JPS59192089A - メトトレキセ−ト耐性ｄｈｆｒを使用する真核生物宿主細胞中での選別及び増幅用物質及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、真核生物細胞を形質転換し、形質転換体を選
択し、且つ所望の産物を産生ずるＤＮＡ配列の発現レベ
ルを増大せしめる分野に係る。本発明は特に、を椎動物
細胞に薬剤耐性を付与して、これにより、同様に所望の
異種タンパクをコードしている配列を含有しているベク
ターで形質転換された細胞の検出を可能にする突然変異
遺伝子の使用に係る。又、本発明は、所望のタンパク産
物に対する配列の発現を制御すべく薬剤耐性を付与で−
る配列の使用に係る。

微生物宿主を異種タンパク産生に利用することは今では
公知である。然しながら、例えば細菌株を宿主細胞とし
−Ｃ使用すると、増殖及び収穫条件が容易であるという
点では利点が得られるか、このような系では形質転換用
配列の発現の結果、ｊｑられるタンパクを修飾したり、
グリコジル化したり、又は他の方法で操作覆る付加的能
力に欠【プるたδ５、しばしば不利な情況が生ずる。例
えば、細菌はトランスフエフ１〜して「デモシンα−１
４を発現させることは満足に行なえるが、産生ずるポリ
ペプチドには吐乳動物系に見られる「天然の」デモシン
α−１の特徴であるＮ−アレデル基が欠ｔづでいる。係
属中の出願（ＥＰＯ公聞Ｎ０１Ｏ（１９３６１９）に開
示されているような組織プラスミノーゲン活性化因子の
産生に於いては、１１１１ｉ乳動物タンパクのアミノ酸
配列の真のコピーが得られるが、べｆヂドをグリコジル
化し得ない。従っＣ１ある場合には、所望のタンパク配
列の発現用宿主細胞として真核生物細胞例えば被形質転
換吐乳動物細胞又は他の真核生物セルラインを使用する
ことが望ましい。

真核生物はルカルチャーの形質転換及びこのＪ：うなカ
ルチｔ？−ｔｌ”の所望タンパクを］−ドしている配列
の発現に成功したことが既に開示されている。例えば１
９８１年８月３１日出願の米国特許出願第２９８．２３
６号（ＥＰＯ公開Ｎ　０．００７３６５７）及び１９８
１年１２月　３日出願の米国特許出願第３２６，９８０
号（ＥＰＯ公聞Ｎ　Ｏ，００７３６５６）参照。これら
の特許出願を引用して本明細書中に包含づる。

異種タンパク産生に応じて形質転換を行なうには、所望
の形質転換体を容易に選択し得るような適切な被形質転
換宿主同定法を得ることが望ましい。細菌の場合は、例
えば、その産物がアンピシリン又はテ１−ラリイクリン
耐性を与える遺伝子がマーカーとして普遍的に使用され
ている。然しなから、を椎動物宿主細胞に対しては普遍
的に利用されるような標準的技術は未だない。最近、β
−イソプロピル−リンゴ酸デヒドロゲナーゼを欠１０し
ている細胞を宿主カルチャーとしで使用覆ると、この酵
素をコードしているＤＮＡ配列がマーカーとして使用し
得ることが発見された。被形賓１１−Ｉ主細胞は、この
酵素の最終産物を含まずこの酵素に対する基質を含む培
地で生育づる（　トＰ　Ｏ特５７［出願Ｎ　ｏ、　８１
−１１００８５．８．　）。種々の酵素例えばＡＭＰピ
ロホスフェートホスホリポシルト・ランスフＪラーゼ（
ａｐｒｔ−）又はチミジンキナーゼ（ｔｋ’−）を欠損
している他の突然変異セルライン（Ｗｉｇｌｃｒ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ。

（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　、　７６　：　１３７３．１９７９
）及びジヒド［］葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ’）活性
を欠損しているヂャイニースハムスター卵巣（ＣＩ−１
０）　１１１１１胞突然変異株（ｄＭｒ　　）　　（ｊ
ｌｒｌａｂ、　Ｑａｉｌ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ。

Ｌ　ａｗｒｅｎｃｅ、Ｐｒｏｃ、ＮａＣ１，Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）　。

７７　：　４２１６．１９８０＞も利用されている。こ
れらの突然変異セルラインは宿主細胞として便利に使用
でき、形質転換用１つＮＡが、宿主細胞が欠損している
酵素をコートしている発現可能配列を含有していれば、
単に、最少培地、即ち宿主細胞が固有には有していない
蒲伝子によってコードされている酵素の産物を欠く培地
で被形質転換細胞を増殖させて増殖可能なこれらのコロ
ニーを選択することだけで、形質転換体の選択が可能に
なる。

優性なマーカー系は未知ではない。例えば、ネオマイシ
ン耐性をｆ」与する配列は、その存在が０４１８を選択
剤として使用して検出される配列であル（ｐ、　Ｊ　、
　３ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　ｐ、　Ｂｅｒｇ、Ｊ　、
　Ｍｏｌ。

Ａ　ｐｐｌ、Ｇ　ｃｎｅｔ、、ユニ　４２７．１９８２
＞。

本発明にＪ：す、吐乳動物又は他のを椎動物セルライン
に薬剤耐性を付与するタンパクをコードしているＤＮＡ
配列を利用して、「野生型」を椎動物宿主細胞の使用が
可能となる。これは、宿主細胞に産生させたい異種タン
パクのロー１’配列を含有する発現ベクターと共に使用
すると特に有用である。本発明の好ましい態様に於い−
Ｃは、既知のＤ　ＨＦ　Ｒ阻害剤であるメトトレキセ−
］−（Ｍ−「Ｘ）に対する真核生物細胞の感受性を利用
でる。

ある種の細胞が多くのメカニズムによってＭ　ＴＸ阻害
を克服し得ることは以前から認められている。これらの
メカニス゛ムでは、例えば、Ｍ　Ｔ　Ｘの摂取を低下さ
せる（　Ｆ　、　Ｍ　、　Ｓ　１ｒｏｔｎａｋ、　ｅｔ
　ａｔ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、２８：　７５．１９６８：　
Ｇ、　Ａ、　Ｆ　１ｓｃｈｅｒ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、、旦：
　１２３３．　１９６２）　、　　Ｄ　Ｉ−ＩＦＲの産
生を増大せしめる（Ｊ、　　Ｌ、　Ｂｉｅｄｌｃｒｅｔ
　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、３２　：　１５３
，１９７２　；　３　、　［。

Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、Ｃｅ１ｌ、ユニ　３９１，
１９７６）　、又は、ＭＴＸに対する親和力の低いＤ　
ＨＰ　Ｒを製造覆る（Ｗ、　Ｆ、　ＦｌｉｎｔｏＨ，３
ｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｑｅｎｅｔ、、　２：２４５、
１９７６　：　Ｗ　１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐ
　ｒＯｃ、　Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　（ＩＪ　３　Ａ　）　、　７７：　３５６
７、１９８０）。即ち、正常なレベルの野生型ＤＨＦＲ
Ｌか含有しない細胞は全て死滅さμる濃度、２０ｎ／ｍ
ｌｌのＭＴＸ存在下でちヂ１フイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）セルライン突然変異株、Ａ２９の増殖を可能
に覆る低親和性Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒか前記細胞中で検出
された。Ａ２９細胞から単１ｉ１１１されたＤＮＡを細
菌性プラスミド１）ＢＲ３２２に結合し、これを用いて
ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を形質転換したところ、
得られた被形質転換細胞は高濃度のＭ　Ｔ、Ｘ中でも生
存することができた。同様に、Ａ２９ゲノムＤＮＡとＢ
型肝炎ウィルス（＋−Ｉ　Ｂ　Ｍ　）のゲノムを含有す
るプラスミドとを共に用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転
換したところ、これらの細胞はＭＴＸで選択するとＩ」
Ｂ　Ｖタンパクを発現するコロニーを形成した。

Ｊ　、　Ｋ、　ＣＩ＋ｒｉｓｔｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　、　　７９
：　１８１５．　１９８２参照。

高レベルのＤＨＦＲによってＭＴＸ耐性となっている細
胞中でＤＨＦＲ道伝了が増幅されることも又知られてい
る（　Ｒ、Ｔ　、　３　ｃｈｉｍｋｅ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　２０２：　１０５１．１９７８）
　。同様にＷｉｇｌｅｒ（上掲）は、ｌ）Ｂ　Ｒ３２２
中に結合されたＡ２９１）ＮＡを用いて形質転換した細
胞を高濃度のＭ　Ｔ　Ｘ中で増殖させると、この細胞中
ｒｌ）１３Ｒ３２２中のＤＮＡ配列が増幅されることを
発見した。いずれの場合も同時１−ランスフエフシコン
された配列はＭＴＸで選択することによって増幅し得る
。

受容された阻害剤親和力を有するジヒドロ葉酸還元酵素
の生成は、いくつかのグループによって観察されている
。Ａ　１ｔ）ｒｅＣｌＩＣｅｔ　ａｔ、、、　Ｃａ１ｌ
（：ｅｒＲｅｓ、、３２：　１５３９．１９７２：　Ｄ
　、　Ｆ　、　ｆ−１ｉｎＬｏｆＬｈ掲；Ｒ，Ｃ０Ｊｃ
ｃｋｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｅｕｒ、　　Ｊ　、　
　Ｃａｎｃｅｒ、１３：５６７．１９６７；　　Ｊ　　
、　　　Ｈ，Ｇｏｌｄｉｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　
Ｅｕｒ、　　　、）　。

Ｃａｎｃｅｒ、１６：　１５３９．１９８０参照。

本発明は特別に改変されたＤＩ−ＩＦＲコード配列に係
り、この配列によると、明らかに、低下したＭＴＸ親和
力とＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ遺伝子の増幅との両方によつ！
、ＭＴＸ耐性を付与するＤＨＦＲＨＦ式クが生成され、
従って、改変したＤＨＦＲをコードしている配列で形質
転換された野生型細胞の、通常は致死性であるＭＴＸ濶
度濃度増殖が可能になる。別の面に於いて本発明では、
前記の如ぎ高濃度のＭＴＸを利用して、ＤＨＦＲ３１仏
子自身だけでなく、細胞に同時１〜ランスフエクトされ
た所望異種ペブヂドのコード配列をも増殖させる。

−面に於いて本発明は、マウス繊維芽細胞の突然変異株
によって産生されるＤＨＦＲ酵素、ＤＨＦＲ３丁６Ｒ４
００のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
に係る。

第二の面に於いて、本発明は、ＭＴＸに対する結合親和
力がＩＬｔいＤ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクをコードして
いるＤＮＡ配列を含むプラスミドに係る。他の面に於い
°Ｃは、前記配列を所望異種タンパクをロードしている
配列と共に含有して８ｉす、各配列がその発現を生起せ
しめ得る配列に有効に（発現りるように）結合されてい
るプラスミドに係る。即ら、本発明は、適切に改変され
たＤ　ＨＦ　Ｒの屓伝了を発現し得るプラスミドのみて
’、：Ｋ　＜　、他の所望タンパク遺伝子をも同時発現
（ｃｏ−ｅｘ旧゛ｅｓｓ）（）るプラスミドも包含する
。

更に別の面に於いて、本発明は、低Ｍ　−ｒ　ｘ結合親
和力のＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクをコードしている配
列を利用して、所望タンパクの遺伝子配列の所望の適切
な形質転換体を選択することによる、真核生物細胞の形
質転換方法及び前記遺イフ、子配列を形質転換体中で増
幅する方法に係る３１本発明方法に於いては、野生型真
核生物細胞が宿主として使用し得、特定の醇素又（ユ補
足因子を欠）員しＣいる突然変異株を使用する必要はな
い。

更に、本発明は、薬剤耐性を付与する発現ベクターを利
用する脊椎動物細胞の選択方法に係る。

又、本発明は、前記方法によって前記ベクターで形質転
換された宿主セルラインを包含する。

最後に、本発明は特許請求の範囲に記載の方法で産生さ
れた所望異種タンパクをも包含する。

Ａ、ｔｉ 本明細書中、「ヌクレオチド配列」は、５′→３′リン
酸ジ工ステル結合で連なった一連のヌクレオチドから成
る核酸を意味し、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列のいずれで−ら
よい。ＤＮＡの場合、ヌクレオチド配列は一本鎖又は二
本鎖のいずれでもよい。同様に、ｒＤＮＡ配列」は、一
本領及び二本鎖の双方を指？ｉ。

ヌクレオチド配列を式で表示するときは、左側の５′末
端から始まり右側の３′末端で終了する。配列が二本鎖
ＤＮＡを表ゎり−とぎ、相補鎖は３′が左に５′が右に
ある。

ｒＭＴＸに対する結合親和力の低いｌ）　＋１１Ｒタン
パク」は本明細書に於いては機能的な定義をも覆る。こ
れは、細胞内部でＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ型どして生成され
たときには、０．２〜／ｄ以」二のＭ　−ｒ　Ｘを含む
培地でＭ　１−　Ｘ感受性細胞を増殖せしめるＤＨＦＲ
ＨＦ式クである。このような機能的定義は、生物のｒＭ
ＴＸに対する結合親和力の低いＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ−Ｒタン
パク」を産生づる能力及び産生されたタンパク自体に依
存することは明らか−Ｃある。然しながら、本明細書中
でこの用Ｂｙを使周り−る場合には、前記の双方のメカ
ニスム間の平衡は問題にならない、。

即ち本発明では、前記の如きＭＴＸレベルで生存づる能
力を付与することが操作のＮ的であり、産生じたＤＨＦ
Ｒ固有の性質に加えＣ多足の発現が前記の如き能力を強
化したが否かは中型でない。

ｒ、ＭＴＸ感受性細胞」とは、遺伝的に変化しているか
又は他の方法で補足されていないかぎり、Ｍ　Ｔ　Ｘ　
ｔｌｔＪ度が０，２鱈／威以上になると周囲及び培地が
細胞のタイプに適した条件であっても増殖できない細胞
を意味りる。

ｒＤｌ−ＩＦＲ３Ｔ６　Ｒ４００Ｊは、Ｄ、　Ａ、　Ｈ
ａｂｅｒｅｔ　ａｔ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
　　２５６：９５０１（１９８１）　：Ｄ　、　　Ａ　
、　　ｌ−１ａｂｅｒ　　ａｎｄ　　　Ｒ，王、　　３
　ｃｈｉｍｋｅ、　　Ｃｅｌ　ｌ。

２（ｉ　：　　３５５　（１９８１）　　（これらの文
献を引用して本明細山中に包含する）に記載されている
ようなマウス繊紐芽細胞の３Ｔ６株中に見い出される変
容ＤＨＦＲを意味する。

「所望の異種タンパク」とは、宿主細胞中で発現させた
いタンパクを意味し、これは宿主細胞自身か通吾５は産
生じず且つ細胞が生存し続けるのに通常は必要どしない
タンパクである。例えば、Ｂ型肝炎ウィルス外殻抗原（
＋−ＩＢＳＡＣ＋）は、ウィルスに感染していない哺乳
動物細胞にとって異梗であるが、宿主組換体細胞中での
１−（ＢＳＡ！Ｊ産生はワクチンの起源として望ましい
。

「発現ベクター」とは、内包づ−るＤＮＡ配列が該配列
を発現させ得る別の配列に有効に（発現し得るように）
結合されている場合、該配列を発現させ得るベクターを
意味する。これらの発現ベクターは、本明細書中必ずし
も明確に記述しなくても、宿主生体中で、■ビソームと
して又は染色体ＤＮＡに組込まれた部分として複製可能
でなりればならない。明らかに、複製能か欠如Ｊるとベ
クターは有効に作用し得ない。

要するに、「発現ベクター」なる用Ｍ１心機能的定義で
あり、内包する特定のＤＮＡコードを発現さば得る任意
のＤＮＡ配列も、イれが特定の配列に適用されるとき、
発現ベクターと相称され得る。

Ｂ、宿主セルカルチャー及びプロモータ一本発明（よ、
通常はＭＴＸに対して感受性の宿主細胞（又は伯の適当
な薬剤に対して感受性のを椎動物セル力ルヂャー）中で
操作し又は使用するのに適している。従って、水門１１
１Ｊ中実施例で用いる宿主細胞は限定覆る意味のもので
はなく単に代表例に過ぎない。０．’Ｏｓ／ｍｌｌ以下
のＭＴＸレベルで増殖か阻止される細胞であれば任意の
ものが使用できる。

