下式は、先頭配列が保持されている（ａ、およびす、そ
れぞれに）Ｌ鎖およびＨ鎖に対するプライマ１１−Ｒア
合成法および先頭配列が除去されかつＬ鎖およびＨ釦（
ｃおよびｄ、それぞれに）の可変鎖域に対するコード配
列のＮ−末端においてｆ−ｍｅｔコドンが導入される場
合での試験管内突然変異誘発法について示している。こ
こで連続する線ハ長鎧ＤＮＡを示し、短いダッシュ線し
マ、末端を示している。

５　’　−□　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　Ｇα
□６′Ａ’ＩＧ　（１．にＡ’ＩＧ　ＡＣ路凹５’　−
　ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＧＣｉ　−　３’
３’　−　ＴＡＣ　ｃｒＧ　ＴＡＣｉ　Ｔ（ＥＣ：　Ｏ
Ｇ−　−□５’５／　　　　　　ｆｆ−　ＡＡＧ　Ｔｒ
Ｇ　’１ｍ　　　　　　　　　　　　３’ＡＴＧ　ＭＧ
Ｔ’ｍ　ＴＧＧ ５／−ＡＴＧ　ＡＡＧ　Ｔ′ｒＧＴｍ−３’３’−ＴＡ
Ｃ　ＴｒＣ　　ＡＡＧ　ＡＣＣ−５〕Ｃ。

５’　−　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＡ　ＴＧＴ　ＧＡＣ　Ａ
ＴＣ　ＣＡＧ−３’ＧＧ　ＴＡＣ：　ＣＡＧ　ＡＴＧ　
ＧＡＣ　ＡＴＣ：　Ｃ５’−ＧＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＡＴ
Ｇ　ＧＡＣＡＴＣＣ−３’３’−ＱＣＡＴＧ　ＧＴＣＴ
Ａｑ襄ＴＡＧ　Ｇ　−５７５／　　　　ＧＧ　ＴＡＧ　
Ｃ石ＡＴＧ　ＧＡＣＡＴＣＣ−３’３’　−ＣＣＡ’ｌ
ｕ　ＧＴＣＴＡＧ　ｃｒＧＴＡＧ　Ｇ　−５’ｄ。

５’　　　　　　ＧＧＴ　ＡＴＣＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＡ
Ｇ　ＧＴＧ　−３’３’　−ＣＣＡ　ＴＡＧＧＴＣＡＣ
Ａ　ＣＴＣ：　ＣＡｃ−５’しし１’　　ｊｕ’Ｕ　　
ＵＡＬｉ　　　　　　Ｇ＃ｊ　　ｌ；ｌ’Ｇ５’−ＧＧ
Ｔ　ＡＴＣＣ＆　ＡＴＧ　Ｇ旭ＧＴＧ　−３’３／−０
ＣＡＴ石ＧＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡＣ−５’０．５μｇの
ジングルストランド５ＤＮＡに上述ａおよびｂの如くに
、２００　ｍＭ　ＮａＣ７１，９ｍＭ酢酸マグネシウム
、２０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む１３ｍＭト
＋）スー塩酸緩衝液Ｄ　Ｈ７，５の６８μｌに溶解した
１　５１ｍｏｌｅ　ノ５’　−’）　ン酸化オリゴヌク
レオチドを添加した後、本混合物を６分間煮沸し直ちに
０℃へ冷却する。これに４種デオキシヌクレオシ１を、
それぞれＡｍ１Ｊに含有する液１μｌ、０．１μ１０１
００　ｍＭアデノシン三リン酸および１μｌ　（１単位
）のＤ　Ｎ　Ａ　＄　ｕメラーゼＩ（ベーリンガーマン
ノ・イム社製）のＫｌｅｎＯＷ断片を添加する。

このようにして、５′−先頭配列をコートゝするストラ
ンド８類およびコード配列あるいはＭｆ領領域コートゝ
配列そのものが合成され、かつ鴫刑非コート９ストラン
ドゝの３′−配向のジングルストランド″ＤＮＡ配列は
、３／−５’−エギソヌクレアーゼ活性で分解される。

先頭配列を含むストランドに対する結果のように、平滑
末端でかつ開始コトゝンノ骨格中にＤＮＡ配列を残すコ
ートゝストランドゝの５′−末端において開始コトゝン
を有すＬ鎖およびＨ鎖の双方の先頭配列および可変領域
をコードするために複式が得られる。

末鎖の先頭配列および可変部をコードする平滑末端複式
を得るために、明細書に記載された条件下にＴ４ポリヌ
クレオチド９リガーゼを用いて制限酵素リンカ−類が適
当なリン酸化されたリンカ−類、例えばＰＳｔＩ　ＩＪ
ンカーから合成されろ。本ベクターＴ）ＢＲ３２２は、
修飾されたＣＤＮＡへ結合させるだめの結合末端を提供
すべ（Ｐｓｔｌ　で開裂される。

各ＣＤＮＡは相補的末端をもった直線ＤＢＲ３２２と結
合される。等モルのベクターおよびＣＤＮＡ類は基本的
にＳｔｅｉｎｍｅｔｓ等が（１９３１年発行）Ｃｅ］ｌ
、　２　Ａ巻；頁１２５−１３ａで記述したようにアニ
ーリング緩衝液中で結合されさらにアニールされたＤＮ
Ａは、そのまま形質転換へ使用される。

