JP2612158B2 - ヒト造血系細胞増殖増強因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、造血系細胞、特に
骨髄細胞を増殖せしめる活性を増強する因子（以下、Ｈ
ＣＧＰＦ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇ
ｒｏｗｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏ
ｒ）ポリペプチドに関する。

【０００２】本ＨＣＧＰＦは単独においても骨髄細胞、
胸腺細胞、胎生肝細胞の増殖を亢進するが、他の造血系
細胞増殖因子（ＨＣＧＦ）と併用すると、これら造血系
細胞の増殖は著しく亢進されるものであり、このような
因子の存在は従来全く知られていない。

【０００３】本発明者らは既にマウスのＩＬ−３依存性
増殖細胞株ＦＤＣ−Ｐ細胞の増殖を誘導する因子の遺伝
子を同定している（特願昭６１−２６３３）。今回本因
子を該遺伝子を用いて、単一サイトカインとして生産す
ることに成功し、かつ単一蛋白にまで精製し、物質とし
て始めて同定しえた本因子が前述の如く、骨髄細胞、胸
腺細胞、胎生肝細胞などの造血系細胞に汎く作用し、か
つ、他のＨＣＧＦと称すべき因子と併用すると、更に著
明な造血系細胞の増殖を惹起することを確認し、本発明
を完成するに至ったわけである。

【０００４】本ＨＣＧＰＦはヒト生体内において上述の
作用を基本とし広汎な免疫調節機能、造血調節機能を有
し、免疫不全症、自己免疫、感染症、肝炎、腎炎、癌、
骨髄移植などの分野において、その有用性が強く期待さ
れるものである。と同時に他の免疫活性物質、免疫療法
剤、リンホカイン、サイトカイン、インターフェロン、
細胞生長因子、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤と
の併用において効果増強ならびに他薬剤の副作用軽減に
も有効である。

【０００５】以上のような有用性をもつ新規物質であ
り、医薬分野での有用性に留まらず、本物質、本物質に
対する抗体、本物質の受容体分子は更に診断薬としての
有用性も期待される。

【０００６】

【従来の技術】最近、コロニー刺激因子と総称され造血
系細胞に直接に作用し、増殖させる因子がヒトについて
３種報告され、それらの遺伝子がクローニングされてい
る。即ち、Ｇｏｕｚｈ，Ｎ．Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９８
４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９，７６３ Ｋａｗａｓａｋ
ｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｎｃｅ
２３０，２９１ Ｎａｇａｔａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１
９８６）Ｎａｔｕｒｅ３１９，４１５。これらは各々、
ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦと略称されてい
る。これ以外に、造血系細胞に汎く作用するコロニー刺
激因子としてのｍｕｌｔｉ−ＣＳＦがマウスにおいては
知られており、既に遺伝子クローニングもされている
（Ｆｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔ
ｕｒｅ，３０７，２３３ Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．ＮＡＳ，ＵＳＡ８１，１０
７０）。

【０００７】また、マウスにおいて、未分化のマウスＴ
細胞に作用して２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（以下「２０αＳＤＨ」と記す）を誘導し成熟
Ｔ細胞に分化させる特異な作用を有するリンホカインが
見い出されインターロイキン３（以下「ＩＬ−３」と記
す）と名付けられている。またマウスＩＬ−３は顆粒
球、巨核球、マスト細胞、好塩基球などの細胞の分化増
殖にも関与しているのみならずその生物活性は性ホルモ
ンの代謝にまで及んでいることが考えられ、その幅広い
生物活性に非常な興味が注がれている（Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ，（１９８２）６３，５−３
２）。このことよりマウスＩＬ−３はマウスｍｕｌｔｉ
−ＣＳＦとも呼称される。

【０００８】この物質はこの様な生物活性から免疫学的
に欠陥または異常のある疾患に対して汎く有用でありか
つ免疫系疾患の臨床上の診断に有用であることが期待さ
れるとともに生物、医学全般の研究試薬としても有用で
ある。

【０００９】しかるにＩＬ−３は、マウスについてその
遺伝子、蛋白構造が解明されたに留まり、ヒトＩＬ−３
についてはその適切な活性検定系のないこと、ヒトＩＬ
−３の好適な産生細胞の知られていないことよりヒトＩ
Ｌ−３の存在すら確認されていない。

【００１０】これらヒトＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ
−ＣＳＦ，マウスＩＬ−３（ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ）は、
骨髄中の幹細胞が分化、成熟する段階に作用して、造血
系細胞のコロニーを形成させる活性がよく知られてお
り、骨髄移植や免疫不全症の治療の領域でその有用性が
検討されつつある。

【００１１】このような因子を生体に投与するに当たっ
ては、生体が本来もつ生理的濃度域での適用が最も望ま
しいものであり、外部から大量に人体に投与すること
は、いたずらに、副作用のみ惹起し、医薬としての適用
に困難を伴なうことの多いことは、ヒトインターロイキ
ン２（ＩＬ−２）の臨床例をみても明らかである。

【００１２】本発明が完成しようとする新規な技術はこ
れら造血系細胞のコロニー形成作用を有する因子と併用
することにより、造血系細胞の増殖を相乗的に強める作
用を有し、かつ自身も単独でその作用を示す物質を同定
し、提供することにある。従って、本因子はヒトＩＬ−
３様の活性も併せもつ面も有する。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】このような造血系細胞
の増殖に関与する因子（インターロイキン３＝ｍｕｌｔ
ｉ ＣＳＦなど）と共存させること、もしくは単独でヒ
ト造血系細胞の増殖を増強する因子（以下ＨＣＧＰＦと
称する）を物質として同定し、微生物等の細胞内に本因
子をコードする遺伝子を導入して生産せしめることが、
本ＨＣＧＰＦを有用ならしめる必須の手段である。従っ
て本発明の目的は本ＨＣＧＰＦの新規物質としての同定
及び提供にある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号１、配列表の配列番号２又は配列表の配列番号３の
いずれかに記載のアミノ酸配列を有するヒト造血系細胞
増殖増強因子（ＨＣＧＰＦ）である。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明者らはヒト末梢血由来単球
系細胞を常法で調製し、このリンパ球をＰＨＡ，ＴＰＡ
の共存下４８時間刺激し、かく活性化したリンパ球より
常法のフェノール抽出によりＲＮＡを抽出し、エタノー
ル沈澱後オリゴｄＴ−セルロースによるアフィニティク
ロマトグラフィーによりｍＲＮＡを採取し、同ｍＲＮＡ
の純度を向上させ、かつｍＲＮＡのサイズ分画を行うべ
く更にオリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィーを繰
り返した。

【００１６】一方、サル細胞（ＣＯＳ細胞）でのｃＤＮ
Ａ発現ベクターｐＤＥ−２を構築した（特願昭５９−２
０８６４５，昭５９．１０．４出願）。すなわち本ｐＤ
Ｅ−２はｐＭＬ−Ｒ１１Ｇ（Ｎａｔｕｒｅ ２９３，７
９（１９８１））とｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１
９８１））を用いて図２に示すように構築したものでｃ
ＤＮＡを両向きのＳＶ４０初期プロモーターにはさみ込
むことができ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製可能でまたアンピ
シリ耐性として選択することができる。

【００１７】本ｐＤＥ−２にＣ−ｔａｉｌｉｎｇしたも
のと前述の２本鎖ｃＤＮＡをＧ−ｔａｉｌｉｎｇしたも
のを混合しアニーリングを行った。本アニーリングした
ＤＮＡをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１ ３８，１７９−２０７
（１９８０））に導入した。Ｌ培地の寒天プレートに塗
抹しコロニーを出現させた。

【００１８】このようにして得られたコロニーを３２ケ
ずつ１９２グループに分け混合培養し常法により３２種
の混合したプラスミドＤＮＡを精製した。

【００１９】本プラスミドＤＮＡ混合物（３２種）をサ
ル細胞（ＣＯＳ−７）（Ｃｅｌｌ２３，１７５−１８２
（１９８１））に導入し、クロロキン処理、洗浄後、４
８時間培養し、その培養上清について、ＦＤＣ−Ｐ細胞
増殖活性を測定し、活性を有するＤＮＡ混合物のグルー
プを同定した。ここに活性の認められたＤＮＡ混合物を
含むグループのＤＮＡプラスミドを３２ケの単一プラス
ミドＤＮＡとして精製し、再びＣＯＳ細胞に導入し、そ
の培養上清を同様に活性検定することによりＦＤＣ−Ｐ
細胞増殖活性、すなわちＩＬ−３様活性を示すクローン
ｐ４−１５を同定した。

【００２０】次いで本クローンに含まれるｃＤＮＡをｄ
ｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法
（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５４６３−５４６７（１９７
７））およびＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍ，６５，５１０−５８０（１９８
０））を用いて解析し、その全塩基配列を決定した。本
ｃＤＮＡはおよそ９００ｂｐの塩基対からなりシグナル
ペプチドを有する分泌蛋白をコードすることが判明し
た。このｃＤＮＡ並びにそこから類推されるポリペプチ
ドの構造は現在までに見出されていないものであり従っ
て全く新しいものである。また、このｃＤＮＡに対応す
るメッセンジャーＲＮＡはＴＰＡ，ＰＨＡにより活性化
されたヒトリンパ球に特異的に発現していることから、
新規のリンフォカインであると考えられる。

【００２１】ｃＤＮＡインサートの制限酵素エンドヌク
レアーゼによる切断図を図１に示す。図１に示すごと
く、このｃＤＮＡはＡｖａＩ，ＰｓｔＩ，ＢａｎＩなる
制限酵素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有す
る。配列表の配列番号９にｃＤＮＡの塩基配列を示す。