近年では多くのを椎動物細胞株（ヒルライン）が組織培
養で増殖されＣいる〈工１ｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

Ａ　ｃａｄ、　Ｐ　ｒｅｓｓ、　　（１９７３）参照）
。異種タンパクの産生に宿主細胞として最も普遍的に用
いられるものには、→ノル繊維芽細胞のＣＯＳ−７株（
Ｇ　ｌｕｚｍａｎ。

Ｃｅ１ｌ、２３　：　２７５．１９８１＞並びにチャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）、　Ｈｅ　Ｌａ
セルライン。

しｌ１ｔｌｌｌｌ及びＶ　ｃｒｏ細胞の如き連続セルラ
インがある。

哺乳動物細胞中で使用づる場合、発現ベクターに対する
制御機能は、一般に、ウィルス性物質によって与えられ
る。例えば常用のプ【−１し一クーは、ポリオーマウィ
ルス、アデノウィルス２から誘導され、更に多くの場合
サルウィルス４０（３ｉｍｉ旧）Ｖ　１ｒｕｓ　４０．
　Ｓ　Ｖ　４０）からｌ１ｌｋ　尋される。ＳＶ４０ウ
ィルスの初期（ｅａｒｌｙ）プロモーター及び後期（１
ａｔｅ）プロモーターが特に有用で゛ある。これ【ま、
いずれもＳＶ４０ウィルスの複製のオリジンをｉｆｔ　
−ｔ！て含む断片として、ウィルスから容易に得られる
からである（　ｒ　Ｉｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ　
ａＬＵｒｆ！、　２７３　：１１３　（１９７８）。こ
の文献を引用しＣ本明細山中に包含する）。Ｓ’Ｖ４０
初期タンパク（Ｔ及び／又はｔ抗原と相称される）の存
在下で、このン１リシン断片を含む発現ベクターは許容
細胞核中で複製し且つ初期及び後期プロモーター・の３
′に（イ装置りる配　− 列の転写を高レベルに促進する（　Ｇ　ｌｕｚｍａｎ　
ｅｔ　ａｌ。

Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（］　ｌ−１ａｒｌｌＯｒ　Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ　　ＱＩＪａｎｔ。

Ｂ　ｉｏｌ、、　４４　：　２９３，１９８０　：　Ｇ
　ｌｕｚｍａｎ、上掲）。

断片がウィルスの複製のオリジン中に位置するＢ（ＩＩ
Ｉ部位に向つＣｌ−１ｉｎｄＩ［［部位から伸びる約２
５０　ｂｐの配列を含む限り、ＳＶ４０断片の長さの長
短は問わない。

以下の実施例では、宿主細胞としてＣＨＯ及びＬ細胞の
使用、並びにプロモーターとしてＳＶ４０の複製のオリ
ジンを含む発現ベクターについて記載づる。然しながら
、他の真核生物宿主セル力ルヂャー中で所望のタンパク
配列を発現する発現ベクターを構築するために類似の技
術を使用することは当業界で充分に公知の事実である。

Ｃ０好ましい具体例の詳細な説明 以下に詳細に記載するように、ｃＤ　Ｎ　Ａはマウス繊
維芽細胞３Ｔ　６−４００細胞から調製した。この細胞
は比較的高レベルのＭＴＸ中で増殖し得る突然変異株で
ある。他のＤＨＦＲ突然変異株も適当なＣＤＮＡの構築
のためのｎ＋ＲＮＡ源どしＣ同様に使用可能である。以
下の実施例で使用する特定Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒの具体例
の他に、前記の如き仙の代替物も本発明の範囲内に包含
される。更に、ｒ　Ｍ　Ｔ　Ｘに対する結合親和力の低
いＤ　ＬＩ　Ｆ　Ｒタンパク」をコードし得る改変ＤＮ
Ａ配列が、Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ。

の米国特許第４，３４２，８３２号に記載のｈ法によっ
て合成的に調製し得る。

本明細書中に記載した如く得られたｃＤＮＡは、初期プ
ロモーターがＤＨＦＲ配列の転写を指令覆るように配向
されたＳＶ４０オリジン、ポリアデニル化シグナル、プ
ラスミドの複製オリジン及びアンピシリン耐性マーカー
を含むｌ）Ｂ　Ｒ３２２山来発現プラスミド中に結合さ
れる。このプラスミドの構築については以下に記載する
。然しながら、明らかなように、他の真核生物由来の制
御機構を利用する他の発現ベクターも使用し得る。同様
に、以下に詳細に記載したようなり型肝炎表面抗原（＋
−４ｌ３３Ａ（１）及び組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔＰＡ）をコードしている配列に加えて、インター
フェロン、成長ホルモン等の遺伝子の如き異種遺伝子を
発現し得る発現ベクターも適切なコード配列を挿入する
ことによって作製し得る。

要するに、以下に記載覆る実施例は単に本発明を説明す
るためのみのものであって本発明を限定するものではな
い。

Ｃ，’１ｍＲＮＡの単離 Ｄｒ、Ｒ，Ｓｃｈｉｍｋｅ（Ｈａｂｅｒ　ａｎｄ　　Ｓ
ｃｈｉｍｋｅ）（上掲）から許可を得−Ｃ突然変異株３
Ｔ６Ｒ４００細胞を入手した。３Ｔ６Ｒ４００のカルチ
ャーを、単純塩と栄養を含み仔ウシ血清を補充した［）
ｕｌｂｅｃｃｏｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ培
地（Ｇ　ｒａｎｄｌ　５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｓから入手）中’Ｑ、　　１５０ｍｎ１組織培養皿当
り約１０　　細胞の細胞密度まで増殖ざけた。３個のプ
レートからの細胞単層を無菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で洗浄し、０．６５％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−ｉｏｏ
、　０．０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ、　ｐｉ−１８，０，１５
ＭＮａＣρ及び０．０１５Ｍ　　Ｍ（］　Ｃｆ！を含有
でる溶液を１０７細胞当り約５ｄ添加して溶菌した。４
℃に５〜１０分間保った後、混合物を１５（ｌＯＸｇで
遠心して細胞破砕物を除去し、上清にＥＤＴＡ　（吋」
８）を０．０２５Ｍ　（７）　Ｕ度になるまで、ＮａＣ
ｊを０．４Ｍまで■つドデシル硫酸す１−リウム（ＳＤ
Ｓ）を０．１％まで補充・した。次いで、溶液を２倍容
の緩衝フェノールで抽出し、遠心して相分離し、２倍容
のフェノール−クロロホルム１：１混合ＩＣ再抽出した
。２倍容のエタノールを水相に添加し、混合物を一２０
℃で６時間以−１＝冷却した。４℃で１６０００ｘｇ　
、　３０分遠心してＲＮＡを回収した。べレットをエタ
ノールで洗浄し、乾燥し、水に再懸濁した。約４ｍ’ｇ
のＲＮＡを得た。

このＲＮ　Ａ約２ｍｇを、０，０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ、　
１）ｌ−１７，５゜０．４Ｍ　　ＮａＣｆ及び０．０１
Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａから成る緩箭液約２ｄ中に入れた
。０．１％ＳＤＳを加えた溶液を同じ緩衝液で予め平衡
されたオリゴｄＴ−セルロースカラム上に入れた。溶液
をノＪラムに２回循環して通し、カラムを前記緩衝液２
０〜３０ｄで洗浄した。０．ＯＩＭ　　Ｔｒｉｓ、　Ｄ
Ｈ７，５，０，０１Ｍ　　ＥＤＴＡを添加してｍＲＮＡ
を溶出した。ｍＲＮ　Ａを含有づる画分をエタノール沈
澱により濃縮し、滅菌水に再懸濁した。約５０／ｌ／Ｊ
のｍＲＮＡを得た。

Ｃ，２ｃＤＮＡの調製 り、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌｌＮｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓＲｅ−ｓｅａｒｃｈ、　　８　：　４０５
７　（１９８０）　　（この文献を引用し−Ｃ木明細書
中に包含づる）に記載されている手順を適用して以下に
記載する結果を得た。

要約すると、上述の如くシで調製したｎ＋ＲＮＡ１０Ｉ
Ｊ！ｌを、　４種のｄＮＴＰ各１ｍＭ、　　ｄＣＴ−Ｐ
　　１（１０ＩＩＣｉ、オリゴ−ｄＴ　（１２−１８）
ブライマー（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓ、
　）約２Ｎ及び逆転′σ酵素（ＢＲＬ）２０ユニツ１へ
を含有づる逆転写酵素綴’ｆＡｉ溶液（２０ｍＭ　　丁
ｒｉｓ、　ｐＨ８，３，２０ｍＭＫＣρ、　８１１１Ｍ
　　Ｍｉｌｌ　Ｃｆ、、　　３０ｍＭ　　β−メルカフ
１〜エタノール（ＢＭＳＩ−１＞）　　１ｏｏｐｉ中に
入れＣ１初期３１　ｐ−ラベル−水銀ＤＮＡを生成した
。溶液を４２℃で３０分間インキュベー１−シ、氷水−
Ｃ急冷し、３分間煮沸した。冷加後、遠心しＣ変性タン
パクを除去し、上清を回収した。

次に、等容のＤＮＡポリメラーゼＴ’（Ｋ　１ｏｎＯＷ
　）１０ユニツ１〜を含有ブーる１、、／　２４Ｅｔ、
逆転写Ｍ％　Ｎｙｉ　ｔＪｉｒ液（ＮＥＮ）を加えて相
補ＤＮＡ鎖を生成した。溶液を１４℃で３時間次いで４
℃Ｃ１５時間インキコペートした。反応を停止させ、緩
衝液（５ｍＭＴｒｉｓ、　　ｐＨ８，２００ｍＭ　　Ｎ
ａ　　Ｃ１２、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で飽和したフェノ
ール１００成で渦を生起さぜ（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）且
つクロロホルムｉｏｏ成を添加してタンパクを抽出した
。次に水相を除去し、−２０℃の約２〜２．５倍容エタ
ノールで核酸を沈澱させた。沈澱物を回転沈降し、冷１
０％エタノールで洗浄した（このタンパク除去核酸回収
法を全体を通じ−Ｃ使用した）、。

次いで、ペレットをＳ１緩衝液（２５ｍＭＮａＯＡＣ，
Ｉ）Ｈ４，５，１ｍ１ｙｌ　　ｚｎ’ｃρ、、　３００
ｍＭ　　ＮａＣｆ）１００成に溶解させ、３７℃で９０
分間約８０ユニツトのＳＴヌクレアーゼ（ＢＲＬ）で処
理してＣＤＮΔ中の１ヘアピン」を開裂した。

Ｅ　ｌ）　Ｔ　Ａを０．０２５Ｍまで添加し、前記のに
うにフェノール−クロロホルム抽出した。ドライアイス
温度で３倍容のエタノールを用いて核酸を沈澱させた。

ペレットを水４５μに再懸濁させ、５０％グリセロール
、０．１％キシレンシアツール（ＸＣ）、　　ｏ、１％
ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）を含む液！〕ρを添
加した。溶液をＧｏｅｄｄｅｌ　（上掲）に記載の如く
調製した６％アクリルアミドゲル（１０Ｘｌ−１１３５
ａｅ、　１０％過硫酸アンモニウム（Δｐ　３　）　　
０．！＋７．４０％アクリルアミド　７，５ｍｅ、水３
６ｎ認、１［ＭＥＤ５０μ）上に載せた。６０分間２０
０Ｖにした後ゲルを臭化エチジウムで染色しサイズ位置
を決定した（アクリルアミドゲル電気泳動は、実施例を
通じて種々の時間でこのように行なった）１、所望り一
イズに対応するバンドを切り出し、シンチレーションカ
ウンターを用いてカランｌ−Ｌ／　（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ
　）１／ｌ０ＴＰＥ緩衝液約４００ｓ！中に電気溶出し
、ｍ度カウントしてｃＤ　Ｎ　Ａの収硝を決定した。（
（ＭＮａ　ＯＡＣ，ｐ）−１７，２，５０ｇを加え、冷
土タノール１０００ＩＪ１を添加した。このｃＤ　Ｎ　
Ａを一２０℃に貯蔵した。

上記特定調製例では、オリゴｄＴをプライマーとして用
いる逆転写酵素反応に前記の如く調製されたｍＲＮΔ１
０ｐｇを使用し、クローン調製ｔε使用するため、７０
０　ｂｐより大きい断片に対応するｌ＼ランドアクリル
アミドゲルから回収した。

Ｃ，３クローン　ＤＩ−ＩＦＲ３Ｔ６−Ｒ４００ｃＤＮ
△の調製 Ｃ，３，ａ　３−ランスフエクション及び増殖以下のよ
うにして、上記の如く調製されたｃＤＮ　Ａ　１００ｎ
ｃ＋　（回収された放射能から判定）の末端にポリＣを
つなぎ［ｌＢ　Ｒ３２２中に挿入した。

水１０成に懸濁したｃＤ　Ｎ　Ａ　　１１００ｎに、１
０×）Ｊコシル酸緩衝液１０ｍ、　　１０ｍＭ　ｄｃＴ
ＰＩＪｔ１２．水６８ρ。

１００ｍＭ　　Ｇｏ　ＣＤ、　１ｍ及びターミナルトラ
ンスフェラーゼ１０ユニットを添加した。混合物を３７
℃で３分間インキュベートし前記の如くフェノール−ク
ロロホルム抽出によってタンパクを除去しＩこ。

ｐｓｔＩで開裂しポリＧを末端に−〕ないｌと　ｐｉｌ
ｌ’＜３２２０．８ｎｇを上清に添加した。混合物を最
初−ノ」ノールで次いでり［］ロホルムで抽出し、３Ｍ
Ｎａ　ＯＡｏ　　３ｄ、　　１）ｌ−１７及びＩ　タ／
　−ル１（１０ｐｆ　’ａ水相に添加した。回転沈澱さ
けた（核酸））沈澱１勿を水９０ρ＋１０Ｘアニーリン
グ緩衝液（１００ｍＭＴ　ｒｉｓ、　Ｉ）ｌ−１７，５
，２，５ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ△　　ＩＭ　　ＮａＣρ）
１０ｐ１に再懸濁し、１晩７０°Ｃから３７℃まで降温
しながらインキュベートし翌日　４℃まで・降温しつつ
インキュベートした。

このようにして調製したアニールしたヘクター及びｃ［
）　Ｎ　Ａ　５０７ｕを用いて、最初Ａ、　Ｍａｎｄｅ
ｌａｎｄ　Ｈ１（ｌａ、Ｊ　、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、
　５３：　　１５４　（１９７０）に記載されＱｏｅｄ
ｄｅｌ　（上掲、引用によって本１月却１書中に包含す
る）によって修正されたリン酸ノｊ）レシウム沈澱法に
より、Ｅ　、ｃｏｌｉ）＜　１２株２９４細胞（ＡＴＣ
Ｃ３１４４６’）　　２００パを形質転換した。１時間
後細胞に４２℃で７０秒間熱衝撃を与え、３７℃のＬＢ
　Ｓｄ中に９０分間保持した。次いで、セルカルチャー
の一部６００成を、テトラザイクリン（Ｔｃ　）５１１
９／ｉｔを含有づる大きいＬＢプレート８個の上にプレ
ー１〜し、被形質転換コロニーを回収した。

コ１コニ−を一部選び取り新鮮なプレートに入れ、１晩
インキユベートし、Ｔｃ　　５７１９／７を含有するＬ
Ｂプレート上のニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　５ｃｈｕｅｌ！　　ＢＡ８５）に移した
。更に中に残存づるコロニーを一２０℃に貯蔵保持した
。

移したコロニーを３７℃で８〜９時間時間インキュベー
ト法いでフィルターからクロラムフェニコール１２．５
／ｚ／７を含有するプレートに移し３７℃で１晩インキ
コベートして増幅させた。