大腸菌系ＨＢ１０１　（ＢｏｙｅｒおよびＲｏｕｌｌａ
ｎｄ　−Ｄｕｓｓｉｏｘ　が（１９６９年発行′）　Ｊ
ｌＭｏｌ−Ｂｉｏｌ。

、１１巻：頁Ａ３９−Ａ７２で＝ａ載）　ノ１　ｍｌ培
養液の一夜培養でＬ−肉汁中２×１０細胞７ｍｌまで増
殖され、菌体を遠心分離（５ｏｒｖａｌ　５Ｓ３４　ｏ
−ター、８５，０００　ｒＤｍ、４℃、５分間）で収め
さらに０．５容量の冷Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＣａＣｌ２で洗浄
される。氷上に２０分放置後、該細胞は再び遠心分離さ
れさらに０．１容量の冷３０　ｍＭ　ＣａＣＪ２　に再
懸濁される。その後０．２０　ｒｎｌの該懸濁液は、ア
ニールされたプラ、ｘ、ミビを含む０−１１ｎｌ　ノ３
０　ｍＭ　Ｃａ　Ｇ　１１２　ヘ添加されついで氷上で
１６分間インキュベーションされる。その後、各形質転
換は、５ｍｌのし肉汁を添加前に７５秒間Ａ２℃まで加
熱される、形質転換培養は３７℃にて２時間インキュイ
ージョンされる。本形質転換体は、その後Ｍ−９最少培
地および１０μｇ　Ａｌにテトラサイクリンを含む寒天
平板まで増殖される。本培地上で増殖したクローンは、
その後Ｍ−９最少培地およびＡＯμｇ、々ｆにアンピシ
リンを含有する寒天平板上へ移される。アンピシリン感
受性であり子トラサイクリン耐性のこれら細胞は、その
後所望するＣＤＮＡを含有するプラスミドの存在が検索
される。

該選択されたクローンはその後１８時間２ｍｌの栄養培
地中で増殖される。そのＱ、　５　ｍｌ、をプラスミド
ゝ抽出のためｔ　ｓ　ａｓエツＲント５ルフ遠心管へ移
す。

これら操作は特に記さない限り室温で実施される。

該遠心管は、１５秒間遠心分離され、ついで上清を微小
管刊アスピレータ−で除去後に沈殿した細胞を２献／ｍ
ｌリゾチーム、５０ｍＭ　ゲルコース、１０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡおよび２５ｍＭトＩＪｘ−塩酸（ＤＨ８，０）から
なる１００μｌのリゾチーム溶液に十分に懸濁する。

０℃で６０分間インキュベーション後、２Ｄ［ｌ！’／
　のｆｋ−ｈり性ＳＤＳ溶液（０，２Ｎ　ＮａＯＨ１１
％ト９デシル硫酸ナトリウム）を加えた後、該遠心管は
静かに渦流にて攪拌される。該遠心管を０℃で５分間保
持後１５０μ１０６Ｍ酢酸す）　ＩＩウム（ｐＨ４，８
）が添加される、数秒間静かに反転を繰り返し混和後、
ＤＮＡ塊が形成されるがそのま。

ま１６分間０℃で保持する。５分間の遠心分離後Ｑ、　
Ａ　ｍｌＯ上清を回収し別の遠心管へ移し、これに１．
７１１の冷エタノールを添加し一２０℃で６０分間保持
する。２分間の遠心分離で沈殿物を収めるがこのとき上
清は吸引により除去する。本沈殿物を１００μｌの酢酸
す）　＋１ウムに再慧濁し、ついで２００μｌのエタノ
ールを添加する、さらに−２０℃で１０分間放置後、再
び遠心分離し沈殿物を集　　　・め５０μｌの水に溶解
する。

本質的には上述した操作と同じ操作法が試験管内操作に
も使用される。プライマーリＲア合成では、唯一の均一
複式が形成される；試験管内突然変異誘発では、異質複
式が最初形成されろカー、その形質転換およびクローニ
ングによって二種の均一複式：即ち起源遺伝子配列；お
よび第１１ゴマ−中にコード化された配列の変化を含ん
だ修飾されたあるいは”所望の”遺伝子配列が生じる。

Ｃおよびｄで示したように、可変領域に対するコード配
列のＮ−末端においてｆ−ｍｅｔをコートゝする開始コ
ドンＡＴＧを導入するオリゴマーが調製される。

ここで得られるプラスミドゝＤｔＪＡは、上述の０１３
くに単離されさらに形質転換に再び使用されろ。

しカルながら、得られる形質転換体は、プラスミド単離
のため少険（２ｍ／りの接地で増殖される。

第２期クローニングサイクルから発生したシングル形質
転換コロニーから調製した本プラスミドＤＮＡは、所望
するＣＤＮＡの尾部をもつ均一複式の単離を確実にする
操作で用いられる　Ｐ−標識オリゴマーとニトロセルロ
ースフィルター上でヅロービングさせるフィルター吸着
混成法（Ｗａｌｌａｃρ等（１９７９年発行）　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ６巻：頁３５
４２−３５５６）で分析されろ。本尾部をもつ配列を含
有するクロンは単離されさらにコート８ストランド６′
−末端でのその後の工程のためのシラスミド５ＤＮＡが
抽出される。

可変領域とコードするＣＤ’ｆｌＡｋ！、　ＰｓｔＩで
分留され試験されうる。ＡＴＧ　（”開始”）コドンが
成熟ポリＲプチトゝのＮ−末端アミノ酸コドンの前に導
入される場合に前記試験管内操作での手法を繰り返すこ
とで６停止”コドンは、可変領域のＣ−末端に導入され
る、オリイヌクレオチド−は、既述のごと（可変部領域
ＣＤＮＡのコートゝ（″センス”）ストランドと相補的
配列を保持したまま調製される。

