KR20060027801A - Ｂ 세포 장애에 대한 조합 요법 - Google Patents

Ｂ 세포 장애에 대한 조합 요법 Download PDF

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퀴안 공
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Abstract

본 발명은 항-CD20 항체와 BLyS 길항제의 조합 요법을 사용하여, B 세포계 악성 종양 및 B 세포 조절된 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
항-CD20 항체, BLyS 길항제, 조합 요법, B 세포계 악성 종양, B 세포 조절된 자가면역 질환.

Description

Ｂ 세포 장애에 대한 조합 요법 {Combination Therapy for B cell Disorders}
관련 출원 참고:
본 출원은 2003년 6월 5일자로 출원된 미국 특허원 제60/476,481호, 2003년 6월 5일자로 출원된 미국 가특허원 제60/476,414호, 및 2003년 6월 6일자로 출원된 미국 가특허원 제60/476,531호의 이권을 청구하고 있다.
본 발명은 B 세포 악성 종양 뿐만 아니라 자가면역 질환을 치료하기 위한 신규한 조합 요법에 관한 것이다.
림프구의 여러 백혈구 집단 중의 하나이고; 이는 외래 항원을 특이적으로 인식하고 그에 반응한다. 3가지 주요 부류의 림프구는 B 림프구 (B 세포), T 림프구 (T 세포) 및 천연 킬러 (NK) 세포이다. B 림프구는 항체 생성에 책임이 있는 세포이고 체액성 면역을 제공해준다. B 세포는 골수 내에서 성숙하고, 세포 표면 상에 항원-결합성 항체를 발현하는 골수를 빠져 나온다. 자연 상태 그대로의 B 세포가 그의 막 결합된 항체에 대해 특이적인 항원과 처음으로 직면하게 되면, 이 세포는 신속하게 분할하기 시작하고 그의 자손은 기억 B 세포와 효과기 세포 ("혈장 세포" 로 불리운다)로 분화된다. 기억 B 세포는 수명이 더 길고 본래의 모 세포와 동일한 특이성을 지닌 막 결합된 항체를 지속적으로 발현시킨다. 혈장 세포는 막 결합된 항체를 생성시키지 않지만, 대신 이러한 항체의 분비된 형태를 생성시킨다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 효과기 분자이다.
CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원인 Bp35로 지칭되기도 함)은 B 전구(Pre-B) 및 성숙 B 림프구 상에 위치하고 분자량이 대략 35 kD인 소수성 막횡단 단백질이다 (문헌 [Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19):11282-11287 (1989); and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)] 참고). 상기 항원은 또한, 90％ 초과의 B 세포 비호지킨 림프종 [non-Hodgkin's lymphomas (NHL)] (문헌 [Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)] 참고) 상에서 발현되지만, 조혈 줄기 세포, 프로(Pro)-B 세포, 정상 혈장 세포 또는 기타 정상 조직 상에서는 발견되지 않는다 (문헌 [Tedder et al. J. Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)] 참고). CD20은 세포 주기 개시 및 분화에 대한 활성화 과정 중의 초기 단계 (들)를 조절하는 것으로 여겨지고 (문헌 [Tedder et al, 상기 참고]) 칼슘 이온 채널로서 기능하는 것으로 예상된다 (문헌 [Tedder et al. J. Cell. Biochem 14D: 195 (1990)] 참고).
CD20이 B 세포 림프종에서 발현된다고 가정하면, 이 항원은 상기 림프종을 치료하는데 유용한 치료학적 표적이 되었다. 미국 내에서는 B 세포 NHL 환자수가 300,000명을 초과하며, 매년 56,000명 이상이 새로운 NHL 환자인 것으로 진단된다. 예를 들어, 인간 CD20 항원에 대항하여 지시되고 유전공학적으로 처리한 키메라 쥐 /인간 모노클로날 항체인 리툭시맙 [rituximab (RITUXAN®)] (시판 공급처: Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.)은 재발되거나 난치성의 저등급 또는 소포성이고 CD20 양성인 B 세포 비호지킨 림프종 환자를 치료하는데 사용되고 있다. 리툭시맙은 1998년 4월 7일자로 허여된 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)에서 "C2B8"로서 지칭된 항체이다. 시험관내 작용 기전 연구 결과, 리툭산 (RITUXAN®)은 인간 보체와 결합하고, 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통하여 림프계 B 세포주를 용해시키는 것으로 입증되었다 (문헌 [Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)] 참고). 부가적으로, 이는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 알아보기 위한 검정에서 상당한 활성을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 생체내 예비임상 연구 결과, 리툭산 (RITUXAN®)이 아마도 보체 및 세포-매개형 공정을 통하여, 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)의 말초혈, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)] 참고). NHL의 치료를 위해 지시된 기타 항-CD20 항체에는 쥐 항체 Zevalin™ (이는 방사성 동위원소에 연결되어 있다), 이트륨-90 (공급처: IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), 벡사르 (Bexxar™) (이는 I-131과 접합된 또 다른 완전한 쥐 항체이다) (공급처: Corixa, WA)가 포함된다.
BLyS (BAFF, TALL-1, THANK, TNFSF13B, 또는 zTNF4로서 공지되기도 함)는 B 세포 생존과 성숙에 필수적인 TNF1 리간드 서브-계열의 구성원이다. BLyS가 트랜스제닉 마우스에서 과발현하게 되면, B 세포가 과다형성되고 중증의 자가면역 질환이 발생한다 (문헌 [Mackay, et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710; Gross, et al. (2000) Nature 404, 995-999; Khare, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3370-33752-4] 참고). BLyS 수준은 각종 자가면역 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)에 걸린 인간 환자에게서 상승한다 (문헌 [Cheema, G. S, et al., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319; Groom, J., et al, (2002) J. Clin. Invest 109, 59-68; Zhang, J., et al., (2001) J. Immunol. 166, 6-10] 참고). 더우기, BLyS 수준은 질병 중증도와 상관이 있는데, 이는 BLyS가 이들 질병의 발병 기전에 직접적인 역할을 할 수 있다는 것을 제시해준다. BLyS는 TNF 수용체 서브-계열의 3가지 구성원, 즉 TACI, BCMA, 및 BR3 (BAFF-R로서 공지되기도 함)과 결합함으로써 B 세포 상에서 작용한다 (문헌 [Gross, et al., 상기 참고; 8. Thompson, J. S., et al., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et al., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552; Yan, M., et al., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41; Schiemann, B., et al., (2001) Science 293, 2111-2114] 참고). 이들 3가지 구성원 중에서, BR3 만이 BLyS에 대해 특이적이고; 나머지 2가지 구성원은 관련 TNF 계열 구성원인 APRIL과 결합하기도 한다. BLyS와 수용체 녹아웃 (knockout) 또는 돌연변이체 마우스의 표현형을 비교한 결과, BR3을 통한 신호전달이 BLyS의 B 세포 생존 기능을 매개한다고 지시하였다 (문헌 [Thompson, et al., 상기 참고; Yan, (2002), 상기 참고; Schiemann, 상기 참고]). 이와는 달리, TACI는 억제성 수용체로서 작용하는 것으로 여겨지지만 (문헌 [Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643] 참고), BCMA의 역할은 명확치 않다 (문헌 [Schiemann, 상기 참고]).
BR3은 B 세포 표면 상에서 발현된 184-잔기 유형 III 막횡단 단백질이다 (문헌 [Thompson, et al., 상기 참고; Yan, (2002), 상기 참고]). 세포내 영역은 공지된 구조 도메인 또는 단백질-단백질 상호작용 모티프와의 서열 유사성을 전혀 지니고 있지 않다. 그럼에도 불구하고, BR3을 통한 BLyS-유도된 신호전달로 인해, 전사 인자 NF-B2/p100이 p52로 프로세싱된다 (문헌 [Claudio, E, et al., (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965; Kayagaki, N., et al., (2002) Immunity 10, 515-524] 참고). BR3의 세포외 도메인 (ECD)에 관한 의견 역시 다양하다. TNFR 계열 구성원은 통상적으로, 그들의 세포외 영역 내에 다수의 시스테인-풍부 도메인 (CRDs)이 존재하는 것을 특징으로 하며; 각 CRD는 전형적으로, 3개의 디설파이드 결합 내에 6개의 시스테인에 의해 안정화된 대략 40개 잔기로 구성된다. 이러한 계열의 종래의 구성원은 리간드 표면 상의 2가지 별개의 패치와 상호작용하는 2개의 CRDs을 통하여 리간드와 접촉한다 (문헌 [Bodmer, J.-L., et al., (2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26] 참고). 그러나, BR3 ECD는 기껏해야 부분 CRD를 형성할 수 있는 4개의 시스테인 잔기 만을 함유하기 때문에, 이러한 작은 수용체가 어떠한 방식으로 고 친화성 리간드 결합을 제공해줄 수 있는지에 관한 의문이 제기된다.
기존에, BR3의 BLyS-결합성 도메인이 26-잔기 코어 영역 내에 정주하고 있다는 사실이 밝혀진 바 있다 (문헌 [Kayagaki, et al., 상기 참고]). 6개의 BR3 잔기가 β-헤어핀 펩티드 내에서 구조형성된 경우 (bhpBR3), 이들은 BLyS 결합을 부여해주고 BR3-매개된 신호전달을 차단시키기에 충분하였다. BLyS와 상호작용하도 록 의도한 폴리펩티드가 기타 문헌에 보고되었다 [참고: 예를 들어, WO 02/24909, WO 03/035846, WO 02/16312, W0 02/02641].
발명의 요약
본 발명은 세포 혼합 집단을 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 혼합 집단으로부터 B 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, B 세포를 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체와 접촉시킴으로써, 세포 혼합 집단으로부터 B 세포를 효과적이고도 선택적으로 고갈시키기 위한 시험관내 검정에 상업적으로 유용하다. 전술된 B 세포 고갈 방법의 또 다른 국면은 특정의 B 세포 서브세트, 예를 들면, 배중심 B 세포 및 연변층 B 세포를 특이적으로 고갈시키는 것이다. 구체적 양태에서는, 배중심 B 세포가 비장 및 파이어판 (Peyer's patch) 내에 존재한다. 본 발명의 또 다른 국면은 B 세포를 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체와 접촉시킴으로써 시험관내 또는 생체 내에서 모든 B 세포 서브세트를 고갈시키는 방법이다.
본 발명은 또한, 모든 B 세포 집단을 고갈시키는데 유효한 양의 BLyS 길항제 및 항-CD20 항체를 포유동물에게 투여함으로써, 비장 내의 모든 B 세포 집단을 고갈시키는 방법을 제공한다. 구체적 양태에서, 상기 방법은 비장, 림프절 및 파이어판에서 연변층 및 배중심 B 세포를 고갈시키는데 유효하다.
신생물(종양) 또는 악성 종양으로 고통받고 있는 환자에게, 치료상 유효량의 CD20 결합 항체 및 치료상 유효량의 BLyS 길항제를 투여하는 것을 포함하는, CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양을 치료하는 방 법이 또한 본 발명에 제공된다. 한 양태에서는, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 동시에 투여한다. 상이한 양태에서는, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 순차적으로 투여한다. 구체적 양태에서는, BLyS 길항제를 투여한 후에 CD20 결합 항체를 투여한다. 특정 양태에서는, B 세포 신생물이 비호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 림프구 우위형 호지킨병 (LPHD), 소포 중심 세포 (FCC) 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병이다. 이러한 치료 방법에서는, BR3-Fc와 리툭산을 "투약" 섹션 하에 기재된 투여량으로 투여한다. 기타 양태에서는, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체를 화학요법과 연계해서 투여한다.
본 발명의 또 다른 국면은 B-세포 조절된 자가면역 질환으로 고통받는 환자에게, 치료상 유효량의 CD20 결합 항체 및 치료상 유효량의 BLyS 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 B-세포 조절된 자가면역 질환을 완화시키는 방법이다. 한 양태에서는, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년성 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병 (Wegener's disease), 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 자가면역 질환이 류마티스성 관절염 또는 전신성 홍반성 루푸스인 경우, 한 양태에서는 BLyS 길항제와 CD20 결합 항체를, 비스테로이드성 소염 약물 (NSAIDs), 글루코코르티코이드, 프레드니손 및 질병 완화 항류마티스약 (DMARD) 중에서 선택된 약물을 이용하는 요법과 연계해서 투여한다.
CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 환자에게 투여하여, 특정 질환을 치료 또는 완화시키는 방법에서는, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 동시에 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있다. 구체적인 양태에서는, BLyS 길항제를 투여한 후에 CD20 결합 항체를 투여한다.
CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
CD20 결합 항체; BLyS 길항제; 및 해당 조성물이 B 세포 신생물 또는 B 세포 조절된 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이란 사실을 지시해주는 라벨을 포함하는 제품이 본원에 추가로 제공된다.
본 발명의 방법, 조성물 및 제품의 모든 양태에서, 항-CD20 항체에는 키메라 및 인간화 항체가 포함된다. 항-CD20 항체의 구체적 양태에는 리툭시맙 (RITUXAN®), m2H7 (쥐 2H7), hu2H7 (인간화 2H7), 및 아미노산 서열을 갖는 그의 모든 기능적 변이체, hu2H7.v16 (v는 버전을 나타낸다), v31, v96, v114, v115가 포함된다. 본래의 hu2H7.v16은 서열 15의 성숙 L 쇄 서열과 서열 16의 H 쇄를 갖는다.
본 발명의 방법, 조성물 및 제품의 모든 양태에서, BLyS 길항제가 한 양태에서 면역부착인자(immunoadhesin)이다. 구체적 양태에서는, 면역부착인자가 BR3의 세포외 도메인을 포함하는 BR3 면역부착인자, TACI의 세포외 도메인을 포함하는 TACI 면역부착인자, 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 BCMA 면역부착인자로 이루어진 군 중에서 선택된다. 기타 양태에서는, BLyS 길항제가 항-BLyS 항체, 특히 잔기 162-275를 포함하는 BLyS의 영역 내에서 BLyS와 결합하는 항-BLyS 항체이다. 또 다른 양태에서는, BLyS 길항제가 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 영역 내에서 BR3과 결합하는 것을 포함한 항-BR3 항체이다. 청구의 범위에 지칭된 인간 BR3의 아미노산 위치는 "BR3" 정의 하에 본원에 기재된 인간 BR3 또는 대체 인간 BR3 하에 넘버링한 서열에 따른다.
구체적 양태에서는, BLyS 길항제가 ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), 또는 ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열을 갖는 17량체 폴리펩티드 뿐만 아니라 이들 17량체의 PEG화 형태;
Figure 112005070833033-PCT00001
(서열 10)의 서열을 갖는 폴리펩티드;
Figure 112005070833033-PCT00002
(서열 2)의 서열을 갖는 hBR3-Fc 면역부착인자
로 이루어진 군 중에서 선택된다.
전술된 본 발명의 방법 모두에 있어 한 양태에서는, BLyS 길항제와 항-CD20 항체가 상승적으로 작용하여 B 세포를 고갈시킨다.
도 1A-1B는 본래의 서열 인간 TACI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 _) 및 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 2는 본래의 서열 인간 BCMA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 _) 및 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 3은 본래의 서열 인간 BLyS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 _) 및 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 4A-4B는 본래의 서열 인간 APRIL를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 _) 및 그의 추정상의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 5A는 본래의 서열 인간 TACIs을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (출발 및 정지 코돈은 밑줄쳐져 있다) (서열 _)을 도시한 것이고; 도 5B는 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 6A는 본래의 서열 인간 BR3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (출발 및 정지 코돈은 밑줄쳐져 있다) (서열 _)을 도시한 것이고; 도 6B는 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이며; 도 6C는 쥐 BR3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (출발 및 정지 코돈은 밑줄쳐져 있다) (서열 _)을 도시한 것이고; 도 9A는 그의 아미노산 서열 (서열 _)을 도시한 것이다.
도 7A-7B는 "PRO"로 명명된 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 명명된 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (％)을 산정하기 위한 예시 방법을 도시한 것이다. 본 발명의 목적상, "PRO" 서열은 본원의 도면에 지칭된 TACI, BCMA, TALL-1, APRIL, TACIs, 또는 BR3 서열일 수 있다.
도 8은 스플라이싱된 변이체인 것으로 여겨지는 "hTACI (265)" (서열 _), 및 도 1A-lB에 지칭되기도 한 "hTACI" (서열 _)로서 지칭되는, TACI 수용체에 대한 두 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 것이다.
도 9는 문자로써 지시된 동일한 아미노산과, 아래 플러스 부호로써 지시된 보존된 아미노산을 수반하는 인간 BR3 (서열 _)과 쥐 BR3 (서열 _)의 서열 정렬을 나타낸 것이다.
도 10은 예측된 막횡단 영역 (박스 안에 있음)과 세포외 영역 (밑줄쳐져 있음)을 보여주는 인간 CD20의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 잠재적 도메인은 다음과 같다: 1-63: 세포질; 64-84: 막횡단; 85-105: 막횡단; 106-120: 세포질; 121-141: 막횡단; 142-188: 세포외; 189-209: 막횡단; 210-297: 세포질; 81-167: 디설파이드 결합.
도 11은 인간 CD20에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 12는 쥐 2H7의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열 (서열 _), 인간화 2H7 v16 변이체의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열 (서열 _), 및 인간 카파 경쇄 아군 I의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열 (서열 _)을 비교하는 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 VL의 CDRs은 다음과 같다: CDR1 (서열 _), CDR2 (서열 _), 및 CDR3 (서열 _).
도 13은 쥐 2H7의 VH 서열 (서열 _), 인간화 2H7 vl6 변이체의 VH 서열 (서열 _), 및 인간 중쇄 아군 III의 컨센서스 서열 (서열 _)을 비교한 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 VH의 CDRs은 다음과 같다: CDR1 (서열 _), CDR2 (서열 _), 및 CDR3 (서열 _).
도 12 및 13에서, 각 쇄 중의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 지시된 바와 같이, 골격 영역 FR1-FR4에 의해 플랭킹된, 각 괄호([]) 안에 봉입되어 있다. 서열 두줄 사이에 표시된 별표는 두 서열 간에 상이한 위치를 지시해준다. 잔기 넘버링은 다음 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르고, a, b, c, d, 및 e로서 표시된 삽입물을 갖는다.
도 14는 hCD20 BAC Tg+ 마우스의 마우스 B220+ 세포 (B 세포)에서의 인간 CD20 트랜스진 발현을 도시한 것이다.
도 15는 B 세포 성숙 동안 hCD20 BAC Tg 마우스에서의 인간 CD20의 발현을 도시한 것이다. 도 15-19에서, 레드 라인은 트랜스진 음성 (Tg-) 한배 새끼 (littermate)로부터의 세포를 항-hCD20 mAb로 염색시킨 음성 대조군을 나타낸다. 그린 라인은 Tg+ 마우스에서 인간 CD20에 대한 염색을 나타낸다. Tg+ 마우스는 hC20 BAC 트랜스제닉 마우스를 지칭한다.
도 16은 Tg+ 마우스 골수 중에서 상이한 성숙/분화기의 B 세포 (성숙, B 전구 및 미성숙 B, 프로-B 및 기원 B 세포)에서의 인간 CD20의 발현을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다.
도 17은 Tg+ 마우스 비장 B 세포에서의 인간 CD20의 발현을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 세포를 B220+ 상에 게이팅시켜 B 세포를 수득하였다. IgM 및 CD21은 T2/소포, 연변층 및 Tl의 각종 B 세포 서브세트로의 윤곽 묘사를 허용해준다.
도 18은 Tg+ 마우스 장간막 림프절 (LN)에서의 인간 CD20의 발현을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다.
도 19는 Tg+ 마우스 파이어판에서의 인간 CD20의 발현을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 세포를 B220+에 대해 게이팅시켰다. CD38 마커는 성숙 세포를 배중심 B 세포와 구별시켜 준다.
도 20은 인간 CD20 Tg+ 마우스에서 항-hCD20 mAb의 효과에 대한 연구를 요약한 것이다. 0일째에, 마우스에게 l.O mg [50 mg/kg에 등가임] 항-CD20 항체를 주사하고 (수평으로 그은 선 위의 블랙 화살표), 수평으로 그은 선 아래의 레드 화살표로써 지시된 일수에서 세포를 분석하였다. FACS 분석은 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어판 상에서 수행하였다. 항-hCD20 mAb의 혈청 수준을 모니터링하였다.
도 21은 항-hCD20 mAb를 이용한 말초혈 B 세포의 고갈을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 좌측 패널은 IgG 대조군, 즉 비-특이적, 이소형 매칭된 항체로 처리된 동물을 나타낸다.
도 22는 우측 패널에서 항-hCD20 mAb에 의한 성숙 말초 LN B 세포의 고갈을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 좌측 패널은 IgG 대조군, 즉 비-특이적, 이소형 매칭된 항체로 처리된 동물을 나타낸다. CD21+CD23+이 모든 B 세포에 대해 게이팅된다.
도 23은 항-hCD20 mAb에 의해 비장 T2 B 세포는 고갈시키지만, 연변층 B 세포는 고갈시키지 않는다는 것을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다.
도 24는 항-hCD20 mAb에 의해 재순환 성숙 B 세포는 고갈시키지만, 미성숙/B 전구 또는 프로-B 세포는 고갈시키지 않는다는 것을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 레드는 IgG-처리된 마우스를 나타내는 반면, 그린은 hCD20을 발현하는 항-hCD20 mAb 처리된 마우스를 나타낸다. IgG 처리된 마우스 (레드)는 성숙 B 세포를 발현하는 hCD20을 보유하고 있는 반면, 항-hCD20 mAb는 hCD20 보유 세포를 고갈시켰다. 결합되지 않은 CD20과 Ab-결합된 CD20 둘 다를 검출하기 위해 인간 CD20 발현을 모니터링하였다.
도 25는 항-hCD20 mAbs에 대한 파이어판 배중심 B 세포의 내성을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 좌측 패널은 대조군 IgG 처리된 마우스로부터의 세포를 나타낸다. 우측 패널은 항-CD20 mAb 처리된 Tg+ 마우스로부터의 세포를 나타낸다.
도 26은 Tg+ 마우스를 항-CD20 mAb로 처리한 후에 말초혈 중에서의 B 세포의 고갈 및 회수를 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 상부 열 (row) 패널은 대조군 mAb 처리된 마우스로부터의 세포를 염색한 것이다. 1일째에, 마우스에게 항체를 투여하였다. 시간이 지남에 따라, hCD20을 발현하지 않는 전구체 B 세포는 CD20+ 성숙 B 세포로 진화 (발달)된다 (6주 및 14주째의 염색 참고).
도 27은 단기간 (단일 주사) 항-CD20 mAb 처리에 대한 비장 배중심 B 세포 의 내성을 입증해 주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 배중심 형성을 유도하기 위해 양 (sheep) 적혈구 면역시킨 후 8일째에, 마우스 한 무리를 인간 CD20에 대한 m2H7 mAb로 처리하였다. 대조군 마우스 세트는 mIgG2a 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 이러한 마우스로부터의 비장 세포를 12일째에 분석하였다. PNA (땅콩 아글루티닌)은 배중심을 염색한다. 항-CD20 처리를 이용해서는 배중심 B 세포의 고갈이 전혀 탐지되지 않았다.
도 28은 비-고갈 연변층 (MZ)과 B1 B 세포가 T-독립성 항원에 대한 보호를 부여해준다는 것을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 우측 3개의 패널 중에서, 비장 세포는 스트렙토코쿠스 (streptococcus) 다당류-포스파티딜 콜린 (TI 항원)에 대해 염색하였다. CD138은 혈장 세포에 대한 마커이다.
도 29는 실시예 4에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 BLyS 길항제, BR3-Fc, 및 항-CD20 mAb, m2H7의 조합 처리의 상이한 생물학적 효과를 도시한 것이다. FACS 분석은 비장, 혈액, 림프절 B 세포 (CD21+CD23+ 상에 게이팅됨) 상에서 수행하였다. 이러한 조합 요법은 비장 내의 B 세포, 특히 연변층, T2 및 소포 B 세포를 고갈시키는데 있어 명백한 상승적 효과를 가져다 주었다.
도 30은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 인간 CD20 Tg+ 마우스 중에서 B 세포 고갈에 대한 항-hCD20 mAb와 BR3-Fc의 조합물의 상승적 효과를 도시한 것이다. 마우스를 대조군 IgG2a, BAFFR/BR3-Fc (12일 동안 마우스당 100 ㎍을 매일 복강내 투여함), 항-hCD20 mAb (9일째에 마우스당 100 ㎍을 복강내 투여함), 또는 BAFFR/BR3-Fc와 항-hCD20 mAb의 조합물 (단일 처리군과 동일하게 투약함)로 처리하였다. 13일째에 B220+ 비장 세포를 분리시키고, CD21 및 CD23에 대해 염색하였다. 한 무리당 5 마리 마우스.
도 31은 마우스를 단일 용량의 0.1 mg 대조군 IgG2a, BAFF/BR3-Fc 또는 항-hCD20 mAb으로 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 4 및 도 30에 기재된 바와 같이 hCD20 Tg+ 마우스로부터 B220+ 총 비장 B 세포 (MZ + FO + Tl + T2의 모든 서브세트), 연변층 (MZ) 및 소포 (FO) B 세포를 고갈시킨 것을 정량화한 것이다. 4일째에 비장 세포를 분석하였다. 한 무리당 5 마리 마우스.
도 32A-C는 고 친화성 BLyS 결합을 위해 파아지 디스플레이 라이브러리 중에서 선택된 17량체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
항-CD20 MAb 처리가 특정의 B 세포 서브세트를 고갈시키긴 하지만, 본 발명자들은 연변층 B 세포, 배중심 B 세포 및 혈장 세포가 보존된다는 것을 이미 관찰하였다. 이와는 대조적으로, BR3-Fc로 B 세포 생존 신호를 봉쇄하는 것 또한 B 세포를 고갈시키거나 또는 B 세포 수를 조정시키지만, 상이한 정도로 조정시켜 준다. BR3은 모든 B 세포의 생존에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 본원에 기재된 실험 결과로부터, 항-CD20 항체를 BLyS 길항제와 조합하여 투여하면 놀랍게도, 생체 내에서 B 세포를 고갈시키는데 있어 상승적 결과가 유발되었다는 사실이 밝혀졌다. BLyS 경로에 대항하여 지시된 요법과 항-CD20 항체를 조합하는 것이, B 세포계 악성 종양 및 B 세포 조절된 자가면역 질환을 포함한 B 세포-매개된 질환을 치료하기 위한 신규한 방법을 제공해준다. 항-CD20 항체와 BLyS 길항제의 조합 요법이 특정 질환, 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 소 림프구성 림프종 (SLL)에 대한 기존의 치료법에 비해 보다 효과적이면서 독성이 덜한 대체 방안을 부여해줄 수 있다.
본원에서의 "자가면역 질환"은 개개인 자신 (자가) 항원 및/또는 조직으로부터 유발되어 자신의 항원 및/또는 조직에 대항하여 지시된 비-악성 질환이다.
본원에 사용된 바와 같은 "B 세포 고갈"은 약물 또는 항체 처리 후 동물 또는 인간에게서의 B 세포 수준이 처리 전의 수준에 비해 저하되는 것을 지칭한다. B 세포 수준은 널리 공지된 검정, 예를 들어 완전한 혈액 계수치를 얻고, 공지된 B 세포 마커에 대한 FACS 분석 염색을 수행하고, 실험 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의해 측정 가능하다. B 세포 고갈은 부분적이거나 전체적일 수 있다. 한 양태에서는, CD20 발현성 B 세포의 고갈이 25％ 이상이다. B 세포를 고갈시키는 약물을 투여한 환자에게서는, B 세포가 일반적으로, 약물이 환자의 체내에서 순환하는 시간과 B 세포를 회수하는 시간 동안 고갈된다.
"CD20" 항원은 말초혈 또는 림프 기관으로부터 B 세포의 90％ 초과의 표면 상에서 발견되는, 분자량이 대략 35 kD인 비-당화 (non-glycosylated) 막횡단 인단백질이다. CD20은 초기 B 전구 세포 발생 동안 발현되고 혈장 세포 분화 때까지 유지되며; 인간 줄기 세포, 림프계 기원 세포 또는 정상 혈장 세포 상에서는 발견되지 않는다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포 상에도 제시된다. 당해 문헌에 보고된 CD20에 대한 다른 명칭에는 "B-림프구 제한된 분화 항원" 및 "Bp35"가 포함된다. CD20 항원은, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149 (1989) and Valentine et al.J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989)].