Ｃ，３，ｂプ［Ｊ−ブの調製 Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ、　　　Ｃｏ１ｄ
　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　ト１ａｒｂｏｒ　　　１　　
ａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　　Ｙｏ
ｒｋ　　（１９８０）（引用して本明細書中に包含４る
）に記載の方法によりニック−翻訳プローブを調製した
。、Ｊ、ｌ−１゜Ｎ　ｕｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ
ｅ１ｌ、１９　：　　３５！ｌ　（１９８０）　　（引
用して本明細占中に包含する）に記載されているような
ネズミＤＨＦＲｃＤＮＡコード領域由来のｃＤ　Ｎ　Ａ
インサートをＰｓｔＩ及びＢｏｌｌＩで消化してＤＮＡ
断片混合物を得、５０μＣ１のアルフッ・”Ｐ　−ｄＣ
ＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｎｏ、１０２０５）及びＩ
）　Ｎ−ａＳｅ５ｐｇ／ｍｅの（Ｐｏ１１緩衝液中）１
／４０，０００希釈液０．５成を添加しｌ；：Ｐｏ１ｌ
ｌｌｉ液（５０ｍＭＴ　ｒｉｓ、吐　７．５．　１０ｍ
Ｍ　　Ｍ　ｇＳ　Ｏｙ、　ｉｍＭジチＡ−スレイトール
、２５０パＭ　ｄＧ、Ａ、丁Ｔ　Ｆ）、　５０ｐ３／ｄ
ＢｓＡ）３ｏ成中で７００　ｂｐ風−刊■断片３００ｎ
ｇを処理した。２０℃１分後、混合物を４℃に冷却し、
ＤＮＡポリメラ＝ピ■（全酵素）１成を加え、湿合物を
１４℃で３時間インキュベートした。

Ｓ　ｅｐｈａｄｅＸ　Ｇ−５０カラムを使用して未取込
みヌクレオチドからラベルしたプローブを分離した。

形質転換され、培養され且つ増幅されたコロニーを含有
する各ニドＥＪセルロースフィルターを所望のｃＤ　Ｎ
　Ａ配列に対して以下の如くプローブした。

溶菌溶液（０，５Ｍ　　Ｎａ　０ｆ−１，１，５Ｍ　　
ＮａＣｌ）で３分間、中和溶液（０，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ
、　３ＭＮａＣρ、　　ｌ１ｌ−４７，５）　Ｆ１５分
間、次イテ２×標準クエン酸ナトリウム溶液で１５分間
飽和した後に乾燥さけたペーパータオル上に、各フィル
ターを次々に載せた。真空中（ｉｎ　ｖａｃｕｏ）　８
０℃で６０分フィルターを加熱した。

５０％小ルムアミド、　　５ＸＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥ
　＝０．１８Ｍ　　Ｎａ　Ｃρ、　　１０ｍＭ　（Ｎ　
ａ　１．５　）　Ｐ　Ｏｐ。

１ｍＭ　　Ｎａ　　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）、　　０
．３％ＳＤＳＪ３よびザケ精子ＤＮＡ　＜　　１／１０
倍容の１．５ＭＮａ　ＯＨ次いで１／１０倍容の１．５
Ｍ　　＋−１ｃρの添加によって変性）１００屑／　ｎ
ｔの溶液をフィルターに添加した。フィルターを４２℃
で２時間インキュベートし、次いで溶液をハイブリダイ
ゼーション溶液（デキストラン−硫酸すトリウムｒｈｏ
％（Ｗ／Ｖ）に作成）に交換した。サク粕イＤ　Ｎ　Ａ
及び１０’　Ｃｐｍのプローブを含有づる溶液を変刺し
フィルターに加えた。４２℃で１６時間後、フィルター
を２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　、　　０．３％ＳＤＳ、４２
℃、２００艷で　５回洗浄し、×−線フイルムにλ１し
て載置し′Ｃ１〕含有コロニー即ちプローブとハイブリ
ダイズするコロニーの位置を決定した。

前記手順を実施して、６００塩基対より大きいＤＮＡイ
ンザー１〜を含有する２０００個のコロニーを選別した
。

二１−〇セルロースフィルター上のこれら２０００個の
コロニーを、前述の如くニック翻訳によって得たプロー
ブどハイブリダイズさせた。１２個のコロニーが強くハ
イブリダイズし、これらのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを更に
解析覆るために単離した。

この小スケールプラスミド単離の手順は、Ｈ２Ｏ，３ｉ
ｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｊ、１）ｏｌｙ、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅＳ、、　７　：　１５１３　（１
９７９）に記載さレテイル。１１離したプラスミドをＴ
ａＱＩ消化に次ぐポリアミドゲル電気泳動によって解析
した。このような解析の基礎となる論理は、正常なネズ
ミＤ　ＨＦ　Ｒの場合、ＤＨＦＲコード配列には１９０
塩基対離れて位置し且つｃＤ　Ｎ　Ａの５′末端に位置
する２個のＴａｑＩ制限部位があるということである。

従って、所望の完全長（ｆｕｌｌ−１ｅｎｇｔｈ　）　
　ｃＤＮＡ配列はこの１９０塩基対レグメントを含まね
ばならない。前記プラスミドのうち５個がこのバンドを
示した。　般に、大スケールプラスミド調製物は、Ｄ、
１３゜Ｃｌｅｗｅｌｌ　ａｎｄ　　ｌ−１ｅｌｉｎｓｋ
ｉ、１３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　９：４４２８　（
１９７０）　　（引用して本明ｉｌｌ出に包含づる）の
透明溶解物法（’ｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ　ｍｃ
ｔｌｌｏｄ）を使用して上記の同定したカルチャーから
精製し、Ｂ　１ｏｒａｄ　Ａ　−５０アガロースカラム
クロマドグツノイーにＪ、って精製した。

これら５個のうち、最長の５′非翻訳領域を有Ｊるクロ
ーン化ＤＮＡをｐＲ４００−１２と命名した。この配列
を二阻工、比組ｆ　工、　ｌ−１ａｅＩＩ［、Ｈ肚■及
びＰｓｔＩを使用して制限解析したところ、開始コｉ〜
ンに隣接する二組１部位の５′側に　１００　Ｊ３．ｉ
基ヌ・１、終止コドンの３′側に３００塩基対伸延して
いた。

このプラスミドのｃＤ　Ｎ　Ａイン１ノートを、へ。

Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅ
ｔｌ＋ｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ　ｒ＋７ｙｍｏｌｏｇＶ、　　
　６５　　：　　　４９９　　（１９８０）　　の　ｈ
２人　、　　（’、ｈｅｌｌ　　ｅｌ’　　ａｌ　。

Ｎ　ａＬＩＪｒｅ、　２９９　：　　５２９　（１９８
２）の方法とＡ、Ｊ、Ｈ。

Ｓｍ１ｔｌ）、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、６５：　　５６５（１９８０）の方法の
組合わせ、及びジーデオキシチェインターミネーション
法を使用して末端から末端まで配列決定した。第１ａ図
にこの配列決定の様子を示ず。

配列決定のために、適当な制限酵素又は一連の制限酵素
２０ユニツトを含む適当な制限用緩衝液（又は一連の緩
衝液）含有溶液的２００Ｉｊ１．でプラスミド２０ｉを
処理することにより、クローン化Ｃ［）ＮＡ含有プラス
ミドの断片を調製した。各酵素インキュベートは３１℃
、１時間であった。酵素と共にインキュベートした後、
前述の如くフェノール−クロロホルム抽出及びエタノー
ル沈澱によってタンパクを除去核酸を回収した。次いで
、サイズ分画用前記６％ポリアクリルアミドゲルに載置
（ｌｏａｄｉｎｇ）するため充填用緩衝液（ｌｏａｄｉ
ｎｇｂｕｆｆｅｒ）　ＡＯＩＪＩ！に核酸を再懸濁した
１゜Ｍ　ａｘａｍ　ａｎｄ　　Ｇ　ｉ　１ｂｅｒｔ法（
１掲）を適用覆るには、ｐＲ４００−１２Ｄ　Ｎ　Ａを
ｌ−（ｉｒｕ　Ｉ　、　”１ａＱＴ又はＢＯ１’ｆｆの
いずれかで消化し、仔つシ腸アルカリ竹ホスファターゼ
を用いて１悦リン酸化し、フコ−ノール−クロロボルム
抽出した。丁４ボリヌクレＡヂドキナーゼ（ＮＥＮ、、
１８ｕ／ｍ）の存在下、３７℃。

３０分間　Ｐ−ＡＴＰで５′末端をラベルした。

ラベルしたＤＮＡを再びフコ−ノール−り［ＩＬ１ホル
ム抽出しエタノール沈澱した。ｌ−１ｉｎｆＪ及びＴａ
ｑＩＤＮＡを１×ゲル緩衝液に再懸濁させ、アクリルア
ミドゲル電気泳動した。ｌ−１ｉｎｒ　Ｉ　　１８００
ｂｐ及びＴ　ａｑ　Ｉ　８００　ｂｐバンドを切り出し
、電気溶出し、４９　Ｑ法を使用してフェノール−クロ
ロボルム抽出及びエタノール沈澱した。これらの断片を
次のように消化した。

ａ）二組■８００は圧咀■で消化、 ＋１）比班ｒｌ１８００は旦竺Ｒ工で消化、Ｃ）　ＢＯ
ＩＩ［（全プラスミド）は毘ｓｔＩで消化。

これらの消化混合物をアクリルアミドゲル電気泳動し、
次のものに相当するバンドを切り出した。

ａ）」１部位でう・ベルされたＣＤＮＡの５′末端を含
み、１）ＢＲ３２２のＰＳｔＩ部位を含む工」且■５０
０　ｂｐ断片、 ｂ）最も５′側のｌ−１ｉｎｆ■部位でラベルされ、ρ
３　Ｒ３２２のＰｓｔＩ部位を含むｌ−１ｉｎｒＪ１５
００　ｂ　ｌ）断片、 Ｃ）　Ｂ旺１ｆ部位Ｃラベルされ、ｐＢ　Ｒ３２２をｐ
Ｒ４００，１２につなぐＰｓｔ■部位で終了７る±Ｑｌ
］Ｔ３００１１１）及び７００　ｂｐ断片。

次にこれらの断片の配列を解析した。

Ｍ１３ベクター配列決定のために、ＤＨＦ、Ｒインサー
トをＦ　ｎｕ４　ｌ−４Ｉで消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　
Ｄ　ＮΔポリメラーゼ丁で平滑にし、ＬＬＬＩＩで再切
断した。

この処理によって得られた６６０　ｂｐ断片をアクリル
アミドゲルから単離し、前述の如くフェノール−クロロ
ホルム抽出しエタノール沈澱した。この断Ｐ１約０．２
屑を、Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　　（１掲）及び３ｍ
１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　（１掲）に記載の如＜、Ｓｍ
ａｌ−Ｂ（ｌｌＩ［消化Ｍ１３ｍｐ８及び９に結合した
。第１図にｃＤ　Ｎ　Ａインサートの完全な配列を示ツ
。

Ｒ／１００及び正常なり　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列の配列解
析の比較によると、野生型に比較して変容酵素（ａｌｊ
Ｏｌ”−ｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　）の］−ド領域にＦ、；
ｉ！Ｉｆｆ、　１個塩基ノ変更がみられる（　＋　３９
７位の「変更＜ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）　ｊはＮｕｎｂ
ｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、、　（１掲）ノ最初ノ報’ｒＬ　
ニＩｒｅ　ｃ−ｒる配列解析ニジ−に依るものである）
。６８位の変更はヂミンをグアニン残基に置換したもの
−ｃｄつり、その結果ペプチドではロイシンの代わりに
アルキニンに置換されている。第１図１．ｉ　３−ｒ　
６　Ｆ＜　／＋００醇索のアミノ酸配列を示している。

この配列の差貸を確認するために、ｐＤ　ＨＦ　Ｒ−１
１からｌｉ向ＩＬ、７こ正常なｃＤＮＡをｐＲ４００，
１２山来ＣＤ　Ｎ　Ａと同時に配列解析した。第２図に
示すように、正常’ａｃＤＮＡは、変容酵素ｃＤ　Ｎ　
Ａ中でＧ残基が占める同じ位置にＴ残基に相当するバン
ドを右づる。

０．４　Ｄｔ−＋ｒＲ−３−ｒ６Ｒ４００発ニーベクタ
ーの構９′エニーベクター１−６　Ｒ４００の発現プラ
スミドは、正しく整合すべく末端を適当に処理したほぼ
等モル吊の所望成分を１”４ＤＮＡリガーゼで結合して
構成した。ベクター及び配列成分０．５鱈に対してリガ
ーげ約１０Ｊ−ニットが必要であった。次いで得られた
プラスミドヘクターをＥ　、　ｃｏｌｉＫ　１２株２９
４（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１４４６）に形質転換してクローン
化した。形質転換及びクローニング、並びに被形質転換
コロニーの選択は前述の如く行なった。プラスミドを選
択されたコ１］ニーから単離し、上述の如く制限解析し
及び／又はＤＮＡ配列決定して所望の配列の存在を確認
した。

Ｒ４００−１２プラスミドを制限酵素１”　ｎｕ　４　
トｌ　、Ｔで開裂して発現プラスミドを構築した。前述
の」、うに、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
ＩＴ：末Ｑｉ；を充填した。

次いで、これをＢｑｌｌｌで再切断し−（ポリアクリル
アミドゲル電気泳動した。

次いで、ＤＨＦＲコード領域を包含１Ｊる６　６０　Ｊ
２漬基λ・１バンドを単離し、Ｓ　Ｖ　４０７１リジン
、Ｂ型ＩＩＴ炎つィルス由来ボリアテ′ニル化シグナル
、プラスミド複製オリジン及びアンピシリン耐性マーカ
ーを含むｐｃＶＥｓＶｌ−ＩＢＶ（後述）に挿入した。

このベクタープラスミドは以下のＪ、うにして得られた
。ＳＶ４０複製オリジンを含む５４０　ｂｐ肚ｄ■−Ｈ
１ｎｄｌ断片（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、　　１
：２１３　（１９８２）参照）をプラスミドｐＭ　Ｌ、
　（Ｍ　。

Ｌ　ｕｓｋｙ　ａｌｌｄ　　Ｍ　、　ＢＯｊＣＦｌａｎ
、　ＮａｔｕｒＣ，２９３：　７９（１９８１）参照）
中にＬ竺ＲＩ部位と比ユｄｌ［［部位の間で結合した。

プラスミドＥＣ０ＲＩ部位及び５Ｖ４０１−１　ｉｎｄ
　１１部位を、ｌ−１ｉｎｄＩ［［洞化前に４種のｄＮ
　Ｔ　Ｐ　（７）存在下ｒＫ　ｌｅｎｏｗ　ＤＮＡボリ
メラーゼエを添加し−Ｃ平滑末端化した。得られたプラ
スミドｐＥ　Ｓ　Ｖをル孤ｄｌ［［と１嶋ＨＩとで消化
し−Ｕ　２９００ｂｐベクタ一断片を単離した。この断
片のＥＣＯＲ王部位に、ポリリンカーを含有するように
改質されたＨＢＶ由来の２０２５　ｂｐ土国ｄＩ［Ｉ−
比旺■断片（多数の制限部位を含むＤＮＡ断片）を結合
した。

このｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ断片は表面抗原遺伝子を含んでおり
、１掲のＬ　ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、　　１：　
　２１３（１９８２）に記載（７）　’ｙ　ＩＪ　−ン
化１−ＩＢＶ　　ＤＮＡノ１ＥｃｏＲＩ−Ｂｃ＋＋ｎ消
化によって誘導される。二本鎖リンカ−ＤＮＡ断片（５
’　ｄＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴ−断片をヒｄＩ
［［−ＢａｌｌＩ断片に変換した。この操作はリンカ−
，１−ＩＢＶ断片及びベクターから成る３種の部分結合
として一行なうことｂできるが、より便利であり実際に
用いたプｊｄ、（゛は、先り１ｌｉｎｄＩ［［−Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−をり１」−ン化＋１［３Ｖ　　Ｉ）ＮＡに
添加し次いでこのブラスミ！−をＨｉｎｄｌｌと１旺■
で同時消化して±ユｄｌｌ？−比旺■断片を切り出した
。得られたプラス４１〜　ｐＣＶ　「Ｓ　Ｖ　Ｈ１３Ｖ
は、ｐＢ　Ｒ３２２から誘導されたｌ）Ｍｌ−出来の細
菌性ｆ２製Ａリシン、同様にｐＭｌ−由来のノ７ンピシ
リン耐性マーカー、初期プ１］モーターが組み込まれｌ
（７１−Ｉ　Ｂ　Ｖ断片の転写を指令りるように配向さ
れたＳＶ４０断片、及びｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍの表面抗原遺伝
子を含有している。このｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍ断片からも、哺
乳動物細胞の細胞質内で通常形成されるようなボリアア
゛ニル化１ｎＲＮＡの生成用のポリアデニル化ジグプル
が得られる。ＥＣ０ＲＩ消化、前記の如ぎ）（ｌｅｌＴ
ＯＷＤＮＡボリメラーげによる末端充填及び３ａｍｌ−
ＩＩによる再切断にＪ：つて、ＨＢＳ　Ａ！Ｊコード領
域を除去づ−る。この領域内にＲ４００ＤＨＦＲｃＤＮ
ＡからのＦ　ｎｕ４　トｌ　Ｉ−Ｂ（ＩＩＩＩ断片を挿
入する。得られたプラスミドを第３図に模式的に示す。

