PT2291657T - Níveis séricos de heterotrímeros blys/april e utilização em métodos de diagnóstico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

NÍVEIS SÉRICOS DE HETEROTRÍMEROS BLYS/APRIL Ξ UTILIZAÇÃO EM

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

As interações celulares que ocorrem durante uma resposta imune são reguladas por membros de várias famílias de recetores de superfície de célula, incluindo a família do recetor do fator de necrose tumoral (TNFR). A família TN FR consiste num número de recetores de glicoproteína de membrana integral, muitos dos quais, em conjunção com os seus respetivos ligandos, regulam interações entre diferentes linhagens de células hematopoiéticas (Smith et ai., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76:959-62, 1994; Cosman, Stem Cells 12:440-55, 1994). Três membros recetores desta família são (1) BCMA, Antígeno de Maturação da Célula B (Gras et ai., Int. Immunol. 17:1093-106, 1995 e Hatzoglou et al., J. Immunol., 165: 1322-30, 2000); (2)

TACI, ativador transmembranar e interator de CAML (von Bulow e Bram, Science 228:138-41, 1997 e Publicação WIPO documento WO 98/39361)) e (3) BAFF-R, também conhecido como recetor 3 de BLyS/BLyS (BR3) (Thompson et al., Science, 293: 2108-11, 2001). Estes recetores são conhecidos por ligarem um ou ambos os ligandos de TNF - estimulador de linfõcitos B (BLyS também conhecido por BLyS, TALL-1, ztnf4 e THANK) (ver, por exemplo, Shu et ai., J. Leukoc, Biol. 65: 680-683 (1999)) e um ligando indutor de proliferação (APRIL) (ver, por exemplo, Hahne et ai., J. Exp. Med. 188: 1185-1190 (1998)). Especif icamente, TACI e BCMA são conhecidos por ligarem ambos BLyS e APRIL e BAFF-R apenas 1 r g a B L y S .

Um número de antagonistas BLyS e/ou APRIL foram desenvolvidos a fim de bloquear a ligação dos ligandos aos membros recetor da família, a fim de bloquear os resultados desta ligação que inclui, mas não deve ser limitada a, co-estimulação de células B, sobrevivência de plasmablast e células de plasma, a troca de classe de Ig, função de células apresentadoras de antígeno de células B aumentado, sobrevivência de células B malignas, desenvolvimento da função de células B-l, desenvolvimento de células B para além da fase T-l e a formação de centro germinal completo. Algumas destas moléculas também podem ligar-se e bloquear o efeito de APRIL nas células B e noutros componentes do sistema imunitário (Dillon et al. (2006) Nat. Rev. Drug Dis. 5, 235-246). As moléculas que foram desenvolvidas para afetar a função da célula B interferindo comi a ligação BLyS e/ou APRIL incluem anticorpos BLyS tal como Lymphostat-B (Belimumab) (Baker et ai., (2003) Arthritis Rheum, 48, 3253-3265 e o documento WO 02/02641); domínio extracelular do recetor/proteínas de fusão domínio de Fc tal como TACI-Ig, que inclui uma forma de realização particular, atacicept (Pedido de Patente U.S. N.° 20060034852), BAFF-R-Fc (documento WO 05/0000351) e BCMA-Ig ou outras proteínas de fusão que utilizam domínios extracelulares recetores. Uma classe adicional de antagonistas BLyS e/ou APRIL inclui outras moléculas que dependem da capacidade de ligação BLyS para bloquear a ligação aos seus recetores tais como AMG 623, recetor de anticorpos e outras moléculas divulgados no documento WO 03/035846 e o documento WO 02/16312.

Um aspeto pouco estudado desta família ligando/recetor é o facto destes ligandos parecem existir in vivo não apenas como homotrímeros (o que seria esperado para ligandos da família de INF), mas também como heterotrímeros (HI) BLyS/APRIL de estequiometria não caraterizada. Utilizando uma amostra definida extremamente pequena e heterogénea (isto é, 15 pacientes com diagnóstico, entre eles, de 6 doenças autoimune diferentes), a existência de HT elevado nos soros em comparação com controlos saudáveis foi relatado por Roschke et al. (J. Immunol. 169: 4314-4321, 2002). No entanto, não houve associação entre a presença de HT elevado com qualquer doença autoimune particular, uma análise necessária para aplicar tais descobertas a métodos de tratamento duma doença especifica nem esta descoberta tem sido apresentada além de informalmente, isto é, com significância estatística.

Assim, permanece uma necessidade na técnica da investigação na atividade biológica de HT e o desenvolvimento de um ensaio para comparar os niveis de HT nativo aos de BLyS e APRIL homotriméricos em pacientes autoimunes. Além disso, este ensaio permite a identificação de padrões de expressão de HT de modo a que as associações estatísticas com doença autoimune possam ser identificadas, tal como lúpus eritematoso sistémico (LES). Tal informação é importante para identificar indivíduos que têm uma propensão para o desenvolvimento de tais doenças autoimunes, estão num estado de doença ativa e para identificar aqueles que responderão favoravelmente ao tratamento de antagonista BLyS e/ou APRIL destas doenças. A presente especificação descreve os niveis de HT associados com doenças autoimunes e proporciona testes de diagnóstico que determinam a presença deste padrão de expressão, nomeadamente níveis séricos de HT aumentados para aqueles que sofrem de doença autoimune tal como LES em comparação com níveis vistos em controlos saudáveis.

Roschke V et al., J. Immunology, Volume 169, 1 de janeiro de 2002, paginas 4314-4321, relata aquela forma biologicamente ativa dos heterotrímeros BLyS e APRIL que são expressos em pacientes com doenças reumáticas baseadas no sistema imunológico imunologia sistémica.

Mal in V Jonsson et ai., J. Clin. Immunology, Volume 25(3), 1 de maio de 2005, paginas 189-201, relata que existe uma associação entre os níveis circulantes de APRIL e BAFF e a organização linf óide no Síndrome de S jõ qre n pr imári o,

Daridon et al., Autoimmunity Reviews, Volume 7(4), 1 de fevereiro de 2008, paginas 267-271, descreve BAFF, APRIL e TWE-PRIL.

Sevier Thorsten M et al., J. Clin. Investigation, Volume 115(11), novembro 2005, paginas 3083-3092, descreve BLyS e APRIL em artrite reumatoide.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao rastreio para níveis séricos de HT e noutras amostras biológicas. Como tem sido mostrado, níveis elevados de HT são associados significativamente com doença autoimune, tal como AR, esta medição é útil como um ensaio de diagnóstico. Tais ensaios de diagnóstico são úteis a predizer uma probabilidade dum indivíduo ter uma condição associada com atividade autoimune, tal como LES. A divulgação refere-se ainda a determinar um tratamento apropriado para um indivíduo com A deteção de altos níveis séricos de HT de pacientes que exibem atividade autoimune, tal como LES, permite a seleção dum plano de tratamento que é mais provável ser eficaz em tratar a condição. Estes planos de tratamento envolvem geralmente a utilização de antagonistas BLyS e/ou APRIL, quer isoladamente ou em combinação com outro produto farmacêutico tal como um fármaco imunossupressor (como MMF ou Cellcept®) ou um antagonista CD 20 (como Rituxan©).

Assim, a divulgação refere-se ainda a tratar um indivíduo recentemente diagnosticado clinicamente com LES, que compreende geralmente a deteção de altos níveis séricos de HT, em comparação com níveis séricos vistos em controlos saudáveis. A deteção de altos níveis séricos de HT permite predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármaco específico que compreende antagonistas BLyS e/ou APRIL. Assim, a invenção proporciona métodos de predizer a probabilidade dum paciente responder a antagonistas BLyS e/ου APRIL (quer isoladamente ou em combinação cora outros fármacos) durante o tratamento para LES, como definido nas reivindicações.

Muito especificamente, a presente especificação descreve um método de deteção de níveis séricos de HT aumentados dura indivíduo que compreende a medição dum primeiro nível dos níveis da proteína HT numa amostra biológica e comparar esse nível com um segundo nível dos níveis da proteína HT presente numa amostra biológica dum indivíduo saudável e determinar se o primeiro nível aumentou em comparação com o segundo nível, em que o referido aumento dos níveis da proteína HT está associado com uma doença autoimune. A doença autoimune pode ser selecionada dum grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite lúpica (NL), Doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia autoimune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellitus, Síndrome de Raynaud, Síndrome de Sjogren e glomerulonefrite. Nos métodos da invenção a doença autoimune é LES. A presente especificação descreve um método de tratar um indivíduo diagnosticado clinícamente com uma doença autoimune, que compreende analisar uma amostra biológica dum indivíduo diagnosticado clinícamente com doença autoimune para a presença ou ausência de elevados níveis séricos de HT, em que a presença de elevados níveis de HT está associada com o diagnóstico clínico de doença autoimune e selecionar um plano de tratamento que é mais eficaz para indivíduos diagnosticados clinícamente como tendo uma condição associada com níveis de HT aumentados. 0 plano de tratamento pode envolver a administração dum antagonista BLyS. E, numa forma de realização preferida, o referido antagonista BLyS também pode ser um antagonista APRIL. Em particular, o plano de tratamento deverá envolver a administração dum antagonista HT. Para este método a doença autoimune pode ser selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite lúpica (NL), doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), troraboci topenia autoimune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellitus, sindrome de Raynaud, sindrome de Sj ogren e glomerulonefri te. Em particular, a doença autoimune é LES. A presente invenção descreve métodos in vitro (como definido nas reivindicações) para predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármaco para LES, que compreende determinar o nível sérico de HT, em que a presença de níveis de HT elevados é preditiva da probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármaco para LES. Além disso, na presente invenção o tratamento com fármaco pode envolver a administração dum antagonista HT, o qual também pode ser um antagonista BLyS e/ou APRIL. A presente invenção refere-se a um método in vitro de deteção de níveis sérícos de HT aumentados dum indivíduo, que compreende medição o nível dos níveis de HT numa amostra biológica de teste do indivíduo; comparar esse nível com o nível dos níveis de HT numa amostra biológica dum controlo saudável e determinar se o nível dos níveis de HT na amostra biológica de teste está aumentado em comparação com o nível na amostra de controlo; em que o referido aumento de níveis de HT está associado com LES. A presente especificação descreve um método in vitro de selecionar um plano de tratamento que é mais eficaz para tratar um indivíduo diagnosticado clinicamente com uma doença autoimune, que compreende analisar in vitro uma amostra biológica dum indivíduo diagnosticado clinicamente com doença autoimune para a presença ou ausência de níveis séricos de HT elevados, em que a presença de níveis de HT elevados está associada com o diagnóstico clínico de doença autoimune. Para este método o plano de tratamento pode envolver a utilização dum antagonista HT e o antagonista HT também pode ser um antagonista BLyS e/ou APRIL. A doença autoimune pode ser selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite lúpica (ML), Doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocítopénica idíopática (PTI) , púrpura trornboci topénica trombótica (PTT), trornbocitopenía autoimune, esclerose múltipla, psoriase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes rnellitus, sindrome de Raynaud, síndrome de Sjogren e glomerulonefrite. Em particular, a doença autoimune é LES.

Ainda numa forma de realização adicional, a presente invenção inclui um método in vitro (como definido nas reivindicações) para predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármaco para LES, que compreende determinar o nível dos níveis de HT numa amostra do paciente; em que a presença de níveis de HT elevados é preditiva da probabilidade do paciente responder a um tratamento com fármaco para LES. 0 tratamento com fármaco pode compreender um antagonista HT e o referido antagonista HT também pode ser um antagonista BLyS e/ou APRIL.

Finalmente, a presente especifreação descreve um antagonista BLyS para utilização no tratamento duma doença autoimune num paciente, em que o referido paciente tem níveis dos níveis séricos de HT elevados. 0 antagonista também pode ser um domínio extracelular do recetor/proteínas de fusão domínio de Fc selecionado de TACI-Ig e BCMA-Ig. Em particular, o domínio extracelular do recetor/proteínas de fusão domínio de Fc pode ser TACI-Ig, tal como atacicept.

Estes e outros aspetos da invenção tornar-se-ão evidentes para os peritos na especialidade após a leitura dos detalhes da invenção, como mais completamente descritos abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1. é um gráfico de dispersão dos níveis de heterotrímero para uma coorte de pacientes diagnosticados com LES ou AR, bem como controlos saudáveis. A FIGURA 2 expressa os dados da FIGURA 1 que mostra os níveis médios de heterotrímero.

A FIGURA 3 representa graficamente os níveis de heterotrímero duma segunda coorte de pacientes com LES. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método in vitro (como definido nas reivindicações) para rastrear níveis de HT em amostras de soro e a utilização desta informação para predizer a presença de LES e predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com antagonista HT. A invenção é baseada na descoberta de que os níveis dos níveis séricos de HT de pacientes autoimmunes são estatisticamente elevados. Os antagonistas HT (que também podem ser antagonistas BLyS e/ou APRIL) neutralizam seletivamente a produção de imunoglobulina autoimune e outros e outras citocinas destrutivas de tecido pelas células imunes, tais como as células B, dos referidos pacientes. Esta observação permite o desenvolvimento de ensaios de diagnóstico para detetar a presença de níveis de HT aumentados em que estes níveis mais altos estão associados corn doença autoimune, tal como LES e também pode predizer a probabilidade de que um indivíduo irá responder com sucesso a métodos de tratamento que neutralizam a ação de células imunológicas reativas, tal como células B, isto é, antagonistas HT (antagonistas BLyS e/ou APRIL),

Antes da presente invenção ser descrita, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às formas de realização particulares descritas, como tal podem, naturalmente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada no presente documento é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares e não pretende ser limitativa, visto que o âmbito da presente invenção apenas será limitado pelas reivindicações apensas. A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um perito na especialidade à equal esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são a g o r a de s c r itos.

Deve ser notado que como utilizado no presente documento e nas reivindicações apensas, as formas singular "um/uma", "e" e "o/a" incluem os referentes plural a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um polimorfismo inclui uma pluralidade de tais polimorfismos, a referência a "uma molécula de ácido nucleico" inclui uma pluralidade de tais moléculas de ácido nucleico e a referência a "o método" inclui a referência a um ou mais métodos, etapas do método e equivalentes do mesmo conhecidos dos peritos na especialidade, e assim por diante.

As publicações discutidas no presente documento são proporcionadas unicamente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada no presente documento é para ser interpretado como uma admissão que a presente invenção não tem o direito a antedatar tal publicação em virtude de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação proporcionadas podem ser diferentes das datas de publicação reais as quais podem necessitar de confirmação independente.

Definições 0 termo heterotrímero (HT), como utilizado no presente documento abrange multímeros de três subunidades do ligando, em que cada subunidade do ligando é ou BLyS ou APRIL e pelo menos uma subunidade é BLyS e pelo menos uma subunidade é APRIL. Assim, "HT" inclui aquelas moléculas que são 2 BLyS e um APRIL, bem como aquelas que são 2 APRIL e um BLyS. 0 termo "polimorfismo", como utilizado no presente documento, refere-se a uma diferençai no nucleótido ou sequência de aminoácidos de uma dada região em comparação com um nucleótido ou sequência de aminoácidos numa região homóloga de outro indivíduo, em particular, uma diferença no nucleótido ou sequência de aminoácidos de uma dada região que difere entre indivíduos da mesma espécie. Um polimorfismo é geralmente definido em relação a uma sequência de referência. Os polimorfismos incluem diferenças de nucleótido único, diferenças na sequência de mais de um nucleótido e inserções de nucleótido únicos ou múltiplos, inversões e deleções; bem como diferenças de um aminoácido único, diferenças na sequência de mais de um aminoácido e as inserções de aminoácido único ou múltiplo, i nver s õe s e de1e ções .

Os termos "polinucleótido" e "molécula de ácido nucleico" são utilizados de forma intersubstituível no presente documento para referir formas poliméricas de nucleótidos de qualquer comprimento. Os polinucleótidos podem conter desoxirribonucleótidos, ríbonucleótidos e/ou os seus análogos. Os nucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função conhecida ou desconhecida. 0 termo "polinucleótido" incluí moléculas de cadeia simples, de cadeia dupla e helicoidal tripla. "Oligonucleotide" refere-se geralmente a polinucleótidos de entre cerca de 5 e cerca de 100 nucleótidos de ADN de cadeia simples ou dupla. No entanto, para os propósitos desta divulgação não há limite superior para o comprimento dum olígonucleótido. Os oligonucleótidos também são conhecidos como oligómeros ou oligos e podem ser isolados de genes ou sintetizados quimicamente por métodos conhecidos na técnica.

