JPS6143121A - 組換え体因子８―ｒ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的にいって構造遺伝子クロンの分野および
このような遺伝子を所望のタンパク生成物の合成に向け
られ九組換えＤＮＡに使用することに関する。更に詳し
くは、本発明は新規な因子ＶＩＩＩタンパク質（因子Ｖ
ＩＩＩ−Ｒ）、その組換え体ＤＮＡ指向合成、および凝
固不調症たとえばホン・ウィルブランド疾患の治療にお
ける使用に関する。

一般に、組換ＤＮＡ技術は今や周知になった。Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ（アカデミ−・プレス）Ｖｏｌ　　６５，
６８　　（１９７９）。

１００．１０１（１９８３）およびそれらに引用されて
いる文献を参照されたい。これらのすべてを引用によっ
てここにくみ入れる。最もふつうに使用される組換え体
ＤＮＡ方法論を用いる広範な技術的討議はマニアティス
らのＭｏ１ｅｃｎｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　コーＡ／
ドｅスプリングーハーバー串ラボラトリ−（１９８２）
に見出される。種々のポリペプチド用の遺伝子フードは
、ポリペプチドをコードするＤＮＡ破片を組換え体ＤＮ
Ａ担持体たとえばバクテリアもしくはウィルスのベクト
ルに組入へ好適な宿主代表的に紘エスチェリチアコリイ
（イー・コリイ）細胞線を変態させ、そして組換え体ベ
クトルを組入れているクロンを単離することによって複
製しうる。このようなりロンを生長させて、所望のポリ
ペプチドを大規模に製造するために使用することができ
る。

若干のグループの研究者拡ユーカリオテイック細胞から
ｍＲＮＡの混合物を単離艮一連の３つの酵素反応を使用
して全遺伝子（このｍＲＮＡ混合物の補形である）の２
重ストランドＤＮＡコピーを合成した。この第１反広に
おいて、ｍＲＮＡはＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ（リ
バース・トランスクリブターゼとも呼ばれる）によって
転写されて単一ストランドの補形のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
となる。５’−３’方向のリバース・トランスクリプタ
ーゼ合成りＮＡは前駆体としてデオキシリボヌクレオシ
ド５′−トリホスフェート管使用し、テンブレ／と一次
ストランドの双方を必要とする。後者は３′−ヒドロキ
シル末端のないものでなければならない。リバース・ト
ランスクリプターゼ生成物は、ｍＲＮＡテンプレートの
部分コピーであれ完全コピーであわ、多くの場合、その
３′−末端に短い部分的に二重ストランドのヘアピン（
ループ）をもつ。第２の反応において、これらの６ヘア
ピン・ループ”はＤＮＡポリマラーゼ用のプライマーと
して利用できる。あらかじめ作成されたＤＮＡはＤＮＡ
ポリマラーゼの作用におけるテンプレートとして及びプ
ライマーとして必要である。ＤＮＡポリマラーゼは３′
−遊離ヒドロキシ基をもつＤＮＡストランドの存在を必
要とし、この３′−遊離ヒドロキシ基に新しいヌクレオ
チドが付加して５’−３’７Ｆ向の鎖を伸ばす。このよ
うな連続リバース・トランスクリプターゼとＤＮＡポリ
マラーゼとの反応生成物は一端にループをもつ。このよ
うにして生成された２重ストランドＤＮＡのループもし
くは１折り曲げ点″（ｆｏｌｄ−ｐｏｉｎｔ　）の頂点
は単一ストランド・セグメントである。第３の反応にお
いて、この単一ストランド・セグメントはこの単一スト
ランドに特異なスフレアーゼＳｌで開裂して“鈍い端部
”の２重ＤＮＡセグメントを発生する。この一般法は任
意のｍＲＮＡ混合物に適用され、ビュエルらのＪ−Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　２５３：　　２４８３（１９
７８）に記載されている。

生成した２重ストランドｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）は
、使用される特定の担体に少なくとも部分的に依存する
が、多くの周知技術のうちの任意のものによって複写用
担体に挿入される。種々の挿入法がＭｅｔｈｏｄｓ　Ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

６８：１６−１８にかなシ記載されてお夛、この文献を
と・こに引用する。

これらの複製用担体は通常は宿主に抗性物質耐性を与え
る。ひとたびＤＮＡセグメントを挿入すると、複製用担
体は好適な宿主を変態させるために使用される。このよ
うな宿主は一般にグロカリオティック細胞またはユーカ
リオテイック細胞である。この点で、変態宿主の数糧の
みが所望のｅＤＮＡを含む。すべての変態宿主の合計は
遺伝子“ライブラリー”を構成する。この方法によって
生じた全ｄｓ−ｃＤＮＡライブラリーは出発物質として
使用されるｍＲＮＡ混合物に存在するコード情報の代表
的試料を与える。

適切なオリゴヌクレオチド系列が利用できるならば、そ
れを次のようにして関心のあるクロンを同定するのに使
用することができる。個々の変態細胞はコ日ニーとして
又はニトロセルローズ済紙上で生長させる。これらのコ
ロニイを溶解し、そのようにして放出されたＤＮＡを加
熱によってＦｇに共有結合させ、このシートを標識付き
オリゴヌクレオチド・プローブと共に培養する。このプ
ローブ系列は関心のある構造の遺伝子に対して補形であ
る二このプローブはこれと補形の関係にあるｄｓ−ｃＤ
ＮＡでフィブリド化し、そしてこれは放射線写真によっ
て同定される。このクロンは所望のタンパク質の構造上
の情報のすべてを含むクロンを同定する特徴がある。関
心のあるタンパク質をコードする核酸系列は単離され表
示ベクトル中に再挿入される。