オリゴヌクレオチド８類および可変領域末端に停止コト
ゝンの挿入法の略図を以下に示す。Ｌ鎖への停止コトゝ
ンの導入はｅにおいて説明され、一方、Ｈｍへの停止コ
トゝンの導入はｆ″′ｃ′ｃ説明。ｅおよびｆにおいて
停止コドン（ＴＧＡ）にはアン〃゛−ラインをつけであ
る、 ５’−ＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＡ　０１１；Ｔ　ＧＣＴ　Ｃ
ＡＴ　Ｇ（７ＴＣＡ■−６′５’　　　ＡＡＡ　（ｎＴ
　’ＩＧＡ　ＴＧＧ　ｆ　Ａ（ＸＥ　　　３／３’　−
ＴｒＴ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　Ａ（ＥＧ　ＡＯＧｌ追−５１
５’　　　Ａｃｅ　ＧＴＣＴＣＣＴＣＡ　ＧｃＣＡＡＡ
　Ａ（？Ｇ　ＡＣＡ−３’５ＬＡｃＣＧｒＣＴＣＣＴＣ
Ａ　′ｙＳｒＡ　ＡＡＡ　Ａ（ＥＧ　ＡＣＡ　−３’６
ＬｒＧＧＧＡｃＡＧＧ　ＡＧＴ　ＡｃＴＴＩＴ　ｗ　’
ＩＧＴ−ｓ’Ｋｌｅｎｏｗ断片および４種デオギシヌク
レオシト８６リン酸の効果は、オリゴマーと非〈アーの
第１、　ヌクレオチドゝまでからそれを含んだコードス
トランドゝの３／　Ｊ端を分解し、かつコードストラン
ドゞの５′−末端と相補的オリゴマー〇３′−末端を延
長させる；それ故にオリゴヌダレチチドと深アーである
数少いヌクレオチド９以外の定常領域とコート９する全
配列は、除去されろ、一方ダプルストラン）”ＤＮＡが
反対配向で形成されろ。その後り俸およびＨ軸の可変領
域の６所望の”配列を有した異質複式は、」二■リンカ
−と結合され、Ｐｓｔｒ　エンドゝヌクレアーゼで制限
分解されＤＢＲ６２２のＰｓｔＩ部位へ挿入される。ク
ローニン〆および再クローニング後、可変領域末端での
停止コト８ンとともに所望のｄｓ　ｃＤＮＡを含有する
プラスミド９は単離され、さらに可変領域をコート９す
る配列（先頭配列をもまた含みうる）は、Ｐｓｔ、Ｉ制
限エンドヌクレアーゼを用いｏＢＨ３２２プラスミビか
ら切除され、ついでｒＦｖ　　のポリハプチト″′鎖の
表現のために使用されうろ２ 可変領域の表現を得るために、プラスミドゝＴ）ＧＭｌ
（ｐＶＨ２５５ΔｔｒｐＬＥ１ｄ１３：Ｍｉｏｚａｒｒ
ｉおよびＹａｎｏｆｓｋｖ　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
（１９７８缶発行）１６６巻：頁１１５７−ＩＡ６６）
が用いられる。木プラスミド８は、ｆ−ｍｅｔコト９ン
ＡＴＧをもった可変部領域をコートゝする配列の挿入を
提供するＰｓｔ１部位を特定の位置でＳｈｉｎｅ−Ｄａ
ｌｇａ　ｒｎ。

配列へ導入するよう修飾される。王妃のオリコヌクレオ
チトゝ配列が調製される： ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴ ｐＧＭｌ（１０μ、９）は５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ／、　
５　ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０１％ＮＰ−、！１０
および１５０μｇ／ｒｕｌの臭化エチジウムを含む１０
０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，２，１ｒＩＬｌに溶解し
たＥｃｏＲＩ　（ベーリンガーマンノ・イム社ＬＩｏｏ
ｏｉ位）で３７℃において１時間分解され１本のストラ
ンド９にニックを入れられる。本反応混液には、最終濃
度１０ｍＭまでＥＤＴＡが添加されその後容量をＱ、　
１　ｍｌまで減少させるため１０倍容量の水飽和インブ
タノールで６回、フェノール−〇ＨＣ／？　３で１回、
エーテルで２回さらにイソブタノールで１回抽出される
。

Ｑ、　５　ｒｎｌのセファデックスＧ−２５カラムを通
過させて脱塩後、本ＤＮＡはエタノールで沈殿されさら
に遠心分離により回収される。約５μｇのニックＤＮＡ
は、２ｍＭＭｇＣ７１！２および１ｍＭβ−メルカプト
エタノールを含む２０μｌの１０ｍＭ）リス−［酸、ｐ
Ｈ７，５に溶解した４０単位のエキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉ（ＢＲＬ）と６７℃にて９０分間インキュベーション
される。木反応液は濃度をそれぞれ１５ｍＭトリス−塩
酸、ＤＨ７，５，７ｍＭＮ　ａ　Ｃ／　、　７　ｍ　Ｍ
　Ｍ　ｇ　ＣＩｔ　２．７ｍＭ　ジチオスレイトールに
調製される。２０単位の細菌アルカ１１性ホスフアター
ゼ（ＢＲＬ）および５単位のＨｉｎｆｌ　（ＢＲＬ）を
添加後、分解は６７℃にて６０分間続けられる、本混合
液は最終濃度が１０　ｍＭまでＥＤＴＡが添加された後
、フェノール−ＣＨＣｌ３で２回、ニー干ルで１回抽出
され最後に水で緩衝化したＱ、５　ｍｌのセファデック
スＧ−２５を通過させる遠心分離法で脱塩される。　　
　　　□ ここで生じる環状５ｓＤＮＡの大部分はＰｓｔ、Ｉサイ
ト導入に対し前記された５／−リン酸化オＩＩ　ｉヌク
レオチド”　５０１）ｍｏｌｅ　と２　［１０ｍＭ　Ｎ
ａＣ／、９ｍＭ酢酸マグネシウム、２０７ＦＩＭβ−メ
ルカプトエタノールを含む１５ｍＭ　トリス−塩酸、Ｄ
Ｈ７５０６８μｌ中で結合され、その後６０分煮沸され
直ちに０℃まで冷却される。４種ａＮＴＰ類をそれぞれ
ＡｍＭに含む５μｌの溶液、０．５μｌの１００ｍＭＡ
ＴＰ、３μｌ（３単位）のＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片）および４μ／（１０単位）のＴ　Ａ　
Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを添如後１本混合液は１２℃で
一夜インキユベーションされ、さらに直接に大腸菌ＨＢ
１０１の形質転換に用いられる；形質転換体は、増殖さ
れ、単離されついで　Ｐ−標識オリゴマーを用いた吸着
混成法によって新Ｐｓｔｌサイトを含む尾部配列を有す
クローンを確認するため分析される。