As seguintes são formas de realização não limitativas de polinucleótidos: um gene ou fragmento de gene, exões, intrões, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmídeos, vetores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Uma molécula de ácido nucleico também pode compreender moléculas de ácido nucleico modificadas, tais como moléculas de ácido nucleico metilado e análogos de molécula de ácido nucleico. Os análogos de purinas e pirimidinas são conhecidos na técnica. Os ácidos nucleicos podem ocorrer naturalmente, por exemplo ADN ou ARN, ou podem ser análogos sintéticos, como conhecido na técnica. Tais análogos podem ser preferenciais para a utilização como sondas devido à estabilidade superior sob condições de ensaio. Modificações na estrutura nativa, incluindo alterações no esqueleto, açúcares ou bases heterocíclicas, têm mostrado aumentar a estabilidade intracelular e a afinidade de ligação. Entre as mudanças úteis na química do esqueleto são fosforotioatos, fosforoditioatos, onde ambos os oxigénios que não fazem ponte são substituídos por enxofre: fosforoamidites; fosfotriésteres alquilo e boranofosfatos. Os derivados de fosfato aquiral incluem 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3' -S-5' -O-fosforotioato, 3' -CH2-5'-0-fosfonato e 3' -NH-5' -O-fosforamidato. Os ácidos nucleicos peptídicos substituiem todo o esqueleto fosfodiéster ribose coin uma ligação peptídica.

As modificações do açúcar também são utilizadas para potenciar estabilidade e afinidade. 0 anómero α de desoxirribose pode ser utilizado onde a base é invertida com respeito ao anómero β natural. 0 2'-OH do açúcar ribose pode ser alterado para formar açúcares 2' -O-metilo ou 2' -0-alilo, os quais proporcionam resistência à degradação sem comprometer a afinidade. A modificação das bases heterocíclicas deve manter o emparelhamento de bases adequado. Algumas substituições úteis incluem desoxiuridina por desoxitimidina; 5-metil“2 ! desoxicitidina e 5-bromo-21-desoxicitidina por desoxicitidina. 5-propinil-2'-desoxiuridina e 5-propinil-2’-desoxicitidina, foram mostradas para aumentar a afinidade e a atividade biológica quando substituídas por desoxitimidina e desoxicitidina, respetívamente.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína", utilizados de forma intersubstitível no presente documento, referem-se a uma forma polimérica de arainoácidos de qualquer comprimento, que podem incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos modificados quimicamente ou bioquimicamente ou derivatizados e polipeptídeos possuindo esqueletos peptideos modificados. 0 termo inclui proteínas de fusão, que incluem, mias não limitadas a, proteínas de fusão com uma sequência de aminoácidos heteróloga, fusões com sequências líder heterólogas e homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminal; proteínas marcadas imunologicamente e semelhante.

No sentido mais amplo, como utilizado no presente documento, os termos "doença autoimune," refere-se a uma doença em que o sistema imunitário dum paciente está a produzir uma resposta imunitária indesejada a uma ou miais das suas próprias proteínas. Exemplos representativos de doenças autoimunes incluem artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite lúpica (NL), Doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) , púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia autoimune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellítus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren e glomerulonefrite.

Um polinucleótido "substancialmente isolado" ou "isolado" é um que é substancialmente livre das sequências com as quais está associado na natureza. Por substancialmente livre significa pelo menos 50%, preferentemente pelo menos 70%, ma is preferentemente pelo menos 80%, e ainda maís preferentemente pelo menos 90% livre dos materiais com os quais está associado na natureza. Como utilizado no presente documento, um polinucleótido "isolado" refere-se também a polinucleótidos recombinantes, os quais, em virtude de origem ou manipulação: (1) não estão associados com o todo ou uma porção dum polinucleótido com o qual está associado na natureza, (2) estão ligados a um polinucleótido diferente daquele a que está ligado na natureza ou (3) não ocorrem na natureza.

As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de diferente "rigor”. As condições que aumentam o rigor duma reação de hibridização são amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989). Os exemplos de condições relevantes incluem (por ordem de rigor crescente): temperaturas de incubação de 25 °C, 37 °C, 50 °C e 68 °C; concentrações de tampão de 10XSSC, 6XSSC, 1XSSC, 0,1XSSC (onde SSC é 0,15 M NaCl e 15 mM tampão citrato) e os seus equivalentes que utilizam outros sistemas tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos e soluções de lavagem de 6XSSC, 1XSSC, 0,1XSSC ou água desionizada. Exemplos de condições rigorosas são hibridização e lavagem a 50 °C ou superior e em 0,1XSSC (9 mM de NaCl/0,9 mM de citrato de sódio). "Tm" é a temperatura em graus Celsius à qual 50% dum duplex polinucleótido feito de hidrogénio de cadeias complementares ligado em direção antiparalela por emparelhamento de bases Watson-Crick se dissocia em cadeias simples sob condições da experiência. Tm pode ser previsto de acordo com uma fórmula padrão, tal como: onde é a concentração de catião (normalmente ião de sódio. Na'1') , em mol/L; (% G/C) é o número de resíduos de G e C como uma percentagem dos resíduos totais no duplex; (%F) é a percentagem de formamída na solução (p/v) e L é o número de nucleótidos em cada cadeia do duplex.

As condições rigorosas para hibridização tanto de ADN/ADN e ADN/ARN são tal como descrito por Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, incorporado no presente documento por referência. Por exemplo, ver página 7.52 de Sambrook et al. O termo "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou uma cultura celular que pode ser ou tenha sido um recetor de qualquer vetor (es) recombinante (s) ou polinucleótido isolado da invenção. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira e a descendência pode não ser necessariamente completamente idêntica à célula parental original (em morfologia ou no complemento de ADN total) devido a mutação natural, acidental ou deliberada e/ou alteração. Uma célula hospedeira inclui células transfetadas ou infetadas in vivo ou in vitro com um vetor recombinante ou um polinucleótido da invenção. Uma célula hospedeira que compreende um vetor recombinante da invenção é uma "célula hospedeira recombinante". 0 termo "liga-se especificamente," no contexto de ligação de anticorpo, refere-se a elevada avidez e/ou a elevada afinidade de ligação dum anticorpo a um polipeptídeo especifico, isto é, epítopo dum polipeptídeo APRIL ou BLyS polimórf ico. A ligação dum anticorpo a um epítopo num polipeptídeo APRIL ou BLyS específico é preferentemente mais forte que a ligação do mesmo anticorpo a qualquer outro epítopo, particularmente aqueles que podem estar presentes em moléculas em associação com, ou na mesma amostra, como o polipeptídeo específico de interesse, por exemplo, liga-se mais fortemente a um epítopo APRIL ou BLyS específico do que a um epítopo APRIL ou BLyS diferente de modo que, ajustando as condições de ligação, o anticorpo liga-se quase exclusivamente ao epítopo APRIL ou BLyS específico e não a qualquer outro epítopo APRIL ou BLyS. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de interesse podem ser capazes de se ligar a outros polipeptídeos num nível fraco, mas detetável (por exemplo, 10% ou menos da ligação mostrada para o polipeptídeo de interesse) . Tal ligação fraca, ou ligação de fundo, é prontamente discernível da ligação do anticorpo específico ao composto ou polipeptídeo de interesse, por exemplo, pela utilização de controlos apropriados. Em geral, os anticorpos da invenção que se ligam a um polipeptídeo APRIL ou BLyS específico com uma afinidade de ligação 101 mole/1 ou mais, preferentemente 108 mole/1 ou mais são referidos ligarem-se especificamente ao polipeptídeo APRIL ou BLyS específico. Em geral, um anticorpo com urna afinidade de ligação de 10° mole/litros ou menos não é útil na medida em que não irá ligar-se a um antígeno num nível detetável u t i1i z ando a me t o d o1o gi a c o nve nc i o na1 a tu a1me nte uti1i zada. O termo "anticorpo monoclonal” como utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido duma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações que ocorrera naturalmente e que poderá estar presentes em quantidades menores.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antígeno. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Adicionalmente à sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 "monoclonal” modificador indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito inicialmente por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonal no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie determinada ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N. ° 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 81: 6851-6855 (1984)). Métodos de produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab ’, F(ab’)2 ou outras subsequêncías de anticorpos de ligação ao antígeno) as quais contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana.

Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nos quais residues de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recetor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como ratinho, ratazana ou coelho que possuem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos da região estrutural (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recetor nem na CDR ou nas sequências estruturais importadas. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as loops hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. 0 número destas substituições de aminoácido na FR são tipicamente não mais do que 6 na cadeia H e na cadeia L, não ruais do que 3. 0 anticorpo humanizado otimamente compreenderá também peio menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et ai., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988) e Presta, Curr. Op, Struct, Biol., 2: 593-596 (1992). 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMATIZADO em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada dum anticorpo produzido por, por exemplo, imunização de macacos macaca com o antígeno de interesse. Os métodos para produzir anticorpos humanizados são conhecidos na técnica.

Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol.Biol., 227: 381 (1991); Marks et ai. , J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). As técnicas de Cole et ai. e Boerner et ai. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos. Cole et ai., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, págna 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). "Fragmentos funcionais" dos anticorpos de ligação da invenção são aqueles fragmentos que retêm a ligação a BLyS, TACI, BAFF-R ou BCMA com substancialmente a mesma afinidade que a molécula de cadeia completa Intacta a partir da qual são derivados e podem ser capazes de esgotar as células B conforme medido in vitro ou em ensaios in vivo tais como os descritos no presente documento. 0 anticorpo "funções efetoras" refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isotipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao recetor de Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de recetores de superfície das células (por exemplo, recetor de célula B) e ativação de células B. "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig segregada ligada a recetores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo que transporta de antígeno e subsequentemente matem a célula-alvo com citotoxinas. As células citotóxicas "arma" dos anticorpos e são absolutamente necessárias para tal matança. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida no Quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Ann. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, tal como descrito na Patente U.S. N.° 5 500 362 ou 5 821 337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como o divulgado em Clynes e t a1. PNAS (EUA) 95: 652-656 (1998).

"Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada) os quais estão ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento pode ser realizado um ensaio de CDC tal como descrito, por exemplo, em Gazzano- Santoro et ai., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado duma componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêutica para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% por peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e muito preferivelmente em mais do que 99% por peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos do N-terminal ou sequência de aminoácidos interna utilizando um sequenciador de copo rotativo ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou preferentemente, corante de prata. O Anticorpo Isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Os termos "anticorpo marcado detetavelmente" referem-se a um anticorpo (ou fragmento de anticorpo que retém especificidade de ligação para um polipeptídeo ou epítopo APRIL), tendo um marcador detetável fixado. O marcador detetável é normalmente fixado por conjugação química, mas quando o marcador é um polipeptídeo, pode ser fixado alternativamente por técnicas de engenharia genética. Os métodos para produção de proteínas marcadas detetáveis são bem conhecidos na técnica. Os marcadores detetáveis podem ser selecionados a partir de uma variedade de tais marcadores conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (por exemplo, peroxidase de raiz-forte) ou outras frações ou compostos que ou emitem um sinal detetável (por exemplo, radioatividade, fluorescência, cor) ou emitem um sinal detetável após a exposição do marcador ao seu substrato. Vários pares detetáveis marcador/substrato (por exemplo, peroxidase de raiz-forte silvestre/diaminobenzidina, a v i d i na/estreptav i d i n a, 1u c i fe r a s e/1u c i fe r ina)), os méto dos para marcação de anticorpos e métodos para utilização de anticorpos marcados são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane, edições. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque)).

Uma "amostra biológica" abrange uma variedade de tipos de amostra obtidos dum indivíduo e pode ser utilizada num ensaio de diagnóstico ou monitorização. A definição abrange sangue e outras amostras liquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido, tais como um espécime de biopsia ou culturas de tecidos ou células delas derivadas e a progénie das mesmas. A definição inclui também amostras que foram manipuladas de alguma forma após a sua colheita, tal como por tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento de certos componentes, tais como polinucleótidos. 0 termo "amostra biológica” abrange uma amostra clinica e inclui também cultura celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido.

Como utilizado no presente documento, os termos "tratamento", "tratar" e semelhantes, referem-se à obtenção dum efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. 0 efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", como utilizado no presente documento, cobre qualquer tratamento duma doença num mamífero, particularmente num ser humano e inclui: (a) prevenir a doença de ocorrer num sujeito que possa estar predisposto à doença mas ainda não foi diagnosticado como a tendo; (B) inibir a doença, isto é, parar o seu desenvolvimento e (c) aliviar a doença, isto é, provocar a regressão da doença. 0s "Fármaco s imuη o s supress ores" s ão quai squer moléculas que interferem com o sistema imunitário e limitam a sua resposta a antígenos estranhos ou próprios. A ciclofosfamida (CYC) e o micofenolato de mofetil (MMF) são dois desses tipos de moléculas. Este termo pretende abranger qualquer fárrnaco ou molécula útil como um agente terapêutico na regulação para baixo do sistema imunitário.

Uma "proteína de fusão" e um "polipeptídeo de fusão" referem-se a um polipeptídeo que tem duas porções ligadas covalentemente entre si, em que cada uma das porções é um polipeptídeo que tem uma propriedade diferente. A propriedade pode ser uma propriedade biológica, tal como atividade in vitro ou in vivo. A propriedade também pode ser uma propriedade química ou física simples, tal como a ligação a uma molécula alvo, catálise duma reação, etc. As duas porções podem estar ligadas diretamente por uma única ligação peptídica ou através de um ligante peptídico que contém um ou mais resíduos de amínoácido. Geralmente, as duas porções e o ligante estarão em quadro de leitura umas com as outras.

Um "conjugado" refere-se a qualquer molécula híbrida, incluindo proteínas de fusão e bem como moléculas que contêm ambos amínoácido ou porções de proteínas e porções não proteicas. Os conjugados podem ser sintetizados por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, síntese em fase sólida, síntese em fase de solução, técnicas sintéticas de química orgânica ou uma combinação destas técnicas. A escolha da síntese dependerá da molécula particular a ser gerada. Por exemplo, uma molécula híbrida não inteiramente "proteína" na natureza, pode ser sintetizada por uma combinação de técnicas recombinantes e técnicas de fase de solução.

Como utilizado no presente documento, o termo "Proteína de fusão Fc" designa moléculas do tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação duma proteína heteróloga cora as funções efetoras dos domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as proteínas de fusão de Fc compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outra que não o reconhecimento do antígeno e o local de ligação dum anticorpo (isto é, é "heterólogo") e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A molécula de Proteína de fusão Fc inclui tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o locai de ligação dum recetor ou um ligando. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na Proteína de fusão Fc pode ser obtida de qualquer imunoglobulina, tal como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. Por exemplo, proteínas de fusão de Fc úteis de acordo com esta invenção são polipeptídeos que compreendem as porções de ligação dum recetor BLyS, sem as sequências transmembranar ou citoplasmátícas do recetor BLyS. Numa forma de realização, o domínio extracelular de BAFF-R, TACI ou BCMA é fundido com um domínio constante de uma sequência de imunoglobulina.

Os termos "indivíduo," "sujeito," e "paciente," utilizados de forma intersubstituível no presente documento, referem-se a um mamífero incluindo, mas não limitado a, murinos, símios, seres humanos, animais de quinta mamíferos, animais de desporto mamífero e animais de estimação mamíferos. 0 termo "mamífero" refere-se a qualquer animal classificado como uru mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de quinta e animais do zoológico, de desportos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, o mamífero no presente documento é um ser humano. A Deteção de HT (Polipeptideos APRIL e BLyS) A presente invenção proporciona a deteção de polipeptideos HT através da medição separada de polipeptideos APRIL e BLyS. 0 termo "polipeptídeo APRIL" abrange uma sequência de aminoácidos codificada por um quadro de leitura aberta (ORF) dum polinucleótido de APRIL conhecido (tal como os disponíveis publicamente, Número de Acesso GenBank: AFQ46888), incluindo o polipeptideo nativo de comprimento completo e fragmentos do mesmo, particularmente os fragmentos biologicamente ativos e/ou fragmentos correspondentes a domínios funcionais, por exemplo, uma região ou domínio que tem atividade biológica, etc., fragmentos antígenos dos mesmos e que incluem fusões de polipeptideos do sujeito a outras proteínas ou partes das mesmas. As sequências de aminoácidos dos polipeptideos APRIL foram divulgadas. (Ver, por exemplo, Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185-90, 1998). Os polipeptideos _APR.IL podem ser isolados duma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido de ser humano ou doutra fonte ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. Um polimorfismo num polipeptideo APRIL é geralmente definido relativamente a uma s e qu ê n c i a de r e f e r ê n ci a. O termo "polipeptideo BLyS" abrange uma sequência de aminoácidos codificada por um quadro de leitura aberta (ORF) dum polinucleótido BLyS conhecido (tal como os disponíveis publicamente através do GenBank ou os seus complementos: N. ° de Acesso NM 052 945 (ARNrn BLyS humano) ou as suas variantes humanas N.°s de Acesso 003808, 172087, 172088 ou N.° de Acesso 033622 (mARN BLyS de ratinho)), que inclui polipeptideo nativo de comprimento completo e fragmentos do mesmo, particularmente os fragmentos biologicamente ativos e/ou fragmentos correspondentes a domínios funcionais, por exemplo, uma região ou domínio que tem atividade biológica, etc., fragmentos antígenos dos mesmos e que incluem fusões de polipeptídeos do sujeito a outras proteínas ou partes das mesmas. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos BLyS foram divulgadas. (Ver, por exemplo, Moore et al. Science 285: 260-3, 1999) . Os polipeptídeos BLyS podem ser isolados duma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido de ser humano ou doutra fonte ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. Um polimorfismo num polipeptídeo BLyS é geralmente definido relativamente a uma sequência de referência.

