JPS62118895A - 蛋白質の高生産株の取得方法 - Google Patents
蛋白質の高生産株の取得方法Info
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- JPS62118895A JPS62118895A JP60260450A JP26045085A JPS62118895A JP S62118895 A JPS62118895 A JP S62118895A JP 60260450 A JP60260450 A JP 60260450A JP 26045085 A JP26045085 A JP 26045085A JP S62118895 A JPS62118895 A JP S62118895A
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- Japan
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- gene sequence
- dna
- gene
- encoding
- dihydrofolate reductase
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、高等真核細胞での特定の蛋白質を高産生する
株の取得方法に関する。さらに詳しくは、所望の蛋白質
をコードする遺伝子配列Ｉ、野生型細胞由来のジヒドロ
ホレートレダクターゼ（以下、ＤＨＦＲと記載）をコー
ドする遺伝子配列■及び形質転換株を選別するに必要な
蛋白質をコードする遺伝子配列ＩＩのＤＮＡを、正常に
機能し、かつメソトレキセート感受性のＤＨＦＲをコー
ドする遺伝子配列を有する高等真核細胞にトランスフェ
クションし、形質転換株を競合阻害剤存在下で培養して
、遺伝子配列ＩＩの増幅とともに遺伝子配列■を増幅さ
せることを特徴とする特定の蛋白質の高産生株の取得方
法に関するものである。
株の取得方法に関する。さらに詳しくは、所望の蛋白質
をコードする遺伝子配列Ｉ、野生型細胞由来のジヒドロ
ホレートレダクターゼ（以下、ＤＨＦＲと記載）をコー
ドする遺伝子配列■及び形質転換株を選別するに必要な
蛋白質をコードする遺伝子配列ＩＩのＤＮＡを、正常に
機能し、かつメソトレキセート感受性のＤＨＦＲをコー
ドする遺伝子配列を有する高等真核細胞にトランスフェ
クションし、形質転換株を競合阻害剤存在下で培養して
、遺伝子配列ＩＩの増幅とともに遺伝子配列■を増幅さ
せることを特徴とする特定の蛋白質の高産生株の取得方
法に関するものである。
（従来の技術）
近年、生物工学の分野では異種蛋白質、すなわち宿主細
胞では通常生産されない蛋白質を遺伝子組換え技術によ
って製造することが大きな注目を集めている。このうち
異種蛋白質をコードする遺伝子配列を大腸菌や枯草菌等
の細菌あるいは酵母に組み込んで、これを発現せしめる
方法は今日まで数多く試みられてきており、その基本的
技術はほぼ確立してきた。
胞では通常生産されない蛋白質を遺伝子組換え技術によ
って製造することが大きな注目を集めている。このうち
異種蛋白質をコードする遺伝子配列を大腸菌や枯草菌等
の細菌あるいは酵母に組み込んで、これを発現せしめる
方法は今日まで数多く試みられてきており、その基本的
技術はほぼ確立してきた。
しかし、高等真核細胞、持に哺乳動物を宿主とした異種
蛋白質の生産は、その生産される蛋白質が細菌を宿主と
して生産される蛋白質と異なり、グリコシレージョンや
各種の修飾等、生体中に存在する天然の型として生産さ
れるなど多くの利点を有していることから最近特に注目
されてきているにもかかわらず、その実用化に際しては
まだ多くの未解決点を有している。例えば、細菌や酵母
に比べ、生産される異種蛋白質の含量がまだ少ないとい
う点や工業的に利用可能となる宿主哺乳動物細胞がまだ
限られている点も、この例としてあげられよう。現在、
哺乳動物細胞を宿主として、工業レベルで異種蛋白質を
多量生産しようとの試みは色々な方法で行われているが
、主たる方法としては２種の宿主・ベクター系を用いる
方法が比較的多く試みられている。
蛋白質の生産は、その生産される蛋白質が細菌を宿主と
して生産される蛋白質と異なり、グリコシレージョンや
各種の修飾等、生体中に存在する天然の型として生産さ
れるなど多くの利点を有していることから最近特に注目
されてきているにもかかわらず、その実用化に際しては
まだ多くの未解決点を有している。例えば、細菌や酵母
に比べ、生産される異種蛋白質の含量がまだ少ないとい
う点や工業的に利用可能となる宿主哺乳動物細胞がまだ
限られている点も、この例としてあげられよう。現在、
哺乳動物細胞を宿主として、工業レベルで異種蛋白質を
多量生産しようとの試みは色々な方法で行われているが
、主たる方法としては２種の宿主・ベクター系を用いる
方法が比較的多く試みられている。
その１種は、牛パピロマウイルス遺伝子を含むＤＮＡを
ベクターとし、マウス乳癌細胞を宿主とした方法である
〔例えば、Ｇ、 Ｎ、 Ｐａｖｌａｋｉｓら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス
Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 Ｕ ＳＡ ）、 ８０巻３９７頁１９８３年
、Ｔ、 Ｖ、 Ｋａｍａｂｈａｄｖａｎら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ１８１巻６７０１頁１９８４年、几、 Ｆｕ
ｋｕｎａｇａら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、８１巻５０８
６頁１９８４年〕。この方法は、ベクターＤＮＡの宿主
細胞内コピー数が２０〜１００コピーと多く、目的とす
る遺伝子産物を比較的多く生産できる利点を有するが、
形質転換株取得後の生産量の向丘を引き続き図ることが
難しいこと、又使用できる宿主が極めて限られているこ
と、等の欠点があった。
ベクターとし、マウス乳癌細胞を宿主とした方法である
〔例えば、Ｇ、 Ｎ、 Ｐａｖｌａｋｉｓら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス
Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 Ｕ ＳＡ ）、 ８０巻３９７頁１９８３年
、Ｔ、 Ｖ、 Ｋａｍａｂｈａｄｖａｎら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ１８１巻６７０１頁１９８４年、几、 Ｆｕ
ｋｕｎａｇａら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、８１巻５０８
６頁１９８４年〕。この方法は、ベクターＤＮＡの宿主
細胞内コピー数が２０〜１００コピーと多く、目的とす
る遺伝子産物を比較的多く生産できる利点を有するが、
形質転換株取得後の生産量の向丘を引き続き図ることが
難しいこと、又使用できる宿主が極めて限られているこ
と、等の欠点があった。
又、他のもう１皿の方法としては、チャイニーズ・ハム
スター卵巣細胞ｄｈｆｒ欠損株（以下、ＯＨＯ（ｄｈｆ
ｒ ）株と記載） （Ｕｒｌａｂ 、 Ｇ、と０ｈａ
ｓｉｎＬ、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、７７巻４２１６頁１
９８０年）を宿主とし、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含む
ベクター（Ｇ！ｈａｎｇ 、 Ａ、 Ｏ，Ｙ、ら、ネイ
チャー （Ｎａｔｕｒｅ ） ２７５巻６１７頁１９７
８年、Ｋａｕｆｍａｎ ラ、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ） ２巻１３０４頁１９８２年〕を用
いた方法であり、導入さ 。
スター卵巣細胞ｄｈｆｒ欠損株（以下、ＯＨＯ（ｄｈｆ
ｒ ）株と記載） （Ｕｒｌａｂ 、 Ｇ、と０ｈａ
ｓｉｎＬ、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、７７巻４２１６頁１
９８０年）を宿主とし、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含む
ベクター（Ｇ！ｈａｎｇ 、 Ａ、 Ｏ，Ｙ、ら、ネイ
チャー （Ｎａｔｕｒｅ ） ２７５巻６１７頁１９７
８年、Ｋａｕｆｍａｎ ラ、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ） ２巻１３０４頁１９８２年〕を用
いた方法であり、導入さ 。
れたＤＨＦＲｃＤＮＡの発現により形質転換株を容易に
選別できると共に、メソトレキセート（以下、ＭＴＸと
記載）を含有する培地中で形質転換 ・株を増殖さ
せるこ上により、細胞中のＤＨＰＲｃＤＮＡを多コピー
数増幅させ（Ｇ、 Ｒｉｎｇｏｌｄら、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・アンド・アプライド・シエネテイツ
クス（Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、 ）１巻
１６５頁１９８１年〕、それｌこ伴い隣接する目的蛋白
質をコードする遺伝子をも増幅させるこ上により、目的