CD20 결합 항체 및 항-CD20 항체는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며; 이러한 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 있어서 치료제로서 유용하고 다음에 기재된 검정에서 기타 단백질, 예를 들면 음성 대조군과 상당히 교차 반응하지 않도록 하기에 충분한 친화성으로 CD20과 결합하는 모든 항체를 포괄한다. 항체의 하나의 암(arm)이 CD20과 결합하는 이중-특이적 (bispecific) 항체가 또한 고려된다. CD20 결합 항체의 정의에는 또한, 이러한 항체의 기능적 단편이 포괄된다. CD20 결합 항체는 CD20과 <lO nM의 Kd로 결합할 것이다. 바람직한 양태에서는, 상기 결합도가 < 7.5 nM, 보다 바람직하게는 < 5 nM, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5 nM, 가장 바람직하게는 < 1 nM의 Kd이다.
CD20 항원과 결합하는 항체의 예에는 현재 "리툭시맙"("RITUXAN®")으로 불리우는 "C2B8" [참고: 미국 특허 제5,736,137호, 이는 본원에 참고로 도입된다]; "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab Tiuxetan)" ZEVALIN®로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체 [참고: 미국 특허 제5,736,137호, 이는 본원에 참고로 도입된다]; "131I-B1" 항체 (요오드 I131 토시투모맙(tositumomab), BEXXAR™)를 생성시키기 위해 131I로 임의로 표지시킨 쥐 IgG2a "B1" [또한, "토시투모맙" (Beckman Coulter)으로 불리우기도 함] [참고: 미국 특허 제5,595,721호, 이는 본원에 참고로 도입된다]; 쥐 모노클로날 항체 "1F5" (문헌 [Press et al. Blood 69 (2): 584-591 (1987)] 참고) 및 그의 변이체 (이에는 "골격 패치되거나" 또는 인간화 1F5가 포함된다) [참고: W0 03/002607, Leung, S.]; ATCC 수탁번호 HB-96450; 쥐 2H7 및 키메라 2H7 항체 [참고: 미국 특허 제5,677,180호, 이는 본원에 참고로 도입된다]; 인간화 2H7; huMax-CD20 (공급처: Genmab, Denmark); AME-133 (공급처: Applied Molecular Evolution); A20 항체 또는 그의 변이체, 예를 들면, 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, hA20) [참고: US 2003/0219433, Immunomedics); 및 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (International Leukocyte Typing Workshop로부터 입수 가능함; 문헌 [Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))] 참고)이 포함된다.
본원에서의 용어 "리툭시맙" 또는 "리툭산 (RITUXAN®)"은 CD20 항원에 대항하여 지시되고 미국 특허 제5,736,137호 (이 문헌은 본원에 참고로 도입된다)에서 "C2B8"로 명명된, 유전공학적으로 처리한 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체, 및 CD20과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 그의 단편을 지칭한다.
구체적 양태에서는, 항-CD20 항체가 인간 및 영장류 CD20와 결합한다. 구체적 양태에서는, CD20와 결합하는 항체가 인간화 또는 키메라 항체이다. CD20 결합 항체에는 리툭시맙 (RITUXAN®), m2H7 (쥐 2H7), hu2H7 (인간화 2H7) 및 그의 모든 기능적 변이체 [이에는 hu2H7.v16 (v는 버전을 의미한다), v31, v73, v75가 포함된다] 뿐만 아니라 푸코스 결핍성 변이체가 포함된다. 몇몇 hu2H7 변이체 항체의 서열이 다음에 제공되며, 진하게 표시된 N-말단 서열은 리더 서열인데, 이는 성숙한 폴리펩티드에서 제거된다:
hu2H7.v16 L 쇄 [232 aa] (서열 3)
Figure 112005070833033-PCT00003
hu2H7.v16 H 쇄 [471 aa] (서열 4)
Figure 112005070833033-PCT00004
hu2H7.v31 H 쇄 [471 aa] 서열 11:
Figure 112005070833033-PCT00005
v31의 L 쇄는 상기 v16의 L 쇄, 즉 서열 3과 동일하다.
본 발명의 목적상, "인간화 2H7v.16"은
가변 경쇄 서열:
Figure 112005070833033-PCT00006
(서열 13); 및
가변 중쇄 서열:
Figure 112005070833033-PCT00007
(서열 14)
를 포함하는, 본래의 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 여기서, 인간화 2H7.v16 항체는 본래의 항체이고, 이는 바람직하게는,
v16 경쇄 아미노산 서열:
Figure 112005070833033-PCT00008
(서열 15); 및
v16 중쇄 아미노산 서열:
Figure 112005070833033-PCT00009
(서열 16)
을 포함한다.
버전 16에 기초한 기타 모든 변이체의 V 영역은 다음 표에 지시되어 있는 아미노산 치환 위치를 제외하고는, v16의 아미노산 서열을 가질 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 2H7 변이체는 v16과 동일한 L 쇄를 가질 것이다.
2H7 버전 중쇄 (VH) 변화 경쇄 (VL) 변화 Fc 변화
31 - - S298A, E333A, K334A (서열 17)
96 D56A, N100A S92A (서열 18)
114 D56A, N100A M32L,S92A (서열 19) S298A, E333A, K334A (서열 20)
115 D56A, N100A M32L,S92A (서열 21) S298A, E333A, K334A, E356D, M358L (서열 22)
전술한 인간화 2H7 mAb의 변이체는 상기 서열 15와 동일한 L 쇄 서열을 갖고 H 쇄 아미노산이 다음과 같은 2H7v.31이다:
Figure 112005070833033-PCT00010
(서열 17).
쥐 항-인간 CD20 항체인 m2H7은
VH 서열:
Figure 112005070833033-PCT00011
(서열 23); 및
VL 서열:
Figure 112005070833033-PCT00012
(서열 24)
을 갖는다. 달리 지시되지 않는 한, 인간화 2H7v.16 및 그의 변이체의 본원에 기재된 서열은 성숙한 폴리펩티드, 즉 리더 서열을 갖지 않는 서열이다.
CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개공보에는 다음이 포함된다: 미국 특허 제5,776,456호, 제5,736,137호, 제5,843,439호, 제6,399,061호 및 제6,682,734호 뿐만 아니라 미국 특허원 US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson et al); 미국 특허 제6,455,043B1호 및 WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky et al.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter and White); WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); US 2001/0018041A1, US 2003/0180292A1, WO 01/34194 (Hanna and Hariharan); 미국 특허원 US 2002/0006404 및 W0 02/04021 (Hanna and Hariharan); 미국 특허원 US 2002/0012665 A1 및 WO 01/74388 (Hanna, N.); 미국 특허원 US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); 미국 특허원 US 2003/0103971 A1 (Hariharan and Hanna); 미국 특허원 US 2002/0009444A1, 및 WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.); 미국 특허원 US 2002/0128488A1 및 W0 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky et al.); W02/096948 (Braslawsky et al.); WO 02/079255 (Reff and Davies); 미국 특허 제6,171,586B1호, 및 WO 98/56418 (Lam et al.); W0 98/58964 (Raju, S.); W0 99/22764 (Raju, S. ); W0 99/51642, 미국 특허 제6,194,551B1호, 미국 특허 제6,242,195B1호, 미국 특허 제6,528,624B1호 및 미국 특허 제6,538,124호 (Idusogie et al.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd et al.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez et al.); 미국 특허원 US 2002/0004587A1 및 WO 01/77342 (Miller and Presta); 미국 특허원 US 2002/0197256 (Grewal, I.); 미국 특허원 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); 미국 특허 제6,565,827B1호, 제6,090,365B1호, 제6,287,537B1호, 제6,015,542호, 제5,843,398호 및 제5,595,721호, (Kaminski et al.); 미국 특허 제5,500,362호, 제5,677,180호, 제5,721,108호, 제6,120,767호, 제6,652,852B1호 (Robinson et al.); 미국 특허 제6,410,391B1호 (Raubitschek et al); 미국 특허 제6,224,866B1호 및 WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg); 미국 특허원 US 2003/0133930 A1 및 WO 00/74718 (Goldenberg and Hansen); WO 00/76542 (Golay et al.); WO 01/72333 (Wolin and Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596B1호 (Ghetie et al.); 미국 특허 제6,306,393호 및 미국 특허원 US 2002/0041847 A1 (Goldenberg, D.); 미국 특허원 US 2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann); W0 02/102312 (Engleman, E.); 미국 특허원 2003/0068664 (Albitar et al.); W0 03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694, US 2002/0009427A1, 및 US 2003/0185796 A1 (Wolin et al.); W0 03/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen et al.); US 2003/0219433 A1 및 WO 03/068821 (Hansen et al.); US 2003/0219818A1 (Bohen et al.); US 2002/0136719A1 (Shenoy et al.); W0 2004/032828 (Wahl et al.) (이들 문헌 각각이 본원에 참고로 도입된다]. 또한, 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 특허원 제330,191호 (Seed et al.); 미국 특허 제4,861,579호 및 EP 332,865A2 (Meyer and Weiss); USP 4,861,579 (Meyer et al.); W0 95/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 A1 (Hansen et al.)을 참고할 수 있다.
CD20 항체는 있는 그대로의 (노출된) 항체(naked antibody) 또는 세포독성 화합물, 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 독소와 접합된 항체일 수 있다. 이러한 항체에는 방사성 동위원소에 연결되어 있는 항체 제발린 (Zevalin™), 이트륨-90 (공급처: IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), 및 I-131에 접합되는 Bexxar™ (공급처: Corixa, WA)가 포함된다. 인간화 2H7 변이체에는 FR에서 아미노산 치환을 갖는 변이체, 및 그래프트된 CDRs 상의 변화를 수반한 친화 돌연변이 변이체가 포함된다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여자 또는 수용체 항체에 존재하는 것으로만 제한되지 않는다. 기타 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 증강된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및 B-세포 사멸 (본원에서 B-세포 고갈로서 지칭되기도 함)을 포함한 효과기 기능을 개선시켜 주는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기 변화를 추가로 포함한다. 특히, CDC 및 ADCC 활성을 개선시키기 위한 3가지 돌연변이물이 확인되었고: S298A/E333A/K334A (본원에서 삼중 Ala 돌연변이체 또는 변이체로서 지칭되기도 함); Fc 영역에서의 넘버링은 문헌 [Idusogie et al., 상기 참고 (2001); Shields et al.]에 기재된 바와 같이 EU 넘버링 시스템을 따른다 (문헌 [Kabat et al., 상기 참고]).
본 발명의 기타 항-CD20 항체에는 안정성을 개선시켜 주는 특이적 변화를 갖는 항체가 포함된다. 한 양태에서, 키메라 항-CD20 항체는 쥐 V 영역과 인간 C 영역을 갖는다. 특이적 키메라 항-CD20 항체 중의 하나가 리툭산 (Rituxan®) (Rituximab®; Genentech, Inc.)이다. 리툭시맙 및 hu2H7은 보체-의존성 세포독성 (CDC)과 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 둘 다를 통하여 B 세포의 용해를 매개할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열과 증가되거나 감소된 Clq 결합 능력을 지니고 있는 항체 변이체는 미국 특허 제6,194,551B1호 및 W0 99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허공보의 내용은 구체적으로 본원에 참고로 도입된다 (또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 참고).
문헌 [참고: WO 00/42072 (Presta)]에는 FcRs에 대한 결합이 개선되었거나 저하된 폴리펩티드 변이체가 기재되어 있다 (상기 특허 공개공보의 내용은 구체적으로 본원에 참고로 도입된다] (또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001)] 참고).
IgG 내의 N-당화 부위는 CH2 도메인 중의 Asn297이다. Fc 영역을 갖는 인간화 CD20-결합 항체가 본원에 포괄되는데, 여기서 조성물 중의 항체의 약 80 내지 100％ (바람직하게는, 약 90 내지 99％)가 당단백질의 Fc 영역에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙한 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 이러한 항체는 인간 IgG와 상호작용하는데 있어서 FcγRIIIA (V158) 만큼 유효하지 않는 FcγRIIIA (F158)와의 결합에 있어 개선을 나타낸다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는, 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 폴리에피토프성 특이성을 지닌 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체의 단편을 포괄한다. 몇 가지 양태에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드를, 예를 들어 가변 영역 또는 CDR 중에서 항체 골격과 융합시켜, 항체가 결합하여 BR3에 대한 BLyS 결합 또는 BLyS 신호전달을 억제할 수 있도록 한다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 항체는 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 항체는 항체 단편일 수 있다. 상기 항체 및 이의 제조 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 항체는 동물을 본 발명의 폴리펩티드로 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하여 지시된 항체가 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하는데, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체는, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연의 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 지시된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 지시된다. 이들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 지시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 (문헌 [미국 특허 제4,816,567호] 참고)에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 상기 쇄 (들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 상기 항체의 단편이 포함된다 (문헌 [미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)] 참고). 키메라 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 쥐) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 기타 항원 결합 아서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체에서 발견되지 않거나 이입된 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키고 최대화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이지만, 이러한 FR 영역은 결합 친화성을 개선시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서의 이들 아미노산 치환 수는 전형적으로, H 쇄에서는 6 이하이고 L 쇄에서는 3 이하이다. 인간화 항체는 최적으로는, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체에는 PRIMATIZED® 항체가 포함되는데, 여기서는 항체의 항원 결합 영역이, 예를 들어 짧은꼬리 원숭이 (macaque monkeys)를 관심있는 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된다. 인간화 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수도 있다 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol.Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)] 참고). 다음 문헌에 기재된 기술 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].
본 발명의 CD20 결합 항체의 "기능적 단편"은 이들을 유도시킨 본래의 완전한 쇄 분자와 실질적으로 동일한 친화성을 지니면서 CD20에 대한 결합을 유지하고 있고, 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 측정된 바와 같이 B 세포를 고갈시킬 수 있는 단편이다. 항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (본래의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하는데, 이는 항체 이소형에 따라서 다양하다. 항체 효과기 기능의 예에는 Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정의 세포독성 세포 (예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 상으로 결합된 분비된 Ig가, 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 있게 해준 다음, 연속해서 이러한 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 해주는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포와 "전투 준비를 하는데", 이는 사멸을 위해 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는데 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [참고: Ravetch and Kinet, Amzu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들면, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해을 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을, 그의 동족 항원과 결합되어 있는 항체 (적당한 아부류의 항체)와 결합시킴으로써 개시시킨다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
"단리된" 항체는 확인되어 천연의 환경으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질 함유 또는 비-단백질 함유 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 실버 스타인을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조할 것이다.
본원에 사용된 경우의 용어 "BLyS", "BLyS 폴리펩티드", "TALL-1" 또는 "TALL-1 폴리펩티드", "BAFF"는 "본래의 서열 BLyS 폴리펩티드" 및 "BLyS 변이체"를 포괄한다. "BLyS"는 다음에 기재된 아미노산 서열들 중의 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 제시된 명칭이다:
인간 BLyS 서열 (도 3; 서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00013
마우스 BLyS 서열 (서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00014
및 본래의 서열 BLyS의 생물학적 활성을 지니고 있는, 도 3 및 그의 동족체 및 단편 및 변이체. BLyS의 생물학적 활성은 B 세포 생존 증진, B 세포 성숙 증진 및 BR3에 대한 결합으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. BLyS의 변이체는 바람직하게는, BLyS 폴리펩티드의 본래의 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상 또는 100％ 까지의 모든 연속 정수, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상일 것이다. "본래의 서열" BLyS 폴리펩티드는 천연 상태로부터 유래된 상응하는 BLyS 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, BLyS는 푸린-유형 프로테아제에 의해 세포 표면으로부터 절단 후 가용성 형태로 존재한다. 이러한 본래의 서열 BLyS 폴리펩티드는 천연으로부터 분리시킬 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 용어 "본래의 서열 BLyS 폴리펩티드"는 구체적으로, 이러한 폴리펩티드의 천연의 절단되거나 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연의 변이체 형태 (예: 대체적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연의 대립유전자 변이체를 포괄한다. 용어 "BLyS"에는 문헌 [참고: Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); GenBank 승인 번호 AF136293; WO 98/18921 (1998년 5월 7일자로 공개됨); EP 869,180 (1998년 10월 7일자로 공개됨); WO 98/27114 (1998년 6월 25일자로 공개됨); WO 99/12964 (1999년 3월 18일자로 공개됨); WO 99/33980 (1999년 7월 8일자로 공개됨); Moore et al., Science, 285: 260-263 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189: 1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274: 15978-15981 (1999)]에 기재된 폴리펩티드가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "BLyS 길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 (1) 본래의 서열 BLyS 폴리펩티드와 결합하거나 또는 본래의 서열 BR3 폴리펩티드와 결합하여 BLyS 폴리펩티드와의 BR3 상호작용을 부분적 또는 완전히 차단시키고; (2) 본래의 서열 BLyS 신호전달을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자가 포함된다. 본래의 서열 BLyS 폴리펩티드 신호전달은 특히, B 세포 생존과 B 세포 성숙을 증진시킨다. BLyS 신호전달을 억제, 차단 또는 중화시키면, 특히 B 세포 수가 감소한다. 본 발명에 따르는 BLyS 길항제는 BLyS 폴리펩티드의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 시험관내 또는 생체 내에서 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시킬 것이다. 한 양태에서는, 생물학적 활성 BLyS가 시험관내 또는 생체 내에서 다음 사건들 중의 하나 또는 조합 사건을 증진시켜 준다: B 세포 생존 증가, IgG 및/또는 IgM의 수준 증가, 혈장 세포의 수 증가, 및 NF-κb2/100을 비장 B 세포 중에서 p52 NF-κb로 프로세싱시켜 줌 (예를 들어, 문헌 [Batten, M et al., (2000) J. Exp. Med. 192: 1453-1465; Moore, et al., (1999) Science 285: 260-263; Kayagaki, et al., (2002) 10: 515-524] 참고). 본 발명에 따르는 BLyS 길항제를 시험하는데 유용한 몇 가지 검정이 본원에 기재되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, BLyS 길항제는 BLyS 신호전달을 시험관내 또는 생체 내에서 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키기 위해 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들어, BLyS 길항제는 BLyS와 직접적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체가 BR3에 대한 BLyS 결합을 입체적으로 방해하도록 인간 BLyS의 잔기 162-275 및/또는 이들 잔기 중에서 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 및 265로 이루어진 군 중에서 선택된 이웃하는 잔기를 포함하는 인간 BLyS의 영역 내에서 결합하는 항-BLyS 항체가 고려된다. 또 다른 예에서는, 직접적인 결합제가 BLyS 수용체, 예를 들면, TACI, BR3 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 또 다른 예에서, BLyS 길항제에는 본원에 기재된 바와 같은, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9), 또는 도 32에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 또 다른 한편, BLyS 길항제는 그의 BLyS 결합 영역에서 본래의 서열 BR3의 세포외 도메인과 결합하여, 시험관내, 계내 또는 생체 내에서 BR3에 대한 BLyS 결합을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 간접적 길항제는 BLyS에 대한 인간 BR3의 결합이 입체적으로 방해되도록 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 BR3 영역 또는 이들 잔기의 이웃하는 영역 내에서 결합되는 항-BR3 항체이다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 BLyS 길항제에는 항-BLyS 항체, 면역부착인자 및 소분자가 포함된다. 추가의 양태에서, 면역부착인자는 BLyS 수용체의 BLyS 결합 영역 (예: BR3, BCMA 또는 TACI의 세포외 도메인)을 포함한다. 추가의 양태에서, 면역부착인자는 BR3-Fc, 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 임의로 융합 또는 접합된, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9), 또는 도 32에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
한 양태에 따르면, BLyS 길항제는 100 nM 이하의 결합 친화도로 BLyS 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드와 결합한다. 또 다른 양태에 따르면, BLyS 길항제는 10 nM 이하의 결합 친화도로 BLyS 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드와 결합한다. 또 다른 양태에 따르면, BLyS 길항제는 1 nM 이하의 결합 친화도로 BLyS 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드와 결합한다.
본원에 사용된 경우의 용어 "BR3", "BR3 폴리펩티드" 또는 "BR3 수용체"는 "본래의 서열 BR3 폴리펩티드" 및 "BR3 변이체" (이는 본원에 추가로 정의된다)를 포괄한다. "BR3"는 다음 폴리뉴클레오티드 서열 및 그의 동족체들 중의 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드에 대해 제공된 명칭이다:
(a) 인간 BR3 서열 (서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00015
(b) 대체 인간 BR3 서열 (서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00016
(c) 쥐 BR3 서열 (서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00017
(d) 랫트 BR3 서열 (서열 _)
Figure 112005070833033-PCT00018
및 그의 변이체 및 단편. 본 발명의 BR3 폴리펩티드는 각종 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형, 또는 또 다른 공급원으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 용어 BR3에는 WO 02/24909 및 WO 03/14294에 기재된 BR3 폴리펩티드가 포함된다.
"본래의 서열" BR3 폴리펩티드는 천연 상태로부터 유래된 상응하는 BR3 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 본래의 서열 BR3 폴리펩티드는 천연으로부터 분리시킬 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 용어 "본래의 서열 BR3 폴리펩티드"는 구체적으로, 이러한 폴리펩티드의 천연의 절단되거나, 가용성 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연의 변이체 형태 (예: 대체적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연의 대립유전자 변이체를 포괄한다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드에는 인간 BR3의 아미노산 잔기 1 내지 184의 연속되는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 BR3 폴리펩티드가 포함된다.
BR3 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 도메인과 세포질 도메인이 실질적으로 없는 BR3 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. ECD 형태의 BR3에는 BR3의 아미노산 1 내지 77, 2 내지 62, 2 내지 71, 1 내지 61, 및 2 내지 63 중의 어느 하나를 포함하는 것이 포함된다.
미니-BR3은 BR3의 BLyS-결합 도메인의 26-잔기 코어 영역이다:
TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR (서열 _).
"BR3 변이체"는 본래의 서열 완전한 길이의 BR3 또는 BR3 ECD의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 BR3 폴리펩티드를 의미하고, 이는 본래의 서열 BlyS 폴리펩티드와 결합된다. 임의로, BR3 변이체에는 단일 시스테인 풍부 도메인이 포함된다. 이러한 BR3 변이체 폴리펩티드에는 예를 들어, 완전한 길이의 아미노산 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 BR3 폴리펩티드가 포함된다. 본래의 서열 BLyS 폴리펩티드와 결합하는 BR3 ECD의 단편이 또한 고려된다. 통상적으로, BR3 변이체 폴리펩티드는 인간 BR3 폴리펩티드 또는 그의 명시된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 81％ 이상, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상, 보다 바람직하게는 약 99％ 이상일 것이다. BR3 변이체 폴리펩티드는 본래의 BR3 폴리펩티드 서열을 포괄하지 않는다. 통상적으로, BR3 변이체 폴리펩티드는 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 종종 약 20개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 30개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 40개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 50개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 60개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 70개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 80개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 90개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 100개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 150개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 200개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 250개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 300개 이상의 아미노산이다.
본원에 사용된 경우의 용어 "TACI" 또는 "TACI 폴리펩티드" 또는 "TACI 수용체"는 "본래의 서열 TACI 폴리펩티드" 및 "TACI 변이체" (이는 본원에 추가로 정의된다)를 포괄한다. "TACI"는 도 1A-1B의 아미노산 서열, 도 5B의 아미노산 1-246 및 도 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 도 1A-1B 및 5A에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 그의 동족체, 변이체 및 단편; 도 1A-1B 및 5A에 제시된 서열을 포함하는 핵산 분자 및 그의 변이체 뿐만 아니라 상기의 단편에 대해 부여된 명칭이다. 본 발명의 TACI 폴리펩티드는 각종 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형, 또는 또 다른 공급원으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
"본래의 서열" TACI 폴리펩티드는 천연 상태로부터 유래된 상응하는 TACI 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 본래의 서열 TACI 폴리펩티드는 천연으로부터 분리시킬 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 용어 "본래의 서열 TACI 폴리펩티드"는 구체적으로, 이러한 폴리펩티드의 천연의 절단되거나, 가용성 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연의 변이체 형태 (예: 대체적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연의 대립유전자 변이체를 포괄한다. 본 발명의 TACI 폴리펩티드에는 문헌 [참고: von Bulow et al., 상기 참고 및 W0 98/39361 (1998년 9월 11일자로 공개됨)]에 기재된 폴리펩티드; 스플라이싱된 변이체 ("hTACI(265)"로서 지칭되고 도 8에 제시되어 있음, 도 8의 아미노산 잔기 1-293의 연속되는 서열을 포함하는 TACI 폴리펩티드)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
TACI "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 도메인과 세포질 도메인이 실질적으로 없는 TACI 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. ECD 형태의 TACI에는 문헌 [참고: von Bulow et al., 상기 참고, WO 98/39361, WO 00/40716, WO 01/85782, WO 01/87979, WO 01/81417]에 기재된 것, 도 1의 아미노산 잔기 1-166, 도 1의 아미노산 잔기 1-165, 도 1의 아미노산 잔기 1-154, 도 1의 아미노산 잔기 1-114, 도 5B의 아미노산 잔기 1-119, 도 5B의 아미노산 잔기 1-120, 및 도 5B의 아미노산 잔기 1-126가 포함된다.
"TACI 변이체"는 본래의 서열 완전한 길이의 TACI 또는 TACI ECD의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 TACI 폴리펩티드를 의미하고, 이는 본래의 서열 BlyS 폴리펩티드와 결합된다. 이러한 TACI 변이체 폴리펩티드에는 예를 들어, 완전한 길이의 아미노산 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 TACI 폴리펩티드가 포함된다. 본래의 서열 BlyS 폴리펩티드와 결합하는 TACI ECD의 단편이 또한 고려된다. 통상적으로, TACI 변이체 폴리펩티드는 도 1에 제시된 핵산 분자에 의해 코딩된 TACI 폴리펩티드 또는 그의 명시된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 81％ 이상, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상, 보다 바람직하게는 약 99％ 이상일 것이다. TACI 변이체 폴리펩티드는 본래의 TACI 폴리펩티드 서열을 포괄하지 않는다. 통상적으로, TACI 변이체 폴리펩티드는 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 종종 약 20개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 30개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 40개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 50개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 60개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 70개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 80개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 90개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 100개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 150개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 200개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 250개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 300개 이상의 아미노산이다.
본원에 사용된 경우의 용어 "BCMA" 또는 "BCMA 폴리펩티드" 또는 "BCMA 수용체"는 "본래의 서열 BCMA 폴리펩티드" 및 "BCMA 변이체" (이는 본원에 추가로 정의된다)를 포괄한다. "BCMA"는 도 2에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 그의 변이체; 도2에 제시된 서열을 포함하는 핵산 분자 및 그의 변이체 뿐만 아니라 상기의 단편에 대해 부여된 명칭이다. 본 발명의 BCMA 폴리펩티드는 각종 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형, 또는 또 다른 공급원으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
"본래의 서열" BCMA 폴리펩티드는 천연 상태로부터 유래된 상응하는 BCMA 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 본래의 서열 BCMA 폴리펩티드는 천연으로부터 분리시킬 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 용어 "본래의 서열 BCMA 폴리펩티드"는 구체적으로, 이러한 폴리펩티드의 천연의 절단되거나, 가용성 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연의 변이체 형태 (예: 대체적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연의 대립유전자 변이체를 포괄한다. 본 발명의 BCMA 폴리펩티드에는 문헌 [참고: Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22: 1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995); Madry et al., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998)]에 기재된 폴리펩티드; 및 도 2의 아미노산 잔기 1-184의 연속되는 서열을 포함하는 BCMA 폴리펩티드 (서열 4)가 포함된다.
BCMA "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막횡단 도메인과 세포질 도메인이 실질적으로 없는 BCMA 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. ECD 형태의 TACI에는 문헌 [참고: Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22: 1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995); Madry et al., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998)]에 기재된 것, 도 2의 아미노산 잔기 4-55, 도 2의 아미노산 잔기 1-48, 도 2의 아미노산 잔기 8-41, 도 2의 아미노산 잔기 4-51, 또는 도 2의 아미노산 잔기 21-53이 포함된다.
"BCMA 변이체"는 본래의 서열 완전한 길이의 BCMA 또는 BCMA ECD의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 BCMA 폴리펩티드를 의미하고, 이는 본래의 서열 BlyS 폴리펩티드와 결합된다. 이러한 BCMA 변이체 폴리펩티드에는 예를 들어, 완전한 길이의 아미노산 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 BCMA 폴리펩티드가 포함된다. 본래의 서열 BlyS 폴리펩티드와 결합하는 BCMA ECD의 단편이 또한 고려된다. 통상적으로, BCMA 변이체 폴리펩티드는 도 2에 제시된 핵산 분자에 의해 코딩된 BCMA 폴리펩티드 또는 그의 명시된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 81％ 이상, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상, 보다 바람직하게는 약 99％ 이상일 것이다. BCMA 변이체 폴리펩티드는 본래의 BCMA 폴리펩티드 서열을 포괄하지 않는다. 통상적으로, BCMA 변이체 폴리펩티드는 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 종종 약 20개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 30개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 40개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 50개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 60개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 70개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 80개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 90개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 100개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 150개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 200개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 250개 이상의 아미노산, 보다 종종 약 300개 이상의 아미노산이다.