Como utilizado no presente documento, "polipeptídeo APRIL polimórfico" refere-se a uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo recombinante ou não recombinante que tem uma sequência de aminoácidos de i) um polipeptídeo APRIL polimórfico nativo, ii) ura fragmento dum polipeptídeo APRIL polimórfico, iii) análogos de polipeptídeos dum polipeptídeo APRIL polimórfico, iv) variantes dum polipeptídeo APRIL polimórfico; v) um fragmento imunologicamente ativo dum polipeptídeo APRIL polimórfico e vi) proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo APRIL polimórfíco. Os polipeptídeos APRIL polimórficos da invenção podem ser obtidos a partir duma amostra biológica ou a partir de qualquer fonte quer seja natural, sintética, semissintética ou recombinante.

Como utilizado no presente documento, "polipeptídeo BLyS polimórfico" refere-se a uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo recombinante ou não recombinante que tem uma sequência de aminoácidos de i) um polipeptídeo BLyS polimórfico nativo, ii) um fragmento dum polipeptídeo BLyS polimórfico, iii) análogos de polipeptídeos dum polipeptídeo BLyS polimórfico, iv) variantes dum polipeptídeo BLyS polirnórf ico; v) um fragmento imunologicamente ativo dum polipeptídeo BLyS polirnórfico e vi) proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo BLyS polirnórfico. Os polipeptídeos BLyS polirnórficos da invenção podem ser obtidos a partir duma amostra biológica ou a partir de qualquer fonte quer seja natural,, sintética, semissintética ou recombinante. 0 termo "polipeptídeo BLyS” ou "polipeptídeo APRIL" abrange uru polipeptídeo que compreende pelo menos cerca de 5 aminoácidos, pelo menos cerca de 10 amínoácidos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos, pelo menos cerca de 50 aminoácidos, pelo menos cerca de 75 aminoácidos, pelo menos cerca de 100 aminoácidos, pelo menos cerca de 200 aminoácidos, pelo menos cerca de 300 aminoácidos, pelo menos cerca de 400 aminoácidos ou até todo o polipeptídeo dum polipeptídeo APRIL ou BLyS polirnórfico. Em certas formas de realização, um polipeptídeo APRIL ou BLyS polimórfico exibe atividade biológica, por exemplo, o polipeptídeo causa proliferação de células B e produção de imunoglobulina num ensaio in vitro. Outros ensaios para a atividade biológica de APRIL ou BLyS são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para determinar se um polipeptídeo APRIL ou BLyS polimórfico exibe atividade biológica e, se desejado, a quantidade de atividade biológica de APRIL ou BLyS. Os ensaios biológicos de APRIL ou BLyS são descritos em várias publicações, por exemplo, Moore et al., supra.

Os polipeptídeos APRIL podem ser obtidos por qualquer método conhecido ou por uma combinação de tais métodos, que incluem o isolamento a partir de fontes naturais, produção por síntese química e produção por técnicas recombinantes padrão. Os polipeptídeos APRIL podem ser isolados a partir de uma "fonte biológica, utilizando cromatografia de afinidade, por exemplo, utilizando anticorpos específicos para um polipeptídeo .APRIL imobilizados num suporte sólido.

Os polipeptídeos podem ser expressos em procariotas ou eucariotas de acordo com maneiras convencionais, dependendo do propósito para a expressão. Para uma produção em larga escala da proteína, um organismo unicelular, tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de inseto em combinação com vetores de baculovirus ou células dum organismo superior tal como vertebrados, particularmente mamíferos, por exemplo, células COS 7, células CHO, células HEK293 e afins, podem ser utilizadas como células hospedeiras de expressão. Nalgumas situações, é desejável expressar o gene em células eucariotas onde a proteína irá beneficiar de dobraqem nativa e modificações pós~ transiacionais. 0 polipeptídeo pode então ser isolado a partir do sobrenadante de cultura celular ou de lisados celulares utilizando métodos de cromatografia de afinidade a partir de métodos de cromatografia de exclusão de permuta aniónica/tamanho, tal como acima descrito.

Com a disponibilidade da proteína ou dos fragmentos da mesma em grandes quantidades, empregando um hospedeiro de expressão, a proteína pode ser isolada e purificada de acordo com maneiras convencionais. Pode ser preparado um lisado do hospedeiro de expressão e o lisado purificado utilizando HPLC, cromatografia de exclusão, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade ou outra técnica de purificação. As proteínas isoladas podem ser utilizadas para produzir anticorpos, que são, por sua vez, utilizados para detetar a presença da referida proteína utilizando sistemas de ensaio padrão, por exemplo, ELISA ou análise de 1 1\ C D ,

Preparação de Polipeptídeos APRIL e BLyS

Adicionalmente à pluralidade de utilizações descritas com grande detalhe nas secções seguintes, as composições de ácido nucleico APRIL são utilizadas na preparação da totalidade du duma porção de polipeptídeos APRIL, como descrito acima. Os polinucleótidos (incluindo ADNc ou o gene de comprimento completo) são utilizados para expressar um produto de gene parcial ou completo. As construções que compreendem os polinucleótidos sujeitos podem ser geradas sinteticamente. Alternativamente, a montagem duma etapa única dum gene e de todo o plasmideo a partir de grandes números de oligodesoxirribonucleótídos é descrita por, por exemplo, Stemmer et al,, Gene (Amsterdão) (1995) 164(1):49-53. Neste método é descrita a montagem PCR (a síntese de sequências de ADN longas a partir de um grande número de oligodesoxirribonucleótídos (oligos)). 0 método deriva de misturar ADN (Stemmer, Nature (1994) 370:389-391), e não depende de ligase de ADN, mas em vez disso depende de polimerase de ADN para construir fragmentos de ADN cada vez mais longos durante o processo de montagem. Construções polinucleótidas apropriadas são purificadas utilizando técnicas de ADN recombinante padrão como descrito em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque e sob os regulamentos atuais descritos no Departamento de HHS dos Estados Unidos, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DMA Research.

Em particular pode ser necessário proporcionar meios de engenharia de trimeri zação da proteína APRIL ou da proteína BLyS a fim de ser capaz de produzir quantidades suficientes de proteína ativa para produzir anticorpos eficazes. Exemplos de trimerização de polipeptídeos tal como a sequência ZymoZipper são divulgados no Pedido de Patente U.S. Série N.° 11/530 672 e as referências nele discutidas. Este tipo de polipeptídeos de trimerização também são úteis para a produção de proteína padrão HT APRIL/BLyS para utilização no ensaio (ver Exemplo 1).

As moléculas polinucleótido que compreendem uma sequência polinucleótida proporcionada no presente documento são propagadas colocando a molécula num vetor. São utilizados vetores virais e não virais, incluindo plasmídeos. A escolha do plasmídeo dependerá do tipo de célula na qual se deseja a propagação e o propósito da propagação. Certos vetores são úteis para amplificar e produzir grandes quantidades da sequência de ADN desejada. Outros vetores são adequados para a expressão em cultura celular. Ainda outros vetores são adequados para a transferência e expressão em células num animal ou pessoa inteiros. A escolha do vetor apropriado está bem dentro da pericia da especialidade. Muitos desses vetores estão disponíveis comercialmente. 0 polinucleótido de comprimento parcial ou completo é inserido num vetor tipicamente por meio de fixação de ligase de ADN a um local de enzima de restrição clivado no vetor. Alternativamente, a sequência de nucleótido desejada pode ser inserida por recombinação homóloga in vivo. Tipicamente, isto é conseguido pela fixação de regiões de homologia com o vetor nos flancos da sequência de nucleótido desejada. As regiões de homologia são adicionadas por ligação de oligonucleotides ou por reação em cadeia de polimerase utilizando iniciadores que compreendem tanto a região de homologia como uma porção da sequência de nucleótido desejada, por exemplo.

Para a expressão, pode ser empregue uma cassete ou sistema de expressão, 0 produto do gene codificado por um polinucleótido da invenção é expresso em qualquer sistema de expressão conveniente, incluindo, por exemplo, bacteriano, levedura, inseto, sistemas de anfíbios e de mamíferos. Os vetores e as células hospedeiras adequados são descritos na Patente U.S. N.° 5 654 173. No vetor de expressão, um polinucleótido que codifica um polipeptídeo APRIL está ligado a uma sequência reguladora apropriada para se obter as propriedades de expressão desejadas. Estes podem incluir promotores (fixados quer à extremidade 5' da cadeia de sentido ou à extremidade 3' da cadeia de anti-sentido), potenciadores, terminadores, operadores, repressores e indutores. Os promotores podem ser regulados ou constitutivos. Em algumas situações pode ser desejável utilizar condicionalmente promotores ativos, tais como promotores específicos de tecido ou específico de etapa de desenvolvimento. Estes estão ligados à sequência nucleótida desejada utilizando as técnicas descritas acima para ligação a vetores. Quaisquer técnicas conhecidas na especialidade podem ser utilizado. Por outras palavras, o vetor de expressão irá proporcionar uma região de iniciação dai transcricional e transi acionai, que pode ser indutível ou constitutiva, em que a região de codificação está ligada operacionalmente sob o controlo transcricional da região de iniciação transcricional e uma região de terminação transcricional e translacional. Estas regiões de controlo podem ser nativas para o gene de APRil ou podem ser derivadas a partir de fontes exógenas.

Os vetores de expressão têm geralmente locais de restrição convenientes localizados perto da sequência do promotor para proporcionar a inserção de sequências de ácido rmcleico que codificam proteínas heterólogas. Pode estar presente um operativo marcador selecionável no hospedeiro de expressão. Os vetores de expressão podem ser utilizados para a produção de proteínas de fusão em que o péptido de fusão exógeno proporciona funcionalidade adicional, isto é, aumento da síntese de proteínas, de estabilidade, de reatividade com antissoros definidos, um marcador de enzima, por exemplo, β-galactosidase, etc.

As cassetes de expressão podem ser preparadas compreendendo uma região de iniciação de transcrição, o gene ou o fragmento do mesmo e uma região de terminação transcricional. De particular interesse é a utilização de sequências que permitem a expressão de epítopos ou domínios funcionais, normalmente pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento, mais normalmente pelo menos cerca de 15 aminoácidos de comprimento a cerca de 25 aminoácidos e até ao completo quadro de leitura aberta do gene. Após a introdução do ADN, as células que contêm a construção podem ser selecionadas por meio dum marcador de seleção, as células expandidas e, em seguida, utilizadas para a Θ Xp 1C Θ S S cL O ·

Os polipeptídeos APRIL podem ser expressos em procariotas ou eucariotas de acordo com maneiras convencionais, dependendo cio propósito para a expressão. Para uma produção era larga escala da proteína, um organismo unicelular, tal como E. coli, B. subtílis, S, cerevisiae, células de inseto em combinação com vetores de baculovirus ou células dum organismo superior tal como vertebrados, particularmente mamíferos, por exemplo, células COS 7, HEK293, CHO, Xenopus Oocytes, etc., podem ser utilizadas como células hospedeiras de expressão. Nalgumas situações, é desejável expressar uma molécula de ácido nucleico APRIL polimórfica em células eucariotas onde a proteína APRIL polimórfica irá beneficiar de dobragem nativa e modificações pós-translacionais. Pequenos péptidos também podem ser sintetizados no laboratório. Os polipeptídeos que são subconjuntos da sequência APRIL completa podem ser utilizados para identificar e investigar partes da proteína importante para a função.

Os sistemas de expressão específicos de interesse incluem bacteriano, levedura, células de inseto e sistemas de expressão derivados de células de mamíferos. Os sistemas representativos de cada uma destas categorias são proporcionados abaixo:

Bactérias. Os sistemas de expressão em bactérias incluem os descritos em Chang et al. , Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281:544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; documento EP 0 036 776; Patente U.S. N.° 4 551 433; DeBoer et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) (1983) 80:21-25 e Siebenlist et al. , Cell (1980) 20:269.

Levedura, Os sistemas de expressão em leveduras incluem os descritos em Hinnen et al., Proc. Natl. Acad, Sei. (EUA) (1978) 75:1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg et al.,

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Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129; Smith et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) (1985) 82:8844; Miyaj ima et al., Gene (1987) 58:273 e Martin et al., DNA (1988) 7:99. Numerosas estirpes e variantes de baculovirus e correspondentes células hospedeiras de inseto permissivas de hospedeiros são descritas em Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6:47-55, Miller et al.,

Generic Engineering (1986) 8:277-279 e Maeda et al.,

Nature (1985) 315:592-594, Células de Mamífero. A expressão de mamífero é realizada como descrito em Dijkema et al., EMBO J, (1985) 4:761, Gorman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) (1982) 79:6777, Boshart et ai., Cell (1985) 41:521 e Patente U.S. N.° 4 399 216. Outras caraterísticas de expressão de mamífero são facilitadas como descrito em Ham e Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes e Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255, Patentes U.S. N. °s 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655, documento WO 90/103430, documento WO 87/00195 e Patente U.S. N.° RE 30 985.

Quando qualquer uma das células hospedeiras acima ou outras células hospedeiras ou organismos apropriados são utilizados para replicar e/ou expressar polinucleótidos ou ácidos nucleicos descritos no presente documento, o ácido nucleico replicado resultante, ARN, proteína ou polipeptídeo expresso, é descrito no presente documento como um produto da célula hospedeira ou do organismo, O produto é recuperado por quaisquer meios apropriados conhecidos na técnica.

Uma vez que o gene correspondente a um polinucleótido selecionado é identificado, a sua expressão pode ser regulada na célula da qual o gene é nativo. Por exemplo, um gene endógeno de uma célula pode ser regulado por uma sequência reguladora exógena inserida no genoma da célula na posição suficiente para, pelo menos, melhorar a expressão do gene na célula. A sequência reguladora pode ser concebida para se integrar no genoma através da recombinação homóloga, como divulgado na Patentes U.S. N.°s. 5 641 670 e 5 733 761, ou pode ser concebida para se integrar no genoma por recombinação não homóloga, como descrito no documento WO 99/15650. Como tal, também é descrito no presente documento a produção de proteínas APRIL, sem manipulação do próprio ácido nucleico codificado, mas em vez disso, através da integração de uma sequência reguladora no genoma de célula que já inclui um gene que codifica a proteína desejada, como descrito nos documentos de patentes acima incorporados.

Preparação de Anticorpos Específicos para Polipeptídeos APRIL e BLyS

Os métodos in vitro da invenção utilizam anticorpos, particularmente anticorpos isolados, que são específicos para polipeptídeos APRIL e BLyS. Os anticorpos são úteis numa variedade de ensaios de diagnóstico, como descrito abaixo com raais detalhes. Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para detetar e/ou medir os níveis de HT numa amostra biológica.

Os polipeptídeos APRIL e BLyS isolados são úteis para a produção de anticorpos, onde fragmentos curtos proporcionam anticorpos específicos para o polipeptídeo particular e fragmentos maiores ou a proteína inteira permitem a produção de anticorpos sobre a superfície do polipeptídeo. Em conformidade, os métodos da presente invenção utilizam anticorpos isolados que se ligam especificamente a um polipeptídeo APRIL, ou um fragmento antigénico do mesmo. Os anticorpos podem ser criados para o tipo selvagem ou formas variantes. Os anticorpos podem ser criados para péptidos isolados correspondentes a estes domínios ou para a proteína nativa. Os anticorpos podem ser criados para polipeptídeos e/ou fragmentos peptídicos de APRIL de qualquer espécie de mamífero. Como um exemplo não limitativo, um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) pode ser utilizado para determinar a especificidade de um dado anticorpo monoclonal para um polipeptídeo APRIL ou B L y S .

Os polipeptídeos APRIL e BLyS são úteis para a produção de anticorpos, onde fragmentos curtos proporcionam anticorpos específicos para o polipeptídeo particular e fragmentos maiores ou a proteína inteira permitem a produção de anticorpos sobre a superfície do polipeptídeo. Como utilizado no presente documento, o termo "anticorpos" inclui anticorpos de qualquer isotipo, fragmentos de anticorpos que retêm a ligação específica ao antígeno, incluindo, mas não limitado a, fragmentos Fab, Fv, scFv e Fd, proteínas de fusão que compreendem tais fragmentos de anticorpo, anticorpos marcados de forma detetável e anticorpos quiméricos, "Especificidade de anticorpo", no contexto das interações anticorpo-antígeno, é um termo bem compreendido na especialidade, e indica que um dado anticorpo se liga a um dado antígeno, em que a ligação pode ser inibida por esse antígeno ou um epítopo do mesmo que é reconhecido pelo anticorpo e não se liga substancialmente a antígenos não relacionados. Os métodos de determinação da ligação a anticorpo específico são bem conhecidos dos peritos na especialidade e podem ser utilizados para determinar a especificidade dos anticorpos para um polipeptídeo APRIL ou BLyS.