表示ベクトルは複写された十分な長さのｄｓ−ｃＤＮＡ
の有効表示（転写および転換）を可能にする特定のプロ
カリオティックまたはユウカリオティックの制御要素の
規則制御のもとて複製クロンをもたらす。従って、この
−膜技術はアミノ酸またはＤＮＡ系列の少なくとも１部
が知られておシ且つそのためのオリゴヌクレオチド・プ
ローブが利用しうるタンパク質に対してのみ適用可能で
ある。一般的には上記のマニアナイスらの報文を参照さ
れたい。

更に近年になって、関心のあるコード化タンパク質に対
して特異な抗体でバクテリア・コロニーを探索すること
によって特異クロンを同定する方法が開発された。この
方法は生成物であるタンパク質の仕上げが必要なので１
表示ベクトル”複製用担体と共にのみ使用しうる。構造
遺伝子が、タンパク質の表示を誘起する規則遺伝子系列
に隣接するベクトル中に挿入される。これらの細胞はベ
クトルによって又は化学的方法によって溶解され、そし
てりｙバク質は特定抗体および積繊系たとえば酵素免疫
分析によって検出される。この例はヤングおよびデビス
によってＰｒｏｃ−Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ、８０　：１１９４−１１９
８（１９８３）に、そしてヤングおよびデビスによって
５ｃｉｅｎｃｅ、　２２　ニア７８（１９８３）に記載
されている。

通常のヒト血漿は因子ＶＩＩＩ錯体と呼ぶ２種の夕／バ
クの錯体を含む。因子ＶＩＩＩ錯体の１成分は血小板接
着に影響を及はし、因子ＶＩＩＩ−Ｒと呼ばれる。因子
ＶＩＩＩ　−Ｈの欠陥はフォノ・タイルブランド疾患す
なわち染色体的に先天的にそなわる疾患である。

因子ＶＩＩＩ　−Ｈの生化学についての文献中の情報は
少ない。因子ＶＩＩＩ　−Ｈのほとんどの研究は正味の
因子ＶＩＩＩ錯体を使用して行なわれた。近年になって
、因子ＶＩＩＩ　−Ｒが因子ＶＩＩＩ錯体およびほとん
どの他の血漿タンパクから、主として寒剤沈澱、免疫吸
着、イオン交換クロマトグラフ、およびゲル濾過によっ
て分離された。一般的にはホイヤーらのＢｌｏｏｄ、　
５８　：　１　：１３　（１９８１）およびジンメルマ
ンらの米国特許第４３６１．５０９号、およびジンメル
マンらのＰｒｏｇ、　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌ、、　１３
　：　２７９　（１９８３）、ならびにそれぞれに引用
されてい為文献を参照されたい。

因子ＶＩＩＩ−Ｒは７オン・ウィルブランド患者の凝血
欠陥を矯正する能力のために治療価値をもつ。不幸なこ
とに、因子ＶＩＩＩ−Ｒを確保するために利用しうる方
法は上述のヒト血漿の分別に限られている。血漿分別に
よる因子ＶＩＩＩ−Ｒの製造は、調製毎に変わる限られ
た量のみを与えるにすぎず、高価であり、肝炎のような
疾患や免疫不全症候群にかかる危険を受は易い。

上述の問題の認識と克服において、本発明は血漿分別調
製の疾患感染の危険のない因子ＶＩＩＩ　−Ｒすなわち
７オン・ウィルブランド因子を多量に容易に入手しうろ
ことを可能にしたものである。これは因子ＶＩＩＩ−Ｒ
タンパク分子のセグメントに特異的にコードするオリゴ
ヌクレオチド、因子ＶＩＩＩ−Ｒり／バク質をコードに
入れる複製用担体を製造するだめの組換え体ＤＮＡ技術
の適用、およびヒト起源の他のタンパク質を実質的に含
まないヒト因子ＶＩＩＩ　−Ｒタンパク質を回収するだ
めの選別／単離法によジ達成された。

従って本発明はヒト起源の他のタンパク質を実質的に含
まないヒト因子ＶＩＩＩ　−Ｒを提供するものである。

特徴的には、因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質はグリコジル
化される。

遺伝子Ｖ’ＩＩＩ　−Ｒは宿主細胞または他の自己複製
性系における岨換え体ＤＮＡによって製造され、実質的
に純粋な形態で見られる。また本発明によれは上記の因
子ＶＩＩＩ　−Ｈの製造法および組成物ならびに治療用
組成物およびヒトや動物の凝血不調の治療における因子
ＶＩＩＩ　−Ｒタンパク質の使用が提供される。

本発明はまたヒト因子ＶＩＩＩ　−Ｒをコードに入れｆ
ＣＤＮＡ系列を組入れた複製性表示ベクトルおよびそれ
によって変態された宿主細胞または細胞のない自己複製
性系をも提供するものである。宿主系は通常はプロカリ
オテイックのものたとえばイー・コリイもしくはビー・
サブチリスあるいはユーカロイテイツ細胞である。

ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒは次の諸工程から成る方法によっ
て製造される：（ａ）好適な宿主細胞または細胞のない
複製性系において、ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒをコードに入
れたＤＮＡを表わしうる複製性表示ベクトルを製造−（
ｂ）　　この宿主系を変態させて組換え体重主系を作シ
、（ｅ）　　この組換え体宿主を該因子ＶＩＩＩ−Ｒコ
ードを入れたＤＮＡ系列の表示を可能にする条件下に保
持してヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒタンノくり質を製造し、そ
して（ｄ）　　該ヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質を回
収する。好ましくは、因子ＶＩＩＩ　−Ｒをコードに入
れた複製性表示ベクトルは因子ＶＩＩＩ−Ｈのメツセン
ジャーＲＮＡを含ｉｒメツセンジャーＲＮＡプールを代
表する２重ストランドの補形ＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）
を製造し該ｄｓ−ｃＤＮＡプ礪１らのＤＮＡを複製性表
示ベクトルにくみ入れることによって作られる。ヒト因
子ＶＩＩＩ　−Ｒを回収する好ましい態様は組換え体重
主系によって表わされるタンパク質を因子ＶＩＩＩ　−
ＲＫｌｆ！！異な少なくとも１種の結合性タンパク質を
含む試剤組成物と反応させ、そこからの検知可能な応答
を観察し、そして同定された因子ＶＩＩＩ−Ｒを宿主系
から単離することから成る。

添付の図面において、第１図は実施例に記載の酵素反応
を示すフローシートである。

第２図は組換え体ベクトルを製造し、ベクトルを宿主に
組入れ、そしてライブラリーを選別して所望のクロンの
同定を行なう一連の方法（実施例に使用した方法）を示
すフローシートである。

ここで使用する［ヒト因子ＶＩＩＩ　−ＲＪはヒト血漿
に生来ある因子ＶＩＩＩ−Ｒがなすような正常な止血に
関与する能力をもつ活性形態で細胞のない培養系によっ
て生じるヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒを表わす。

因子ＶＩＩＩ−Ｈの異なった対立因子力哨然に存在しう
る。

これらの変異体は同じ生物学的機能のタンノくり質をコ
ードする構造上の遺伝子の全ヌクレオチド系列中の相違
によつて特徴づけられる。また、グリコジル化ならびに
他の後変換変形体の配置と程度は宿主の性質およびタン
パク質の生ずる環境により変化しまたこれに依存する。

単一または多重のアミノ酸置換、削除、活性断片、付加
または置換えをもつヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒ類似体を製造
することは可能である。

これらは血小板結合のならびに内因性もしくは自然のヒ
ト因子ＶＩＩＩ−Ｒとは異なる特異点の付加の場を備え
た類似体を含むことができる。特定の所望の生物学的性
質を使用するものを包含する亜生殖断片も実在しうるし
又は製造しうる。このような対立因子の変異体、変形体
および生来のヒト因子ＶＩＩＩ−Ｈの生物学的性質を保
持するヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒの誘導性を生成する類似体
も本発明の範囲内に含まれる。

表示ベクトルとはそこに含まれるＤＮＡ系列を転写およ
び移動しうる且つこのような系列がその表示を行ないう
る他の規則的系列に結合しているベクトルをいう。これ
らの表示ベクトルはエピサム、バクテリオファージとし
であるいは染色体ＤＮＡの一体構造の一部としての、宿
主微生物または系中で複製されなければならない。本発
明の使用に特に好適な表示ベクトルの一形体はバクテリ
ア中に通常に住みバクテリア中で複製するバクテリオ・
ファージ、ウィルスである。この目的のために特に望ま
しいファージはヤングらによって上記雑文中に報告され
ているランプダｇｔ１０およびランプダｇｔ１１ファー
ジである。ランブダｇｔ１１は挿入ＤＮＡによって特定
されるポリペプチドを製造しうる一般的な組換え体ＤＮ
Ａ表示ベクトルである。

組換え体ベクトルはその安定性を強大させるための単一
コピー生産挿入子としてその宿主細胞中で増殖しうる。

このベクトルは異質ＤＮＡのコピー数の迅速な増大およ
び高水準の転写による誘導に応答する。劣化を最小にす
るために、異質ユーカリオティック性ポリペプチドをそ
の構造ＤＮＡ系列からのユーカリオティック部分とその
遺伝子からのプロオリオティツク・タンパク質Ｂ−ガラ
クトシダーゼのすべてだが小部分との融合体として合成
する。タンパク質劣化経路に欠陥のある宿主細胞の使用
も誘導ランブダｇｔ　１１クロンから生産される新規な
タンパク質の寿命を増大させる。ランプダｇｔ１１クロ
ン中の異質ＤＮＡの適切な表示はＢ−ガラクトシダーゼ
促進剤について挿入ＤＮＡの配位および読み枠に依存す
る。組換え体ＤＮＡ技術に有用な表示ベクトルの別の形
態は「プラスミド」すなわち円形の、一体化していない
余分の染色体の２重ストランド・ループである。本発明
は画業技術で既に知られた又は次に知られるに至る均等
な機能を果す他の任意の形態の表示ベクトルを包含する
。

