JP2003518138A - テザード・リガンド及び使用方法 - Google Patents

テザード・リガンド及び使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、受容体リガンド相互作用を分析するための方法、試薬及び装置、細胞及び細胞集団における受容体発現のプロフィールの決定、並びに診断及び薬物スクリーニング方法を提供する。本発明は、リガンド・ドメイン、スターク・ドメイン、及び任意に、固定化ドメインを有する固定化テザード・リガンド融合タンパク質を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、受容体−リガンド相互作用を特徴付け、そのような相互作用のモジ
ュレータを同定し、かつ細胞及び細胞集団の受容体発現プロフィールを特徴付け
るための試薬及び方法に関する。本発明は生体医用科学において用途が見出され
る。
【０００２】関連出願との相互参照 本願は、2000年3月3日出願の U.S.S.N. 60/186626 に対する優先権を主張する
。
【０００３】発明の背景 細胞間の伝達は多細胞生物における成長、分化、代謝、及び生物学的応答（例
えば、免疫応答）の生成に関与する基本プロセスである。しばしば、細胞−細胞
シグナル伝達には細胞外受容体又は細胞接着分子が介在する。これらの膜関連分
子は他のタンパク質、例えば、ペプチドホルモンのような可溶性因子、細胞外マ
トリックス、及び他の細胞によって提示される細胞表面分子と相互作用する。幾
つかの場合において、シグナル伝達は細胞−細胞接触（例えば、細胞上の２つの
表面タンパク質間の接触）を含む。そのような相互作用の例は、Ｔリンパ球表面
上のＴ細胞受容体と抗原提示細胞表面上のＭＨＣ／抗原複合体との結合である。
異なるタイプの細胞−細胞シグナル伝達には、標的細胞上の特異的受容体との相
互作用によって標的細胞の活性の変化を導く可溶性ポリペプチドが介在する。可
溶性ポリペプチドが介在する細胞−細胞シグナル伝達の実例かつ重要な例は、哺
乳動物系におけるケモカインの活性である。
【０００４】 ケモカインは、炎症応答、白血球輸送、血管形成、並びに細胞の遊走及び活性
化に関連する他の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすサイトカインの
一クラスである。化学走性及び炎症のメディエータとして、ケモカインは病理学
的状態において役目を果たす。例えば、ケモカインＭＣＰ−１の濃度は、他の関
節疾患の患者よりも関節リュウマチの患者の滑液において高い。
【０００５】 公知のケモカインは、典型的には、システインモチーフの配置に基づいて４つの
サブファミリーのうちの１つに割り当てられる。例えば、いわゆるアルファ−ケ
モカインにおいては、４つのシステイン（アミノ末端から始まる）のうちの最初
の２つが介在性アミノ酸によって分離される（すなわち、モチーフＣ−Ｘ−Ｃを
有する）。ベータ−ケモカインは最初の２つのシステインの間に介在性アミノ酸
が存在しないことを特徴とする（すなわち、モチーフＣ−Ｃを有する）。より小
さいガンマ−ケモカイン・ファミリーは単一のＣ残基（ガンマ）を特徴とする。
デルタ−ケモカイン・ファミリーは３つの残基で分離されたシステインの対を特
徴とする（すなわち、モチーフＣＸ３Ｃを有する）。唯一のＣＸ３Ｃケモカイン
（フラクタルカイン）は、長ムチン様スターク（stalk）につながれたケモカイ
ンドメインを含む１型膜タンパク質である。フラクタルカイン、別名ニューロタ
クチンは、長ムチン様スタークにつながれたアミノ末端にケモカインドメインを
含んでいる。ケモカインに関する最近の総説については、Ward et al., 1998, I
mmunity 9:1-11 及び Baggiolini et al., 1998, Nature 392:565-568、並びに
それらに引用される参考文献を参照のこと。
【０００６】 幾つかのケモカインの活性（例えば、前遊走（promigratory）効果）には、標
的白血球表面上の細胞表面受容体のアレーへの結合が介在する。これらの受容体
は７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体クラス（代わりに７ＴＭ又はＧＰＣＲと