Os anticorpos são preparados de acordo com maneiras convencionais, em que a expresso é polipeptídeo ou proteína é utilizado como um imunogénio, sozinho ou conjugado com veículos imunogénicos conhecidos, por exemplo KLH, pre-S HBsAg, outras proteínas virais ou eucarióticas ou semelhantes. Podem ser empregues vários adjuvantes, com uma série de injeções, conforme for apropriado. Para os anticorpos monoclonais, depois de uma ou mais injeções de reforço, o baço é isolado, os linfócitos imortalizados por fusão celular e depois rastreados para ligação de anticorpo de elevada afinidade. As células imortalizadas, isto é, hibridomas que produzem os anticorpos desej ados, podem então ser expandidas. Para uma descrição adicional ver Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane eds. , Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nova Torque, 1988. Se desej ado, o mARN que codifica as cadeias pesada e leve pode ser isolado e rnutagenizados por clonagem em E. coli e as cadeias pesada e leve misturadas para melhorar ainda mais a afinidade do anticorpo. Alternativas a imunização in vivo como um método de criação de anticorpos incluem ligação a bibliotecas de apresentação de fagos, normalmente em conjunto com a maturação de afinidade in vitro.

Os anticorpos podem ser fixados, diretamente ou indiretamente (por exemplo, através duma molécula de ligação) a um suporte sólido para utilização num ensaio de diagnóstico para determinar e/ou medir a presença de HT numa amostra biológica. A fixação é geralmente covalente, embora não necessite de ser. Os suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, contas (por exemplo, esferas de poliestireno, esferas magnéticas e outras semelhantes); superficies plásticas (por exemplo, placas multi-poços de poliestireno ou policarbonato tipicamente utilizadas num ELISA ou radioimunoensaio (RIA) e semelhantes); folhas, por exemplo, nylon, nitrocelulose e semelhantes; e lascas, por exemplo, lascas de Si02, tais como as utilizadas em micro arranjos. Em conformidade, a invenção proporciona ainda dispositivos de ensaio que compreendem anticorpos ligados a u m s u porte s ó1i do.

Um único anticorpo ou uma bateria de anticorpos diferentes pode então ser utilizado para criar um dispositivo de ensaio. Um tal dispositivo de ensaio pode ser preparado utilizando tecnologia convencional conhecida dos peritos na especialidade. 0 anticorpo pode ser purificado e isolado utilizando técnicas conhecidas e ligado a uma superfície de suporte que utiliza procedimentos conhecidos. A superfície resultante que tem anticorpo ligado nela pode ser utilizada para ensaiar uma amostra de teste, por exemplo, uma amostra biológica, in vitro, para determinar se a amostra contém um ou mais tipos de moléculas HT. Por exemplo, anticorpos que se ligam apenas a um epítopo HT específico que pode ser fixado à superfície de um material. Alternativamente, podem ser utilizados uma pluralidade de anticorpos específicos, que podem ser arranj ados numa matriz, em que anticorpos específicos para dois ou mais epítopos diferentes HT são fixados ao suporte sólido. Uma amostra de teste é posta em contacto com os anticorpos ligados à superfície do material. A ligação específica pode ser detetada utilizando qualquer método conhecido. Se a ligação específica não é detetada, pode-se deduzir que a amostra não contém o epítopo HT específico. Como um exemplo não limitativo de como a ligação específica pode ser detetada, uma vez a amostra de ensaio tenha sido posta em contacto com os anticorpos ligados ao suporte sólido, um segundo anticorpo marcado detetável pode ser adicionado, o qual reconhece um epítopo HT distinto do epítopo reconhecido pelo anticorpo ligado ao suporte sólido.

Uma variedade de outros reagentes pode ser incluída nos ensaios para detetar olipeptídeos HT descritos no presente documento. Estes incluem reagentes tais como sais, proteínas neutras, por exemplo albumina, detergentes, etc. que são utilizados para facilitar a ligação proteína-proteína ótima e/ou reduzir as interações não específicas ou de fundo. Podem ser utilizados reagentes que melhorem a eficiência do ensaio, tais como ínibídores de protease, agentes anti-microbianos, etc. Os componentes são adicionados em qualquer ordem que proporcione a ligação requerida. As incubações sã o re a1iz adas a qua1quer temperatura adequada, tipicamente entre 4 °C e 40 °C. Os períodos de incubação são selecionados para atividade ótima, mas também podem ser otimizados para facilitar um rastreio de alto rendimento rápido. Tipicamente será suficiente entre 0,1 e 1 hora.

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes do marcador de superfície da célula B. Outros desses anticorpos podem ligar-se a um primeiro marcador de célula B e ligar-se ainda a um segundo marcador de superfície de célula B, Em alternativa, um braço de ligação de marcador anti-células B pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula recetora de células T (por exemplo CD2 ou CD3) ou recetores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (GDI6) de modo a focar os mecanismos de defesa celular para a célula B. Os anticorpos biespecíticos podem também ser utilizados para localizar agentes cítotóxicos para a célula B. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a marcador de célula B e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferão, alcaloides da vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo).

Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Os métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo baseia-se na co-expressáo de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et aí., Nature, 305: 537-539 (1983)).

Por causa do sortido aleatório de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados no documento WO93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10: 36b5-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de antígeno-anticorpo) são fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. Preferivelmente a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2 e CH3. É preferível que tenha a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. As fusões de cadeia pesada de imunoglobulina que codificam ADNs e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co~ transfetados para um organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em formas de realização quando razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos excelentes. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou para as três cadeias polipeptídicas num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm significado particular.

Numa forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos bíespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida no outro braço (proporcionando uma segunda especificidade de ligação). Verifícou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto bíespecífico desejado das combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecifica proporciona uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecificos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N.° 5 731 168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 dum domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de arninoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais grandes de aminoácido por outras mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina) . Isto proporciona um mecanismo parai aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecificos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugado". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para dirigir células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. N.° 4 676 980) e para tratamento de infeção por HIV (o documento WO 91/00360, o documento WO 92/200373 e documento EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação são bem conhecidos na técnica, e são divulgados na Patente U.S. N.° 4 676 980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2 . Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol de arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab’-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. 0 progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíf icos. Shalaby et ai., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) descrevem a produção duma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico direto in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o recetor ErbB2 e células T humanas normais, bem como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama em humanos.

Também foram descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente a partir de cultura celular recombinantes. Por exemplo, os a ntic o rp o s b i espec í f i c o s fo r am pr o du z i do s uti1iza n d o ziperes de leucina. Kostelny et al, J. Immunol, 148 (5) : 1547-1553 (1992). Os peptideos de ziper de leucina das proteínas Fos e Jim foram ligados as porções Fab de dois anticorpos diferentes por fusão de genes.

Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diabody" descrita por Hollinger et al, Proc. Nat1. Acad. Sei. EUA, 90: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Em conformidade, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Também foi relatada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos pela utilização de dímeros Fv (sFv) de cadeia única. Ver Gruber et ai, J. Immunology., 152: 5368 (1994).

Os anticorpos com mais de duas valências estão também contemplados. Por exemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tuttet et al., J, Immunol, 147: 60(1991).

Ensaios de Diagnóstico A especificação descreve métodos para deteção da presença e/ou um nível de mARN HT numa amostra biológica e métodos para deteção da presença e/ou um nível de polipeptídeo de HT numa amostra biológica. A invenção envolve a deteção em série de cada subunídacie individual na amostra, de tal maneira que apenas as moléculas HT irão ser detetadas. Isto é feito utilizando um processo que é uma adaptação de como um ELISA padrão funciona. Em particular, um anticorpo quer para APRIL ou BLyS é imobilizado {por exemplo, fixado a uma conta) e a amostra é posta em contacto com este anticorpo. Essas moléculas que compreendem a subunidade para a qual o anticorpo é específico ligar-se-ão, enquanto que aqueles homotrímeros que não incluem essa subunidade serão lavados. As moléculas ligadas, serão então postas em contacto com um anticorpo (marcado) detetável para a segunda subunidade (por exemplo, biotinilado) e aquelas moléculas que primeiro foram capturadas que também incluem a segunda subunidade (isto é, aquelas moléculas que são HT) irão ser detetadas. Ma is especificamente, se o primeiro anticorpo é contra APRIL, todas as moléculas BLyS homotrírnericas serão lavadas na primeira etapa. Quando estas moléculas são contactadas com o segundo anticorpo que é específico para BLyS, todas as moléculas APRIL homotrimericas não se irão ligar e serão lavadas. Assim, o smal remanescente será representativo das moléculas HT (aquelas que compreendem ambas BLyS e APRIL) na amostra. 0 padrão conhecido de molécula de HT 2 APRIL/um BLyS é utilizado para construir uma curva de concentração padrão e o sinal experimental obtido é comparado com esta curva padrão para produzir uma estimativa da concentração de HT na amostra biológica.

Também é descrito no presente documento um método para deteção dum nível de mÃRN HT numa amostra biológica derivada dum indivíduo, que compreende analisar uma amostra de polinucleótido dum indivíduo para o nível de mARN que codifica polipeptídeo de HT. 0 nivel de mARN HT pode ser associado com doença autoimune.

Ainda noutras formas de realização, um método é proporcionada para detetar a presença e/ou um nível dum polipeptídeo de HT numa amostra biológica.

Estão disponíveis vários métodos para determinar o nível de expressão duma molécula de ácido nucleico HT, por exemplo, um mARN HT ou polipeptídeo de HT numa amostra particular. 0 diagnóstico pode ser realizado por vários métodos para determinar a ausência ou a presença ou quantidades alteradas de ARNm HT normal ou anormal numa amostra do paciente. Por exemplo, a deteção pode utilizar a coloração de células ou secções histológicas com anticorpos marcados, realizada em conformidade com métodos convencionais. As células são permeabilízadas para corar as moléculas citoplasmáticas. Os anticorpos de interesse são adicionados à amostra de células e incubados por um período de tempo suficiente para permitir a ligação ao epítopo, normalmente pelo menos cerca de 10 minutos. O anticorpo pode ser marcado com radioisótopos, enzimas, fluorescência, quimioluminescência ou outros marcadores para deteção direta. Em alternativa, um anticorpo ou reagente de segunda etapa é utilizado para amplificar o sinal. Tais reagentes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o anticorpo primário pode ser conjugado com biotina, com avidina conjugada comi peroxidase de raiz-forte adicionada como um reagente de segunda etapa. Em alternativa, o anticorpo secundário conjugado com um composto fluorescente, por exemplo, fluoresceína, rodamina, Texas red, etc. A deteção final utiliza um substrato que sofre uma alteração de cor na presença da peroxidase. A ausência ou presença de ligação do anticorpo pode ser determinada por vários métodos, incluindo citometria de fluxo de células dissociadas, microscopia, radiografia, contagem de cintilação, etc. A presença e/ou o nível dum polipeptídeo de HT também pode ser detetado e/ou quantificado de qualquer maneira conhecida por um perito comum.

Adicionalmente, um teste pode incluir medições da expressão de ARNm HT. Estudos bioquímicos podem ser realizados para determinar se um polimorfismo na sequência duma região que codifica ou região de controlo de HT está associado cora a doença. A doença associada a polimorfismos pode incluir deleção ou truncagem do gene, mutações que alteram o nível de expressão, que afetam a atividade da p r o t e 1 na, e t c .

As alterações na sequência promotora ou potenciadora que podem afetar níveis de expressão de HT podem ser comparadas com os níveis de expressão do alelo normal por mé t o d o s v á r 1 o s c o n h e c i d o s n a t é c n í c a. 0 s rné t o d o s p a r a determinar a força promotora ou potenciadora incluem quantificação da proteína natural expressa; inserção do elemento de controlo variante num vetor com um gene repórter tal como β-galactosidase, luciferase, cloranfenícol-acetiltransferase, etc. que proporciona por quantificação conveniente e semelhante.

Os métodos de diagnóstico do tema da invenção {como definido nas reivindicações) , em que o nível de HT é de interesse, envolvem a comparação da abundância de ácido nucleico ou proteína de HT duma amostra de interesse com a dum valor de controlo para determinar quaisquer diferenças relativas, onde a diferença pode ser medida qualitativamente e/ou quantitativamente, cuias diferenças são, então, relacionadas com a presença ou ausência de uns níveis de HT anormais. Uma variedade de diferentes métodos parai determinar a abundância de ácido nucleico numa amostra são conhecidos dos peritos na especialidade, em que es métodos específicos de interesse incluem aqueles descritos em: Pietu et al., Genome Res. (junho 1996) 6: 492-503; Zhao et ai., Gene (Apr. 24, 1995) 156: 207-213; Soares, Carr,

Opin. Biotechnol. (outubro 1997) 8: 542-546; Raval, J.

Pharmacol Toxicol Methods (novembro 1994) 32: 125-127;

Cnalifour et ai., Anal. Biochem (1 de fevereiro de 1994) 216: 299-304; Stolz e Tuan, Mol. Biotechnol. (dezembro 19960 6: 225-230; Hong et ai., Bioscience Reports (1982) 2: 907 e McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143:298. Também de interesse são os métodos divulgados no documento WO 97/27317.

Por um gene cujo nível de expressão é "correlacionada com” ou "associada com” um estado fisiológico específico, pretende-se um gene cuja expressão mostra uma correlação estatisticamente significativa com o estado fisiológico. A força da correlação entre o nível de expressão de um gene expresso diferencialmente e a presença ou ausência de um estado fisiológico particular pode ser determinada por um teste de significância estatística. Os métodos para determinar a força de uma correlação entre o nível de expressão de um gene expresso diferencialmente e um estado fisiológico particular pela atribuição de uma pontuação estatística para a correlação são revistos em Holloway et ai. (2002) Nature Genetics Suppl. 32:481-89, Churchill (2002) Nature Genetics Suppl. 32:490-95, Quackenbush (2002) Nature Genetics Suppl. 32:496-501; Slonim (2002) Nature Genetics Suppl. 32:502-08 e Chuaqui et al. (2002) Nature Genetics Suppl. 32:509-514. As pontuações estatísticas podem ser utilizadas para selecionar os genes cujos níveis de expressão têm a maior correlação com um estado fisiológico específico, a fim de aumentar a precisão do diagnóstico ou prognóstico dos métodos da invenção.

Testes adicionais que têm sido associados com a gravidade ou progressão da doença autoimune podem ser combinados com o teste de ITT descrito acima para prestar um diagnóstico completo ou um resultado prospetivo.

Por exemplo, o American College of Rheumatology desenvolveu 11 critérios para diagnosticar LES, que abrangem o espetro clínico de LES em aspetos de testes de pele, sistémico e laboratorial. Estes critérios incluem eritema malar, erupção cutânea discóide, sensibilidade à luz solar, úlceras orais, artrite, serosite, inflamação do sistema nervoso central e renal, alterações sanguíneas e a presença de anticorpos antinucleares. Um paciente deve cumprir quatro destes critérios a fim de ser classificado como um paciente com LES. (Tan et al. (1982) Arthritis Rheumatol. 25:1271-1277). 0 LES é normalmente confirmado por testes que incluem, mas não estão limitados a, testes sanguíneos para detetar anticorpos anti-nucleares; testes de sangue e urina para avaliar a função renal; testes complementares para detetar a presença de níveis baixos de complemento que são frequentemente associados com LES; uma taxa de sedimentação (ESR) ou proteína C-reativa (PCR) para medir os níveis de inflamação; raios-X para avaliar danos nos pulmões e ECGs para avaliar os danos do coração. Monitorização dos Efeitos do Tratamento com Fármaco A monitorização da influência de agentes (por exemplo, fármacos, compostos) nos níveis de proteína HT (por exemplo, a modulação da ativação transcricional) pode ser aplicada não apenas no rastreio básico de fármaco, mas também em ensaios clínicos. Por exemplo, a eficácia dum determinado agente por um ensaio de rastreio para diminuir os níveis de proteína HT, como descrito no presente documento, pode ser monitorizada em ensaios clínicos de sujeitos que exibem expressão do gene HT ou níveis de proteína diminuídos. Em tais ensaios clínicos, a expressão ou a atividade de um gene HT e preferentemente, de outros genes que tenham sido implicados, por exemplo, um distúrbio associado com níveis de proteína HT, pode ser utilizada como uma "leitura" ou marcadores do fenótipo de uma célula particular, no caso presente, as células B.