【００２２】本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つ
の大きなオープンリーディングフレームを保有する。真
核生物の読み取り開始配列となると推定したＡＴＧ配列
（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｃｅｌｌ．１５，１１０９−１１２
３（１９７８））は、５′−端から６４−６６ヌクレオ
チド位に存在し、読み終りコドンＴＧＡが存在するヌク
レオチド位６５５−６５７迄１９６のコードンがこのＡ
ＴＧにつながっている。ｍＲＮＡの３′−ｐｏｌｙ
（Ａ）末端に相当するＡのつながりがｃＤＮＡ末端に見
出され、通常真核生物ｍＲＮＡのほとんどに見出される
６個からなるヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ（８８３−８８
８位）が先に位置する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．
＆ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｃ．Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６
３，２１１−２１４（１９７６））。配列表の配列番号
９参考。

【００２３】ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配
列は配列表の配列番号３のごとく演えきでき、しかも配
列番号３のポリペプチドは１９７個のアミノ酸からな
り、今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（Ｂｌｏｂｅｌ Ｇ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｓｙｍ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，３３，９−３
６（１９７９））、上記演えきＨＣＧＰＦポリペプチド
のＮ末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟ＨＣ
ＧＰＦの分泌時に切断されるシグナルペプチドの役割を
果しているであろう。切断は１８−１９位のＳｅｒとＴ
ｈｒ間で起るか３０−３１位間のＧｌｙ−Ｉｌｅ間で切
断され、それぞれ配列表の配列番号１および配列番号２
を有するポリペプチドを生成する。何故ならば同様な切
断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にもしばしば見
出されているからである（Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，３３，９
−３６（１９７９））。

【００２４】従って成熟ＨＣＧＰＦポリペプチドは１７
９ないし１６７個のアミノ酸から成ると算出される。ま
た実施例４に示すごとく配列表の配列番号９の塩基配列
１１８−１２０位にあるＡＣＣコードンから始まるＤＮ
Ａ画分、即ち１９位に位置するＴｈｒから始まるポリペ
プチドに対するコードはＨＣＧＰＦ活性を有するポリペ
プチドを表現していることが確認された（配列表の配列
番号１）。配列表の配列番号９の塩基配列１５４−１５
６位にあるＡＴＣから始まるＤＮＡ画分、即ち、３１位
に位置するＩｌｅから始まるポリペプチドをコードする
ＤＮＡ画分は、実施例５に示すごとくＨＣＧＰＦ活性を
有するポリペプチドを表現していることが確認された
（配列表の配列番号２）。

【００２５】真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン
遺伝子でも知られている様に多形現象を示すことが知ら
れている（谷口ら，Ｇｅｎｅ １０，１１−１５（１９
８０），大野，谷口．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３０５−５３０９（１９
８１）：Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２９
５，５０１−５０８（１９８１））。この多形現象によ
って、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場
合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変わらない
場合もある。

【００２６】上記説明からも明らかなごとく、本発明の
遺伝子は、配列表の配列番号９に示された塩基配列を有
するＤＮＡの６４−６６位のＡＴＧ配列から始まり、６
５２−６５４位にある少くともＧＣＣ配列に至る連続塩
基配列を有するＤＮＡ、１１８−１２０位のＡＣＣ配列
から始まり、ＡＣＣ配列から少くともＧＣＣ配列に至る
連続塩基配列を有するＤＮＡ、また１５４−１５６位の
ＡＴＣ配列から少くともＧＣＣ配列に至る連続塩基配列
を有するＤＮＡを包含する。

【００２７】本発明の遺伝子はまた、６５２−６５４位
のＧＣＣ配列に終り、１位のＧに始まるＤＮＡ、６４−
６６位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、１１８−１２０位のＡ
ＣＣ配列で始まるＤＮＡ又は１５４−１５６位のＡＴＣ
配列で始まるＤＮＡを包含する。更に本発明の遺伝子
は、９０９位のＴで終り、１位のＡで始まるＤＮＡ、６
４−６６位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、１１８−１２０位
のＡＣＣで始まるＤＮＡまたは１５４−１５６位のＡＴ
Ｃ配列で始まるＤＮＡを包含する。

【００２８】本発明の遺伝子はまたｐｏｌｙ（Ａ）で終
り、６４−６６位のＡＴＧコードンから始まるＤＮＡ、
１１８−１２０位のＡＣＣ配列で始まるＤＮＡまたは１
５４−１５６位のＡＴＣ配列で始まるＤＮＡを含む。ま
た、本発明は、配列表の配列番号１，２又は３に記載の
アミノ酸配列に相当する塩基配列を有する遺伝子を含
む。

【００２９】配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列の
中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプチ
ド、あるいは、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列
中の１個ないしそれ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドはＨＣＧＰＦ活
性を有することもあり、従ってこの様なポリペプチドを
コードする遺伝子は本発明の遺伝子として使える。

【００３０】同様に配列表の配列番号１，２又は３記載
のアミノ酸配列に対して１個ないしそれ以上のアミノ酸
を表現し得る１個ないしそれ以上の塩基を余分に結合し
た遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、ポリペプチ
ドのＨＣＧＰＦ活性発現を邪魔しない限り本発明の中に
包含される。ＨＣＧＰＦとしてのポリペプチド機能を阻
害する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても新
たに追加された領域が容易に除去出来るものならば本発
明の遺伝子として利用出来る。

【００３１】同じことは配列表の配列番号１，２又は３
記載のアミノ酸配列に対応する遺伝子の各アミノ酸配列
のＣ−末端にアミノ酸追加をコードするＤＮＡが３′−
末端に追加結合せしめたＤＮＡの場合にも言える。従っ
て、この様なポリペプチドをコードする遺伝子の利用
は、本発明に包含される。

【００３２】生細胞中でＨＣＧＰＦ産生をする組み換え
ＤＮＡ体は、次の各種方法で作られる。例えば、ＨＣＧ
ＰＦｃＤＮＡをコードする配列を発現するベクターのプ
ロモーター配列下流に挿入する。あるいはプロモーター
配列を持つｃＤＮＡ片を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の
前あるいは後にＨＣＧＰＦをコードする配列の上流に挿
入することが出来る。

【００３３】ＨＣＧＰＦｃＤＮＡを発現し、ＨＣＧＰＦ
ポリペプチドを産生する真核生物、あるいは原核生物の
造成法を詳述すれば以下の通りである。

【００３４】エシェリヒア・コリ中でＨＣＧＰＦｃＤＮ
Ａを発現させるには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモー
ターと結合せしめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを
含有するハイブリドプラスミドを作る。このプラスミド
を、例えばエシェリヒア・コリＨＢ１０１に感染させ、
ヒトＨＣＧＰＦ活性を有する蛋白を生合成する細菌がク
ローンされる。本来細菌のプロモーターならば如何なる
ものでもｃＤＮＡに適当に接続されていればＨＣＧＰＦ
ｃＤＮＡを発現する。この様なｃＤＮＡの発現例は実施
例において示す。

【００３５】ＨＣＧＰＦｃＤＮＡはまた適当な発現ベク
ターに組み込みこれを宿主細胞に導入すれば酵母でも発
現させることができる。酵母に外来遺伝子を発現させる
ための各種シャトル・ベクターは既にいくつか報告され
ている（ＨｅｉｔｚｍａｎらＮａｔｕｒｅ ２９３，７
１７−７２２（１９８１）宮下ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１−５（１９８
３））。これらのベクターはエシェリヒア・コリおよび
酵母両方の宿主で増殖することができる。また、酵母遺
伝子のプロモーター配列を内蔵している基本的には発現
ベクターすべてがＨＣＧＰＦｃＤＮＡの発現に利用可能
である。動物細胞や細菌の利用に較べ酵母を利用すれば
ＨＣＧＰＦ産生能のレベルをより高くすることも可能で
あり、また糖鎖を含むＨＣＧＰＦを生産することも可能
であり、ＨＣＧＰＦの溶解性向上に有用である。

【００３６】酵母−エシェリヒア・コリシャトル・ベク
ターｐＡＴ７７，ｐＡＭ８２が宮下ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０ １−５（１９
８３））によって報告されている。ベクターｐＡＭ８２
はｐＡＴ７７の誘導体であり、両者ともａｒｓｌのマー
カーを持ち（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ＤＴ ｅｔ ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ ２８２，３９−４３（１９７９），２
μｍ ｏｒｉ（Ｂｒｏａｃｈ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｇ
ｅｎｅ，８，１２１−１３３（１９７９），ｌｅｕ２
（Ｒａｔｚｋｉｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７ ４，４７４−４９１
（１９７９））酵母の酸性フォスファターゼ（ＡＰａｓ
ｅ）に対するプロモーターを持っている。両ベクターと
もアンピシリン耐性マーカー（ＡＰr ）を持つｐＢＲ３
２２の３，７００塩基からなるＤＮＡ画分と増幅オリジ
ンを持っている。ＡＰａｓｅプロモーターは培養液中で
高濃度リン酸を低濃度にシフトすると始めて誘導され
る。

【００３７】その他の真核生物細胞に増幅したＤＮＡを
挿入するには、宿主細胞に適したベクターを原核細胞か
ら切断分離されたｃＤＮＡ挿入に結合すれば良い。そし
て、有核生物細胞を合成したベクターに感染させ培養す
る。

【００３８】組み換えＤＮＡ体を挿入した細胞を培養し
て組み換えＤＮＡ体を増幅し又はＨＣＧＰＦポリペプチ
ドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる。例
えば感染した酵母を炭素源、窒素源、無機塩類、必要あ
れば、ビタミン、アミノ酸の如き有機栄養源を含有する
培地で２７℃ないし３７℃の範囲、ｐＨ４〜７にて好気
的条件下で行う。エシエリヒア・コリ又はバチルス・ズ
ブチリスの如き形質転換された原核生物も通常の方法で
培養することが出来る。