蛋白質の生産性を向上せしめる方法である〔例えば、Ｊ
、 Ｈａｙｎｃｓと０． Ｗｅｉｓｓｍａｎ 、ヌクレ
イツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓＲｅｓ、）１１巻６８７頁１９８８年、Ｓ、 Ｊ、
５ｃａｈｉｌｌら、プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、８０巻４６
５４頁１９８３年、ゲデルら、特開昭５９−４４８２１
、ｙ、０ｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら、ディーエヌエ−（
ＤＮＡ ）３巻２９７頁１９８４年〕。この方法は、Ｍ
Ｔ’Ｘ耐性濃度を順次増加させるこ上により、目的とす
る蛋白質の生産量を増加できる利点を有するが、使用で
きる動物細胞宿主が現在のところＯＨＯ（ｄｈｆｒ−）
株に限られており、ＯＨＯ（ｄｈｆｒ−）株の親株であ
るＯＨＯ・Ｋ１細胞や池の哺乳動物細胞では利用できな
い欠点がある。この欠点は、野生型細胞では核の染色体
中、自身の正常ＤＨＰＲをコードする遺伝子を有してお
り、又さらに、この正常なりＪ（ＰＲをコードする遺伝
子から産生されるＤＨＦＲ蛋白質は、マウスＤＨＦＲｃ
ＤＮＡにより生産されるマウスＤＨＦＲ蛋白質に比べ、
Ｍ’ｌ’Ｘに対する親和力が低い為に、マウスＤＨＦＲ
ｃＤＮＡを含むベクターをトランスフェクションした場
合には、形質転換株がＭＴＸによって選別できないこと
、さらに高濃度ＭＴＸに対する耐性が染色体ｄｈｆｒ遺
伝子の増幅により獲得されやすいからと考えられている
。
選別できると共に、メソトレキセート（以下、ＭＴＸと
記載）を含有する培地中で形質転換 ・株を増殖さ
せるこ上により、細胞中のＤＨＰＲｃＤＮＡを多コピー
数増幅させ（Ｇ、 Ｒｉｎｇｏｌｄら、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・アンド・アプライド・シエネテイツ
クス（Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、 ）１巻
１６５頁１９８１年〕、それｌこ伴い隣接する目的蛋白
質をコードする遺伝子をも増幅させるこ上により、目的
蛋白質の生産性を向上せしめる方法である〔例えば、Ｊ
、 Ｈａｙｎｃｓと０． Ｗｅｉｓｓｍａｎ 、ヌクレ
イツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓＲｅｓ、）１１巻６８７頁１９８８年、Ｓ、 Ｊ、
５ｃａｈｉｌｌら、プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、８０巻４６
５４頁１９８３年、ゲデルら、特開昭５９−４４８２１
、ｙ、０ｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら、ディーエヌエ−（
ＤＮＡ ）３巻２９７頁１９８４年〕。この方法は、Ｍ
Ｔ’Ｘ耐性濃度を順次増加させるこ上により、目的とす
る蛋白質の生産量を増加できる利点を有するが、使用で
きる動物細胞宿主が現在のところＯＨＯ（ｄｈｆｒ−）
株に限られており、ＯＨＯ（ｄｈｆｒ−）株の親株であ
るＯＨＯ・Ｋ１細胞や池の哺乳動物細胞では利用できな
い欠点がある。この欠点は、野生型細胞では核の染色体
中、自身の正常ＤＨＰＲをコードする遺伝子を有してお
り、又さらに、この正常なりＪ（ＰＲをコードする遺伝
子から産生されるＤＨＦＲ蛋白質は、マウスＤＨＦＲｃ
ＤＮＡにより生産されるマウスＤＨＦＲ蛋白質に比べ、
Ｍ’ｌ’Ｘに対する親和力が低い為に、マウスＤＨＦＲ
ｃＤＮＡを含むベクターをトランスフェクションした場
合には、形質転換株がＭＴＸによって選別できないこと
、さらに高濃度ＭＴＸに対する耐性が染色体ｄｈｆｒ遺
伝子の増幅により獲得されやすいからと考えられている
。
近年、これらの欠点の解決策として宿主のもつＤＨＦＲ
蛋白質よりＭＴＸに対する親和力の低いＤＨＦＲ蛋白質
をコードするｄｈｆｒ遺伝子の取得が試みられ、ＣＨＯ
の突然変異株Ａ２９から変異ｄｈｆｒ遺伝子を得る試み
（Ｍ、 Ｗｉｇｌｅｒら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ Ｓ Ａ
７７巻３５６７頁１９８０年、Ｊ、 Ｋ、 Ｃｈｒｉｓ
ｔｍ晶ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
ソミー・オブ・サイエンスＵＳＡ７９巻１８１５頁１９
８２年）や、マウス繊維芽細胞の突然変異株から同様な
遺伝子を得る試み（レヴインスンら、特開昭５９−１９
２０８９）がなされているが、これらの方法は形質転換
株の選別に高濃度のＭＴＸを必要とし、かつ遺伝子増幅
操作でこの濃度がさらに上昇するため宿主細胞の増殖へ
の影響が推測され、まだ実用に供し得るほどに充分であ
るとはいえない。
蛋白質よりＭＴＸに対する親和力の低いＤＨＦＲ蛋白質
をコードするｄｈｆｒ遺伝子の取得が試みられ、ＣＨＯ
の突然変異株Ａ２９から変異ｄｈｆｒ遺伝子を得る試み
（Ｍ、 Ｗｉｇｌｅｒら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ Ｓ Ａ
７７巻３５６７頁１９８０年、Ｊ、 Ｋ、 Ｃｈｒｉｓ
ｔｍ晶ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
ソミー・オブ・サイエンスＵＳＡ７９巻１８１５頁１９
８２年）や、マウス繊維芽細胞の突然変異株から同様な
遺伝子を得る試み（レヴインスンら、特開昭５９−１９
２０８９）がなされているが、これらの方法は形質転換
株の選別に高濃度のＭＴＸを必要とし、かつ遺伝子増幅
操作でこの濃度がさらに上昇するため宿主細胞の増殖へ
の影響が推測され、まだ実用に供し得るほどに充分であ
るとはいえない。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、誰でもが入手可能な遺伝子材料を用い、
またＭ’ｌ’Ｘに感受性を示す細胞ならば、いかなる高
等真核細胞でも形質転換でき、かつその後の遺伝子の増
幅操作により目的とする蛋白質を容易に高生産できる高
等真核細胞での育種方法を開発すべく鋭意研究を行った
結果、目的とする蛋白質をコードする遺伝子配列と共に
、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡ及び形質転換細胞を選別する
に必要な蛋白質をコードする遺伝子配列を同一ベク、
ター上にもつか、あるいは異なったベクター上に持つＤ
ＮＡを宿主高等真核細胞にトランスフェクションし、Ｍ
ＴＸによらないで形質転換株を選別すれば該形質転換株
が正常なｄｈｆｒ遺伝子を染色体ＤＮＡ中にもっていて
も、ＭＴＸ含有培地中で該形質転換株を増殖せしめるこ
上により、目的蛋白質を大量かつ安定に生産しうる生産
株が取得できることを見い出し、本発明を完成させるに
至った。
またＭ’ｌ’Ｘに感受性を示す細胞ならば、いかなる高
等真核細胞でも形質転換でき、かつその後の遺伝子の増
幅操作により目的とする蛋白質を容易に高生産できる高
等真核細胞での育種方法を開発すべく鋭意研究を行った
結果、目的とする蛋白質をコードする遺伝子配列と共に
、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡ及び形質転換細胞を選別する
に必要な蛋白質をコードする遺伝子配列を同一ベク、
ター上にもつか、あるいは異なったベクター上に持つＤ
ＮＡを宿主高等真核細胞にトランスフェクションし、Ｍ
ＴＸによらないで形質転換株を選別すれば該形質転換株
が正常なｄｈｆｒ遺伝子を染色体ＤＮＡ中にもっていて
も、ＭＴＸ含有培地中で該形質転換株を増殖せしめるこ
上により、目的蛋白質を大量かつ安定に生産しうる生産
株が取得できることを見い出し、本発明を完成させるに
至った。
（問題点を解決するための手段及び作用効果）宿主染色
体中ＤＨＰＲをコードする遺伝子及びそれに近傍して存
在する所望蛋白質をコードする遺伝子の増幅がＭ’Ｉ’
Ｘ含有培地中で増殖させるこ上により得られるメカニズ
ムに関しては、いくつかの論文（例えば、Ｊ、 Ｌ、
Ｂｉｅｄｌｅｒら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ、 ） ８２巻１５３頁１９７２年、Ａｌｔ
、 Ｆ、 Ｗ、ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ、 ）２
５３巻１３５７頁１９７８年、Ｊ、 Ｃｔｈｒｉｓｔｍ
ａｎら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵ Ｓ Ａ ７９巻１８１５頁
１９８２年、Ｒｉｎｇｏｌｄ、 Ｇ、ら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネテイ
クス１巻１６５頁１９８１年）によって示されているの
で、上記論文引用により本明細書中に包含されるものと
する。
体中ＤＨＰＲをコードする遺伝子及びそれに近傍して存
在する所望蛋白質をコードする遺伝子の増幅がＭ’Ｉ’
Ｘ含有培地中で増殖させるこ上により得られるメカニズ
ムに関しては、いくつかの論文（例えば、Ｊ、 Ｌ、
Ｂｉｅｄｌｅｒら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ、 ） ８２巻１５３頁１９７２年、Ａｌｔ