Em algumas formas de realização, a presente especificação descreve um método para monitorizar a eficácia do tratamento dum sujeito com um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena, ou outro fármaco) que compreende as etapas de (i) obter uma amostra de pré-administração dum indivíduo antes da administração do agente; (ii) detetar o nível de expressão duma proteína HT ou mARN na amostra de pré-administração; (iii) obter uma ou mais amostras pós-administração do sujeito, (iv) detetar o nível de expressão ou atividade da proteína HT ou mARN nas amostras pós-administração; (v) comparar o nível de expressão ou atividade da proteína HT ou mARN na amostra pré-administração com a proteína HT ou mARN na amostra ou amostras pós-administração e (vi) alterar para o sujeito a administração do agente, em conformidade. De acordo com tal forma de realização, a expressão ou atividade de HT pode ser utilizada como um indicador da eficácia do agente, mesmo na ausência duma resposta fenotípica observáve1. 0 nível de expressão basal de HT em diferentes tecidos pode ser determinado por análise de amostras de tecidos de indivíduos considerados para a presença ou ausência dum polimorfismo específico. Qualquer método conveniente pode ser utilizado, por exemplo, ELISA, RIA, etc. 'para a quantificação de proteínas, Northern blot ou outras análises de hibridização, RT-PCR quantitativo, etc. para a quantificação de mARN. A expressão específica para tecido é correlacionada com o genótipo. É determinada a alteração da expressão de HT em resposta a um modificador por administração ou combinação do modificador candidato com um sistema de expressão, por exemplo, animal, célula, ensaio de transcrição in vitro, etc. É determinado o efeito do modificador sobre a transcrição HT e/ou níveis de mARN de estado estacionário. Como nos níveis de expressão basal, as interações específicas de tecido são de interesse. As correlações são feitas entre a capacidade dum modificador de expressão para afetar os níveis de HT e a presença dos polimorfismos proporcionados. Um painel de modificadores diferentes, tipos de células, etc pode ser rastreado a fim de determinar o efeito sob várias condições diferentes. Métodos de Tratamento A presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo diagnosticado clínicamente com uma condição associada com o aumento dos níveis séricos de HT. Os métodos compreendem geralmente analisar uma amostra biológica para medir os níveis de HT e comparar tais níveis àqueles presentes em controlos saudáveis. Um plano de tratamento que é ma is eficaz para indivíduos diagnosticados clinicamente como tendo uma condição associada com o aumento dos níveis de HT, tal como doença autoimune, é então selecionado e o paciente é então tratado em conformidade. Assim, a invenção proporciona ainda um método para predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármaco para uma condição associada com níveis de HT aumentados, que compreende determinar uma expressão dum gene de HT do paciente, em que a presença de níveis de HT aumentados associada com uma condição autoimmune, tal como LES e é preditivo da probabilidade do paciente responder a um tratamento com fármaco para a condição.

Assim, outro aspeto da invenção proporciona métodos para ajustar o tratamento terapêutico dum indivíduo com a expressão de HT de acordo com a resposta ao fármaco desse indivíduo. Os farmacogenómicos permitem a um clínico ou a um médico dirigir tratamentos profiláticos ou terapêuticos a pacientes que mais irão beneficiar do tratamento e evitar o tratamento de pacientes que irão experimentar efeitos secundários tóxicos relacionados com o fármaco.

Doenças autoimunes A seguinte é uma lista não limitativa das doenças autoimunes possíveis cujo tratamento das mesmas pode ser ajudado pela utilização do ensaio de medição de HT divulgado presentemente. As doenças autoimunes reguladas por célula B incluem artrite (artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), psoríase, dermatite incluindo dermatite atópica; urticária crónica autoimune, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistémica, respostas associadas com doença inflamatória dos intestinos (TBD) (doença de Crohn, colite ulcerosa), síndrome da angústia respiratória, síndrome de dificuldade respiratória no adulto (SDRA), meningite, rinite alérgica, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus (incluindo nefrite, não renal, discóide, alopecia), diabetes de inicio juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, respostas imunológicas associadas com hipersensibilidade aguda e retardada medrada por citócinas e linfócítos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplástica, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond-Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AHAI), anemia perniciosa, aplasia pura dos glóbulos vermelhos (PRCA), deficiência de Fator VIII, hem.ofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenía, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, miastenia gravis, doenças mediadas por complexos antigeno-anticorpo, doença da membrana basal antiglomerular, síndrome do anticorpo antifosfolipido, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Miastenia de Lambert-Eaton, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgãos sólidos (incluindo pré-tratamento painel para altos títulos de anticorpos reativos, depósito de IgA em tecidos, etc.), doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigóide bolhoso, pênfigo (todos, incluindo vulgaris, foliáceo), poliendocrinopatia

autoimune, doença de Reiter, síndrome do homem rígido, arterite de células gigantes, netrite do complexo imune, nefropatia IgA, polineuropatias IgM ou neuropatia medrada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) , trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e do ovário incluindo orquite autoimune e ooforite, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite autoimune, tiroidite crónica (tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Adi c i on ar i son, doença de Grave, síndrornes políglandulares autoimunes (ou síndrornes de endocrinopatia poliglandular), diabetes do Tipo I também referido como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite intersticial linfóide (HIV), bronquiolite obliterante (não transplante) vs NSIP/PINE, síndrome de Guillain-Barre, vasculite de vasos grandes(incluindo polimialgia reumática e de Arterite células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia por IgA) , glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrose biliar primária, doença celíaca (enteropatia ao glúten), Crioglobulinemia, ELA e doença arterial coronariana. Antagonistas BLyS e/ou APRIL

Se são vistos altos níveis de HT num paciente que sofre duma doença autoimune, isto sugere a probabilidade de que o paciente irá responder favoravelmente à inibição BLyS e/ou APRIL. Assim, a presente especificação descreve antagonistas BLyS e/ou APRIL que são utilizados para o tratamento de doenças autoimunes em que o paciente tem níveis elevados de HT. Os exemplos seguintes são representativos de antagonistas BLyS e/ou APRIL que podem ser utilizados para tratar tais pacientes. Para o propósito de funcionar como um antagonista BLyS e/ou APRIL, o domínio extracelular de qualquer recetor da família do TNFR é um polipeptídeo essencialmente livre de domínios de transmembrana ou citoplásmicos que geralmente mantêm a capacidade de se ligarem a BLyS. Especificamente, o domínio extracelular de TACI pode compreender aminoácidos 1 a 154 da sequência de polipeptídeo TACI (SEQ ID NO: 2) . Além disso, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tais como formas de ECD de TACI como descrito em von Bulow et al, , supra, documento WO 98/39361, documento WO 00/40716, documento WO 01/85782, documento WO 01/87979, e documento WO 01/81417. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1-106 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1-142 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 30-154 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 30-106 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 30-110 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 30-119 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1-166 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-165 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-114 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-119 da SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-120 da SEQ ID NO: 2 e aminoácidos 1-126 da SEQ ID NO:2. Adicionalmente, o ECD de TACI pode compreender aquelas moléculas que têm apenas um domínio rico em cisteína.

As formas de ECD de BAFF-P. incluem aquelas que compreendem os aminoácidos 1-71 da sequência de polipeptídeo de BAFF-R (SEQ ID NO:4). Adicionalmente, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tais como formas de ECD de BAFF-R como descrito em documento WO 02/24909, documento WO 03/14294 e documento WO 02/38766. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1-77 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 7-77 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 1-69 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 7-69 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 2-62 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 2-71 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1-61 da SEQ ID NO: 4 e aminoácidos 2-63 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 1-45 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 1-39 da SEQ ID NO:4, aminoácidos 7-39 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1-17 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 3 9-64 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 19-35 da SEQ ID NO: 4 e aminoácidos 17-42 da SEQ ID NO:4. Adicionalmente, o ECD de BAFF-R pode compreender aquelas moléculas que têm um domínio rico em cisterna.

As formas de ECD de BCMA incluem aquelas que compreendem os aminoácidos 1-48 da sequência de polipeptídeo de BCMA (SEQ ID NO: 6) . Adicionalmente, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tais como formas de ECD de BCMA como descrito em documento WO 00/40716 e documento WO 05/075511. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1-150 da SEQ ID NO:6, aminoácidos 1-48 da SEQ ID NO:6, aminoácidos 1-41 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 8-41 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 8-37 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 8-88 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 41-88 da SEQ ID NO:6, aminoácidos 1-54 da SEQ ID NO:6, aminoácidos 4-55 da SEQ ID NO:6, aminoácidos 4-51 da SEQ ID NO:6 e aminoácidos 21-53 da SEQ ID NO:6. Adicionalmente, o ECD de BCMA pode compreender aquelas moléculas que têm apenas um domínio rico em cisterna parcial.

Numa forma adicional de realização, a região de ligação BLyS dum recetor BLyS (por exemplo, um domínio extraceluiar ou fragmento do mesmo de BAFF-R, BCMA ou TACI) pode ser fundido a uma de Fc: duma molécula de imunoglobulina para facilitar a sua solubilidade in vivo. De acordo com uma forma de realização, o antagonista BLyS e/ou APRIL liga-se a um polipeptídeo BLyS com uma afinidade de ligação de lOOnM ou menos. De acordo com uma outra forma de realização, o antagonista BLyS e/ou APRIL liga-se a um polipeptídeo BLyS com uma afinidade de ligação de lOnM ou menos. o antagonista BLyS e/ou APRIL liga-se a um polipeptídeo BLyS com uma afinidade de ligação de InM ou menos.

Noutro exemplo, antagonistas BLyS e/ou APRIL incluem polipeptideos que ligam BLyS que não são sequências nativas ou variantes da mesma. Alguns exemplos de tais polipeptideos são aqueles que têm a sequência de Formula I, Formula II, Formula III como descrito em documento WO 05/000351. Em particular, alguns polipeptideos de ligação incluem ECFDLLVRAWVPC5VLK (SEQ ID NO:13), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID NO :14), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID NO :15), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID NO:16), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID NO:17) ou as sequências listadas na FIGURA 32 do documento WO 05/000351.

Em alternativa, o antagonista BLyS e/ou APRIL pode ligar-se a um domínio extracelular TACI de sequência nativa, BAFF-R ou BCMA na sua região de ligação BLyS para bloquear parcialmente ou completamente, inibir ou neutralizar a ligação BLyS in vitro, in situ, ou in vivo. Por exemplo, tal antagonista indireto é um anticorpo TACI que se liga numa região de TACI tal que a ligação BLyS é impedida estericamente. Por exemplo, a ligação em aminoácidos 72-109 ou numa região vizinha acredita-se que bloqueia a ligação BLvS. Pode também ser vantajoso bloquear a ligação de APRIL a esta molécula, o que se acredita que ocorra na região de aminoácidos 82-222. Outro antagonista BLyS e/ou APRIL é um anticorpo de BAFF-R que se liga numa região de BAFF-R tal que a ligação de BAFF-R humano a BLyS é impedido estericamente. Por exemplo, a ligação em aminoácidos 23-38 ou aminoácidos 17-42 ou numa região vizinha acredita-se que bloqueia a ligação BLyS. Finalmente, um antagonista mais indireto seria um anticorpo APRIL que se liga numa região de APRIL tal que a ligação BLyS é impedida estericamente. Por exemplo, a ligação em aminoácidos 5-43 ou numa região vizinha acredita-se que bloqueia a ligação BLyS (ou APRIL).

Em algumas formas de realização, um antagonista BLyS e/ou APRIL inclui anticorpos BLyS. O termo "anticorpo” quando referido é utilizado no seu sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos com especificidade de poliepítopos, anticorpos de cadeia única e fragmentos de anticorpos. De acordo com algumas formas de realização, um polipeptideo desta invenção é fundido numa estrutura de anticorpo, por exemplo, na região variável ou numa CDR de tal modo que o anticorpo se pode ligar a e inibir a ligação BLyS a TACI, B.AFF-R. ou BCMA ou inibir a sinalização BLyS. Os anticorpos que compreendem um polipeptideo podem ser quimérico, humanizado, ou humano. Os anticorpos que compreendem um polipeptideo podem ser um fragmento de anticorpo.

Em alternativa, um anticorpo pode ser produzido por imunização dum animal com um polipeptideo. Assim, é contemplado um anticorpo dirigido contra um polipeptideo descrito,

Em particular, são contemplados anticorpos específicos para BLyS que se ligara dentro duma região BLyS humanos (SEQ ID NO:8) que compreende resíduos 162-275 e/ou um aminoácido vizinho de aminoácidos selecionado a partir do grupo que consiste em 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 e 265 BLyS humanos. A ligação dos anticorpos são tais que o an.tic.orpo impede estericamente a ligação BLyS a um ou mais dos seus recetores. Tais anticorpos são descritos no documento WO 02/02641 e documento WO 03/055979. Um anticorpo particularmente prefe.renc.ial é o descrito como Lymphostat-B (Baker et ai, (2003) Arthritis Rheum, 48, 3253-3265).

Outros fármacos imunossupressores A especificação descreve a utilização doutros fármacos imuno s supres sores quer isoladamente ou em combinação com um inibidor BLyS e/ou ABRIL. Estes outros fármacos incluem, mas não estão limitados a, agentes imunossupressores tais como inibidores da calcineurina (par exemplo, ciclosporina A ou. FK.50 6), ester6.id.es (por exemplo, prednisona metilo ou prednísona) ou agentes imunossupressores que param o crescimento de células imunitárias (por exemplo, rapamicina), inibidores via anti~CD40 (por exemplo, anticorpos anti-CD40, anticorpos ligando anti-CD40 e inibidores de moléculas pequenas da via CD40), inibidores da via de salvamento de transplante (por exemplo, o micofenolato die mofetil (MMF) ) , antagonistas do recetor IL~ 2 ( por exemplo, Zeonpax.COPYRIGHT. de Hoffmann-la Roche

Inc. e Simulet da Novartis, Inc.) ou análogos dos mesmos, ciclof osf amidcL, talidomida, azatioprina, anticorpos monoclonais (por exemplo, Daclizumab (anti-interleucina (IL)~2), Infliximab (fator de necrose anti-tumoral), MEDI-2Q5 (anti-CD2), abx-cbl (anti-CD147)) e anticorpos policlonais (por exemplo, ATG (globulina antitimócito)). Formulações Farmacêuticas

As formulações terapêuticas dos antagonistas BLyS e/ou APRIL tais como anticorpos que ligam BLyS utilizados como descrito no presente documento sâo preparados para armazenamento misturando um anticorpo que tem o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores opcionais aceitáveis farmaceuticamente, (Remitgtorz' s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou s o 1 u ç õ e s a qu o s a s .

Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis sâo recetores não tóxicos nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, butilo ou álcool benzilico; parabenos de alquil tais como parabeno de metil ou prop!1; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); baixa massa molecular (menos de que cerca de 10 resíduos); polipeptídeos; proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacárídos e outros hídratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraiões formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensioativos não iónícos tais como TWEEN, PLURONICS ™ ou polietilenoglicol (PEG)), A formulação no presente documento também pode conter mais dum composto ativo se necessário, para a indicação particular a ser tratada, preferentemente aqueles com atividades complementares que não se afetem adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um agente citotóxíco, um agente quimioterapêutico, citoquina ou um agente imunossupressor (por exemplo, um que atua em células T, tal como ciclosporina ou um anticorpo que se liga a células T, por exemplo, um que se liga a LFA-1) . A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença ou distúrbio ou tratamento e doutros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como descrito no presente documento ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregues até agora.

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilceluloso ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metacrilato de metil), respetivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas errs Remington/s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A, Ed. (1980).

Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contêm o antagonista, matrizes estas que estão na forma de artigos enformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéís (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), e poli álcool vinilico)), polilactídeos (Patente U.S. N.° 3 773 919), copolimeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etil, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolimeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT (microesferas injetáveis compostas de copolimero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a ser utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. EXPERIMENTAÇÃO

Os exemplos seguintes são impulsionadores do propósito de proporcionar aos peritos na especialidade uma divulgação e descrição completas de como produzir e utilizar a presente invenção e não pretendem limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como a sua invenção, nem pretendem representar que as experiências abaixo são todas ou as únicas experiências realizadas. Têm sido feitos esforços para assegurar a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, massa molecular é massa média da massa molecular, temperatura é em graus Celsius e pressão é ou está próxima da atmosférica.