呼ばれる）のものである。Ｃ−Ｃケモカインの幾つかの７回膜貫通Ｇタンパク質
共役型受容体がクローン化されている：ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−
２、ＭＣＰ−３、及びＭＩＰ−５を認識するＣ−Ｃケモカイン受容体−１（Neot
e et al., 1993. Cell, 72:415-415）；ＭＣＰ１、２、３及び４又は５の受容体
であるＣＣＲ２：ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２、３、４、ＭＩＰ−５及びエオタキ
シンの受容体であるＣＣＲ３；ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳの
受容体であるＣＣＲ５；ＣＭＤＣ又はＴＡＲＣの受容体であるＣＣＲ４；ＬＡＲ
Ｃの受容体であるＣＣＲ６；並びにＳＬＣ及びＭＩＰ−３βの受容体であるＣＣ
Ｒ７（Sallusto el al., 1998, Immunol. Today 19:568 及び Ward et al., 199
8, Immunity 9:1-11 において概説されている）。
【０００７】 生物学的機能における受容体（例えば、ケモカイン受容体）とそれらのリガン
ドとの相互作用の重要性のため、そのような相互作用を特徴付けるための迅速か
つ有効な方法の必要性が存在する。
【０００８】発明の要約 一側面において、本発明はアレー状に組織された複数の異なる固定化テザード
（tethered）リガンド融合タンパク質を有するアッセイ装置を提供し、ここで、
リガンド−スターク融合タンパク質はリガンド・ドメイン及びスターク・ドメイ
ンを含む（「アッセイ装置」）。一態様において、リガンド−スターク融合タン
パク質はリガンド・ドメイン、中間スターク・ドメイン、及び固定ドメインを有
する（「アッセイ装置」）。一態様において、リガンド・ドメイン及びスターク
・ドメインは天然タンパク質においては会合しない。様々な態様において、固定
化テザード・リガンド融合タンパク質はムチン誘導スターク配列、フラクタルカ
イン・ムチン反復領域配列、及び／又はケモカインをコードするリガンド・ドメ
インを含む。
【０００９】 別の側面において、本発明はテザード・リガンド融合タンパク質を提供し、こ
こで、リガンド・ドメインはケモカイン配列以外である。
【００１０】 別の側面において、本発明は受容体とリガンドとの間の相互作用を同定するた
めの方法であって、受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を固
定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ細胞とテザード・リガ
ンド融合タンパク質との結合を検出することによる方法を提供し、ここで、細胞
の融合タンパク質への結合は受容体と融合タンパク質のリガンド・ドメインに相
当するリガンドとの相互作用に相関する。一態様において、テザード・リガンド
は前記アッセイ装置上に固定される。様々な態様において、細胞は組換え受容体
（例えば、オーファン受容体）を発現する。一態様において、細胞はケモカイン
受容体を発現する。一態様においては、受容体と２つ以上のリガンドとの相互作
用が検出される。
【００１１】 別の側面において、本発明は受容体とリガンドとの間の相互作用のモジュレー
タを同定するための方法であって、受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発
現する細胞を試験化合物の不在下で固定化テザード・リガンド融合タンパク質と
接触させ、かつ細胞の固定化テザード・リガンド融合タンパク質への結合を測定
し、受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の存在
下で固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ細胞の固定化テ
ザード・リガンド融合タンパク質への結合を測定し；並びに結合のレベルを比較
することによる方法を提供し、ここで、試験化合物の存在下における細胞の結合