、 Ｆ、 Ｗ、ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ、 ）２
５３巻１３５７頁１９７８年、Ｊ、 Ｃｔｈｒｉｓｔｍ
ａｎら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンスＵ Ｓ Ａ ７９巻１８１５頁
１９８２年、Ｒｉｎｇｏｌｄ、 Ｇ、ら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネテイ
クス１巻１６５頁１９８１年）によって示されているの
で、上記論文引用により本明細書中に包含されるものと
する。
使用するＤＨＦＲ競合阻害剤は通常ＭＴＸを用い、その
濃度は１０〜５００，０００ ｎＭの範囲で培地中に含
有されるが、ＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅に有効な濃度なら
ば、この限りでなく、上限値及び下限値を限定するもの
ではないと共に、ホモ葉酸のような他の葉酸誘導体や他
の化合物を使用することも可能である。正常なｄｈｆｒ
遺伝子を有する宿主高等真核細胞の例として０ＨＯ−に
１及びＭＯＰＣを具体例に記載するが工業的に有用な可
能性をもつ細胞としＣＢＨＫ、ＶＥＲＯ，ＣＯ８，ＯＥ
Ｍ。
濃度は１０〜５００，０００ ｎＭの範囲で培地中に含
有されるが、ＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅に有効な濃度なら
ば、この限りでなく、上限値及び下限値を限定するもの
ではないと共に、ホモ葉酸のような他の葉酸誘導体や他
の化合物を使用することも可能である。正常なｄｈｆｒ
遺伝子を有する宿主高等真核細胞の例として０ＨＯ−に
１及びＭＯＰＣを具体例に記載するが工業的に有用な可
能性をもつ細胞としＣＢＨＫ、ＶＥＲＯ，ＣＯ８，ＯＥ
Ｍ。
ＮａｍａｌＶ＆ 、その他多数の細胞があり、本発明は
、これら例示細胞に限定されるわけではない。また同様
に、所望の蛋白質例として、インターフェロン−γを実
施例で記載するが、これは勿論代表例であって、例えば
エリスロボイエチン、ティッシュプラスミノーゲンアク
ティベーター、インタロイキン−２、インターフェロン
−β、その他であっても何らさしつかえないことは容易
に理解されよう。さらに又、形質転換株を選別するに必
要な蛋白質をコードする遺伝子として、大腸菌由来のＥ
ＣＯｇｐｔをコードする遺伝子（Ｒ，Ｇ！、 Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎとＰ、 Ｂｅｒｇ 、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、
７８巻２０７２頁１９８１年）を例示するが、細菌のト
ランスボゾンＴｎ５由来のＮｅｏｒ遺伝子（５ｏｕｔｈ
ｅｒｎＰ、Ｊ、、Ｂｅｒｇ Ｐ、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス、１
巻８２７Ｎ１９８２年）、チミジンキナーゼ欠損宿主に
対するヘルペスウィルス由来のｔｋ遺伝子（Ｗｌｇｌｅ
ｒＭ、ら、セル（Ｃｅｌｌ）、 １１巻２２３頁１９７
７年）その他、形質転換株を選別可能ならば、どんな遺
伝子であっても使用可能である。同様に野生型細胞由来
のＤＨＦＲをコードする遺伝子配列例としてマウスＤＨ
ＦＲｃＤＮＡを例示するが、他の動物細胞由来の遺伝子
でも、また染色体由来の遺伝子であっても何らさしつか
えないことは言うまでもないことである。
、これら例示細胞に限定されるわけではない。また同様
に、所望の蛋白質例として、インターフェロン−γを実
施例で記載するが、これは勿論代表例であって、例えば
エリスロボイエチン、ティッシュプラスミノーゲンアク
ティベーター、インタロイキン−２、インターフェロン
−β、その他であっても何らさしつかえないことは容易
に理解されよう。さらに又、形質転換株を選別するに必
要な蛋白質をコードする遺伝子として、大腸菌由来のＥ
ＣＯｇｐｔをコードする遺伝子（Ｒ，Ｇ！、 Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎとＰ、 Ｂｅｒｇ 、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、
７８巻２０７２頁１９８１年）を例示するが、細菌のト
ランスボゾンＴｎ５由来のＮｅｏｒ遺伝子（５ｏｕｔｈ
ｅｒｎＰ、Ｊ、、Ｂｅｒｇ Ｐ、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス、１
巻８２７Ｎ１９８２年）、チミジンキナーゼ欠損宿主に
対するヘルペスウィルス由来のｔｋ遺伝子（Ｗｌｇｌｅ
ｒＭ、ら、セル（Ｃｅｌｌ）、 １１巻２２３頁１９７
７年）その他、形質転換株を選別可能ならば、どんな遺
伝子であっても使用可能である。同様に野生型細胞由来
のＤＨＦＲをコードする遺伝子配列例としてマウスＤＨ
ＦＲｃＤＮＡを例示するが、他の動物細胞由来の遺伝子
でも、また染色体由来の遺伝子であっても何らさしつか
えないことは言うまでもないことである。
尚、本発明において材料として用いたプラスミドおよび
細胞は記載した入手先から入手することが可能である。
細胞は記載した入手先から入手することが可能である。
（実施例）
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実ｍ例１ インターフェロン−γ、ＤＨＦＲ及びＥＣ
Ｏｇｐｔをコードする遺伝子配列を同一ベクター上にも
つプラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２の構築ｐＳＶｅｄ
ｈｆｒ−γ２の構築のためインターフェロン−γ遺伝子
とＥＣＯｇｐｔ遺伝子をもつプラスミドベクターとして
本発明者らによって作製されたプラスミドｐＳＶｅｓｍ
ａｌｒ （特願昭５９−１１９６４８）を、またマウ
スＤＨＦＲｃＤＮＡをもつプラスミドベクターとしてプ
ラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ （ＡＴＯＣ８７１４６）を
用いた。
Ｏｇｐｔをコードする遺伝子配列を同一ベクター上にも
つプラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２の構築ｐＳＶｅｄ
ｈｆｒ−γ２の構築のためインターフェロン−γ遺伝子
とＥＣＯｇｐｔ遺伝子をもつプラスミドベクターとして
本発明者らによって作製されたプラスミドｐＳＶｅｓｍ
ａｌｒ （特願昭５９−１１９６４８）を、またマウ
スＤＨＦＲｃＤＮＡをもつプラスミドベクターとしてプ
ラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ （ＡＴＯＣ８７１４６）を
用いた。
ｐＳＶ２ｄｈｆｒ ＤＮＡ １０１１（／を１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨｏＩ （’ＰＨ７，５）、７ ｍＭ
Ｍｇ０１２．６０ ｍＭＭａｉｌ及び７ｍＭ２−メル
カプトエタノールを含む１００μ４の溶液に溶かし、制
限酵素Ｐｖｕｌｌ １０単位を用いて３７°Ｃ６０分間
反応させた後、６５°Ｃ１０分間加熱してＰｖｕ ｌを
失活させた。２．５倍量のエタノールによる沈澱処理後
、２０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ （ｐＨ７，５）、６
ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭジチオスレイトール及び５００
μＭ ＡＴＰ を含む全量２５μｌの溶液に溶かし、こ
の溶液に５′末端がリン酸化されたＢａｍＨｌ リン
カ−を１μｇ加えた。この場°合、液にさらにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１０単位を加え、４°Ｃで１７時間結合反応
を行った。反応終了後、エタノール沈澱処理によりＤＮ
Ａを回収し、次いで２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨｏＩ
（ｐＨ７，５）、１０ ｍＭ Ｍｇ０１２．１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び５０ ｍＭ Ｍａｉｌを含む
全＠２’０ｔｔ（ｌの溶液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨ
１を５単位加え、３７°Ｃで６０分間消化反応を行った
。反応液を６５°Ｃ１１０分間加熱して酵素を失活させ
た後、アガロース電気泳動法にて精製し、ｄｈｆｒ遺伝
子を含む約１．９ＫｂのＤＮＡ断片を約１，５μｇ得た
。
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨｏＩ （’ＰＨ７，５）、７ ｍＭ
Ｍｇ０１２．６０ ｍＭＭａｉｌ及び７ｍＭ２−メル
カプトエタノールを含む１００μ４の溶液に溶かし、制
限酵素Ｐｖｕｌｌ １０単位を用いて３７°Ｃ６０分間
反応させた後、６５°Ｃ１０分間加熱してＰｖｕ ｌを
失活させた。２．５倍量のエタノールによる沈澱処理後