EXEMPLO 1: ENSAIO PARA MEDIR NÍVEIS DE HT

Reagentes: anticorpo Anti-APRIL conjugado a conta (exemplo, E9617 anticorpo anti-APRIL ZGEN (clone 319,6.8,5) conjugado com BioRad xMap conta 106 (Hercules, CA)) anticorpo Anti-APRIL biotinilado (E4731 anticorpo anti-BLyS ZGEN (clone 258,2.1,9.1,3) biotinilado) estreptavidina-PE (Jackson ImmunoResearch. Labs, Inc (West Grove, PA) #016-110- 084) placas Multiscreen (Millipore (Billerica, MA), MABVN1250) ELISA B (ELISA C + 1% BSA + NaAZ) heterotrimero de APRIL/BLyS LOTE A1642F padrão (25 ng/mL), QC1 (7,5ng/mL) e QC2 (500pg/mL) (2 subunidades de .APRIL, um BLyS) Soro AB de Amostras Humanas (pré-rastreados para conteúdo baixo de BLyS e APRIL) Shaker 1) Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente 2) Bloquear placa: adicionar lOOuL de ELISA B a todos os poços, agitar durante 10', vácuo. 3) Submeter a vórtice as contas durante 30", sonicar as contas durante 30"

a. Determinar volume das contas a adicionar: 5K contas/poço em 25 uL/poço ELISA B b. Para uma placa completa 2,5 mL + 5E5 contas 4) Adicionar 25uL de mistura de contas por poço a todos os poços. 5) Diluir padrões: padrão diluído de A1642F (25 ng/mL) em ELISA B, 1:3 seis vezes para uma série de diluição de 7 pontos: 25000, 8333, 2778, 926, 309, 103 e 34 pg/mL,

6) Adicionar 25 uL 25000 pg/mL padrão a AI, 8333 pg/raL padrão a Bl, etc. 7) Adicionar 25 uL de QC1 a A2, adicionar 25 uL de QC2 a B2 . 8) Adicionar 25 uL de soro a todos os poços padrão, fundo e QC. 9) Adicionar 25 uL ELISA B a todos os poços da amostra e ao poço de fundo. 10) Adicionar 2 5 uL de amostra de soro a cada poço da amostra *, **. 11) Vedar a placa e cobrir com película metalizada.

Colocar no agitador a 600 RPM durante 60' a Ta. 12) Vácuo. Lavar placa com 2x100 uL de ELISA B. 13) Adicionar 25 uL/poço de 1 ug./raL de anticorpo E4731- biotina. 14) Vedar a placa e cobrir com película metalizada.

Colocar no agitador a 600 RPM durante 60'

15) Sem lavar ou aspirar adicionar 25 uL/poço 1:100 SA-PE em ELISA B. 16) Vedar a placa e cobrir com película metalizada.

Colocar no sacudidor a 600 RPM durante 30' 17) Vácuo. Lavar placa coin 2x10 0 uL de ELISA B. 18) Adicionar 110 uL de ELISA B por poço. Misturar a 600 RPM durante 5' 19) Executar em Luminex 100, _Mapa de Placa_ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2500 QC1 S2 S4 S6 S8 S10 S12 S14 Sl 6 SI 8 S20 B 8333 QC2 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 C 2778___1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 D 92 6 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:1 6 1:1 6 E 309 Sl S3 S5 S7 S9 Sll S13 S15 S17 S19 S21 F 103 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 G 34 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 Η B 1:16 [1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 É muito importante executar amostras puras e nas diluições seguintes: 1:4, 1:8 e 1:16. Isto é necessário para permitir que os complexos de ΗΪ nativos se dissociem e este não é um efeito de soro. A concentração do soro deve ser mantida constante ao longo das séries de diluição pela diluição cie amostras com o soro padrão. Ter menos de 25 uL de soro em cada poço pode fazer com que esses poços exibam valores errados. • Exemplo de desempenho do ensaio:

Os valores aceitáveis para os controlos padrão e de qualidade são +/-25% dos valores esperados. 0 LOD ensaio é esperado ser 100pg/mL com amostras executadas puras (100% soro). O ensaio pode ser executado com precisão até 34pg/mL. O padrão utilizado neste ensaio é um HT que contém 2 subunidades APRIL e 1 subunidade BLyS. Os valores absolutos de HT nativo serão diferentes se esta molécula é relativamente rara no soro do paciente, no entanto, neste momento não há evidência de que haja qualquer viés para qualquer combinação triraérica particular.

EXEMPLO 2: MEDIÇÃO DE HT EM SOROS DE PACIENTE E CONTROLO SAUDÁVEL

O domínio de trimerização N-terminal ZymoZipper permite a produção de heterotrímeros BLyS/APRIL recombinantes (rHT), que foram utilizados como um padrão para desenvolver um imunoensaio baseado em conta para quantificar HT nativo em soro humano como descrito no Exemplo 1. Neste ensaio, juntamente com ELISAs especificas de BLyS e APRIL foram utilizados para medir estes 3 ligandos em soros de controlos saudáveis (CS; n=79) e pacientes de lúpus eritematoso sistémico (LES; n=30) e artrite reurnatoicie (AR; n=2 9) (ver Figuras 1 e 2), A atividade biológica de rHT foi comparada com a de rBLyS e rAPRIL, num ensaio de sinalização de 4 horas utilizando células Jurkat transfetadas de TACI com um gene repórter NFKB/luciferase e num ensaio de proliferação de célula B humana primária de 4 dias.

Significativamente mais pacientes com LES que CS tinham HT detetável no soro (70% vs. 14%, p<0,0001, teste exato de Fisher) e 24% de pacientes com AR tinham HT detetável. Nesta coorte, a média dos niveis sérícos de HT foram 177 pg/mL (LES) , 64 pg/mL (AR) e 66 pg/ml (CS) . No ensaio de Jurkat-TACI (ver Exemplo 4), a sinalização rHT é semelhante ao de BLyS ou APRIL. No ensaio de célula B (ver Exemplo 3), rHT são indutores menos potentes que os ligantes homotrimérico (valores EC50: 0,02 nM para BLyS, 0,17 nM para APRIL e 4,0 6 nM para HT) . Isto provavelmente reflete a expressão predominante de BAFF-R, ao qual a nossa rHT se liga fracamente, em células B em circulação. Atacicept e BCMA-Ig neutralizam a atividade de todos os 3 ligandos nestes ensaios, enquanto BAFFR-Ig exibe pouca ou nenhuma inibição da atividade de rHT. Os nossos dados confirmam que HT nativo são elevados em pacientes auto-imunes e demonstram que rHT são ativos biologicamente. Se HT nativo tem um papel biológico distinto dos seus homólogos homotriméricos permanece para ser determinado. Atacicept inibe a bioatividade de todas as 3 formas de ligandos, o que pode revelar-se importante no tratamento clínico da doença autoimune.

Num segundo conjunto de pacientes com LES, que incluiam 72 pacientes com LES e 42 controlos saudáveis. Os níveis de BLyS e APRIL foram determinados por ELISA. Os níveis de HT foram medidos em 36 pacientes e 25 controlos utilizando um ensaio baseado em luminex. HT foi detetado em mais pacientes que em controlos (72% vs. 32% χ2=== 0,0019) .

EXEMPLO 3: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA B

Um frasco para injetáveis que contém 1 x 108 congelado,, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de aférese foi rapidamente descongelado em 370C banho de água e ressuspensas em 25 ml de meio de células B (Meio 1640 de RPMI, 10% de soro de bovino fetal inativado a alta temperatura, 5% de L-glutamina, 5% de Pen/Strep) num tubo de 50 ml. As células foram testadas para viabilidade de utilização de azul de tripano (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). As células CD19+B foram então isoladas por seleção positiva utilizando microesferas revestidos anti--CD19 (Miltenyi Biotech). As células revestidas foram, em seguida, isoladas numa coluna MACS LS (Miltenyi Biotech) As células B foram ressuspensas a uma concentração final de 1,6 x 10 células/ml em meio de células B e plaqueadas a 100 μΐ/poço, numa placa de 96 poços fundo U (Falcon, VWR, Seattle, WA). HT e ligandos homotriméricos foram preparados e foram adicionados às células em 3 diluições dobradas de 1000 ng/ml a 0 ng/ml. O volume final foi de 200 μΐ/poço.

As células foram então incubadas a 370C num incubador humidificadodurante 72 horas. Dezasseis horas antes da colheita, 1 uCi de 3H timidina foi adicionado a todos os poços. As células foram recolhidas numa placa de filtro de 96 poços (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) em que foram recolhidas utilizando um recolhedor de células (Packard) e coletadas de acordo com as instruções do fabricante. As placas foram secas a 55 °C durante 20-30 minutos e o fundo dos poços foi selado com um selante de placa opaco. Para caída poço foi adicionado 0,25 ml de fluido de cintilação (Microscint-O, Packard) e a placa foi lida utilizando um TopCount Microplate Scintillation Counter (Packard) EXEMPLO 4: BIOENSAIQ DE CÉLULAS JURKAT TRANFETADAS POR TACI O bioensaio in vitro TACI utiliza uma linha celular Jurkat (linfõcito células T aguda humana, KZ142, clone #24) que foi transfetado com dois plasmídeos. Primeiro, a linha celular foi transfetada com um plasmideo contendo um gene repórter de luciferase sob o controlo do promotor NF-κβ/ΑΡ-1 e um gene resistente a neomicina. Um clone apropriado foi escolhido após seleção com G418. Esta linha celular foi então transfetada com um plasmideo contendo o ADNc de TACI de comprimento completo sob o controlo do promotor CMV (TACI/pZP7P) e um gene resistente a puromicina. Os clones foram selecionados com puromicina e, em seguida, uma linha celular apropriada escolhida para o ensaio por avaliação para a expressão de TACI por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais de TACI. 0 ensaio baseia-se na gravação da leitura da expressão do gene de luciferase que é desencadeada pela ligação do ligando de teste (HT ou BLyS homotrimérico ou APRIL homotrimérico) a TACI de superfície celular produzido por a partir do ADNc de TACI.

As células Jurkat transfetadas foram propagadas em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (Rosewell Park Memorial Institute, Buffalo, Nova Iorque) adicionado com 10% FBS. Foi adicionada puromicina a 2 qg/ml como um reagente seletivo para a transfeção. Também foram adicionados ao meio piruvato de sódio e L-glutamina a volume de 1% de volume. O substrato e tampão de ensaio de Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI #E2510) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio foi realizado por ressuspensão de células Jurkat transfetadas em meio de 1,6 x 106 célula/ml. As células são plaqueadas numa placa de ensaio branca com 50 ].f\por poço. Amostras de ZZ-APRIL foram trazidas para diluição adequada e colocadas numa placa de 96 poços. As diluições foram adicionadas às células, a 50 μλ por poço. A placa foi incluída 4 horas numa incubadora de 37 °. Durante a incubação, o tampão e o substrato de Steady-GLO foi equilibrado à temperatura ambiente. Após as 4 horas de incubação, a placa foi deixada a arrefecer à temperatura ambiente durante 5 minutos. 0 tampão e o substrato de ensaio foram misturados em conjunto e adicionados a 100 ul por poço. As placas foram turbilhonadas a baixa configuração durante 1 minuto ’para misturar, em seguida, incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. A placa foi então lida num luminómetro com integração de cinco segundos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Stacey R, Dillon Brandon J. Harder

<120> NÍVEIS SÉRICOS DE HETEROTRÍMEROS BLYS/APRIL E

UTILIZAÇÃO EM MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO <130> 054878/371388 < 1 60> 26 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210 > 1 < 211> 1377

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <22 0 >

<221> CDS <222> (14) . . . (892) < 4 0 0 > 1 agcatcctqa gta atg agt ggc ctg ggc egg age agg cqa ggt ggc egg 49

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg 1 5 10 age cgt gtg gac cag gag gag ege ttt oca cag ggc ctg tgg aeg ggg 97

Ser Arg Val Asp Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly 15 20 25 gtg get atg aqa tee tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg ctg 145

Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu 30 35 40 ggt acc tgc atg tee tgc aaa ace att tgc aac cat cag age cag ege 193

Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr He Cys Asn His Gin Ser Gin Arg 45 50 55 60 acc tgt gca gee t.tc tgc agg tea etc age tgc ege aag gag caa ggc 241

Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly 65 70 75 aag ttc tat gac cat ere ctg agg gac tgc arc age tgt gee tee arc 289

Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys He Ser Cys Ala Ser He 80 85 90 tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac tee tgt gag aac aag etc 337

Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu 95 100 ” 105 agg age cca gtg aac ett cca cca gag etc agg aga cag egg agt gga 385

Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg .Arg Gin Arg Ser Gly 110 115 120 gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga agg tac caa gga ttg gag 433

Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu 125 130 135 140 cac aga ggc tea gaa gca agt cca get etc ccg egg ctg aag ctg agt 431

His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser 145 150 155 gca gat caq gtg gee ctg gtc tac age aeg ctg ggg etc tgc ctg tqt 529

Ala .Asp Gin Val Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys 160 165 170 gee gtc etc tgc tgc tte ctg gtg geg gtg gee tgc ttc etc aag aag 577

Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Vai Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys 175 180 185 agg ggg gat ccc tgc tee tgc cag ccc ege tea agg ccc cgt caa agt 625

Arq Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser 190 195 200 ccg gee aag tet tee cag gat cac geg atg gaa gee ggc age cct gtg 673

Pro Ala Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val 205 210 215 220 age aca tee ccc gag cca gtg gag acc tgc age ttc tgc ttc cct gag 721

Ser Thr Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu 225 230 235 tgc agg geg ccc aeg cag gag age gca gtc aeg cct ggg acc ccc gac 769

Cys Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp 240 245 250 ccc act tgt get gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg 817

Pro Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu 255 260 " 265 cag cct tgc cca cac ate cca gac agt ggc ett ggc att gtg tqt gtg 865

Gin Pro Cys Pro His lie Pro Asp Ser Gly Leu Gly He Val Cys Val 270 275 280 cct gee caq gag ggg ggc cca ggt gca taaatggggg tcagggaqgg 912

Pro Ala Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala 285 ~ 290 aaaggaggag ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga 972 gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagaaaggg agagaaacag aggagacaga 1032 qaqggaqaqa gagacaqagg gaqaqagaqa caqaggggaa qagaggcaqa gagqqaaaga 1092 ggcagagaag gaaagagaca ggcagagaag gagagaggea gagagggaga gaqgcagaga 1152 gggagagaqg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc 1212 ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt 1272 gcaataaagt cctcgtgcct qctgctcaca gcccccqaga gcccctcctc ctgqagaata 1332 aaacctttgg cagctgccct tcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1377

<210 > 2 <211> 293 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <4 0 0>2

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai Asp 1 5 10 15

Girt Glu Glu -Arg Phe Pro Girt Gly Leu Trp Thr Gly Vai Ala Met Arg 20" 2 5 30

Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 35 )u 45

Ser Cys Lys Thr lie Cys Asn His Gin Ser Gin Arq Thr Cys Ala Ala 50 ' 55 60'

Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80

His Leu Leu Arg Asp Cys lie Ser Cys Ala Ser lie Cys Gly Gin His 85 90 95

Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Vai 100 105 110

Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn 115 120 125

Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arq Gly Ser 130 135 140

Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gin Vai 145 150 155 160

Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai Leu Cys 165 170 175

Cys Phe Leu Vai Ala Vai Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro 180 185 190

Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205

Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Vai Ser Thr Ser Pro 210 ’ 215 220

Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 225 230 235 240

Thr Gin Glu Ser Ala Vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 2 4 5 2 50 2 5 5

Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Vai Leu Gin Pro Cys Pro 260 265 270

His lie Pro Asp Ser Gly Leu Gly lie Vai Cys Vai Pro Ala Gin Glu 275 ’ 280 285 o 1 y Gly P r o G1 y 1 a 290

<210 > 3 <211> 586 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <22 0 >

<221> CDS <22/> (27),., (578) < 4 Ο Ο > 3 gcagcttgtg cggcqgcgtc ggcacc atg agg cga ggg ccc cgq age ctg egg 53

Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg 1 5 ggc agg gae geg cca gee ccc aeg cce tgc gtc ecg gee gag tgc ttc 101

Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe 10 15 20 * 25 gae ctg ctg gtc ege cac tgc geg gee tgc ggg etc ctg ege aeg cca 119

Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro 30 3 5 10 egg ccg aaa ccg gee ggg gee age age cct geg ccc agg aeg geg ctg 197

Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu 15 50 55 cag ccg cag gag teg gtg ggc geg ggg gee ggc gag geg geg ctg ccc 215

Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro 60 65 " " 70 ctg ccc ggg ctg etc ttt ggc gee ccc geg ctg ctg ggc ctg gca ctg 293

Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu 75 80 85 gtc ctg geg ctg gtc ctg gtg ggt ctg gtg age tgg agg egg cga cag 311

Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin 90 95 100 J 105 egg egg ett ege ggc geg tee tee gca gag gee ccc gae gga gae aag 389

Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys 110 115 120 gae gee cca gag ccc ctg gae aag gtc ate att ctg tet ccg gga ate 437

Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val lie He Leu Ser Pro Gly He 125 130 135 tet gat. gee aca get. cct gee t.gg cct cct cct. ggg gaa gae cca gga 485

Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly 140 145 " 150 acc acc cca cct qgc cac aqt gtc cct gtg cca gee aca gag ctg ggc 533

Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly 155 160 165 tee act. gaa ctg gtg acc acc aag aeg gee ggc cct gag caa caa 578

Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 170 175 180 tageaggg 586 <210 > 4 < 211> 184

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <40 0 > 4

Met Arg Arq Gly Pro Arq Ser Leu Arq Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 " 5 10 15