ここに開示する組換え体と方法論は広範囲のプロカリオ
テイック微生物およびユーカリオティック微生物の宿主
細胞中に使用するのに好適である。もちろん、一般的に
プロカリオテイック微生物がＤＮＡ系列を移植するのに
及び本発明において有用なベクトルを構成するのに好ま
しい。たとえばイー・コリイに１２菌株ＭＭ２９４（Ａ
ＴＣＣ扁３１４４６）は特に有用である。もちろん他の
微生物菌株も使用しうる。宿主の細胞または系に適合す
る種から誘導される複製および制御の系列を含むベクト
ルはこれらの宿主と関連して使用される。このベクトル
は起源または複製ならびに変態細胞中に表現型の（ｐｈ
ｅｎｏｔｙｐｉｃ　）選択を与えうる特性を備えている
。イー・コリイはイー・コリイ種から誘導されるプラス
ミドであるｐＢＲ３２２を使用して変態させることがで
きる〔ポリバーら；Ｇｅｎｅ、２：９５（１９７７））
。ｐＢＲ３２２はアンピシリ／およびテトラサイクリン
耐性の遺伝子を含み、従って変態細胞の同定手段を与え
る。表示ベクトルはまたそれ自身の表示のためベクトル
によって使用しうるプロモーターを含まなければならな
い。普通のプロカリオテイツク・プロモーターとしてベ
ータ・ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、
トリプトファン（ｔｒｐ）およびバクテリオファージ・
ランブダのｐＲとｐＬがあげられる。これらのプロモー
ターの組合せ（たとえばｔｒｐプロモーターとラクトー
ス・オペレーターとの融合物であるＴＡＣ）も使用され
た。他のプロモーターも発見され使用されており、その
ヌクレオチド系列は刊行物に記載されているので、当業
者はそれらを機能的に適切なベクトルに付は名ことがで
きる。

プロカリオテイック微生物の他に、ユーカリオテイツク
微生物たとえばイースト培養物を使用することもできる
。

サッカロマイセスセレビシアエまたは普通のノくン焼キ
イーストはユーカリオテイツク微生物の中でも最も普通
に使用されるものである。然し他の多数の菌株も普通に
使用できる。イーストベクトル中の好適なプロモーター
系列として３−ホスホグリセレート・キナーゼまたは他
のグリ・ユリティック酵素系用のプロモーターがあげら
れる。好適な表示ベクトルを構成する際に、これらの遺
伝子に同伴する端末系列もｍＲＮＡおよび端末のポリア
デニル化を与えるように表示されることの望まれる系列
の表示ベクトル３′に結合される。イースト適合性プロ
モーター、複製の起源、および適切な端末系列を含む任
意のベクトルが遺伝子ＶＩＩＩ　−Ｈの表示に好適であ
る。

微生物の他に、多細胞微生物から誘導される細胞の培養
物も宿主として使用することができる。原理的に、を推
動物または非を推動物の細胞培養物のいづれであっても
、任意のこのような培養物は操作可能である。然し、興
味はを推動物細胞において最大であった、そして培養物
（組織培養物）中のを推動物細胞の増殖が近年において
日常の方法になった。このような有用な宿主細胞列の実
例はＶＥＲＯおよびＬｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハム
スター・オバリイ（ｃＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、Ｂ
ＨＫ、Ｃ０８−７およびＭＤＣＫ細胞列である。このよ
うな細胞の表示ベクトルは通常は（必要ならば）複製の
起源、表示されるべき遺伝子の前面に配置したプロモー
ター、ならびに任意の必要なりボゾーム結合の場、ＲＮ
Ａ接続の場、ポリアデニル化の場、および転写端末系列
を含む。

哺乳動物細胞に使用するために、表示ベクトル上９制御
機能にはしばしばウィルス物質が備えられる。たとえば
普通に使用されるプロモーターはボリオマすなわちアド
ノウイルス２そして最もしばしばシミア／・ウィルス４
０（ＳＶ　４０　）から誘導される。更に、望ましい遺
伝子系列に自然に同伴するプロモーターもしくは制御系
列を使用することも、このような制御系列が宿主系と適
合する限り、可能であゃまた多くの場合望ましい。転写
速度を増大させるために、ユーカリオテイック・増強剤
系列を構造物に加えることもできる。これらの系列は種
々の動物細胞から又はマウス・ザルコマ・ウィルスのよ
うなオンコルナ・ウィルスから見られる。

複製の起源は外因性起源たとえばＳＶ４０または他のウ
ィルス源を備えたものを含むようにベクトルを構成する
ことによって、または宿主細胞の染色体複製機構によつ
て与えられる、ハベクトルが宿主細胞染色体に組入れら
れているならば、後者は多くの場合に十分である。

宿主細胞はヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質を製造する
ことができる。この因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質は種々
の化学組成のものでありうる。このタンパク質は第１ア
ミノ酸（構造遺伝子の前方に挿入されたＡＴＧ信号コー
ドンによって提示される）としてメチオニンをもつもの
として製造される。

このメチオニンはまた細胞内または細胞外で開裂してそ
の正常な第１アミノ酸をもっていてもよい。このタンパ
ク質社その信号ポリペプチドと一緒に又は通常の信号ポ
リペプチド以外の共役夕／バクと一緒に生産されるが、
共役の信号ポリペプチドは内部または外部の環境におい
て特に開裂される。最後に、因子ＶＩＩＩ−Ｒは外部が
らのポリペプチドを開裂させる必要なしに成熟形態にお
いて直接表示によって製造される。

組換え体宿主細胞は組換え体ＤＮＡ技術を使用して製造
されるベクトルで変態させた細胞と呼ばれる。ここに定
義するように、因子ＶＩＩＩ−Ｒはこの変態の結果とし
て製造される。このような細胞によって製造される因子
ＶＩＩニーＲ拡以下に述べる方法は、本発明の方法に有
用な脣定の試剤を製造するためによく確立された広範囲
の種々の方法のうちの若干にすぎない。メツセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）混合物を得るだめの一般法は組織試
料から抽出物を作ること又は所望のタンパク質を生産す
る細胞を培養してチャーゲインらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　１８：５２９４　（１９７９）に記載されて
いるような方法によって抽出することである。

このｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ　）セルロースまたはボ！
Ｊ　（ｕ）セファロース上でクロマトグラフ処理し次い
でｍＲＮＡ富化留分含有ポリ囚を溶出することによって
ポリ囚ｍＲＮＡ含有物質を富化させる。

ｍＲＮＡ富化留分を含む上記のポリ（４）は反転トラン
スクリプターゼを使用する単一ストランド補形ＤＮＡ（
８Ｓ−ｃＤＮＡ）の合成に使用される。ＤＮＡ合成の結
果として、ＤＮＡの３′一端部にヘアピン・ループが形
成され、これが第２のストランドＤＮＡ合成を開始する
。適切な条件下で、このループはＤＮＡポリメラーゼ訃
よびヌクレオチド・トリホスフェートの存在下での第２
ストランドの合成を行なうのに使用される。

見られた２重ストランドｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）は
多くの周知技術のうちの任意のものによって表示ベクト
ル中に挿入される。一般法などはマニアティスらの前記
の雑文およびＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、　■ｏ１．６５および６８（１９８０）、１００−
１０１（１９８３）に記載されている。一般に、ベクト
ルは少なくとも１種の制限工／ドヌクレアーゼによって
直線化され、これは少なくと４２つの鈍い端部もしくは
凝集端部を生せしめる。このＤＮＡはベクトル挿入の場
に結紮もしくは結合せしめられる。

実質的な細胞壁を含むグロカリオティック細孔を使用す
るとき、表示ベクトルによる変態を行なう最も普通の方
法はコーエｙ−ｘフ、ｚヌらのＰｒｏｅ、　Ｎａｔ’１
．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ。

（ＵＳＡ）、６９：２１１０（１９７２）に記載の塩化
カルシウム予備処理法である。細胞壁バリヤーのない細
胞を宿主細胞として使用するとき社、変態はグラハムお
よびフェル・デル・ニブのＶｉｒｏｌｏｇｙ　６２　：
　５４６　（１９７８）に記載のリン酸カルシウム予備
沈澱法によって行なう。ＤＮＡを細胞にくみ入れるその
他の方法たとえば被注入またはプロトプラスト融合も成
功裡に使用された。この微生物を次いで組換え体ｃＤＮ
Ａライブラリー・エンコードの生ずる選択媒質およびタ
ンパク質をで培養する。

因子ＶＩＩＩ−Ｈの部分または全系列を含むクロンはこ
のようにして生成したｄｓ−ｃＤＮＡ混合物を化学的に
合成されたオリゴヌクレオチド・プローブでフィブリド
化することによって同定しうる。オリゴヌクレオチド・
プローブは因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質の第１アミノ酸
系列から決定される。

所定のアミノ酸系列をコードしているオリゴヌクレオチ
ドの系列は遺伝子コードの退化をもとにして推論しうる
。

クロンハニトロセルロース・フィルタ上で生育され、ク
ロンシュタインおよびホグネスのＰｒｏａ−Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７２：３９６１（１９７５）によるフィブリ
ド化に供せられる。このフィルタは因子ＶＩＩＩ−Ｈの
アミノ酸系列を基準にして合成されたａｚｐ標識オリゴ
ヌクレオチドと反応させ、次いで洗浄、乾燥して放射線
写真にかける。強いフィブリド化信号を示したクロ／を
えらんで更に分析する。ＤＮＡは次いでノルガードらの
Ｊ−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１３８：２７０（１９７９）に記載の方法によって単離
することができ、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで開
裂し、開裂断片はマニアテイスらの上記雑文（１９７５
）に記載されているように水平１．５％アガロース・ゲ
ル中の電気泳動によって分離される。最長のｃＤＮＡ挿
入子を含むベクトルは次いでマクサムおよびギルバート
のＭｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　
：　４９９　（１９８０）に記載されているように連結
させることができる。因子ＶＩＩＩ−Ｒをコードする全
ヌクレオチド系列に相当するクロンが同定される。

因子ＶＩＩＩ−Ｈの部分または全遺伝子を含むクロンは
また、因子ＶＩＩＩ−Ｒ部分の一部または全部に向けら
れた特異抗体によっても同定される。この同定法は挿入
の場に隣接して適切な規則的核酸系列を含むベクトル中
にｄｓ　−ｃＤＮＡを挿入することを必要とする。これ
らの規則的系列はベクトル中に挿入されたこれらのｄｓ
　−ｃＤＮＡの転写および移動を開始する。規則的系列
に対して正しく配置された因子ＶＩＩＩ−ＲｃＤＮＡ系
列を含むクロンは因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質の一部又
は全部を増殖させる。この因子ＶＩＩＩ−Ｒアミノ酸系
列は適切に特異性のおる抗体によって検出される。

このようなりロン系は上記のヤングおよびデビスの雑文
に記載されているランプダｇｔ１１系である。

特異結合分析選別技術を使用して変態宿主の生産した因
子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質を同定するのが好ましい。特
異結合分析はリガンドすなわち測定下の結合性分析物と
その結合パートナ−との間の特異の相互作用にもとづく
ものである。

因子ＶＩＩＩ−Ｈの場合のように、リガンドおよびその
結合パートナ−のうちの１方が抗原であり、他方が対応
する抗体であるとも、この分析は免疫分析として知られ
ている。

数種の異なった結合分析系は画業技術において周知であ
り、使用する標識の性質により一般に分類されている。

標識の作用特性は測定可能な性質の任意のものでよい。

大部分の場合に、この系は免疫化学的方法で試料のリガ
ンドまたは結合能と相互作用する均一な特異結合分析試
剤を組入れる。たとえば、１つの系において、標識は酵
素であって、物質に作用する酵素の能力がその結合パー
トナ−との標識共役物の゛結合によって、正または負の
感覚で試験される。