本６所望の”　ｐＧＭｌ　は、単離されさらにＰｓｔ、
１によって部分的に制限される、さらに挿入法に対し既
述した方法に従って、前記調製した可変領域り鎖および
ＨａをコードするＤＮＡ配列がＬ鎖（１）ＧＭＩ’Ｌ）
およびＨ鎧（ｐＧＭＩＨ）をコート８するＤＮＡ配列を
有した２種のプラスミド９を提供するために各々に尾部
サイトへ挿入される、ここで生じるプラスミドゝ類は大
腸菌ＨＢ１［］１の形質転換に使用され、さらに所望す
る方向ずけでＬａおよび、Ｈ鎖可変領域配列を有すクロ
ーン類は制限地図により同定されその後精製される、 Ｌ鎖およびＨ鎖をそれぞれ認識する抗血清は、免疫原と
して特殊鋼を用いて調製され、その後膣抗血清は単離さ
れついで通常の方法（Ｍａｒｃｈ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｂｅｍ、　（１９７１年発行）６０巻：頁１４９−１
５２）によってセファロースに共有結合さ、れた後肢調
製物はアフィニティーカラムに用いられる。

本形質転換体は、細胞密度が約１０　細胞／ｍｌまで増
殖された後、遠心分離によって回収さｔ１７る。

得られた沈殿は、５ＱｍＭ　ＥＤＴＡ　、１５％シ：＋
糖、１ｍＱ／ｄ４リゾチーム、０．５％ＮＰＡＱを含む
５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ８の５０μｉに再懸濁され
る。０℃にて６０分放置後２８０ｍＭＭｇＣ１２，１１
ｍＭ　Ｃａ（Ｊ２および１μｊｑ　ＤＮａｉｅを含む１
５０ｙｎＭ）ＩＩＸ−塩酸、ｐＨ７，５の１０μｌを添
加し、ついで１２．００’０４９で１５分間遠心分離さ
れる。

その後膣蛋白質は、沈殿と上清とを分離して単離されさ
らに木上清はトリス−塩酸、ｐＨ７，５で緩衝化した免
疫吸着カラム（０，１５ｍ／りに通過されるｎ　ｒＦｖ
のＬ鎖およびＨ鎖は、１Ｍ酢酸、ｐＨ２，５で溶出され
、該溶出液は集められ０℃においてｐＨ５，５まで中和
される。該集収溶出液は、１００容量の酢酸緩衝液ｐＨ
５，５に対し３回、ついで１００容量のＰＢＳｐＨ７に
対し６回透析される。

もしも、ｒＦｖ　の復元Ｌ＠およびＨ鎖が同一起源であ
る場合、それらはｒＦｖ組成物を含む溶出　　。

液をまとめて後ＤＮＰ−アフィニティーカラムを通過さ
せることでさらに精製されうる。（本実施例では、Ｈｅ
およびＬａの起源が異ることから本工程は除かれる）。

ＤＮＡ−アフィニティーカラムとその方法は、Ｋｏｏｉ
ｓｔｒａおよびＲｉｃｈａｒｄｓによりＢｉｏｃｈｅｍ
、（１９７８年発行）１７巻：頁３ａ５−３５１におい
て記述されている。結合したｒＦｖは、１Ｍ酢酸の溶出
で単離されついで上記連続透析で復元される、さらにＳ
Ｈ−基類はＫｏｏｉｓｔ、ｒａおよびＲｉｃｈａｒａが
同雑誌で記載したようにヨービアセタミト８で保護され
うろ。

水沫は、既決ハブテンサイトに対し高親ｔｏ　性ヲもつ
化合物を形成する２つのはプチド鎖を有する均一組成の
蛋白性化合物を提供する。天然に存在する免疫グロブリ
ンを模写することによって、該２種の鎖は、特殊リガン
ドに対し特異性を有するｒＦｖ　を形成する。定常領域
が無い場合、生じろｒＦｖはイムノジエン性が減少され
さらに特殊適用１例えば補体結合に対し望ましくない棲
能を持ちうるＲプチビ配列を欠く、 ｒＦｖは、種々の用途で診断、治療に使用されうる、本
組成は均一でありため一定の再現性をもつ免疫性を有し
ている。また、その低分子量に起因して、哺乳動物宿主
へ投与後の体内滞在期間は比較的短期でありうる。この
ことは、診断あるいは治療のためにｒＦｖが放射性核種
、重金属、細胞毒素およびこれら類似物のような危険標
識を用いて標識される場合に特に重要なことであるとい
えろ、短期滞在期間は％　ｒＦｖを生体内の生理活性物
質例えばホルモン、酵素１表面レセプター、リンノミ球
またはその他およびこれら類似物の抑制疋使用する場合
にも重要でありうる。

均一の組成は制御さ・れた標識を可能にする、即ち、１
本または他の１本あるいは双方の錆止の特殊サイトを標
識する能力が増加される。該均一性は制御された接合、
正確な治療能力の判定、治療効果の簡便な追跡結果の再
現性の増大および副作用の制御および観察の易容性を可
能にする。

本発明は既決した適用サイトに対する結合サイトの形成
に召集されうるポリはプチドの簡便な合成法を提供する
ことである。水沫にしたがって調製されたＬ＠およびＨ
鎖は、リガント９の有無に関係なく召集されうろ。また
本発明は特殊用途、例えばチロシンの放射性ヨービ化に
対して錆止のいずれかの末端における特殊アミ／゛酸の
導入を可能にする。可変領域をコート８するＤＮＡ起源
としてのモノクロナール混成細胞の使用により、本来性
している結合能力は保持されたまま結合親和性を様々に
変化させうる。