BAFF는 비장, 림프절, PBLs, 단구, 대식세포, DCs, T 세포, K562, HL-60 및 G361에서 발현된다. APRIL는 비장, 췌장, 결장에서 약하게 발현된다. APRIL은 PBLs 및 각종 종양 세포주 및 조직에서 발현된다. BCMA는 비장, 림프절, 흉선, PBLs, 간, 부신 및 B 세포에서 발현된다. TACI는 비장, 흉선, PBLs, 소장, B 세포 및 활성화 T 세포에서 발현된다. BAFF-R은 비장, 림프절, 흉선, PBLs, B 세포에서 발현된다. BAFF-R는 휴지기 T 세포 상에서는 저 수준으로 발현된다 [참고: Mackay and Browning, July 2002, Nature Reviews, Immunology, 2: 465-475].
아미노산 측쇄 특성 상의 유사성에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)] 참고):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 전하를 띠지 않는 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H).
또 다른 한편, 천연 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 다음 군으로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: norleucine(노르루이신), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성의 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 발명 내에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적" 아미노산 치환은 기능상 등가의 아미노산을 치환시키는 아미노산 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 변화는, 이로써 생성된 펩티드의 아미노산 서열 상의 침묵 변화를 가져다 준다. 예를 들어, 유사한 극성의 하나 이상의 아미노산은 기능적 등가물로서 작용하여, 펩티드의 아미노산 서열 내에 침묵 변경을 가져다 준다. 일반적으로, 특정 군 내에서의 치환은 구조와 기능 면에서 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 특정한 잔기의 역할이 이것이 존재하는 분자의 3차원 구조 내에서의 역할과 관련하여 결정된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, Cys 잔기는 산화된 (디설파이드) 형태로 존재할 수 있는데, 이는 환원된 (티올) 형태 보다는 덜 극성이다. Arg 측쇄의 장 지방족 부분은 구조 또는 기능적 역할에 있어 결정적인 특징을 구성할 수 있고, 이는 또 다른 염기성 잔기 보다는 오히려 비극성 잔기의 치환에 의해 보존될 수 있다. 또한, 방향족기를 함유하는 측쇄 (Trp, Tyr, 및 Phe)는 이온성-방향족 또는 "양이온-파이(cation-pi)" 상호작용에 참여할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 경우, 이들 측쇄 중의 하나를 산성 또는 전하를 띠지 않는 극성기의 구성원으로 치환시키는 것은 구조와 기능 면에서 보존적일 수 있다. Pro, Gly, 및 Cys (디설파이드 형태) 등의 잔기는 주요 쇄 입체 형태에 직접적인 영향을 미칠 수 있고, 종종 구조적 비틀림 없이는 치환시킬 수가 없다.
본원에서 확인된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일성 (％)"은 최대 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 본원에서 확인된 상기 리간드 또는 수용체 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율 (％)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있는데, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈리안 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용한다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있으며, 이에는 비교하고자 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알고리듬이 포함된다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 (％)은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 다음에 기재되는 바대로 수득하는데, 여기서는 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드가 다음 표에 제공된다. ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)사에 의해 창시되었고, 다음 표에 제시된 원시 코드는 미국 저작권국 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서 제출함으로써 출원하였으며, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 공급처 [Genentech, Inc., South San Francisco, California]를 통하여 공개적으로 입수 가능하거나, 또는 다음 표에 제공된 원시 코드로부터 자료를 수집하여 편집할 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교용 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
돌연변이 유발시키는데 바람직한 위치인, 단백질 내의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌 [참고: Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"이다. 특정 잔기 또는 표적 잔기 군을 확인하고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu 등의 전하를 띤 잔기), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시켜, 상기 아미노산과 결합성 표적 간의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환 부위에 추가의 또는 기타 변이체를 도입함으로써, 상기 치환에 대한 기능적 민감도를 나타내는 아미노산 위치를 세밀히 구별시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 위치는 예정된 것이긴 하지만, 돌연변이 특성 그 자체가 반드시 예정될 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 변이체를 대상으로 하여 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
용어 "2면각(dihedral angle)"은 결합 주변의 회전을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2 ed., W. H. Freeman and Company, New York, NY] 참고).
용어 "파이 (phi)"는 아미노산의 N-Cα 결합 주변의 회전을 의미하는 2면각이다 (예를 들어, 문헌 [Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2 ed., W. H. Freeman and Company, New York, NY] 참고).
유형 I 베타 선회는 문헌 [참고: Hutchinson, E. G. & Thornton, J. M. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216]에 기재되어 있다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩티드"는 함께 공유적으로 연결된 2개의 부분을 갖는 폴리펩티드를 지칭하는데, 이러한 부분 각각은 상이한 특성을 지닌 폴리펩티드이다. 특성은 생물학적 특성, 예를 들면 시험관내 또는 생체 내 활성일 수 있다. 특성은 또한, 단순한 화학적 또는 물리적 특성, 예를 들면, 표적 분자에 대한 결합, 반응의 촉매작용 등일 수 있다. 2개의 부분을 단일 펩티드 결합에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 통하여 직접 연결할 수 있다. 일반적으로, 상기 2개의 부분과 링커는 서로 동일한 판독 프레임 내에 존재할 것이다.
"접합체"는 융합 단백질을 포함한 모든 하이브리드 분자 뿐만 아니라 아미노산 또는 단백질 부분과 비-단백질 부분 둘 다를 함유하는 분자를 지칭한다. 접합체는 당해 분야에 공지된 각종 기술에 의해 합성할 수 있는데, 이러한 기술에는, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 고체 상 합성, 용액 상 합성, 유기 화학 합성 기술 또는 이들 기술의 조합이 포함된다. 합성 기술의 선택은 생성시키고자 하는 특정한 분자에 좌우될 것이다. 예를 들어, 본래 전적으로 "단백질"이 아닌 하이브리드 분자는 재조합 기술과 용액 상 기술을 조합하여 합성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역부착인자"는 이종 단백질 ("부착인자")의 결합 특이성과 면역글로불린 불변 영역의 효과기 기능을 조합한 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조상, 면역부착인자는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, 이종인) 목적하는 결합 특이성을 지닌 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역부착인자 분자의 부착인자 부분은 전형적으로, 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속되는 아미노산 서열이다. 면역부착인자 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 모든 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 유용한 면역부착인자는 BLyS 수용체의 막횡단 또는 세포질 서열을 수반하지 않는 BLyS 수용체의 BLyS 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 양태에서는, BR3, TACI 또는 BCMA의 세포외 도메인을 면역글로불린 서열의 불변 도메인에 융합시킨다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 마우스 BR3-Fc 면역부착인자 및 인간 BR3-Fc 면역부착인자는 다음으로써 나타낼 수 있다:
mBR3 - Fc (서열 1):
Figure 112005070833033-PCT00019
hBR3 - hIgG1 Fc (서열 2):
Figure 112005070833033-PCT00020
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들면, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸롤로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜킨; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨, 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL®; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (TAXOTERE®; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 약물의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들면, 항에스트로겐, 에를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤); 항안드로겐, 예를 들면, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루이프롤리드 및 고세렐린; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예를 들면, 핵산분해성 효소, 항생제 및 독소, 예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (이에는 상기의 단편 및/또는 변이체가 포함된다), 및 다음에 기재된 각종 항종양제 또는 항암제가 포함된다. 기타 세포독성제는 다음에 기재되어 있다.
본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체 내에서, 세포, 특히 CD20 발현성 암 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상에서 PSCA 발현성 세포의 비율을 상당히 저하시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단시키는 작용제, 예를 들면, G1 정지와 M-상 정지를 유도시키는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들면, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제가 또한 S-상 정지로까지 영향을 미치는데, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들면, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 있다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목(yew tree)으로부터 유래된 항암제이다. 유럽산 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (TAXOL®; Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린(tubulin) 이량체로부터의 미소관의 어셈블리를 증진시키고 탈중합을 방지함으로써 미소관을 안정화시켜, 세포에서 유사분열을 억제시킨다.
용어 "포유동물"은 포유동물로서 분류된 모든 동물을 지칭하는데, 이에는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 바람직하게는, 본원에서의 포유동물이 인간이다.
용어 "치료상 유효량"은 대상체 또는 포유동물에게서 특정 질병 또는 질환을 "완화" 또는 "치료"하는데 유효한 항체 또는 길항제 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료상 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다 [하기 "치료"의 정의 참고]. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 또는 세포독성일 수 있다.
본 발명의 항-CD20 항체는 CHO 세포 등의 진핵성 숙주 세포를 일시적 또는 안정적 형질감염시킴으로써 생성시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"에는 이용된 투여량과 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제가 포함된다. 종종, 생리상 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리상 허용 가능한 담체의 예에는 완충제, 예를 들면, 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산을 포함한 산화방지제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (이에는 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함된다); 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당 알코올, 예를 들면, 만니톨 또는 솔비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들면, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™이 포함된다.
1. 폴리펩티드 BLyS 길항제
BLyS의 길항제로서 유용한 폴리펩티드에는, 예를 들어 WO 02/092620에서 서열 123으로서 TALL-1 12-3으로 지칭된 폴리펩티드가 포함되고, 아미노산 서열이 본원에 제공된다:
Figure 112005070833033-PCT00021
(서열 10).
상기 폴리펩티드는 BLyS와 결합하고, BLyS에 대한 BR3 결합을 억제시킨다. 몇몇 양태에서, 17량체 펩티드는 가용성이고 (바람직하게는, 막 결합되지 않고), 코어 서열로서 사용될 수 있거나 또는 다음에 기재되는 바와 같은 각종 구조물과 조합 또는 접합될 수 있다. 17량체 폴리펩티드 중의 몇 가지 아미노산을 무작위로 뽑아, 이들을 대상으로 하여 보존적 치환 및 비-보존적 치환에 대해 스크리닝하였다. 당업자에 의해 인식되고 본원에 기재된 바와 같이, 생성되는 17량체 폴리펩티드 및 구조물 (생성되는 17량체 펩티드를 포함함)의 BLyS 결합에는 전혀 손상을 입히지 않으면서 제한된 기준에 근거하여 부가 및 치환을 수행할 수 있다. BLyS 결합 기능을 산출시키도록 허용된 치환에 관한 안내는 다음 기재 내용 및 실시예에 제공된다. 몇몇 양태에서는, 구조적 또는 결합 친화성 관계에 밀접한 영향을 미치는 잔기를 보존시키는데, 이는 아미노산 실체가 보유되거나 또는 보존적 치환이 다음 식과 기재 내용에 기재된 바와 같이 만들어진다는 것을 의미한다.
본 발명의 BLyS 폴리펩티드 길항제는 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, 도 32에 인용된 서열, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함한다.
본 발명의 한 국면에서, 폴리펩티드는 다음 서열식 I의 아미노산 서열을 포함한다:
Xl-CN-X3-D-X5-L-X7-X8-X9-X10-Xll-Xl2-CT-Xl4-Xl5-Xl6-Xl7 (서열식 I)
상기식에서,
X1, X3, X5, X7, X8, X9, X10, X11, Xl2, Xl4, X15 및 Xl7은 시스테인을 제외한 모든 아미노산이고;
X16은 L, F, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산이며;
상기 폴리펩티드는 서열식 I의 CT (시스테인 C 말단)에 대한 C-말단 및 CN (시스테인 N 말단)에 대한 7개 아미노산 잔기 N-말단 내에 시스테인을 포함하지 않는다.
몇몇 양태에서, 서열식 I의 서열을 포함하는 폴리펩티드는 디설파이드 결합에 의해 연결된 CN 및 CT; L과 X7 사이에 선회 중심을 갖는 유형 I 베타 선회 구조의 입체 형태를 형성하는 X5LX7X8을 갖고; X8의 2면각 파이에 대한 양성 값을 갖는다.
몇몇 양태에서, X10은 W, F, V, L, I, Y, M 및 비-극성 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X10은 W이다. 몇몇 양태에서, X3은 M, V, L, I, Y, F, W 및 비-극성 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X5는 V, L, P, S, I, A 및 R로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X7은 V, T, I 및 L로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X7은 T 또는 I가 아니다. 몇몇 양태에서, X8은 R, K, G, N, H 및 D-아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X9는 H, K, A, R 및 Q로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X11은 I 또는 V이다. 몇몇 양태에서, X12는 P, A, D, E 및 S로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 양태에서, X16은 L이다.
구체적 양태에서, 서열식 I의 서열은 ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)로 이루어진 군 중에서 선택된 서열이다.
본 발명의 또 다른 국면에서, 폴리펩티드는 다음 서열식 II의 아미노산 서열을 포함한다:
Xl-CN-X3-D-X5-L-V-X8-X9-W-Xll-Xl2-CT-Xl4-Xl5-L-Xl7 (서열식 II)
상기식에서,
X1, X3, X5, X8, X9, X11, Xl2, Xl4, X15 및 Xl7은 시스테인을 제외한 모든 아미노산이고;
상기 폴리펩티드는 서열식 II의 CT (시스테인 C 말단)에 대한 C-말단 및 CN (시스테인 N 말단)에 대한 7개 아미노산 잔기 N-말단 내에 시스테인을 포함하지 않는다.
몇몇 양태에서, 서열식 I의 서열을 포함하는 폴리펩티드는 디설파이드 결합에 의해 연결된 CN 및 CT; L과 X7 사이에 선회 중심을 갖는 유형 I 베타 선회 구조의 입체 형태를 형성하는 X5LVX8을 갖고; X8의 2면각 파이에 대한 양성 값을 갖는다.
서열식 II의 몇몇 양태에서, X3은 M, A, V, L, I, Y, F, W 및 비-극성 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 II의 몇몇 양태에서, X5는 V, L, P, S, I, A 및 R로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 II의 몇몇 양태에서, X8은 R, K, G, N, H 및 D-아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 II의 몇몇 양태에서, X9는 H, K, A, R 및 Q로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 II의 몇몇 양태에서, X11은 I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 II의 몇몇 양태에서, X12는 P, A, D, E 및 S로 이루어진 군 중에서 선택된다.
또 다른 국면에서, 폴리펩티드는 도 32에 기재된 서열들 중의 어느 하나 중에서 선택된 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 서열식 III의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다:
E-CN-F-D-X5-L-V-X8-X9-W-V-X12-CT-X14-X15-X16-X17 (서열식 III)
상기식에서,
X5, X8, X9, Xl2, Xl4, X15 및 Xl7은 시스테인을 제외한 모든 아미노산이고;
X16은 L, F, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산이며;
상기 폴리펩티드는 서열식 III의 CT (시스테인 C 말단)에 대한 C-말단 및 CN (시스테인 N 말단)에 대한 7개 아미노산 잔기 N-말단 내에 시스테인을 포함하지 않고;
CN 및 CT는 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
서열식 III의 몇몇 양태에서, 서열식 III의 연속되는 서열을 포함하는 폴리펩티드는 CN 및 CT 간에 디설파이드 결합을 갖고, X5LVX8에서 L과 V 사이에 선회 중심을 갖는 유형 I 베타 선회 구조를 형성하며; X8의 2면각 파이에 대한 양성 값을 갖는다.
서열식 III의 몇몇 양태에서, X5, X8, X9, Xl2, Xl4, X15 및 Xl7은 L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D, 및 G로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 III의 몇몇 양태에서, X5는 L이고, X8은 R이다. 서열식 III의 몇몇 양태에서, X9는 H, K, A, S, R 및 Q로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 III의 몇몇 양태에서, X12는 P, A, D, E 및 S로 이루어진 군 중에서 선택된다. 서열식 III의 몇몇 양태에서, X12는 P이다. 서열식 III의 몇몇 양태에서, X16은 L이다.
구체적 양태에서, 서열식 III의 서열은 ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8) 및 ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)로 이루어진 군 중에서 선택된 서열이다.
또한, ECFDLLVRAWVPCSVLK, ECFDLLVRHWVPCGLLR, ECFDLLVRRWVPCEMLG, ECFDLLVRSWVPCHMLR 및 ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 5 내지 9)로 이루어진 군 중에서 선택된 연속되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명은 또한, 도 32에 기재된 서열들 중의 어느 하나 중에서 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 도 32에 기재된 서열들 중의 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드는 바람직하게는, 서열의 시스테인을 디설파이드 결합에 의해 연결시킨다. 몇몇 양태에서, 서열의 5번째 잔기와 8번째 잔기 사이의 서열은 L과 X7 사이에 선회 중심을 갖는 유형 I 베타 선회 구조의 입체 형태를 형성하고, 8번째 잔기는 2면각 파이에 대해 양성 값을 갖는다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 BlyS 폴리펩티드는 연속되는 서열이다. 본 발명은 또한, ECFDLLVRAWVPCSVLK, ECFDLLVRHWVPCGLLR, ECFDLLVRRWVPCEMLG, ECFDLLVRSWVPCHMLR 및 ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 5 내지 9)로 이루어진 군 중에서 선택된 연속되는 17량체 폴리펩티드 서열과의 서열 동일성이 88％ 이상인 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 양태에서는, 최대의 상동성을 제공하기 위해 정렬시킨 후의 서열 동일성이 64％ 이상 내지 100％까지의 각 연속 정수이다. 상동성은 최대 상동성을 제공하기 위해 정렬시킨 후 본 발명의 17량체 보다 짧은 서열 및 서열 갭에 대해 저하된다. 어떠한 N-말단 또는 C-말단 연장 또는 삽입도 상동성 감소로서 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 폴리펩티드는 길이가 50개 미만의 아미노산, 25개 미만의 아미노산, 또는 17량체이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열에 대한 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 둘 다에 부가의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 부가의 폴리펩티드 서열은 본래의 서열 BR3 폴리펩티드에 대해 이종이고, 이에는, 예를 들어 면역글로불린의 Fc 부분이 포함된다.
본 발명의 또 다른 국면에서, BlyS 길항제 폴리펩티드는 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 적어도 하나, 보다 바람직하게는 하나 이상 포함한다. 함께 연결되는 폴리펩티드는 동일한 서열 또는 상이한 서열을 갖는다. 몇몇 양태에서, 이들 폴리펩티드는 임의로, 링커의 사용을 통하여 서로 연결될 수 있다. 링커는 스페이서로서 작용하고 각종 화학적 화합물로 만들 수 있다. 몇몇 양태에서, 링커는 약 1 내지 50개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 1 내지 30개 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 링커 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 링커 서열에는 GGGKGGGG 및 GGGNSSGG 등이 포함된다. 구체적 양태에서, 함께 연결된 폴리펩티드는 동일한 서열을 갖고 식 PP1-Ll-PP1-L2-PP1를 포함하는데, PP1은 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 및 도 32에 기재된 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, L1 및 L2는 서열 상 상이한 링커 서열이다.
BR3과의 BLyS 결합에 대한 길항제, 예를 들어 본원에 기재된 폴리펩티드는 바람직하게는, 본래의 BR3 서열, 예를 들어 서열 _의 BR3 EDC 또는 서열 _의 미니-BR3과 동일하거나 이 보다 큰 친화성으로 BLyS와 결합한다. 몇몇 양태에서, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드는 BLyS에 대한 결합 친화도가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하이다. 결합 친화도를 측정하는 한 가지 방법이 본 실시예에 제공된다.
BLyS 길항제를 발견하기 위해 본 발명에서 사용된 방법은 BR3의 17 잔기의 코어 서열을 확인, 변형 및 선택적으로 무작위화하는 것을 포함한다. 사용된 구체적 기술이 다음 기재 내용 및 실시예에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, X2 위치에서의 N-말단 시스테인 잔기 (CN)와 위치 X13에서의 C-말단 시스테인 (CT)이 보존되고, 이는 바람직하게는 디설파이드 브릿지를 형성한다. 몇몇 양태에서, CN과 CT는 10개의 연속되는 아미노산 정도 떨어져 있다. 바람직하게는, 17량체 서열이 위치 X2 및 X13 이외에서는 어떠한 시스테인 잔기도 함유하지 않는다. 부가적으로, 17량체가 보다 큰 구조에 포함되는 경우, 17량체를 플랭킹하는 서열은 바람직하게는, CN 또는 CT의 7개 아미노산 내에 시스테인 잔기를 전혀 포함하지 않을 것이다. X1O은 시스테인을 제외한 모든 비-극성 아미노산, 예를 들어 W, F, V, L, I, Y 또는 M에 의해 치환된다. 몇몇 양태에서, X10은 W이다.
몇몇 양태에서, 모티프 D-X5-L-X7은 보존되는데, 이는 BLyS 결합에 기여한 것으로 입증되었기 때문이다. 몇몇 양태에서, CN과 CT 사이에 위치한 베타-선회가 X4와 X7 사이에 형성된다. 몇몇 양태에서, 베타 선회의 중심이 L-X7 사이에 위치한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 17량체 펩티드의 구조는 일반적으로, 유형 I 베타-선회에 의해 연결된 2개의 베타-쇄이어서, CN과 CT 사이의 디설파이드 결합에 의해 연결된 베타-헤어핀을 형성한다. 부가적으로, 몇몇 양태에서, X8에서의 잔기는 X8의 2면각 파이에 대한 양성 값을 갖도록 적응시켜 유형 I 베타 선회가 베타 헤어핀 구조를 수용하도록 한다.
부가의 구조 정보는 X4에서의 D와 X6에서의 L이 BLyS-BR3 복합체의 BLyS-BR3 게면 내에 가려져 있다는 것을 지시해준다. 몇몇 양태에서, 이들 잔기는 보존된다. X7에서의 잔기 역시 BLyS-BR3 계면 내에 가려져 있다. 몇몇 양태에서, X7은 V, T, I 및 L로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 몇몇 양태에서, X7은 바람직하게는 V이다. 몇몇 양태에서, X4에서 X7 까지의 모티프는 DLLV이다.
몇몇 양태에서, BLyS 길항제의 결합 영역 길이는 17개 아미노산이다. 몇몇 양태에서, 폴리펩티드 BLyS 길항제는 17개 아미노산이다. 몇몇 양태에서, 4개의 아미노산 Xl4-Xl7은 C-말단에서의 CT 다음에 온다. 몇몇 양태에서, Xl6은 17량체가 결합되고 보존되는 경우에 BLyS와의 소수성 접촉을 형성한다. 몇몇 양태에서, X16은 L이다.
2. 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포
몇몇 양태에 따르면, 본 발명의 BLyS 길항제 폴리펩티드는 본원에 기재된 17량체 폴리펩티드, 코어 영역으로서 하나 이상의 17량체 폴리펩티드가 혼입된 폴리펩티드, 및 상기 17량체 펩티드 및 폴리펩티드의 공유적으로 변형된 형태 (예: 면역부착인자, 표지된 폴리펩티드, 보호된 폴리펩티드, 접합된 폴리펩티드, 융합 단백질 등)으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 이들 형태의 폴리펩티드를 제조하기 위해 이용되는 각종 기술이 본원에 기재되어 있다. 폴리펩티드를 표지시키고 분자를 폴리펩티드에 접합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
당해 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 다음의 기재 내용은 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포를 배양하고; 이러한 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 상기 폴리펩티드를 생성시키는 방법에 관한 것이다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)] 참고).
목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예: cDNA 또는 게놈 DNA)을 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 각종 벡터는 공개적으로 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음들 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 (이의 각각이 다음에 기재되어 있다). 이용될 수 있는 임의의 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 WO 97/25428에 추가로 상세히 기재되어 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유하고, 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 프로모터는 이에 작동적으로 연결된 특정한 핵산 서열의 전사 및 해독을 제어하는 구조적 유전자 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 출발 코돈에 대해 상류 (5')에 위치한 비해독 서열이다. 이러한 프로모터는 전형적으로 2가지 부류, 즉 유도성 및 구성성 프로모터로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건 상의 일부 변화, 예를 들어 영양분의 존재 또는 부재, 또는 온도 상의 변화에 반응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다. 이때, 각종의 잠재적 숙주 세포에 의해 인식된 다수의 프로모터는 널리 공지되어 있다. 이들 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써, 코딩 DNA에 작동적으로 연결된다.
상기 기재된 성분들 중의 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 연결 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 맞게한 다음, 요구되는 플라스미드를 생성시키기에 요망되는 형태로 재연결시킨다. 구축된 플라스미드 내에서의 정확한 서열을 확인할 목적으로 분석하기 위해, 상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 (E. coli) K12 균주 294 (ATCC 31,446)를 형질전환시킬 수 있고, 성공적인 형질전환체를 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별하였다. 이러한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고/하거나 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 서열 분석하였다 (예를 들어, 문헌 [Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)] 참고).
코딩 DNA를 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켜 주는 발현 벡터를 이용할 수 있다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터를 이용하여, 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 복사물을 축적하여, 결국에는 이러한 발현 벡터에 의해 코딩된 목적하는 폴리펩티드를 고수준으로 합성하도록 하는 것을 포함한다 [Sambrook et al., 상기 참고]. 적합한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일시적 발현 시스템은, 클로닝된 DNAs에 의해 코딩된 폴리펩티드를 편리하고도 확실하게 확인시켜 줄 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 대상으로 하여, 목적하는 생물학적 또는 생리학적 특성에 대해 신속하게 스크리닝해준다.
재조합 척추동물 세포 배양물에서 목적하는 폴리펩티드를 합성하도록 적응시키는데 적합한 기타 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [참고: Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
본원의 벡터 내에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포에는 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 이러한 목적한 적합한 원핵 세포에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해성 효소를 분비해야 한다.
원핵 세포 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들면, 필라멘트상 진균 또는 효모가 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 당화 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 이러한 모든 숙주 세포의 예는 W0 97/25428에 추가로 기재되어 있다.
숙주 세포를 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염, 바람직하게는 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 영양 배지에서 배양한다.
형질감염은 어떠한 코딩 서열도 실제로 발현되든지 아니면 발현되지 않든지 간에, 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 흡수를 지칭한다. 수 많은 형질감염 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, CaPO4 및 전기천공법이 있다. 상기 벡터의 작동 징후가 숙주 세포 내에서 존재하는 경우에 일반적으로 성공적인 형질감염으로 인식된다.
형질전환은 DNA를 유기체 내로 도입하여, 이러한 DNA가 염색체외 요소로서 복제 가능하거나 또는 염색체 통합체에 의해 복제 가능하도록 하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 형질전환은 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 문헌 [Sambrook et al. 상기 참고]에 기재된 바와 같이, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공이 일반적으로, 실재적 세포-벽 장벽을 함유하고 있는 원핵 세포 또는 기타 세포에 사용된다. 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로의 감염은 문헌 [참고: Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일자로 공개됨)]에 기재된 바와 같이 특정한 식물 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 또한, 식물은 WO 91/00358 (1991년 1월 10일자로 공개됨)에 기재된 바와 같이 초음파 처리를 이용하여 형질감염시킬 수 있다.
상기 세포 벽을 수반하지 않은 포유동물 세포의 경우에는, 문헌 [참고: Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 국면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되었다. 효모 내로의 형질전환은 전형적으로, 문헌 [참고: Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라서 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 기타 방법, 예를 들면, 핵 미세주사, 전기천공, 본래의 세포와의 세균성 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들면, 폴리브렌, 폴리오르니틴을 이용할 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키기 위한 각종 방법은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)].
원핵 세포는 문헌 [Sambrook et al., 상기 참고]에 기재된 바와 같이 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배양 배지의 예에는 햄스 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘벡코 변형 이글스 배지 ("DMEM", Sigma)가 포함된다. 이러한 모든 배지에 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오시드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: 젠타마이신), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원을 필요에 따라 보충할 수 있다. 기타 모든 필수 보충물이 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포를 이용하여 앞서 이용된 것이고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로, 포유동물 세포 배양 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제적 기술은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)].
발현된 폴리펩티드는 배양 배지로부터 분비된 폴리펩티드로서 회수할 수 있지만, 분비 신호 없이 직접 생성되는 경우에는 이들을 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수도 있다. 폴리펩티드가 막-결합된 경우에는, 적합한 세정 용액 (예: Triton-X 100)을 사용하여 막으로부터 방출시킬 수 있거나, 또는 그의 세포외 영역을 효소적 절단에 의해 방출시킬 수 있다.
폴리펩티드를 인간 기원 이외의 재조합 세포에서 생성시키는 경우, 이에는 인간 기원의 단백질 또는 폴리펩티드가 없다. 그러나, 폴리펩티드를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 회수 또는 정제하여 실질적으로 균질한 제제를 수득하는 것이 통상 필요하다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리시켜 미립형 세포 부스러기를 제거할 수 있다. 다음은 적합한 정제 과정의 예시 과정이다: 이온-교환 칼럼 상에서 분별시킴; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들면, DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; 및 오염물질 (예: IgG)을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼.
파아지 디스플레이
몇몇 양태에 따르면, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 및 도 32에 기재된 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 본 발명의 폴리펩티드를 파아지 디스플레이에 활용할 수 있다.