の減少はその試験化合物が受容体と該融合タンパク質のリガンド・ドメインに相
当するリガンドとの相互作用の阻害剤であることを示し、試験化合物の存在下に
おける細胞の結合の増加はその試験化合物が受容体と融合タンパク質のリガンド
・ドメインに相当するリガンドとの相互作用のエンハンサであることを示す。一
態様において、テザード・リガンドは前記アッセイ装置上に固定されている。一
態様において、受容体はケモカイン受容体である。
【００１２】 別の側面において、本発明は細胞集団中の細胞における受容体発現のプロフィ
ールを検出するための方法であって、細胞集団を固定化テザード・リガンド融合
タンパク質と接触させ、かつテザード・リガンド融合タンパク質への細胞集団の
細胞の結合を検出することによる方法を提供し、ここで、テザード・リガンド融
合タンパク質への細胞集団中の細胞の結合は融合タンパク質のリガンド・ドメイ
ンに相当するリガンドに結合する受容体の発現に相関する。一態様において、テ
ザード・リガンドは前記アッセイ装置に固定されている。一態様において、接触
工程はその集団を複数の異なる融合タンパク質と接触させることを含み、かつ検
出工程はゼロ、１又は２以上の融合タンパク質への細胞の結合を検出する。一態
様において、この集合は不均一であり、例えば、集団は滑液、脳脊髄液、気管支
肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又は血液から得られる。一態様において、この方法は、
アレー内の各テザード・リガンド融合タンパク質への結合のレベルを定量するこ
と、又はアレーの各セクタで結合する細胞を特徴付けること（例えば、免疫染色
により）を含む。
【００１３】 別の側面において、本発明は診断方法を提供する。この方法は、疾患を患うこ
とが疑われる患者から細胞集団を得る工程、その集団について受容体プロフィー
ルを決定する工程、及び該受容体プロフィールをその疾患状態のプロフィール特
性と比較する工程を含む。一態様において、受容体プロフィールの決定は、細胞
集団を固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ該集団の細胞
によって結合されるテザード・リガンド融合タンパク質を同定し、それにより受
容体プロフィールを決定することによって行う。一態様において、テザード・リ
ガンドは前記アッセイ装置上に固定される。様々な態様において、この方法を決
定することは、例えば免疫染色により、アレーの各セクタでの細胞の結合を定量
し、又はアレーの各セクターで結合する細胞を特徴付けることも含む。様々な態
様において、疾患は炎症もしくはアレルギー性疾患、又は自己免疫疾患である。
様々な態様において、集団は滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又
は血液から得られる。
【００１４】 別の側面において、本発明は、患者に対する薬物又は治療の効果を決定するた
めの方法であって、患者に由来する細胞集団の受容体プロフィールの第１の決定
を行い、薬物又は治療を患者に施し、患者に由来する細胞集団の受容体プロフィ
ールの第２の決定を行い、並びに得られた受容体プロフィールを比較して患者に
おける受容体発現細胞に対する薬物又は治療の効果を決定することによる方法を
提供する。一態様において、この決定は、該細胞集団を固定化テザード・リガン
ド融合タンパク質と接触させ、かつ該集団の細胞が結合するアレー化テザード・
リガンド融合タンパク質のサブセットを同定し、それにより受容体プロフィール
を同定することによって行う。一態様においては、テザード・リガンドは前記ア
ッセイ装置上に固定されている。様々な態様において、この方法を決定すること
は、例えば免疫染色により、アレーの各セクタでの細胞の結合を定量し、又はア
レーの各セクターで結合する細胞を特徴付けることも含む。様々な態様において
、集団は滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又は血液から得られる
。
【００１５】 別の側面において、本発明は受容体とリガンドとの間の相互作用のモジュレー