基質に及ぼす酵素の作用はある特徴通常は螢光または光
吸収（色）において区別される生成物を生じる。

Ａ、内皮細胞の生育 ヒトのヘソ部静脈内皮細胞をマシアグらのＪ、　Ｃｅ１
ｌ　ＢｉｏＬ９１：４２０（１９８１）に記載されてい
るように生育さ也トここれらを２０％胎児子牛血清、内
皮細胞生育因子（１００μ？／ｍ７り、ベニシリｙＧ（
１０，ｕ）／ｄ）、ストレプトマイシｙ（１μ？／１ｊ
Ｌｔ）およびシアンジゾン（５μｆＰ／／Ｎｔ）を含む
媒質１９９中で培養した。融合するまで２〜３日毎に細
胞を供給した。融合した時点で細胞をこすり取って回収
しＰＢＳに入れた。

Ｂ、全ＲＮＡの製造 全ＲＮＡ（メツセンジャー、リボゾーマルおよびトラン
スファー）を実質的に前記チャーブウィンらの雑文に記
載されているようにして内皮細胞から抽出した。この細
胞を４Ｍのグアニジン・チオシアネート、２５ｍＭのク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．５％のＮ−ラウ
リルザルコシン、０．１Ｍの２−メルカプトエタノール
、および０．２　％の消泡剤人（米国ミズリー州セント
ルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー製）を含む溶液
１５容景中で均質化した。この均質化物を５ｏｒｔａ１
１　ＧＳＡＯ−夕中で６，０００　ｒｐｍにおいて１０
℃で１５分間遠心分離した。上澄み液を酢酸添加により
ｐＨ５，０に調整１．、ＲＮＡを０．７５容量のエタノ
ールによって一２０℃で２時間沈澱させた。遠心分離で
ＲＮＡを集めて２５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび５
ｍＭのジチオスレイトールを含む７．５Ｍのグアニジン
塩酸塩にとかした。０．５容量のエタノールを使用する
２回の追加沈澱の後に、残渣グアニジン塩酸塩を絶対エ
タノールによシ沈澱物から抽出した。ＲＮＡｔ滅菌水に
とかし、遠心分離によって不溶物を除き、ペレットを水
で再抽出した。ＲＮＡを０．２Ｍの酢酸カリウムに調整
し、ｚ５容量のエタノールを一２０℃で一夜加えて沈澱
させた。

Ｃ，ポリ（Ａ）含有ＲＮＡの製造 上記のようにして製造した全ＲＮＡ沈澱を１０ｍＭのＥ
ＤＴＡおよび１％ＳＤＳを含むｐＨ７，２のＨｅｐｅ１
１緩衝液２０緩衝液２０ラ 速に２５℃に冷却した。ＲＮＡ溶液を次いで等溶量の水
で希釈し、ＮａＣ　１を加えて最終濃度を３　０　０　
ｍＭ−ＮａＣ１とした。２４００　Ａ２６０単位までの
ＲＮＡを含む試料を標準法を使用してポリ値）−セファ
ロース上でクロマトグラフ処理した。ポリ（４）含有Ｒ
ＮＡを１種ＭのＨｅｐｅｓ　緩衝液（　ｐＨ　７．　２
．　）を含む７０％ホルムアミドで溶出した。溶出液を
０．　２　４　Ｍ　ＮａＣ１に調整し、−２０℃のエタ
ノ−／Ｌ４５容量によってＲＮＡを沈澱させた。

Ｄ．ランプダｇｔ　１１中でのｃＤＮＡコロニーの構成
添付の第１図に一般的にダイヤグラムで示した全酵素反
応に従った方法を実施した。ビニエルらの上記雑文およ
びウイッケンズらのＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、　
２　５　３　：　２　４　８　３（１９７８）に記載さ
れているとおりにして、ｍＲＮＡ（２０μＰ）ｌバース
・トランスクリブターゼおよびＤＮＡポリマラーゼエを
もつｄｓ　−　ｃ　ＤＮＡ中にコピーした。

製造指針に従いこのｄｓ−ｅＤＮＡをセファデックスＧ
−５０上で脱塩し、空隙容量留分をＥｌｕｔｉｐ−Ｄカ
ラム　（　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅ１１，
　Ｋｅｅｎｅ，　ＮＨ）上で更に精製した。ノルガード
らの上記雑文に記載のように８１ヌクレアーゼで培養す
ることによってｄｓ−ｃＤＮＡを端部の鈍いものにした
。反応混合物は０．２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４５）
、０，４Ｍの塩化ナトリウム、　２．５ｍＭの酢酸亜鉛
、およびｄｓ−、・ｃＤＮＡ１ｎＰ当シ０．１単位の８
１ヌクレアーゼ、を最終反応容積１００μｔにして成る
ものであった。このｄｓ−ｅＤＮＡを３７℃で１時間培
養し、フェノール：クロロホルムで抽出し、次いで上述
のようにセファデックスＧ−５０カラム上で脱塩した。

この２重ストランドｃＤＮＡを次いで上述のマニアテイ
スらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の反
応条件を使用してＥｃｏ　ＲＩメチラーゼおよびＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｖ）で処理した。このｃ
ＤＮＡを上述のようにしてセファデックスＧ−５０上で
再び脱塩し、次いでＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ（上述のマニ
アテイスの雑文）をもつホスホリル化Ｅｃ。