파아지 디스플레이 기술을 사용하여, 표적 분자와 고 친화성으로 결합하는 서열에 대해 신속하게 분류시킬 수 있는 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을, 바이러스성 외피 단백질, 예를 들면, 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 융합시킨다. 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파아지 디스플레이 시스템을 개발하였다 (문헌 [Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)참고). 1가 파아지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합이 저 수준으로 발현되고, 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어, 입자의 감염도가 유지된다. 펩티드 라이브러리를 생성시키는 방법과 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 수 많은 특허 (예를 들면, 미국 특허 제5,723,286호, 동 제5,432,018호, 동 제5,580,717호, 동 제5,427 908호 및 동 제5,498,530호)에 보고되었다.
몇몇 양태에서, 서열식 I, 서열식 II 또는 서열식 III은 파아지 상에 펩티드 라이브러리로서 발현된다. 이어서, 서열식 I, 서열식 II 또는 서열식 III의 폴리펩티드 라이브러리를 발현하는 파아지를 대상으로 하여, BLyS 결합에 근거하여 선별을 수행하였다. 몇몇 양태에서는, 이러한 선별 과정이 몇몇 파아지를 바이오티닐화 BLyS에 결합시킨 다음, 연속해서 뉴트라비딘 판에 결합시키는 것을 포함한다. BLyS-바이오틴-뉴트라비딘 결합을 통하여 판에 결합된 파아지를 회수하고 증식시킨다. 몇몇 양태에서는, 파아지를 대상으로 하여 선별을 수회 수행한다. 몇몇 양태에서는, 파아지를 BLyS-바이오틴과 함께 항온 배양한 다음, 바이오티닐화되지 않은 BLyS를 경쟁적 결합제로서 부가한다. 본 발명의 맥락에서 파아지 디스플레이의 사용에 관한 추가의 안내는 본 실시예에 제공되어 있다.
이종 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 면역부착인자 분자를 본원의 방법에 사용하는 것이 추가로 고려된다. 몇몇 양태에서, 이러한 분자는 본 발명의 폴리펩티드와, 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정한 영역과의 융합물을 포함한다. 2가 형태의 면역부착인자의 경우에는, 이러한 융합물이 유용하게는, IgG 분자의 Fc 영역을 포함한다. 추가의 양태에서는, Fc 영역이 인간 IgG1 분자로부터 유래된다. 몇몇 양태에서, 면역글로불린 융합물은 IgGl 분자의 힌지 (hinge), CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합물을 생성시키기 위해, 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,428,130호 (1995년 6월 27일자로 허여됨) 및 Chamow et al., TIBTECH, 14: 52-60 (1996)].
가장 단순하고도 간단한 면역부착인자 고안은 종종, 부착인자 (예: 본 발명의 길항제 폴리펩티드)의 결합 도메인 (들)을 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역과 합하는 것이다. 예를 들어, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 면역글로불린의 Fc 부분에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 또한, 이들 폴리펩티드 중의 하나 이상을 서로 연결시킬 수 있고 면역글로불린의 Fc 부분에 연결시킬 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 면역부착인자를 제조하는 경우에는, 부착인자의 결합 도메인을 코딩하는 핵산을, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단적으로 융합시킬 것이지만, N-말단 융합 또한 가능하다.
전형적으로, 이러한 융합에서는 코딩된 키메라 폴리펩티드가 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능상 활성 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에 대한 융합, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대한 즉시 N-말단 융합이 또한 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않고; 특정한 부위는 널리 공지되어 있으며, 면역부착인자의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하도록 선택할 수 있다.
바람직한 양태에서는, 부착인자 서열을 면역글로불린 Gl (IgGl)의 Fc 영역의 N-말단에 융합시킨다. 완전한 중쇄 불변 영역을 부착인자 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 보다 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 규정하는 (즉, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기가 114인 것을 고려하면 잔기 216) 파파인 절단 부위, 또는 기타 면역글로불린의 유사한 부위의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하는 서열이 상기 융합에 이용된다. 특히 바람직한 양태에서는, 부착인자 아미노산 서열을 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 CH2 및 CH3; 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합시킨다.
이중-특이적 면역부착인자의 경우에는, 면역부착인자를 다량체, 특히 이종-이량체 또는 이종-사량체로서 어셈블리한다. 일반적으로, 이와 같이 어셈블리된 면역글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 4가지 기본 쇄 구조 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4가지 쇄 단위는 보다 고분자량 면역글로불린에서 반복되는데, IgM은 일반적으로, 디설파이드 결합에 의해 함께 유지된 4가지 기본 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 종종 IgG 글로불린은 혈청 중에 다량체 형태로 존재할 수도 있다. 다량체의 경우, 4가지 단위 각각은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 범위 내에 속하는 각종의 어셈블리된 면역부착인자의 예가 다음에 도식적으로 다이아그램되었다:
(a) ACL-ACL;
(b) ACH- (ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(c) ACL-ACH- (ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, 또는 VLCL-VHCH)
(d) ACL-VHCH- (ACH, 또는 ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(e) VLCL-ACH- (ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH); 및
(f) (A-Y)n- (VLCL-VHCH)2
상기에서,
A는 각각, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 아미노산 서열, 또는 도 32에 기재된 서열, 또는 이들의 조합물을 포함하는 동일하거나 상이한 폴리펩티드를 나타내고;
VL는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1 초과 정수이고;
Y는 공유 가교결합제의 잔기를 지칭한다.
간결하게 하기 위해, 전술된 구조는 단지 주요 특징 만을 나타내고; 이는 면역글로불린의 연결 (J) 또는 기타 도메인을 지시하지 않을 뿐만 아니라 제시된 디설파이드 결합을 지시하지도 않는다. 그러나, 상기 도메인이 결합 활성을 위해 요구되는 경우에는, 이들이 면역글로불린 분자 내에 점유하고 있는 통상의 위치에 존재하도록 구축해야 한다.
또 다른 한편, 부착인자 서열을 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입하여, 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 수득되도록 할 수 있다. 이러한 양태에서는, 부착인자 서열을 힌지와 CH2 도메인 사이 또는 CH2와 CH3 도메인 사이에서, 면역글로불린의 각 암 중의 면역글로불린 중쇄의 3' 말단과 융합시킨다. 유사한 구조물이 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28: 1027-1037 (1991)].
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착인자 내에 요구되지는 않지만, 면역글로불린 경쇄는 부착인자-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유적으로 연합되거나 또는 부착인자에 직접적으로 융합되어 존재할 수도 있다. 전자의 경우에는, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 전형적으로, 부착인자-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동으로 발현된다. 선별시, 하이브리드 중쇄와 경쇄가 공유적으로 연합되어, 2개의 디설파이드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 (1989년 3월 28일자로 허여됨)에 기재되어 있다.
면역부착인자는 부착인자 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 동일 프레임 내에서 면역글로불린 cDNA 서열과 융합시킴으로써 가장 편리하게 구축한다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편과의 융합을 이용할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Aruffo et al., Cell, 61: 1303-1313 (1990); and Stamenkovic et al., Cell, 66: 1133-1144 (1991)] 참고). 후자 유형의 융합에는 발현을 위한 Ig 조절 서열이 존재해야 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열을 기준으로 하여, 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 분리할 수 있다. 면역부착인자의 면역글로불린 부분 및 "부착인자"를 코딩하는 cDNA를, 선택된 숙주 세포에서 효율적인 발현을 지시해 주는 플라스미드 벡터 내로 직렬식으로 삽입한다.
이들 분자의 루이신 지퍼(zipper) 형태가 또한 본 발명의 의해 고려된다. "루이신 지퍼"는 이의 융합 파트너 (예: 루이신 지퍼가 융합되거나 연결되는 서열 또는 분자)의 이량체화 또는 삼량체화를 증강, 증진 또는 구동시키는 루이신 풍부 서열을 지칭하기 위해 사용된 용어이다. 각종 루이신 지퍼 폴리펩티드가 당해 분야에 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Landschulz et al., Science, 240: 1759 (1988); 미국 특허 제5,716,805호; WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341: 24 (1989)] 참고). 당업자는 루이신 지퍼 서열을 본 발명의 폴리펩티드의 5' 또는 3' 말단에서 융합시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드를 서로 융합시키거나, 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합시킴으로써 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형시킬 수도 있다. 몇몇 양태에 따르면, 이러한 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 키메라 분자를 올리고머화하는데 작용하는 것이다. 몇몇 양태에서는, 상기 키메라 분자가, 항-태그 항체가 선택적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공해 주는 태그 폴리펩티드와 본 발명의 폴리펩티드의 융합물을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로, 상기 폴리펩티드의 아미노 또는 카복실 말단에 위치시킨다. 이러한 에피토프-태그된 형태의 폴리펩티드가 존재하는 것은 태그 폴리펩티드에 대항한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써, 이러한 에피토프 태그와 결합하는 항-태그 항체 또는 또 다른 유형의 친화 매트릭스를 사용하여 폴리펩티드를 친화 정제함으로써 용이하게 정제시킬 수 있다. 각종 태그 폴리펩티드와 그의 각각의 항체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이의 예에는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [참고: Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [참고: Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [참고: Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]가 포함된다. 기타 태그 폴리펩티드에는 플래그(Flag)-펩티드 [참고: Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [참고: Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; "-튜불린 에피토프 펩티드 [참고: Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [참고: Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci: USA, 87: 6393-6397 (1990)]가 포함된다.
펩티드-중합체 접합체의 구축
몇몇 양태에서, 합성 펩티드의 중합체를 접합시키기 위한 전략 (예: PEG화)은 용액 중에서 접합체 연쇄를 형성시키는 것을 통하여, 펩티드와 PEG 부분 (각각은 다른 것에 대해 상호 반응성인 특수 기능성을 보유하고 있다)을 조합하는 것으로 이루어진다. 펩티드는 통상적인 고체 상 합성으로 용이하게 제조할 수 있다. 펩티드는 특이적 위치에서 적당한 기능기를 이용하여 "예비활성화"시킨다. PEG 부분과 반응시키기에 앞서, 전구체를 정제하고 완전히 성상 확인한다. 펩티드를 PEG와 연결시키는 것은 통상적으로, 수성 상에서 수행되고, 이는 역상 분석적 HPLC에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다. PEG화 펩티드는 조제적 HPLC에 의해 용이하게 정제할 수 있고, 분석적 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광측정법에 의해 성상 확인할 수 있다.
a. 펩티드 반응성 부위
몇몇 양태에서는, 주로 반응 조건, 중합체의 분자량 등에 따라서, 펩티드를 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 통하여 중합체의 말단 반응성기에 공유 결합시킨다. 반응성기 (들)를 수반한 중합체가 본원에서 활성화 중합체로서 명명된다. 반응성기는 자유 아미노 또는 펩티드 상의 기타 반응성기와 선택적으로 반응한다. 잠재적 반응성 부위에는 N-말단 아미노기, 리신 잔기 상의 엡실론 아미노기 뿐만 아니라 기타 아미노, 이미노, 카복실, 설프히드릴, 히드록실, 및 기타 친수성기가 포함된다. 그러나, 최적의 결과를 수득하기 위해 선택된 반응성기의 유형 및 양 뿐만 아니라 이용된 중합체의 유형은, 반응성기가 펩티드 상의 너무 많은 특별한 활성기와 반응하는 것을 피하기 위해 이용된 특정한 펩티드에 좌우될 것이라는 것을 인지해야 한다. 몇몇 양태에서, 반응성 잔기 (예를 들면, 리신 (K), 변형된 비-천연의 아미노산, 또는 기타 소분자)를, 접합에 적합한 위치에서 치환시킬 수 있다.
몇몇 양태에서, 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열을 포함하는 펩티드는 말단 반응성기를 갖는다. 몇몇 양태에서, 펩티드는 서열식 I, 서열식 II, 서열식 III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (서열 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (서열 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (서열 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (서열 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (서열 9)의 서열, 또는 도 32에 기재된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 적어도 하나, 보다 바람직하게는 하나 이상 포함한다. 함께 연결되는 폴리펩티드는 동일한 서열 또는 상이한 서열과 말단 반응성기를 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, 이들 폴리펩티드는 임의로, 링커의 사용을 통하여 서로 연결될 수 있다.
접합이 폴리펩티드 상의 모든 반응성 아미노산에서 일어날 수 있긴 하지만, 몇몇 양태에서는 반응성 아미노산이, 자유 엡실론-아미노기를 통하여 활성화 중합체의 반응성기에 연결되는 리신; 또는 아미드 결합을 통하여 중합체에 연결되는 글루탐산 또는 아스파르트산이다. 몇몇 양태에서 폴리펩티드의 반응성 아미노산은 위치 X2 및 X12에서의 시스테인 잔기가 아니다.
각 펩티드와의 중합체 접합 정도는 펩티드 상의 반응성 부위의 수; 중합체의 분자량, 친수성 및 기타 특징; 및 선택된 특정한 펩티드 유도체화 부위에 따라서 다양할 것이다. 몇몇 양태에서는 접합체가 펩티드 분자당 1 내지 10개 중합체 분자의 최종 몰비를 갖지만, 본 발명의 펩티드에 부착된 더 많은 수의 중합체 분자가 또한 고려된다. 몇몇 양태에서는 각 접합체가 1개의 중합체 분자를 함유한다. 목적량의 유도체화는, 접합체의 중합체 치환도를 크기 배제 크로마토그래피 또는 당해 분야에 공지된 기타 수단에 의해 결정한 후, 시간, 온도 및 기타 반응 조건을 다양하게 하여 치환도를 변화시키는 실험용 매트릭스를 사용함으로써 용이하게 달성시킨다.
b. 활성화 중합체
몇몇 양태에서는, 중합체가 반응성인 단일기 만을 함유한다. 이는 단백질 분자의 가교결합을 피하는데 도움을 준다. 그러나, 가교결합을 감소시키기 위해 반응 조건을 최대화하거나, 또는 실질적으로 균질한 유도체를 회수하기 위해 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 반응 생성물을 정제하는 것이 본 발명의 범위 내에 속한다. 기타 양태에서는, 중합체가 다중 펩티드를 중합체 주쇄에 연결시킬 목적의 2개 이상의 반응성기를 함유한다. 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피를 재사용하여 실질적으로 균질한 형태의 목적하는 유도체를 회수할 수 있다. 몇몇 양태에서는, 다기능성 (통상 이기능성) 가교결합제를 사용하지 않고서도 중합체를 펩티드에 직접적으로 공유 결합시킨다. 몇몇 양태에서는 PEG 쇄 대 펩티드의 몰 비가 1:1이다.
공유 변형 반응은 펩티드 상의 반응성기가 리신기인 경우에 바람직하게는 약 pH 5 내지 9, 보다 바람직하게는 7 내지 9에서, 생물학적 활성 물질을 불활성 중합체와 반응시키는데 일반적으로 이용되고 있는 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 이러한 공정은 활성화 중합체 (활성화시키고자 하는 적어도 하나의 말단 히드록실기를 전형적으로 갖는 중합체)를 제조하고; 이러한 중합체로부터 활성 기질을 제조한 후; 펩티드를 활성 기질과 반응시켜, 제형화에 적합한 펩티드를 생성시키는 것을 포함한다. 상기 변형 반응은 한 가지 이상의 단계를 포함할 수 있는 여러 방법에 의해 수행할 수 있다. 활성화 중합체를 1-단계 반응으로 제조하는데 사용될 수 있는 변형제의 예에는 시아누르산 클로라이드 (2,4,6-트리클로로-S-트리아진) 및 시아누르산 플루오라이드가 포함된다.
몇몇 양태에서는, 변형 반응이 2 단계로 수행되는데, 여기서는 중합체를 먼저, 산 무수물, 예를 들면, 석신산 또는 글루타르산 무수물과 반응시켜 카복실산을 형성시킨 다음, 이러한 카복실산을 카복실산과 반응할 수 있는 화합물과 반응시켜, 펩티드와 반응할 수 있는 반응성 에스테르기를 수반한 활성화 중합체를 형성시킨다. 상기 화합물의 예에는 N-히드록시석신이미드, 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산 등이 포함되고, 바람직하게는 N-히드록시석신이미드 또는 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산을 사용한다. 예를 들어, 모노메틸 치환된 PEG를 승온, 바람직하게는 약 100 내지 110℃ 하에 4시간 동안 글루타르산 무수물과 반응시킬 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 모노메틸 PEG-글루타르산을 카보디이미드 시약, 예를 들면, 디시클로헥실 또는 이소프로필 카보디이미드의 존재 하에 N-히드록시석신이미드와 반응시켜 활성화 중합체인 메톡시폴리에틸렌 글리콜릴-N-석신이미딜 글루타레이트를 생성시킨 다음, 이를 GH와 반응시킬 수 있다. 이러한 방법은 문헌 [참고: Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984)]에 상세히 기재되어 있다. 또 다른 예에서는, 모노메틸 치환된 PEG를 글루타르산 무수물과 반응시킨 다음, 디시클로헥실 카보디이미드의 존재 하에 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산 (HNSA)과 반응시켜 활성화 중합체를 생성시킬 수 있다. HNSA는 문헌 [참고: Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical Co., RockfordIll., 1981), p. 97-100, and in Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) entitled "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications"]에 기재되어 있다.
몇몇 양태에서, 아미노기에 대한 공유 결합은 염화시아누르, 카보닐 디이미다졸, 알데히드 반응성기 (PEG 알콕시드 플러스 브로모아세트알데히드의 디에틸 아세탈; PEG 플러스 DMSO 및 아세트산 무수물, 또는 PEG 클로라이드 플러스 4-히드록시벤즈알데히드의 페녹시드, 활성화 석신이미딜 에스테르, 활성화 디티오카보네이트 PEG, 2,4,5-트리클로로페닐클로로포르메이트 또는 P-니트로페닐클로로포르메이트 활성화 PEG)를 기준으로 하여 공지된 화학에 의해 달성시킨다. 카복실기는 카보디이미드를 사용하여 PEG-아민을 커플링시킴으로써 유도체화한다. 설프히드릴기는 WO 97/10847 (1997년 3월 27일자로 공개됨)에 기재된 바와 같은 말레이미도-치환된 PEG (예: 알콕시-PEG 아민 플러스 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트), 또는 공급처 [Nektar Technologies, San Carlos, CA (이전 명칭: Shearwater Polymers, Inc.)]로부터 시판되고 있는 PEG-말레이미드와 커플링시킴으로써 유도체화한다. 또 다른 한편, 펩티드 상의 자유 아미노기 (예: 리신 잔기 상의 엡실론 아미노기)를 N-히드록시석신이미딜 치환된 PEG (Nektar Technologies로부터 입수 가능한 PEG-NHS)와 커플링시킬 수 있거나, 또는 2-이미노-티올란 [트라우츠 시약 (Traut's reagent)]으로 티올화시킨 다음, 문헌 [참고: Pedley et al., Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994)]에 기재된 바와 같이 PEG의 말레이미드 함유 유도체와 커플링시킬 수 있다.
PEG를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 많은 불활성 중합체가 제약에 사용하기 적합하다 (예를 들어, 문헌 [Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980)] 참고). 본 발명의 몇몇 양태에서는, 비-단백질 함유 중합체를 사용한다. 비-단백질 함유 중합체는 전형적으로, 친수성 합성 중합체, 즉 천연 상태에서는 발견되지 않는 중합체이다. 그러나, 본래의 공급원으로부터 분리되는 중합체와 같이, 천연 상태로 존재하고 재조합 또는 시험관내 방법에 의해 생성되는 중합체 또한 유용하다. 친수성 폴리비닐 중합체가 본 발명의 범위 내에 속하는데, 예를 들면 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐 피롤리돈이 있다. 특히 유용한 것은 폴리알킬렌 에테르, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리옥시알킬렌, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체 (Pluronics); 폴리메타크릴레이트; 카보머; 당류 단량체 D-만노스, D- 및 L-갈락토스, 푸코스, 프럭토스, D-크실로스, D-아라비노스, D-글루쿠론산, 시알산, D-갈락투론산, D-만누론산 (예: 폴리만투론산, 또는 알진산), D-글루코사민, D-갈락토사민, D-글루코스 및 뉴라민산을 포함하는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예를 들어 동종-다당류 및 이종-다당류, 예를 들면, 락토스, 아밀로펙틴, 전분, 히드록시에틸 전분, 아밀로스, 덱스트란 설페이트, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐, 또는 산 뮤코다당류의 다당류 소단위체, 예를 들면, 히알루론산; 당 알코올의 중합체, 예를 들면, 폴리솔비톨 및 폴리만니톨; 헤파린 또는 헤파론이다.
접합시키기 이전의 중합체가 반드시 수용성일 필요는 없지만, 바람직하게는 수용성이고, 최종 접합체는 바람직하게는 수용성이다. 바람직하게는, 접합체가 약 0.01 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 이상, 보다 더 바람직하게는 약 1 mg/ml 이상의 수 용해도를 나타낸다. 또한, 중합체가 접합체 형태에서 고도로 면역원성일 필요는 없거나, 또는 접합체를 정맥내 주입, 주사 또는 흡입 경로에 의해 투여하고자 하는 경우에는, 이러한 정맥내 주입, 주사 또는 흡입에 비화합성인 점도를 보유하지도 말아야 한다.
중합체의 분자량은 약 100,000 D 이하, 바람직하게는 약 500 D 이상, 또는 약 1,000 D 이상, 또는 약 5,000 D 이상의 범위내일 수 있다. 몇몇 양태에서는, PEG 또는 기타 중합체의 분자량이 5000 내지 20,000 D의 범위 내이다. 선택된 분자량은 달성하고자 하는 접합체의 유효 크기, 중합체의 특성 (예: 구조, 예를 들면, 선형 또는 분지), 및 유도체화 정도, 즉 펩티드당 중합체 분자의 수, 및 펩티드 상의 중합체 부착 부위 (들)에 좌우될 수 있다. 몇몇 양태에서는 분지된 PEG의 중합체를 사용하여 펩티드의 유효 크기의 상당한 증가를 유도시킬 수 있다. PEG 또는 기타 중합체 접합체를 활용하여 반감기를 증가시키고, 용해도를 증가시키며, 단백질 분해적 공격으로부터 안정화시키며, 면역원성을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드를 변형시키기 위한 기능성화 PEG 중합체는 공급처 [Nektar Technologies of San Carlos, CA (이전 명칭: Shearwater Polymers, Inc.)]로부터 입수 가능하다. 이러한 시판되고 있는 PEG 유도체에는 아미노-PEG, PEG 아미노산 에스테르, PEG-N-히드록시석신아미드 화학 (NHS), PEG-히드라지드, PEG-티올, PEG-석시네이트, 카복시메틸화 PEG, PEG-프로피온산, PEG 아미노산, PEG 석신이미딜 석시네이트, PEG 석신이미딜 프로피오네이트, 카복시메틸화 PEG의 석신이미딜 에스테르, PEG의 석신이미딜 카보네이트, 아미노산 PEG의 석신이미딜 에스테르, PEG-시카보닐이미다졸, PEG-니트로페닐 카보네이트, PEG 트레실레이트, PEG-글리시딜 에테르, PEG-알데히드, PEG 비닐설폰, PEG-말레이미드, PEG-오르토피리딜-디설파이드, 이종 기능성 PEG, PEG 비닐 유도체, PEG 실란, 및 PEG 포스포리드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 PEG 유도체를 커플링시키기 위한 반응 조건은 단백질, 목적하는 PEG화 정도, 및 활용된 PEG 유도체에 따라서 다양할 것이다. PEG 유도체를 선택하는데 관여한 몇 가지 인자에는 목적하는 부착점 (예를 들면, 리신 또는 시스테인 R기), 유도체의 가수분해적 안정성 및 반응성, 연쇄의 안정성, 독성 및 항원성, 분석 적합성 등이 포함된다. 특정한 유도체의 사용에 대한 구체적인 지시 사항은 제조업자로부터 입수 가능하다.
c. 접합체의 성상 확인
접합체는 SDS-PAGE, 겔 여과, NMR, 트립신 지도화, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법에 의해, 및 시험관내 생물학적 검정에서 성상 확인할 수 있다. 예를 들어, PEG의 접합 정도는 SDS-PAGE 및 겔 여과에 의해 나타낸 다음, PEG의 메틸렌 수소에 대한 특이적 공명 피크를 지닌 NMR에 의해 분석할 수 있다. 각 분자 상의 PEG기의 수는 NMR 스펙트럼 또는 질량 분광측정법으로부터 산정할 수 있다. 10％ SDS 중의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 용출 완충액으로서 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl 중에서 적절히 수행한다. 잔기가 PEG화되는지를 결정하기 위해, 트립신 지도화를 수행할 수 있다. 따라서, PEG화 펩티드를 100 mM 나트륨 아세테이트, 10 mM Tris-HCl, 1 mM 염화칼슘, pH 8.3 중에서 37℃ 하에 4시간 동안 100 대 1 (mg 기준)의 단백질/효소 비율로 트립신으로 분해시킨 다음, pH <4가 되도록 산성화시켜 분해를 중지시킨 후, HPLC 뉴클레오실 (Nucleosil) C-18 (4.6 mm. times.150 mm, 5.mu., 100A) 상에서 분리시킨다. 이 크로마토그램을 비-PEG화 출발 물질의 것과 비교한다. 이어서, 각 피크를 질량 분광측정법에 의해 분석하여 피크 중의 단편의 크기를 확인할 수 있다. PEG 기를 수반한 단편 (들)은 통상적으로, 주사 후 HPLC 칼럼 상에 유지되지 않으며 크로마토그래피로부터 소멸된다. 이와 같이 크로마토그래피로부터 소멸되는 것은 적어도 하나의 리신 잔기를 함유해야 하는 특정한 단편 상에서 PEG화가 이루어졌다는 지표이다. 이어서, PEG화 펩티드를 대상으로 하여, 통상적인 방법에 의해 BLyS와 결합할 수 있는 능력에 대해 검정할 수 있다.
몇몇 양태에서는, 접합체를 이온-교환 크로마토그래피 (예: 이온 교환 HPLC)에 의해 정제한다. 친전자적으로 활성화된 수 많은 PEG의 화학으로 인해, PEG화 생성물의 아미노기 전하가 감소된다. 따라서, 고 해상 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 자유 단백질과 접합된 단백질을 격리시킬 수 있고, 상이한 PEG화 수준을 지닌 종을 분할할 수 있다. 사실상, 상이한 종 (예를 들면, 1개 또는 2개의 PEG 잔기를 함유함)의 분할은 반응되지 않은 아미노산의 이온 특성 상의 차이로 인해 가능하기도 하다. 한 양태에서, 상이한 PEG화 수준을 지닌 종은 WO 96/34015 (국제 출원번호 PCT/US96/05550; 1996년 10월 31일자로 공개됨)에 기재된 방법에 따라서 분할한다. 접합체의 이종 종은 동일한 방식으로 서로로부터 정제시킨다.
몇몇 양태에서는, PEG-N-히드록시석신아미드 (NHS)가 1급 아민 (예: 리신 및 N-말단)과 반응한다. 몇몇 양태에서는, PEG-NHS가 폴리펩티드의 C-말단 리신 (K)과 반응한다. 몇몇 양태에서는, 리신 잔기를 17량체 폴리펩티드의 C-말단에 부가하는 반면, 기타 양태에서는 X17이 리신으로 치환된다. 몇몇 양태에서는, 중합체가 N-말단과 반응한다. 바람직한 양태에서는, 다음 실시예에 기재된 유도체화 및 정제 방법을 활용함으로써 접합체를 생성시킨다.
한 국면에서, 본 발명은 접합체의 공유 분자 구조 내의 외부적 사항없이도, 그의 성분 일부, 즉 하나 이상의 중합체 분자 (들)에 공유적으로 부착된 하나 이상의 펩티드 (들)에 의해 형성된 상기 언급된 모든 접합체를 제공한다.
항체의 생성
본 발명의 방법 및 제품은 CD20과 결합하는 항체를 이용하거나 이를 혼입시킨다. 따라서, 상기 항체를 생성시키는 방법이 본원 및 실시예에 기재될 것이다.
항체를 생성하기 위해 또는 항체에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 CD20은, 예를 들어, 목적하는 에피토프를 함유하는 가용성 형태의 항원 또는 그의 일부일 수 있다. 인간 CD20의 서열은 공지되어 있다 [도 10 및 도 11 참고]. 인간 CD20의 클로닝 및 서열은 적어도 다음 참고 문헌에 기재되어 있다 [참고: Stamenkovic I., Seed B., J. Exp. Med. 167, 1975-1980, 1988. Analysis of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B1, Bp35), a type III integral membraneprotein."; Tedder T. F., Streuli M., Schlossman S. F., Saito H., Proc. Nail. Acad. Sci. U. S. A. 85, 208-212, 1988. "Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes"; Tedder T. F., Klejman G., Schlossman S. F., Saito H., J. Immunol. 142, 2560-2568, 1989. "Structure of the gene encoding the human B lymphocyte differentiation antigen CD20(B1)"; Einfeld D. A., Brown J. P., Valentine M. A., Clark E. A., Ledbetter J. A., EMBO J. 7, 711-717, 1988.: "Molecular cloning of the human B cell CD20 receptor predicts a hydrophobic protein with multiple transmembrane domains."]. 세포외 도메인 (ECD)의 펩티드 단편을 면역원으로서 사용할 수 있다. 이들 공지된 서열과 도메인 윤곽 묘사를 기준으로 하여, 당업자는 항체를 생성하는데 사용하기 위한 CD20 폴리펩티드 및 그의 단편을 발현할 수 있다.