本発明のプラスミドゝの名称はＰ（デルタ）ＩＫ３５２
０／ＬＥ３９２である。これは遺伝子操作微生物である
。生育培地はＬ−ズイヨン（またはＬ−寒天）およびア
ンピシリンナトリウム（５０〜１００μ’ｊ／ｌｄ）で
ある。培地の代表的組成は、酵母エキス（５ｇ／ｌ）、
トリプトン（１０ｇ／７り、ＮａＣＪ（０，５ｇ／　１
３　）を混合し、これにＮａＯＨを添加してｐＨを７．
０とした後、アンピシリンナトリウム５０〜１００μｊ
ｊ　／ｍｌを添加してなる。従って、最終培地のＤＨ値
はＺＯである。培地の殺菌条件は１２０℃で２０分間行
なう。このプラスミド８は好気性であり、３７℃で振＋
うプラットフォーム上で培養される。

特許出願人　　シエリング・コーポレーション第１頁の
続き ｏＩｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（Ｃ
Ｉ２　Ｐ　２１１００　　　　　　　　　　　　−Ｃ１
２Ｒ１／１２５）　　　　　　　　　　６７６０−４８
（Ｃ１２Ｐ　２１１００　　　　　　　　　　　　−Ｃ
１２Ｒ１／８６５）　　　　　　　　　　６７６０−４
Ｂ［相］発明者　　アレジャンドロ・ザツファ口一二 アメリカ合衆国カリフォルニア 州９４０２５アサートン・イザベラ ・アベニュー１６８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、形質転換された表現ベクターあるいはプラスミド９
   であって、該ベクターまたはプラスミドは既決したりガ
   ントに特異な免疫グロブリンの軽（Ｌ１句または重同鎖
   の可変領域をコードするｄ　ｓ　ＤＮＡ配列を有するが
   前記領域に不要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチ
   ド９類を欠如しており、さらに前記ＤＮＡ配列の５７−
   末端および３′−末端のそれぞれにおいて開始および終
   止コト５ンを備えていることを特徴とする前記ベクター
   またはプラスミドゝ。 ２．６ｓＤＮＡ配・列は、免疫グロブリン１感のＬｍあ
   るいはＨ鎖の可変領域をコート９するものである特許請
   求の範囲第１項記載のベクターあるいはプラスミド。 ６、　ｄＳＤＮＡ配列は、リガンドである酵素に特異な
   免疫グロブリンのＬｍあるいはＨ４１１の可変領域をコ
   ードするものである特許請求の範囲第１項記載のベクタ
   ーあるいはプラスミド。 ４、ｄｓＤＮＡ配列は、リガンドである表層蛋白質に特
   異な免疫グロブリンのＬ鎖あるいはＨ１ｌ’ｌの可変領
   域をコードするものである特許請求の範囲第１項記載の
   ベクターあ名いはプラスミド。 ５、ｄｓＤＮＡ配列は、約９５−１１５１７）７ミノ酸
   残基を有するＬ＠の可変領域をコードするものである特
   許請求の範囲第１項記載のベクターあるいはプラスミド
   。 ６、ｄｓＤＮＡ配列は、約１１０−１２５のアミノ酸第
   基を有すＨ鎖の可変領域をコードするものである特許請
   求の範囲第１項記載のベクターあるいはプラスミド９゜ ７、　ｄｓ　ＤＮＡ配列は前記Ｈ錯の少くともＤ領域を
   コードするものである特許請求の範囲第１項記載のベク
   ターあるいはプラスミド。 ８、特許請求の範囲第１項−第７項のいずれか記載ノベ
   クターあるいはプラスミドゝにより形質転換された宿主
   。 ９　形質転換された表現ベクターあるいはプラスミドを
   運搬する形質転換宿主であって、眩ベクターまたはプラ
   スミドは既決したりガント７に特異な免疫グロブリンの
   Ｌ鎖またはＨ鎖の可変領域をコードするｄｓ　ＤＮＡ配
   列を右するが前記領域に不要なアミノ酸残基をコードす
   るヌクレオチド類？欠如しており、さらに前記ＤＮＡ配
   列の５７−末端および６′　−末端のそれぞれにおいて
   開始および終止コドンを備えていることを特徴とする前
   記形質転換宿主。 １０、前記宿主は細菌である特許請求の範囲、第８項ま
   たは＠９項記載の宿主。 １１、　　前記宿主は、大腸菌である特許請求の範囲第
   １０項記載の宿主。 １２、前記宿主は酵母である特許請求の範囲第８項また
   は第９項記載の宿主。 １６、既決したりガントに特異な免疫グロブリンのＬｌ
   ｌまたはＨ鎖の可変領域をコードするｄｓ　ＤＮＡ配列
   を有するが前記領域に不快なアミノ酸残基をコードする
   ヌクレオチド類を欠如しておりさらに前記ＤＮＡ配列の
   ５′−末端および６′−末端のそれぞれにおいて開始お
   よび終止コドンを備えている。形質転換された表現（フ
   タ−あるいはプラスミドを運搬する方法であって。 該方法は； 前記鎖をコードするｍ　ＲＮＡより少くとも前記り鎖あ
   るいはＪｌの１本をコードするｄｓ　ｃＤＮＡ　の調製
   ； 前記可変領域に対し不要なヌクレオチド配列の前記ｄｓ
   　ｃＤＮＡからの除去、および前記可変領域をコート９
   する必要に合ったｄｓ　ｃＤＮＡを提供するためのＨＤ
   ＮＡ配列５′および６′−末端それぞれで開始および終
   止コドンを折供； さらには、前記ｄｓ　ｃＤＮＡ表現のための必要に合っ
   たｄｓｃＤＮＡ　　の表現ベクターへの挿入操作からな
   ることを特徴とす歪。 １４、前記開始および終止コ°トンは試験管内突然変異
   誘発によって提供されたものである特許請求の範囲＠１
   ３項記載の方法。 １５、前記挿入操作前に、異なるアミノ酸をコードする
   コドンと変換するため前記ｄｓ　ＤＮＡ中の少くとも１
   個のヌクレオチドの置換操作を追加工程として有する特