野生型ＤＩ−ＩＦＲｃＤＮＡプラスミド　ｐｏ　ｌ−Ｉ
　Ｆ　Ｒ−１１の旦ｎｕ４１−Ｉ　Ｉ　−Ｂ（ＩＩＩＩ
断片を使用してｐＦ　Ｄ　１１を構築した（Ｎｕｎｌ）
ｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ：掲）。ｐＲ４００，１
２からの同様な断片を用いて１）ＦＲ４００を構築した
。

Ｃ，５１）ＦＲ４００による宿主細胞のトランスフ１ク
シヨン 上述のように調製されたＤＨＦＲ発現プラスミド　１埒
を、０，２５Ｍ　Ｃ，ａ　Ｃρ、　２５０．ｎ中うット
キｖ　’）Ａ’−ＤＮＡ１０ｐ９と混合し、次いでＨＥ
ＰＥＳ緩衝生理食塩水（２Ｂ２Ｏ３Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＲ
、１，５ｍＭ　　Ｎ　ａ、ＰＯｐ　、　５０ｍＭ　　ｌ
−Ｉ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　　吐７．１　）　　２５０
．ｉｆ　全滴下して組織培養細胞をトランスフェクトし
た。室温で３０分後、６０　ｍ　ｍプラスチック組織培
養細胞で増殖している組織培養細胞に溶液を添加した。

Ｃｊｌｏｌ　、ＣＩ−ＩＱ　　Ｄｆ−ＩＦＲ−ＤＵＸ−
８＋１及びｌ−１’に一細胞を使用した。前記１１１１
はイ１）子細胞に）凶した］１′１地３威を８有してい
た。

ＣＩ−１０１及びＣＩ−１０１）　１１１’−ｆで−１
）ＵＸ−ｆ５１１細胞用培地は、１０％仔ウシつ清、１
００μ／　ｍｌ！ペニシリン、１００μＮ／ｄス１〜レ
ゾトマイシン及び１−グルタミン２．ｕｉＭを補充した
ｌ−１ａｌｌｌ　Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ）であった
。ｌ、、ｔｋ−レルレ、イン用ｊ）゛１地ｔＪ、前述ノ
ヨうに補充した［）ｕｌｔ）ｅＣｃｏ　ｍｏｄＨｉｅｄ
Ｅ　ａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　　（Ｄ　Ｍ　［Ｍ　
）　’ｒあった。

３〜１６時間後、培地を除去し、細胞をリン酸糾衝生理
食塩水中２０％グリレロールＣ洗浄した。新鮮な培地を
各プレートに添加し、細胞を更（こ２０インキュベ−１
へした。

２日間増殖させＩｃ後に細胞を１−リブシン処理（即ち
、ＥＤＴＡ　Ｏ，２＋ｎｇ／ｍヲ含有ｔル滅菌ト！Ｊプ
シン０．５ｍｇ／ｄで細胞を処理）し、選択培地を入れ
た１　０＋ｎｎ＋組織培養プレー１〜に〜３×１０９細
胞を添加して、トランスフエフＩ〜された宿主細胞を選
択しＩｃ　Ｑ旧１［（・−細胞用の培地は、グリシン、
ヒボキサンチン及びチミジンを欠く培地（Ｆ−１２ＧＩ
ＢＣＯ，Ｇｌ−ＩＴ−培地）である。ＤＨＦＲ宿主細胞
用には通常の増殖培地にＭ　Ｔ　Ｘを添加する。

１〜２週間のうらにＤ　ＨＦ　Ｒプラスミドを発現し立
ち」−って来る■１胞からのコロニーが生起した。

プラスミドなし及び正常Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ含有プラス
ミド１）ＦＤ−１１を使用する１〜ランスフ工クシヨン
条件を用いてコン１ヘロール（対照）試験を実施した。

表１に、Ｇ　ｌ−Ｉ　Ｔ培地を使用してコロニーを選択
する際のｄＭｒ−ＣＩ−（０細胞を使用するコロニー形
成頻度を示゛す。コロニーをｉ　００ｍ皿にプレートし
、７％透析仔ウシ血清を補充したクセリシン、ヒボキサ
ンチン及びデミジンを欠りトｊａｍｓ培地［−１２を供
給した。ある場合には処方された濃度のＭ　ＴＸを添加
した。各場合、３日後に同じ培地を細胞に再供給し１ｃ
ｏ１〜ランスフ［クシ・１ンの１０［」後にクリスタル
バイオレット ウントした。

表１　　突然変異及び野生型ＤＨＦＲ発現プラスミドプ
ラスミドなし　　ｐＦＤｌｌ　　ｐＦＲ４０００（０，
３）１０３３３０ １　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　３
１０５　　　　　　　　＜０．３　　　　　２６０２３
０１０　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　　　
　２４０２５　　　　　　　　　　　　　　　　３０　
　　　２５０５０　　　　　　　　（０，３（０，３２
４０１００＜０．３　　　　＜０．３　　　２００２５
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１７
０５００　　’　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　８５１０００　　　　　　　　−−　　　　　
　　　　　　　　７５１０４　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　４５、Ｑ５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１０（注）ｒ−Ｊ　　・・・
・・「試験せず」表１から判るように、Ｍ　Ｔ　Ｘの不
右下での丁１１−に一の形質転換では、正常のＤ　１１
　［Ｒを含有りるプラスミドは高い効率を示し、多少効
率が１１（いとはいえプラスミドρＦ　Ｒ−４００も同
様であ・ンた。、、ｉ常ＤＨＦＲで形質転換した■１胞
が完全に４１育（゛さないような高濃瓜のＭＴＸの存在
下でｂ、突然変異株、ＭＴＸ−耐性Ｄ　ＨＦ　Ｒの１〜
ランスフ王クシヨン効率は保たれＣいる。明らかに、１
０１１〜ＨＩＶＩＴＸ　　４５乃／威）より大きい濃度
はこれらｉ−ランスフエクトされた細胞の適当な選択培
地となり冑ノこ。

組織培養系での選択マーカーとしての野」型ＤＨＦ　Ｒ
の欠陥は、１〜ランスフエクトした野牛型ｒ３り素発現
プラスミドがトランスフＬり１〜された細胞に付与する
Ｍ　Ｔ　Ｘ耐性が比較的低い度合゛Ｃあるということで
ある。このことを第４図に示づ。第４図は、野生型非形
質転換ＣＩ−（０−Ｋ　１細胞に比較し【、Ｉ）ＦＲ４
００又はｐＦ　Ｄ　１１でトランスフエフ１−されたＣ
ｌ−１０−ＤＵＸ−Ｂｌｌ　（ｄｈｆｒ　　）細胞のＭ
ＴＸによる発育阻害の様子を示す。ｐＦＲ４００又はｐ
ＦＤｌｌで１〜ランスフエクトされたｄ　ｈ　ｆ−ｒ−
細胞から個々のコロニーを単離し、ＭＴＸの不在下で増
ｌＡさせた。２個のクローンからの細胞及びＣＨＯ−Ｋ
ｌ細胞の等量をトリプシン処理し、６０ｎ＋ｍ冊中へ分
割した。各■１へ種々のレベルのＭ　Ｔ　Ｘを加え、細
胞を３日間インキュベートし、次いで力「り　ン　１へ
　し　た　。

高レベルのＭＴＸの存在下でのｐＦＤｌｌでトランスフ
エフ１〜した細胞の増殖能は、同一条件下でのＣｌ−１
０１＜１　　（ＤＩ−ＩＦＲ）細胞の増殖能よりも明ら
かに低い。３日間アッセイで細胞増殖を５−Ω％■害す
るＭＴＸレベルは、ＩＮＦ　Ｄ　１１でトランスフェク
トしたコロニー（１）ＦＤｌｌ、１）由来細胞では約３
ｎＭ−ｒあったが、ＣＩ（Ｏ−に１１１１１胞では２０
ｎＭであった。これに対して、Ｉ）ＦＲ４００で１〜ラ
ンスフエクトした細胞から単ｉｔされた：１０ニー（１
）ＦＲ４００，１）は、非常に高レベルのＭＴＸの存在
下でし生育し得た。Ｆ　Ｒ４００，１細胞の５０％明害
レベルは約３０００　ｎ　Ｍである。

ＤＨＦＲ及びｄＭｒ−セルライン双方でのｐＦで４００
の１−ランスフエクション効率を表２に示づ一０ｐＲ４
Ｏ０での１−ランスフ」−クシ・」ンでは、Ｍ　−［−
Ｘ１００、　２５０及び５００ｎＭでＭＴＸ耐性：］Ｌ
に一が出現する。野生型酵素発現プラスミドＤ「＋）１
１で１〜ランスフエク（〜した＊胞からも、担体ＤＮ△
のみで１−ランスフエクトした細胞からも、生育し１ｑ
るコロニーは得られない。このＩ）ｒＲ４００によつ（
コードされているＤＨＦＲは、組織培養細胞中で′ＭＴ
Ｘを補充した培地での選択による優すり選択マーカーと
して使用し得る。

表２　　　　ＤＨＦＲ発現プラスミドでトランスフェク
トした　　　　　Ｃ，５この トランスフェクション効率ル。

コロニー／μ／１０６細胞　　　　　　　　　ＨＢＭＴ
Ｘ（ｎｍ）　　セルライン　プラスミドなし　ｐＦＤｌ
ｌ　　ｐＦＲ４００ＨＭ　し１条　し　ｌこ ２５０　　　　Ｌｔｋ−（２（２４４ −を添 ５００　　　　Ｌｔｋ−（２（２１４ −一一一−−−−−−−−−−−−−−−−−む３４８
及び電 杓　サブクローニングで増殖しなかった　　　　　（ｅ
　Ｌ、　ｔ、＝生育不能コロニー　　　　　　　　　　
　　　（Ｃｈ。

旦透且Ｒ ｂｐ断 旦？リ　ア−Ｔ−２、′び３Ｔ６４００のＵＳΔｇタン
パクコード配列を以下のＪ、うにだ。要約すれば、サル
ウィルスＳＶ４０のオを単離するために、ＳＶ４０　１
．）ＮＡをｌ−１ｉｎ消化しコンバーター（ＡＧＣＴＧ
ＡＡ１丁添加して止ユｄｌ末端を［ｃｏＲＩ末端に変。

このＤＮＡをＰＩＩＩで切断し＋ｑ　＋リンカ加した。

ＥＣ０ＲＩで消化後、オリジンを含ｂｐ断片をポリアク
リルアミ１〜ゲル電気泳動気溶出で単離し、１ＩＢＲ３
２２中でクローン。ＨＢＶ　（△ｎｉｍａｌ　Ｖ！ｒＵ
ｓ　　Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｓ。

５　）　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　（１９
８（＋）　）の１及びＢ（ＩＩＩ［による消化で得られ
た１９８６片（これはＨＢ　Ｓ　’Ａ　ｇをコー１〜し
ている遺伝子を含んでいる）を、ＥＣｏＲＩ部位及びＢ
止Ｈ■部位でプラスミドｐｖ　Ｌ　（Ｌ　ｕｓｋｙ　ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｎ　ａｔｕｒｅ、　２９３　：　７９　（１９８１）　
）にクローン化して発現プラスミドｆｕｌｌ　１３３３
４８−Ｅを構築した（ｐＭＬは、ザル細胞中でのプラス
ミド複製を阻害する配列が除去された欠失を有するＩ）
ＢＲ３２２の誘導体である）。得られたプラスミド（ｐ
ＲＩ　＝Ｂ！Ｌｌ）を次に［：ｃｏＲＩで直線化し、Ｓ
Ｖ４０のオリジン領域を示す３４８　ｌ１ｌ）断片をｐ
ＲＩ−比重の１刈ＲＩ部位に導入した。オリジン断片は
いずれの配向でも挿入され１■る。この断片は複製のオ
リジン以外に初期及び後期のＳＶ４０プロモーターをコ
ードしているので、オリジンの配向次第でどちらかのプ
ロモーターが作用し該ブロモ−クーの制御下でＨＩ３Ｖ
　３ｍ！仏子が発現し得た（Ｉ］ＨＢＳ３４８〜Ｆは初
期プロモーターの制御下ぐ発現したトＩＢｓを示す）。

１）Ｅ３４２を修飾覆るためには、ｌ］Ｅ３４２をＦＣ
ＯＲＩで部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａボリメ
ラ−１ｍ’Ｉを用いて開裂部位を充填し、プワスミ１−
をＩＩＪ結合し、これにより、１）Ｅ３４２中の５Ｖ４
０７１リジンに先行するＥＣｏＲｌ部位を除去Ｊる。ｊ
ｑられるゾレスミド即ちｐ「３４２△［で１をｌ−Ｉ　
ＣＯ［＜１で消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａボリ
メラーＬ！ｒを用いで充填し、ＢａｍＨＩで再度切断す
る。アクリルアミドグル電気泳動後、約３５００１）　
ｌ］断片を電気溶出し、前記の如くフェノール／クロロ
・ホルム抽出し１タノール沈澱させる。

このようにして調製したｐ３４２Ｆ　　３５００　ｂｐ
ベクターをＬ工ＲＩ及び１旦■で消化し、Ｉ−Ｉ　Ｂ　
ＳΔＱ］−ド配列の１部を含有づる３５００　ｂｐ断片
をアクリルアミドゲルから単離した。

プラスミドＩ）ＦＲ４００をＣ１ａＩ及び影ａｃｌＴて
（肖化し、７２０　ｂｐ断片を単離した。

ｐＢ　Ｒ３２２中でクローン化したｌ−（１３Ｖ　　Ｄ
　ＮＡ（ｌ　ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、ユニ　　２
１３．１９８２＞を凪ＰＩ及びＴ　ａｑ　Ｉて消化し且
つ約２０００　ｂｐ断片をアクリルアミドグルで単離し
て、ＨＢＶ表面抗原遺伝子を含むじＲＩ−ＴａｑＩ断片
を得た。

これら３種の断片を第５図に示すように結合して　Ｉ）
ＣＶＳＶＥＩ−ＩＢＶＲ４００を作製した。

次に、５ＶｌｌＯプロモーターを以下の方法を用いてＤ
　ＨＦ　Ｒコード配列の前に挿入した。プラスミド　ｐ
Ｍｌ−を堕ｄ　Ｉｌｌ及び江ＨＩで消化し、３０００ｂ
ｐ断片を電離した。クローン化ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ
　（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｔ、、上掲）を１−１１１８ＩＩ
テ消化し、Ｋ　ｌｃｎｏｗ　Ｉ）　Ｎ　Ａポリメラーげ
を用いて末端を平滑にし、ｌ−１ｉｎｄ１１．で再切断
した。ＳＶ４０オリジンを含む約４１０　ｂｐ断片を単
離した。最後に、クローン化１−ＩＢＶ　　ＤＮＡ　（
（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、上掲）をＦＪｆｃ。

ＲＩＴ−消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラ
ーゼを用いて充填し、Ｂ（ＩＩＩで再切断した。１９８
５　ｂｐ断片をアクリルアミドゲルで単離した。１３種
の断片を第５図に示すように結合して　ＩＩＬ４００を
作製した。