인간 CD20에 대한 항체를 생성하기 위해, 세포외 도메인 아미노산 잔기 142-188, 및 길이가 6개 이상의 잔기인 펩티드 단편을, 마우스, 햄스터 및 랫트를 포함한 설치류, 토끼, 염소 또는 기타 적합한 동물에서 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 가용성 CD20 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 적합한 숙주 세포, 예를 들면, 세균 또는 진핵 세포에서 발현시킬 수 있다. 인간 및 쥐 세정제-가용화된 완전한 길이의 CD20를 이. 콜라이에서 생성시키고 (하기 실시예 참조), 이를 사용하여 면역시키고 항-CD20 항체를 생산하는 하이브리도마에 대해 스크리닝한다.
또 다른 한편, 또는 부가적으로, 세포 표면에서 CD20를 발현하는 B 세포 또는 세포주를 사용하여 항체를 생성시키고/시키거나 이에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 세포주 중의 한 가지가 인간 림프아구계 세포주 SB (ATCC 수탁 번호 ATCC CCL 120; 공급처: ATCC, Rockville, Md)이다. 인간을 치료하기 위해 인간 CD20에 대한 항체를 생성시킨다. 항체를 생성시키는데 유용한 기타 형태의 CD20가 당업자에게 명백할 것이다.
파아지 디스플레이 방법론을 사용하여 CD20 결합 항체를 생산할 수도 있다.
CD20와 결합하는 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 이러한 항체 및 이의 생성 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.
(i) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아쥬반트를 수회 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에게서 생성시키는 것이 바람직하다. 이기능성 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시석신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)를 사용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어, (각각, 토끼 또는 마우스에 대한) 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체를 3 용적의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대항하여 면역시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 중의 펩티드 또는 접합체 본래 양의 1/5 또는 1/10을 다중 부위에 피하 주사함으로써, 상기 동물을 추가면역시킨다. 7 내지 14일 후에, 상기 동물을 번식시키고, 혈청을 대상으로 하여 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 일정한 수준에 도달할 때까지 동물을 추가 면역시킨다. 바람직하게는, 동일한 항원의 접합체이긴 하지만, 상이한 단백질 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통하여 접합된 접합체를 이용하여 동물을 추가 면역시킨다. 접합체를 재조합 세포 배양물 내에서 단백질 융합물로서 만들 수도 있다. 또한, 백반 등의 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증강시킨다.
(ii) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수도 있는 천연의 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 형질이 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것을 지시해준다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물, 예를 들면, 햄스터를 상기 언급된 바와 같이 면역시켜, 면역을 위해 사용된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또 다른 한편, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)] 참고).
이로써 제조된 하이브리도마 세포를 시딩하고, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 한 가지 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에게 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우에는, 하이브리도마에 대한 배양 배지가 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지시키는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합시켜 주고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 안정한 고수준의 항체 생성을 뒷받침해주며, HAT 배지 등의 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 세포주, 예를 들어 공급처 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA]로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것; 및 공급처 [American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA]로부터 입수 가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) 참고).
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 항원에 대항하여 지시된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [참고: Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 과정에 의해 클론을 서브클로닝시킨 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)] 참고). 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물 중에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
상기 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 격리시킨다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 분리 및 서열 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이들은 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 세균 내에서 재조합 발현시키는 것에 관한 고찰 문헌에는 다음 문헌이 포함된다 [참고: Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)].
추가의 양태에서는, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [참고: McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리시킬 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에는 파아지 디스플레이를 사용하여 쥐 및 인간 항체를 각각 분리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파아지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)] 참고) 뿐만 아니라 연쇄 셔플링 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)] 참고)에 의해 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 분리시키기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대체 방안이다.
DNA는, 예를 들어, 상동성 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩 서열로 치환시키거나 (문헌 [미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)] 참고), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수도 있다.
전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 항체의 불변 도메인 대신 사용하거나, 또는 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용하여, 항원에 대한 특이성을 지닌 하나의 항원 결합 부위와, 상이한 항원에 대한 특이성을 지닌 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 창출시킨다.
(iii) 인간화 항체
비-인간 항체를 인간화시키는 방법이 당해 분야에 보고되었다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜한 본래의 인간 가변 도메인을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될, 중쇄 및 경쇄의 인간 가변 도메인의 선택이 항원성을 저하시키는데 있어 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 이때, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 골격 영역 (FR)으로서 허용한다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)] 참고). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 15-1 :2623 (1993)] 참고).
항원에 대한 고 친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성을 유지하고 있는 항체로 인간화시키는 것이 추가로 중요하다. 이를 달성하기 위한 바람직한 양태에 따르면, 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 시판되고 있으며, 당업자에게 널리 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 추정상의 3차원 입체 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수 가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 면역글로불린이 이의 항원과 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선별하고, 이를 수용자로부터 유입 서열과 합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들면, 표적 항원 (들)에 대한 증가된 친화성을 달성하도록 한다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합 기능에 있어 직접적이면서도 가장 실재적으로 관여한다.
(iv) 인간 항체
인간화에 대한 대체 방안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제되는 것으로 보고되었다. 이러한 생식 계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호] 참고).
또 다른 한편, 파아지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)] 참고)을 사용하여, 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트상 박테리오파아지, 예를 들면, M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파아지 입자 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트상 입자는 파아지 게놈의 일본쇄 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기준으로 하여 선별하게 되면, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수 있다. 따라서, 파아지는 B 세포의 특성들 중의 몇 가지 특성을 모방한다. 파아지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있으며, 이들에 대한 고찰은, 예를 들어, 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]. V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파아지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 분리하였다. 비면역화 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자가 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 필수적으로, 문헌 [참고: Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라서 분리시킬 수 있다 [또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참고].
인간 항체는 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [참고: 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호].
(v) 항체 단편
항체 단편을 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래의 항체를 단백질 분해적 절단시킴으로써 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참고). 그러나, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 또 다른 한편, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)] 참고). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리시킬 수 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 양태에서는 선택되는 항체가 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [참조: WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호]. 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.
(vi) 이중-특이적 항체
이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체이다. 예시되는 이중-특이적 항체는 B 세포 표면 마커의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 제1 B 세포 마커와 결합할 수 있고, 제2 B 세포 표면 마커와 추가로 결합할 수 있다. 또 다른 한편, 항-B 세포 마커 결합 암을, B 세포에 대한 세포성 방어 기전에 집중하도록, 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들면, T-세포 수용체 분자 (예: CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 암과 합할 수 있다. 이중-특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 B 세포에 국재시킬 수도 있다. 이들 항체는 B 세포 마커-결합성 암과, 세포독성제 (예: 사포린, 항인터페론-, 빈카 알카로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)과 결합하는 암을 보유하고 있다. 이중-특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예: F(ab')2 이중-특이적 항체)로서 제조할 수 있다.
이중-특이적 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전통적인 완전한 길이의 이중-특이적 항체의 생성 방법은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)] 참고). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마(quadromas)]는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 친화 크로마토그래피 단계에 의해 통상 수행되는, 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율도 낮다. 유사한 과정이 문헌 [참고: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3가지 폴리펩티드 쇄의 부적당한 비율이 최적의 수율을 제공해주는 경우의 양태에서, 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 융통성을 제공해준다. 그러나, 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄를 동등한 비율로 발현시키는 것이 고 수율을 가져다 주거나, 또는 이들 비율이 특별한 의미를 갖지 않은 경우에, 2가지 또는 3가지 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 바람직한 양태에서는, 이중-특이적 항체가 하나의 암 중에 제1의 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 암 중에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2의 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가 목적하는 이중-특이적 화합물을 바람직하지 못한 면역글로불린 쇄 조합물로부터 격리시키는 것을 촉진시켜 주는데, 이는 이중-특이적 분자의 단지 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 격리 방식을 제공해주기 때문이다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중-특이적 항체를 생성시키기 위한 추가의 내역에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참고할 수 있다. 미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 계면을 공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종-이량체의 비율 (％)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "강(cavity)"은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 창출시킨다. 이는 기타 바람직하지 못한 최종 생성물, 예를 들면, 동종-이량체에 비해 이종-이량체의 수율을 증가시켜 주는 기전을 제공한다.
이중-특이적 항체에는 가교결합되거나 "이종-접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종-접합체 내의 항체들 중의 하나를 아비딘에 커플링시킬 수 있고, 다른 것은 바이오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 바람직하지 못한 세포에 표적화하고 [참고: 미국 특허 제4,676,980호], HIV 감염을 치료하는 것으로 제안되었다 [참조: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089]. 이종 접합체 항체는 편리한 모든 가교결합 방법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 수 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이중-특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [참조: Brennan et al, Science, 229: 81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을 디티올 착화제 나트륨 아비산염의 존재 하에 환원시켜 근접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시킨다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써, Fab'-TNB 유도체들 중의 하나를 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중-특이적 항체를, 효소를 선택적으로 고정화시키기 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근 기술상의 진보로 인해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 것이 촉진되었는데, 이들 단편을 화학적으로 커플링하여 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중-특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성 방법이 기재되어 있다. 각 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 별개로 분비시키고, 이를 대상으로 하여 시험관 내에서 직접적인 화학적 커플링을 수행하여 이중-특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중-특이적 항체는 인간 유방 종양 표적에 대항한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킬 뿐만 아니라 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포와 결합할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 분리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중-특이적 항체를 생성시켰다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)] 참고). Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종-이량체를 생성시키기 위해 활용할 수도 있다. 문헌 [참조: Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디 (diabody)" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인와 짝짓기시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152: 5368 (1994)] 참고).
2 원자가 이상을 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다 (문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)] 참고).
본원에 기재된 단백질 또는 펩티드 길항제 및 항체의 아미노산 서열 변형 (들)이 고려된다. 예를 들어, CD20 결합 항체 또는 길항제의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 길항제의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를 길항제 핵산 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들어 길항제의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 최종 구조물에 도달하기 위해 만들어질 수 있는데, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유하고 있어야 한다. 아미노산 변화는 길항제의 해독 후 프로세스를 변형시킬 수도 있는데, 예를 들면, 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시킨다.
돌연변이 유발시키는데 바람직한 부위인 길항제의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌 [참고: Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은, 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"이다. 여기서는, 특정 잔기 또는 표적 잔기 군을 확인하고 (예: 전하를 띤 잔기, 예를 들면, arg, asp, his, lys, 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시켜 아미노산과 항원 간의 상호 작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환 부위에 추가의 또는 기타 변이체를 도입함으로써, 상기 치환에 대한 기능적 민감도를 나타내는 아미노산 위치를 세밀히 구별시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 위치는 예정된 것이긴 하지만, 돌연변이 특성 그 자체가 반드시 예정될 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 길항제 변이체를 대상으로 하여 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입에는 길이가 1개의 잔기에서 부터 수 백개의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 수반한 길항제, 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제가 포함된다. 길항제 분자의 기타 삽입 변이체에는 효소, 또는 길항제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의, 길항제의 N- 또는 C-말단에 대한 융합물이 포함된다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 길항제 분자 내에 상이한 잔기에 의해 대체된 적어도 하나의 잔기를 갖는다. 항체 길항제의 치환적 돌연변이 유발에 가장 큰 관심이 집중되는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이란 표제하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 인해, 생물학적 활성이 변하면, 표 1에서 "예시 치환"으로 명명되거나 또는 아미노산 부류를 기준으로 하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 상당한 변화를 도입할 수 있고 생성물을 스크리닝할 수 있다.
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길항제의 생물학적 활성 상의 상당한 변형은 (a) 치환 부위 내에서 폴리펩티드 주쇄 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선상 입체 형태로서 유지시키거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는데 있어서의 효과 상의 상당한 차이를 나타내는 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 다음 군으로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성의 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시켜 줄 것이다.
길항제의 적당한 입체 형태를 유지하는데 관여하지 않은 모든 시스테인 잔기를 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교결합을 방지시킬 수도 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합 (들)을 길항제에 가하여 (특히, 길항제가 항체 단편, 예를 들면, Fv 단편인 경우) 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
특히 바람직한 유형의 치환적 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이로써 생성된, 추가의 개발을 위해 선별된 변이체 (들)은 이들을 생성시킨 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 지닐 것이다. 이러한 치환적 변이체를 생성시키는 편리한 방식은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화적 성숙이다. 간략하게 언급하면, 여러 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환물을 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체를, 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파아지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이한다. 이어서, 파아지-디스플레이된 변이체를 대상으로 하여, 본원에 기재된 바와 같은 생물학적 활성 (예: 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형시키기 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기가, 본원에 언급된 기술에 따라서 치환하기 위한 후보물이다. 상기 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 하여 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한 가지 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선별할 수 있다.
길항제의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 길항제의 본래의 당화 패턴을 변경시킨다. 변경시킨다는 것은 길항제에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 길항제에는 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가하는 것을 의미한다. 폴리펩티드의 당화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 당화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
당화 부위를 길항제에 부가하는 것은 (N-연결된 당화 부위를 위해) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중의 하나 이상를 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 길항제 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수 있다 (O-연결된 당화 부위를 위함). 길항제의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 (천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 천연 공급원으로부터 분리시키는 방법, 또는 길항제의 초기에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조가 포함된다.
효과기 기능 측면에서, 예를 들어, 길항제의 항원-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증강시키도록 본 발명의 길항제를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체 길항제의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 시스테인 잔기 (들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역에서 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 동종-이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 지닐 수 있다 (문헌 [Caron et al, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B.J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)] 참고). 문헌 [참고: Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종-이기능성 가교결합제를 사용하여, 항종양 활성이 증강된 동종-이량체성 항체를 제조할 수도 있다. 또 다른 한편, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 공학적으로 처리시킴으로써, 증강된 보체 용해 및 ADCC 능력을 지니게 할 수 있다 (문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)] 참고).
길항제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 구제 수용체 (salvage receptor) 결합성 에피토프를 길항제 (특히, 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "구제 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예: IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
검정
CD3-/CD40+ 세포를 계수하는 FACS 방법에 의해 말초 B-세포 농도를 측정한다. 샘플 내에서 총 림프구 중의 CD3-CD40+ B 세포의 ％는 다음 게이팅 전략에 의해 수득할 수 있다. 림프구 집단을 전방 산란/측면 산란 산포도 상에 표식하여 영역 1 (R1)의 범위를 한정한다. R1에서의 사건을 이용하여, 형광 세기 도프 플롯을 CD40 및 CD3 마커에 대해 디스플레이한다. 형광성 표지된 이소형 대조군을 사용하여 CD40 및 CD3 양성도에 대한 각각의 컷오프 지점을 결정한다.
FACS 분석
50만개 세포를 세척하고, 5 ㎕의 염색 또는 대조군 항체를 함유하는, 1％ BSA를 수반한 인산염 완충 식염수인 100 ㎕의 FACS 완충액 중에서 재현탁시킨다. 이소형 대조군을 포함한, 염색하는 모든 항체는 공급처 [PharMingen, San Diego, CA]로부터 수득한다. 인간 CD20 발현은 FITC-접합된 항-인간 IgG1 2차 항체와 함께 리툭산 (Rituxan®)으로 염색함으로써 평가한다. FACScan 및 Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 사용하여 FACS 분석을 수행한다. 모든 림프구는 전방 및 측광 산란에서 규정된 반면, 모든 B 림프구는 세포 표면 상에서의 B220의 발현으로 규정된다.
B 세포 고갈 및 회수는, 말초 B 세포 계수치를 분석하고 비장, 림프절 및 골수에서 FACS에 의해 hCD20+ B 세포를 분석함으로써 평가하는데, 이는 주사한 후 처음 1주 동안은 매일 수행하고 그 후에는 매주 수행한다. 주사된 2H7 변이체 항체의 혈청 수준을 모니터링한다.
제약 조성물
본 발명에 따라서 사용된 CD20-결합 항체의 치료적 제형은 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 참고)와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 완충제, 예를 들면 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 산화방지제, 예를 들면 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
항-CD20 항체 제형의 예는 본원에 참고도 도입된 W0 98/56418에 기재되어 있다. 또 다른 제형은 2 내지 8℃ 하의 저장시 최소 2년의 저장 수명을 갖는, 항-CD20 항체 40 mg/ml, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알코올, 0.02％ 폴리솔베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 반복투여용 액상 제형이다. 관심있는 또 다른 항-CD20 제형은 9.0 mg/ml 염화나트륨 중의 10 mg/ml 항체, 7.35 mg/ml 나트륨 시트레이트 이수화물, 0.7 mg/ml 폴리솔베이트 80, 및 멸균성 주사용 수 (pH 6.5)를 포함한다. 또 다른 수성 제약 제형은 10-30 mM 나트륨 아세테이트 (약 pH 4.8 내지 약 pH 5.5, 바람직하게는 pH 5.5), 약 0.01 내지 0.1％ v/v 양의 계면활성제로서의 폴리솔베이트, 약 2 내지 10％ w/v 양의 트레할로스, 및 방부제로서의 벤질 알코올 [참고: 미국 특허 제6,171,586호]을 포함한다. 피하 투여용으로 적응시킨 동결건조된 제형은 W0 97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제를 사용하여 고 단백질 농도가 되도록 재구성할 수 있고, 이와 같이 재구성된 제형은 본원에서 치료하고자 하는 포유동물에게 피하 투여할 수 있다.
인간화 2H7 변이체에 대한 한 가지 제형은 10 mM 히스티딘, 6％ 슈크로스, 0.02％ 폴리솔베이트 20 (pH 5.8) 중의 12 내지 14 mg/ml의 항체이다. 구체적 양태에서, 2H7 변이체, 특히 2H7.v16를 lO mM 히스티딘 설페이트, 60 mg/ml 슈크로스, 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 20, 및 멸균성 주사용 수 (pH 5.8) 중의 항체 20 mg/ml로 제형화한다.
본원에서의 제형은 치료하고 자하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토킨 또는 면역억제제 (예를 들면, T 세포 상에서 작용하는 작용제, 예를 들면, 시클로스포린, 또는 T 세포와 결합하는 항체, 예를 들면, LFA-1과 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용하거나, 또는 전술된 이용 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.
활성 성분을, 예를 들어, 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 길항제를 함유하는 고형 친수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테애트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
질병 치료
질병
본 발명의 CD20 결합 항체 및 BLyS 길항제는 B 세포 악성 종양 및 B 세포 조절된 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.
B 세포 조절된 자가면역 질환에는 관절염 (류마티스성 관절염, 유년성 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염), 건선, 아토피성 피부염을 포함한 피부염; 만성 자가면역 두드러기, 다발성근염/피부근염, 독성 표피 괴사용해, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 장 질환 (IBD)과 연관된 반응 (크론병, 궤양성 결장염), 호흡기 장애 증후군, 성인 호흡기 장애 증후군 (ARDS), 수막염, 알레르기성 비염, 뇌염, 포도막염, 결장염, 사구체신염, 알레르기성 질환, 습진, 천식, T 세포의 침윤과 연관된 질환 및 만성 염증 반응, 아테롬성 경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 (신염, 비-신성, 원판상, 탈모증 포함), 유년기 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과감작과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증 (sarcoidosis), 베게너스 (Wegener's) 육아종증을 포함한 육아종증, 과립구결핍증, 혈관염 (ANCA 포함), 재생불량성 빈혈, 콤브스 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수한 적혈구 무형성 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병 (Bechet disease), 캐슬맨 증후군 (Castleman's syndrome), 구드패스츄어 증후군 (Goodpasture's Syndrome), 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 (Stevens- Johnson) 증후군, 고형 기관 이식체 거부 (고 패널 반응성 항체 역가에 대한 전처리, 조직 내에서의 IgA 침착 등 포함), 이식편 대 숙주 질병 (GVHD), 유사천포창 물집, 천포창 (보통천포창, 낙엽천포창 포함), 자가면역 폴리내분비증 (polyendocrinopathies), 라이터병 (Reiter's disease), 근육강직 증후군, 거세포(성) 동맥염, 면역 복합 신염, IgA 신병증, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개된 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 고환 및 난소의 자가면역 질환 (자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능저하증 포함), 자가면역 내분비 질환 [자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디송병 (Addison's disease), 그레이브스병 (Grave's disease), 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비증 증후군), 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM)으로서 지칭되기도 하는 유형 I 당뇨병 및 쉬이한 증후군 (Sheehan's syndrome) 포함]; 자가면역 간염, 림프계 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre' Syndrome), 대혈관 혈관염 (류마티스성 다발성 근통 및 거대 세포 (다카야스) 동맥염 포함), 중간 혈관 혈관염 [가와사키병 (Kawasaki's Disease) 및 결절성 다발성 동맥염 포함), 강직성 척추염, 베르거병 [Berger's Disease (IgA 신경병증)], 신속하게 진행되는 사구체신염, 원발 담즙성 간경변, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 한랭글로불린혈증, ALS, 관상 동맥 질환이 포함된다.
B 세포 신생물에는 CD20-양성 호지킨병 [림프구 우위형 호지킨병 (LPHD) 포함]; 비호지킨 림프종 (NHL); 소포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발 세포 백혈병이 포함된다. 비호지킨 림프종에는 저 등급/소포 비호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 중간 등급/소포 NHL, 중간 등급 확산 NHL, 고 등급 면역 모세포 NHL, 고 등급 림프아구성 NHL, 고 등급 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 형질세포계 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia)이 포함된다. 이들 암의 재발을 치료하는 것 또한 고려된다. LPHD는 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발하는 경향이 있는 호지킨병의 유형이고, CD20-양성 악성 세포를 특징적으로 나타낸다. CLL은 4가지 주요 유형의 백혈병 중의 하나이다. 림프구로 불리우는 성숙 B 세포의 암인 CLL은 세포가 혈액, 골수 및 림프 조직 내에 진행성 축적되는 징후를 나타낸다. 무통성 림프종은 서서히 성장하는 불치병인데, 수 차례의 일시적 차도와 재발을 반복한 후에 환자들은 평균 6 내지 10년 정도 생존한다.
구체적 양태에서, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체는 비호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우위형 호지킨병 (LPHD), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소 림프구성 림프종 (SLL) [이는 비호지킨 림프종 (NHL)의 한 유형이다], 류마티스성 관절염 및 유년성 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염 포함), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 치료하는데 사용한다.
목적 수준의 B 세포 고갈은 해당 질병에 좌우될 것이다. CD20 양성 암을 치료하기 위해서는, 본 발명의 항-CD20 항체의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, CD20 양성 B 세포 신생물을 치료하기 위해서는, 예를 들어, 종양 성장 (크기), 암성 세포 유형의 증식, 전이, 특정 암의 기타 징후 및 증상을 모니터링함으로써, 당해 분야의 의사에 의해 평가될 수 있는 질병의 진행을 적어도 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 질병의 진행을 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월, 보다 바람직하게는 4개월, 보다 바람직하게는 5개월, 보다 더 바람직하게는 6개월 정도 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 보다 더 바람직한 양태에서는, 병의 차도 시간을 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년, 보다 바람직하게는 3년, 보다 더 바람직하게는 5년 이상 증가시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 가장 바람직한 양태에서는, 해당 질병을 치료하기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 바람직한 양태에서는, 암 환자에게서의 B 세포 고갈이 치료전 기준선 수준의 약 75％ 이상, 보다 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 및 심지어 100％이다.
자가면역 질환을 치료하기 위해서는, CD20 결합 항체의 투여량을 조정함으로써, 개개 환자에게서 질병 및/또는 질환의 중증도에 따라서 B 세포 고갈 정도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, B 세포 고갈은 완성할 수 없을 뿐만 아니라 완성되지도 않는다. 또한, 총 B 세포 고갈은 초기 치료에서는 요망되지만, 후속 치료에서는 그렇치 않을 수 있으며, 투여량은 부분 고갈만을 달성하도록 조정할 수 있다. 한 양태에서는, B 세포 고갈이 20％ 이상인데, 즉 치료전의 기준선 수준과 비교해서 CD20 양성 B 세포의 80％ 이하가 잔존한다. 기타 양태에서, B 세포 고갈은 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％ 이상이다. 바람직하게는, B 세포 고갈이 질병의 진행을 중지시키기에 충분하고, 보다 바람직하게는 치료 중인 특정한 질병의 징후 및 증상을 완화시키기에 충분하고, 보다 더 바람직하게는 질병을 치유하기에 충분하다.
리툭시맙을 이용한 요법에 관한 공개 문헌에는 다음이 포함된다 [참고: Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1) (part 1-2): p. 88B (1998); Stashi et al "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61: 833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al. "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1): 2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40: 205-211 (2001); Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab. "Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002].
치료적 응용하기 위해, 본 발명의 항-CD20 항체와 BLyS 길항제를, 예를 들어 화학요법제, 호르몬, 항혈관형성제, 방사성 표지된 화합물과의 조합 요법, 또는 수술, 한랭요법 및/또는 방사선 요법과의 조합 요법에 사용할 수 있다. 앞서의 치료 방법은 기타 형태의 통상적 요법과 연계해서 투여할 수 있는데, 통상적 요법과 연속해서, 통상적 요법 전 또는 후에 투여한다. 항-CD20 항체와 BLyS 길항제는 치료상 유효량의 화학요법제와 함께 투여할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 항-CD20 항체와 BLyS 길항제를 화학요법과 연계해서 투여하여 화학요법제의 활성과 효능을 증강시킨다. 의사용 탁상 편람 (PDR)에는 각종 암 치료에 사용되어 온 화학요법제의 투여량이 기재되어 있다. 치료상 유효한 이들 전술된 화학요법제의 투약 섭생과 투여량은 치료하고자 하는 특정 암, 질병의 정도 및 당해 분야의 의사에게 친숙한 기타 요인들에 의해 좌우될 것이고, 이는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여한 후에 치료전과 비교해서 증상 또는 기타 적용 가능한 기준 상의 측정 가능한 정도의 개선이 있는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 환자에게서 B 세포 신생물 또는 B 세포 조절된 자가면역 질환을 완화시키거나 성공적으로 치료하였다. 치료 효과는 본 발명의 조성물을 투여한 후 3 내지 10주 이내에 분명할 수 있다. 각 질병에 대한 적용 가능한 기준은 해당 분야의 의사에게 널리 공지될 것이다. 예를 들어, 의사는 치료받은 환자를 대상으로 하여, 질병의 임상 또는 혈청학적 증거, 예를 들면, 질병의 혈청학적 마커, 완전한 혈액 계수치 (B 세포 계수치 포함), 및 혈청 면역글로불린 수준에 대해 모니터링할 수있다. IgG 및 IgM의 혈청 수준은 BR3-Fc 처리된 마우스에서 감소된다. BR3-Fc 또는 항-CD20 항체 치료, 또는 양 치료에 반응하는 인간 환자 역시, 혈청 IgG 및 IgM 수준 상의 감소를 나타낼 것으로 예상된다. 환자는 다음 중의 하나 이상에 있어 관찰 가능하고/하거나 측정 가능한 수준의 감소를 나타내거나 다음 중의 하나 이상의 부재를 나타낼 수 있다: 암 세포 수의 감소, 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 암 세포가 기관 내로 침윤되는 것의 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킴); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킴); 종양 성장의 어느 정도의 억제; 및/또는 특이적 암과 연관된 한 가지 이상 증상의 어느 정도의 경감; 사망률과 발병률 저하, 및 삶의 질 개선. 바람직하게는, 본 발명의 조성물을 투여한 후, 본 발명의 방법에 의한 치료 전에 취한 판정 기준 또는 특별한 증후군에 대한 기준선에 비해 20％ 이상, 보다 바람직하게는 25-30％, 보다 더 바람직하게는 30-35％, 가장 바람직하게는 40％ 이상의 개선이 이루어진다.
신생물의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질병 담당 의사에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 해당 분야 의사는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 파라미터에는 평균 질병 진행 시간, 병의 차도 시간 및 안정한 질병이 포함될 수 있다. B 세포 신생물의 경우, 측정 가능한 기준에는, 예를 들어 병이 진행되는 시간, 전체 생존 기간 및/또는 병이 진행되지 않고 생존하는 기간의 증가가 포함될 수 있다. 백혈병의 경우에는, 골수 생검을 수행하여 차도 정도를 결정할 수 있다. 완전한 차도는 치료한지 30일 후에 환자의 골수에서 발견되는 모든 세포의 5％ 미만에서 백혈병 세포가 만들어지는 것으로 정의될 수 있다.
다음 참고 문헌에는 림프종 및 CLL, 이들의 진단, 치료, 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의학 과정이 기재되어 있다 [참고: Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].