【００３９】ここに得られたＨＣＧＰＦはマウスＩＬ−
３に対応するヒト由来のリンホカインであるとも推定さ
れるが現在ヒトＩＬ−３の存在が不明であり、ヒトＩＬ
−３の権威づけられた活性検定系が存在しないことより
マウスＩＬ−３に対応するヒト由来のものと断定するこ
とは出来ない。事実、このｃＤＮＡの構造はマウスＩＬ
−３ ｃＤＮＡのそれと類似性を持たず、同一のａｎｃ
ｅｓｔｒａｌ ｇｅｎｅから両者が分岐したものとは考
え難い。

【００４０】またＦＤＣ−Ｐ細胞はＩＬ−３依存性細胞
株として広く国内外で常用されている細胞株であり、他
のリンホカイン類の存在では増殖しないことも確認され
ている。例えばインターロイキン２、インターロイキン
１、インターフェロンにはこれらの活性は存在しない。
ここに得られた遺伝子配列のコードするアミノ酸配列を
有する蛋白はこれまで未知でありＩＬ−３と若干類似の
活性を示すヒトＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ
とも構造が異なり、いわゆる選択的コロニー刺激因子
（ＣＳＦ）とは異なる物質である。従って本遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）によって発現される新規なリンフォカインと考
えられるポリペプチドの示す活性は、少くとも上述のヒ
トＩＬ−３活性の一部を担っていることが明らかであ
る。

【００４１】ここにおいて得られたヒトＩＬ−３様蛋白
は塩析、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、
高速液体クロマトグラフィーおよびその他の知られてい
るポリペプチドの分離、精製法を単独または組み合せれ
ば容易に純化される。

【００４２】本ＩＬ−３様蛋白をＣＯＳ細胞において多
量に発現してその活性を検定したところ単独でも、マウ
ス骨髄細胞、ヒト骨髄細胞、胸腺細胞やマウス胎生肝細
胞に対して増殖誘導活性を示し、活性の強度は別として
ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ様の活性を示すことも確認されてい
る。更に、マウス骨髄細胞を標的細胞とする系において
本発現蛋白はマウスＩＬ−３の存在下に相乗的に著明な
増殖を誘導した。

【００４３】以上のことより本ヒトＩＬ−３様、ｍｕｌ
ｔｉ−ＣＳＦ様活性を有し、ＩＬ−３と相乗的に作用
し、造血系細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌ
ｌｓ）を増殖させる因子として本新規リンホカインポリ
ペプチドをＨＣＧＰＦと呼称することにしたわけであ
る。

【００４４】かくしてえられたＨＣＧＰＦは哺乳動物細
胞から作られるＨＣＧＰＦと同一の生化学的ならびに生
物学的挙動を示しＨＣＧＰＦ活性を示す。ＨＣＧＰＦ活
性はＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理しても又５６℃３
０分間熱処理しても安定であり、活性はｐＨ４〜９で安
定である。

【００４５】

【実施例】以下に実施例にもとづいて本発明を詳述す
る。

【００４６】実施例１ （１）Ｆａｌｋｏｆｆらの方法（Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．，５０，３９（１９８２））及び
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，ｐｐ３４６９−３
４７２（１９８１））に従ってヒト末梢血由来細胞を調
製した。そしてＰＨＡ５μｇ／ｍｌとＴＰＡ５ｎｇ／ｍ
ｌで４８時間刺激した末梢血由来細胞（３．４×１０1
0）はＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，１０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）お
よそ４００ｍｌに懸濁した。この細胞を遠心操作により
２回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボヌクレオシ
ド−バナジル複合体１０ｍＭを含むＴＢＳ溶液２００ｍ
ｌに再懸濁した。

【００４７】さらに界面活性剤ＮＰ−４０を最終濃度
０．１％となるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を
３０００ｒｐｍ，５分，４℃下で遠心分離して除いた。
その上清液はＳＤＳ（０．５％）とＥＤＴＡ（５ｍＭ）
を加えた後、等量の水飽和フェノールを加え抽出した。
フェノールによる抽出を３回繰り返した後、ＲＮＡは２
倍量の冷エタノールにより沈澱させ、本沈澱物を遠心に
より集め、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５溶
液に溶解した。得られたＲＮＡは４０ｍｇであった。

【００４８】ｍＲＮＡの分画はオリゴｄＴ−セルロース
（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｙｐｅ７）に
よるアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
吸着液は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳを含むｐ
Ｈ７．５の溶液であり、溶出はカラムを緩衝液（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）でよく洗浄後、Ｈ2 Ｏと１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で交互に行った。溶
出により得られたｍＲＮＡは使用したＲＮＡ３３ｍｇに
対し０．９ｍｇであった。

【００４９】さらにｍＲＮＡの精製度を高めるために再
度、オリゴｄＴ−セルロースによるアフィニティークロ
マトを同じように繰り返し、ｍＲＮＡ標品０．４５ｍｇ
を得た。

【００５０】（２）次に本ｍＲＮＡ標品より次のように
ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ｃＤＮＡクローニング
のために使用した。ｃＤＮＡの合成法は基本的にはＬａ
ｎｄらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，ｖｏｌ ９，Ｐ２５５１（１９８１））に従っ
た。

【００５１】（イ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．３，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１Ｍ ＫＣｌ，１
０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），０．５ｍＭの各
ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（ｄＣＴＰは
32Ｐ放射標識したものを含む）、０．３７５ＯＤ単位の
オリゴｄＴ10，５０μｇｍＲＮＡおよび５０単位ＡＭＶ
逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を混合
し、４１℃下で９０分反応した。反応終了後、フェノー
ル処理を行い、エタノール沈澱物としてｍＲＮＡ−ｃＤ
ＮＡハイブリッドを回収し、０．３Ｎ ＮａＯＨ溶液に
溶解した。室温にて１５時間静置し、次いでｐＨ７．５
の２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を等量加えて中和後、セ
ファデックスＧ−５０カラムを通して、ｃＤＮＡを回収
した。回収された単鎖ｃＤＮＡは約１０μｇであった。

【００５２】（ロ）０．１Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ
７．２）、１０ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭ ＣｏＣｌ2 ，
０．５ｍＭ 32Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性１×１０6 ｃｐｍ
／ｎｍｏｌｅ）、１０μｇ ｃＤＮＡおよび６０単位の
デオキシヌクレオチジルターミナルトランスフェラーゼ
（ＢＲＬ）を混合し、２４℃，２３分間インキュベート
した後、フェノール処理を行い、セファデックスＧ−５
０カラムを通してｃＤＮＡ画分を集め、エタノール沈澱
物として９．５μｇのｄＣ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを
得た。このｃＤＮＡは約２０個のｄＣＭＰ残基が３′末
端に付加されていた。

【００５３】（ハ）次に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ，１ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰ（ｄＣＴＰは 3Ｈで標識したものを含む）、７．２
μｇオリゴｄＧ10，９．５μｇの単鎖ｃＤＮＡおよび５
０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＢＲ
Ｌ製）を混ぜ６時間、１５℃で反応を行った。反応終了
後、フェノール処理を行い、セファデックスＧ−５０カ
ラムを通して、二本鎖ｃＤＮＡ画分を集め、エタノール
沈澱物として約１６μｇのＤＮＡを回収した。

【００５４】（ニ）次に３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテー
ト、ｐＨ７．９，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１０ｍＭ
ＤＴＴ，６６ｍＭ酢酸カリウム、０．１ｍＭの各ｄＡ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（ｄＣＴＰは除く），１６μ
ｇの二本鎖ｃＤＮＡおよび２２．５単位のＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（タカラ）を混ぜ１５分，３７℃で反応を
行い、３1 末端についたｄＣ−ｔａｉｌを除去した。反
応終了後、フェノール処理を行い、セファデックスＧ−
５０カラムを通してＤＮＡ画分を集め、エタノール沈澱
物として１５．５μｇのＤＮＡを回収した。

【００５５】（ホ）次に５０ｍＭ酢酸ソーダ（ｐＨ４．
５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭＺｎＣｌ2 および１
５．５μｇの二本鎖ｃＤＮＡを３７℃で２０分間、予備
インキュベートした後、３単位のヌクレアーゼＳ1 （三
共製）を加え、さらに３７℃，１５分間インキュベート
した。反応終了後、フェノール処理を２回行い、セファ
デックスＧ−５０を通して二本鎖ｃＤＮＡ１５μｇを得
た。

【００５６】（ヘ）得られた二本鎖ｃＤＮＡ１５μｇを
蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１
ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５を含む溶液中で蔗糖密度勾
配５−２５％，４０，０００ｒｐｍ，４℃下で１３時
間）により分画し、その１部をアガロースゲル電気泳動
法によるオートラジオグラムにより解析し、二本鎖ｃＤ
ＮＡのｓｉｚｅが６００ｂｐ以上の画分を集めてエタノ
ール沈澱法で回収した。回収した二本鎖ｃＤＮＡは約７
μｇであった。

【００５７】（ト）０．１Ｍカコジル酸カリウム（トリ
スＢａｓｅでｐＨを７．２にしたもの）１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ，２ｍＭ ＣｏＣｌ2 ，０．５ｍＭ 32Ｐ−ｄＧＴＰ
（比活性１×１０6 ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ），７μｇ二本
鎖ｃＤＮＡおよび５０単位のデオキシヌクレオチジルタ
ーミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、２４
℃，２０分間インキュベートした後、フェノール処理を
行い、セファデックスＧ−５０カラムを通してｃＤＮＡ
画分を集め、エタノール沈澱物として６μｇのｄＧ−ｔ
ａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡは約１３個
のｄＧＭＰ残基が３′両末端に付加されていた。