ｐｌ、−４００のオリジン断片は、片組［部位がオリジ
ンの初期側（ｅａｒｌｙ　５ｉｄｅ）に、ｋｌ　−）　
［３ａｍ　ｌ−ｌ　Ｉ部位が後期側（１ａｔｅ　５ｉｄ
ｅ）に配列されている。ｐ［−４００をＣ１ａＩ及びｐ
ＨＩで消化し、オリジン断片をアクリルアミドゲルで甲
Ｈ１シた。プラスミドｐｃＶｓＶＥＩ−ＩＢＶＲ４００
を広胆１及び則旺ＩＩで消化し仔つシ腸アルカリ性小ス
フノ・ターじ（Ｂ　ｏｅｌｌｒｉｎＢｒ　）で処理した
。、オリジン断片をｐＣＶＳＶＥＢＶＲ４００？ＪＰ合
物ｔ、：［１ＪＪｌｌしＴ結合Ｌ、第５図に示す如きｐ
ｃＶｓＶＥｌ−ＩＢＶＥ４ｏ０　Ｒ４００（ｐＦＨＥｌ
でとも相称づる）を作製した。

Ｃ，６異種遺伝子配列の発現 プラスミドｐＥ　Ｈ［Ｅ　Ｒを使用して、前記の如ぎＣ
ｌ−１０’　−Ｋ　Ｉ　Ｄ　Ｕ　Ｘ　−Ｂ　１１細胞、
Ｃ１−１０−Ｋｌ及びＬ［１り一細胞を１−ランスフエ
クトし選択した。コロニーの回りにガラスシリンダーを
置き、トリプシン処理して細胞をプレート表面から分離
してコロニーを単離する。前記の如ぎ適当な培地を入れ
た培養用１中に細胞を置き、数日間増殖させ、次いでし
ｉｕ　Ｃｔ　ａｌ、、　（上掲）に記載の如きラジオイ
ムノアッセイ＝１−ツ１〜（ＡｂｂｏＢを用いて１−Ｉ
ＢＳＡ（］産生をアラレイした。

表３に示づように、ｐＥｆ−ＩＥＲでトランスフエフ１
へしたけルラインから単離されたコロニー中では表面抗
原が非常に高レベルで産生されている。

類似の野牛型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ／　ｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ　
Ａ　（Ｉプラスミド（１１Ｅ３４２．１−ＩＢＶｌ、　
Ｅ／ｌｏＯ，Ｄ２２）でトランスフエフ１〜されたｄ　
ｈ　ｆ　ｒ−細胞でも同様のレベルのｌ−１Ｂ　ＳＡｇ
産生が観察されるが、このプラスミドでトランスフエフ
（へしたしｔｋ−又はＣ）−１ｏ細胞ではコロニーが形
成されず、従って表面抗原は産生されない。組織プラス
ミノーゲン活性化因子を発現するプラスミド（後述）で
細胞をトランスフ１り１−ツーると、コロニーは同時１
〜ランスフエク１−された范伝子がコードしているタン
パクをも産／Ｉ］する。

表　　　３ ＤＨＦＲＦＲ４０００３３０− ＤＨＦＲ−ＦＤＩＩ　　０１０００〜 ＤＨＦＲ−ＥＨＥＲ０３００６／６− ＤＨＦＲ−ＥＴＰＥＲ０３００−３２７’１２ＣＨＯｋ
ｉ　ＦＲ４００２５０２７０−ＣＨｏｋｌ　ＦＤＩＩ　
２５０　　（２−ＣＨｏｋｉ　ＥＨＥＲ２５Ｑ　　２７
０３／４−ＣＩ−１０ｋｌ　ＥＨＥＲ５００７５４／４
．−ＣＨｏｋｌ　ＥＨＥＲ１０００４０６／６−ＣＨｏ
ｋｌ　ＥＴＰＥＲ２５０２５０−２／４ＣＨＯｋｌ　Ｅ
ＴＰＥＲ５００７０−４，／４ＣＨＯｋｌ　ＥＴＰＦＲ
１０００４０−４／４Ｌｔｋ〜ＦＲ４００２５０４５− Ｌｔｌ＜−ＦＤＩＩ　２５０　　（２−Ｌｔｋ−ＥＨＥ
Ｒ１００１００６／６−Ｌｔｋ−ＥＨＥＲ２５０４５６
／６− 表３中に示したセルラインを前記の如き過当なプラスミ
ドでトランスフェクトし、トランスフェクシヨンの２日
後に表示したレベルのＭ　１’　Ｘを含む前記の如き選
択培地中に分割した。クローニングリング（ｃｌｏｎｉ
ｎｇｒｉｎｇ）を用い（’　１」Ｉに−をリブクロ、−
ン化し、選択培地を通過させた。し−１ｕｅｔ　ａｌ、
、　（上掲）に記載のように△ｕｓ四ａ（ｔｍ）　ＲＩ
Ａキッｒ−（Ａ　ｂｂｏｔｔ　）を実施することによっ
て１−ＩＢＳ　Ａ！Ｊ梵現をモニターした。組織プラス
ミノーゲン活性化因子は１）Ｅ３４２　ＴＰＡ［Ｒ４０
０（ｐｌＴＴＰＥＲ）によってコートされており、水明
細書に記載した繊維素載置技術（ｆｉｂｒｉｎ　ｏｖｅ
ｒｌａｙ＋ｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いてアッセイした。

Ｃ，７ｔＰＡ発現の増幅 同時１〜ランスフエクｉ−する遺伝子として、ヒ）・組
織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ、Ｉ−ＩΔ）を］−
ドしている配列を−含むプラスミド由来のＣＤＮＡイン
ザー（・を、以下のようにして１ＩＦＲ４００発現プラ
スミド中に挿入した。

ｔＰＡをコードしているｃＤ　Ｎ　Ａプラスミドは、Ｇ
ｏｅｄｄｃｌ　ｅｔ　ａｌ、　４９８２年５月５日付米
国特許出願第３７４，８６０ｊｔ３　＜ＶＸ州特許出願
公開第００９３６１９号。

引用しく本明細書中に包含する）に記載されている。ヒ
１−メラノーマ細胞（［３ｏｗｅｓ）を、炭酸水素す１
〜リウム（最ｔＰ’　ｉＨＨＯ２１２％）　、　２ｍＭ
のグルタミ゛ン及び１０％の熱失活牛胎児血清を補充し
た　１００ｄのＥ　ａｒｌｅｓ　Ｍ　１ｎｉｎａｌ　　
Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　　Ｍ　ｅｄｉａ中で、コンフルエ
ンｉ−な単層になるまで培養した。メラノーマ細胞がヒ
１〜組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生じた
ことを確認すべく、２４ウ工ルマイクロタイター冊でヒ
トメラノーマ細胞をコンフルエン１−な状態になるまで
培養した。０．３３μＭのプロテアーゼインヒビター、
アプロチニンの存在下又は不在下で、細胞をリン酸緩衝
生理食塩水で１度洗浄し、血清及びメチＡ二ンを含まな
い培地０．３ｄを添加した。７５μＣ１の［Ｓ］−メヂ
オニンを添加し細胞を３７℃ぐ３時間かり（ラベルした
。３時間でラベルした後、培地を細胞から除去し、免疫
沈降のために組織プラスミノーゲン活性化因子特異的Ｉ
ｇＧ又は免疫前血清で処理した（５４）。免疫沈降産物
を１０％５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動によって
表示した。、平板ゲルを固定し、乾燥し、Ｘ線螢光測定
した。

メラノーマ細胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗａｒｄ　
　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ　　、　　Ｖ　白゛ｏｌ、　
　　９　：　　　６４　　　（＋９７２）　　の方法を
準用して抽出した。細胞を遠心によりベレットにし次に
　１０ｍＭ　ＮａＣＩ、　１０ｍＭ’ｒｒｉｓ−ＨＣＩ
Ｉ　　（ＯＨ７，！ｉ）及び１．５０＋ＭＭｑＣらに再
懸濁させた。ＮＰ　　４０（Ｒ終濃度１％）を添加して
細胞を溶解し、遠心して核をぺＬフッ１へ化した。

全ＲＮＡを含む上清を多数回のフ」ノール−クロロホル
ム抽出ににり更に精製した。水相をＯｉＭＮａＣρ溶液
にし、次に２倍容のエタノールを添加して全ＲＮ△を沈
澱させた。オリゴ−ｄＴセルロースク［１７１−グラフ
ィーを用い、全ＲＮＡ調製物から　ｌｌｌＲＮＡを精製
した（Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｔ、、　ＮＵＣＩ。

Ａｃ１ｄ’ｓ　　Ｒｃｓ、、　８．２３３１　（１９８
’０）参照）。典型的な収用としては、１０ｇの培養メ
ラノーマ細胞から５乃至１０ｍｇの全ＲＮ　Ａ及び５０
乃至２００〜のポリ（Ａ＞プラスｍＲＮＡが得られた。

尿素−アガロースゲル電気泳動を用いてポリへ４ｍＲｘ
Ａ＜　２００埒）の分画を行なった（Ａｖｉｖｅｔａｌ
、、　Ｐ　Ｎ　Ａ　３　、６９：　１４０８．１９７２
）　、　１．７５％のアカロース、　　０．０２５Ｍの
クエン酸ナトリウム（ｐＨ３，８）及び６Ｍの尿素から
成る平板アカロースゲルを用いた。電気泳動は２５ミリ
アンペア、４℃で７時間実施し、次にゲルをｈミソリの
刃で分割した。各スライスを７０℃で融解し、フェノー
ルで２回、クロ］］ホルムで１回抽出した。次に両分を
↓タノール沈澱し、引続いてイスのスイ臓ミクＬｌ　”
ノームを補充したウリ”ギ網状赤面球ライピー１〜系（
Ｂｅｔｌ＋ｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ｌ　　ａ
ｈ、　　）中ｉ　ｎ　ｖ　ｉ　＋　ｒｏテ、以下の如く
翻訳しＣアラし！イを実施した。、　　２　！＋　ｍ　
ｌｙｌの１−ＩＥ’ＰＥｓ、４８．３　ｍＭの」蕩化カ
リウム、　　１０ｍＭのリン酸クレアチン、各５０　ｍ
　Ｍの１９Ｍ！のアミノ酸。

１．１ｍＭ（７）塩化マグネシウム、　１Ｇ、（ｉ　Ｉ
ＩＩＭのｒ　ｌ）　−１’　Ａ　。

０、１６ｍＭのジチオスレイトール、　８．３ｍＭのヘ
ミン。

１６．６〜／ｄのクレアチンキナ−１２、０，３３ｍＭ
のＪ、！１１Ｘ化カルシウム、　　０．６６ｍＭのＥＧ
Ｔ△及び２３．３ｍＭの塩化す１−リウムを含む最終容
（７３３（ｌ　ｐｉ！の溶液中Ｃ′２５μＣｉの［Ｓ］
−メチオニン及ヒ５００ｎｇ＋／）各グルスライスＲＮ
Ａを用い−Ｃ翻訳した５゜３０℃で９０分間インギコヘ
ー１〜した。リポソーム（Ｂ　１ｏｂｅｌ　ｅｔ　ａｔ
、、　Ｊ　、　Ｃｅ１ｆ　Ｂ　ｉｏｌ、、　６７：　８
！１２（１９７５）参照）を除去ずべく　ＩＥ　Ｄ　Ｔ
　Ａを用い−（相ミクロソームから調製したイヌのスイ
臓ミクロソーム朕を、ヌクレアーゼで処理しく　３　ｈ
ｉｅｌｄｓ　ｅｔａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｂｅｍ、
、　　２５３：３７５３（１９７８）参照）最終ｉｌ！
度７△２６Ｑユニット／ｄで翻訳混合物中に存在させ′
だ。翻訳産物又は免疫沈降翻訳産物を、既に記載の如＜
　（ｌ　ａｅｍｍｌｊ　Ｎ　ａｔｕｒｅ、ユ２７：、６
８０（１９７０）参照）、ドデシル硫酸す１ヘリウム中
の１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて解析
した。未染色の甲板ゲルを固定し、乾燥して螢光測定し
た〈Ｂｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　［’ｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏ−ｃｌ＋ｅｍ、、４６　：　８３　＜　４９７
４）参照）。

各ゲル画分から得られた翻訳産物をウザキの抗−ヒト絹
械プラスミノーゲン活性化囚子特異的ＩｇＧで免役沈降
させた。１個の主要な免疫沈降ポリペブヂドバンドが、
分子量約６３．０００ダルトンのＲＮＡ画分Ｎ０．７及
び８（２１乃至２４Ｓの移動度）の翻訳産物中に見られ
た。免疫沈降の際に免疫前１（ＩＧを使用覆ると前記の
バンドが見られイｃかった。このことは、これらのポリ
ペプチドか組織／ラスミノーグン活性化囚子特箕的−（
あることをＬ味する。

５屑のゲル画分ｎＩＲＮΔ（ゲルスライス７の１ｎＲＮ
Ａ）を使用し、標準法（５２，６５及び６Ｇ）ｒ’、、
。

水銀ＣＤ　Ｎ　Ａを調製しｌ〔。ＣＤＮＡを６％ポリラ
フクリルアミドグルでサイズ分画し、３　！ｉ　０１１
１）より艮いＣＤＮＡ　（１２５ｎｇ）を電気溶出した
１、ターミノルデオキシメクレオチジルトランスフエラ
ーゼを用いて３０　ｎ　ｇのＣＤＮＡにデオキシ（Ｃ）
残りをつなぎ、同様にデオキシ（Ｇ　）残塁をＰｓｔＩ
部イ；ｔに結合したプラスミドｌ）Ｂ　Ｒ３２２（Ｃｈ
ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎ　ａｔｔｉｒｅ、ニア５　：　　６１７　（１９７８
）参照＞　　３　（１（ｌ　ｎ　ｇとアニールした。ア
ニールした混合物を次にＩ　、　ｃｏｌｉＫ１２株２９
４　（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、３１４４６　）に形質転換
して約４６００個の形質転換株を行だ。

上掲の文献（欧州特許出願公開第４１７７６号）に記載
の方法で精製ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を得
た。

・合成プローブの作製の最適領域を見い出づべく分子を
以下の如く検査した。

タンパクを１ヘリプシン消化し易くするために還元し且
つカルボキシメヂル化した。組織プラスミノーゲン活性
化因子２ｍｇのリーンプルを先ず０．０１％Ｔ　ｗｅｅ
ｎ　８０にり・］シて室温で１晩透析した。凍結乾燥し
たタンパクを次に０．５６Ｍのトリス−ＨＣρ緩衝液（
ｐｌ−ｌ　８．６）、８Ｍの尿素及び５ｍＭの［Ｄｌ−
Ａを含む′ａ、１２ｄに溶解した。０．１ｄのβ−メル
カプ１−エタノールを添加してジスルフィド結合を還元
した。反応は窒素下４５℃で２時間行なった。

１．４Ｍのヨード酢酸のＩＮ　　ＮａＯＨ溶液１，０威
を添加して還元ジスルフィドをアルキル化しカルボキシ
メチル化誘導体を得た。室温に２０分間放じ後、０．０
１％Ｔ　ｗｅｅｎ　８０に対して室温で１８時間透析し
て反応を停止し、凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥カル小キシメチル化タンパクを３ｍｅ
の０，１Ｍリン酸す１−リウム緩肖液（ｐ１１７．５）
に再度溶解した。１〜リブシン（ＩＩ）ＣＫ）を（１：
５０の割合で）添加し、３７°Ｃ−Ｃ消化しｌζ。

３時間、　６時間及び１２時間後にリーンプル（０，１
ｍＲ）を取出しｌ〔。１２時間後にトリプシンを再度添
加した。２４時間後にサンプルを凍結して反応を停」１
１）、ＨＰＩ　Ｃに注入できるまで保存した。ＳＤＳグ
ルによりサンプルの消化の程度を測定しｌζ。３時間後
の４ノンプルでかづかなバントが驕られる以外、全ての
ゲルに変化はなかった。このことは、２４時間で完全な
消化が行なわれ、人さいベゾヂドか残存しないことを示
す。

約０．５ｄのサンプルを２系列操作型の高分解能Ａｌｔ
ｅｘＣ−８ウル１−ラス７１７　（’　１ｌｌｔｒａｓ
ｐＨｅｒｏ）５μカラムに注入した。アセ１−二トリル
の勾配を徐々に与えたく　５分で　１乃至５％、１００
分で５乃至３５％、３０分で３５乃至５０％）。２系列
操作のうちの１系列の操作で溶出液を２つの波長（２１
０ｎｍ及び２８０ｎ…）（・・七ニターした。２つの波
長での吸収比を用いて１〜リブｌ〜フアンを含むペプヂ
１−を検出した。