ＲＩ結合剤の０．５μ？に結紮した。この混合物を次い
で１Ｅｃｏ　ＲＩで開裂し、トリス−ボレート緩衝液中
の８％アクリルアミドゲル（上述のマニアテイスの雑文
）上で分別した。１キロベースよシ大きい寸法のＤＮＡ
をゲルから溶出し、Ｅｌｕｔｉｐ　−　Ｄカラムに結合
させることによって回収し１Ｍ０ＮａＣ１で溶出し、次
いでエタノール沈澱によって集めた。

この実施例の残余に従う方法は第２図に一般的にダイヤ
グラムで示しである。ＤＮＡ断片を次いでＥｃｏ　ＲＩ
に挿入し、開裂し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼでランプ
ダｇｔ１１をホスファターゼ処理して約８０万個の組換
え体ファージのライブラリィを生成させる。このライブ
ラリィをイー・コリイＹＩ　Ｏ８８（ｓｕｐＥ　　ｊｕ
ｐＦ　　：５ｕｐＢ　　ｔｒｐＲｈｓｄＩ′ｈｓｄＭ”
　　ｔｏｎＡ２１　５ｔｒＡ　　１ａｃＵＩ６９　　ｐ
ｒｏＣ：：Ｔｎ５（ｐＭｃｏ　）　）上で４２℃におい
てプレート・ストックを生成させることによって増幅し
た。増幅法は前記のマニアテイスの雑文に記載されてい
る。ヤングおよびデビスによって記述されているこの菌
株の重要な特徴は５ｕｐＥ　（Ｓ遺伝子中のファージ・
アンバー・ミューチージョンの抑制に必要）、ｈａｄＲ
”−ｈｓｄＭ”　（宿主変態前の外部ＤＮＡの制限を防
ぐのに必要）、１ａｃＵ　１６９　（ラック・オペロン
の削除は宿主ファージ組換え体を減少し、ランプダｇｔ
ｌ１組換え体（Ｂ−ガラクトシダーゼ活性は一般に少な
いが又はない）を弁組換え体（Ｂ−ガラクトシダーゼ活
性）から区別するのに必要）、およびｐＭＣ９（１ａｃ
Ｉをはこんで宿主細胞およびファージの生育に有害であ
るかも知れない外部遺伝子の表示を抑制するｐＢＲ３２
２プラスミド）を含む。

Ｅ、因子ＶＩＩＩ−Ｒ系列を含むコロニーの同定コロニ
ーを生成する因子ＶＩＩＩ−Ｒ抗原決定要素のライブラ
リーを選別するために、ランプダｇｔｌ１組換え体７ア
ージをイー・コリイＹｌ　０９０　（１ａｃＵ１６９　
　ｐｒｏＡ＋イオｙ　ａｒａＤ１３９　５ｔｒＡｓｕｐ
Ｆ　（ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０）（ｐＭＣ９））の芝
土に植え、４２℃で２５時間培養する。

この宿主はイオン・グロテアーゼを欠き、それによって
表示された外部タンパク質の劣化を減少する。１ａｃｚ
転写の誘発剤である１０ｍＭのインプロピルチオ−Ｂ−
ｄ−ガ５クトピラノサイド（ＩＰＴＧ）であらがじめ飽
和させたニトロセルロース・フィルターをこのプレート
の上Ｋｔ＜。次いでこのプレートを３０’Ｃに１．５時
間除く。う／ブダｇｔ１１中の外部ＤＮＡ挿入子の表示
を１ａｃｚ転写についての普通の制御下におき、そして
そのま＼また誘発させた。フィルターの位置を針でマー
クし、フィルターを除いてＴＲ８緩衝液（２０ｍＭのト
リス、ｐＨ７，５および５００ｍＭ０ＮａＣ１）中で洗
浄し、次いでＴＢＳプラス３チゼラチン中で室温で６０
分間培養した。

このフィルターをＴＢＳ中の１％ゼラチンから成る緩衝
液中の因子ＶＨＩ−Ｈに対して指向されたモノクロナル
抗体の１：１００希釈液〔ジンメルマン、ＰＮＡ、７９
：１６４８（１９８２））中で一夜室温で培養した。こ
のフィルターを次いでそれぞれＴＢＳ緩衝液中で１Ｏ分
間づつ２回洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒ
ｋｅｇｕａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋　ＭＤ　）と組合せたホー
スラディ７　シｚ　”パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１
：２００Ｇ希釈液２００ｄを添加し、次いで室温で１時
間培養し、ＴＢＳ中でそれぞれ１０分間づつ２回洗浄し
た。このフィルターを次いでＫｉｒｋｅｇｕａｒｄ　＆
　Ｐｅｒｒｙの引用文献中に記載されているようにＨＲ
Ｐカラー現像液中で室温において培養した。

着色現像信号のそれぞれの位置において４ｍ径のカンテ
ン・プラグをプレートから除き、１０ｍＭ）リスＨＣＩ
、ｐＨ７−５および１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，中の中で少な
くとも１時間培養した。この溶液中のファージを約１０
３斑点形成率位（ＰＦＵ）の密度で９０ｍプレート上に
再び植え、上述のようにして再び選別した。この再植え
付は再選別の方法をプレート上のすべての斑が信号を生
じるまでくりかえした。

これらの斑はヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒを生産する組換え体
クロンであることを示した。