자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질병 담당 의사에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 해당 분야 의사는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 다음의 이의 예이다:
류마티스성 관절염 (RA)은 원인 미상의 자가면역 질환이다. 대부분의 RA 환자는 만성 질환 과정으로 고통받고 있으며, 심지어 요법을 행한 경우에도 진행성 관절 파괴, 기형, 장애 및 심지어 미숙한 사망에 이를 수 있다. RA 요법의 목표는 관절 손상을 예방 또는 제어하고, 기능 손실을 예방하며 통증을 감소시키는 것이다. 초기 RA 요법은 통상적으로, 다음 약물들 중의 한 가지 이상을 투여하는 것을 포함한다: 비스테로이드성 소염 약물 (NSAIDs), 글루코코르티코이드 (관절 주사를 통함), 및 저 용량 프레드니손 (문헌 ["Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)] 참고). RA인 것으로 새로이 진단된 대부분의 환자는 진단한지 3개월 이내에 질병 완화 항류마티스약 (DMARD) 요법으로 시작한다. RA에 흔히 사용되는 DMARDs는 히드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에탄에르셉트, 인플릭시맙 (경구 및 피하 메토트렉세이트가 부가됨), 아자티오프린, D-페니실라민, 골드 (경구), 골드 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 스타필로코쿠스성 단백질 A 면역흡착제이다.
RA 동안 신체는 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 생산하기 때문에, TNFα 억제제가 상기 질병에 대한 요법에 사용되었다. 에탄에르셉트 (ENBREL®)는 활성 RNA의 요법에 대해 미국에서 승인된 주사용 약물이다. 에탄에르셉트는 TNFα와 결합하고 대부분의 TNFα를 관절과 혈액으로부터 제거시키는 작용을 함으로써, TNFα가 염증 및 류마티스성 관절염의 기타 증상을 증진시키지 못하게 한다. 에탄에르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진다. REMICADE®이란 상표명으로 시판중인 인플릭시맙은 RA와 크론병을 치료하도록 처방된 면역억제성 약물이다. 인플릭시맙은 TNFα와 결합하고, 염증을 유발시키는 TNFα를 표적으로 하여 이와 결합함으로써, 체내의 염증을 저하시키는 키메라 모노클로날 항체이다.
기존에 D2E7로서 공지된 아달리무맙 [Adalimumab (HUMIRA™, Abbott Laboratories)]은 TNFα와 결합하는 모노클로날 항체로서, 이는 한 가지 이상의 전통적인 질병 완화 DMARDs에 대한 불충분한 반응을 지니고 있는 적당한 정도 내지 중증의 활성 RA 성인 환자에게서 구조적 손상 진행을 억제하고 징후 및 증상을 저하시키는 것으로 승인되었다.
항-CD20 항체와 BLyS 길항제를 투여함으로써 류마티스성 관절염을 치료하는 것은 RA에 대한 전술된 약물 중의 한 가지 이상을 이용한 요법과 연계해서 수행할 수 있다.
예를 들어, 류마티스성 관절염의 경우, 치료 경과에 대한 측정은 팽윤되고 부서지기 쉬운 관절의 수와 조조 경직 길이를 포함할 수 있다. 환자를 대상으로 하여, X선과 샤프 스코어 (Sharp score)로서 공지된 스코어링 시스템을 사용함으로써, 얼마 만큼의 손과 발 관절이 침식되었는지를 검사할 수 있다. 또 다른 스코어링 시스템은 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 미국 류마티스 협회 기준을 근거로 한 것이다.
RA에서의 치료 효능을 평가하기 위한 한 가지 방법은 미국 류마티스 협회 (ACR) 기준에 근거한 것인데, 이는 특히 부서지기 쉽고 팽윤된 관절 상의 개선율을 측정한다. RA 환자는 항체 치료하지 않거나 (예를 들면, 치료 전의 기준선) 또는 위약으로 치료한 경우와 비교해서 ACR 20 (20％ 개선)으로 스코어링될 수 있다. 항체 치료 효능을 평가하기 위한 다른 방식에는 X선 스코어링, 예를 들면, 뼈 침식 및 관절 공간 협소화와 같은 구조적 손상을 스코어링하는데 사용되어 온 샤프 X선 스코어가 포함된다. 치료 동안 또는 치료 후 일정 기간에 건강 평가 질문서 [HAQ] 스코어, AIMS 스코어, SF-36를 기준으로 하여 장애를 예방하거나 개선시키는 것에 대해 환자를 평가할 수 있다. ACR 20 기준은 부서지기 쉬운 (통증있는) 관절 계수치와 팽윤된 관절 계수치 둘 다에 있어서의 20％ 개선과, 5가지 부가의 조치 중의 적어도 3가지에 있어서 20％ 개선을 포함할 수 있다:
1. 가시적 아날로그 규모에 의한 환자의 통증 평가 (VAS),
2. 질병 활성에 대한 환자의 포괄적인 평가 (VAS),
3. 질병 활성에 대한 의사의 포괄적인 평가 (VAS),
4. 건강 평가 질문서에 의해 측정된 환자의 자체 평가된 장애; 및
5. 급성 상 반응물 CRP 또는 ESR.
ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, ACR 스코어 20 이상, 바람직하게는 ACR 30 이상, 보다 바람직하게는 ACR 50 이상, 보다 더 바람직하게는 ACR 70 이상, 가장 바람직하게는 ACR 75 이상을 달성하기에 유효한 양의 본 발명의 CD20 결합 항체를 환자에게 투여한다.
건선성 관절염은 독특하면서도 별개의 방사선촬영 특징을 갖는다. 건선성 관절염의 경우, 관절 침식과 관절 공간 협소화는 또한, 샤프 스코어에 의해 평가할 수 있다. 본원에 기재된 인간화 CD20 결합 항체를 사용하여 관절 손상을 예방할 뿐만 아니라 상기 질환의 병 징후와 증상을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 치료상 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를, SLE로 고통받고 있는 환자에게 투여함으로써 루푸스 또는 SLE를 치료하는 방법이다. SLEDAI 스코어는 질병 활성의 수치적 정량화를 제공해준다. SLEDAI는 질병 활성과 상관이 있는 것으로 공지된 24가지 임상 및 실험실용 파라미터의 칭량 지수이고, 수치 범위는 0 내지 103이다 (문헌 [Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14: 515-521] 참고). 이본쇄 DNA에 대한 항체는 신장 발적 (renal flares) 및 루푸스의 기타 소견 (증상)을 유발시키는 것으로 여겨진다. 항체 치료를 받고 있는 환자를 대상으로 하여, 혈청 크레아티닌, 뇨단백 또는 뇨중 혈액 상의 상당하고도 재현 가능한 증가로서 정의되는 신장 발적 시간에 대해 모니터링할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 환자를 대상으로 하여, 항핵 항체 및 이본쇄 DNA에 대한 항체 수준을 모니터링할 수 있다. SLE에 대한 치료는 고 용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.
척추관절병증은 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 포함한 관절 질환 군이다. 치료 성공은 입증된 환자 및 의사 포괄적 평가 측정 도구에 의해 결정할 수 있다.
전신성 홍반성 루푸스의 경우에는, 환자를 대상으로 하여 항핵 항체 및 이본쇄 DNA에 대한 항체 수준에 대해 모니터링할 수 있다.
각종 약물을 사용하여 건선을 치료하고; 치료는 질병 중증도와 직접 관련하여 상이하다. 보다 순한 형태의 건선을 나타내는 환자는 전형적으로, 국소 치료를 활용하는데, 예를 들면, 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐을 활용하여 질병을 관리하는 반면, 중간 정도 및 중증의 건선을 나타내는 환자는 전신 요법 (예: 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB)를 이용하는 것으로 예상된다. 타르를 사용하기도 한다. 이들 요법은 안전성 측면에서의 우려, 시간 소모적 섭생 또는 불편한 치료 과정을 복합적으로 나타낸다. 더우기, 몇몇 요법은 비용이 많이 드는 장비가 요구되고 연구실 세팅 내에 전용 공간이 필요하다. 전신용 약물은 고혈압, 고지혈증, 골수 억제, 간 질환, 신장 질환 및 위장 장해를 포함한 심각한 부작용을 유발시킬 수 있다. 또한, 광요법의 사용은 피부암 발병을 증가시킬 수 있다. 국소 요법의 사용과 연관된 불편함과 불쾌함 이외에도, 광요법과 전신 치료는 요법을 수행하거나 요법을 수행하지 않은 경우에도 환자를 순환시켜야 하고, 부작용으로 인한 평생 노출을 모니터링해야 한다.
건선에 대한 치료 효능은 기준선 질환과 비교한 의사의 포괄적 평가 (PGA) 변화 및 건선 부위 및 중증도 지수 (PASI) 스코어, 건선 증상 평가 (PSA)를 포함한, 상기 질병의 임상 징후 및 증상의 변화를 모니터링함으로써 평가한다. 환자를 대상으로 하여, 특정 시점에 경험한 가려움 정도를 지시하기 위해 사용되어 온 가시적 아날로그 등급에 대해 치료 전 과정에 걸쳐 주기적으로 측정할 수 있다.
투약 (dosing)
해당 분야의 전문의에게 잘 알려져 있는 투약과 관련한 요인들과 치료하고자 하는 적응증에 따라서, 본 발명의 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체를, 독성과 부작용은 최소화시키면서 상기 적응증을 치료하는데 효능이 있는 투여량으로 투여할 것이다. 구체적 양태에서 B-세포 신생물, 예를 들면, 비호지킨 림프종으로 고통받고 있는 환자를 치료하기 위해서는, 본 발명의 항-CD20 항체를 인간 환자에게 l mg/체중 kg 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 2.5 mg/kg 내지 10 mg/kg의 투여량 범위로 투여할 것이다. 바람직한 양태에서는, 항-CD20 항체를 10 mg/kg 또는 375 mg/㎡의 투여량으로 투여한다. NHL를 치료하기 위한 한 가지 투약 섭생은 항-CD20 항체 375 mg/㎡을 격주로 2 내지 4회분으로 투여하거나, 치료 첫째 주에는 항체 조성물 1회분을 투여한 다음, 2주 간격으로 동일한 양의 항체의 두번째 용량을 투여한다. 일반적으로, NHL 환자는 이러한 치료를 1년에 1회 받지만, 림프종이 재발한 경우에는 이를 반복할 수 있다. NHL을 치료하는데 있어서, 항-CD20 항체 + BLyS 길항제 요법을 CHOP를 사용하는 등의 화학요법과 조합할 수 있다. 또 다른 양태에서는, CLL 또는 SLL 등의 B 세포 신생물을 치료하기 위해, 환자에게 BR3-Fc를 투여하기 전 또는 투여한 후에 리툭산 375 mg/㎡ 용량을 4주마다 투여할 수 있다. 재발된 CLL에 대해서는, 항-CD20 항체와 BLyS 길항제를 이용한 치료를 예를 들어, 플루다라빈 및 시톡산을 이용한 화학요법과 조합할 수 있다.
류마티스성 관절염을 치료하기 위한 한 가지 양태에서는, 키메라 항체인 리툭산을 2주마다 총 2회 용량으로 매회 500 mg을 투여한다. 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항-CD20 항체, 예를 들어 hu2H7v.16 또는 hu 2H7의 기타 모든 변이체를 매회당 500 mg 미만으로 투여하는데, 예를 들면, 매회 약 200 내지 500 mg, 약 250 내지 450 mg, 또는 300 내지 400 mg을 격주 또는 3주마다 총 2 내지 4회분으로 투여한다.
BR3-Fc는 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 l mg/kg 내지 5 mg/kg, 보다 바람직하게는 1.5 mg/kg 내지 2.5 mg/kg의 투여량 범위로 투여할 수 있다. 한 양태에서는, BR3-Fc를 1일 내지 12일의 치료 기간 동안 격일로 5 mg/kg 투여량으로 투여한다. 또한, 2 내지 3일 간격으로 총 2 내지 5회분으로 약 2 내지 5 mg/kg을 투약하는 것이 고려된다.
본 발명의 치료 방법은 항-CD20 항체와 BLyS 길항제 (본원에서 둘 다 약물로서 지칭됨)를 동시에 및 순차적으로 투여하는 것의 조합을 포함한다. 순차적 투여에서는, 상기 약물을 어느 순서로도 투여할 수 있는데, 즉 BLyS 길항제를 먼저 투여한 다음 항-CD20 항체를 투여한다. 환자를 한 가지 약물로 치료한 다음, 다음 약물로 치료하기 전에 효능에 대해 모니터링한다. 예를 들어, BLyS 길항제가 부분 반응을 유발시킨 경우에는, 항-CD20 항체로 후속 치료를 수행하여 완전한 반응을 달성시킬 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 면역부착인자인 BR3-Fc는 완전한 길이의 항-CD20 항체와 비교해서 절반 정도 더 짧다. 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염을 치료하는 경우, 항-CD20 항체가 리툭산이고 BLyS 길항제가 BR3-Fc이면, 바람직한 양태에서는 이를 필요로 하는 환자에게 BR3-Fc를 먼저 투여한 다음, 리툭산으로 치료한다. 또 다른 한편, 환자에게 두 약물을 초기에 투여한 다음, 단지 하나 또는 다른 약물 만을 후속 투약할 수 있다.
환자가 약물을 견디도록 하고/하거나 치료 화합물의 초기 및 후속 투여로부터 발생되는 부작용 (예를 들면, 주입 관련 증상) 발생을 저하시키도록 환자의 컨디션을 조정하기 위해, 상기 약물 투여를 필요로 하는 포유동물에게 한 가지 약물 또는 두가지 약물 모두의 컨디셔닝 용량을 처음 또는 초기에 투여한 다음, 한 가지 약물 또는 두 가지 약물 모두의 적어도 제2 치료상 유효량을 투여할 수 있다 (이러한 제2 및 후속 용량은 제1 용량 보다 더 많다). 제1 용량은 포유동물이 보다 높은 제2 치료 용량을 견뎌내도록 컨디션 조정하기 위해 제공된다. 이러한 방식으로, 포유동물은 초기에 투여될 수 있었던 것 보다 더 높은 용량의 치료 화합물을 견뎌낼 수 있다. "컨디셔닝 용량"은 치료 화합물의 투여와 연관된 제1 용량 부작용의 빈도수 또는 중증도를 약화 또는 저하시키는 용량이다. 컨디셔닝 용량은 치료 용량, 치료량 이하의 용량, 증상성 용량 또는 증상성 이하의 용량일 수 있다. 치료 용량은 환자에게서 치료 효과를 나타내는 용량이고, 치료량 이하의 용량은 치료받은 환자에게서 치료 효과를 나타내지 않는 용량이다. 증상성 용량은 투여시 한 가지 이상의 부작용을 유도시키는 용량이고, 증상성 이하의 용량은 부작용을 유도시키지 않는 용량이다. 몇몇 부작용으로는 발열, 두통, 오심, 구토, 호흡 곤란, 근육통 및 오한이 있다.
투여 경로
BLyS 길항제와 항-CD20 항체는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 전 기간에 걸친 연속식 주입, 피하, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 활막내, 수막강내 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여한다. 항-CD20 항체는 일반적으로 정맥내 또는 피하 투여에 의해 투여할 것이다. 상기 약물은 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여할 수 있다.
제품 및 키트
본 발명의 또 다른 양태는 상기 언급된 B 세포계 악성 종양 또는 B 세포 조절된 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 BLyS 길항제와 항-CD20 항체를 포함하는 제품이다. 구체적 양태에서, 상기 제품은 비호지킨 림프종을 치료하기 위한, 서열 2의 BR3-Fc, 및 hu2H7v.16 항체를 함유한다.
본 발명의 제품은 1개 이상의 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 이 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 본 발명의 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 한 가지 이상의 활성제는 본 발명의 CD20 결합 항체, 예를 들면, 리툭산 또는 hu2H7v.16이고, 다른 활성제는 BLyS 길항제, 예를 들면, BR3-Fc이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 특정한 질환, 예를 들면 비호지킨 림프종 또는 류마티스성 관절염을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시해준다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지시사항을 추가로 포함할 것이다. 부가적으로, 본 발명의 제품은 제약상 허용 가능한 완충액, 예를 들면, 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들면, 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
각종 목적, 예를 들면, B 세포 사멸 검정에 유용한 키트가 또한 제공된다. 제품과 같이, 키트는 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 이 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 상기 용기는 본 발명의 하나 이상의 항-CD20 항체와 하나의 BLyS 길항제를 포함하는 조성물을 보유하고 있다. 예를 들어, 희석제, 완충액, 대조군 항체를 함유하는 부가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물에 대한 기재 사항 뿐만 아니라 의도한 시험관내 또는 진단 사용에 대한 지시사항을 제공해줄 수 있다.
실험 실시예
실시예 1
CD20에 대한 모노클로날 항체의 발생
6마리의 Balb/c 마우스, 3마리의 루이스 (Lewis) 랫트 (공급처: Charles River Laboratories, Hollister, CA) 및 3마리의 아르메니안 햄스터 (공급처: Cytogen Research and Development, Inc., Boston, MA)를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의, 쥐 CD20을 일시적으로 발현하는 아데노바이러스-감염된 인간 293 세포 (공급처: Genentech, Inc., South San Francisco, CA)로 과면역시켰다. 이. 콜라이에서 발현된 정제된 재조합 쥐 CD20 및 쥐 CD20의 내인성 수준을 발현하는 쥐 세포로 이루어진 예비-주입용 부스터를, 주입하기 3일 전에 투여하였다. 모든 동물로부터의 B 세포를, 문헌 [참고: Kohler and Milstein, 1975; Hongo et al., 1995] 에 앞서 기재된 바와 유사한 변형 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포 (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Manassas, VA)와 융합시켰다. 10 내지 14일 후, 마우스 및 햄스터 융합물로부터의 상등액을 수거하고, 이를 대상으로 하여 직접적인 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 항-쥐 CD20 및 항-인간 CD20 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. mCD20 ELISA 스크린은 햄스터 융합물로부터 59개의 양성 하이브리도마 (2개는 hCD20와 교차 반응성이다)를 확인하였고, 마우스 융합물로부터는 1개의 양성 하이브리도마 (hCD20와 교차 반응성이다)를 확인하였다. 제한 희석에 의한 서브클로닝 후 가장 높은 면역결합성을 나타내는 양성 클론은, Mab의 생체내 생성을 위해 프리스탄-프라이밍된 마우스 [참고: Freund and Blair, 1982] 내로 주사하거나 또는 시험관 내에서 배양하였다. 복수액 및/또는 상등액을 풀링한 다음, 앞서 기재된 바와 같이 [참고: Hongo et al., 1995] 또는 앞서 기재된 프로토콜의 변형 버전을 사용하여 친화 크로마토그래피 (Pharmacia fast protein liquid chromatography [FPLC]; Pharmacia, Uppsala, Sweden)함으로써 정제하였다. 이와 같이 정제된 항체 제제를 멸균 여과시키고 (0.2-㎛ 공극 크기; Nalgene, Rochester NY), PBS 중에서 4℃ 하에 저장하였다.
면역 혈청을 평가하기 위한 직접적인 ELISA
미세역가 플레이트 (NUNC)를 0.05 M 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 100 ㎕/웰의 쥐 또는 인간 CD20 (1 ㎍/ml; Genentech, Inc., South San Francisco, CA)으로 피복시켰다. 피복된 판을 ELISA 세척 완충액 (PBS/0.05％ Tween 20)으로 3회 세척하고, 0.5％ 소 혈청 알부민과 0.05％ Tween 20 (PBS/BSA/T20)을 함유하는 PBS로 1 시간 이상 동안 차단시켰다. 이어서, 차단 완충액을 제거하고 100 ㎕의 희석 샘플 및 대조군을 가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 상기 판을 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 종 특이적 항-IgG 접합체 (공급처: Sigma, St. Louis, MO 또는 ICN Cappel, Durham, NC)를 가하고 (100 ㎕/웰), 주위 온도에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 세척하고 테트라메틸벤지딘 기질 (공급처: BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)과 함께 5 내지 10분 동안 항온 배양한 다음, 정지 용액 (100 ㎕/웰; BioFX Laboratories)을 부가하였다. 이어서, 자동화 판 판독기 (EL808, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT)를 사용하여 판을 판독하였다.
참고 문헌:
[Hongo, J.S., Mora-Worms, M., Lucas, C. and Fendly, B. M.: Development and characterization of murine monoclonal antibodies to the latency-associated peptide of transforming growth factor βl. Hybridoma 1995; 14: 253-260.
Kohler, G. and Milstein, C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497.
Freund YR and Blair PB: Depression of natural killer activity and mitogen responsiveness in mice treated with pristane. J Immunol 1982; 129: 2826-2830].
실시예 2
2H7 항-CD20 쥐 모노클로날 항체의 인간화
쥐 항-인간 CD20 항체인 2H7 (본원에서 m2H7로서 지칭되기도 함; m은 쥐를 의미한다)의 인간화는, 일련의 부위-지시된 돌연변이 유발 단계로 수행하였다. 2H7의 CDR 잔기는, 쥐 2H7 가변 도메인 (미국 특허 제5,846,818호에 기재됨)을 공지된 항체 서열 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참고)와 비교함으로써 확인하였다. 경쇄 및 중쇄에 대한 CDR 영역은 서열 초가변성 [Kabat et al., 상기 참고]을 기준으로 하여 범위를 한정하였으며, 도 12 및 도 13에 각각 도시되었다. 합성 올리고뉴클레오티드 (표 2)를 사용하고, 부위-지시된 돌연변이 유발 (문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 488-492 (1985)] 참고)을 이용하여 쥐 2H7 CDR 영역의 6개 모두를, 플라스미드 pVX4 상에 함유된 컨센서스 서열 VκI,VHIII (VL 카파 아군 I, VH 아군 III)에 상응하는 완전한 인간 Fab 골격 내로 도입하였다. 파아지미드 pVX4를 돌연변이 유발을 위해 사용할 뿐만 아니라 이. 콜라에서 F(ab)s의 발현을 위해 사용하였다. 파아지미드 pb0720을 기준으로 하면, pB0475 (문헌 [Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)] 참고)의 유도체인 pVX4는 인간화 컨센서스 κ-아군 I 경쇄 (VLκI-CL) 및 인간화 컨센서스 아군 III 중쇄 (VHIII-CH1) 항-IFN-α (인터페론 α) 항체를 코딩하는 DNA 단편을 함유하고 있다. pVX4는 또한, 앞서 기재된 또 다른 pUC119-이용 플라스미드인 pAK2 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)] 참고)로부터 둘 다 유래된 알칼리성 포스파타제 프로모터와 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열을 갖는다. 독특한 SpeI 제한 부위를 F(ab) 경쇄와 중쇄를 코딩하는 DNA 사이에 도입하였다. 양 항-IFN-α 중쇄와 경쇄 중의 처음 23개 아미노산은 StII 분비 신호 서열이었다 (문헌 [Chang et al., Gene 55: 189- 196 (1987)] 참고).
2H7의 CDR-swap 버전 (2H7.v2)을 구축하기 위해, 부위-지시된 돌연변이 유발을 pVX4의 데옥시우리딘-함유 주형 상에서 수행하였고; 항-IFN-α의 6개 CDRs 모두를 쥐 2H7 CDRs로 변화시켰다. 이로써 생성된 분자는 인간화 2H7 버전 2 (2H7.v2), 또는 2H7의 "CDR-swap 버전"으로서 지칭되었고; 이는 도 12 및 13에 도시된 컨센서스 인간 FR 잔기를 수반한 m2H7 CDR 잔기를 갖는다. 인간화 2H7.v2를 추가의 인간화에 사용하였다.
표 2에는 H 및 L 쇄 중에서 쥐 2H7 (m2H7) CDRs 각각을 창출시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열이 제시되어 있다. 예를 들어, CDR-H1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 m2H7 H 쇄 CDR1을 재창출시켰다. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 각각 H 쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭하고; 유사하게, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 L 쇄 CDRs 각각을 지칭한다. CDR-H2 내에서의 치환은 2개의 올리고뉴클레오티드 CDR-H2A 및 CDR-H2B를 사용하여 2 단계로 수행하였다.
Figure 112005070833033-PCT00023
(쥐 2H7 CDRs의 CDR-swap를 pVX4 중의 인간 골격 내로 구축하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열. 각 올리고뉴클레오티드에 의해 변화된 잔기는 밑줄쳐져 있음)
인간 VκI,VHIII 컨센서스 골격 (도 12 및 13)을 갖는 쥐 2H7 골격 잔기와, 기존의 인간화 항체 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289(1992)] 참고)의 서열 비교를 근거로 하여, 몇 가지 골격 돌연변이를 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 2H7.v2 Fab 구조물 내로 도입하였다. 이들 돌연변이로 인해, CDR 입체 형성 또는 항원 접촉에 영향을 미칠 수도 있는 부위에서, 특정의 인간 컨센서스 골격 잔기가 쥐 2H7 골격에서 발견되는 것으로 변하였다. 버전 3은 VH (R71V, N73K)을 함유하였고, 버전 4는 VH (R71V)를 함유하였으며, 버전 5는 VH (R71V, N73K) 및 VL (L46P)를 함유하였고, 버전 6은 VH (R71V, N73K) 및 VL (L46P, L47W)을 함유하였다.
m2H7 항체의 인간화 및 키메라 Fab 버전을 이. 콜라이에서 발현시키고 다음과 같이 정제하였다. 이본쇄 및 일본쇄 DNA를 제조하기 위해, 플라스미드를 이. 콜라이 균주 XL-1 Blue (공급처: Stratagene, San Diego, CA) 내로 형질전환시켰다. 각 변이체에 대해, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)을 사용하여 경쇄와 중쇄 둘 다를 완전히 서열 분석하였다. 플라스미드를 MM294의 유도체인 이. 콜라이 균주 16C9 내로 형질전환시키고, 5 ㎍/ml 카베니실린을 함유하는 LB 판 상으로 도말한 다음, 단일 콜로니를 대상으로 하여 단백질 발현을 위해 선별하였다. 단일 콜로니를 5 ml LB-100 ㎍/ml 카베니실린 중에서 37℃ 하에 5 내지 8시간 동안 성장시켰다. 5 ml 배양물을 500 ml AP5-100 ㎍/ml 카베니실린에 가하고, 4 L 조절판 진탕 플라스크 내에서 37℃ 하에 16시간 동안 성장시켰다. AP5 배지는 다음으로 이루어졌다: 1 L 수 중의, 1.5 g 글루코스, 11.0 하이카세 (Hycase) SF, 0.6 g 효모 추출물 (인증됨), 0.19 g 무수 MgS04, 1.07 g NH4Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1 M 트리에탄올아민, pH 7.4. 이어서, 이들을 0.1 ㎛ 실킨 (Sealkeen) 필터 내로 멸균 여과시켰다.
세포를 1 L 원심분리용 병 (Nalgene)에서 3000 xg 하에 원심분리시킴으로써 수거하고 상등액을 제거하였다. 1시간 동안 동결시킨 후, 펠릿을 25 ml 찬 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5.0 (완충액 A)에 재현탁시켰다. 250 ㎍의 0.1M PMSF (Sigma)를 가하여 단백질분해를 억제시키고 3.5 ml의 스톡 10 mg/ml 암탉 난백 리소자임 (Sigma)을 가하여 세균성 세포 벽의 용해를 도와주었다. 얼음 상에서 1시간 동안 온화하게 진탕시킨 후, 샘플을 40,000 xg 하에 15분 동안 원심분리시켰다. 완충액 A를 사용하여 상등액을 50 ml로 만들고, 이를 완충액 A로 평형시킨 2 ml DEAE 칼럼 상에 부하하였다. 이어서, 병류 (flow-through)를 완충액 A로 평형시킨 단백질 G-세파로스 CL-4B (Pharmacia) 칼럼 (0.5 ml 층 용적)에 적용하였다. 상기 칼럼을 10 ml 완충액 A로 세척하고, 3 ml 0.3 M 글리신, pH 3.0을 사용하여 1.25 ml 1 M Tris, pH 8.0 내로 용출시켰다. 이어서, 센트리콘 (Centricon)-30 (Amicon)를 사용하여 F(ab)를 PBS로 완충제 교환시키고, 최종 용적이 0.5 ml가 되도록 농축시켰다. 모든 F(ab)s의 SDS-PAGE 겔을 수행하여 순도를 확인하였고, 각 변이체의 분자량을 전자분무 질량 분광측정법에 의해 검증하였다.