、２０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ （ｐＨ７，５）、６
ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭジチオスレイトール及び５００
μＭ ＡＴＰ を含む全量２５μｌの溶液に溶かし、こ
の溶液に５′末端がリン酸化されたＢａｍＨｌ リン
カ−を１μｇ加えた。この場°合、液にさらにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１０単位を加え、４°Ｃで１７時間結合反応
を行った。反応終了後、エタノール沈澱処理によりＤＮ
Ａを回収し、次いで２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨｏＩ
（ｐＨ７，５）、１０ ｍＭ Ｍｇ０１２．１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び５０ ｍＭ Ｍａｉｌを含む
全＠２’０ｔｔ（ｌの溶液に溶かし、制限酵素ＢａｍＨ
１を５単位加え、３７°Ｃで６０分間消化反応を行った
。反応液を６５°Ｃ１１０分間加熱して酵素を失活させ
た後、アガロース電気泳動法にて精製し、ｄｈｆｒ遺伝
子を含む約１．９ＫｂのＤＮＡ断片を約１，５μｇ得た
。
又、一方、ｐＳＶｅｓｍａＩｒ ２ ｔｔｆを前記Ｅａ
ｍＨ１反応液２０μｅに溶かし、消化反応後、アルカリ
ホスファターゼ処理（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ＋ Ｌ−１Ｓ
ｇａｒａｍｅｌｌａ、 Ｖ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｃｌｓ Ｒｅｓ、 、 ９巻８５頁１９８１年）をし
、５′末端のリン酸を除いた後、フェノール処理及びエ
タノール沈澱処理をヮして’Ｉ’４ＤＮＡリガーセ反応
液に溶かし、前記１．９ＫｂＤＮＡ断片を全型混合溶解
後、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼ５単位を加え、４°Ｃで１
７時間結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて常法通り、大腸菌ＨＢ １０１株（Ａ
ＴＣＣ！３３６９４）を形質転換し、Ａｍｐｒのコロニ
ーを得た。このコロニーの培養液からプラスミドを分離
、第１図に示したｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２を得た。
ｍＨ１反応液２０μｅに溶かし、消化反応後、アルカリ
ホスファターゼ処理（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ＋ Ｌ−１Ｓ
ｇａｒａｍｅｌｌａ、 Ｖ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｃｌｓ Ｒｅｓ、 、 ９巻８５頁１９８１年）をし
、５′末端のリン酸を除いた後、フェノール処理及びエ
タノール沈澱処理をヮして’Ｉ’４ＤＮＡリガーセ反応
液に溶かし、前記１．９ＫｂＤＮＡ断片を全型混合溶解
後、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼ５単位を加え、４°Ｃで１
７時間結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて常法通り、大腸菌ＨＢ １０１株（Ａ
ＴＣＣ！３３６９４）を形質転換し、Ａｍｐｒのコロニ
ーを得た。このコロニーの培養液からプラスミドを分離
、第１図に示したｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２を得た。
実施例２ インターフェロン−γとＤＨＦＲをコードす
る遺伝子配列を同一ベクター上にもつプラスミドｐＳＶ
ｅｄｈｆｒ−１１の構築 ｐＳＶ２ｄｈｆｒ Ｄ Ｎ Ａ ５ ｔｔｆを１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ ｍＭ Ｍｇ
Ｏ１２，１００ｍＭ ＫＣＩ、７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール及び０．０１％ＢＳＡを含む全量５０ｔｔ（ｌ
の溶液に溶かし、制限酵素ＰｖｕｌとＨｐａｌを各々５
単位ずつ加え、３７°Ｃで６０分間消化反応を行った後
、６５°Ｃで１０分間加熱してＰｖｕ ｌとＨｐａｌを
失活させた。この消化反応液をアガロース電気泳動法に
て精製し、ｄｈｆｒ遺伝子を含む約３．６ＫｂのＤＮＡ
断片約８．２ｔｔｆ＆得た。又、ｐＳＶｅｓｍａｌγＤ
Ｎ Ａ ５ ｔｔｆもｐＳＶ２ｄｈｆｒと同様Ｐｖｕ
ｌとＨｐａｌによる消化反応後、アガロース電気泳動
法にて精製し、インターフェロン−γ遺伝子を含む約７
．５ＫｂのＤＮＡ断片を約２．８μｇ得た。両断片を２
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５＞、６ ｍ
Ｍ Ｍｇ０１２．５ｍＭジチオスレイトール及び５００
ｔｔＭ ＡＴＰを含む５０μｌの溶液に溶かし、この
混合溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え、４°Ｃ
で１７時間結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌ＨＢ １０１
株を形質転換し、第２図に示したｐＳＶｅｃｉｈｆｒ−
γ１を得た。
る遺伝子配列を同一ベクター上にもつプラスミドｐＳＶ
ｅｄｈｆｒ−１１の構築 ｐＳＶ２ｄｈｆｒ Ｄ Ｎ Ａ ５ ｔｔｆを１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ ｍＭ Ｍｇ
Ｏ１２，１００ｍＭ ＫＣＩ、７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール及び０．０１％ＢＳＡを含む全量５０ｔｔ（ｌ
の溶液に溶かし、制限酵素ＰｖｕｌとＨｐａｌを各々５
単位ずつ加え、３７°Ｃで６０分間消化反応を行った後
、６５°Ｃで１０分間加熱してＰｖｕ ｌとＨｐａｌを
失活させた。この消化反応液をアガロース電気泳動法に
て精製し、ｄｈｆｒ遺伝子を含む約３．６ＫｂのＤＮＡ
断片約８．２ｔｔｆ＆得た。又、ｐＳＶｅｓｍａｌγＤ
Ｎ Ａ ５ ｔｔｆもｐＳＶ２ｄｈｆｒと同様Ｐｖｕ
ｌとＨｐａｌによる消化反応後、アガロース電気泳動
法にて精製し、インターフェロン−γ遺伝子を含む約７
．５ＫｂのＤＮＡ断片を約２．８μｇ得た。両断片を２
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５＞、６ ｍ
Ｍ Ｍｇ０１２．５ｍＭジチオスレイトール及び５００
ｔｔＭ ＡＴＰを含む５０μｌの溶液に溶かし、この
混合溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼ１０単位を加え、４°Ｃ
で１７時間結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌ＨＢ １０１
株を形質転換し、第２図に示したｐＳＶｅｃｉｈｆｒ−
γ１を得た。
実施例３ プラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２を用いた
ＣＨＯ形質転換株の取得 実施例１で得たｐＳＶｅｄｈｆｒ−ｒ２ ＤＮＡ ２０
ｔｔｆ／を径６（１７）ディツシュ（コーニング社％
Ｎｃｔ ２５０１０）に２Ｘ１０５の細胞数生育させた
ＣＨＯ・ＫＬ （大日本製薬より購入）に対して、カル
シウム・ホスフェート法（Ｗｉｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら、
セル、１４巻７２５頁１９７８年）を用いてトランスフ
ェクションシタ。
ＣＨＯ形質転換株の取得 実施例１で得たｐＳＶｅｄｈｆｒ−ｒ２ ＤＮＡ ２０
ｔｔｆ／を径６（１７）ディツシュ（コーニング社％
Ｎｃｔ ２５０１０）に２Ｘ１０５の細胞数生育させた
ＣＨＯ・ＫＬ （大日本製薬より購入）に対して、カル
シウム・ホスフェート法（Ｗｉｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら、
セル、１４巻７２５頁１９７８年）を用いてトランスフ
ェクションシタ。
３７°Ｃ１４８時間培養後、培地を透析牛胎児血清（Ｇ
ＩＢＣＯ製）５％を含む核酸不合アルファーＭＥＭ （
ＧＩＢＣＯ製）に、■５０ないし１００ ｎＭのＭＴＸ
（選択条件、ＭＴＸと表１で記Ｊ載）、■７５μＭの
ミコフェノール酸、２５０μｇ／Ｍｔのキサンチン、０
，１μＩ／ｙｔｔｌのアミノプテリン、５μｆ／ｍｌの
チミジン及び２５ ｐｆｌ／ｘｉのアデニン（選択条件
、ＭＰＡと表１及び２で記載）、■７５μＭのミコフェ
ノール酸、２ Ｑ ｎＭのＭ’ｌ’Ｘ及び２５０／’９
／ｍｌのキサンチン（選択条件、ＭＰＡ、ＭＴＸと表１
及び２で記載）の各々を含む形質転換株選択培地で２週
間コロニーを形成させた。次いで各コロニーは９６穴マ
ルチプレート（コーニング社製、４２５８６０）に移し
、フルシートに生育後、培地を５％透析牛脂児血清を含
む核酸不合アルファ＝ＭＥＭに変換し、さらに３７℃で
２４時間培養し、培養液中のインターフェロン−γ活性
を調べｔこ 。 、 インターフェロン−γ活性の検定は、Ｆ Ｌ細胞に対す