タを同定するための方法であって、受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発
現する細胞を試験化合物の存在下において固定化テザード・リガンド融合タンパ
ク質と接触させ、かつ融合タンパク質への結合のレベルを決定し、受容体又はそ
れらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の不在下において固定化
テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ；かつ融合タンパク質への結合の
レベルを決定し、並びに結合のレベルを比較することによる方法を提供し、ここ
で、リガンド・スターク融合タンパク質はリガンド・ドメイン、中間スターク・
ドメイン、及び固定化ドメインを含み、並びに試験化合物の存在下における細胞
の結合の減少はその試験化合物が受容体と融合タンパク質のリガンド・ドメイン
に相当するリガンドとの相互作用の阻害剤であることを示し、かつ試験化合物の
存在下における細胞の結合の増加はその試験化合物が受容体と融合タンパク質の
リガンド・ドメインに相当するリガンドとの相互作用のエンハンサであることを
示す。一態様において、リガンド・ドメイン及びスターク・ドメインは天然タン
パク質においては会合しない。一態様において、スターク・ドメインはリガンド
に対してカルボキシ末端であり、かつ固定化ドメインはスターク・ドメインに対
してカルボキシ末端である。
【００１６】 別の側面において、本発明は本明細書に記載される方法のいずれかにおけるテ
ザード・リガンド融合タンパク質の使用を提供する。
【００１７】詳細な説明 １．定義 本発明の実施において読者を補助するため以下の定義を提供する。本明細書で
用いられる場合： 「受容体」という用語は当該技術分野における通常の意味を有し、第２のタン
パク質を特異的に結合するタンパク質を指す。通常（すなわち、幾つかの態様に
おいて）、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを特徴とする膜
間連タンパク質である。このような受容体は「膜関連受容体」と呼ばれる。他の
態様においては、「受容体」という用語は他のタイプのポリペプチド結合性タン
パク質、例えば、接着分子、可溶性結合性タンパク質を指すのに用いられる。本
明細書で用いられる場合、「受容体」という用語が免疫グロブリンを指すことが
ないのは明らかであろう。
【００１８】 「リガンド」という用語は受容体タンパク質に結合するペプチド又はポリペプ
チドを指す。典型的には、リガンドは細胞−細胞シグナル伝達又は他の細胞もし
くは細胞外マトリックスへの細胞の接着に関与する。
【００１９】 「特異的結合」という用語は、２つの分子、例えば、リガンド及び受容体の間
の結合であって、多くの他の様々な分子の存在下でさえも別の特定の分子（受容
体）と会合するタンパク質（リガンド）の能力、すなわち、分子の不均一混合物
中で他者に対する１つの分子の優先的な結合を示す能力を特徴とする結合を指す
。受容体に対するリガンドの特異的結合は、検出可能に標識されたリガンドの受
容体への結合の、過剰の非標識リガンドの存在下における減少によっても立証さ
れる。
【００２０】 「オーファン受容体」という用語は、それに対する天然同族リガンドが知られ
ていない推定受容体ポリペプチドを指す。典型的には、オーファン受容体は、タ
ンパク質又は遺伝子の配列及び構造に基づく公知受容体に対する相同性（配列同
一性）に基づいて識別される。
【００２１】 「融合タンパク質」という用語は、本明細書で用いられる場合、複合ポリペプ
チド、すなわち、通常は一緒になって単一のアミノ酸配列に融合することはない
２つ以上（例えば、３つ）の異なるポリペプチドから構成される単一の連続アミ
ノ酸配列を指す。融合タンパク質は、一般には、組換え核酸法により、すなわち
、組換え遺伝子融合産生物（融合は第１ポリペプチド領域をコードするセグメン
ト及び第２ポリペプチド領域をコードするセグメントを含む）の転写及び翻訳の
結果として、又は当該技術分野において公知の化学合成法によって調製すること
ができる。したがって、例えば、単一の天然タンパク質（例えば、フラクタルカ