最も多くの１−リブトファンを含むと思われるペブヂド
ピーク、又は他の理由で有用と考えられたベブヂ１へピ
ークの配列決定を最初に行なった。これにより大部分の
１−リブ］へファンの周辺の配列を決定し１ｑた１、約
２５飼の最良ど思われるペプヂ１−ピークの配列決定後
、−列に並べた全部の配列データをプールして組織プラ
スミノーゲン活性化因子の一次構造の子猫モデルが得ら
れた。このデータ及びモデルからいくつかの可能なプロ
ーブの位置を決定した。

５１１９／ｍｆｌのデトラザイクリンを含むＩＢを入れ
たマイクロタイターブレー１−の各つＩルに」１１−一
を１個ずつ接種し、７％までｌ）　Ｍ　Ｓ　Ｏを添加し
て一２０℃に保存した。コロニーライ−ノ゛ラリ−の２
個のコピーを二１−ロセルロースフｒルターにで増殖さ
け、各Ｊ　［］　ニーから１￥また［）ＮΔをＯｒｕｎ
ｓｌｅｉｎＨｏｇｎｅｓｓ法（ＰＮＡＳ、　　７２：３
９［ｉ＋（１９７！ｉ）　参照）でフィルターに固定し
た。

丁ＣＣＣＡプローブを、１）ａ記の如く合成オリゴマー
から調製したく前記（Ｗ−［−Ｙ−０−１））１４ヌク
レＡヂド体プール）。５０　Ｉｌｌ　Ｍのリン酸す１〜
リウム（１）Ｈ６，８）、５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（１３ｆｉ
ｎ　Ｃｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　３：２３０３．
１９７６）、＋５Ｊｑｇ／ｄの超音波処理リケ精子ＤＮ
Ａ、５　Ｘ　フ２ンハルト溶液及び１０％ホルムアミド
中、４．６（１０個の形７．ｉ転換・株を含むフィルタ
ーを、室温Ｃ２時間ゾレハイブリダイスし、次に同じ溶
液中で５０Ｘ　１０　　カラン１〜フ分の標識プローブ
とハイブリタイス′した。

室温で１晩インキユへ−１〜し、フィルターを６×ＳＳ
Ｃ及び０．１％ＳＤＳ中室温で３０分間３回洗浄し、２
Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで　１回洗浄し、次にＤ　ｕｐｏｎｔＬ
ｉｇ旧旧＋１（Ｊ　　ｐｌｕｓ増感スクリーンで）（ｏ
ｄａｋ　　ＸＲ−５Ｘ線フイルムに１６時間露光した。

ポジディプなハイブリダイゼーション反応を示ず全（（
７）　］　ＤニーからプラスミドＤＮＡを急速法（Ｒｒ
ｉｎｂｏｒｉｎ　ｃｌ　ａｌ、ＪＪ　ｕｃｌ、△ｃｉｄ
ｓ　　ＲｅＳ、、ユ。

１５１３　（１９７９）参照）にＪ：り単離した。次に
、これらのクローンから得たＣＤＮＡインザートの配列
を、１ｌｌｉ片をＭ１３ベクターｍｐ７　　（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　９：　３０９，
１９８１）中でサブクローン化した後、Ｍ　ａｘａｍ　
　Ｇｉ　１ｂｅｒｔ化学法（７４）により決定した。第
３図は、ボジゲイブな組織プラスミノーゲン活性化因子
クローン、のハイブリダイゼーションパターンを示づフ
ィルターＮ　ｏ、２５を示す。クローン２５ｇ１０中の
ｃＤＮ△イン４ノートのアミノ酸配列と、精製組織プラ
スミノ、−グン粘性化囚子から得られたペプチド配列（
１”＋：＋記参照）との比較、及びｌ：、ｃｏｌｉ中て
゛産生された発現産物から（詳細は後記）、このｃＤＮ
△インサートが組織プラスミノーゲン活性化因子をコー
ドづるｌ）　ＮＡであることが判明した。クローン２５
Ｅ　１０は、２３０４１月）の長さを有しており、その
最長のＡ−グンリーディングフレームは５０８個のアミ
ノ酸から１；ｘルタンハ’）　（ＭＷ　５Ｊ７５６　）
　ヲ’−１−トシ”Ｃｄ５つ、７７２　ｂｐの３′非翻
訳領域を含んでいた。このｃＤＮＡクローンにはＮ−末
端をコードづる配列が欠如していた。

５０μ３のｐｐ　Ａ　２５Ｆ　１０　（前記）を凪■で
消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｒ３７６
１＋ｐの断片を単離した。この断片約３１Ｊ、Ｑを電気
溶出てグルから単離し、３０ユニツトのＱｄｅ工を用い
て３７℃ｒｉｌ＋￥間消化し、フェノール−クロロホル
ムで抽出し、王タノール沈澱さけた。これにより［）ｄ
ｅｌ粘７１末ρに：；が１！ｌられる。反応８ｖ合物に
５ユニツ１〜のＤ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（Ｋ　１ｏ
ｎＯＷ断片）並びに各０．１ｍＭのｄ△丁−Ｐ、ｄｃｌ
−Ｐ、ｄＧＴＰ及び′ｄＴ　Ｔ　Ｐを添加し４°Ｃで８
時間インキュベートして、前記の±ｒｌ　ｅ　Ｔ粘看末
端を伸ばして平滑末端とした。

７１ノール−クロロホルム抽出後、ＤＮＡを１５ユニツ
１〜のＮａｒ丁ｒ２時間消化し、反応混合物を６％ポリ
アクリルアミ１〜ゲル電気泳動にか（プた。約０．５μ
３の所望の１２５１１１）平滑末端−瓦ａｒ■断片を回
収した。このｌ’１ｌｌｉ　７−７は、成熟全長組織プ
ラスミノーゲン話性化囚Ｔタンパクのアミノ酸のうちＮ
　ｏ、６９からＮＯ，１１０まＣのアミノ酸をコードし
ている。

１ｆ３４：ｉ　１月１　ＩＱ〔１−ＢＯＩＩＩ断片を単
離づるために、３０）互の　ＩＩ　ＰΔ２５Ｅ　１０を
３０ユニツトのベゴげ一丁及び３５ユニツ１〜のＢ（１
１１１により３７°０Ｃ２０、−量器化し、反応混合物
を６％ポリアクリルアミドクル電気泳動にか（ブた。約
ＧＩＪ９の所望の１６４５１１　ｐとＥＴ−迎■断片を
回収した。

プラスミドｐ△ＲＩ　Ｓ　ＲＣＣｒＬ’、プラスミド　
１］Ｓ［でＣｅＸ１Ｇ　　（Ｍｃ　　Ｇｒａｔｈ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、Ｎ　ａｔｕｒｔ！、　　２９！ｉ　　：
　　　４２３（１９ｇ２）参照）の誘導体であり、役名
に於い（は、ｔ　ｒｌ）プ１」モーターに近位てＳ　Ｒ
Ｃｉ貨伝了に遠Ｋｌの１ｃｏＲＩ部位がＤＮＡボリメラ
−１ｆｆ１Ｊで修復りることにより除去されており、小
スボｊ−リ：［スプル法で合成された自己相補的オリゴ
デオキシヌクレオヂド　ＡＡ下ＴＡ王ＧＡΔｌ−１’　
ＣＡ下が及匝Ｊ部位の直ぐ隣りの残存ＥｃｏＲ］部位に
仲人され（いた。２０μ３の　ｐ△ＲＩ　Ｓ　ＲＣを旦
血ヅ＜　Ｊ　（完全に消化し、フェノール−り［１ｌ］
　ノ１＼ルｌ＼抽出し、Ｌタノール沈澱した。次に、２
５　ｍ　Ｍの耐酸ノｊ〜リウム（ｐｔ−＋　４．ｅ＞　
、１ｍＭの７−ｎＣ１，及び０．３Ｍ　（ｆ）　Ｎ　ａ
ＣＩの中でプラスミドを１００１ニツ１−のヌクレアー
ゼＳ１で１６°Ｃ１３０分間消化し、配列ＡＴＧをもつ
平滑末端を形成した。フェノール−クロロホルム抽出及
びエタノール沈澱後、ＤＮＡを３ａｍＨＩで消化し、６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかり、人きい（４
，３００ｂｐ）ベクター断片を電気溶出で回収した。

０．２鱈のベクター、０．０６鱈の１２５　ｂｐ平滑末
端−Ｎシ」断片及び０．６埒の１６４５　ｂｐ又畦■−
影旺■断片とを、１０コニツトのＴ、ＤＮＡリガーゼで
、室温”Ｃ７時間を要して互いに結合して発現プラスミ
ドを構築し、Ｆ　、　ｃｏｌｉ　２９４株＜ＡＴＣＣＮ
ｏ。

３１４４６　）をアンピシリン耐性に形質転換すべく使
用した。シラスミド））　Ｎ　Ａを２６個のコロニーか
ら調製し＆匝１及びＥＣ０ＲＩで消化した。そのうち１
２個のプラスミドが所望の４１５　ｂｐ　Ｘ　ｂａＩ　
−Ｅ　ｃ。

ＲＩ断片及び４７２　ｂｐ　Ｅ　ＣＯＲＩ−断片を含ん
でいた。ＤＮＡの配列解析により、これらのプラスミド
のいくつかが、出発点であるアミノ酸Ｎ０．６９力ａ（
セリン）に対して正しく配置された△ＴＧ聞始コドンを
有することが確認された。これらのプラスミドの１つ、
ｐΔＲＩ　ＰＡ’を試験したところ、所望の組織プラス
ミノーゲン活性化因子を序牛していた。

０．４．ｑの合成オリゴヌクレΔヂド５’　−ｒ’　−
ｒ　ＣＴ　ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧ３’をブライマー
として使用し、標準法にＪ、す、７．５屑のゲル両分Ｎ
（１，８のｍＲＮＡ（前記）から、二本鎖ＣＤ　Ｎ　Ａ
を調製した。ＣＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲルで
り一イス分画した。３００　ｂｐより大きい」Ｊ−（ス
画分（３０ｎｇ）を電気溶出した。ターミナルデオキシ
ジデシル１〜ランスフエラーゼを用いて５０ｇのＣＤＮ
Ａにデオキシ（Ｃ）残基をつなぎ、同様に賃記」部位に
デオキシ（Ｇ）残塁をつないだ５０ｎｇのプラスミド　
Ｉ）ＢＲ３２２どアニールした。次にアニールした混合
物をＥｃｏｌｉ　　Ｋ４２株２９４に形質転換した。約
１．５００個の形質転換株が得られた。

ＣＩ）ＮＡのブライミング反応が、クローンｐＰ△２５
Ｅ１０のＮ−末端から１３　ｂｐとハイブリダイズした
合成断片を用い−Ｃ行なわれたので、（１６ヌクレオヂ
ド体配列を含む）この２９　ｂｐ領領域は、ＣＤＮＡり
［］−ンをスクリーニングするための適当ｔｆ制限断片
は得られなかった。従って、Ｎ−末端組織ブラスミノー
ゲン活性化因子をコードしている配列を含みブライマー
で伸延したｃＤＮＡクローンを同定りるためには、ヒ１
へ組織プラスミノーゲン活＋！１化囚子ゲノムのクロー
ンを単離することが必要Ｃあった。

このブ［１−１，：’スの第１段階では、唯一の相同組
織ブンスミノーグン活性化囚子の遺伝子がヒ１−ゲノム
ＤＮΔ中に存在り”ることを確認した。このためにサザ
ンハイブリダイゼーションを実施した。この方法に於い
ては、５埒の高分子量ヒＩ〜リンパ球ＤＮＡを種々の制
限エンドヌクレアーゼ（完全に消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動にか（Ｊ、ニトロセルロースフィルタ
ーにブロワ１へした。

ＣＤＮＡクローンＩＭＰ　Ａ　２５Ｅ　１０のｃＤＮＡ
インリ−−１−（２３０ｂｐ比担■−胆■断片）の５′
末端からＦ２ｐ−標識ＤＮＡプローブを調製し、前記二
１−口セルロースフィルターとハイブリダイズした。

３５Ｘ　１０　　カウント７分のプ［］−ブを４０藺間
ハイブリダイスし次に洗浄した＜、　ｑ　ｌ゛目ｓｃｈ
　ｅｌ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ、１９：９５９　　（１９８０）参照）１，２
種のエンドヌクレアーゼ消化パターンから唯一のハイノ
リダイスＤＮＡ断片：比（ＩＩＩＩ　（５，７Ｋ１１１
１）及びＬ咀ＩＩ（４，２Ｋｌ）ｐ）か得られた。２種
のハイプリダイスＤＮＡ断片が±組ＣＩＩ　（５，ＩＫ
ｂｐ及び４．３Ｋｂｐ）で観察された。両者を総合した
データにＪ、れば、ヒ１〜ヶノム中にｐｌＩ−の組織プ
ラスミノーゲン活性化因子が存在すること、及び該遺伝
子が少なくとも１個の介在配列を有づ−ることか判明し
た。

組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子を担うλフ？−
ジ組換体を同定づるために、組織プラスミノーゲン活性
化因子り［Ｊ−ンｌ）Ｐ　Ａ　２５Ｅ　１０から調製さ
れた放射性プローブとのヌクレＡヂド相同性を検出りる
方法を用いた。１００万個の組換λファージを４０，０
００１］ｆＵ　／　１５ｃｍプレートの密度でＤＰ５０
３ｕｐ　　［にプレー１〜アウトし、Ｂ　ｅｎｔｏｎ及
びＤａＶｉＳの方法（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、ユ９６　：　
　１８０　（１９７７）参照）により、各プレート毎に
ニトロセルロースフィルターレプリカを調製した。標準
法を使用し、りＩ」−ンｌ１２５Ｅ　１０の５′末端か
ら３４　ｂｐに位置する２３０　ｂｐＨ叱１−」■断片
を用いて　Ｐ−標識ＤＮＡブ［］−ブを調製した。５０
ｍ１ｙｌのリン酸ナトリ「ン　ム　（ｐｌ−１６，５）
　　、　　　５Ｘ　　Ｓ　　Ｓ　　Ｃ（７７）　　、　
０．０５ｍｇ／−の超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５×デ
ンハル１〜溶液及び５０％ボルムアミド中で、６二ｌ−
＋＋（２ル１−」−スフイルターを４２℃で２時間プレ
ハイブリタ゛イスし、次に１０％デキス］〜ラン硫酸−
ノ１〜リウムを含む同じ溶液中で、５０×１０６ノノウ
ン１へ、７分の標識グローブとハイブリダイスした。４
２℃（・１晩イン−１−ユベー１−シ、フィルターを０
．２Ｘ’Ｓ　Ｓ　Ｃ及び０．１％ＳＤＳ中５０℃、３０
分間で４回洗浄し、２×ＳＳＣで′室温で　１回洗浄し
、次に［）ＵｐＯｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンで
Ｋ　ｏｄａｋ　　Ｘ　Ｒ−５Ｘ−線−，７イ／Ｌ／ムに
１晩露光した。全部で１９個のクローンがプローブとハ
イブリダイズした。６個の組換体から既に記載された方
法で７１−ジＩ）　Ｎ　Ａを調製した。コロニースクリ
ーニング用のｐｖｕ■断片を調製Ｊるために、λり］コ
ーンＣを選択した。３０μ３のＤＮＡをｐｖｕ［を用い
て３７℃で１時間消化し　１．０％アガロースゲル電気
泳動にか（プた。組織プラスミノーゲン活１（１化因子
をコードする配列を含有することが既に判明した４、２
Ｋｌ）ｌ）の断ｊ）を電気溶出して精製した。後）小の
如きコロニーハイブリダイゼーションを行なうために標
準法を用いて　Ｐ−標識グローブを調製した。