   許請求の範囲第１６項または第１４項記載の方法。 １６、特許請求の範囲第１２項−第１５項のいずれかに
   記載の方法であって、該方法は；ａ）定常領域と可変領
   域から構成され、この場合該可変領域は約９５から１２
   ５のアミノ酸残基を有する免疫グロブリンのＬＭまたは
   Ｈ鎖をコードするｄｓｃＤＮＡを調製する工程、ここで
   、該ｄｓｃＤＮＡ調製工程は、前記鎖をコードするｍＲ
   ＮＡを単離し；前記ｍＲＮＡを逆転写してｓｓ　ｃＤＮ
   Ａ　　を生成し；前記ｓｓ　ｃＤＮＡ　　と相補的なス
   トランドをＤＮＡポリメラーゼによって合成して前記Ｉ
   ＪＩＩまたはＨ鎖をコードするコードストランド ｃ　ＤＮＡを生成し；そして、前記ｄｓ　ｃＤＮＡ　を
   クローン化することからなり，前記コードストランドは
   ．前記コードストランドの５’−３’配向中の前記免疫
   グープリンの先頭配列，可変領域および定常領域をコー
   ドするＤＮＡ配列を含有している；ｂ）前記クローン化
   ｄｓ　ｃＤＮＡ　　よりコード化あるいは非コード化ｓ
   ｓ　ｃＤＮＡ　ストランドをもたらす工程； 次いで、下記の工程ｃ）、　　ｄ）、　　ｅ）およびｆ
   ）をｄｅｃｆあるいはｃｄｅｆＯ順で行なう：Ｃ）先頭
   領域および可変領域に対するコード配列の接合点での非
   コードストランドと開始部位を規定する開始コドンを保
   有した第１オリゴヌクレオチドプライマーとを混成して
   第１複式を生成し。 ついで本複式を酵素的に処理することで前記非コード化
   ＳｓＣＤＮＡに対して相補的５’−３’配向の第１オリ
   ゴヌクレオチドプライマーを延長し，さらに他配向前記
   非コー）’　ｅｓ　ｃＤＮＡ　を前記第１オリゴヌクレ
   オチド９プライマーを相補的配列まで分解して所望のＮ
   −末端ｄｓ　ｃＤＮＡを生成する工程；ｄ）可変領域お
   よび定常領域の接合点をコードするＤＮＡ配列でのコー
   ドストラン、ドと停止コ１゛ンを含む第２オリイヌクレ
   オチドプライマーとを混成して第２複式を生成し，つい
   で本複式を酵素的に処理し前記コードストランドに相補
   的な５’−３’配向の第２オリゴヌクレオチド９プライ
   マーを延長し、さらに他配向の前記コード化ｓｓ　ｃＤ
   ＮＡ　　と前記第２オリイヌクレオチドプライマーと相
   補的配列まで分解して所望のＣ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡ　
   を生成する工程； ｅ）所望のＣ−あるいはＮ−末端を有する得られたｄｓ
   　ｃＤＮＡをクローン化し；所望のＣ−またはＮ−末端
   を有する得られたｄｓ　ｃＤＮＡをコードおよび非コー
   ドストランドゝへ分離する工程；さらには本工程が工程
   ｄ）から続く場合は前記コードストランド コードストランドを利用することを含む：さらにｆ）得
   られた所望のＮ−およびＣ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡをクロ
   ーン化し；ついで所望のＮ−およびＣ−末端ｄｓ　ｃＤ
   ＮＡ　　を転写および翻訳の制御信号と密接な関係をも
   つ前記コート９配列を有した表現ベクターまたはプラス
   ミドへ挿入する工程；がら構成されている。 １２、特許請求の範囲第１６項記載の方法であって該方
   法は： Ａ）定常領域と可変領域から構成され，この場合該可変
   領域は約９５から１２５のアミノ酸残基を有する免疫グ
   ロブリンのＬ＠またはＨ鎖をコードするｄｓ　ｃＤＮＡ
   を調製する工程，ここで、該ｄｓｃＤＮＡ調製工程は，
   前記釧をコードするｍ　ＲＮＡを単離し；前記ｍＲＮＡ
   を逆転写してｓｓ　ｃＤＮＡ　　を生成し：前記ｓｓ　
   ｃＤＮＡと相補的なストランドをＤＮＡポリメラーゼに
   よって合成して前記ＬｉまたはＨ舒をコート９するコー
   ドストランドを有するｄｓｃＤＮＡを生成し；そして、
   前記ｄｓ　ｃＤＮＡ　　をクローン化することからなり
   、前記コードストランドハ，前記コードストランドゞの
   ５′−６′配向中の前記免疫グロブリンの先頭配列、可
   変領域および定常領域をコードするＤＮＡ配列を含有し
   ている；Ｂ）クローン化したｄｓ　ｃＤＮＡをコードお
   よび非コードストラ”ンドとに分離することによって前
   記り鎖またはＨ鎖の可変領域と接する部位をコードする
   部位を少くとも除去し：さらに，可変領域を表現する開
   始部位を規定する開始コドンを有する第１オリイヌクレ
   オチドプライマーを非コードストランドと混成して第１
   複式な生成し、この場合。 前記オリゴヌクレオチドプライマーは先頭領域のコード
   配列を相補的であるか，または先頭領域および可変領域
   の接合点をコードするＤＮＡ配列と部分的に相補的であ
   りかつ前記接合点附近では非相補的開始コドンを有する
   ；ここで得られた本複式の酵素的に処理して前記非コー
   ト’ｓｓ　ｃＤＮＡ　に対し相補的な５′−ろ′配向の
   第１オリゴヌクレオチドプライマーを延長し：さらに他
   配向の前配非コー　ト４ｓｓ　ｃＤＮＡを前記第１オリ
   ゴヌクレオチドゞブライマーと相補的配列まで分解して
   所望のＮ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡを生成し；得られた所望
   のＮ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡをクローン化し；得られた所