【００５８】（チ）次にｄＧ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡ
６μｇを１％アガースゲル電気泳動を行いｓｉｚｅ分
画した。すなわち約７００ｂｐ以上のｃＤＮＡ画分をＤ
ＥＡＥ−セルロースペーパに吸着させて、次いで１．５
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．５溶液にて溶出させて回収し、さらにフェノール処
理、クロロホルム処理、エタノール沈澱により回収し、
約１．９μｇのｄＧ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを得た。

【００５９】（３）一方、図２に示したようにサル細胞
（ＣＯＳ細胞）でのｃＤＮＡ発現ベクターｐＤＥ−２を
構築した。ｐＤＥ−２はｃＤＮＡを両向きのＳＶ４０初
期プロモーターにはさみ込むことができ、Ｅ．ｃｏｌｉ
中で複製可能で、またアンピシリン耐性として選択する
ことができる。

【００６０】このｐＤＥ−２をＥｃｏＲＩで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で接着末端を充した
後、先程のｄｓ−ｃＤＮＡの３′端の両端にｄＧ ｔａ
ｉｌをつけたのと全く同じようにｄＣ ｔａｉｌを１３
個前後付与した。次にこのｄＣ−ｔａｉｌｅｄ ｐＤＥ
−２ １００ｎｇとｄＧ−ｔａｉｌｅｄｄｓ−ｃＤＮＡ
２０ｎｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液に混
合し、まず６５℃で２分間、ついで４５℃で６０分間、
３７℃で６０分間、そして室温で６０分間インキュベー
トした。そしてこのアニーリングしたＤＮＡをコンピテ
ントなＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１に導入した。次にＭ
Ｃ１０６１のコンピテント細胞の作り方、導入法を以下
に示す。

【００６１】Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１を１００ｍｌ
のΨ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，ｐＨ７．６）に接種し、培
養液の吸光度が５５０ｎｍで０．３〜０．５付近になる
まで３７℃で振盪培養した。培養終了後、培養液を５分
間、０℃に保持し、菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂ
Ｉ（３０ｍＭ酢酸カリウム，１００ｍＭ ＲｂＣｌ，１
０ｍＭ ＣａＣｌ2 ，５０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ，１５％グ
リセリン，ｐＨ５．８）の４０ｍｌに懸濁し、０℃に５
分間静置した。

【００６２】再び菌体を遠心分離により集め、ＴｆｂII
（１０ｍＭ ＭＯＰＳ又はＰＩＰＥＳ，７５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 ，１０ｍＭ ＲｂＣｌ，１０％グリセリン，ｐＨ
６．５）の４ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間静置した。
この懸濁液を分注して−７０℃に保存した。

【００６３】次にこのように調製したコンピテント細胞
の１００μｌを１５分間，０℃に保持し、この中に先程
ｄＧ−ｔａｉｌｅｄ ｐＤＥ−２ベクターとｄＣ−ｔａ
ｉｌｅｄ ｃＤＮＡとをアニールした標品１０μｌ及び
５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＣａＣｌ2 の溶液９
０μｌとを混合し、０℃で２０分間静置する。ついで３
７℃で６０秒間熱処理後、１〜２分間、０℃に保持し、
これにΨ培地７ｍｌを加え、３７℃で６０分間振盪培養
した。この培養液を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンと２
５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬ培地（１％
トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）
の寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩インキュベート
するとコロニーが出現した。

【００６４】（４）出現したコロニーを３２コずつ１９
２グループに分け、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンと２
５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むΨ培地１００
ｍｌに接種し、３７℃で５〜７時間振盪培養した。次に
最終濃度１７０μｇ／ｍｌとなるようにクロラムフェニ
コールを含む新たなΨ培地１００ｍｌを加え、さらに一
晩振盪培養した。

【００６５】このようにして増幅されたプラスミドＤＮ
Ａを以下のように精製した。培養液を遠心分離により菌
体のみ集め、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
の５ｍｌに懸濁し−８０℃に凍結後、融解して次にリゾ
チーム（最終濃度、２ｍｇ／ｍｌ）を加えて０℃で１０
分間静置し、さらにＥＤＴＡ（最終濃度０．１Ｍ）を加
え、０℃で１０分間静置する。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００（最終濃度０．１％）を加えて０℃で６０分間
静置する。ついで３０，０００ｒｐｍ，３０分間超遠心
分離し、その上清液を等量の水飽和フェノールで処理す
る。その水層をさらに等量のクロロホルムで処理し、そ
の水層を抽出し、これに最終濃度２０μｇ／ｍｌとなる
ようにＲＮａｓｅを加え、３７℃で６０分間インキュベ
ートした。

【００６６】その後０．２容の５Ｍ ＮａＣｌと１／３
容のポリエチレングリコールを加え、０℃に６０分間静
置後、１０，０００ｒｐｍ２０分間、遠心分離によりＤ
ＮＡ沈澱を回収する。次にこの沈澱を３．８ｍｌの水に
溶解し、４ｇのＣｓＣｌを加えて溶解後、１０ｍｇ／ｍ
ｌのＥｔＢｒの２００μｌを加えて４０，０００ｒｐ
ｍ、１６時間、２０℃で超遠心分画を行う。

【００６７】遠心終了後、ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ画分
を抽出し、水飽和ｎ−ブタノールの１〜２容で４回抽出
操作を行ってＥｔＢｒを除く、その後Ｈ2 Ｏ中で透析を
行ってＣｓＣｌを除去後、３Ｍ酢酸ソーダｐＨ５．６の
１／１０容を加えさらに２容の冷エタノールを加えて、
−２０℃で一晩静置する。このエタノール沈澱を遠心分
離で集めて８０％エタノール−水溶液で洗浄後、よく乾
燥し、この沈澱物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．５の５０μｌに溶解しサル細胞トランスフェクショ
ンのためのサンプルとする。

【００６８】実施例２ （１）サルＣＯＳ−７細胞へのプラスミドの感染法 ＣＯＳ−７細胞を１×１０5 コ／ｍｌになる様に１０％
牛胎児血清含有ＤＭＥＭに懸濁し、この８ｍｌ分を１０
ｃｍシャーレにて５％炭酸ガスインキュベーター内３７
℃で一夜培養した。培養上清を除去し、新しい１０％牛
胎児血清含有ＤＭＥＭ ５ｍｌを加え、３７℃５％炭酸
ガスインキュベーター内で４時間培養した。培養後、上
清を除去し、ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５，１３０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，
０．６ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）５ｍｌにて１回洗浄し
た。

【００６９】ＴＢＳ（＋）（ＴＢＳに０．７ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 ，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を加えたもの）２．５
ｍｌ，プラスミドＤＮＡ５μｇおよび１０ｍｇ／ｍｌ
ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ １２８μｌを加え、３７℃
５％炭酸ガスインキュベーター内で１時間インキュベー
トし、上清を除去後、ＴＢＳ５ｍｌで洗浄除去し、１５
０μＭクロロキン含有１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭ ５ｍｌ
を加えた。３７℃５％炭酸ガスインキュベーター内で３
時間インキュベート後上清を除去し、ＴＢＳ５ｍｌで２
回洗浄した。１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ ８ｍｌを
加え、３７℃５％炭酸ガスインキュベーター内で一夜培
養した。上清を除去後同ＤＭＥＭ ８ｍｌを加え、３７
℃５％炭酸ガスインキュベーター内で２日間培養した。
そしてこの培養上清を遠沈後その上清をＩＬ−３様活性
測定用サンプルとした。

【００７０】（２）Ａｓｓａｙ法とＡｓｓａｙ結果 ＦＤＣ−Ｐ細胞の増殖活性の測定は以下の方法に従っ
た。９６穴の組織培養プレートの個々の穴に、ＦＤＣ−
Ｐ細胞増殖活性を検定しようとするＣＯＳ細胞培養上清
を１００μｌずつ入れ、ＲＰＭＩ１６４０プラス１０％
ＦＢＳ培地にて２倍希釈を繰り返す。

【００７１】次いでＩＬ−３依存性細胞株であるＦＤＣ
−Ｐ細胞を１×１０4 個／１００μｌの細胞密度で各穴
に１００μｌ宛添加する。３７℃，５％ＣＯ2 下で１８
時間培養後に、トリチウムチミジン１μＣｉを加え６時
間パルスをおこなった後、この分野で良く知られた方法
に従って細胞をグラスファイバー濾紙上に採取し、シン
チレーターを添加後、細胞内に取り込まれたβ−放射線
量を測定した。ＦＤＣ−Ｐ細胞増殖活性の高い検体ほど
細胞内に取り込まれるトリチウム化チミジン量が多いこ
とより、ＣＯＳ細胞培養上清中のＦＤＣ−Ｐ細胞増殖因
子の産生量を容易に定量することができる。

【００７２】本方法により前述のプラスミド混合物をＣ
ＯＳ細胞にトランスフェクションして得られた１９２の
培養上清について活性検定を行ったところ表１に示す結
果が得られ、３−１１と番号表示したグループについて
有意の活性の存在が認められた。

【００７３】

【表１】

【００７４】（３）グループ３−１１は３２クローンの
混合体であるので次は３２クローンを別々に培養し、実
施例１の（４）で用いたのと全く同じ方法でプラスミド
を調製し前項の（１）と同じ方法でＣＯＳ細胞にトラン
スフェクションしてその培養上清についてＦＤＣ−Ｐ細
胞増殖活性を測定したところ１つのクローン（１５番
目、ｐ４−１５と命名）に増殖活性が認められ（図
３）、本クローンがＩＬ−３様活性を示すｃＤＮＡを持
つことが同定された。

【００７５】（４）プラスミドｐ４−１５よりＥｃｏＲ
ＩによりｃＤＮＡを切り出し、Ｍ１３を用いるｄｉｄｅ
ｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法とＭａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの方法を用いてその塩基配列を
決定したところ、本ＩＬ−３ｃＤＮＡはおよそ９００ｂ
ｐの塩基対よりなり、そのオープンリーディングフレー
ムよりおよそ１９７アミノ酸、あるいは８３アミノ酸か
らなる前駆ＨＣＧＰＦ蛋白をコードしていることが推定
された。本ｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号９）
と推定アミノ酸配列（配列表の配列番号３及び１０）を
示す。