］Ｄニーをプレー１へから二１〜口しルロースフィルタ
ーに移しＣ増殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　
ｒｌｌｌｌｓＬｅｉｎ　−１−１０ＱｎｅＳＳ法でフィ
ルターに固定した。単離した絹械プラスミノーゲン括性
化因子λゲノムのり［１−ンからＣ２Ｋ　ｂｐＰ　ｖｕ
ｌｌ断片をシライムする仔牛胸腺（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ
　ａｌｌ、　３１ｏ−ｃｈｅｎ＋、　３１ｏｐｈｙ、Ａ
ｃｔａ、　４４２：　３２４　　（＋９７６）参照）に
よって　Ｐ−標識グローブを製造した。１，５００個の
形質転換株を含むフィルターを、１１２Ｘ　１０’Ｃｌ
１ｍの　Ｐ−ゲノムｐｖｕＩＩ［ｉ片とハイブリダイズ
した。Ｆ　ｒｉｔＳＣｌｌ　ｅｔ　ａｔ、により記載さ
れた条件を用いてハイブリダイゼーションを１６時間継
続した。

フィルターをＪ、く洗い、次に［）ｕｐｏｎｔ　ｌ　ｉ
ｇｂｌｎｉｎｇ−ｐ　ｌｕｓ増感スクリーンど共（こＫ
　ｏｔｌａｋ　　Ｘ　Ｒ−３Ｘ−線フィルムに１６乃至
４８時間露光した。、１８個のコロニーが明らかにゲノ
ム１ローブとハイブリダイスした。プラスミドＤＮＡを
これらの−１１，１”’　−の各々から単離し、ニド［
＝１Ｌルロースフィルターに固定し、最初のプライミン
グ反応に使用した３２Ｐ−標識合成オリゴヌクレオチＪ
：（１６ヌクレＡヂド体）とハイブリダイスした。１８
個のクローンのうちの７個がキナーゼによって７．−；
性化した１６ヌクレＡチドイホとハイブリダイズした。

ｕ＋　１３ベクターｎ叩７（７３）中での断片のザック
ローン生後に配列を解析すると、１種類のり「１−ン（
ｐ［）△１７）が組織プラスミノーゲン活性化因子のｌ
しいｒ’、　Ｉ　Ｎ−末端領域、シグナルリーダー配列
及び８４１１１１５’非翻訳領域を含むことが判明し／
Ｊ０２秤のクローンｐＰ　Ａ　２５Ｅ　Ｉｏ及びｌ）Ｐ
　Ａ　１７から、全長組織ブラスミノーグン活性化囚子
クローンの第５図の完全ヌクレチド配列及び制限パター
ン（第４図）を決定した。Δ−バーラップするｔＰＡプ
ラスミド。

１）Ｐ　Ａ　２５Ｅ　１０．　　ｐｐ　Ａ　１７及びｐ
△ＲＩＰＡ’から３種の断片を以下の如く調製した。プ
ラスミドｐｐ　Ａ　４７をｍ蛙■で消化し、Ｋ　ｌｅｎ
ｏｗ　Ｄ　Ｎ△ポリメラーゼＴを用いて充１眞し、ＰＳ
ｔＩで再度切断した。その結果生成された５′末端ｔＰ
Ａ配列を含む約１９０　ｂｐの断Ｊ、ｌを単離した。第
２のｔＰＡ断片を１＠るために、ｐ△ＲＩ　ＰＡｏを旦
ｓｔＩ及びｌＱ、ａｒ■で消化し、約３２０　ｂｐの断
片を単離した。第３のｔＰＡ断片を得るために、ｐＰ　
Ａ　２５Ｅ　１０を生［１及びＢ（ＩＩＩＩで消化し、
１６４５　ｂｐの断片を単離した。最後の断片はｔＰＡ
をコードする領域の殆んどを含んでｄ３り更にいくらか
の３′非翻訳配列を含んでいる。

１−Ｉ　Ｂ　Ｖ表面抗原を発現するプラスミド０３４２
［（ｐＩＩ　Ｂ　５３４８−Ｅとも積和−される）は、
１−（！ＶｉｎＳＯｎ　ｅｔ　ａｔ、により１９８１釘
づ２月　３０イζ１出ＩＷｉの米国特許出願第３２６，
９８０号明細Ｖ！に記載されており、プロモーターかＳ
Ｖ４０Δリジンを含む３４２　ｂｐＰｖｕＩＩ　−１−
１ｉｎｄ　ｍ断片である以外は１）０＼／ＳＶ［”１−
Ｉ　Ｂ　Ｖと同様である。該出願を引用しＣ水明細用中
に包含する。１）Ｅ３４２を修１１ｉｌｌりるため（こ
、１）１：３４２を微量のＥＣ０ＲＴで消化し、１＜　
ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を用い“Ｃ開裂
部イ☆を充ｊ眞し、プラスミドを再結合し、これにより
、ｐＥ３４２中のＳＶ４０′Ａリジンに先行する［Ｅｃ
ｏＲＴ’部イイ／を除ム−りる１゜得られたプラスミド
即ち　Ｉ）Ｅ３／１２△（？１を１）、ｃｏＲ■で゛消
化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　ＡボリメラーＬｌ’Ｉ
を用いて充填し、Ｂａｍ１−ＩＩで再度切断づる。アク
リルアミドゲル電気泳動後、約３５００　ｂｐ断片を電
気溶出し、フェノール／クロロホルム抽出し、丁タノー
ル沈澱さぜる。

１−Ｉ　Ｂ　Ｍ表面抗原を発現するプラスミド　ｌ）Ｅ
　３４２（ＩＩＨＢ　３３４８〜Ｆとも槓杵される）は
、ｌ　ｅｖｉｎｓｏｎ　ａｔ旧、により１９８１年１２
月　３日付出願の米国特許出願第３２６，９８０号明細
書に記載されている。該出願を引用して本明細Ｒ中に包
含する（欧州特許出願公開抛００７３６５６号）。要約
すれば、ザルウィルスＳＶ４０のΔリジンを単離するた
めに、５Ｖ４（ｌ　　ＤＮＡをｌ−１ｉｎｄ　■で消化
してコンバーター　（ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を添加し
て止班ｄｕｌｌ末端を［ＥｃｏＲＴ末端に変換した。こ
のＤＮＡをＬリー■て切断しＲＩリンカ−を添加し７ｊ
　、　Ｅ　ｃｏ［＜ＩＣ消化後、Ａリジンを含む３４８
１）ｌ）断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電
気溶出で単頭し、ｐ３Ｒ３２２中Ｃ゛り１−１−ン化し
た。ｌ−ＩＢＭ（Δ旧−ｍａｌ　Ｖ　１ｒｕｓ　　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　（Ｃ１１，５）　Ａｃａｄ、ｐｒｅｓ
ｓ。

Ｎ、　Ｙ、　　（１９８０）　）のＬ剪ＲＩ及び良計■
による消化でｍられた１！＋８６　＋）Ｄ断片くこれは
１−ＩＢｓＡ（］をコード覆る遺伝子を含んでいる）を
、Ｅ　竺１＜　１部位及びＦ３ａｍｌ−ＩＴ部位でブ゛
ノスミド　１］Ｍ１（ｌ　ｕｓｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ、
、　　　Ｎａ１ｕｌ”０．２り３：　７９　（１９８１
））にクローン化しＣ発現ブラスミ１へ　ｐｌ−１［３
ｓ　３４８−シを構築した（ｐｌｖｌＬは、ザル■１胞
中（のプラスミド複製を阻害づる配列が除］、された欠
失をイＪりるＤＢＲ３２２の誘導イ木である）。社？ら
れｌ、二ノ′−ノスミト（ｐＲＩ　−ＲＣＩＩ）　ヲ次
ニ１．　ＧＯｌ’＜　Ｉ　（’　ｌＬ＝！　線化し、Ｓ
　Ｖ　４０（１）　ｔ　’）　シン領域を；Ｊ（ｔ　３
４８１＋ｐＦＪｉ　）′１’ｃ　ｉｌＲｌ−１旺の旦剪
ＲＩ部位に導入した１、オリジン断）′１はいずれの配
向でも挿入され得る。この断片は複製のΔリシン以外に
初期及び後期のＳＶ／１０ゾ１ｌｌ−−クーをコードし
ているのＣ，Ａリジンの配向次第でとらｊうかのブ■］
モーターかイ′［用し該ヅ１−１ヒーターの制御下で１
−１　［３Ｖ　Ｊ転子か発現し４４．、＋だ（ｐｌｌＢ
　Ｓ　３４８−Ｆは初期プ［］モーターの制りＩＩ　’
Ｅ　Ｃ’発現し１〔ＨＢ　Ｓを示す）。ｐＥ　３４２を
バ篩するために、ｐＦ３４２をＩＥ　Ｃｏ　＋、！　Ｉ
　テ部分消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　ＮＡポリメラー
ゼ■を用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再結合し
、これにより、１）Ｅ３４．２中の５Ｖ４０７Ｉリシン
に先行するＥＣｏＲＩ部位を除去する。得られたプラス
ミド即ち　１）Ｅ３４２△Ｒ１をＬｃｏＲＩｒＷ’ｊ化
し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を用い
て充填し、３ａｍｌ−ＩＩで再度切断する。アクリルア
ミドゲル電気泳動後、約３５００　ｂｐ断片を電気溶出
し、フェノール／クロロボルム抽出し、前記の如くエタ
ノール沈澱させる。

前記の如く調製されたｐ３４２Ｆ　　３５００　ｂｔ）
ベクター及び約２１６０　ｌａｐの前記ｔＰＡ断片を標
準法によりＡ７いに結合した。ＩＩＰＡをコートする３
種の断片を適正方向で含むプラスミドを単離し、特性決
定し、１）［３４２−ｔ−ＰＡど命名した。このプラス
ミドを５ａＣＩＩて消化し細菌性アルカリ性小スフ１ク
ーゼ＜ＢＲＬ礼製）で処理した。ＤＨＦＲ配列をく該配
列の発現用制御配列と共に〉ちえるために、吐１−ＩＦ
Ｒの５ａｃｌ消化によツー（約１７００１）Ｉｌ　（ｆ
）　１ｌｌｌｉ片を生成した（　　ＩＩＩＥ　Ｉ−１「
Ｒは前記′Ａζ国狛清出願第４５９．１５１号明細書に
記載の突然変異Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒを発現するプラスミ
ドである）。〃約りるど、ｐ「１１ＥＲは第１３図に示
す如くして調製した。ｐ３４２ｊ：はＬ　ｅｖｉｎｓｏ
ｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８３年３月９日イｑ欧州特許
出願公開第００７３６５６号に記載されＣいる。ｐｆ−
１１３Ｖ−Ｔ’−１Ａ及びＩ）Ｓ　Ｖ　Ｒはｌ−ｉｕ　
ｃｔ　ａｌ、、Ｄ　Ｎ△。

ユニ　　２１３　（１９１３２）に記載されている。ｐ
ＦＲ／１００は以下のようにして調製される。

ＳＶ／ｌｏ複ｖオリシンヲ含ムｓａｏ　ｂｐ　ＩＩ　国
ｄ、■−１−ｌｉｎｄＩ［［断片（Ｌｉｕ　ｃＮ　ａｌ
、、ＤＮＡ、　　１：　　２１３（１９８２）参照）を
プラスミド１１Ｍ　ｌ　　（Ｍ　、　１．　ｕｓｋｙｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎ　ａｊｕｒｅ、　２９３　：　７９（
１９８４）　参照）中にＥＣｏＲＩ部位とｌ−ｌ　ｉｎ
ｄ　ＩＩ［部位の間で結合した。プラスミドのＥＣｏＲ
Ｉ部位及びＳ　Ｖ　４０Ｈｉｎｄ　Ｕ部位を、＋−＋　
ｉｎｄ　Ｉ［ｌ消化前に４種のｄＮ　Ｔ　Ｐの佇在下で
ＫＩＯＩＩＯ〜ｖＩ）Ｎ△ボリメラーゼエを添加して平
滑末端化した。得られたプラスミド　ｐＦ　Ｓ　Ｖをｌ
−１ｉｎｄ川とＢａｍ１−１１とて６Ｍ化して２９００
　ｂｐベクター断片を単Ｈ１シた。この断片のＥＣｏＲ
Ｉ部位に、ポリリンカーを含有づるように改質されたｌ
−Ｉ　Ｂ　Ｖ由来の２０２　！ｉ　ｂ　ｐ±班ｄ［ｌ−
江■断片（多数の制限部位を含むＤ　Ｎ　Ａ　Ｉｌ、＋
　）ｉ）を結合した。このＨＢ　Ｖ断片（４表面抗原遺
伝子を含んでおり、上掲のＬ　ｉｕ　ｅｔａｌ、、ＤＮ
Ａ、ユニ２１３（１９８２）に記載のクローン化ＨＦ３
　Ｖ　　１つＮΔの辷匹ＲＩ　−Ｂ蛙■消化によつ−Ｃ
誘導される。−１本鎖リンカ−ＤＮＡ断片（５′ｄへＡ
ＯＣ下ｒ、ＡＴｃＧＡｌ−ＴＣＴＡＧＡＡＴ丁Ｃ３′・
・・・・・）をｌ−１ｉｎｄＩ［［と旦副ＲＩで消化し
ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍ断片に添加しＣ，辷剪ＲＩ−比１■断片
を比ユｄＩ［Ｉ−Ｂ＋＋ｌＴＩ断片に変換し）〔。この
操作はリンカ−９）−ｌ　Ｂ　Ｍ断片及びベクターから
成る３種の部分結合としでも行なわれ得るか、より便利
であり実際に用いた方法では、先ず±ｉｎｄ　Ｉｌｌ　
−ｒ　ｃｏＲ丁リンカ−をクローン化１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　
　ｌ）　ＮΔに添加し次い（このプラスミドをｌ−１ｉ
ｎｄＩＩＩとＢＬｌｌｌＣ同時消化しで１１ｉｎｄ　ｍ
　−Ｂ（ＪＩＩＩＩり１片を切り出した。１Ｆ１″られ
たシラスミド　Ｉ）ＣＶＦＳＶＩ−１１３Ｖは、＋）［
−３Ｒζ（２２から誘導されたｐＭｌ−由来の細菌Ｖ（
複製Ａリシン、同様にｐＭＬ由来のアンピシリン耐性マ
ーカー、初期プロモーターが組み込まれたｌ−１１１”
３　Ｖ断片の転写を指令するように配向された５Ｖ４ｔ
）断）“１．及び１１ＢＶの表面抗原遺伝子を含有しＣ
いる。この１１）３Ｖ断ハからも、吐乳動物細胞の細胞
質内Ｃ・通１；（形成されるようなポリアデニル化ｎ１
ＲＮＡの生成用のポリアデニル化シグナルが１！ｌられ
る。ＩＴ　ｃｏＲＩ消化、前記の如ぎＫ　ｌｅｎｏｗ　
Ｄ　Ｎ　Ａポリメン−Ｕによる末端充填及びＢ、１１＋
１ｌ−ＩＨによる再９）断にＪ、って、ｔ−Ｉ　Ｂ　ｓ
へ〇コード領域を除去する。この争域内【ごＤ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　ＲをコードしているｃＤ　Ｎ　Ａからの１視４１
−ＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を挿入する。得られたプラスミ
ドを第１４図に模式的に示す。野生型ＤＨＦＲｃＤＮＡ
プラスミド１）ＤＨＦＲ−１１の１匹４１−Ｉ　Ｉ　−
Ｂａｌｌｌ断片を使用してｐＦＤｌｌを構築した。

（Ｎｕｎｂｅｒｇｃｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、１９：　
　３５５（１９８０）参照）。Ｂｌ（４００，１２から
の同様な断片を用いて　ｐ［Ｒ４００を構築した。

ρＲ４００，１２は、メトトレキレート耐性ＤＩ−ＩＦ
ＲをコードしているＤＮＡ配列を含有する組換体ブラス
ミ１−である。この調製のためには、突然変異体３Ｔ６
Ｒ４００細胞（Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、
２６：３５５　（１９８１）参照）からのｍＲＮ　Ａを
単離し、単離したｌｌｌＲＮＡからＣＤＮＡライブラリ
ーを調製し、ｃＤ　Ｎ　Ａを凪開裂ｐＢ　Ｒ３２２中に
結合し、Ｅ、Ｃ０１ｉ株’２９４（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１４
４６）を形質転換し、形質転換体をネズミＤＩ−ＩＦＲ
ｃＤＮＡ　（ＮｕｎｂｅｒｇＯｔ　ａｔ、、上掲）から
のｃＤ　Ｎ　Ａインリートの巧肚Ｉ−Ｂｇ１ｍ消化物で
プローブし、正しい突然変異Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒをコー
ドしている配列を右づるプラスミドを含有するコロニー
を選択りる。この断１’ｌを１）Ｒ３４２−ｔＰＡプラ
スミドに結合し、１）１ヨ　（ＩＩ〕△Ｅ　Ｒ４００を
作製した。該プラスミドはｌ）　「ｌ−ｌ　Ｅ　ｌ’＜
に類似しているがＨＢｓ八〇へコードする領域がｔＰＡ
からのｃＤＮＡ配列で防ｊチされている。