従ってこの実施例は、他のＥト・タンパク質またはポリ
ペプチドの広いライブラリーのＲＮＡとの不均一混合物
中で因子ＶＩＩＩ−Ｒタンパク質をコードしたＲＮＡを
含むヒト組織抽出物からヒト起源の他のタンパク質を実
質的に含まないヒト因子ＶＩＩＩ−Ｒを与える実験法を
記述するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例に記載の酵素反応を示すフローシートで
ある。 第２図は組換え体ベクトルを製造し、ベクトルを組入に
組入力、そしてライブラリーを選別して所望のクロ／の
同定を行なう一連の方法を示すフローシートである。 図面の滲出（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６０年特許願第１６４２３３号 ２、発明の名称 組換え体因子■−Ｒ ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　メ覧イ　ラボラトリーズ　インコーホレーテッド
４、代理人 ５、補正の対象 ３、補正の内容 別紙のとおり、但し明細書及び図面の内容の補正はない
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト起源の他のタンパク質を実質的に含まない、ヒ
   ト因子VIII−Ｒ、その対立因子の変異体、変形体および
   類似体。 ２、実質的に純粋な形態にある特許請求の範囲第１項記
   載のヒト因子VIII−Ｒ。 ３、細胞の又は細胞のない自己複製性組換え体系におい
   て、ヒト起源の他のタンパク質を実質的に含まないヒト
   因子VIII−Ｒ、その対立因子の変異体、変形体および類
   似体を表わしうる複製性表示ベクトル。 ４、ヒト起源の他のタンパク質を実質的に含まないヒト
   因子VIII−Ｒその対立因子の変異体、変形体および類似
   体を表わしうる複製性表示ベクトルで変態させた細胞の
   又は細胞のない自己複製性組換え体系。 ５、イー・コリイまたはビー・サブチリスを変態させる
   ことによってえた特許請求の範囲第４項記載の組換え体
   系。 ６、自然の内因性因子VIII−Ｒ生産性細胞に複製性表示
   ベクトルを組入れることによってえた特許請求の範囲第
   ４項記載の組換え体系。 ７、次の諸工程から成ることを特徴とするヒト因子VII
   I−Ｒの製造法： （ａ）好適な自己複製性組換え体宿主系において、ヒト
   因子VIII−Ｒをコードに入れたＤＮＡ系列を表わしうる
   複製性表示ベクトルを製造し、 （ｂ）この宿主系を変態させて組換え体宿主系を作り、
   （ｃ）この組換え体宿主を該因子VIII−Ｒをコードに入
   れたＤＮＡ系列の表示を可能にする条件下に保持してヒ
   ト因子VIII−Ｒを製造し、そして （ｄ）該ヒト因子VIII−Ｒを回収する。 ８、複製性表示ベクトルの製造が因子VIII−Ｒをコード
   に入れたメッセンジャーＲＮＡを含むメッセンジャーＲ
   ＮＡ集団からｄｓ−ｃＤＮＡを製造する工程および該ｄ
   ｓ−ｃＤＮＡからのＤＮＡを複製性表示ベクトルに組入
   れる工程から成る特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、表示ベクトルがバテリオファージである特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 １０、バテリオファージがランブダｇｔ１０またはラン
   ブダｇｔ１１である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、ヒト因子VIII−Ｒを回収する工程が組換え体宿主
   系によって表わされるタンパク質を因子VIII−Ｒに特異
   な少なくも１種の結合性タンパク質を含む試剤組成物と
   反応させ、そこからの検知可能な応答を観察し、そして
   宿主系から検知因子VIII−Ｒを単離することから成る特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 １２、特異結合性タンパク質が一次抗体である特許請求
   の範囲第１１項記載の方法。 １３、抗体がポリクロナル抗体である特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １４、抗体がモノクロナル抗体である特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １５、抗体が検知可能な応答を与えるに有効な物質と結
   合している特許請求の範囲第１１項〜第１４項のいづれ
   か１項に記載の方法。 １６、試剤組成物がヒト因子VIII−Ｒに特異な一次抗体
   および該一次抗体に特異な二次抗体から成る特許請求の
   範囲第１１項記載の方法。 １７、一次抗体および二次抗体が共にポリクロナルであ
   る特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、二次抗体が検知可能な応答を与えるに有効な物質
   と結合している特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、検知可能な応答を与えるに有効な物質がアイソト
   ープまたは非アイソトープの標識を含む特許請求の範囲
   第１５項または第１８項記載の方法。 ２０、該物質が酵素、その基質および、酵素と基質との
   相互作用に特異的に応答して検知可能な応答を与える試
   剤から成る特許請求の範囲第１５項または第１８項に記
   載の方法。 ２１、酵素がパーオキシダーゼであり、基質がパーオキ
   シダーゼであり、そして試剤がレドックス色原体である
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、ヒト因子VIII−Ｒを回収する工程がｄｓ−ＤＮＡ
   プールを含む組換え体宿主系を、因子VIII−Ｒタンパク
   質の少なくとも１部を連結する標識付きオリゴヌクレオ
   チド・プローブと共に培養して該プローブを因子VIII−
   Ｒをコードに入れたｄｓ−ｃＤＮＡでフィブリド化して
   、そしてこのように同定された因子VIII−Ｒ　ｄｓ−ｃ
   −ＤＮＡ含有複製性表示ベクトルを単離して培養するこ
   とから成る特許請求の範囲第７項記載の方法。 ２３、ヒト起源の他のタンパク質を実質的に含まないヒ
   ト因子VIII−Ｒ、その対立因子の変異体、変形体および
   類似体の治療有効量を医薬的に許容しうる担体と混合し
   て成る組成物。 ２４、非経口投与に好適な特許請求の範囲第２３項記載
   の組成物。