るシンドビスウイルスの細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔ
ｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ）の阻害によって調べ（特願昭
５９−１１９６４８号参照）、標準インターフェロン−
γとして国際標準サンプル（Ｇｇ２８−９０１−５３Ｑ
）を用いて行った。
ＩＢＣＯ製）５％を含む核酸不合アルファーＭＥＭ （
ＧＩＢＣＯ製）に、■５０ないし１００ ｎＭのＭＴＸ
（選択条件、ＭＴＸと表１で記Ｊ載）、■７５μＭの
ミコフェノール酸、２５０μｇ／Ｍｔのキサンチン、０
，１μＩ／ｙｔｔｌのアミノプテリン、５μｆ／ｍｌの
チミジン及び２５ ｐｆｌ／ｘｉのアデニン（選択条件
、ＭＰＡと表１及び２で記載）、■７５μＭのミコフェ
ノール酸、２ Ｑ ｎＭのＭ’ｌ’Ｘ及び２５０／’９
／ｍｌのキサンチン（選択条件、ＭＰＡ、ＭＴＸと表１
及び２で記載）の各々を含む形質転換株選択培地で２週
間コロニーを形成させた。次いで各コロニーは９６穴マ
ルチプレート（コーニング社製、４２５８６０）に移し
、フルシートに生育後、培地を５％透析牛脂児血清を含
む核酸不合アルファ＝ＭＥＭに変換し、さらに３７℃で
２４時間培養し、培養液中のインターフェロン−γ活性
を調べｔこ 。 、 インターフェロン−γ活性の検定は、Ｆ Ｌ細胞に対す
るシンドビスウイルスの細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔ
ｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ）の阻害によって調べ（特願昭
５９−１１９６４８号参照）、標準インターフェロン−
γとして国際標準サンプル（Ｇｇ２８−９０１−５３Ｑ
）を用いて行った。
ＭＴＸ、ＭＰＡはそれぞれメソトレキセートおよびミコ
フェノール酸を表わす。
フェノール酸を表わす。
表２ インターフェロン活性測定結果
「
各々の実験区から２０株を選択し、インターフェロン−
ｒの産生を調べた結果、ＭＴＸ単独の形質転換株選別時
では、インターフェロン産生株が得られなかったのに対
して、ミコフェノール酸選択及びミコフェノール酸とＭ
’ｌ’Ｘで選択した実験区では種々の量のインターフェ
ロン−γを生産する形質転換株が得られた（表１および
表２参照）、。
ｒの産生を調べた結果、ＭＴＸ単独の形質転換株選別時
では、インターフェロン産生株が得られなかったのに対
して、ミコフェノール酸選択及びミコフェノール酸とＭ
’ｌ’Ｘで選択した実験区では種々の量のインターフェ
ロン−γを生産する形質転換株が得られた（表１および
表２参照）、。
実施例４ プラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−ｒ １とｐＳ
Ｖ２ｇｐｔの同時トランスフェクションによるＣＨＯ形
質転換株の取得 実施例２で得たｐＳＶｅｄｈｆｒ −ｒ １とＡ’ｌ’
ＯＯから入手したｐＳＶ２ｇｐｔ （ＡＴＣＣ３７１４
５）を５対１のモル比で全量２０μｆ混合し、実施例３
と同様な方法で同時トランスフェクションを行ない、ミ
コフェノール酸単独又はミコフェノール酸とＭＴＸの共
存の選択培地で形質転換株を選択した。各形質転換株に
ついて２４時間当りのインターフェロン生産量を測定し
た結果、代表的な株の生産量は表３の通りであった。
Ｖ２ｇｐｔの同時トランスフェクションによるＣＨＯ形
質転換株の取得 実施例２で得たｐＳＶｅｄｈｆｒ −ｒ １とＡ’ｌ’
ＯＯから入手したｐＳＶ２ｇｐｔ （ＡＴＣＣ３７１４
５）を５対１のモル比で全量２０μｆ混合し、実施例３
と同様な方法で同時トランスフェクションを行ない、ミ
コフェノール酸単独又はミコフェノール酸とＭＴＸの共
存の選択培地で形質転換株を選択した。各形質転換株に
ついて２４時間当りのインターフェロン生産量を測定し
た結果、代表的な株の生産量は表３の通りであった。
表３ インターフェロン活性測定結果
実施例５ ＣＨＯでの遺伝子増幅及びインターフェロ
ン−γ産生量の増大 実施例３及び４で得られた形質転換株について、５０
ｎＭないし１００ ｎＭのＭＴＸを含む核酸不合アルフ
ァーＭＥＭＩＯ＋４を入れた１０°ａ径デイツシユ（フ
ァルコン社製１ｈ３００：Ｉｔ）に１０個の細胞をプレ
ートし、３ないし４日目ご上に培地を変換、３７°Ｃで
３週間培養しコロニーを形成させた。
ン−γ産生量の増大 実施例３及び４で得られた形質転換株について、５０
ｎＭないし１００ ｎＭのＭＴＸを含む核酸不合アルフ
ァーＭＥＭＩＯ＋４を入れた１０°ａ径デイツシユ（フ
ァルコン社製１ｈ３００：Ｉｔ）に１０個の細胞をプレ
ートし、３ないし４日目ご上に培地を変換、３７°Ｃで
３週間培養しコロニーを形成させた。
形成されたコロニーについて前記のごとくインターフェ
ロン−ｒアッセイをすると多くの株に未増幅の株のイン
ターフェロン−ｒ産生量に対して約１０から２０倍の活
性が検出できた（表４参照）。
ロン−ｒアッセイをすると多くの株に未増幅の株のイン
ターフェロン−ｒ産生量に対して約１０から２０倍の活
性が検出できた（表４参照）。
表４ ＭＴＸによる遺伝子増幅と
また２種の形質転換株選択条件、すなわち、ミコフェノ
ール酸単独による選択とミコフェノール酸とＭＴＸの共
存による選択との間での比較では、後者において遺伝子
増幅量の取得頻度が高く、形質転換株選別時にＭＴＸを
共存させることがより有効であった。これらの株につい
て遺伝子増幅量を調べた。遺伝子増幅量の定量はＫａｆ
ａｔＯ８Ｆ、 Ｃ。
ール酸単独による選択とミコフェノール酸とＭＴＸの共
存による選択との間での比較では、後者において遺伝子
増幅量の取得頻度が高く、形質転換株選別時にＭＴＸを
共存させることがより有効であった。これらの株につい
て遺伝子増幅量を調べた。遺伝子増幅量の定量はＫａｆ
ａｔＯ８Ｆ、 Ｃ。
らによるＤＮＡ−ＤＮＡドツトハイブリダイゼーション
法（Ｋａｆａｔｏｓ Ｆ、Ｏ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、 、 ７巻１５４１頁１９７９年）を
参考にして行つた。又、染色体ＤＮＡの調製は次のよう
にして行った。すなわち、インターフェロン産生細胞を
１５０Ｃ１４フラスコ（コーニング社製患２５１２０）
に増殖させ、０．０２％ＥＤＴＡ−０．２５％トリプシ
ン処理により細胞を回収後、ＰＢＳ液（１０ｍＭＮａ２
ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐ、Ｈ７，２）、１５０
ｍＭＮａＣｌ ）にて２回洗滌、次いでｌＯ細胞当り２
肩ダのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ−０，５％５ａｒｋｏｃｙｌ溶液２０ｍ１を加え
、５０°Ｃで３時間処理後、フェノール処理をし、さら
にＴＥＳ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７
，６）、１ ｍＭＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＮａＣ１）に
おける透析を行った。透析後、エタノール沈澱にて回収
したＤＮＡはＴＥＳ液に溶解後、ｍｌ当り１００ ｐダ
のＲＮ ａＳｅＡでＩｔ Ｎ Ａを分解し、フェノール
処理、透析処理、エタノール沈澱処理を行った後、水に
溶かした状態で染色体ＤＮＡサンプルとした。
法（Ｋａｆａｔｏｓ Ｆ、Ｏ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、 、 ７巻１５４１頁１９７９年）を
参考にして行つた。又、染色体ＤＮＡの調製は次のよう
にして行った。すなわち、インターフェロン産生細胞を
１５０Ｃ１４フラスコ（コーニング社製患２５１２０）
に増殖させ、０．０２％ＥＤＴＡ−０．２５％トリプシ
ン処理により細胞を回収後、ＰＢＳ液（１０ｍＭＮａ２
ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐ、Ｈ７，２）、１５０
ｍＭＮａＣｌ ）にて２回洗滌、次いでｌＯ細胞当り２
肩ダのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ−０，５％５ａｒｋｏｃｙｌ溶液２０ｍ１を加え
、５０°Ｃで３時間処理後、フェノール処理をし、さら
にＴＥＳ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７
，６）、１ ｍＭＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＮａＣ１）に
おける透析を行った。透析後、エタノール沈澱にて回収
したＤＮＡはＴＥＳ液に溶解後、ｍｌ当り１００ ｐダ
のＲＮ ａＳｅＡでＩｔ Ｎ Ａを分解し、フェノール
処理、透析処理、エタノール沈澱処理を行った後、水に
溶かした状態で染色体ＤＮＡサンプルとした。
又、プローブとして用いるインターフェロン遺伝子ＤＮ
Ａは、ｐＳＶｅｓｍａｆｒ のインターフェロン遺伝子
中より第４エキソンを含むＥｃｏ几１− ＢａｍＨ１断
片を制限酵素ＢｃｏＲ１、ＢａｍＨｌを用いてＢａｍＨ
［反応液中で消化し、アガロース電気泳動法にて精製す
るこ上により約５００ ｎｙ得た。得られたＤＮＡ断片