１）ＦＴＰＡＦＲ４００（ｐＥｌ−ＰＦＲ）を旧）ｆｒ
−ＣＩ−１０−ＤＵＸ　　Ｂ１１細胞及びＩ）　ＩＩ　
［ＲＣｕＯ−Ｋｌ　　（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）■１胞の
双方に１〜ランスフ］−り１〜した。グリシン、じポキ
リンブーン及びチミジンを含まない培地で・増殖して、
形質転１φされた旧）ｆｒ−細胞を選択した。１００　
ｎ　Ｍ以−１のＭ１×中での増殖により、形質転換され
たＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ■１胞を選択した。適当な選択培
地上に発生した］１］ニーを、クローン化リングで単＃
ｔ　シｌ１ｉｌ　Ｕ培地中Ｃ数世代まで増殖した。

増幅のために、コロニーから細胞を分割して５Ｘ　１０
．１０　、２．５Ｘ　４０”、　５ｘ　１０’及び１０
’ｎＭのＭＴＸを含む培地に入れ、この操作を数回繰返
した。

極めて低い細胞密度（ｉｏ２−１０’細胞／ブレー１−
　）で細胞を＋ＯｃｍＱ）１１１１にプレートし、得ら
れたコロニーを単離した１゜ ｐＥ−ｒＰＥＲの構築に使用した方法と同様の方法で、
野生型Ｄ　Ｉ−ｌ　Ｆ　ＰをコードするＤＮＡ配列を含
むプラスミド　ｐＥＴＰＦＲを構築した。実施例Ｃ，Ｌ
　Ａに記載の如く構築づるが、Ｄ　Ｉ−ＩＦ　Ｒタンパ
ク頂転子配列の起源としてプラスミド　吐１」［Ｒの代
わりに、プラスミド　ｐＥ　３４２．１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　
、　Ｒ４００［）２２を使用した。野生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　
Ｆ　Ｒと突然変異株ＤＨＦＲとの間の１個の塩基対の相
違以外はプラスミド　ｐＥ３４２．ＨＢＶ、　Ｒ４００
，［）２２はｐＥ　ＨＥＲと同様である。これはｐＦＲ
４００の代わりにｐＦＤｌｌを用いて　ｐＥｌ−ＩＥＲ
と同様に構築し得る。

従って、得られるプラスミドＤ［Ｅｌ−ＰＦＲは全ての
点でｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒど類似しくいるが、突然変異
Ｄ　ｌ−Ｉ　Ｆ　ＲをコートづるＤＮＡ配り１１の代わ
りに、野生型Ｄ　ＨＦ　ＲをコードするＤ　Ｎ△配列か
含まれ（いる。

１］ＦＴＰＡＰＲ４００（ｐ［Ｅ丁１）１−Ｒ）を旧）
ｆ１゛−及びＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲＣＨＯ細胞の双方に前
記のように１−ランスフエクトした。グリシン、じポ１
リンデン及びチミジンを含まない培地（・・旧）ｆｒ−
細胞ｆ、ＭＴＸでＣ）−１０−Ｋ　１細胞を選択し、ク
ローニンクリングを用いてコロニーを単離し、選択中で
数世代まで増殖した。増幅のために、コ１−に一から細
胞を分割して５ｘ　１０．１０　、２．！ｉＸ　１０　
、５ｘ　１０　　及び１０　ｎＭのＭ　Ｔ−Ｘを含む培
地に入れ、この操イ′１を数回繰返した。極めて低い細
胞密度（＋０２−１０’細胞／プレート）で細胞を１０
０Ｉｎの皿にプレー１〜し、得られたコＩ」ニーを通常
のように単離した。

１〜ランスフエクトされ増幅されたコロニー中の１’　
Ｉ）　Ａの発現は、以下のようにしてアッセイされる。

ｌ）Ｅ　Ｔ　ＰΔＥＲ４００で＋−ランスフエク１〜さ
れた細胞からの培地を繊紺素及びプラスミノーゲンを含
むアガロースプレー１〜に加える。ｔＰＡ活性を有りる
リンプルはウェルの周囲領域を速かに透明ニ（ルが、他
の場合は濁る（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、。

上掲：　Ｇ　ｒａｌｌｅｌｌｉ−ｐ　！ｐｅｒｌＴＯａ
ｎｄ　　Ｒｅｉｃｈ、　Ｊ　。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１４８：　　２２３（１９７８
）参照）。

Ｄ　Ｉ−１Ｆ　Ｒ及びｔｌ）Ａ配列の同時増幅は、増幅
されたコロニーのコンフルエントな単層から下記のｆｆ
ｌｌ　＜　Ｄ　Ｎ　Ａを単離し−Ｃアッセイする。１５
０ｍｍプレー１〜の］ンフルエン１へな中層を５０薇の
無菌ＰＢＳで洗浄し、５ｄの０．１％ＳＤＳ、０．４Ｍ
　　ＣａＣＲ２及び０．１ＭのＥＤＴＡ　（１）Ｈ８）
を添加して溶解づる。５乃至１０分後、混合物を取出し
、フェノール抽出し、り甲ロボルム抽出し、エタノール
沈澱させる。１０ｍＭ　トリス（＋１＋−１８）及び１
ｍＭのＥＤＴＡ　（ＴＥ）からなる液１７！（１５０ｍ
ｍプレー１〜当り）にＤＮＡを再懸濁とし　０．１ｍｇ
／　Ｒ＋Ｉ２よＣＲＮ　ａｓｅを添加し、溶液を３７℃
４３０分間インキＪベートする。次にＳＤＳを０．１％
まで添加し、ゾロナーゼ〈シグマ社′製フを０．５ｍｇ
／ｍｅまで添加する。３７°Ｃで３乃至１６時間インキ
コベートした後、溶液を再度フェノール抽出、り（」１
」ホルム抽出し、通常のＪ：うにエタノール沈澱さじる
。１つＮ△ペレットを０．５ｍの水に再懸濁さＶ１標準
仕様により制限酵素で消化する。約５乃至１０μｇの消
化Ｄ　Ｎ　Ａをアガロースゲル［１％のアガロースを含
む１ヘリス−酢［耐液（４０ｍＭｔ−リス、１ｍＭのＥ
　［）　−ｒ　Ａ、酢酸でｌ）Ｈ８，２に調整）］の電
気泳動にかりる（Ｃｒｏｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　
、　１３　ｉｏｌ、Ｃｈｅｌｎｏ、２旺：　７８８７　
（１９８２）参照）。ブロモフェノールブルー染料がグ
ルの長さ　２／３まで移行した後、ゲルを取出し臭化１
．　（−ジウムで染色する。紫外線でＤＮＡを児えるよ
うにし、ゲルを１−ＩＣＩ＋、Ｎａ　ＯＨ及びＮａＣＲ
−トリスで処理し、ザリ“ン法（Ｊ、ＭＯ＋。

［３ｉｏｌ、、眩：　　５０３　（１９７５）参照）に
よりゲルから二１〜に１１？ルロースフィルターに移行
さゼる。次にフィルターを、（前記の如く調製されハイ
ブリダーイスされた）　　ＩＩＦ　ｌ−Ｉ　Ｅ　Ｒの１
７００　ｂｐ比匹■断片又はＩ）ＰΔ２５［２１０の約
１９５０　ｂｐの良計■断ハがら製造されたニック翻訳
プローブとハイブリダイズさμる。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、Ｒ４００ｃ［）　Ｎ　Ａの制限地図、第１
１１図は、Ｄ　Ｈｌ−Ｒ３Ｔ　６　Ｒ４００のヌクレオ
チド配列及びＪｕｌ定されたアミノ酸配列を示す図、第
２図は、突然変異及び野生型ＤＨＦＲｃＤＮＡを比較し
て示す図、第３図は、ＤＨＦＲ発現プラスミド。 ｐＦＲ４００及びｐＦＤｌｌの構築を示１図、第４図は
、ｐＦＤｌｌ及び［１ＦＲ４００で形質転換された細胞
のＭＴＸによる増殖用害を小り図（＋１−１つ１１は野
生型Ｄ　ＨＦ　Ｒを担持し、ｐｌ−１又７Ｉ００はＩ）
ＩＩＩＴＩで３Ｔ６Ｒ４００を担持する）、第５図は、
突然変異Ｄ　）−４Ｆ　Ｒ及びＨＢＳ　Ａｇを発現Ｊる
プラスミド１）ＣＶＳＶＥＩ−１１３ＶＥ４００　　（
ＩＩＥＩ−ＩＥＲ）の誘導を示１図、第６図は、突然変
異Ｄ　Ｈｌ”　Ｉ’＜及び　ｊ　ｌ）Ａを発現するプラ
スミド１１Ｅ丁１つＡ、ｌｌ［００（ｌｌ１＝−ｒＰＥ
Ｒ）の誘導を示す図である。 代理人弁理士今　　村　　　元 Ｆｔ’ｇ６ （Ｃ１２Ｎ　　５１００ Ｃ１２Ｒ１／９１　） ０発　明　者　クリスチャン・クリントン・サイモンゼ
ン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５３１０サン・ジョゼ・パークヴ イユー・アヴエニュ１５０９ ０発　明　者　エリザベス・マクリオウド・イエールヴ
アートン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５１２９サン・ジョゼ・ダンロマ ス・ウェイ１６２４ 手続ネｒ１ｍ正書くフラ式〉 特許庁長官　若杉　和犬　殿 １、事件ノ表示　　　１１ＲＩＩ７５９年特Ｆｒｆ＃Ｍ
　７９００＠２、発明の名称　　　メトトレキｉ−ト耐
性Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒを使用り゛る３゜ 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　ジエネンテック・インコーホレイテッド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
冠　山ＩＩＩピル（郵便Ｍｌ’４１６０）　電話（０３
）、　３５４−８６２３５゜ ６゜ ７゜ 図面 ８、補１１の内容 願に関づる昭和５９狂３月１３　＋１　（＝Ｊ提出の手
続補ｉＦ山（自発）にＣ捉出致しました。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 く１）　実質的に添附の第１ｂ図に示されているような
   構造のヌクレオチド配列。 （２）　　ＩＩＩＦＲ３丁６−Ｒ４００のアミノ酸配列
   をコードしており、不純物及びイン１〜ロン配列を実質
   的に含有しないヌクレオチド配列。 （３）　　ＭＴＸにス−Ｊする結合親和力が低いＤＨＦ
   Ｒタンパクのアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列
   を含み、該ＤＮＡ配列が該アミノ酸配列を発現けじめ得
   るＤＮＡ配列に有効に結合されている発現ベクター。 （４）　真核生物宿主細胞内でＭＴＸに対゛する結合親
   和力が低いＤＨＩ−Ｒタンパクを光１．！＋！セしめ冑
   る複製可能なプラスミド。 （５）　　ＤＨＦＲタンパクがＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ｌで　
   ３’１−Ｇ−Ｒ４００であることを特徴とする特ＫＱ　
   Ｒｒｉ求の範囲第３項又は第４項に記載のブラスミ１〜
   。 （６）　プラスミドρＦＲ４００゜ （７）　真核生物細胞を特許請求の範囲第３項又は第４
   項に記載のプラスミドと混合づることからなる真核生物
   細胞の形質転換方法。 （８）　特許請求の範囲第３項又は第４項に記載のプラ
   スミドで形質転換された真核住換レルライン。 （９）　　ＭＴＸに対する結合親和ツノか低いｌ）　ｌ
   −ｉ　ＦＲ全タンパク］−１・している第−ＤＮＡ配列
   及び所望の異種タンパクをコードし−（いる第二ｒ＞　
   Ｎ　Ａ配列を含んでおり、該第−及び第二配列の各々か
   夫々のコードしＣいる配列を発現ゼしめ得るＯ　ＮＡ配
   列に有効に結合されている発現ベクター。 （１０）　　該第−及び第二ＤＮＡ配列が、双方の配列
   を発現せしめ１ｑる単−ＤＮＡ配列に有効に結合されＣ
   いることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載のベ
   クター。 （１１）　　ＤトＩＦＲタンパクがＤＨＦＲ３Ｔ６−Ｒ
   ４００であることを特徴とする特許請求の範囲第９項又
   は第１０項に記載のベクター。 （１２）　　所望の異種タンパクがＨＢＳ　Ａ！ＩＩ又
   はｔＰＡであることを特徴とする特許請求の範囲第９項
   乃至第１１項のいずれかに記載のベクター。 （１３）　　７ラスミドｐＣＶ　Ｓ　Ｖ　Ｅ　ｔ−Ｉ　
   Ｂ　Ｖ　Ｅ　４ｏｏ　Ｒ４００又はｐＥ　−ｒ　ＰＡ　
   Ｅ　Ｒ４００。 （１４）　　真核生物細胞を特許請求の範囲第９項又は
   第１０項に記載の発現ベクターと混合することからなる
   真核生物細胞の形質転換方法。 （１５）　　真核生物細胞を特許請求の範囲第３項。 第４項、第９項又は第１０項（Ｊ記載の発現ベクターと
   混合し、形質転換細胞を選択するのに有効な濃度のＭＴ
   Ｘを含有するｊ８地中ぐ該細胞を増殖さＵることからな
   るトランスフ」−り１〜された真核生物細胞の選択方法
   。 （１６）　　真核生物宿主細胞を特許請求の範囲第９項
   又は第１０項に記載のベクターと混合し、増幅濃度のＭ
   ＴＸの存在下で該細胞を増殖さけることからなる、所望
   の異種タンパクをコードしているＤＮＡ配列を真核生物
   宿主細胞培養で増幅さμるブｊ法。 （１７）　　真核生物宿主細胞を特許請求の範囲第９項
   又は第１０項に記載のベクターと混合し、増幅濃度のＭ
   　Ｔ　Ｘの存在下で該細胞を増殖さけることからなる、
   真核生物宿主細胞培養で所望のｉ　ｆｊｆｉタンパクの
   産生を増大せしめる方法。 （１８）　　特許請求の範囲第９項又は第１０項に記載
   のベクターＣ形質転換されＩζ真核細胞宿主セルカルヂ
   １７−８ （１９）　　’ｉ？ｊ”ＪＥＬ！ＪレカルチＰ−カｃＨ
   ＯＫ１　Ｆアルことを特徴とする特許請求の範囲第１４
   項に記載の方法。 （２０）　　宿主レルカルチ１７−がＣＩ−１０Ｋ　１
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載
   の方法、。 〈２１）　　宿主レルカルチャーがＣＨＯＫ　１である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の方法
   。 （２２）　　ＤＨＦＲが１］−ＩＦＲ５丁６−Ｒ４００
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載
   の方法。 （２：３）　　ＤＩ−ＩＦＲがＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ３Ｔ
   　６−Ｒ４００であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１６項に記載の方法。 ＜２４）　　ＤＨＦＲがＤＨＦＲ３Ｔ６−Ｒ４００−ｅ
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の
   方法。 （２５）　　薬剤耐性を付与するタンパクをコードして
   いるＤＮＡ配列を含んでおり、該配列が該タンパクを発
   現せしめ得るＤＮＡ配列に有効に結合されている複製可
   能な発現ベクターを洪づることを特徴とするトランスフ
   ■り１−されたを椎動物細胞の選択方法。 （２６）　　所望の異種タンパクを］−卜し−ＣいるＤ
   ＮＡ配列及び薬剤耐性を付与するタンパクをコードし−
   ＣいるＤＮＡ配列を含んでおり、各配列が各タンパクを
   発現せしめ得るＤＮＡ配列に有効に結合されている複製
   可能な発現ベクターを供づ゛ることを特徴とするトラン
   スフ１り１−されたを椎動物細胞の選択方法。 （２７）　　特許請求の範囲第１１項に記載の方法で゛
   産生される異種タンパク。 ＜２８）　　ＨＢＳＡΩ又はｔＰＡであることを特徴と
   する特８′ｌ請求の範囲第２１項に記載のタンパク。