【００７６】即ち、本ｃＤＮＡは、９０９個の塩基より
なり、コードするアミノ酸配列としては、配列表の配列
番号３及び１０に示すものが考えられる。

【００７７】実施例３ （１）ヒトＨＣＧＰＦ遺伝子をより効率よく発現させる
ためにｃＤＮＡの５′側に含まれるｐｏｌｙ ＧＣ ｔ
ａｉｌを除いたプラスミドを以下のように構築した（図
４）。実施例１で構築したプラスミドｐ４−１５から制
限酵素ＥｃｏＲＩによりｃＤＮＡを切り出し、そのうち
の一部を制限酵素ＢｇｌＩで切断した。このようにして
得られた３９６塩基対のＢｇｌＩ−ＢｇｌＩ断片をＴ４
ポリメラーゼを用いて両端を平滑末端にした後、Ｈｉｎ
ｄIII リンカーとモル比で１：１になる様混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。結合した断片を回
収後制限酵素ＨｉｎｄIII およびＳｐｈＩで切断し、Ｈ
ｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片を得た。

【００７８】一方のこりのｃＤＮＡをＳｐｈＩで切断し
ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得た。更に、プラスミドｐ
ＳＰ６２−ＰＬ（ＮＥＮ）を制限酵素ＨｉｎｄIII およ
びＥｃｏＲＩで切断してＳＰ６プロモーターを含むＤＮ
Ａ断片を得た。

【００７９】以上の様にして得られた３つの断片をモル
比で１：１：１になる様混合しＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。このようにして得られた組み換えＤＮ
Ａをエシエリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピ
シリン抵抗性を有する株を選択した。分離した株よりプ
ラスミドを調製し、制限酵素による切断試験および結合
部位付近の塩基配列の決定を行なう事によりｐＳＰ６−
４−１５を保持する菌を選定した。

【００８０】次にこの菌より得たプラスミドを制限酵素
ＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩで切断しｃＤＮＡインサ
ートを回収した。このｃＤＮＡをＴ４ポリメラーゼを用
いて両端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩリンカーとモ
ル比で１：１となる様混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。結合した断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ
で開裂したｐＫＣＲ（Ｇｌｕｔｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ
２３，１７５−１８２（１９８１））と混合しＴ４リガ
ーゼを用いて結合させた。

【００８１】このようにして得られた組み換えＤＮＡを
エシエリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入しアンピシリン
抵抗性を有する株を選択した。分離した株からプラスミ
ドを調製し、制限酵素切断試験を行なう事によってベク
ター上およびｃＤＮＡ上の制限酵素切断部位がＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ−ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩの順
に並ぶ様な形でｃＤＮＡが挿入されているプラスミドｐ
ＫＣＲ−４−１５を保持する菌を選定した（ｐＫＣＲ−
４−１５／ＨＢ１０１）。本ｐＫＣＲ−４−１５／ＨＢ
１０１を常法に従って培養し、実施例１の第（４）項の
方法に従ってプラスミドｐＫＣＲ−４−１５を得た。

【００８２】実施例４ （１）ヒトＨＣＧＰＦ遺伝子を原核生物で発現させるた
めに使用したベクターＤＮＡを以下のように構築した
（図５）。まず図６に示すＤＮＡ配列を持つＤＮＡ断片
（ａ）〜（ｌ）をそれぞれ固相リン酸トリエステル法で
合成した。（ａ）および（ｇ）以外はＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼとＡＴＰを用いて５′末端をリン酸化して
おいた。

【００８３】次に（ａ）〜（ｌ）を混合し、アニール
後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて二本鎖合成ＤＮＡ
（Ａ）を形成させた。一方、ｐＴ９−１１（特開昭６１
−８８８８２）を制限酵素ＨｐａＩおよびＸｂａＩで切
断しアガロースゲル電気泳動により大きなＤＮＡ断片を
分離した。次に得られたｐＴ９−１１断片と合成ＤＮＡ
（Ａ）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させ
た。得られた組み換えＤＮＡを、エシエリヒア・コリＨ
Ｂ１０１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を
選択した。分離した株から、プラスミドＤＮＡを得て制
限酵素による切断試験および塩基配列の決定を行うこと
により、ｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を保持する菌を選択し
た。

【００８４】（２）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）お
よびｐ４−１５を用いＮ末端をＴｈｒ19としたＨＣＧＰ
Ｆを発現する組み換えＤＮＡを以下の様に構築した（図
７）。

【００８５】ｉ）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を制
限酵素ＣｌａＩおよびＰｖｕIIで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動により大きなＤＮＡ断片を単離精製した。

【００８６】他方、プラスミドｐ４−１５を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＨＣ
ＧＰＦｃＤＮＡインサートを回収した。そして該Ｅｃｏ
ＲＩＨＣＧＰＦｃＤＮＡインサートを制限酵素ＢａｌＩ
およびＨｇｉＡＩで完全切断し、アガロースゲル電気泳
動により大きなＤＮＡ断片を回収した。次にトリプトフ
ァンプロモーター／オペレーター（ｔｒｐＰ／Ｏ）を含
むｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）断片；ＨＣＧＰＦｃＤＮＡを含
むＨｇｉＡＩ−ＢａｌＩ断片および合成ＤＮＡ（Ｉ）
〔配列表の配列番号１７と１８〕を混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを使って結合させた。

【００８７】得られた組み換えＤＮＡをエシエリヒア・
コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有す
る株を選択した。分離した株からプラスミドを得て制限
酵素による切断試験および結合部位付近の塩基配列の決
定を行なうことにより、ｐＴＨＣＧＰＦ−１９を保持す
る菌を選定した（ｐＴＨＣＧＰＦ−１９／ＨＢ１０１，
ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４６）。

【００８８】ii）ｐＴＨＣＧＰＦ−１９／ＨＢ１０１を
２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＬＧ培地（１％バクトトリプト
ン，０．５％酵母エキス０．５％ＮａＣｌ，０．１％グ
ルコース，ｐＨ７．５）１０ｍｌ中で３７℃一晩生育さ
せた。ついで培養懸濁液５ｍｌをＭ９−カザミノ酸培地
（０．６％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ，０．３％ＫＨ
2 ＰＯ4 ，０．０５％ＮａＣｌ，０．１％ＮＨ4 Ｃｌ，
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．００１４７％Ｃ
ａＣｌ2 ，０．２％グルコース，０．２％カザミノ酸、
０．０２％Ｌ−ロイシン，０．０２％Ｌ−プロリン，
０．０００２％チアミン塩酸塩，ｐＨ７．４）へ移植
し、２８℃にて３時間培養した。

【００８９】その後、２５μｇ／ｍｌになる様に３−ト
ンドールアクリル酸（ＩＡＡ）を添加し２３℃にて２１
時間誘導培養した。培養菌体を遠心分離し、２０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ７．５，３０ｍＭ ＮａＣｌを含む）
で洗浄し、同じ緩衝液８ｍｌに懸濁した。かくして菌体
内に産生される蛋白を５０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下１％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または１ｍｇ／ｍｌリ
ゾチーム消化に引き続きソニック処理（５０Ｗ，３０秒
間）することにより抽出した。図８に示す如く、該培養
抽出液はＨＣＧＰＦ活性を示した。

【００９０】実施例５ （１）実施例４にて構築したプラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎ
ｃｏ）およびｐ４−１５を用いＮ末端をＩｌｅ31とした
ＨＣＧＰＦを発現する組み換えＤＮＡを以下の様に構築
した（図９）。

【００９１】ｉ）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を成
分酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、アガロースゲル
電気泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。他方、プ
ラスミドｐ４−１５を制限酵素ＡｐａＩで切断後、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理し、アガロースゲル電気泳動
により小さなＤＮＡ断片を回収した。これら両断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組み換
えＤＮＡをエシエリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、
アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。分離した株
からプラスミドを得て制限酵素による切断試験を行なう
ことにより、ｐＴＨＣＧＰＦ−０１を保持する菌を選定
した（ｐＴＨＣＧＰＦ−０１／ＨＢ１０１）。

【００９２】ii）ｉ）で得たプラスミドｐＴＨＣＧＰＦ
−０１を制限酵素ＣｌａＩで完全切断後、ＡｖａＩで部
分切断し、アルカリ性フォスファターゼ処理を行なっ
た。この様にして調製したＤＮＡ断片と合成ＤＮＡ（I
I）〔配列表の配列番号１１，１２〕を混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組み換えＤ
ＮＡをエシエリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アン
ピシリン抵抗性を有する株を選択した。分離した株から
プラスミドを得て制限酵素による切断試験および結合部
位付近の塩基配列の決定を行なうことにより、ｐＴＨＣ
ＧＰＦ−３１を保持する菌を選択した（ｐＴＨＣＧＰＦ
−３１／ＨＢ１０１，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４７）。

【００９３】iii)ｐＴＨＣＧＰＦ−３１／ＨＢ１０１を
実施例４ii）に従い培養菌体抽出液を得た。図８に示す
如く、該培養抽出液はＨＣＧＰＦ活性を示した。

【００９４】実施例６ （１）実施例４にて構築したプラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎ
ｃｏ）および実施例５にて構築したｐＴＨＣＧＰＦ−０
１を用いＨＩＬ−２蛋白融合Ｎ末端をＴｈｒ19としたＨ
ＣＧＰＦを発現する組み換えＤＮＡを以下の様に構築し
た（図１０）。