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社より入手したニック・トランス
レーションキット中に入れ、〔α−８２ｐ ）ｄＯＴｐ
液（８００Ｃｉ／ｍ、 ｍｏｌ、 １０ ｍｏｉ／ｇ／
） ５μｌを加えた後、１５°Ｃで３時間反応させる
ことニＪ： ｔ） ２．８ Ｘ １０ ｃｐｍのカウ
ントをもつプローブＤＮＡを作製した。
Ａは、ｐＳＶｅｓｍａｆｒ のインターフェロン遺伝子
中より第４エキソンを含むＥｃｏ几１− ＢａｍＨ１断
片を制限酵素ＢｃｏＲ１、ＢａｍＨｌを用いてＢａｍＨ
［反応液中で消化し、アガロース電気泳動法にて精製す
るこ上により約５００ ｎｙ得た。得られたＤＮＡ断片
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社より入手したニック・トランス
レーションキット中に入れ、〔α−８２ｐ ）ｄＯＴｐ
液（８００Ｃｉ／ｍ、 ｍｏｌ、 １０ ｍｏｉ／ｇ／
） ５μｌを加えた後、１５°Ｃで３時間反応させる
ことニＪ： ｔ） ２．８ Ｘ １０ ｃｐｍのカウ
ントをもつプローブＤＮＡを作製した。
ニトロセルロースフィルター（ミリホアａ［）に染色体
ＤＮＡＩμｆ をスポットし、フィルターを０．５ Ｎ
Ｎａ６Ｈ溶液に５分間、次いでＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，６）液に５分間ずつ３回浸した後、さら
に２ＸＳＳＣ（０，１５Ｍ Ｍａｉｌ、０、０１５
Ｍ Ｎａ −Ｃｉｔｒａｔｅ ）液に１分間浸し、と
り出した後８０°Ｃで１時間の焼きつけ操作をした。
ＤＮＡＩμｆ をスポットし、フィルターを０．５ Ｎ
Ｎａ６Ｈ溶液に５分間、次いでＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，６）液に５分間ずつ３回浸した後、さら
に２ＸＳＳＣ（０，１５Ｍ Ｍａｉｌ、０、０１５
Ｍ Ｎａ −Ｃｉｔｒａｔｅ ）液に１分間浸し、と
り出した後８０°Ｃで１時間の焼きつけ操作をした。
ＤＮＡを焼きつけたフィルターはハイブリダイゼーショ
ン液（２０ＸＳＳＰＥ （１２０ｍＭ Ｎａ１ｌ、１５
ｍＭ Ｎａ−ｃｉ、ｔｒａｔｅ、 １３ｍＭ ＫＨ２
ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ） ２．５ｔｇｔ、 ５０
ＸＤｅｎｈａｒｄｔ 溶液（０，０２％ＢＳＡ−画分
■、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィ
コール）１ｍ／、１０％Ｓ Ｄ Ｓ Ｏ，１ｍｌ及び水
６．４ｙ／）１０ｇ／！に熱変性サーモンＤＮＡ２ｑを
加えた溶液を含むビニル袋中に入れ、空気を完全に除い
た後、シールし、６５°Ｃ４時間のプレハイブリダイゼ
ーションを予め行った。８２Ｐ−ｄＯＴｐでラベルした
プローブＤＮＡを３ｔｔｔｌのハイブリダイゼーション
溶液に混合し、新たなビニル袋に入れた後、プレハイブ
リダイゼーション後のフィルターをビニル袋中で十分浸
み込ませ、空気を完全に除いてシールし、６５°Ｃで１
夜反応させた。反応後、フィルターを取り出し、２ｘｓ
ｓ ｃ、各５００ｙｔｌで２〜３分間５回洗滌した。
ン液（２０ＸＳＳＰＥ （１２０ｍＭ Ｎａ１ｌ、１５
ｍＭ Ｎａ−ｃｉ、ｔｒａｔｅ、 １３ｍＭ ＫＨ２
ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ） ２．５ｔｇｔ、 ５０
ＸＤｅｎｈａｒｄｔ 溶液（０，０２％ＢＳＡ−画分
■、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィ
コール）１ｍ／、１０％Ｓ Ｄ Ｓ Ｏ，１ｍｌ及び水
６．４ｙ／）１０ｇ／！に熱変性サーモンＤＮＡ２ｑを
加えた溶液を含むビニル袋中に入れ、空気を完全に除い
た後、シールし、６５°Ｃ４時間のプレハイブリダイゼ
ーションを予め行った。８２Ｐ−ｄＯＴｐでラベルした
プローブＤＮＡを３ｔｔｔｌのハイブリダイゼーション
溶液に混合し、新たなビニル袋に入れた後、プレハイブ
リダイゼーション後のフィルターをビニル袋中で十分浸
み込ませ、空気を完全に除いてシールし、６５°Ｃで１
夜反応させた。反応後、フィルターを取り出し、２ｘｓ
ｓ ｃ、各５００ｙｔｌで２〜３分間５回洗滌した。
さらに６５°Ｃに保ったｏ、ｔｘｓｓａ１各５００肩ｌ
で３０分間３回洗った。フィルター上の水分をよくペー
パータオルで除いた後、Ｘ線フィルム（富士写真社製）
で４日間露出させた。この様にして得られた増幅株の１
例のネガフィルムのスポットニヨれば、Ｍ’Ｉ’Ｘ処理
によるＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅操作によってインターフ
ェロン遺伝子が２０倍以と増幅されていることが認めら
れた。
で３０分間３回洗った。フィルター上の水分をよくペー
パータオルで除いた後、Ｘ線フィルム（富士写真社製）
で４日間露出させた。この様にして得られた増幅株の１
例のネガフィルムのスポットニヨれば、Ｍ’Ｉ’Ｘ処理
によるＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅操作によってインターフ
ェロン遺伝子が２０倍以と増幅されていることが認めら
れた。
実施例６ ＭＯＰＯ株でのプラスミドｐＳＶｅｄｈｆ
ｒ−γ２ による形質転換と遺伝子増幅操作によるイン
ターフェロン−γの出産量の増加 ｐＳＶ８ｄｈｆｒ−γ２により形質転換した大腸菌ＨＢ
１０１を５ａｎｄｒｉ−Ｇｑｌｄｉｎらの方法（５ａｎ
ｄｒｉ −Ｇｏｌｄｉｎ、 Ｒ，Ｍ、 ラモレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１
１． Ｂｉｏｌ、 ） １巻７４３頁１９８１年）に従
ってプロトプラスト化した。すなわち２５ｍ１のアンピ
シリンを含むＬ培地中で対数前期まで増殖させた菌にク
ロラムフェニコールをｍｌ培地当り１２５μｆになるよ
う添加し、プラスミドを増幅後、遠心にて菌を回収、氷
とで冷やした２０％庶糖−０，０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＯＩ （ｐＨ８，０）液１．２５ｍ１を添加した。菌
を分散後、直前に０．２５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ
（ｐＨ８，０）にｍ／当り５肩ダのリゾチームを溶解し
た溶液を０．２５ ｔｔｔｔ加え、氷上に５分間静置し
、０．２５Ｍ ＥＤＴＡｏ、５ｇ／を追加して、さら
に５分間保った。０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ （ｐＨ
８，０） ０．５ｔｔｔｌを添加後、菌を３７°Ｃのウ
ォーターバス中に移し、１０分間インキュベートした後
に１０％庶糖と１０ ｍＭ Ｍｇ０１２を含む１０ｍ１
のＤＭＥ培地（グルベツコ変法イーグルＭＥＭ、日永社
製）に希釈し、プロトプラスト菌を得た。この液５ｍｌ
にＭＯＰＣ！−８１０細胞（大日本製薬社より購入）を
６Ｘ１０６個混合し、５００×１で５分間遠心した後、
５０％ポリエチレンクライコール４０００ （和光純薬
社製）を含むＤＭＥ培地２ｔｓｔに分散させた。５００
）１で３分間の遠心の後、’ＩｔｘｌのＤＭＥ培地を加
え、再分散、さらに５００Ｘｆ、５分間の遠心の後、上
澄液を除いて、細胞を１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥ
培地中に浮遊させ、２４穴マルチプレート（ファルコン
社製１に３０４７）に移した。４８時間培養後、２５０
μｇ／肩ｔのキサンチン、１５μｆ／ｍｅのヒポキサン
チン、２５μｆ／ｌｌのミコフェノール酸、４０ｎＭの
ＭＴＸ及び１０％の透析牛胎児血清を含むＤＭＥ培地を
等量添加し、３ないし４日目ご上に培地を変換して２週
間培養して形質転換株を得た。
ｒ−γ２ による形質転換と遺伝子増幅操作によるイン
ターフェロン−γの出産量の増加 ｐＳＶ８ｄｈｆｒ−γ２により形質転換した大腸菌ＨＢ
１０１を５ａｎｄｒｉ−Ｇｑｌｄｉｎらの方法（５ａｎ
ｄｒｉ −Ｇｏｌｄｉｎ、 Ｒ，Ｍ、 ラモレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅ１
１． Ｂｉｏｌ、 ） １巻７４３頁１９８１年）に従
ってプロトプラスト化した。すなわち２５ｍ１のアンピ
シリンを含むＬ培地中で対数前期まで増殖させた菌にク
ロラムフェニコールをｍｌ培地当り１２５μｆになるよ
う添加し、プラスミドを増幅後、遠心にて菌を回収、氷
とで冷やした２０％庶糖−０，０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＯＩ （ｐＨ８，０）液１．２５ｍ１を添加した。菌
を分散後、直前に０．２５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ
（ｐＨ８，０）にｍ／当り５肩ダのリゾチームを溶解し
た溶液を０．２５ ｔｔｔｔ加え、氷上に５分間静置し
、０．２５Ｍ ＥＤＴＡｏ、５ｇ／を追加して、さら
に５分間保った。０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ （ｐＨ
８，０） ０．５ｔｔｔｌを添加後、菌を３７°Ｃのウ
ォーターバス中に移し、１０分間インキュベートした後
に１０％庶糖と１０ ｍＭ Ｍｇ０１２を含む１０ｍ１