   望のＮ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡをコードおよび非コードス
   トランドへ分離し；コート９化ストランドに対し停止コ
   ドンを含み前記可変領域および定常領域の接合点附近の
   配列と相補的オリゴヌクレオチドブライマーとを混成さ
   せて第２複式を生成し，この場合，前記停止アンチコド
   ンは前記接合点のものでありかつそれによって前記可変
   領域未着で停止コドンを導入できる；得られた複式を酵
   素的に処理して前記コード化ストランドに相補的な５’
   −３’配向の第２オリゴヌクレオヂドプライマーを延長
   し；さらに他配向の前記コード化ｓｓ　ｃＤＮＡ　を前
   記オリゴヌクレオチドプライマーと相補的配列まで分解
   して前記免疫グロブリンの定常領域を含まないＬ鎖およ
   びＨ鎖の可変領域をコートゝする所望のＮ−およびＣ−
   末端ｄｓ　ｃＤＮＡを生成し；　得られた所望のＮ−お
   よびＣ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡ　をクローン化し；更に、
   所望の前記Ｎ−およびＣ−末端ｄ．ｓｃ　ＤＮＡを転写
   および翻訳の制御信号と密接な関係をもつ前記コード配
   列を保持した表現Ｒフタ−あるいはプラスミドへ挿入す
   る工程からなる。 １８、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは。 前記先頭配列のＮ−末端において前記非コードストラン
   ド 求の範囲第１７項記載の方法。 １９　前記第１オリイヌクレオチドブライマーは前記先
   頭配列および前記可変領域の接合点附近で前記可変領域
   をコードするＤＮＡ配列のＮ−末端において開始コドン
   を導入するものである特許請求の範囲第１６項記載の方
   法。 ２０　前記挿入操作前に、前記の所望のＮ−およびＣ−
   末端ｄｓ　ｃＤＮＡ　　に対し独特の制限リンカ−を結
   合させ、前記リンカ−を酵素的に分解して結合末端をも
   たらす追加工程を含む特許請求の範囲第１６．１８およ
   び１９項のいずれかに記載の方法。 ２１、　　少くともひとつのオリゴヌクレオチドプライ
   マーは、前記ＤＮＡストランドに対し極めて部分的に相
   補的である特許請求の範囲第１６．１８および１９項の
   いずれかに記載の方法。 ２２、各混成工程後の前記クローン化は、前記第１ある
   いは第２オリゴヌクレオチド配列をもつクローンの選択
   、前記ｄｓ　ｑＤＮＡを含むＤＮＡ　の単離および該ｄ
   ｓ　ｃＤＮＡの再クローン化の追加工程を含むものであ
   る特許請求の範囲第１６−２１項のいずれかに記載の方
   法。 ２３、蛋白質あるいは酵素ポ１７．５プチドの所望部位
   のみをコードするＤＮＡ配列を運搬し、かつ前記ＤＮＡ
   配列の５７−および６′−末端それぞれに開始および停
   止コドンを備えた形質転換された表現ベクターするいは
   プラスミドの製造方法であって：該方法は： 前記蛋白または酵素をコードするｍ−ＲＮＡからｄｓ　
   ｃＤＮＡを調製する工程；前記ｄｓ　ｃＤＮＡから余分
   なヌクレオチド配列を前記ポリはプチド鎖の所望部位へ
   移し、さらにＤＮＡ配列の５′−および３′−末端それ
   ぞれに開始および終止コドンを提供して前記ポリペプチ
   ド鎖の所望部位をコードする所望のｄｓ　ｃＤＮＡ生成
   する工程；さらに前記ｄｓｃＤＮＡを表現する表現ベク
   ターへ前記所望のａＳｃＤＮＡを挿入する工程からなる
   ことを特徴とする。 ２４゜前記開始および終止コドンは、試験管内突然変異
   誘発によって調製される特許請求の範囲第２６項記載の
   方法。、 ２５、前記挿入操作前に、前記ｄｓ　ｃＤＮＡ　中の少
   くとも１個のヌクレオチドを置換することによって、異
   るアミノ酸をコードするコドンと変換する追加工程をも
   つ特許請求の範囲第２６項または第２４項に記載の方法
   。 ２、特許請求の範囲第２３−２５項のいずれかに記載の
   方法であって、該方法は： ａ）前記鎖をコードするｍＲＮＡを単離し；前記ｍＲＮ
   Ａを逆転写してｓｓ　ｃＤＮＡを生成し；前記５ｓｃＤ
   ＮＡと相補的なストランドをＤＮＡポリメラーゼによっ
   て合成して前記り鎖またはＨ鎖をコードするコードスト
   ランド そして、前記ｄｓ　ｃＤＮＡをクローン化する工程によ
   って前記ポリペプチド鎖をコードするｄｓ　ｃＤＮＡを
   調製し，前記コードストランド トランド ンの先頭配列，可変領域および定常領域をコー１−゛す
   るＤＮＡ配列を含有している； ｂ）前記クローン化ｄｓ　ｃＤＮＡよりコード化あるい
   は非コード化ＳＳ　ＣＤＮ／１．ストランドをもたらし
   ；さらにその後は工程ｃ）、　　ｄ）、　　ｅ）および
   ｆ）をｄｅｃｆあるいはｃ　ｅｄ　ｆＯ順で行なう：Ｃ
   ）所望部位の開始点および不要部に対するコード配列の
   接合点で非コードストランド を規定する開始コドンを保有した第１オリコ゛ヌクレオ
   チドプライマーとを混成して第１複式を生成し、ついで
   本複式を酸素的に処理することで前記非コード化ｓｓ　
   ｃＤＮＡに対し相補的５’−３’　　配向の第１オリゴ
   ヌクレオチドプライマーを延長し。 さらに他配向前記非コート’ｓｓ　ｃＤＮＡを前記第１
   オリイヌクレオチドプライマーと相補的配列まで分解し
   て所望の一末端ｄｓ　ｃＤＮＡを生成し；ｄ）所望部位
   の終末と不要部位との接合点をコードするＤＮＡ配列で
   のコードストランドンを含む第２オリゴヌクレオチドブ