【００９５】ｉ）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を制
限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断後アガロースゲ
ル電気泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。他方プ
ラスミドｐＴＨＣＧＰＦ−０１を制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで切断しアガロースゲル電気泳動により
小さいＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片をＨｇｉＡ
Ｉで完全切断し、アガロースゲル電気泳動にて大きいＤ
ＮＡ断片を回収した。

【００９６】この様にして調製したＤＮＡ断片と合成Ｄ
ＮＡ（III)〔配列表の配列番号１３と配列番号１４〕を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得ら
れた組み換えＤＮＡをエシエリヒア・コリＨＢ１０１株
へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。
分離した株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による
切断試験および塩基配列の決定を行うことにより、ｐＴ
１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９（ｐＴ１
３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９／ＨＢ１０
１，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４８）を保持する菌を選択し
た。

【００９７】（２）生産物の取得 ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９／Ｈ
Ｂ１０１を実施例４に従い培養し、以下の手順で、菌体
内に生成した顆粒を抽出した。遠心分離により菌体を集
め、１０倍濃縮になるように３０ｍＭ ＮａＣｌを含む
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を添
加し懸濁後そこにリゾチーム１ｍｇ／ｍｌ，ＥＤＴＡ
０．０５Ｍを添加し攪拌した後、氷中にて、１時間放置
した。次いで、超音波破砕で菌体を破壊し、１０，００
０ｒｐｍ，５分間の遠心分離で、顆粒を回収した。

【００９８】そして、この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで
可溶化した。該可溶化物は図１１に示す如く、ＨＣＧＰ
Ｆ活性を示した。また該可溶化物の逆相ＨＰＬＣ（ＡＰ
−３１２、山村化学）分画物も同様ＨＣＧＰＦ活性を示
した（図１２）。さらに該６Ｍ塩酸グアニジン可溶化物
をΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白濃度が１
００ｍｇ／ｍｌ、及び２Ｍ塩酸グアニジン溶液となるよ
うに濃度調整を行ない、これに、酸化型グルタチオン１
ｍＭと還元型グルタチオン１０ｍＭを添加し、ｐＨ８．
０、室温で１０〜１６時間放置した。

【００９９】次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲ
ル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリクレ
イン反応用緩衝液溶液となったΔＨＩＬ２（５３）−Ｈ
ＣＧＰＦ−１９蛋白相当画分を得た。本物質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量がアミノ
酸組成から計算した値とほぼ一致し、又、プロテインシ
ークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結
果、ＨＩＬ−２の配列であることが確認された。

【０１００】（３）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．８中で、得られたΔＨＩＬ２（５
３）−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白８０μｇとヒトプラズマカ
リクレインを３７℃、１５時間反応後、逆相ＨＰＬＣで
ＨＣＧＰＦ−１９蛋白相当画分を分取した。これを、プ
ロテインシークエンサーにてＮ末端付近のアミノ酸配列
を分析した結果ΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９
蛋白が、定量的にＨＣＧＰＦ−１９蛋白に変換されたこ
とが確認された。該ＨＣＧＰＦ−１９蛋白はＨＣＧＰＦ
活性を示した（図１３）。

【０１０１】実施例７ （１）実施例４および５にてそれぞれ構築したプラスミ
ドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）およびｐＴＨＣＧＰＦ−０１を
用いＨＩＬ−２蛋白融合Ｎ末端をＩｌｅ31としたＨＣＧ
ＰＦを発現する組み換えＤＮＡを以下の様に構築した
（図１４）。

【０１０２】ｉ）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を制
限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断後アガロースゲ
ル電気泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。他方プ
ラスミドｐＴＨＣＧＰＦ−０１を制限酵素ＢａｍＨＩで
完全切断後、ＡｖａＩで部分切断し、ＨＣＧＰＦｃＤＮ
Ａインサートを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動により回収した。

【０１０３】この様に調製したＤＮＡ断片と合成ＤＮＡ
（IV）〔配列表の配列番号１５と１６〕を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組み換え
ＤＮＡをエシエリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、ア
ンピシリン抵抗性を有する株を選択した。分離した株か
らプラスミドＤＮＡを得て、制限酵素による切断試験お
よび塩基配列の決定を行うことにより、ｐＴ１３ＳΔＨ
ＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−３１を保持する菌を選択
した（ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−３
１／ＨＢ１０１，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２５１）。

【０１０４】（２）生産物の取得 ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−３１／Ｈ
Ｂ１０１を実施例４に従い培養し、実施例６に従い菌体
内に生成した顆粒を抽出し、この顆粒を６Ｍ塩酸グアニ
ジンで可溶化した。図１５に示す如く、該可溶化物はＨ
ＣＧＰＦ活性を示した。さらに、ΔＨＩＬ２（５３）−
ＨＣＧＰＦ−３１蛋白濃度が１００μｇ／ｍｌ、及び２
Ｍ塩酸グアニジン溶液となるように、濃度調整を行ない
これに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グルタチオ
ン１０ｍＭを添加し、ｐＨ８．０、室温で１０〜１６時
間放置した。

【０１０５】次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲ
ル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時にカリクレイ
ン反応用緩衝液溶液となったΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣ
ＧＰＦ−３１蛋白相当画分を得た。本物質はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、分子量が、アミノ
酸組成から計算した値とほぼ一致し、又、プロテインシ
ークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結
果、ＨＩＬ−２の配列であることが確認された。

【０１０６】（３）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．８中で得られたΔＨＩＬ２（５
３）−ＨＣＧＰＦ−３１蛋白８０μｇとヒトプラズマカ
リクレインを３７℃、１５時間反応後、逆相ＨＰＬＣで
ＨＣＧＰＦ−３１蛋白相当画分を分取した。これを、プ
ロテインシークエンサーにてＮ末端付近のアミノ酸配列
を分析した結果ΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−３１
蛋白が定量的に、ＨＣＧＰＦ−３１蛋白に変換されたこ
とが確認された。該ＨＣＧＰＦ−３１蛋白は、ＨＣＧＰ
Ｆ活性を示した（図１３）。

【０１０７】実施例８ （１）ｉ）実施例６にて構築したプラスミドｐＴ１３Ｓ
ΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９を制限酵素Ｂｇ
ｌIIおよびＸｂａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ）処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結
合させた（図１６）。得られた組み換えＤＮＡをエシエ
リヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリン抵抗
性を有する株を選択した。分離した株からプラスミドＤ
ＮＡを得て制限酵素による切断試験および結合部位付近
の塩基配列の決定を行うことにより、ｐＴ１３ＳΔＨＩ
Ｌ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−１９を保持する菌を選択し
た（ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−１９
／ＨＢ１０１，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４９）。

【０１０８】（２）生産物の取得 ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−１９／Ｈ
Ｂ１０１を実施例４に従い培養し、実施例６に従い菌体
内に生成した顆粒を抽出し、この顆粒を６Ｍ塩酸グアニ
ジンで可溶化した。図１１に示す如く、該可溶化物はＨ
ＣＧＰＦ活性を示した。さらに、ΔＨＩＬ２（２０）−
ＨＣＧＰＦ−１９蛋白濃度が１００μｇ／ｍｌ、及び２
Ｍ塩酸グアニジン溶液となるように、濃度調整を行な
い、これに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グルタ
チオン１０ｍＭを添加し、ｐＨ８．０、室温で１０〜１
６時間放置した。

【０１０９】次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲ
ル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリクレ
イン反応用緩衝液溶液となったΔＨＩＬ２（２０）−Ｈ
ＣＧＰＦ−１９蛋白相当画分を得た。本物質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分子量が、アミノ
酸組成から計算した値とほぼ一致し、又、プロテインシ
ークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結
果、ＨＩＬ−２の配列であることが確認された。

【０１１０】（３）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．８中で、得られたＨＣＧＰＦ−１
９蛋白８０μｇとヒトプラズマカリクレインを３７℃１
５時間反応後、逆相ＨＰＬＣでＨＣＧＰＦ−１９蛋白相
当画分を分取した。これを、プロテインシークエンサー
にてＮ末端付近のアミノ酸配列を分析した結果ΔＨＩＬ
２（２０）−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白が定量的にＨＣＧＰ
Ｆ−１９蛋白に変換されたことが確認された。該ＨＣＧ
ＰＦ−１９蛋白はＨＣＧＰＦ活性を示した。

【０１１１】実施例９ （１）ｉ）実施例７にて構築したプラスミドｐＴ１３Ｓ
ΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−３１を制限酵素Ｂｇ
ｌIIおよびＸｂａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ）処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って
結合させた（図１７）。得られた組み換えＤＮＡをエシ
エリヒア・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリン抵
抗性を有する株を選択した。分離した株からプラスミド
ＤＮＡを得て制限酵素による切断試験および結合部位付
近の塩基配列の決定を行うことにより、ｐＴ１３ＳΔＨ
ＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−３１を保持する菌を選択
した（ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−３
１／ＨＢ１０１，ＦＥＲＭＢＰ−１２５２）。

【０１１２】（２）生産物の取得 ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−３１／Ｈ
Ｂ１０１を実施例４に従い培養し、実施例６に従い菌体
内に生成した顆粒を抽出し、この顆粒を６Ｍ塩酸グアニ
ジンで可溶化した。図１５に示す如く、該可溶化物はＨ
ＣＧＰＦ活性を示した。さらに、ΔＨＩＬ２（２０）−
ＨＣＧＰＦ−３１蛋白濃度が１００μｇ／ｍｌ、及び２
Ｍ塩酸グアニジン溶液となるように濃度調整を行ない、
これに、酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グルタチオ
ン１０ｍＭを添加し、ｐＨ８．０、室温で１０〜１６時
間放置した。

【０１１３】次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲ
ル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリクレ
イン反応用緩衝液溶液となったΔＨＩＬ２（２０）−Ｈ
ＣＧＰＦ−３１蛋白相当画分を得た。本物質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量が、アミ
ノ酸組成から計算した値とほぼ一致し、又、プロテイン
シークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した
結果、ＨＩＬ−２の配列であることが確認された。

