ES2578526T3

ES2578526T3 - Concentraciones séricas de heterotrímeros BLyS/APRIL y su uso en métodos diagnósticos

Info

Publication number: ES2578526T3
Application number: ES09739435.7T
Authority: ES
Inventors: Stacey R. Dillon; Brandon J. Harder
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2008-05-01
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2029-04-20
Also published as: DK2291657T3; US9146242B2; EP2291657B1; PT2291657T; EP2291657A1; US20130330339A1; JP2011523037A; CA2720651C; AU2009241442B2; SI2291657T1; WO2009134633A1; AU2009241442A1; CA2720651A1; JP5902478B2; HUE028784T2; US20090274711A1; PL2291657T3

Abstract

Un método in vitro para predecir la probabilidad de un individuo de tener lupus eritematoso sistémico (LES) mediante la detección de concentraciones elevadas del heterotrímero (HT) BLyS/APRIL en el suero de un individuo, que comprende: (a) medir la concentración de HT en una muestra de suero de ensayo del individuo, en donde la detección de concentraciones elevadas del heterotrímero (HT) BLyS/APRIL comprende poner en contacto la muestra de suero con un anticuerpo inmovilizado que se une específicamente a una de las subunidades del HT y, posteriormente, poner en contacto las moléculas unidas a un anticuerpo detectable que se une específicamente a la otra subunidad del HT, en donde la unión a ambos anticuerpos indica la presencia del heterotrímetro (HT) BLyS/ APRIL; (b) comparar esa concentración con la concentración de HT en una muestra de suero de un control sano y (c) determinar si la concentración de HT en la muestra de suero de ensayo se incrementa en comparación con la concentración en la muestra de suero control; en el que dichas concentraciones elevadas de HT están asociadas al lupus eritematoso sistémico (LES).

Description

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ejemplo, 10 % o menos de la unión mostrada al polipéptido de interés). Dicha unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión del anticuerpo específico al compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados. En general, los anticuerpos de la invención que se unen a un polipéptido APRIL o BLyS específico con una afinidad de unión de 107 mol/l o más, preferiblemente 108 mol/l o más se dice que se unen específicamente al polipéptido APRIL o BLyS específico. En general, un anticuerpo con una afinidad de unión de 106 moles/litros o menos no es útil, ya que no se unirá a un antígeno a un nivel detectable usando la metodología convencional que se utiliza actualmente.

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en comparación con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que generalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en el sentido de que son sintetizados mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Nature,

256: 495 (1975) o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (véase, por ej., la patente US4.816. 567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al, Nature, 352:624628 (1991) y Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente US4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:68516855 (1984)). Los métodos para fabricar anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica.

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana.

En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (RDC) del receptor se sustituyen por residuos de una RDC de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (RM) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la RDC o marco importadas. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y maximizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones RM son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones RM pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión. El número de estas sustituciones de aminoácidos en la RM son generalmente no más de 6 en la cadena H y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al, Nature, 321:522525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZADO en el que la región de unión al antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, por inmunización de monos macacos con el antígeno de interés. Métodos de fabricación de anticuerpos humanizados son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las bibliotecas de expresión en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al. J. Mol. Biol.,

222:581 (1991). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos. Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):8695 (1991). “Fragmentos funcionales” de los anticuerpos de unión de la invención son aquellos fragmentos que retienen la unión

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aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, más habitualmente al menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, a aproximadamente 25 aminoácidos y hasta completar el marco de lectura abierto del gen. Después de la introducción del ADN, las células que contienen la construcción se pueden seleccionar mediante un marcador seleccionable, se lleva a cabo la expansión de las células expandidas y a continuación se utilizan para la expresión.

Los polipéptidos APRIL pueden expresarse en procariotas o eucariotas de acuerdo con formas convencionales, dependiendo de la finalidad de la expresión. Para la producción a gran escala de la proteína, se puede usar las células del hospedador de expresión un organismo unicelular, tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores de baculovirus o células de un organismo superior, tal como vertebrados, particularmente mamíferos, por ejemplo, células COS 7, HEK 293, CHO, oocitos de Xenopus, etc. En algunas situaciones, es deseable expresar una molécula de ácido nucleico APRIL polimórfico en células eucarióticas, donde la proteína APRIL polimórfica se beneficiará del plegamiento nativo y de las modificaciones posttraduccionales. Los péptidos pequeños también pueden sintetizarse en el laboratorio. Los polipéptidos que son subconjuntos de la secuencia completa APRIL pueden usarse para identificar e investigar partes de la proteína importantes para la función.