のＤＭＥ培地（グルベツコ変法イーグルＭＥＭ、日永社
製）に希釈し、プロトプラスト菌を得た。この液５ｍｌ
にＭＯＰＣ！−８１０細胞（大日本製薬社より購入）を
６Ｘ１０６個混合し、５００×１で５分間遠心した後、
５０％ポリエチレンクライコール４０００ （和光純薬
社製）を含むＤＭＥ培地２ｔｓｔに分散させた。５００
）１で３分間の遠心の後、’ＩｔｘｌのＤＭＥ培地を加
え、再分散、さらに５００Ｘｆ、５分間の遠心の後、上
澄液を除いて、細胞を１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥ
培地中に浮遊させ、２４穴マルチプレート（ファルコン
社製１に３０４７）に移した。４８時間培養後、２５０
μｇ／肩ｔのキサンチン、１５μｆ／ｍｅのヒポキサン
チン、２５μｆ／ｌｌのミコフェノール酸、４０ｎＭの
ＭＴＸ及び１０％の透析牛胎児血清を含むＤＭＥ培地を
等量添加し、３ないし４日目ご上に培地を変換して２週
間培養して形質転換株を得た。
形質転換株は、９６穴マルチプレート当り１０４個のマ
ウス腹腔細胞を含む培地中でクローン化を行なった後、
１００ ｎＭないし２００ ｎＭのＭ’［’Ｘ及び１０
％の透析牛胎児血清を含むＤＭＥ培地培地１０匡／０４
個分散させ、２４穴マルチプレートにて３週間培養させ
た。増殖してきた細胞はクローン化後、細胞数がｔｘｔ
当り１０に達した時点で培地を変換し、１日当りのイン
ターフェロン−γ産生量を測定した。１００ｎ１００ｎ
耐性及び２００ｎＭＭＴＸ耐性で多くのクローン株のイ
ンターフェロン産生量が１０倍以上増大しており、その
代表的な例としては、形質転換細胞のインターフェロン
産生量が１２０ ｕ ／ｌｓｌ／日に対して、１００ｎ
１００ｎ耐性で２２００ｕ／ｇｌ、２００ｎＭＭＴＸ耐
性で３１５０ ｕ／ｌｘｌであった。以上の結果からＭ
ＯＰＣ！−３１０株においても形質転換細胞をＥＯＯｇ
ｐｔ遺伝子とミコフェノール酸の組合せで選択後、ＭＴ
ＸによるＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅操作によりインターフ
ェロン産生量が増大することが確かめられた。
ウス腹腔細胞を含む培地中でクローン化を行なった後、
１００ ｎＭないし２００ ｎＭのＭ’［’Ｘ及び１０
％の透析牛胎児血清を含むＤＭＥ培地培地１０匡／０４
個分散させ、２４穴マルチプレートにて３週間培養させ
た。増殖してきた細胞はクローン化後、細胞数がｔｘｔ
当り１０に達した時点で培地を変換し、１日当りのイン
ターフェロン−γ産生量を測定した。１００ｎ１００ｎ
耐性及び２００ｎＭＭＴＸ耐性で多くのクローン株のイ
ンターフェロン産生量が１０倍以上増大しており、その
代表的な例としては、形質転換細胞のインターフェロン
産生量が１２０ ｕ ／ｌｓｌ／日に対して、１００ｎ
１００ｎ耐性で２２００ｕ／ｇｌ、２００ｎＭＭＴＸ耐
性で３１５０ ｕ／ｌｘｌであった。以上の結果からＭ
ＯＰＣ！−３１０株においても形質転換細胞をＥＯＯｇ
ｐｔ遺伝子とミコフェノール酸の組合せで選択後、ＭＴ
ＸによるＤＨＦＲｃＤＮＡの増幅操作によりインターフ
ェロン産生量が増大することが確かめられた。
第１図は、インターフェロン−γ、ＤＨＦＲ及びＥｃｏ
ｇｐｔをコードする遺伝子配列を同一ベクター上にもつ
プラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２の簡単な制限酵素地
図及びｐＳＶｅｓｍａｌｒとｐＳＶ２ｄｈｆｒよりｐＳ
Ｖｅｄｈｆｒ−γ２の構築の方法の概略図、第２図は、
インターフェロン−γとＤＨＦＲをコードする遺伝子配
列を同一ベクター上にもつプラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ
−γ１の簡単な制限酵素地図及びｐＳＶｅｓｍａｌｒと
ｐＳＶ ２ｄｈｆｒよりｐＳＶｅｄｈｆｒ −ｒ １の
構築の方法の概略図である。
ｇｐｔをコードする遺伝子配列を同一ベクター上にもつ
プラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２の簡単な制限酵素地
図及びｐＳＶｅｓｍａｌｒとｐＳＶ２ｄｈｆｒよりｐＳ
Ｖｅｄｈｆｒ−γ２の構築の方法の概略図、第２図は、
インターフェロン−γとＤＨＦＲをコードする遺伝子配
列を同一ベクター上にもつプラスミドｐＳＶｅｄｈｆｒ
−γ１の簡単な制限酵素地図及びｐＳＶｅｓｍａｌｒと
ｐＳＶ ２ｄｈｆｒよりｐＳＶｅｄｈｆｒ −ｒ １の
構築の方法の概略図である。
Claims (24)
- （１）特定の蛋白質をコードする遺伝子配列 I 、野生
型細胞由来のジヒドロホレートレダクターゼをコードす
る遺伝子配列II、及び形質転換株を選別するに必要な蛋
白質をコードする遺伝子配列IIIのＤＮＡを、正常に機
能し、かつメソトレキセート感受性のジヒドロホレート
レダクターゼをコードする遺伝子配列を染色体ＤＮＡ中
に有する宿主高等真核細胞にトランスフエクシヨンし、
形質転換株をジヒドロホレートレダクターゼ活性の競合
阻害剤存在下で培養して、遺伝子配列IIの増幅とともに
遺伝子配列 I を増幅させることを特徴とする特定蛋白
質の高生産株の取得方法。 - （２）遺伝子配列 I 、II、及びIIIが同一ベクター上に
存在するＤＮＡを用いてトランスフエクシヨンを行う特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３）遺伝子配列 I 及びIIが同一ベクター上に存在す
るＤＮＡと遺伝子配列IIIを有するベクターＤＮＡを混
合してトランスフエクシヨンを行う特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - （４）ジヒドロホレートレダクターゼ活性の競合阻害剤
がメソトレキセートである特許請求の範囲第１項乃至第
３項いずれかの項に記載の方法。 - （５）遺伝子配列IIIがグアニンホスホリボシルトラン
スフエラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフエラ
ーゼ、チミジンキナーゼの産生、又はネオマイシン耐性
をコードする遺伝子配列である特許請求の範囲第１項乃
至第４項いずれかの項に記載の方法。 - （６）遺伝子配列IIがマウス由来のジヒドロホレートレ
ダクターゼをコードするｃＤＮＡである特許請求の範囲
第１項乃至第５項いずれかの項に記載の方法。 - （７）メソトレキセート存在下で形質転換株の選択を行
う特許請求の範囲第１項乃至第６項いずれかの項に記載
の方法。 - （８）正常に機能し、かつメソトレキセート感受性のジ
ヒドロホレートレダクターゼをコードする遺伝子配列を
染色体ＤＮＡ中に有する宿主高等真核細胞がｃＨＯ−Ｋ
１又はＭＯＰＣである特許請求の範囲第１項乃至第７項
いずれかの項に記載の方法。 - （９）遺伝子配列 I がヒト・インターフエロン−γを
コードする遺伝子配列である特許請求の範囲第１項乃至
第８項いずれかの項に記載の方法。 - （１０）遺伝子配列IIIが大腸菌由来のグアニンホスホ
リボシルトランスフエラーゼをコードする遺伝子配列で
ある特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - （１１）遺伝子配列 I 、II及びIIIが同一ベクター上に
存在するＤＮＡがｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２である特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 - （１２）遺伝子配列 I 及びIIが同一ベクター上に存在
するＤＮＡがｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ１であり、遺伝子配
列IIIを有するベクターＤＮＡがｐＳＶ２ｇｐｔである
特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - （１３）特定の蛋白質をコードする遺伝子配列 I 、野
生型細胞由来のジヒドロホレートレダクターゼをコード
する遺伝子配列II及び形質転換株を選別するに必要な蛋
白質をコードする遺伝子配列IIIのＤＮＡを、正常に機
能し、かつメソトレキセート感受性のジヒドロホレート
レダクターゼをコードする遺伝子配列を染色体ＤＮＡ中
に有する宿主高等真核細胞にトランスフエクシヨンし、
形質転換株をジヒドロホレートレダクターゼ活性の競合
阻害剤存在下で培養して遺伝子配列IIの増幅とともに遺
伝子配列 I を増幅させて特定蛋白質の高生産株を取得
し、該高生産株を培養して特定蛋白質を製造する方法。 - （１４）遺伝子配列 I 、II及びIIIが同一ベクター上に
存在するＤＮＡを用いてトランスフエクシヨンを行う特
許請求の範囲第１３項に記載の方法。 - （１５）遺伝子配列 I 及びIIが同一ベクター上に存在
するＤＮＡと遺伝子配列IIIを有するベクターＤＮＡを
混合してトランスフエクシヨンを行う特許請求の範囲第
１３項に記載の方法。 - （１６）ジヒドロホレートレダクターゼ活性の競合阻害
剤がメソトレキセートである特許請求の範囲第１３項乃
至第１５項いずれかの項に記載の方法。 - （１７）遺伝子配列IIIがグアニンホスホリボシルトラ
ンスフエラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ、チミジンキナーゼの産生又はネオマイシン耐性