【０１１４】（３）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．８中で得られたΔＨＩＬ２（２
０）−ＨＣＧＰＦ−３１蛋白８０μｇとヒトプラズマカ
リクレインを３７℃、１５時間反応後逆相ＨＰＬＣでＨ
ＣＧＰＦ−３１蛋白相当画分を分取した。これを、プロ
テインシークエンサーにてＮ末端付近のアミノ酸配列を
分析した結果ΔＨＩＬ２（２０）−ＨＣＧＰＦ−３１蛋
白が、定量的にＨＣＧＰＦ−３１蛋白に変換されたこと
が確認された。該ＨＣＧＰＦ−３１蛋白はＨＣＧＰＦ活
性を示した。

【０１１５】実施例１０ （１）実施例４にて構築したプラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎ
ｃｏ）および実施例６にて構築したプラスミドｐＴ１３
ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９を用いＨＩＬ
−２蛋白融合Ｎ末端をＴｈｒ19としたＨＣＧＰＦを発現
する組み換えＤＮＡを以下の様に構築した（図１８）。

【０１１６】ｉ）プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）を制
限酵素ＰｓｔＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、更に制限酵素ＰｖｕＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動により２番目に大きいＤＮＡ断片を回収した。他
方、プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧ
ＰＦ−１９を制限酵素ＸｂａＩで切断後、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、更に制限酵素Ｐｖ
ｕＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により大きいＤ
ＮＡ断片を回収した。

【０１１７】これら両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを使っ
て結合させた。得られた組み換えＤＮＡをエシエリヒア
・コリＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有
する株を選択した。分離した株からプラスミドを得て制
限酵素による切断試験および結合部位付近の塩基配列の
決定を行なうことによりｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（１１）
−ＨＣＧＰＦ−１９を保持する菌を選択した（ｐＴ１３
ＳΔＨＩＬ２（１１）−ＨＣＧＰＦ−１９／ＨＢ１０
１，ＦＥＲＭ ＢＰ−１２５０）。

【０１１８】（２）生産物の取得 ｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（１１）−ＨＣＧＰＦ−１９／Ｈ
Ｂ１０１を実施例４に従い培養し、実施例６に従い菌体
内に生成した顆粒を抽出し、この顆粒を６Ｍ塩酸グアニ
ジンで可溶化した。図１１に示す如く、該可溶化物はＨ
ＣＧＰＦ活性を示した。さらに、ΔＨＩＬ２（１１）−
ＨＣＧＰＦ−１９濃度が１００μｇ／ｍｌ及び２Ｍ塩酸
グアニジン溶液となるように濃度調整を行ないこれに、
酸化型グルタチオン１ｍＭと還元型グルタチオン１０ｍ
Ｍを添加し、ｐＨ８．０、室温で、１０〜１６時間放置
した。

【０１１９】次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲ
ル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリクレ
イン反応用緩衝液溶液となったΔＨＩＬ２（１１）−Ｈ
ＣＧＰＦ−１９蛋白相当画分を得た。本物質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量が、アミ
ノ酸組成から計算した値とほぼ一致し、又、プロテイン
シークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した
結果、ＨＩＬ−２の配列であることが確認された。

【０１２０】（３）カリクレインによる切断 １１３ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液ｐＨ７．８中で、得られたΔＨＩＬ２（１１）
−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白８０μｇとヒトプラズマカリク
レインを３７℃、１５時間反応後逆相ＨＰＬＣでＨＣＧ
ＰＦ−１９蛋白相当画分を分取した。これを、プロテイ
ンシークエンサーにてＮ末端付近のアミノ酸配列を分析
した結果ΔＨＩＬ２（１１）−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白
が、定量的にＨＣＧＰＦ−１９蛋白に変換されたことが
確認された。該ＨＣＧＰＦ−１９はＨＣＧＰＦ活性を示
した。

【０１２１】実施例１１ マウス骨髄細胞を用いるＨＣ
ＧＰＦ活性検定 （１）ヒトＨＣＧＰＦを含むＣＯＳ細胞培養上清を以下
の様に調製した。実施例３で得られたプラスミドｐＫＣ
Ｒ−４−１５ ５μｇを実施例２の方法に従ってサルＣ
ＯＳ−７細胞に感染させ培養上清を得、これをアミコン
社製限外濾過膜（ＹＭ１０）を用いて５倍濃縮しヒトＨ
ＣＧＰＦ活性測定サンプルとした。

【０１２２】（２）ヒトＨＣＧＰＦを含むエシエリヒア
・コリ抽出物の調製および、そのカリクレインによる切
断は実施例６〜１０に述べた通りに行なった。各々得ら
れた培養抽出物、６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ塩酸可溶
物、その逆相ＨＰＬＣ（ＡＰ−３１２，山村化学）によ
る精製分画およびカリクレイン切断物を各々１μｇ／ｍ
ｌになる様２０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にて希釈
しこれをヒトＨＣＧＰＦ活性測定サンプルとした。

【０１２３】（３）アッセイ法 マウス骨髄細胞を用いるヒトＨＣＧＰＦアッセイは以下
の様にして行った。５〜９週令のＤＢＡ／２雌マウス
（チャールズリバージャパン（株））の大腿骨を取り出
し、両骨端を切除した後、１ｍｌの１０％（容量比）の
牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地を、注射針を
操着した注射筒にて一方より注入する事により骨髄細胞
をプラスチックチューブに押し出した。更に本骨髄細胞
懸濁液を注射針を操着した注射筒にて吸引、吹出しを繰
り返す事でシングル細胞化した。１０％ＦＢＳを含むＲ
ＰＭＩ培地で３回洗浄した後１×１０6 個／ｍｌになる
様２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に懸濁した。

【０１２４】９６穴の組織培養プレートの個々の穴にＨ
ＣＧＰＦ活性を測定しようとするサンプルを１００μｌ
ずつ入れ、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地にて２倍
希釈を繰り返した。次いで、実施例２の方法に従って、
マウスインターロイキン３（ＩＬ−３）ｃＤＮＡを含む
プラスミドｐＱＲＭＩＬ３ ５μｇをサルＣＯＳの細胞
に感染させて得たマウスＩＬ−３を含む培養上清を各穴
に５０μｌずつ添加した。

【０１２５】ＨＣＧＰＦの直接の骨髄細胞に対する増殖
刺激を測定する場合には、本培養上清の代わりに２０％
のＦＢＳを含むＲＰＭＩを５０μｌ添加する。

【０１２６】最後に、上記の様に調製したマウス骨髄細
胞浮遊液を各穴５０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ
2 存在下に５日間培養後、トリチウムチミジン１μＣｉ
を加え８時間パルスを行った後、常法に従って細胞内に
取り込まれたβ−放射線量を測定した。

【０１２７】骨髄細胞のうち、ＨＣＧＰＦに応答して増
殖する細胞は取り込むトリチウムチミジン量が多いこと
によりＣＯＳ細胞上清中およびエシエリヒア・コリ抽出
物などの産生量を容易に定量することができる。本方法
によって、ＣＯＳ上清中には図１９に示すように単独で
骨髄細胞を増殖させる弱い活性並びにマウスＩＬ−３と
協同して骨髄細胞を増殖させる活性が含まれる事が明ら
かとなった。対照として用いたｃＤＮＡを含まないプラ
スミドｐＫＣＲを感染して得たＣＯＳ−７細胞上清には
いずれの活性もみとめられない。

【０１２８】また、エシエリヒア・コリ抽出物、６Ｍ
Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ塩酸可溶化物、該抽出物逆相ＨＰＬ
Ｃ分画、さらにはカリクレイン切断物においても同様に
活性が認められた（図８，図１１，図１２，図１３，図
１５）。

【０１２９】実施例１２ ヒト骨髄細胞、胸腺細胞を用
いる活性検定 実施例１１と同じサンプルにつき以下の方法を用いてＨ
ＣＧＰＦ活性を測定した。健常人より得たヒト骨髄細胞
（２×１０5 個／ｗｅｌｌ）もしくは胸腺細胞（５×１
０5 ／ｗｅｌｌ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に
懸濁したものを、１０％ＦＢＳを含む倍々希釈したＨＣ
ＧＰＦ活性を測定しようとするサンプル１００μｌを含
む９６穴の組織培養プレートの各穴１００μｌずつ加
え、５日間３７℃、５％ＣＯ2 中で培養した後、１μＣ
ｉのトリチウムチミジンを各穴に加え８時間パルスし
た。常法に従って細胞をハーベストした後、取り込まれ
たβ放射活性を測定した。表２に示す様に弱いながら有
意な増殖誘導が認められた。

【０１３０】

【表２】

【０１３１】

【発明の効果】本発明のＨＣＧＰＦは免疫調節機能、造
血調節機能を有するので免疫不全症、感染症、癌、肝
炎、腎炎、骨髄移植等の分野に応用できる。また、本Ｈ
ＣＧＰＦを他の免疫活性物質、免疫療法剤、リンホカイ
ン、サイトカイニン、インターフェロン、細胞生長因
子、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤と併用する
と、効果増強及び他薬剤の副作用軽減に有効であると考
えられる。

【０１３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly Ile Phe Gly Phe 1 5 10 15 Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly 20 25 30 Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala 35 40 45 Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly 50 55 60 Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp 85 90 95 Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu 100 105 110 Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val 115 120 125 Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro 130 135 140 Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr 145 150 155 160 Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg 165 170 175 Thr Gly Ala

【０１３３】配列番号：２ 配列の長さ：１６７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln 20 25 30 Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly 35 40 45 Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met 50 55 60 Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser 85 90 95 Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu 100 105 110 Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser 115 120 125 Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu 130 135 140 Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala 165