Sistemas de expresión específicos de interés incluyen bacterias, levaduras, células de insectos y sistemas de expresión derivados de células de mamíferos. A continuación se proporcionan sistemas representativos de cada una de estas categorías:

Bacterias. Los sistemas de expresión en bacterias incluyen aquellos descritos en Chang et al., Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281:544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; EP 0 036,776; patente US4.551.433; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:2125 y Siebenlist et al., Cell (1980)

20:269. Levaduras. Los sistemas de expresión en levaduras incluyen aquellos descritos en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990)8:135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376; patentes US4.837.148 y US4.929.555; Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284289; Tilburn et al., Gene (1983) 26:205221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:14701474; Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479; EP 0 244,234; and WO 91/00357. Células de insecto. La expresión de genes heterólogos en insectos se realiza como se describe en la patente US4.745.051; Friesen et al., “The Regulation of Baculovirus Gene Expression”, en: The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler, ed.); EP 0 127,839; EP 0 155,476 y Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:765776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonell et al., Gene (1988) 73:409; Maeda et al., Nature (1985) 315:592594; LebacqVerheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8844; Miyajima et al., Gene (1987) 58:273 y Martin et al., DNA (1988) 7:99. En Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6:4755, Miller et al., Generic Engineering (1986) 8:277279 y Maeda et al., Nature (1985) 315:592594 se describen numerosas cepas de baculovirus y variantes y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas.

Células de mamíferos. La expresión en mamíferos se realiza como se describe en Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:6777, Boshart et al., Cell (1985) 41:521 y patente US

4.399.216. Otras características de la expresión en mamíferos son facilitadas como se describe en Ham y Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes y Sato, Anal. Biochem.(1980) 102: 255, patentes US4.767.704, US4.657.866, US4.927.762, US4.560.655, WO 90/103430, WO 87/00195 y patente US RE N.º 30.985.

Cuando se usa cualquiera de las células hospedadoras anteriores u otras células hospedadoras u organismos apropiados para replicar y/o expresar los polinucleótidos o ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, el ácido nucleico replicado resultante, ARN, proteína expresada o polipéptido, se describe en la presente memoria como un producto de la célula u organismo hospedadores. El producto se recupera por cualquier medio apropiado conocido en la técnica.

Una vez identificado el gen correspondiente a un polinucleótido seleccionado, su expresión puede ser regulada en la célula para la que el gen es nativo. Por ejemplo, un gen endógeno de una célula puede ser regulado por una secuencia reguladora exógena insertada en el genoma de la célula en la ubicación suficiente para al menos mejorar la expresión del gen en la célula. La secuencia reguladora puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación homóloga, como se divulga en las patentes US5.641.670 y 5.733.761 o puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación no homóloga, como se describe en el documento WO 99/15650. Como tal, también se describe en la presente memoria la producción de proteínas ABRIL sin manipulación del propio ácido nucleico que codifica, sino en su lugar a través de la integración de una secuencia reguladora en el genoma de célula que ya incluye un gen que codifica la proteína deseada, como se describe en los documentos de patente anteriormente incorporados.

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Por ejemplo, el Colegio Americano de Reumatología ha elaborado 11 criterios para el diagnóstico del LES, que abarcan todo el espectro clínico del LES en los aspectos de la piel, sistémicos y de pruebas de laboratorio. Estos criterios incluyen exantema malar, erupción discoide, sensibilidad a la luz del sol, úlceras orales, artritis, serositis, inflamación del riñón y del sistema nervioso central, alteraciones de la sangre y la presencia de anticuerpos antinucleares. Un paciente debe cumplir con cuatro de estos criterios con el fin de ser clasificado como un paciente con LES. (Tan et al. (1982) Arthritis Rheumatol. 25:127177). El LES se suele confirmar mediante pruebas, incluyendo, pero sin limitarse a, análisis de sangre para detectar anticuerpos antinucleares; análisis de sangre y orina para evaluar la función renal; pruebas del complemento para detectar la presencia de bajos concentraciones de complemento que a menudo están asociadas a LES; la velocidad de sedimentación globular (VSG) o la proteína Creactiva (PCR) para medir los niveles de inflamación; radiografías para evaluar el daño pulmonar y electrocardiogramas para evaluar el daño cardíaco.