Thr Pro Cys Val Pro AJa Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30

Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro .Ala Gly A.la 3 5 10 -1 5

Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly 50 5 5 60 .Ala Gly Ala Gly Glu Ala -Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 * * 70 75 80*

Ala Pro .Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu .Ala Leu Val Leu Val 85 90 95

Gly Leu Val. Ser Trp Arg .Arg Arq Gin .Arg Arq Leu .Arg Gly Ala Ser 100 105 110

Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp 115 12 0 12 5

Lys Val He lie Leu Ser Pro Gly lie Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 130 135 110

Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 150 155 160

Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr 165 170 175

Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180 < 2 1 0 > 5

<211> 995 <212 > ADN < 213 > Η oni o s ap i e n s <22 0>

<221> CDS <22/> (219).,.(770) <400>5 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gcfc.gcat.ttg ctctggaatt cttgtagaga tafctacttgfc ccfctccaggc 180 tgttcLttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg get ggg 236

Met Leu Gin Met Ala Gly 1 6 cag tgc tcc caa aat gaa. tat ttt gac agt ttg ttg cat get tgc ata 284

Gin Cys Set Gin Asn Glu Tvr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys lie 10 " 15 20 cct tgt caa cfct ega tgt tet tet aat act act cct eta aca tgt cag 332

Pro Cys Gin Leu Arg Cys Set Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gin 25 30 35 cgt tat tgt aat gca agt gfcg act aat tea gtg aaa gga aeg aat geg 380

Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala 40 45 50 att etc tgg ace tgt ttg gga ctg age tta ata att tet ttg gca gtt 128 lie Leu Trp Thr Cys Leu. Gly Leu Ser Leu lie lie Ser Leu Ala Val 55 ’ 60 65 30 ttc gtg cts. atg ttt ttg eta agg aag ata. age tet gaa tea tta aag l'<6

Phs; Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys He Set Ser Glu Pro Leu Lys 7 5 3 0 8 5 gac gag ttt. aaa aac aca gga tea ggt etc ctg ggc atg get aac att 524

Asp Glu ?he Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn He 90 95 100 gac ctg gaa aag age agg act ggt gat gaa att att ett ccg aga ggc 572

Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu He He Leu Pro Arg Gly 105 110 115 etc gag tac aeg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc ate aag age 620

Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Tie Lys Ser 120 125 130 aaa ccg aag gtc gac tet: gac cat tgc ttt cca etc cca get atg gag 666

Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu 135 ’ 140 145 150 gaa ggc gca acc att ett gtc acc aeg aaa aeg aat gac tat tgc aag 716

Glu Gly Ala Thr He Leu Val Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys 135 160 165 age ctg cca get get ttg agt get aeg gag ata gag aaa tea att tet 764

Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala 'Thr Glu He Glu Lys Ser He Ser 170 175 180 get agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat cttttgtcag 820 A1a Arg aatagatqat gtgtcagatc tctttagqat qactqtattt ttcagtrgcc gatacagctt 880 tttgtcctct aactgtggaa actctt.tatg ttagatatat ttctctaggt tactgttggg 940 agettaatgg tagaaaette cttggtttca tgattaaagt cttttttttt cctga 995 <210 > 6 < 211> 184

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <40 0 > 6

Met Leu Gin Met Ala Gly Gin Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 15 10 15

Leu Leu His Ala Cys lie Pro Cys Gin Leu Arq Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 " 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gin Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 " 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala lie Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 lie lie Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys lie 65 70 75 80

Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn lie Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 ' 105 110 lie lie Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 ” 120 " 125

Glu Asp Cys lie Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr lie Leu Val Thr Thr Lys 145 150 ’ 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 * 170 175 lie Glu Lys Ser lie Ser Ala Arg 180 < 210 > 7 <211> 1149

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS < 2 2 2 > (173) ...( 1023) <40 0> 7 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 gc.cctgcx.at gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt 120 ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg at atg gat 178

Met Asp 1 gac tcc aea gaa agg gag cag tea ege ett act tet tgc ett aag aaa 226

Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gin Ser A.rg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys 5 10 15 aga gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc ate etc cca egg aag 274

Arg Glu Glu Mae Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser lie Leu Pro A.rg Lys 2 0 2 5' 30 gaa age ccc ter gtc ega tec tec aaa gae gga aag ctg ctq get gea 322

Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala 35 40 45 50 acc tt.g ctg ctg gca ctg ctg tot. tgc tgc etc a eg gtg gtg tee ttc 3"0 'l'hr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Set Cys Cys Leu Thr Val Val Set Phe 55 60 55 tac cag gtg gee gcc ctg caa ggg gac ctg gee age etc egg gca gag 418

Tyr Gin Val Ala Ala Leu Gin Gly Asp "Lear Ala Ser Leu Arg Ala Glu 70 75 80 ctg cag ggc cac cac geg gag aag ctg cca. gca gga gca gga gcc ccc 4 66

Leu Gin Gly His His Ala Glu Lys Leu Fro Ala Gly Ala Gly Ala Pro 85 90 95 aag gcc ggc ctg gag gaa get, cca get gtc acc geg gga ctq aaa ate 514

Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys lie 100 105 110 ttt gaa cca cca get cca gga gaa gee aac tec agt rag aac age aga 562

Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asr Ser Ser Gin 3an Ser Arg 115 120 " " 125 130 aat aag cgt gcc gtt cag qgt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc 610

Asri Lys A.rg Tula Val Gin Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gin Asp Cys 135 140 145 ttg caa ctq ate gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tet 658

Leu Gin Leu Tie Ala Asp Ser Glu ritr Pro Thr ile Gin Lys Gly Ser 150 155 160 tac aca ttt gtt cca tgg ett etc age ttt aaa agg gga agt gcc eta 706 lyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys A.rg Gly Ser Ala Leu 165 " 170 ~ 175 gaa gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt 754

Glu Glu Lys Glu Asn Lys lie Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe 180 135 190 ata La.L qgl. esq git Ltd. Lai act gat aag acc lac gee atg gga cal 802

Ile Tyr Glv Gin Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Mat Gly His 195 * 200 205 210 c-ta att cag agg aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg 850

Leu Tie Gin. Arg Lys Lys Val Bis Val Phe Gly .Asp Glu Leu Ser Leu 215 * 220 " 225 gtg act ttg ttt ega tgt att caa aat atg cct gaa aca eta ccc aat 898

Val Thr Leu Phe Arg Cys lie Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn 230 235 240 aat tee tgc tat tea get. ggc a.tt gca aa.a ctg gaa gaa gga gat gaa 946

Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly lie Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu 245 250 255 etc CS?, ett gca ata cca. aga gaa aat gca caa at a tea ctg gat gga 994

Leu G_lçl Leu Ala _ 1 a Pro Arg Glu Asn Ara Gm Ire Ser Leu Asp Gly 260 265 270 gat gtc aea ttt ttt ggt gca ttg aaa ct gctgtgacct acttacacca 1043

Asp Val Thx Pha Pee Gly Ala Leu Lys 2 7 5 280 tgtctgtagc c? tt. fc T3CC t C CCt t C t CT. Cj ‘OSCCt-C-t-clilC]' citiO 3. âciÇH B. t. CLci.clCTlÇãS.cl lj.03 ataccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ccctcgagcg gccgcc 1149 < 210 > 8 <211> 283

< 212 > PRT < 213 > H orn o s ap i e n s <400>8

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Ljj-U G In Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu 15 10 15

Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser lie Leu Pro 20 25 30

Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu 35 4 0 " 4 5

Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val 50 55 60

Ser Phe Tyr Gin Val Ala Ala Leu Gin Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg 65 70 75 80 A.la Glu Leu Gin Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro A.la Gly A.la Gly 85 90 95

Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu 100 105 110

Lys lie Phe Glu Pro Pro Ala Fro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn 115 120 ~ 125

Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gin Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gin 130 ” " 135 " 140

Asp Cys Leu Gin Leu He Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr He Gin Lys 14 5 150 15 5 16 0

Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser 165 170 175

Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys He Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr 180 * 185 190

Phe Phe He Tyr Gly Gin Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met. 195 200 205

Gly His Leu He Gin Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu 210 ' 215 " 220

Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys He Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240

Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly He Ala Lys Leu Glu Glu Gly 245 250 255

Asp Glu Leu Gin Leu Ala He Pro Arg Glu Asn Ala Gin He Ser Leu 260 265 270

Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys 275 280 <210 > 9 < 211> 185

< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 9

Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 CLr Li.o Cys Val Pro Aid elu CyTs rhe Asp -réu Leu va.r Arg His Cys 20 25 30

Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 ’ 45

Ala Ser Ser Pro ALL a Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val 50 55 60

Gly Ala Gly .Ala Gly Glu Ala .Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu File 65 70 75 80

Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu 85 90 95

Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala 100 105 110

Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu 115 120 125

Asp Lys Val lie lie Leu Ser Pro Gly lie Ser Asp Ala Thr Gila Pro 130 135 14 0

Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His 145 150 ’ 155 160

Ser Val Pro Val Pro A.la Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr 165 170 175

Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180 185 < 210 > 10 <211> 247

< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 10

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 'lO 15

Gin Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe 20 25 30

Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys lie Ser Cys Ala Ser lie Cys Gly 35 40 45

Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 5 0 ’ 5 5 " * 60

Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Val 65 70 75 80

Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg 85 ’ 90 95 G1 y Ser G1 u A™ 1 a Ser Pro A.la Leu Pro G1 y Leu lys Leu Ser A,ra Asp 100 105 no

Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val 115 120 125

Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala. Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly 130 135 " 140

Asp Pro Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala 145 150 ' 155 160

Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro val Ser Thr 165 170 175

Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg ISO 185 190

Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr 195 200 " 205

Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr val Leu Gin Pro 210 215 220

Cys Pro His lie Pro Asp Ser Gly Leu Gly lie Val Cys Val Pro Ala 225 230 235 240

Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala 245 <210 > 11 <211> 17

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 >

<223> Polipeptideo que liga BLyS < 4 0 0 > 11

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu 1 5 10 15

Lys < 210 > 12

< 211> 17 <212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Polipeptídeo que liga BLyS < 4 0 0 > 12

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu Lys <210 > 13 < 211> 17

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0 > <223> Polipeptídeo que liga BLyS <40 0 > 13

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met Leu 1 5 10 15 Γ' " t - y < 210 > 14 <211> 17

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 Ο > <223> Polipeptideo que liga BLyS <400 > 14

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met Leu 1 5 10 *15

Arg <210 > 15 < 211> 17

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0 > <223> Polipeptideo que liga BLyS <40 0 > 15

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Ala Cys Gly Leu Leu 1 * 5 10 15

Arg < 210 > 16

< 211> 1214 <212 > ADK <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <220>

<2 21. > CDS < 2 2 2 > (17) ..,( 1192) < 4 0 0 > 16 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg etc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt teg etc age eag gaa ate cat gee 100

Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu He His Ala 15 2 0 2 5 gag ttg aga ege ttc cgt aga get atg aga tee tgc ccc gaa gag eag 148

Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 " 4 0 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tee tgc aaa acc att tgc 196

Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr lie Cys 45 50 55 60 aac cat eag age eag ege acc tgt gca gcc ttc tgc agg tea etc age 244

Asti His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 ’ 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292

Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 " 85 ’ 90 ate age tgt gcc tee ate tgt gga eag cac cct aag caa tgt gca tac 340

He Ser Cys Ala Ser lie Cys Gly Gin His Fro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac etc cca cca gag etc 388

Fhe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Sei Fro Val Asn Leu Fro Fro Glu Leu 110 115 120 agg aga cag egg agt gga gaa gtt gaa aac aac tea gac aac teg gga 436

Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly 125 130 135 140 agg tac caa gga ttg gag cue aga ggc tea gaa gca agt cca get etc 484

Arg Tyr Gin Gly Leu Glu Hi3 Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 14 5 1 5 0 1 5 5 cca ggt etc aag gag ccc aaa tet tea gae aaa act cac aca tgc cca 532

Pro Gly Leu Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 160 165 170 ccg tgc cca gca cct gaa gee gag ggg gca ccg tea gtc ttc etc ttc 580

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 175 180 185 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc ate ate tee egg -ace cct gag gtc 628

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 190 195 200 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag etc 676

Thr Cys Val VaL Val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 2 C 5 210 215 220 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 724 •As π Trp Tyr Vai Asp Griy Val Glu Val His A.sn Ala Lys Thr Lys Vro 2Ξ5 230 235 egg qaq gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc 772

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 240 245 250 gtc ctg cac cag cac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 820

Val Leu His Glu Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 255 260 265 tee aac. aaa gee etc. cca tee tee ate gag aaa acc ate tee aaa gee B66

Ssr Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 270 275 280 aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee egg SI 6

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 285 290 295 300 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 964

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 1012

Phe Tyr Pro Ser Asp Tie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 320 325 330 gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtq ctg gac tee gac ggc tee 1060

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 335 ’ " 340 345 ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg caq cag 1108

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 350 355 360 ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat gag get ctg cac aac cac 1156

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Fils Glu Ala Leu His Asn His 365 370 375 380 tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa taatctaqaq 1202

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 gcgcgccaat. ta 1214

<210> 17 <211> 392 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0 > <223> Proteína de fusão TACI-Fc <40 0> 17

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 :i 0 15

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu lie His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30

Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35’ 40 45

Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr lie Cys Asn His Gin Ser 50 " 55 60

Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80

Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys lie Ser Cys Ala 85 90 95

Ser lie Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110

Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg -Arg Gin Arg 115 120 125

Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly 130 135 140

Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys 145 150 155 160

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 165 170 175

Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 180 185 190

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 195 200 205

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 210 215 220

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 225 230 235 240

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 245 250 255

Asp Trp Leu Asn. Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 260 265 270

Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 275 280 285

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 290 ~ 295 300

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 305 310 315 320

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 325 330 335

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 340 345 350

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 355 360 365

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn. His Tyr Thr Gin Lys 370 375 380

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 < 210 > 18 <211 > 1.Q70

<212 > ADK <213> Sequência artificial <220 > <223> Proteína cie fusão TACI-Fc <22 0>

<221> CDS <222> (17) . ., (1048) < 4 0 0 > 18

tattaggccg qccacc atg gat gca atg aag aga ggg etc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Giy Lew Cys Cys Val Leu 1 5 JO ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt teg etc age cag gaa ate cat gee 100

Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu lie Pis Ala 15 20 25 gag t'.tg aga ege ttc cgt aga get atg aga tee tgc ccc gaa gag cag 1-3 8

Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 33 10 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tee tgc aaa acc att tgc 196

Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr lie Cys -33 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gca gcc ttc tgc agg tea etc age 244

Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292

Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gcc tee ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 3-3 0 lie Ser Cys Ala Ser lie Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 388

Phe Cys Glu Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 110 115 120 ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tea gtc ttc etc ttc 436

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Giy Ala Pro- Ser Val Phe Leu Phe 125 130 135 140 ccc cca aaa ccc aag' gac acc etc atg ate tee egg ace cct gag gtc 484

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Gris Val 145 ' 150 155 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag tte 532

Thr Cys Val Val val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Gig Val Lys Phe 160 165 170 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 580

Asn Trp Tyr Val -Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 175 180 185 egg gag gag csg tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc 628 .Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 190 195 200 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 676

Val Leu His Gin .Asp Trp· Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 205 210 * 215 ’ 220 tee aac aaa gee etc cca tee tee ate gag aaa acc ate tee aaa gee 724

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala 225 230 235 aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee egg 772

Lys Gly Gin Pro -Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 240 ' 245 250 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age erg acc tgc ctg gtc aaa ggc 820

Asp Glu Leu Thr Lys .Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 255 260 265 tte tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 863

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 270 275 ' 280 gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ctg gac tee gac ggc tee 916

Glu Asn .Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu -Asp Ser A.sp Gly Ser 285 " 290 295 " 300 tte tte etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 964

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 305 310 " 315 ggg aac gtc tte tea tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aac cac 1012

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 320 325 330 tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa taatetagag 1058

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 335 340 gcgcgccaat ta 1070 <210 > 19 <211> 344

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína cie fusão TACI-Fc < 4 0 0 > 19

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ssr Lsu Ser Gin Glu lie His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30

Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr: Trp Asp Pro 35' 40 45

Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr lie Cys Asn His Gin Ser 50 55 60

Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 '?0 7 5 8 0

Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys He Ser Cys Ala 85 90 95

Ser He Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 'Thr Cys Fro Pro Cys Pro Ala Π5 120 12 5

Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Fro 130 135 140

Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 180 185 190

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 'val Leu Thr Val Leu His Gin 195 200 205

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 210 215 220

Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 225 230 235 240

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 245 250 255

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270

Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 ’ 300

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 3 0 5 310 315 32 0

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 325 330 335

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys A A Λ

-5 -4 U

<210> 20 < 211> 10 82 < 212 > ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <2 2 0 >

<221> CDS <222> (17) , . . (1060) <400> 20 tattaggccg gccacc atg gat qca atg aaq aga ggg etc tgc tgt qtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt teg etc age cag gaa ate cat gee 100

Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Sex Gin Glu lie His Ala 15' 20 25 gag ttg aga cqc ttc cgt aqa get atg aga tee tgc ccc gaa qaq cag 148

Glu Leu Arg Arg Phe Arg -Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt aec tgc atg tee tgc aaa ace att tgc 196

Tyr Tip Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met; Ser Cys Lys Thr lie Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag egc acc tgt. gca gcc ttc tgc agg tea etc age 244

Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Asia Ala Phe Cys Arg Ser: Leu Ser 65 70 ~ ' 75 tgc ege aag qaq cua ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292

Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tee acc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340 lie Ser Cys Ala Ser lie Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age gag ccc aaa tet tea gac aaa act 388

Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arq Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 110 ' 115 120 cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tea 436

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser 125 130 135 140 gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee egg 484

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 145 150 155 acc cct gag gtc aca tgc qtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct 532

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 160 165 Π0 gag gtc aaq ttc aac tgg ts.c gtg qae ggc gtg gag gtg cac aat gcc 580

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 175 180 185 aag aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc 628

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 190 195 200 age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 676

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu. Asn Gly Lys Glu Tyr 205 210 215 220 aag tgc aag gtc tee aac aaa gcc etc cca tee tee ate gag aaa acc 724

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr 225 230 235 ate tee aaa gee aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg 772 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 240 245 250 ccc cca. tee egg gat gag ctg acc aa.g aac cag gtc age ctg acc tgc 82 0

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 255 260 265 ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age 868

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Tie Ala Val Glu Trp Glu Ser 270 275 280 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ctg gac 916

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 285 290 295 300 tee gac ggc tec ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age 964

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat gag get 1012

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 320 325 330 ctg cac aac cac tac aeg cag' aag age etc tee ctg cct ccg' ggt aaa 1060

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 335 ‘ 340 345 taatetagag gcgcgccaat ta 1082 <210>21 < 211> 34 8

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0 > <223> Proteína de fusão TACI-Fc <400 > 21

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 lu I ,

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu lie His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30

Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45

Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr He Cys Asn His Gin Ser 50 55 60

Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 " " 70 75 ... ^

Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys lie Ser Cys Ala 85 90 ~ " 95

Ser He Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys A.la Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110

Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser A,sp Lys Thr His Thr Cys Pro 115 1Ξ0 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly AM a Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 180 185 190

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 195 200 205

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 210 215 22 0

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 225 230 235 240

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 245 250 255

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Girt Pro 275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 305 310 315 ’ 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 325 330 335

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345

<210> 22 < 211> 110 9 <212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Proteína de fusão TACI-Fc < 2 2 0 >

<221> CDS <222> (17) , . . (1090) <40 0 > 22 tattagqccg gccacc atg gat gca atg aag aqa gqg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu

15 1C ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt teg etc age cag gaa ate cat gee 100

Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu lie His Ala Í5 " 20 25 gag ttg aga ege ttc cgt aga get atg aqa tee tgc ccc gaa gag cag 148

Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt ace tgc atg tee tgc aaa acc att tgc 196

Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr He Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gca gcc ttc tgc agg tea etc age 244

Asn His Glia Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 J 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292

Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tee ate tgt. gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340 lie Ser Cys Ala Ser He Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac ett cca cca gag etc 388

Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asti Leu Pro Pro Gin Leu 110 115 120 agg gag cce aaa Let tea gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 436

Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 125 " 130 " 135 140 gca cct. gaa gee gag ggg gca ccg tea gtc ttc etc ttc cce cca aaa 484

Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 145 150 155 ccc aag gac acc etc atg ate tec egg acc cct gag gtc aca tgc gtg 532

Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

160 165 17C gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 580

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 175 160 185 gtg gac gqc gtg gag gtg cat. aac gee aag aca aag ccg egg gag gag 628

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Aid Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 190 195 200 cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac 676

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 205 210 215 220 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tee aac aaa 724

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 235 gee etc cca tee tee ate gag aaa acc cite tee aaa gee aaa ggg cag 772

Ala Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin 240 245 250 ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee egg gat gag ctg 320

Fro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 255 260 265 acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc. 868

Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 270 275 280 age qae ate gee gtg gag tgg gag age aat qgg cag ccq gag aac aac 916

Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 285 290 ^ 295 300 tac aag acc aeg cct ccc gtq ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc etc 964

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Sex Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 315 tac age aa.g etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc 1012

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 320 325 330 ttc tea tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aae cac tac aeg cag 1060

Phe- Ser Cys Ser Val Met His Gin Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 335 340 345 aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa t.aa tetagaggeg cgccaatta 1109

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys * 350 355

<2 10> 23 <211> 357 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <400> 23

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Girt Glu He His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30

Phe .Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Girt Tyr Trp .Asp Pro 35" 40 45

Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys The lie Cys Asn His Gin Ser 50 55 60

Gin .Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80

Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu .Arg Asp Cys He Ser Cys Ala 8 5 90 95

Ser He Cys Gly Girt His Pro Lys Girt Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110

Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Glu Pro Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 130 135 140

Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160

Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asrt Lys Ala Leu Pro Ser 225 230 235 240

Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Girt Pro Arg Glu. Pro 245 250 255

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg .Asp Glu Leu Thr Lys Asn. Gin 260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 275 " 280 " 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Girt Girt Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu. His Asrt His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys 355

<210> 24 <211> 311 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 Ο > <223> Proteína de fusão BAFF-R-Fc <400> 24

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Vai Gly Ala .Ala Vai Ala Ser 1 5 10 15

Thr Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 20 25 30

Thr Pro Cys Vai Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Vai Arg His Cys 35 40 45

Vai Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 50 55 ' 60

Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Gin Vai 65 70 75 80

Thr Asp Lys Ala Ala His Tyr Thr Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 85 90 95

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 100 105 110

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 115 120 125

Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 130 135 140

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 145 150 " 155 160

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 165 170 175

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 180 ’ " * 165 ’ 190

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 195 200 205

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 210 " 215 ' 220

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 225 230 " 235 240 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 245 250 255

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr: Ser 260 265 270

Lvs Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 275 280 285

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 290 295 300

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 25 < 211> 134 8

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <22 Ο >

<221> CDS <122;· (282) . , . (1034) < 4 Ο Ο > 2 5 ggtacgaggc ttcctagagg gactggaacc taattctcct gaggctgagg gagggtggag 60 ggtctcaagg caacgctggc cccacgacgg agtgccagga gcactaacag tacccttagc 120 ttgctttcct cctccctcct ttttattttc aagttccttt ttatttctcc ttgcgtaaca 180 accttcttcc cttctgcacc actgcccgta cccttacccg ccccgccacc tccttgctac 240 cccactettg aaaccacagc tgttggcagg gtccccagct c atg cca gcc tea t.ct 296

Met Pro Ala Sex Ser 1 5 cct ttc ttg eta gcc ccc aaa ggg cct cca ggc aac atg ggg ggc cca 344

Pro Phe Leu Lari Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly Asn Met Gly Gly Pro 1ϋ " 15 20 gtc aga gag ccg gca etc tea qtt gcc etc tgg ttg agt tgq ggg gca 392

Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp Leu Ser Trp Gly Ala 2 5 3 0 3 5 get ctg ggg gcc gtg get tgt gcc atg get ctg ctg acc caa caa aca 440

Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu Leu Thr Gin. Gin Thr 40 45 50 gag ctg cag age etc agg aga gag gtg age egg ctg cag ggg aca gga 483

Glu Leu Gin Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg Leu Gin Gly Thr Gly 55 60 65 ggc ccc tee cag aat ggg gaa ggg tat ccc tgg cag agt etc ccg gag 536

Gly Pro Ser Gin Asn Gly Glu Gly Tyr Fro Trp Gin Ser Leu Pro Glu 70 75 SO 85 cag agt tee gat gcc ctg gaa gcc tgg gag aat ggg gag aga tee. egg 584

Gin Ser Ser Asp Ala Leu. Glu Ala Trp Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg ”90 95 100 aaa agg aga gca gtg etc acc caa aaa cag aag aag cag cac tet gtc 632

Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gin Lys Gin Lys Lys Gin His Ser Val 105 110 115 ctg cac ctg get ccc act aac gcc acc tee aag gat gac tee gat gtg 680

Leu His Leu Val Pro lie Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val 120 125 130 aca gag gtg atg tgg caa cca get ctt. agg cgt ggg aga ggc eta cag 728

Thr Glu Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gin 135 140 145 gcc caa gga tat ggt gtc ega ate cag gat get gga gtt tat ctg ctg 776

Ala Gin Gly Tyr Gly Val Arg lie Gin Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu 150 155 160 165 tat age cag gtc ctg ttt caa gac gtg act ttc acc atg ggt cag gtg 824

Tyr Ser Gin Val Leu Phe Gin Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gin Val 170 175 180 gtg tet ega gaa ggc caa gga agg cag gag act eta ttc ega tgt ata 872

Val Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr Leu Phe Arg Cys He 135 190 195 aga aqt atg ccc tcc cac ccg gac egg gee tac aac age tgc tat age 920

Arg Ser Met Pro Ser Mis Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser 200 205 210 gca ggt gtc ttc cat tta cac caa ggg gat att ctg agt gtc ata act 968

Ala Gly Val Phe His Lea His Gin Gly Asp lie Leu Ser Val lie lie 215 220 " ' 225 ccc egg gca agg geg aaa ett aac etc tet cca cat gga acc ttc ctg 1016

Pro Arg Ala Arg Ala Ays Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu 2 30 2 35 2 40 245 ggg ttt gtg aaa ctg tga ttgtgttata aaaagtggct cccagcttgg 1064

Gly Phe Val Lys Leu * 2 50 aagaccaggg tggqtacata ctggagacag ccaagagctg agtatataaa ggagagggaa 1124 tgtgcaggaa cagaggcatc ttcctgggtt tggctccccg ttcctcactt ttcccttttc 1184 attcccaccc cctagacttt gattttacgg atatettget tctgttcccc atggagctcc 1244 gaattcttgc gtgtgtgtag atgaggggcg ggggacgggc gccaggcatt gttcagacct 1304 ggtcggggcc cactggaaqc atccagaaca gcaccaccat etta 1348

<210> 26 <211> 250 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <40 0 > 26

Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Giy Pro Pro Gly 1 5 10 15

Asti Met. Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Gly Ala .A.1.a Leu Gly ..A 1 a Val Ala Cys Ala Met Ala Leu 35 " 4 θ' " 45

Leu Thr Gin Gin Thr Glu Leu Gin Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg 50 55 60

Leu Gin Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gin Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp 65 70 75 So"

Gin Ser Leu Pro Glu Gin Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn 85 90 95

Gly Glu Arq Ser Arq Lys Arq Arq Ala Val Leu Thr Gin Lys Gin Lys 100 " " 105 lio

Lys Gin His Ser Val Leu His Leu Val Pro lie Asn Ala Thr Ser Lys 115 120 125

Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg 130 135 140

Gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin Gly Tyr Gly Val Arg lie Gin Asp Ala 145 " 150 ’ ” ’ 155 160

Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gin Val Leu Phe Gin Asp Val Thr Phe 165 170 175

Thr Met. Gly Gin Val Val Ser Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gin Glu Thr 180 185 190

Leu Phe Arq Cys lie Arq Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tvr 195 ” 200 205

Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gin Gly Asp He 210 215 220

Leu Ser Val He He Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 225 230 235 240

His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu 245 ’ ' 250

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição * WO 9839361 A [0001] [0112] * WO 0202641 A [0002] [0119] * US 20060034852 A [0002] * WO 050000351 A [0002] * WO 03035846 A [0002] * WO 0216312 A [0002] * US 4816567 A [0038] [0039] * US 5500362 A [0045] * US 5821337 A [0045] * US 530672 Ã [0066] * US 5654173 A [0068] * EP 0036776 A [0072] * US 4551433 A [0072] * US 4837148 A [0072] * US 4929555 A [0072] ® EP 0244234 A [0072] * WO 9100357 A [0072] * US 4745051 A [0072] * EP 0127839 A [0072] * EP 0155476 A [0072] * US 4399216 A [0073] * US 4767704 A [0073] * US 4657866 A [0073] * US 4927762 A [0073] ® US 4560655 A [0073] * WO 90103430 A [0073] * WO 8700195 A [0073] * US RE3 098 5 E [0073] * US 5641670 A [0075] * US 5733761 A [0075] * WO 9915650 A [0075] * WO 9308829 A [0085] * WO 9404690 A [0087] * US 5731168 A [0087] * US 4676980 A [0088] * WO 9100360 A [0088] * WO 92200373 A [0088] * EP 03089 A [0088] * WO 9727317 A [0101] * WO 0040716 A [0112] [0114] * WO 0185782 A [0112] * WO 0187979 A [0112] * WO 0181417 A [0112] * WO 0224909 A [0113] * WO 0314294 A [0113] * WO 0238766 A [0113] * WO 05075511 A [0114] * WO 05000351 A [0116] * WO 03055979 A [0119] * US 3773919 A [0124]

Docnra^ntos da não citados na á^SGricão xx*. VxP VxV vHvnnxiVM A «χ* «χχ iixí ^Λ«χχ «x «X*x9» «χχ Jwx«xx» vVxvm «» «x» «xx VxV «xWt 3x9 «x «<xin ν^·χ»χ* 3x9 «xX xW» cxx» «te* U<Vr * SMITH et al, The INF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins. Activation, Costimulation and Death, 1994, vol. 76, 959-62 [0001] * COSMAN. Stern Cells, 1994, vol. 12, 440-55 [0001] * GRAS et al. Int. Immunol., 1995, vol. 17, 1093-106 [0001] * HATZOGLOU et al. J. Immunol., 2000, vol. 165, 1322-30 [0001] * VON BULOW ; BRAM. Science, 1997, vol. 228, 138-41 [0001] * THOMPSON et a!. Science, 2001, vol. 2 93, 2108-11 [0001] * SHU et al. J. Leukoc. Biol., 1999, vol. 65, 680-683 [0001] * HAHNE et al. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, 1185-1190 [0001] * DILLON et al. Nat. Rev. Drug Dis., 2006, vol. 5, 235- 246 [0002] * BAKER et al. Arthritis Rheum, 2003, vol. 48, 3253-3265 [0002] [0119] * ROSCHKE et al. J. Immunol., 2002, vol. 169, 4314-4321 [0003] * ROSCHKE ¥ et al. J. Immunology, 01 January 2 0 02, vol. 169, 4314-4321 [0004] ® MALIN V JOM8SOM et al. J. Clin. Immunology, 01 May 2005, vol. 25 (3), 189-201 [0004] * DARIDON et al. Autoimmunity Reviews, 01 February 2008, vol. 7 (4), 267-271 [0004] ® SEYLER THGRSTEN M et al. J. Clin. Investigation,

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Claims (6)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método in vitro de predizer a probabilidade dum indivíduo ter lúpus eritematoso sistémico (LES) pela deteção do aumento dos níveis séricos de heterotrímero (HT) BLyS/APRIL dum indivíduo, que compreende: (a) medição do nível de HT numa amostra de soro de teste do indivíduo em que a deteção de níveis de heterotrímero BLyS/APRIL compreende o contacto da amostra de soro com um anticorpo imobilizado que se liga especificamente a uma das subunidades de HT e subsequentemente contactando as moléculas ligadas com um anticorpo detetável que se liga especif icamente à outra subunídade de HT, em que a ligação a ambos os anticorpos indica a presença de heterotrímero (HT) BLyS/APRIL; (b) comparar esse nível ao nível de HT numa amostra de soro dum controlo saudável; e (c) determinar se o nível de HT na amostra de soro de teste aumentou em comparação com o nível na amostra de soro de controlo; em que os referidos níveis aumentados de HT estão associados com lúpus eritematoso sistémico (LES).

2. Um método in vitro para predizer a probabilidade dum paciente responder a um tratamento com fármacos para lúpus eritematoso sistémico (LES), em que o tratamento com fármacos compreende a inibição de BLyS e/ou APRIL, que compreende: determinar o nível de heterotrímero (HT) BLyS/APRIL numa amostra de soro do paciente, em que a deteção dos níveis de heterotrímero (HT) BLyS/APRIL compreende o contacto da amostra de soro com um anticorpo imobilizado que se liga especif icamente a uma das subunidades de HT e subsequentemente contactando as moléculas ligadas com um anticorpo detetável que se liga especificamente à outra subunidade de HT, em que a ligação a ambos os anticorpos indica a presença de heterotrímero (HT) BLvS/APRIL; em que a presença de níveis elevados de HT na amostra de soro do paciente em comparação com uma amostra de soro de controlo é preditivo da probabilidade do paciente responder ao tratamento com fármacos para a condição patológica.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida determinação é feita utilizando um ensaio baseado em contas.

4. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido tratamento com fármacos compreende um antagonista HT que compreende uma região do domínio extracelular de TACI que compreende os aminoácidos 30-110 da SEQ ID NO: 2 fundida na estrutura a uma porção Fe duma imunoglobulína.

5. O método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido antagonista HT é um antagonista BLyS.

6. O método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido antagonista HT é um antagonista APRIL.