イン）は融合タンパク質ではない。
【００２２】 「組換え」という用語は、細胞に関して用いられる場合、細胞が異種核酸を複
製するか、又は異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発
現することを示す。組換え細胞は、その細胞の未変性（非組換え）形態内に見出
されない遺伝子を含むことができる。組換え細胞は、その細胞の未変性形態に見
出される遺伝子であって、（例えば、受容体の発現を高めるため）人工的な手段
によって修飾され、かつ再導入された遺伝子を含むこともできる。また、この用
語は、細胞に内在性の核酸であって、その細胞から除去することなく修飾されて
いる核酸を含む細胞をも包含する；このような修飾には、遺伝子置換、部位特異
的突然変異、及び関連技術によって得られるものが含まれる。
【００２３】 「組換え発現カセット」又は単に「発現カセット」という用語は、核酸構築体
であって、そのような配列に適合する宿主内で構造遺伝子の発現をもたらし得る
核酸要素で組換え的又は合成的に産生される核酸構築体である。発現カセットは
、少なくともプロモーターを、及び任意に転写終止シグナルを含む。典型的には
、組換え発現カセットは転写しようとする核酸（例えば、所望のポリペプチドを
コードする核酸）、及びプロモーターを含む。本明細書に記載されるように、発
現をもたらすのに必要であるか、又はそれに役立つさらなる要素を用いることも
できる。転写終止シグナル、エンハンサ、及び遺伝子発現に影響を及ぼす他の核
酸配列を発現カセットに含めることもできる。「発現ベクター」は、用いられる
発現系に必要な挿入コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクタ
ーである（例えば、発現カセットを含むベクター）。
【００２４】 「組換えポリヌクレオチド」又は「組換えポリペプチド」は、それぞれ、２種
類以上の供給元核酸又はポリペプチドに由来する核酸又はアミノ酸配列を含む非
天然ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。
【００２５】 「ケモカイン」（「ＣＫ」と略す）という用語は、炎症応答、白血球輸送、血
管形成、並びに細胞の遊走及び活性化に関連する他の生物学的プロセスに関与す
るサイトカインの一クラスである。公知ケモカインは、典型的には、システイン
モチーフの配置に基づいて４つのサブファミリー（α、β、γ、及びδ）のうち
の１つに割り当てられる。ケモカインの非包括的なリストが表２に記載される。
【００２６】 「受容体結合可能タンパク質」という用語は、ポリペプチド・リガンドを参照
する場合、しばしば完全長天然タンパク質よりは短い、同族受容体（すなわち、
天然リガンドを結合する受容体）に結合するのに十分なリガンドの一部を指す。
【００２７】 ２．序論 本発明は、受容体−リガンド相互作用のようなタンパク質−タンパク質相互作
用の分析に有用な試薬、装置、及び方法を提供する。本発明は、本明細書に記載
されるように、そのような受容体−リガンド相互作用のモジュレータを同定する
ための試薬及び方法、並びに他の方法を提供する。一態様において、本発明はケ
モカイン間、例えば、ヒトケモカイン、及び公知もしくはオーファン・ケモカイ
ン受容体の間の相互作用を同定し、かつ特徴付けるのに用いられる。
【００２８】 本発明の一側面においては、以下に詳細に記載されるように、受容体を発現す
る細胞を１種類以上のテザード・リガンドと接触させ、存在するのであれば、特
異的結合を検出及び分析する。このような接触、検出及び分析は、時折、「追求
（interrogation）」と呼ばれる。本発明によって用いられる「テザード・リガ
ンド」は、少なくとも２つ、通常は少なくとも３つの異なるドメイン：リガンド
・ドメイン、スターク・ドメイン、及び任意に、固定化ドメインを有する融合タ
ンパク質である。細胞は予め定義された受容体タンパク質を発現する組換え細胞
（オーファン受容体を発現する細胞を含む）であってもよく、又は生物学的資源
（例えば、患者又は非ヒト動物に由来する組織）から単離された細胞であっても
よい。
【００２９】 受容体を発現する細胞と本発明のテザード・リガンド融合タンパク質との結合