Control de los efectos del tratamiento farmacológico

El control de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre las concentraciones de proteína HT (por ejemplo, la modulación de la activación de la transcripción) se puede aplicar no sólo en el cribado básico de fármacos, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente determinada mediante un ensayo de cribado como se describe en la presente memoria para reducir de las concentraciones de proteína HT, puede controlarse en ensayos clínicos de sujetos que muestran una disminución en la expresión de genes HT o en las concentraciones de proteína. En tales ensayos clínicos, puede usarse la expresión o actividad de un gen HT, y preferiblemente, otros genes que han sido implicados en, por ejemplo, un trastorno asociado a concentraciones de proteína HT, como una “lectura” o marcadores del fenotipo de una célula en particular, en el presente caso, los linfocitos B.

En algunas realizaciones, la presente memoria describe un método para controlar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro fármaco) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra preadministración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de una proteína o ARNm HT, en la muestra preadministración; (iii) obtener una o más muestras postadministración del sujeto, (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína o ARNm HT en las muestras postadministración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína o ARNm HT en la muestra preadministración con la proteína o ARNm HT en la muestra o muestras postadministración y (vi) alterar la administración del agente al sujeto en consecuencia. De acuerdo con tal realización, la expresión o actividad del HT se puede usar como un indicador de la eficacia de un agente, incluso en ausencia de una respuesta fenotípica observable.

El nivel de expresión basal de HT en el tejido diferente puede ser determinado mediante el análisis de muestras de tejido de individuos tipificados para la presencia o ausencia de un polimorfismo específico. Se puede usar cualquier método conveniente, por ejemplo, ELISA, RIA, etc. para la cuantificación de las proteínas, transferencia Northern u otro análisis de hibridación, RTPCR cuantitativa, etc. para la cuantificación del ARNm. La expresión específica en tejido se correlaciona con el genotipo.

La alteración de la expresión del HT en respuesta a un modificador se determina mediante la administración o la combinación del modificador candidato con un sistema de expresión, por ejemplo, animal, célula, ensayo de transcripción in vitro, etc. Se determina el efecto del modificador sobre la transcripción del HT y/o las concentraciones de ARNm en el estado estacionario. Al igual que con los niveles de expresión basales, las interacciones específicas en el tejido son de interés. Las correlaciones se realizan entre la capacidad que tiene un modificador de la expresión para afectar las concentraciones de HT y la presencia de los polimorfismos proporcionados. Se puede examinar un panel de diferentes modificadores, tipos de células, etc., con el fin de determinar el efecto en una serie de diferentes afecciones.

Métodos de tratamiento

La presente invención proporciona un método de tratamiento de un individuo clínicamente diagnosticado con una afección asociada a concentraciones elevadas de HT en suero. Los métodos generalmente comprenden analizar una muestra biológica para medir las concentraciones de HT y comparar estas concentraciones con las presentes en los controles sanos. A continuación, se selecciona el plan de tratamiento que sea más eficaz para los individuos diagnosticados clínicamente de tener una afección asociada a concentraciones elevadas de HT, tales como una enfermedad autoinmunitaria y, a continuación, el paciente es tratado en consecuencia. Por lo tanto, la invención proporciona además un método para predecir la probabilidad que tiene un paciente de responder a un tratamiento farmacológico para una afección asociada a concentraciones elevadas de HT, que comprende determinar la expresión en el paciente de un gen de HT, en el que la presencia de concentraciones elevadas de HT está asociada a una enfermedad autoinmunitaria, tal como LES, y es predictiva de la probabilidad que tiene el paciente de responder a un tratamiento farmacológico para la afección.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona métodos para adaptar el tratamiento terapéutico de un individuo con la expresión de HT de acuerdo con la respuesta al fármaco de ese individuo. La farmacogenómica

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• Ejemplo de rendimiento del ensayo:

Heterotrímero pg/ml Esperado Observado: %CV Estadísticos Error relativo

Patrones: 25000 8333 2778 926 309 103 34 27062 8039 2931 874 316 110 32 2,0% 0,4% 3,0% 3,6% 1,4% 13,0% 13,9% 8,2% 3,5% 5,5% 5,6% 2,5% 7,2% 7,3%

CC1 CC2: 7500 500 7259 455 12,3% 5,5% 3,2% 8,9%

Los valores aceptables para el patrón y los controles de calidad son +/25 % de los valores esperados. Se espera que el LdD del ensayo sea 100 pg/ml con muestras analizadas puras (suero 100 %). El ensayo se puede realizador con precisión a 34 pg/ml.