   ライマーとを混成して第２複式を生成し，ついで本複式
   を酵素的ニ処理し前記コードストランドに相補的な５′
   −５′　配向の第２オリゴヌクレオチドプライマーを延
   長し、さらに他配向の前記コード化ｓｓ　ｃＤＮＡを前
   記第２オリイヌクレオチドプライマーと相補的配列まで
   分解して所望のＣ−末端ｄｓ　ｃＤＮＡ　を生成し； ｅ）得られた所望のＣ−またはＮ−末端ｄｓ　ｒＬＩＮ
   Ａをクローン化し；得られた所望のＣ−またはＮー末端
   ｄｓ　ｃＤＮＡ　　をコート１および非コート９ストラ
   ンドへ分離し；さらには本工程が工程ｄ）から続く場合
   は前記コードストランド り続く場合は，前記非コードストランドを利用すること
   を含む； さらにｆ）得られた所望のＮ−およびＣ−末端ｄｓｃＤ
   ＮＡをクローン化し；ついで所望のＮ−およびＣ−末端
   ｄｓ　ｃＤＮＡを，転写および翻訳の制御信号と密接な
   関係をもつ前記コード配列を有した表現ベクターまたは
   プラスミドへ挿入する工程から構成されている。 ２Ｚ　各混成工程後の前記クローン化工程は前記第１あ
   るいは第２オリゴヌクレオチド配列をもつクローンの選
   択，前記ｄｓ　ｃＤＮＡを含むＤＮＡの単離および該ｄ
   ｓ　ｃＤＮＡの再クローン化といった追加工程を含むも
   のである特許請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２、特許請求の範囲第１６項から２７項のいずれかで記
   載した方法で調製された形質転換された表現（フタ−あ
   るいはプラスミｒ０ ２、特許請求の範囲第２８項記載の表現ベクターあるい
   はプラスミドにより形質転換された宿主。 ３０、既決リガンドに対し特異的な免疫グロブリンのＬ
   ＠あるいはＨ鎖の可変領域の少くとも１部のアミノ酸配
   列から本質的に構成される結合性ポリペプチドの調製法
   であり、この場合前記アミノ酸配列は本質的に類似鎖の
   結合特異性を有しており； 前７記方法は： 前記鎖をコードするｍＲＮＡから少くとも前記り鎖ある
   （・はＨ釧の一方をコードするｄｓ　ｃＤＮＡ　　を調
   製し； 前記ｄｓ　ｃＤＮＡから不要なヌクレオチド配列な前記
   可変領域へ移動させ，さらに該ＤＮＡ　　配列の５７−
   および３′−末端それぞれの位置に開始コドンおよび終
   止コドンを与えて前記可変領域をコードする所望のｄｓ
   　ｃＤＮＡを調製し；前記ｄｓ　ＣＤＮＡ表現のため表
   現ベクターへ前記所望のｄｓ　ＣＤＮＡを挿入しさらに
   前記所望のｄｓｃＤＮＡを伴った前記表現はフタ−に対
   する宿主へ形質転換し； 前記形質転換宿主を増殖させて前記り鎖およびＨｅの一
   方の前記結合性ポリペプチドを表現させ；さらに 前記結合性ポリペプチドを単離する工程から構成される
   。 ３１　前記宿主は，細菌である特許請求の範囲第３０項
   記載の方法。 ３２、前記宿主は酵母である特許請求の範囲第６０項記
   載の方法。 ３６、　　前記免疫グロブリンはＩｇＧである特許請求
   の範囲第３０項から３２項のいずれか記載の方法。 ６４、　　前記Ｈ鎖の可変領域は，Ｄ配列を含む特許請
   求の範囲第３０項から６２項のいずれか記載の方法。 ろ５、前記リガドンは酵素である特許請求の範囲第６０
   項から３２項のいずれか記載の方法。 ６６　前記リガンドは，表層蛋白質である特許請求の範
   囲第ろ０項から６２項のいずれか記載の方法。 ３２、特許請求の範囲第６０項から６６項のいずれか記
   載の方法で調製および単離されるポリペプチド類。 ３８、酵素あるいは蛋白質の不要部を含まないポリペプ
   チドの一部の調製法であって； 前記方法は： 特許請求の範囲第８項から１２項あるいは第２９項のい
   ずれか記載の形質転換宿主を増殖させて前記ポリはプチ
   ドを表現させ：さらに前記ポリペプチドを単離する工程
   から構成される。 ６９　前記ポリペプチドは、既決りガントに対し特異的
   な免疫グロブリンのＬ鎖あるいはＨ鎖の可変領域の少く
   とも一部のアミノ酸配列から本質的に構成される結合性
   ポリペプチドであり，前記アミノ酸配列は本質的に類似
   鎖の結合特異性ケ有している特許請求の範囲第３８項記
   載の方法。 ４０　特許請求の範囲第３８項あるいは第３９項記載の
   方法で調製されたポリペプチド。 ４、１　　既決りガントに対し結合特異性を有する免疫
   グロブリンの可変領域の少くとも一部のアミノ酸配列を
   本質的に有するが定常領域については欠如している２本
   のポリペプチド鎖からなる特異結合性組成物であり、こ
   の場合２本のポリペプチド邸は前記既決リガンドに対し
   高親和性と特異性なもった化合物の形成に関与する前配
   絹成物。 ４２、前記２本のポリペプチド鎖は、約９５から１１５
   アミノ酸残基のＬ鎖および約１１０から１２５残基のＨ
   鎖であり、この場合前記Ｈ鎖はＤ領域を含んでいる特許
   請求の範囲第４１項記載の組成物。 ４６、前記俸の各々は約６０から７５のアミノ酸で分離
   された少くとも２残基のシスティンを含みさらにジスル
   フィド結合によってドメインを形成し結合されている特
   許請求の範囲第４１項あるいは第４２項記載の組成物。 ４４、　　認識信号を示しうる官能基で標識された特許
   請求の範囲第４１項から４３項のいずれか記載の組成物
   。 ４５、細胞毒試薬で標識された特許請求の範囲第４１項
   から４３項のいずれか記載の用成物。 ４６、前記細胞毒試薬は放射性核物質である特許請求の
   範囲第４５項記載の組成物。