を検出するアッセイは様々な方法で行うことができる。
【００３０】 一態様においては、１種類以上のテザード・リガンドと１種類以上の受容体発
現細胞との相互作用を検出し、かつ特徴付ける。特には、この相互作用に対する
１種類以上の試験化合物の効果をアッセイすることができる。
【００３１】 例えば、本発明のテザード・リガンド融合タンパク質（すなわち、単一種）を
表面（例えば、スライド、プレート、ビーズ、ディップスティックのような固体
表面）上に固定し、試験化合物又は細胞集団と接触させることができる。
【００３２】 本発明の別の態様においては、複数（すなわち、少なくとも３つ、典型的には
少なくとも１０、しばしば少なくとも１５）の異なるテザード・リガンド（すな
わち、異なるリガンド・ドメインを有する）をアレー状に固定する。このアレー
を、テザード・リガンドのリガンド・ドメインを特異的に結合することが知られ
るか、又はそれが疑われる受容体を発現する組換え細胞によって追求するができ
る。これらの細胞とアレーのテザード・リガンドとの相互作用に対する試験化合
物の効果を決定することができる。（診断、スクリーニング、又は他の目的で）
このアレーを天然細胞の集団によって追求し、その集団の受容体プロフィールを
決定することもできる。特には、本発明のテザード・アレーはオーファン受容体
のリガンド結合プロフィールを決定するのに有用である。
【００３３】 本発明は様々なタンパク質−タンパク質相互作用の特徴付けにその用途が見出
される。特には、本発明は７回膜貫通受容体（例えば、ケモカイン受容体）と推
定リガンド（例えば、ケモカイン）との相互作用の特徴付けに有用である。しか
しながら、下記から明らかなように、本発明は７回膜貫通受容体の特徴付けに限
定されるものではない。
【００３４】 ３．テザード・リガンド 前述のように、本発明の方法及び装置は「テザード・リガンド」を用いる。テ
ザード・リガンドはリガンド・ドメイン、スターク・ドメイン、及び通常は、固
定化ドメインを有する融合タンパク質である。スターク・ドメインはリガンド・
ドメインと固定化ドメインとの間に位置する（すなわち、これは「中間部」であ
る）。スターク・ドメイン配列は他のドメインの一方もしくは両方と隣接してい
てもよいが、典型的には、少なくとも幾つかの追加（例えば、リンカー）配列が
介在する。典型的には、リガンド・ドメインは融合タンパク質のアミノ末端側に
位置し、固定化ドメインはカルボキシ末端側に位置する（それらの間にスターク
・ドメインを伴う）。図１は例示テザード・リガンドの図を示す。
【００３５】 代替態様においては、リガンド・ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端
側に位置し、固定化ドメインがアミノ末端側に位置する。後者の配向はリガンド
・ドメインが細胞内タンパク質、又は膜貫通タンパク質の細胞内ドメインの配列
を有する場合に有用である。
【００３６】 本発明のテザード・リガンドの産生において有用な技術（例えば、融合タンパ
ク質を含む組換えタンパク質のクローン化及び発現）は当該技術分野において公
知であり、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory 及び1999及び2
000補遺を含む、Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, G
reene Publishing and Wiley-lnterscience, New York に記載されている。例え
ば、様々な（例えば、少なくとも２種類の）、融合タンパク質のコード化に用い
られるアミノ酸コーディングセグメントを互いにイン・フレームでクローン化し
て融合タンパク質をコードする。
【００３７】 テザード・リガンドの構造及び産生をより詳細に説明する。
【００３８】 ３．１リガンド・ドメイン テザード・リガンドのリガンド・ドメインは関心のあるタンパク質又はペプチ
ド・リガンドの配列を有し、それは細胞外リガンドであっても細胞内リガンドで
あってもよい。
【００３９】 細胞外リガンドは膜関連受容体の細胞外ドメインが天然に結合するポリペプチ