El patrón utilizado en este ensayo es un HT que contiene 2 subunidades de APRIL y 1 subunidad de BLyS. Los valores absolutos del HT nativo serán diferentes si esta molécula es relativamente poco común en el suero del paciente, sin embargo, en este momento no hay evidencia de que exista sesgo alguno para cualquier combinación trimérica en particular.

EJEMPLO 2: MEDICIÓN DE HT EN SUEROS DE PACIENTES Y DE CONTROLES SANOS

El dominio de trimerización Nterminal ZymoZipper permitió la producción de heterotrímeros BLyS/APRIL recombinantes (HTr), que se utilizaron como patrón para desarrollar un inmunoensayo basado en perlas para cuantificar el HT nativo en suero humano tal como se describe en el Ejemplo 1. Este ensayo, junto con los ensayos ELISA específicos de BLyS y APRIL se utilizaron para medir estos 3 ligandos en sueros de controles sanos (CS; n = 79) y de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES; n = 30) y artritis reumatoide (AR; n = 29) (ver Figuras 1 y 2). La actividad biológica del HTr se comparó con la de rBLyS y rAPRIL en un ensayo de señalización de 4 h usando células Jurkat transfectadas con TACI con un gen informador NFkB/luciferasa y en un ensayo de proliferación de linfocitos B primarios humanos de 4 días.

Significativamente más pacientes con LES que los CS tenían HT detectable en el suero (70 % frente a 14 %, p <0,0001, prueba exacta de Fisher) y el 24 % de los pacientes con AR tenían HT detectable. En esta cohorte, las concentraciones medias de HT en suero eran 177 pg/ml (LES), 64 pg/ml (AR) y 66 pg/ml (CS). En el ensayo de TACIJurkat (véase el Ejemplo 4), la señalización del HTr es similar a la de BLyS o APRIL. En el ensayo de linfocitos B (véase el Ejemplo 3), los HTr son inductores menos potentes que los ligandos homotriméricos (valores CE50: 0,02 nM para BLyS, 0,17 nM para APRIL y 4,06 nm para HT). Esto probablemente refleja la expresión predominante de BAFFR, al que nuestro HTr se une mal, en los linfocitos B circulantes. Atacicept y BCMAIg neutralizan la actividad de los 3 ligandos en estos ensayos, mientras que BAFFRIg exhibe poca o ninguna inhibición de la actividad del HTr. Nuestros datos confirman que el HT nativo se encuentra elevado en los pacientes con enfermedades autoinmunitarias y demuestran que los HTr son biológicamente activos. Si el HT nativo tiene un papel distinto al de sus homólogos homotriméricos queda por determinar. Atacicept inhibe la bioactividad de las 3 formas de ligando, lo cual puede resultar importante en el tratamiento clínico de la enfermedad autoinmunitaria.

En un segundo grupo de pacientes con LES, incluyendo 72 pacientes con LES y 42 controles sanos. Las concentraciones de BLyS y APRIL se determinaron por ELISA. Las concentraciones de HT se midieron en 36 pacientes y 25 controles usando un ensayo basado en Luminex. Los HT fueron detectados en más pacientes que en los controles (72 % frente a 32 % χ2= 0,0019).

EJEMPLO 3: ENSAYO DE PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS B

Un vial que contiene 1 x 108 células mononucleares de sangre periférica (CMSP) recogidas por aféresis congeladas se descongeló rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se resuspendió en 25 ml de medio de linfocitos B (medio RPMI1640, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % bovino, Lglutamina 5%, Pen/Strep 5 %) en un tubo de 50 ml. Las células se ensayaron para determinar la viabilidad usando azul de tripano (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). A continuación los linfocitos B CD19 + se aislaron por selección positiva usando microperlas recubiertas con antiCD19 (Miltenyi Biotech). Las células recubiertas se aislaron a continuación en una columna MACS LS (Miltenyi

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Claims

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