완전한 길이의 IgG를 발현하기 위한 플라스미드는, hu2H7 항체의 인간화 Fab 뿐만 아니라 키메라 Fab의 VL 및 VH 도메인을, 포유동물 세포 발현을 위해 기존에 언급된 pRK 벡터 (문헌 [Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)] 참고) 내로 서브클로닝함으로써 구축하였다. 간략하게 언급하면, 각 Fab 구조물을 EcoRV 및 BlpI로 분해시켜 VL 단편을 절단시키고, 이를 완전한 경쇄 (VL-CL 도메인)의 발현을 위해, 플라스미드 pDRl의 EcoRV/BlpI 부위 내로 클로닝하였다. 부가적으로, 각 Fab 구조물을 PvuII 및 ApaI로 분해시켜 VH 단편을 절단시키고, 이를 완전한 중쇄 (VH-CH1-CH2-CH3 도메인)의 발현을 위해 플라스미드 pDR2의 PvuII/ApaI 부위 내로 클로닝하였다. 각 IgG 변이체에 대해, 경쇄 발현성 플라스미드와 중쇄 발현성 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 (문헌 [Graham et al., J. Gen.Virol., 36: 59-74, (1977)] 참고) 내로 공동 형질감염시킴으로써, 일시적 형질감염을 수행하였다. 간략하게 언급하면, 293 세포를 형질감염시키기 전날 분할시키고, 혈청 함유 배지에 도말하였다. 그 다음날, 인산칼슘 침전물로서 제조된 이본쇄 DNA를 가한 다음, pAdVAntage™ DNA (공급처: Promega, Madison, WI)를 가하고, 세포를 37℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 세포를 혈청 무함유 배지에서 배양하고 4일 후에 수거하였다. 단백질 A-세파로스 CL-4B를 사용하여 항체를 배양 상등액으로부터 정제한 다음, 10 mM 나트륨 석시네이트, 140 mM NaCl, pH 6.0 내로 완충제 교환시키고, 센트리콘-10 (Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 단백질 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다.
실시예 3
본 실시예에는 인간 CD20 BAC 트랜스제닉 (Tg) 마우스의 생성과, hCD20+ 마우스에서 항-CD20 항체 또는 BLyS 길항제 단독의 효과를 연구하기 위한 실험이 기재되어 있다.
인간 CD20 트랜스제닉 마우스를 인간 CD20 BAC DNA (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 생성시켰다. 마우스를 대상으로 하여, 인간 CD20 발현의 FACS 분석을 근거로 하여 스크리닝하였다. 도 14에서의 FACS 플롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 트랜스진에 대한 마우스 이형접합체 (Tg+/-) 및 동형접합체 (Tg+/+)는 그들의 B220+ B 세포 상에서 인간 CD20을 발현한다. 도 15는 B 세포 분화 및 성숙 동안 각종 세포 표면 마커 (CD43, IgM, IgD)의 발현을 도시한 것이다. Tg+ 마우스에서는, hCD20가 B 전구 및 미성숙 B 세포 상에서 발현되고, 대부분은 성숙 B 세포 상에서 발현되었다. Tg+ 마우스를 대상으로 하여, 골수, 비장, 장간막 LN 및 파이어판의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대해 스크리닝하였고; 그 결과가 도 16 내지 19에 도시되어 있다. 세포를 B220 및 CD43 상에 게이팅하면, 각종 B 세포 집단으로의 윤곽 묘사가 가능해졌다. 이어서, Tg+ 마우스를 항-CD20 mAb (l mg 총 = 50 mg/kg; 70 kg 남자의 경우, 3.5 mg에 등가임)로 처리하여, 도 20의 도식에 요약된 바와 같은 B 세포에 대한 효과를 알아보았다. FACS 분석을 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이아판 상에서 수행하였다. 항-CD20 mAb의 혈청 수준을 모니터링하였다. 마우스에서는 B 세포 고갈이 항-CD20 항체로 처리한지 3 내지 4일 이내에 일어났다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, B 세포 사멸은 ADCC 또는 세포소멸, 또는 이들 둘 다에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. Tg+ 마우스를 항-hCD20 mAb (m2H7) 단독으로 처리하면, 말초혈 중의 B 세포, 성숙 말초 림프절 B 세포, 비장 중의 T2 및 소포 B 세포가 고갈된다 [도 21-24 참고]. 그러나, 세포 표면 상의 항체 수준이 극히 높음에도 불구하고 (포화 수준인 것으로 예상됨), 특정의 B 세포 서브세트가 항-CD20 항체에 의한 사멸에 내성이 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 내성 B 세포는 비장 중의 연변층 B 세포 (도 23), 및 파이어판 (도 25)과 비장 (도 27) 둘 다 중의 배중심 B 세포이다. 한 가지 실험에서 (도 27), 마우스에게 항-CD20 mAb의 제1 용량 100 ㎍을 1일째에 주사한 다음, 3일째에 제2 용량 100 ㎍을 주사하였고 (50 ㎍의 단일 용량이 B 세포를 포화시키기에 충분한 것으로 예상되었다); T2/소포 B 세포는 고갈되었지만, 파이어판으로부터의 배중심 B 세포는 항-CD20 mAb와 결합되긴 하였지만, 사멸에 내성이 있는 것으로 밝혀졌다.
항-CD20 항체 처리 후에 B 세포의 회수를 수행하였다. 1일째에 마우스에게 항체를 투여하였다. 도 26은 항체 처리 후 6일째에, 말초혈 중에서는 B 세포가 전혀 검출 가능하지 않았다는 것을 보여준다. 6주째에 항체가 제거되면, hCD20+ 세포는 검출되기 시작하고, 14주째에 B 세포는 정상 수준으로 회수되는 것으로 여겨졌다. CD20+ 성숙 B 세포로 진화되는 CD20을 발현하지 않는 전구체 B 세포로부터 줄기 세포를 회수하였다.
도 27은 단기간 (단일 주사) 항-CD20 mAb 처리에 대한 비장 배중심 B 세포의 내성을 입증해주는 FACS 플롯을 도시한 것이다. 마우스를 면역시키지 않거나, 또는 1일째에 양 (sheep) 적혈구 (SRBC)를 복강내 주사하여 비장 내에 배중심을 유도시킴으로써 마우스를 면역시켰다. 배중심은 7일째 출현되었다. 8일째에, 마우스 한 무리를 인간 CD20에 대한 m2H7 mAb로 처리하였다. 대조군 마우스 세트는 mIgG2a 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 마우스로부터의 비장 세포를 12일째에 분석하였다. PNA (땅콩 아글루티닌)은 배중심을 염색하였다. SRBC로 비면역화된 마우스의 비장에서는 검출 가능한 배중심이 전혀 보이지 않은 반면, 면역시킨 마우스의 비장은 0.3％ PNA 염색성 세포를 나타내었다. 항-CD20 항체 처리로 인해 T2/소포 B 세포가 고갈되긴 하였지만, 비장 내에서의 연변 중심 B 세포는 이러한 항체에 대해 내성이 있었다.
다음에서는, B 세포 고갈시, 마우스가 T 독립성 면역 반응을 발생할 수 있었는지를 결정하였다. 마우스를 0일째에 m2H7 또는 이소형 대조군 항체 mIgG2a로 처리하였다. 3 내지 7일째에, B 세포 고갈이 일어났다. 7일째에 마우스에게 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumonias) IV를 정맥내 주사하여 다당류에 대한 반응을 유도시켰다. 11일째에 T 세포 독립성 반응이 설정되었다. 그 결과가 도 28에 도시되어 있는데, 이는 항-CD20 (2H7 또는 리툭산)으로의 처리가 비장의 연변층과 배중심으로부터의 B 세포 반응에 영향을 미치지 못하였다는 것을 입증해주었는데, 즉 비-고갈 MZ 및 BI B 세포는 T-독립성 항원에 대한 보호를 부여해주었다. 이러한 데이터는 항-CD20 mAb 처리에도 불구하고, 체액성 면역-특이적 T-독립성 B 세포 반응 (본 경우)의 몇 가지 국면이 보존된다는 것을 입증해준다.
실시예 4
본 실시예는 B 세포 조정/고갈을 위한 항-CD20 mAb와 BLys 길항제 처리 간의 상승 효과를 입증해준다.
BAFF/BLyS/TALL-1 (TNF 슈퍼-계열의 구성원)은 미성숙 T2, FO 및 MZ B 세포의 생존 및 성숙에 중요한 역할을 하고, 자가반응성 B 세포의 경쟁적 생존을 증강시켜 준다 (문헌 [S. Mandala et al., Science 296, 346-9 (2002); F. Mackay, P. Schneider, P. Rennert, J. Browning, Annu Rev Immunol 21, 231-64 (2003); P. A. Moore et al., Science 285, 260-3 (1999)] 참고). 수용성 형태의 BAFF/BLyS/TALL-1이 마우스에서 과발현되면, B 세포 과다형성, 고감마글로불린혈증 및 자가면역 루푸스-유사 증후군이 발생한다 (문헌 [S. A. Marsters et al., Curr Biol 10, 785-8 (2000)] 참고). 역으로 말하면, 루푸스 경향의 마우스를, BAFF/BLyS를 중화시키는 BAFFR/BR3-Fc 융합 단백질로 처리하면, 자가면역 혈청학, 신 병리학 및 사망률이 개선되었다 (문헌 [R. Lesley et al., Immunity 20, 441-53 (2004)] 참고).
재료 및 방법:
실험 실시예에서는, 사용된 BR3-Fc 또는 BAFFR/BR3-Fc가 서열 2의 hBR3-Fc이었다. 도 29에 제시된 실험에 대해서는, 인간 CD20을 코딩하는 세균성 인공 염색체를 발현하는 FVB 마우스 (hCD20+ 마우스로서 명명됨)를 항-CD20 mAb (9일째에 100 마이크로그램을 단일 주사함), BR3-Fc (1일째부터 12일 동안 100 마이크로그램을 격일로 주사함), 또는 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 조합물로 복강내 주사 처리하였다. 각 무리는 4마리 마우스로 이루어졌다. 마지막으로 주사한지 2일 후에, 마우스를 희생시키고 hCD20+ B 세포에 대해 분석하였다. 비장, 혈액, 림프절 및 파이어판의 FACS 분석은 B 세포 마커 (CD21+CD23+)에 대해 분석하였다.
도 30에 제시된 실험에 대해서는, hCD20 Tg+ 마우스를 대조군 IgG2a, BAFFR/BR3-Fc (12일 동안 매일 마우스당 100 ㎍을 복강내 투여함), 항-hCD20 mAb (9일째에 마우스당 100 ㎍을 복강내 투여함) 또는 BAFFR/BR3-Fc와 항-hCD20 mAb의 조합물 (단일 처리군과 동일한 투여량으로 투약)로 처리하였다. B220+ 비장 세포를 13일째에 분리하고, CD21 및 CD23에 대해 염색하였다. 한 무리당 5 마리 마우스. 도 30은 인간 CD20 Tg+ 마우스에서 항-hCD20 mAb와 BR3-Fc의 조합물의 B 세포 고갈에 대한 상승 효과를 도시한 것이다. 도 31은 hCD20 Tg+ 마우스로부터 B220+ 총 비장 B 세포, 연변층 (MZ) 및 소포 (FO) B 세포의 고갈을 정량화한 것이다. 상기 마우스를 단일 용량의 0.1 mg 대조군 IgG2a, BAFF/BR3-Fc 또는 항-hCD20 mAb로 처리하였다. 비장 세포를 4일째에 분석하였다. 한 무리당 5마리 마우스.
결과:
이들 결과는 도 29, 도 30 및 도 31에 제시되었다.
1. 항-CD20 mAb 요법은 혈액 및 림프절에서 성숙한 순환성 B 세포의 > 99％를 고갈시켰다.
2. BR3-Fc는 혈액 및 림프절에서 성숙한 순환성 B 세포를 감소시켰다.
3. 항-CD20 mAb 요법은 비장 중의 T2 및 소포 B 세포를 고갈시켰지만, 연변층 B 세포는 그렇게 하지 못하였다.
4. BR3-Fc는 비장 중의 T2/소포 및 연변층 B 세포를 감소시켰다.
5. 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 조합물은 비장 중의 모든 B 세포 집단을 고갈시키는데 있어 상승 작용을 하였다.
hCD20+ 마우스를 대략 2주 동안 BAFFR/BR3-Fc로 처리하면, MZ 및 T2/FO B 세포가 현저하게 감소되었다 (도 30, 패널 3). BAFFR/BR3-Fc와 항-hCD20 mAb를 조합 치료하면, 놀랍게도 모든 비장 B 세포 서브세트가 고갈되었다 (도 30, 패널 4). BAFF 중화와 항-hCD20 mAb의 잠재적 상승 작용을 추가로 이행하기 위해, 단일 용량의 항-hCD20 mAb와 BAFFR/BR3-Fc으로 처리한지 4일 후에 B 세포 손실 정도를 정량화하였다. 단일 용량의 항-hCD20 mAb 또는 BAFFR/BR3-Fc으로 처리하면, MZ B 세포가 대략 40 내지 50％ 손실되고 FO B 세포가 대략 33 내지 70％ 손실되긴 하였지만, 항-hCD20 mAb와 BAFFR/BR3-Fc의 조합 용량으로 처리하면, MZ 및 FO B 세포가 > 90％ 손실되었다 (도 31). 따라서, 생존 인자는 항-hCD20 mAb 매개된 B 세포 고갈에 대한 감수성을 결정하는데 있어 중요한 역할을 하기도 한다.
실시예 5
BlyS 길항제의 생성
BLyS 82-285 생성
인간 BAFF (잔기 82-285)를 코딩하는 DNA 단편을 pET15b (Novagen) 발현 벡터 내로 클로닝하여, N-말단 His-태그와의 융합물을 창출시킨 다음, 트롬빈 절단 부위를 생성시켰다. 이. 콜라이 BL21 (DE3) (Novagen) 배양물을, 50 mg/L 카베니실린을 수반한 LB 배지에서 37℃ 하에 중간-log 기로 성장시킨 다음, 16℃로 냉각시킨 후, 1.0 mM IPTG로 유도시켰다. 추가로 성장시킨지 12시간 후에 세포를 원심분리시킴으로써 수거하고 -80℃ 하에 저장하였다. 세포 펠릿을 50 mM Tris, pH 8.0, 및 500 mM NaCl에 재현탁시키고 얼음 상에서 초음파처리하였다. 원심분리시킨 후, 상등액을 Ni-NTA 아가로스 칼럼 (Qiagen) 상에 부하하였다. 이 칼럼을 50 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 및 20 mM 이미다졸로 세척한 다음, 250 mM 이미다졸을 수반한 동일한 완충액 중에서 단계 구배를 이용하여 용출시켰다. BAFF-함유 분획을 풀링하고, 트롬빈을 가하며, 샘플을 20 mM Tris, pH 8.0, 및 5 mM CaCl2에 대항하여 4℃ 하에 밤새 투석시켰다. 단백질을 monoQ (Pharmacia) 칼럼 상에서 추가로 정제한 다음, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 및 5 mM MgCl2 중의 S-200 크기 배제 칼럼 상에서 최종적으로 정제하였다. 이로써 생성된 BLyS 단백질을 다음에 기재된 바와 같이 사용하였다.
BR3 세포외 도메인 생성
인간 BR3의 세포외 도메인 (잔기 1 내지 61)을 pET32a 발현 벡터 (Novagen) 내로 서브클로닝시켜, N-말단 티오레독신 (TRX)-His-태그와의 융합물을 창출시킨 다음, 엔테로키나제 프로테아제 부위를 생성시켰다. 이. 콜라이 BL21 (DE3) 세포 (Novagen)를 30℃ 하에 성장시키고, IPTG로 단백질 발현을 유도시켰다. TRX-BR3을 Ni-NTA 칼럼 (Qiagen) 상으로 정제시키고, 이미다졸 구배로 용출시키며, 엔테로키나제 (Novagen)로 절단시켰다. 이어서, BR3을 S-세파로스 칼럼 상으로 정제하고, 3 mM 산화 및 1 mM 환원 글루타치온의 존재 하에 PBS, pH 7.8 중에서 밤새 재폴딩시키며, PBS에 대항해 투석시키고, MonoS 칼럼 상으로 재정제하며, 농축시킨 다음, PBS 내로 투석시켰다.
펩티드 합성
표준 Fmoc 화학을 사용하여 파이오니아 (Pioneer) 펩티드 합성기 (PE Biosystems) 상에서 미니BR3를 C-말단 아미드로서 합성하였다. 시스테인 19 및 32의 측쇄 티올을 트리플루오로아세트산 (TFA)-안정한 아세트아미도메틸 (Acm) 유도체로서 보호시켰다. 펩티드를 TFA 중의 5％ 트리이소프로필 실란으로 실온 하에 1.5 내지 4시간 동안 처리함으로써, 수지로부터 절단시켰다. 회전 증발시켜 TFA를 제거한 후, 에틸 에테르를 부가함으로써 펩티드를 침전시킨 다음, 역상 HPLC (아세토니트릴/H20/0.1％ TFA)에 의해 정제하였다. 전자분무 질량 분광측정법에 의해 펩티드 실체를 확인하였다. 동결건조 후, 산화된 펩티드를 HPLC에 의해 정제하였다. 환원된 미니BR3을 함유하는 HPLC 분획을, NH4OH를 사용하여 pH 약 9가 되도록 조정한 다음; 소 과량의 K3Fe(CN)6을 부가함으로써, 시스테인 24와 35 사이에 디설파이드를 형성시키며, 산화 펩티드를 HPLC에 의해 정제하였다. HPLC 용출액을 소 과량의 I2로 대략 4시간에 걸쳐 처리함으로써, Acm기를 제거하였다 (이와 동시에, 제2 디설파이드가 형성되었다). 산화 진행 과정을 분석적 HPLC에 의해 모니터링하고, 최종 생성물을 HPLC에 의해 다시 정제시켰다. 미니BR3을 10배 몰 과량의 설포-NHS-바이오틴 (Pierce Chemical, Co.)과 반응시킴으로써 수지 상에서 아미노 말단적으로 바이오티닐화하였다. 이어서, 이와 같이 바이오티닐화된 미니BR3을 수지로부터 절단시키고, 바이오티닐화시키지 않은 미니BR3에 대해 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
다음 펩티드 ECFDLLVRHWVACGLLR (BLyS0027) (서열 9), ECFDLLVRHWVPCGLLR (BLyS0048) (서열 6) 및 ECFDLLVRAWVPCSVLK (BLyS0051) (서열 5)를 일반적으로 다음과 같이 합성하였다: 5배 몰 과량의 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재 하에 2-(1H-벤조트리아존-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)으로 활성화시킨 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호된 아미노산 3배 몰 과량과 링크 아미드 수지를 사용하여, 라이닌 심포니 (Rainin Symphony) 펩티드 합성기 시스템 상에서 펩티드를 합성하였다. 아미노산을 디메틸포름아미드 (DMF) 중의 피페리딘의 20％ 용액으로 탈보호시키고 다음 잔기로 이동하기 전에, 각 위치에서 2회 커플링시켰다. 커플링 단계들 간의 세척은 디메틸아세트아미드 (DMA)를 사용하여 수행하였다. 최종 아미노산을 펩티드 상으로 커플링시키고 DMF 중의 20％ 피페리딘을 사용하여 탈보호시킨 후, 3 당량의 아세트산 무수물과 5 당량의 DIPEA (DMA 중)를 사용하여 펩티드를 그의 아미노 말단에서 아실화시켰다. 또 다른 한편, 5-카복시플루오레세인과의 아실화를 통하여, (+)-바이오틴과의 아실화를 통하여, 또는 또 다른 형광단 또는 리포터 분자와의 반응을 통하여, 아미노 말단을 변형시켰다. 이어서, 2.5％ 물 및 2.5％ 트리이소프로필실란을 함유하는 95％ 트리플루오로아세트산 (TFA) 용액으로 90분 동안 처리함으로써, 펩티드를 수지로부터 절단시켰다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 디에틸 에테르를 가하며 고형물을 여과 제거하였다. 이로써 생성된 침전물을 디에틸 에테르로 다시 세척하고, 합한 유기물을 경사 제거하였다. 이어서, 세척시킨 고형물을 아세트산, 아세트산과 아세토니트릴의 1:1 혼합물, 아세트산, 아세토니트릴 및 물의 1:1:1 혼합물, 아세트산, 아세토니트릴 및 물의 1:1:8 혼합물, 및 최종적으로 물로 연속해서 세척하였다. 합한 세척물을 동결건조시키고, 이로써 생성된 조 펩티드를, 분당 15 밀리리터의 유속으로 각 용매 중에서 0.1％ 트리플루오로아세트산을 수반한 수중 아세토니트릴의 10 내지 70％ 30분 구배를 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 목적하는 펩티드를 함유하는 분획은, 용액이 착색된 채로 유지될 때까지 아세트산 중의 포화 요오드 용액을 부가함으로써 산화시켰다. 이어서, 상기 용액을 동결건조시켰다. 최종적으로, 이와 같이 동결건조시킨 조 산화 펩티드를 동일한 조건 하에 두번째로 정제시키고, 목적하는 펩티드를 함유하는 분획을 동결건조시켰다. 4배 과량의 아미노산을 사용하여 PerSeptive 파이오니아 자동화 합성기 상에서 합성을 수행하여, 잔기당 단지 1개만을 커플링시킨 것을 제외하고는, 일부 펩티드를 동일한 조건 하에서 합성하였다.
실시예 6
17량체의 파아지 디스플레이
라이브러리 구축. STII 분비 신호 서열 ("STII ss"), 링커 (GGGSGGG, 서열 _), 및 M13 파아지의 소수 단백질 III의 C-말단 잔기를 코딩하는 서열 (예를 들면, 잔기 267-421) ("cP3"으로 후술됨)을 코딩하는 파아지미드를 라이브러리 구축을 위한 주형으로서 사용하였다. C32W 돌연변이를 수반한 인간 BR3의 잔기 28-39에 상응하는 단편 ("17량체 C32W"로서 공지되기도 함)을 도입시키고, 부가적으로 17량체 C32W 영역 내에서 돌연변이를 코딩시키는 올리고뉴클레오티드 및 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이 유발 기술을 사용하여, 2개의 라이브러리를 구축하였다. 구체적으로 언급하면, 라이브러리 1은 31, 34 및 36-39로 번호 매겨진 잔기에서 대체 코돈 (대체 코돈: NNS = 모든 코돈)을 코딩하고, 라이브러리 2는 대체 코돈 잔기 27, 30, 31, 34 및 36-39 (대체 코돈: VNC = 아미노산 L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D 및 G를 코딩한다)를 코딩하였다. 대체 코돈에서, N은 25％ A, 25％ C, 25％ G, 25％ T이고; S는 50％ G/50％ C이며; V는 33％ G/33％ A/33％ C이고; C는 100％ C이었다. 라이브러리 1은 1.1 x 109개 구성원을 코딩하였고, 라이브러리 2는 4.3 x 108개 구성원을 코딩하였다.
라이브러리 분류. 파아지를 대상으로 하여 선별 4회전을 수행하였다. 일반적으로, 회당 파아지 유입량은 제1 회전에서는 1014개 파아지였고 (고체 상 분류), 그 다음 부가 회전시에는 3 x 1012 개 파아지였다 (용액 상 분류).
파아지 선별. 선별 제1 회전은 고체 상 분류 방법이었다. Maxisorp 면역판 (96-웰)을 상기 언급된 바와 같이 제조된 BLyS82-285 (50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 2 ㎍/ml 하의 100 ㎕)으로 4℃ 하에 밤새 피복시켰다. 이어서, 상기 웰을 1시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 0.2％ (w/v) BSA로 차단시키고, PBS, 0.05％ Tween 20으로 3 내지 5회 세척시켰다. 파아지 입자 [ELISA 완충액 (PBS/0.5％ BSA/0.05％ Tween 20) 중의 100 ㎕/웰]를 상기 웰에 가하였다. 2시간 후, 상기 웰을 PBS, 0.05％ Tween 20으로 수 차례 세척하였다. 웰에 결합된 파아지를 실온 하에 10분 동안 0.1 N HC1로 용출시켰다. 1/20 용적 2M Tris pH 11.0를 부가함으로써, 상기와 같이 용출시킨 파아지를 중화시켰다.
파아지의 역가를 측정하기 위해, log 상 XL-1 (OD 600 nm 대략 0.3)을 30분 동안 37℃ 하에 용출된 파아지로 감염시켰다. 그 다음, 이와 같이 감염된 세포를 2YT에서 10배 증가시키면서 일련으로 희석시켰다. 10 ㎕ 분취액의 감염된 세포를 카베니실린 판에 따라 도말하였다. 각 라이브러리로부터의 대략 108개 파아지를 선별 제1 회전으로부터 수득하였다.
파아지를 증식시키기 위해, 용출시킨 파아지를 사용하여 log 상 XL-1 (OD 600 nm 대략 0.3)를 37℃ 하에 30분 동안 감염시켰다. 헬퍼 파아지, K07, 및 카베니실린을 37℃ 하에 1 x 1010 pfu/ml K07 및 50 ㎍/ml 카베니실린의 최종 농도로 상기 감염물에 30분 더 부가하였다. 배양물을 50 ㎍/ml 카베니실린 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 수반한 2YT 배지에서 37℃ 하에 밤새 성장시켜 최종 용적이 25ml가 되도록 하였다.
세포를 10000 rpm으로 10분 동안 방사함으로써 파아지를 정제하였다. 상등액을 수집하였다. 20％ PEG/2.5 M NaCl을 상등액 용적의 1/5로 가하고, 혼합한 다음, 실온 하에 5분 동안 교반시켰다. 파아지를 10000 rpm으로 10분 동안 펠릿 내로 방사하였다. 상등액을 경사 제거하고 파아지 펠릿을 5000 rpm으로 5분 동안 재방사하였다. 펠릿을 0.7 ml PBS에 재현탁시키고 13000 rpm으로 10분 동안 방사하여 부스러기를 제거하였다. 재현탁된 파아지 펠릿의 OD를 268 nm 하에 판독하였다.
선별 제2 내지 4회전은 용액 분류 방법을 활용하였다. 제2 회전의 경우에는, Maxisorp Nunc 96-웰 판을 4℃ 하에 밤새 5 ㎍/ml 뉴트라비딘 (Pierce)으로 피복시켰다. 그 다음, 상기 판을 PBS 중의 200 ㎍/ml 슈퍼블록 (Pierce)으로 실온 하에 30분 동안 차단시켰다. Tween20을 최종 농도 0.2％ (v/w)를 위해 각 웰에 가하고, 실온 하에 30분 더 차단시켰다. 이와 같이 증폭시키고 정제시킨, 선별 제1 회전으로부터의 파아지를 슈퍼블록 0.5％ 및 0.1％ Tween20를 함유하는 150 ㎕ 완충액 중의 50 nM 바이오티닐화 BLyS (최종 농도)와 함께 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 혼합물을 PBS/0.05％ Tween로 5 내지 10배 희석시키고, 100 ㎕/웰로 뉴트라비딘 피복된 판에 적용하였다. 상기 판을 실온 하에 5분 동안 온화하게 진탕시켜, 웰에서 포획될 바이오티닐화 BLyS에 파아지가 결합되도록 할 수 있다. 이어서, 상기 웰을 PBS/0.05％ Tween20으로 수 차례 세척하였다. 결합된 파아지를 0.1 N HCl로 10분 동안 용출시키고, 중화시키며, 역가 측정하고, 증식시킨 다음, 상기 언급된 바와 같이 정제하였다. 각 라이브러리로부터의 약 3 x 106개 파아지를 선별 제2 회전으로부터 수득하였다.
선별 제3 회전은 제2 회전과 유사한데, 단 희석 및 각 웰에 대한 부가에 앞서, 2 nM 농도의 바이오티닐화 BLyS를 파아지와 함께 항온 배양하였다. 결합된 파아지를 0.1 N HCl로 10분 동안 용출시키고, 중화시키며, 역가 측정하고, 상기 언급된 바와 같이 증식시켰다. 각 라이브러리로부터의 약 104개 파아지를 선별 제3 회전으로부터 수득하였다.
그 다음, 선별 제3 회전으로부터의 파아지를 대상으로 하여, 제4 회전에서 2가지 상이한 선별 방법을 수행하였다. 방법 4a는 선별 제2 회전 및 제3 회전과 유사한데, 단 파아지를 0.5 nM 바이오티닐화 BLyS의 존재 하에 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 혼합물을, 희석 및 피복 웰로의 부가에 앞서, 바이오티닐화되지 않은 1000배 과량 (500 nM)의 BLyS의 존재 하에 실온에서 15분 더 항온 배양하였다. 방법 4b 또한, 선별 제2 회전 및 제3 회전과 유사한데, 단 희석 및 각 웰로의 부가의 앞서, 파아지를 0.2 nM BLyS와 함께 항온 배양하였다. 각 선별 제4 회전으로부터의 결합된 파아지를 0.1 N HCl로 10분 동안 용출시키고, 중화시키며, 역가 측정하고, 상기 언급된 바와 같이 증식시켰다. 각 라이브러리로부터의 약 103개 파아지를 선별 제4 회전 각각 (4a 및 4b)으로부터 수득하였다.