をコードする遺伝子配列である特許請求の範囲第１３項
乃至第 １６項いずれかの項に記載の方法。 - （１８）遺伝子配列IIがマウス由来のジヒドロホレート
レダクターゼをコードするｃＤＮＡである特許請求の範
囲第１３項乃至第１７項いずれかの項に記載の方法。 - （１９）メソトレキセート存在下で形質転換株の選択を
行う特許請求の範囲第１３項乃至第１８項いずれかの項
に記載の方法。 - （２０）正常に機能し、かつメソトレキセート感受性の
ジヒドロホレートレダクターゼをコードする遺伝子配列
を染色体ＤＮＡ中に有する宿主高等真核細胞がＣＨＯ−
Ｋ１又はＭＯＰＣである特許請求の範囲第１３項乃至第
１９項いずれかの項に記載の方法。 - （２１）遺伝子配列 I がヒト・インターフエロン−γ
をコードする遺伝子配列である特許請求の範囲第１３項
乃至第２０項いずれかの項に記載の方法。 - （２２）遺伝子配列IIIが大腸菌由来のグアニンホスホ
リボシルトランスフエラーゼをコードする遺伝子配列で
ある特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 - （２３）遺伝子配列 I 、II及びIIIが同一ベクター上に
存在するＤＮＡがｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ２である特許請
求の範囲第１４項に記載の方法。 - （２４）遺伝子配列 I 及びIIが同一ベクター上に存在
するＤＮＡがｐＳＶｅｄｈｆｒ−γ１であり、遺伝子配
列IIIを有するベクターＤＮＡがｐＳＶ２ｇｐｔである
特許請求の範囲第１５項に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60260450A JPH0714341B2 (ja) | 1985-11-20 | 1985-11-20 | 蛋白質の高生産株の取得方法 |
| CA000522981A CA1321766C (en) | 1985-11-20 | 1986-11-14 | Process for producing cell having high productivity of protein and process for preparing protein by using the cell |
| DE8686115971T DE3682164D1 (de) | 1985-11-20 | 1986-11-18 | Verfahren zur herstellung einer zelle mit hoher produktivitaet an protein und verfahren zur herstellung von protein unter verwendung dieser zelle. |
| EP19860115971 EP0223230B1 (en) | 1985-11-20 | 1986-11-18 | Process for producing cell having high productivity of protein and process for preparing protein by using the cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60260450A JPH0714341B2 (ja) | 1985-11-20 | 1985-11-20 | 蛋白質の高生産株の取得方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62118895A true JPS62118895A (ja) | 1987-05-30 |
| JPH0714341B2 JPH0714341B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=17348105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60260450A Expired - Fee Related JPH0714341B2 (ja) | 1985-11-20 | 1985-11-20 | 蛋白質の高生産株の取得方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0223230B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0714341B2 (ja) |
| CA (1) | CA1321766C (ja) |
| DE (1) | DE3682164D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1297434C (en) * | 1986-04-14 | 1992-03-17 | Kenji Murakami | Method of producing peptides, recombinant plasmid for use in the same and animal cells transformed with the same |
| JP2585532B2 (ja) * | 1986-05-10 | 1997-02-26 | 三井東圧化学株式会社 | 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法 |
| EP0319206A3 (en) * | 1987-11-30 | 1990-04-18 | Berlex Laboratories, Inc. | Gene amplification |
| WO1991014781A1 (en) * | 1990-03-19 | 1991-10-03 | Henkel Research Corporation | METHOD FOR INCREASING THE OMEGA-HYDROXYLASE ACTIVITY IN $i(CANDIDA TROPICALIS) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58183693A (ja) * | 1982-04-03 | 1983-10-26 | ビ−チヤム・グル−プ・ピ−エルシ− | ペニシリン誘導体、その製法及びそれを含む製薬組成物 |
| JPS59192089A (ja) * | 1983-01-19 | 1984-10-31 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | メトトレキセ−ト耐性ｄｈｆｒを使用する真核生物宿主細胞中での選別及び増幅用物質及び方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE56716B1 (en) * | 1983-01-19 | 1991-11-20 | Genentech Inc | Method for producing human tpa and expression vectors therefor |
| US4670399A (en) * | 1983-01-31 | 1987-06-02 | Stauffer Chemical Co. | Hybrid plasmid with marker |
-
1985
- 1985-11-20 JP JP60260450A patent/JPH0714341B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-11-14 CA CA000522981A patent/CA1321766C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-18 DE DE8686115971T patent/DE3682164D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-18 EP EP19860115971 patent/EP0223230B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58183693A (ja) * | 1982-04-03 | 1983-10-26 | ビ−チヤム・グル−プ・ピ−エルシ− | ペニシリン誘導体、その製法及びそれを含む製薬組成物 |
| JPS59192089A (ja) * | 1983-01-19 | 1984-10-31 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | メトトレキセ−ト耐性ｄｈｆｒを使用する真核生物宿主細胞中での選別及び増幅用物質及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0223230B1 (en) | 1991-10-23 |
| DE3682164D1 (de) | 1991-11-28 |
| EP0223230A1 (en) | 1987-05-27 |
| CA1321766C (en) | 1993-08-31 |
| JPH0714341B2 (ja) | 1995-02-22 |
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