【０１３４】配列番号：３ 配列の長さ：１９７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly 1 5 10 15 Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly Ile Phe 20 25 30 Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu 35 40 45 Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp 50 55 60 Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu 65 70 75 80 Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg 85 90 95 Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala 100 105 110 Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His 115 120 125 Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser 130 135 140 Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys 145 150 155 160 Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln 165 170 175 Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala 180 185 190 Gln Arg Thr Gly Ala 195

【０１３５】配列番号：４ 配列の長さ：１９４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Pro Arg Phe Arg Thr 1 5 10 15 Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly Ile Phe Gly Phe Ser 20 25 30 Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly Lys 35 40 45 Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala 50 55 60 Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Thr Gly Thr 65 70 75 80 Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val 85 90 95 Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp Leu 100 105 110 Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu Glu 115 120 125 Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val Lys 130 135 140 Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly 145 150 155 160 Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr Ala 165 170 175 Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg Thr 180 185 190 Gly Ala

【０１３６】配列番号：５ 配列の長さ：２０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Pro Arg Phe Arg Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln 20 25 30 Glu His Ser Gly Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn 35 40 45 Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg 50 55 60 Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala 65 70 75 80 Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala 85 90 95 Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly 100 105 110 Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val 115 120 125 Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn 130 135 140 Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala 145 150 155 160 Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile 165 170 175 Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser 180 185 190 Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala 195 200

【０１３７】配列番号：６ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Ser Arg Phe Arg Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu 50 55 60 Gln Glu His Ser Gly Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg 65 70 75 80 Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr 85 90 95 Arg Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His 100 105 110 Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln 115 120 125 Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln 130 135 140 Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser 145 150 155 160 Val Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg 165 170 175 Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln 180 185 190 Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile 195 200 205 Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu 210 215 220 Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala 225 230 235

【０１３８】配列番号：７ 配列の長さ：１９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Pro Arg Phe Arg Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr 35 40 45 Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe 50 55 60 Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val 65 70 75 80 Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val 85 90 95 Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile 100 105 110 Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu 115 120 125 Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala 130 135 140 Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp 145 150 155 160 Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys 165 170 175 Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala 180 185 190

【０１３９】配列番号：８ 配列の長さ：２２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Ser Arg Phe Arg Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser 50 55 60 His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr 65 70 75 80 Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp 85 90 95 Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys 100 105 110 Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp 115 120 125 Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro 130 135 140 Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His Val Leu Glu Gln Arg 145 150 155 160 Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu 165 170 175 Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe 180 185 190 Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu 195 200 205 Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala 210 215 220

【０１４０】配列番号：９ 配列の長さ：９０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GGATGCTGCG GCGCCCGCTG GCCGGGCGGC TGCGGCCGCC CTGGCCGGGC CCCACCGGAC 60 GGC ATG TCG GGC CCC AGG CCT GTG GTG CTG AGC GGG CCT TCG GGA GCT 108 Met Ser Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala 1 5 10 15 GGG AAG AGC ACC CTG CTG AAG AGG CTG CTC CAG GAG CAC AGC GGC ATC 156 Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly Ile 20 25 30 TTT GGC TTC AGC GTG TCC CAT ACC ACG AGG AAC CCG AGG CCC GGC GAG 204 Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu 35 40 45 GAG AAC GGC AAA GAT TAC TAC TTT GTA ACC AGG GAG GTG ATG CAG CGT 252 Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg 50 55 60 GAC ATA GCA GCC GGC GAC TTC ATC GAG CAT GCC GAG TTC TCG GGG AAC 300 Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn 65 70 75 CTG TAT GGC ACG AGC AAG GTG GCG GTG CAG GCC GTG CAG GCC ATG AAC 348 Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn 80 85 90 95 CGC ATC TGT GTG CTG GAC GTG GAC CTG CAG GGT GTG CGG AAC ATC AAG 396 Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys 100 105 110 GCC ACC GAT CTG CGG CCC ATC TAC ATC TCT GTG CAG CCG CCT TCA CTG 444 Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu 115 120 125 CAC GTG CTG GAG CAG CGG CTG CGG CAG CGC AAC ACT GAA ACC GAG GAG 492 His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu 130 135 140 AGC CTG GTG AAG CGG CTG GCT GCT GCC CAG GCC GAC ATG GAG AGC AGC 540 Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser 145 150 155 AAG GAG CCC GGC CTG TTT GAT GTG GTC ATC ATT AAC GAC AGC CTG GAC 588 Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp 160 165 170 175 CAG GCC TAC GCA GAG CTG AAG GAG GCG CTC TCT GAG GAA ATC AAG AAA 636 Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys 180 185 190 GCT CAA AGG ACC GGC GCC TGAGGCTTGC TGTCTGTTCT CGGCACCCTG 684 Ala Gln Arg Thr Gly Ala 195 GGCCCATACA GGACCAGGGC AGCAGCATTG AGCCACCCCC CTTGGCAGGC GATACGGCAG 744 CTCTGTGCCC TTGGCCAGCA TGTGGAGTGG AGGAGATGCT GCCCCTGTGG TTGGAACATC 804 CTGGGGTGAC CCCCGACCCA GCCTCGCTGG GCTGTCCCCT GTCCCTATCT CTCACTCTGA 864 ACCCAGGGCT GACATCCTAA TAAAATAACT GTTGGATTAG AAACT 909

【０１４１】配列番号：１０ 配列の長さ：８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Arg Arg Pro Leu Ala Gly Arg Leu Arg Pro Pro Trp Pro Gly 1 5 10 15 Pro Thr Gly Arg His Val Gly Pro Gln Ala Cys Gly Ala Glu Arg Ala 20 25 30 Phe Gly Ser Trp Glu Glu His Pro Ala Glu Glu Ala Ala Pro Gly Ala 35 40 45 Gln Arg His Leu Trp Leu Gln Arg Val Pro Tyr His Glu Glu Pro Glu 50 55 60 Ala Arg Arg Gly Glu Arg Gln Arg Leu Leu Leu Cys Asn Gln Gly Gly 65 70 75 80 Asp Ala Ala

【０１４２】配列番号：１１ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CGATAAGCCA TGATCTTTGG CTTCAGCGTG TCCCATACCA CGAGGAAC 48

【０１４３】配列番号：１２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCGGGTTCCT CGTGGTATGG GACACGCTGA AGCCAAAGAT CATGGCTTAT 50

【０１４４】配列番号：１３ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ATCTAGATTC CGCACCCTGC TGAAGAGGCT GCTCCAGGAG CA 42

【０１４５】配列番号：１４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCTGGAGCAG CCTCTTCAGC AGGGTGCGGA ATCTAGATAG CT 42

【０１４６】配列番号：１５ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ATCTAGATTC CGCATCTTTG GCTTCAGCGT GTCCCATACC ACGAGGAAC 49

【０１４７】配列番号：１６ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCGGGTTCCT CGTGGTATGG GACACGCTGA AGCCAAAGAT GCGGAATCTA GATAGCT 57

【０１４８】配列番号：１７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：３５ CGATAAGCCA TGACCCTGCT GAAGAGGCTG CTCCAGCAGC A 41

【０１４９】配列番号：１８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCTGGAGCAG CCTCTTCAGC AGGGTCATGG CTTAT 35

【図面の簡単な説明】

【図１】ｃＤＮＡインサートの制限酵素エンドヌクレア
ーゼによる切断図である。

【図２】発現ベクターｐＤＥ−２の構築図である。

【図３】ｐ４−１５クローンを導入したＣＯＳ細胞の培
養上清のＦＤＣ−Ｐ増殖誘導活性を示す。 □−□ ｐ４−１５クローン（４倍濃縮） ○−○ ｐ４−１５クローン（原液） ●−● 対照（遺伝子非導入ＣＯＳ上清） ----- 活性検定培地

【図４】プラスミドｐＫＣＲ−４−１５の構築図であ
る。

【図５】ベクターｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）の構築図であ
る。

【図６】ヒトＩＬ−２のＤＮＡ断片を示す。

【図７】プラスミドｐＴＨＣＧＰＦ−１９の構築図であ
る。

【図８】各種プラスミド感染エシエリヒア・コリ培養抽
出液のＨＣＧＰＦ活性を示す。

【図９】プラスミドｐＴＨＣＧＰＦ−３１の構築図を示
す。

【図１０】プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−
ＨＣＧＰＦ−１９の構築図を示す。

【図１１】マウスＩＬ−３添加および無添加の場合の各
種プラスミド感染エシエリヒア・コリ培養抽出顆粒の６
Ｍグアニジン塩酸可溶化物のＨＣＧＰＦ活性を示す。

【図１２】ΔＨＩＬ２（５３）−ＨＣＧＰＦ−１９蛋白
の逆相ＨＰＬＣ精製分画のＨＣＧＰＦ活性を示す。

【図１３】ＨＩＬ−２融合ＨＣＧＰＦ蛋白のカリクレイ
ン切断物のＨＣＧＰＦ活性を示す。

【図１４】プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（５３）−
ＨＣＧＰＦ−３１の構築図を示す。

【図１５】各種プラスミド感染エシエリヒア・コリ培養
抽出顆粒の６Ｍグアニジン塩酸可溶化物のＨＣＧＰＦ活
性を示す。

【図１６】プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−
ＨＣＧＰＦ−１９の構築図である。

【図１７】プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（２０）−
ＨＣＧＰＦ−３１の構築図である。

【図１８】プラスミドｐＴ１３ＳΔＨＩＬ２（１１）−
ＨＣＧＰＦ−１９の構築図である。

【図１９】マウスＩＬ−３添加および無添加の場合のＣ
ＯＳ細胞培養上清のＨＣＧＰＦ活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 (72)発明者 鹿島 信一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 審査官 高堀 栄二

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１、配列表の配列番号
   ２又は配列表の配列番号３のいずれかに記載のアミノ酸
   配列を有するヒト造血系細胞増殖増強因子。