클론 분석. 선별 제4 회전 후, 개개의 클론을 카베니실린 및 K07 헬퍼 파아지가 보충된 400 ㎕의 2YT 배지에서 96-웰 포맷으로 성장시켰다. 3가지 배양물로부터의 상등액을 파아지 ELISAs에 사용하였다. 파아지 ELISAs하기 위해서는, Nunc Maxisorp 96-웰 판을 4℃ 하에 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 BLyS 2 ㎍/ml 용액으로 밤새 피복시켰다. 상기 판을 PBS로 세척하고, PBS 중의 0.5％ BSA로 2시간 동안 차단시켰다. 파아지 상등액을 50 nM BLyS의 존재 또는 부재 하에 ELISA 결합 완충액 (PBS, 0.5％ BSA, 0.05％ Tween20) 중에서 1:4로 희석시키고, 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 100 ㎕의 희석된 파아지 상등액을 피복된 판에 옮기고, 온화하게 진탕시켜 파아지를 20분 동안 포획하였다. 이어서, 상기 판을 PBS/0.05％ Tween20으로 수 차례 세척하였다. 이어서, PBS/0.05％ Tween20 (1:5000) 중의 HRP-접합된 항-M13 항체 100 ㎕/웰을 상기 판에 옮기고, 20분 동안 항온 배양하였다. PBS/0.05％ Tween으로 세척한 다음 PBS로 세척한 후, 상기 판을, 0.8 mg/ml OPD (Sigma) 및 0.01％ H202을 함유하는 100 ㎕ PBS 기질 용액과 함께 5분 동안 항온 배양하였다. 반응물을 100 ㎕/웰 1M H3PO4로 켄칭시키고, 판을 490 nm 하에 판독하였다. 그 다음, 시험된 클론을 앞서 기재된 바와 같이 서열 분석하였다 (문헌 [Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., and Sidhu, S. S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8950-8954] 참고). 허용 가능한 질의 서열을 해독하고 정렬시켰다. 17량체의 아미노산 서열은 도 32에 제시되었다.
14개 클론을 BLyS 결합 검정에서 추가로 분석하여 그들의 IC50 값을 결정하였다. 클론 2 및 7은 제4 회전에서 높은 수의 형제 (동일한 서열을 갖는 클론)을 가졌다. 파아지 ELISA 검정에 따르면, 클론 13, 19, 22, 26, 32, 39 및 44는 50 nM BLyS에 의해 판에 결합되는 것이 상당히 억제되었다 (도 11). 클론 35, 45, 68, 82 및 90의 결합 역시, 파아지 ELISA 검정에서 상당히 억제되었다 (도 11). 이들 14개 클론으로부터의 파아지 상등액을 사용하여, 상기 언급된 바와 같이 증식 및 정제시킨 log 상 XL-1를 감염시켰다.
디스플레이 및 파아지 수율에 대해 표준화시키고 IC50 측정에 대한 파아지의 적당한 희석을 측정하기 위해, 각 클론으로부터의 정제된 파아지의 일련의 희석물을 ELISA 결합 완충액 (PBS, 0.5％ BSA, 0.05％ Tween20)에서 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 100 ㎕의 각 희석물을 BLyS 피복 판에 옮기고, 온화하게 진탕시켜, 상기 언급된 바와 같이 파아지를 20분 동안 포획시켰다. 결합된 파아지를 HRP-접합된 항-M13 항체에 의해 검출한 다음, OPD/H202 기질 반응물에 의해 검출하고, 켄칭한 다음, 상기 언급된 바와 같이 490 nm 하에 판독하였다. 이러한 과정에 의해, 490 nm 하에 약 1 O.D.를 생성시킨 각 클론의 희석을 결정하고, 이를 IC50 검정에 사용하였다.
14개 클론 각각의 IC50 값을 결정하기 위해, Nunc Maxisorp 96-웰 판을 4℃ 하에, 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 100 ㎕의 BLyS 2 ㎍/ml 용액으로 밤새 피복시키고, 상기 언급된 바와 같이 세척 및 차단시켰다. 14개 클론 각각에 대한, 증폭되고 정제된 파아지 희석물을 실온 하에 1시간 동안, 130 ㎕ ELISA 결합 완충액 (PBS, 0.5％ BSA, 0.05％ Tween20) 중의 0.003 내지 1000 nM 농도 범위의 일련의 BLyS의 존재 하에 항온 배양하였다. 이들 농도 시리즈 각각의 100 ㎕를 BLyS 피복 판에 옮기고, 포획하며, 세척하고, HRP-접합된-M13 항체로 검출한 다음, 상기 언급된 바와 같이 처리하였다. IC50 값을 14개 클론 각각에 대한 ELISA 신호의 4개 파라미터 피트에 의해 결정하였다. IC50 값은 0.4 (클론 44) 내지 11 nM (클론 22)의 범위였다.
경쟁적 치환 ELISA. 다음 17량체, 즉 Ac-ECFDLLVRHWVACGLLR-NH2 (서열 _) ("BLyS0027"), Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2 (서열 _) ("BLyS0048"), Ac-ECFDLLVRAWVPCSVLK-NH2 (서열 _) ("BLyS0051")을 상기 언급된 바와 같이 합성하였다. Nunc Maxisorp 96-웰 판을 4℃ 하에, 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 100 ㎕의 BLyS 2 ㎍/ml 용액으로 밤새 피복시켰다. 상기 판을 PBS로 세척하고, PBS 중의 1％ 탈지유로 차단시켰다. BR3 ECD (잔기 1-61) 및 상기 17량체 펩티드의 일련의 희석물을, 3 ng/ml 바이오티닐화 미니BR3을 함유하는 PBS/0.05％ Tween 20에서 제조하였다. PBS/0.05％ Tween으로 세척한 후, 각 희석물 100 ㎕/웰을 옮기고 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 상기 판을 PBS/0.05％ Tween으로 세척하고, PBS/0.05％ Tween 중의 100 ㎕/웰의 0.1 U/ml 스트렙타비딘-POD (Boehringer Mannheim)와 함께 항온 배양하였다. PBS/0.05％ Tween으로 세척한 다음 PBS로 세척한 후, 상기 판을, 0.8 mg/ml OPD (Sigma) 및 0.01％ H202을 함유하는 100 ㎕ PBS 기질 용액과 함께 5분 동안 항온 배양하였다. 반응물을 100 ㎕/웰 1M H3PO4로 켄칭시키고, 판을 490 nm 하에 판독하였다. IC50 값을 경쟁적 치환 ELISA 신호의 4개 파라미터 피트에 의해 결정하였다. 미니BR3 및 BR3 세포외 도메인의 초기 스톡 용액의 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다.
상기 검정을 이용하여, IC50 값을 BR3 ECD, BLyS0027, BLyS0048 및 BLyS0051에 대해 결정하였다. 17량체 펩티드 모두는 62량체 BR3 ECD 보다 BLyS에 대한 친화성이 훨씬 더 높았다.
실시예 4
펩티드-PEG 접합체
BLyS 82-285 생성 및 펩티드 합성. 상기 실시예 5에 기재된 바와 같음.
펩티드에 대한 중합체의 접합. 1급 아민 (리신 및 N-말단)과 반응시키기 위해 N-히드록시석신이미드 화학 (NHS)으로 변형시킨 선형 PEGs를 사용함으로써, PEG화 17량체 펩티드를 생성시켰다. 모든 PEG-NHS (PEG-SPA) 시약은 공급처 [Nektar Therapeutics, San Carlos, CA]로부터 구입하고 -70℃ 질소 하에 저장하였다. 펩티드 1 mg/ml을 인산염 완충 식염수 (PBS)에 용해시켰다. 0.4 ml 분취액의 펩티드 용액에 고형 2KPEG-SPA, SKPEG-SPA, 또는 20KPEG-SPA를 가하였다. 충분한 고형물을 부가하여, PEG-SPA 대 펩티드의 3:1 몰비를 수득하였다. 이들 용액을 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하고, 반응 진행 과정을 50 ㎕ 용액 일부 상에서 역상 분석적 HPLC함으로써 분석하였다. 모든 펩티드가 변형될 때까지 PEG 부가 및 항온 배양을 2회 반복하였다. PEG화 펩티드를 대상으로 하여, 추가의 정제없이 BlyS 결합에 대해 시험하였다. 정제된 접합 생성물 중의 PEG:펩티드의 비는 대략 1:1이었다.
경쟁적 치환 ELISA. 17량체, 즉 Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2 (서열 _) ("blys0048")를 상기 언급된 바와 같이 합성하였다. ECFDLLVRHWVPCGLL K (blys0095) (서열 _)을 합성하고, 이를 각각의 2K, 5K 및 20K PEG-NHS에 상기 언급된 바와 같이 커플링시켰다. Nunc Maxisorp 96-웰 판을 4℃ 하에, 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 100 ㎕의 BLyS 2 ㎍/ml 용액으로 밤새 피복시켰다. 상기 판을 PBS로 세척하고, PBS 중의 1％ 탈지유로 차단시켰다. 미니BR3 (서열 _) 및 상기 17량체 펩티드 및 PEG-펩티드 접합체의 일련의 희석물을, 3 ng/ml 바이오티닐화 미니BR3을 함유하는 PBS/0.05％ Tween 20에서 제조하였다. PBS/0.05％ Tween으로 세척한 후, 각 희석물 100 ㎕/웰을 옮기고 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 상기 판을 PBS/0.05％ Tween으로 세척하고, PBS/0.05％ Tween 중의 100 ㎕/웰의 0.1 U/ml 스트렙타비딘-POD (Boehringer Mannheim)와 함께 15분 동안 항온 배양하였다. PBS/0.05％ Tween으로 세척한 다음 PBS로 세척한 후, 상기 판을, 0.8 mg/ml OPD (Sigma) 및 0.01％ H202을 함유하는 100 ㎕ PBS 기질 용액과 함께 5분 동안 항온 배양하였다. 반응물을 100 ㎕/웰 1M H3PO4로 켄칭시키고, 판을 490 nm 하에 판독하였다. IC50 값을 경쟁적 치환 ELISA 신호의 4개 파라미터 피트에 의해 결정하였다. 방정식은 다음과 같다: y = m1 + (m2-m1)/(1+m0/m4)^m3 [여기서, m1은 무한 경쟁인자 농도 하의 흡광도이고, m2는 경쟁인자가 부가되지 않은 흡광도이며, m3은 중간점 근처 곡선의 기울기이고, m4는 IC50 값이며, m0은 경쟁인자 (본 경우에, 펩티드)의 농도이다]. 바이오티닐화 미니BR3의 농도는 약 10 pM이었다. 미니BR3의 초기 스톡 용액의 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다.
결과
본 검정을 이용하여, 경쟁적 치환 ELISA 신호의 4개-파라미터 피트는 다음과 같은 IC50 값을 제공하였다: blys0095: 19 nM, blys0048: 14 nM 및 blys0095-2kPEG 접합체: 43 nM, 및 blys0095-5kPEG 접합체: 51nM. 유사하게, 별개의 실험에 대한 경쟁적 치환 ELISA 신호의 피트는 다음과 같은 IC50 값을 제공하였다: blys0095-20kPEG 접합체: 99 nM 및 blys0048: 15 nM.
17량체 펩티드-PEG 접합체 (2k, 5k 및 20k)는 BLyS에 대한 결합 능력을 입증해주었다. blys0095에 대한 PEG의 접합은, 접합되지 않은 유사한 펩티드와 비교해서 그의 결합 친화성을 상당히 저하시키지 않았다.
결론
본원의 실험은 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 조합이 모든 B 세포 서브세트를 고갈시키는데 있어 상당한 상승적 효과를 가져다 주었다는 놀라운 결과를 입증해주었다.
참고 문헌
특허, 공개공보 및 기타 공보를 포함한, 본원에 인용된 참고 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
<110> GENENTECH, INC. <120> COMBINATION THERAPY FOR B CELL DISORDERS <130> P2040R1PCT <140> PCT/US04/17693 <141> 2004-06-04 <150> US 60/476,531 <151> 2003-06-06 <150> US 60/476,481 <151> 2003-06-05 <150> US 60/476,414 <151> 2003-06-05 <160> 145 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg 20 25 30 Asp Ser Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp 35 40 45 Pro Leu Val Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro 50 55 60 Asp Thr Gly His Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln 65 70 75 Pro Gln Glu Gly Gln Val Thr Gly Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 80 85 90 Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 95 100 105 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile 110 115 120 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys 125 130 135 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 140 145 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cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca catatgcatg 1050 catgcacact taaaaatgtc aaaattagcg gctggagaaa ttcatggtca 1100 acagcgctta ctgtgattcc agaggatgag agtttgattc ccagaatgca 1150 ctgcgggtgg ctcattactg agcataactt ttgcttcagg ggacctgatg 1200 cctctggact tcatgggcat ctgtattcac gtgcacatcc tacacacaca 1250 cacacacaca cacacagaca tacacacaca cacactcttt tacaaatgat 1300 aaaatataag ataggcatgg tggtacacac ctttaatccc aacattgggg 1350 aagcaaaggc aggcaggtaa ctgagttgga ggccatcctg gtctacatag 1400 caagttccag gctaaccaga gctaaatggt gagaccaagt ctcaaaataa 1450 tactcccccc ccaaaaaaaa aaaactttta aattttgatt tttttctttt 1500 attattattt tttatattaa tttcatggtg tttagaagtg gtatacttag 1550 atggtgacta agaggaggta aagccatcag gactgagccc ctaacataca 1600 aggagaaagc agagacaatg aacacgcccc tctcctgctg tgtgccagct 1650 ctggaccacc agccagaggg caatcatcag atgtgggccc tagaaccttc 1700 agagccgaaa gctaaatcaa tctcatttct ttgtaaagct atttagcctt 1750 aggtgttttg ttacggtgat ataaaatgga ctaacacagg cactatgagt 1800 aagaagcttt tctttgagct gggaaaggta ctgttaaacc aaaattaatc 1850 tgaataaaaa aaggctaagg ggaagacact t 1881 <210> 35 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp 1 5 10 15 Ser Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro 20 25 30 Leu Val Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp 35 40 45 Thr Gly His Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro 50 55 60 Gln Glu Gly Ser Ala Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Val Gly 65 70 75 Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ile Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly 80 85 90 Leu Val Ser Leu Val Ser Trp Arg Trp Arg Gln Gln Leu Arg Thr 95 100 105 Ala Ser Pro Asp Thr Ser Glu Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu 110 115 120 Asn Val Phe Val Pro Ser Ser Glu Thr Pro His Ala Ser Ala Pro 125 130 135 Thr Trp Pro Pro Leu Lys Glu Asp Ala Asp Ser Ala Leu Pro Arg 140 145 150 His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu 155 160 165 Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln 170 175 <210> 36 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 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ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat 350 gataatgaat tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt 400 caatcatgga catacttaat attaaaattt cccatttttt aaaaatggag 450 agtctgaatt ttattagagc tcacacacca tatattaaca tatacaactg 500 tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc caatactgtt 550 acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600 gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa 650 aagaacgtgc tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag 700 aaaaaaaaga acagactatt gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact 750 gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa gacattgaaa ttattccaat 800 ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca gaacctcccc 850 aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 65 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gln Trp Val Pro Cys Glu Arg 1 5 10 15 Ile Arg <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 66 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met 1 5 10 15 Leu Gly <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 67 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Lys Trp Val Pro Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Gly <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 68 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Thr Trp Val Glu Cys Ser Leu 1 5 10 15 Leu Asn <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 69 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys Gly Thr 1 5 10 15 Leu Met <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 70 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met 1 5 10 15 Leu Arg <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 71 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Thr Trp Val Pro Cys Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 72 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Arg Cys Asp Met 1 5 10 15 Leu Leu <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 73 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gly Trp Val Pro Cys Glu Lys 1 5 10 15 Leu Met <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 74 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Trp Leu 1 5 10 15 Arg Leu <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 75 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Gly Leu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 76 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Asp Cys Ala Phe 1 5 10 15 Leu His <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 77 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys Ser Ser 1 5 10 15 Leu Gly <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 17 <223> Unknown amino acid <400> 78 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Thr Trp Val Pro Cys Asn Val 1 5 10 15 Leu Xaa <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 79 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Leu 1 5 10 15 Leu Val <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 80 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Lys <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 81 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gln Trp Val Ser Cys Gln Val 1 5 10 15 Phe Ala <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 82 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Val Trp Val Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 83 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gln Trp Val Pro Cys Gly Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 84 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Asn Glu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 85 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Glu Trp Val Pro Cys Arg Ile 1 5 10 15 Leu Gln <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 86 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Ser Trp 1 5 10 15 Leu Leu <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 87 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Ser Leu 1 5 10 15 Val Lys <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 88 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gln Trp Val Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Met <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 89 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Tyr 1 5 10 15 Leu Ser <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 90 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Asp Trp Val Pro Cys Ser Leu 1 5 10 15 Leu Phe <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 91 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys Thr Leu 1 5 10 15 Leu Ser <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 92 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Lys Trp Val Pro Cys Ser Thr 1 5 10 15 Phe His <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 93 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gly Trp Val Pro Cys Ser Val 1 5 10 15 Leu Gln <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 94 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val 1 5 10 15 Leu Lys <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 95 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gln Trp Val Ser Cys Glu Leu 1 5 10 15 Leu Ser <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 96 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Gly Trp Val Asp Cys Ser Leu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 97 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 97 Glu Cys Phe Asp Ile Leu Val Asp Arg Trp Val Pro Cys Ala Ile 1 5 10 15 Leu His <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 98 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Gly His Trp Val Pro Cys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ile <210> 99 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 99 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Ala Arg Trp Val Pro Cys His Leu 1 5 10 15 Ile Asn <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 100 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Val Trp Val Asp Cys Ser Ile 1 5 10 15 Leu Asp <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 101 Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Asn Ala Trp Val Pro Cys Ser Ala 1 5 10 15 Ile Arg <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 102 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Asn Arg Trp Val Asp Cys Arg Leu 1 5 10 15 Leu Ile <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 103 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Ile Trp Val Ala Cys Asp Arg 1 5 10 15 Leu Ala <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 104 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Gly Arg Trp Val Pro Cys Thr Leu 1 5 10 15 Leu His <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 105 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys His Leu 1 5 10 15 Ile Asp <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 106 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Gly His Trp Val Pro Cys Ser Val 1 5 10 15 Leu Thr <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 107 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Asn Arg Trp Val Asp Cys Val Ala 1 5 10 15 Leu His <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 108 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Asn Leu Trp Val Asp Cys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Asn <210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 109 Glu Cys Phe Asp Val Leu Val Ser Ala Trp Val Asp Cys Ala Arg 1 5 10 15 Leu Asn <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 110 Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg Leu Trp Val Pro Cys Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 111 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 111 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Gly Ser Pro 20 <210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 112 Glu Cys Phe Asp Ile Leu Val Asn Ala Trp Val Pro Cys Arg Val 1 5 10 15 Ile Gly <210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 113 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Asn Arg Trp Val Pro Cys Asn Leu 1 5 10 15 Ile Val <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 114 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Thr Ala 1 5 10 15 Leu Thr <210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 115 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys His Leu 1 5 10 15 Ile Thr <210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 116 Glu Cys Phe Asp Ile Leu Val Gly Arg Trp Val Pro Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ile His <210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 117 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Asp Trp Val Arg Cys Asp Ile 1 5 10 15 Leu Thr <210> 118 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 118 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Val Trp Val Pro Cys Thr Val 1 5 10 15 Leu Arg <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 119 Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Gly Val 1 5 10 15 Leu Ser <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 120 Glu Cys Phe Asp Val Leu Val His Arg Trp Val Pro Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ile Arg <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 121 Glu Cys Phe Asp His Leu Val Arg Ile Trp Val Pro Cys Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ala <210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 122 Glu Cys Phe Asp Thr Leu Val Asn Ala Trp Val Pro Cys Asn Leu 1 5 10 15 Leu Asp <210> 123 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 123 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Asn Gly Trp Val Pro Cys Ala Val 1 5 10 15 Leu His <210> 124 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 124 Glu Cys Phe Asp Arg Leu Val Asn Ala Trp Val Asp Cys Arg Leu 1 5 10 15 Leu Ala <210> 125 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 125 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Asn Asp Trp Val Pro Cys Gly Ala 1 5 10 15 Ile Thr <210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 126 Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val Arg Arg Trp Val Asp Cys Ser Leu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 127 Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val His Arg Trp Val Asp Cys Ala Val 1 5 10 15 Leu Gly <210> 128 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 128 Glu Cys Phe Asp Val Leu Val Asn Ala Trp Val Asp Cys Ala Val 1 5 10 15 Leu Arg <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 129 Glu Cys Phe Asp Gly Leu Val Asn Ala Trp Val Asp Cys Gly Leu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 130 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 130 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Asp <210> 131 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 131 Glu Cys Phe Asp Asp Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Asp Leu 1 5 10 15 Leu Thr <210> 132 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 132 Glu Cys Phe Asp Val Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Thr <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 133 Glu Cys Phe Asp Ile Leu Val Asn Arg Trp Val Pro Cys Gly Ala 1 5 10 15 Leu Thr <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 134 Glu Cys Phe Asp Asp Leu Val Arg Asn Trp Val Pro Cys Ala Leu 1 5 10 15 Leu Asn <210> 135 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 135 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Asn Ala Trp Val Pro Cys Ala Val 1 5 10 15 Leu His <210> 136 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 136 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Leu Arg Trp Val Pro Cys Ser Ala 1 5 10 15 Leu His <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 137 Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val His Arg Trp Val Pro Cys Asp Leu 1 5 10 15 Leu Arg <210> 138 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 138 Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg Asp Trp Val Pro Cys Asp Leu 1 5 10 15 Ile His <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 139 Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Asn Ser Trp Val Pro Cys Ser Val 1 5 10 15 Ile Ala <210> 140 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 140 Glu Cys Phe Asp Thr Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser His 1 5 10 15 Leu Thr <210> 141 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 141 Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg Ile Trp Val Pro Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ile Asp <210> 142 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 142 Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Asn Ala Trp Val Pro Cys His Val 1 5 10 15 Leu Thr <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Unsure <222> 1 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 3 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 5 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 7-12 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 14-17 <223> Unknown amino acid <400> 143 Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 144 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unsure <222> 1 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 3 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 5 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 8-9 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 11-12 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 14-15 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 17 <223> Unknown amino acid <400> 144 Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Val Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa <210> 145 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unsure <222> 5 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 8-9 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 12 <223> Unknown amino acid <220> <221> Unsure <222> 14-17 <223> Unknown amino acid <400> 145 Glu Cys Phe Asp Xaa Leu Val Xaa Xaa Trp Val Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa

Claims (55)

  1. 세포 혼합 집단을 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 혼합 집단으로부터 B 세포를 고갈시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, B 세포가 인간 B 세포이고, 세포 혼합 집단이 생체 내에서 BLyS 길항제 및 CD20 결합 항체와 접촉되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, BLyS 길항제가 면역부착인자(immunoadhesin)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 면역부착인자가 BR3의 세포외 도메인을 포함하는 BR3 면역부착인자, TACI의 세포외 도메인을 포함하는 TACI 면역부착인자 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 BCMA 면역부착인자로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, BR3 면역부착인자가 서열 2의 BR3-Fc인 방법.
  6. 제1항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BLyS 항체인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항-BLyS 항체가, 잔기 162-275를 포함하는 BLyS의 영역 내에서 BLyS와 결합되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BR3 항체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항-BR3 항체가 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 영역 내에서 BR3과 결합되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항-CD20 항체가 리툭산 (Rituxan™)인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 항-CD20 항체가 서열 15 및 서열 16의 경쇄 및 중쇄 서열을 각각 갖는 hu2H7v.16인 방법.
  12. 제1항에 있어서, BLyS 길항제와 항-CD20 항체가 상승적으로 작용하여 B 세포를 고갈시키는 방법.
  13. 치료상 유효량의 CD20 결합 항체 및 치료상 유효량의 BLyS 길항제를, CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물(neoplasm) 또는 악성 종양으로 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 B 세포 신생물 또는 악성 종양을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 동시에 투여하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 순차적으로 투여하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, CD20 결합 항체를 투여하기 전에 BLyS 길항제를 투여하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, B 세포 신생물이 비호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 림프구 우위형 호지킨병 (LPHD), 소포 중심 세포 (FCC) 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병인 방법.
  18. 제17항에 있어서, B 세포 신생물이 비호지킨 림프종 (NHL) 또는 소 림프구성 (SL) NHL인 방법.
  19. 제13항에 있어서, BLyS 길항제가 면역부착인자인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 면역부착인자가 BR3의 세포외 도메인을 포함하는 BR3 면역부착인자, TACI의 세포외 도메인을 포함하는 TACI 면역부착인자 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 BCMA 면역부착인자로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, BR3 면역부착인자가 서열 2의 hBR3-Fc인 방법.
  22. 제13항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BLyS 항체인 방법.
  23. 제14항에 있어서, 항-BLyS 항체가, 잔기 162-275를 포함하는 BLyS의 영역 내에서 BLyS와 결합되는 방법.
  24. 제13항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BR3 항체인 방법.
  25. 제8항에 있어서, 항-BR3 항체가 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 영역 내에서 BR3과 결합되는 방법.
  26. 제13항에 있어서, CD20 결합 항체가 인간 항체의 불변 영역에 융합된 쥐 항체로부터의 가변 영역을 포함하는 키메라 항체인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 키메라 항체가 리툭산인 방법.
  28. 제13항에 있어서, CD20 결합 항체가 인간화 항체인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 인간화 항체가 서열 15 및 서열 16의 경쇄 및 중쇄 서열을 각각 갖는 hu2H7v.16인 방법.
  30. 제21항에 있어서, CD20 결합 항체가 리툭산, 또는 서열 15 및 서열 16의 경쇄 및 중쇄 서열을 각각 갖는 hu2H7v.16인 방법.
  31. 제30항에 있어서, BR3-Fc가 약 2 내지 5 mg/kg의 투여량으로 투여되고, 리툭산이 약 375 mg/㎡의 투여량으로 투여되는 방법.
  32. 제13항에 있어서, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체의 투여가 B 세포를 고갈시키는데 있어서 상승 효과를 나타내는 방법.
  33. 제13항에 있어서, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체를 화학요법과 연계해서 투여하는 방법.
  34. 치료상 유효량의 CD20 결합 항체 및 치료상 유효량의 BLyS 길항제를, B 세포 조절된 자가면역 질환으로 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, B 세포 조절된 자가면역 질환을 완화시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 순차적으로 투여하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, CD20 결합 항체를 투여하기 전에 BLyS 길항제를 투여하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년성 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병 (Wegener's disease), 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome) 및 사구체신염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염 및 전신성 홍반성 루푸스인 방법.
  39. 제34항에 있어서, BLyS 길항제가 면역부착인자인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 면역부착인자가 BR3의 세포외 도메인을 포함하는 BR3 면역부착인자, TACI의 세포외 도메인을 포함하는 TACI 면역부착인자 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 BCMA 면역부착인자로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, BR3 면역부착인자가 서열 2의 BR3-Fc인 방법.
  42. 제34항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BLyS 항체인 방법.
  43. 제34항에 있어서, BLyS 길항제가 항-BR3 항체인 방법.
  44. 제34항에 있어서, CD20 결합 항체가 인간 항체의 불변 영역에 융합된 쥐 항체로부터의 가변 영역을 포함하는 키메라 항체인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 키메라 항체가 리툭산인 방법.
  46. 제34항에 있어서, CD20 결합 항체가 인간화 항체인 방법.
  47. 제28항에 있어서, 인간화 항체가 서열 15 및 서열 16의 경쇄 및 중쇄 서열을 각각 갖는 hu2H7v.16인 방법.
  48. 제41항에 있어서, CD20 결합 항체가 리툭산, 또는 서열 15 및 서열 16의 경쇄 및 중쇄 서열을 각각 갖는 hu2H7v.16인 방법.
  49. 제48항에 있어서, BR3-Fc가 약 2 내지 5 mg/kg의 투여량으로 투여되고, 리툭 산이 약 2.5 내지 10 mg/kg의 투여량으로 투여되는 방법.
  50. 제34항에 있어서, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체의 투여가 B 세포를 고갈시키는데 있어서 상승 효과를 나타내는 방법.
  51. 제38항에 있어서, BLyS 길항제와 CD20 결합 항체를, 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 글루코코르티코이드, 프레드니손 및 질병 완화 항류마티스약 (DMARD) 중에서 선택된 약물을 이용하는 요법과 연계해서 투여하는 방법.
  52. 치료상 유효량의 CD20 결합 항체 및 치료상 유효량의 BLyS 길항제를, B 세포 신생물 또는 B 세포 조절된 자가면역 질환으로 고통받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 연변층 또는 배중심 세포 B 세포를 고갈시키는 방법.
  53. 제1항, 제13항, 제34항 및 제52항 중의 어느 한 항에 있어서, BLyS 길항제가 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  54. CD20 결합 항체와 BLyS 길항제를 포함하는 조성물.
  55. CD20 결합 항체; BLyS 길항제; 및 해당 조성물이 B 세포 신생물 또는 B 세포 조절된 자가면역 질환을 치료하기 위한 것임을 표시하는 라벨을 포함하는 제품.
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