ド・リガンドである；例示的な細胞外ドメインにはケモカイン（ケモカイン受容
体が結合する）；他のサイトカイン、インターフェロン（インターフェロン受容
体が結合する）、ドーパミン（ドーパミン受容体が結合する）が含まれる。多く
の他のものが当業者に明らかではあるが、例示的な細胞外受容体を表１に列挙す
る。テザード・リガンドの特に有用なクラスはケモカインに相当するリガンド・
ドメインを有するものである。ケモカイン・ドメインを有するテザード・リガン
ドは、時折、「スタルコカイン」と呼ばれ、例えば、リガンド・ドメイン内にＴ
ＡＲＣ配列を有するテザード・リガンドについては「ＴＡＲＣ−スタルコカイン
」と呼ばれる。
【００４０】 ケモカイン及びサイトカインは当該技術分野において公知である。例示的なサ
イトカインを表２に列挙する。これらの、及び他のサイトカインを説明する参考
文献は R&D Systems Catalog (1999) 及び (2000) R&D Systems Inc., 614 McKi
nley Place N.E. MN 55413, http:/www.mdsystems.com のＲ＆Ｄオンライン・カ
タログ（例えば、1999年10月10日）（これらの両者は全ての目的で参照すること
によって組み込まれる）；CFB（Cytokine Facts Book, 1994, Academic Press L
td.), Chemokine Facts Book, 1997, Academic Press Ltd.（全ての目的で参照
することによって組み込まれる）、及び GeneBank タンパク質配列データベース
（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）において提供されている。 リガンド・ドメインが、それが対応する細胞内又は細胞外リガンドの完全な配
列を必ずしも含む必要がないことは理解されるであろう；様々な態様において、
リガンド・ドメインは天然リガンドの少なくとも１つの受容体結合可能部分を含
む。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】 幾つかの代替態様においては、「受容体」は膜関連受容体の細胞外ドメインで
はなく、異なるタンパク質結合性部分、例えば、細胞内タンパク質のタンパク質
結合性ドメイン又はタンパク質ドメインである。例えば、本発明において用いら
れる「受容体−リガンド対」はＣＣＲ１の細胞内ドメイン（「受容体」）及びＧ
タンパク質（「リガンド」）であり得る。この場合、「リガンド」はＧタンパク
質ドメインであり、スターク・ドメイン（例えば、フラクタルカイン・ムチン領
域配列）との融合タンパク質として発現する。「受容体」はＣＣＲ１の細胞内ド
メインであり、これは単一膜貫通受容体（例えば、キナーゼ・ドメインが欠失し
たＥＧＦ受容体）とのアミノ末端融合タンパク質として発現し得る。これは、Ｃ
ＣＲ１細胞内ドメインが、例えば、細胞外（すなわち、細胞の表面上）に発現す
ることを可能にする。したがって、Ｇタンパク質テザード・リガンドをその表面
上に固定化することにより、ＣＣＲ１細胞内ドメインを発現する細胞を追求する
ことができる。細胞内リガンド（細胞内タンパク質を結合するタンパク質、又は
細胞内タンパク質ドメイン）の別の例は、Ｇタンパク質結合グルタミン酸受容体
を結合するＧタンパク質である。
【００４４】 ３．２スターク・ドメイン テザード・リガンド融合タンパク質のスターク・ドメインは、部分的には、そ
のテザード・リガンド融合タンパク質が固定されている基体の上方のかなりの距
離に上昇させることによってリガンド・ドメインを提示するように機能をする。
特定の機構によって結びつけようとするものではないが、表面の上方のかなりの
距離にリガンドを提示することは受容体発現細胞において提示される受容体との
リガンドの結合を増加させるものと信じられる。 典型的には、融合タンパク質のスターク・ドメインの長さは少なくとも約５０
アミノ酸残基、少なくとも約７５アミノ酸残基、少なくとも約１００アミノ酸残
基、しばしば少なくとも約１５０残基、頻繁には少なくとも約２００残基である
。典型的には、スターク・ドメインは約２００残基ないし５００残基であり、通
常約２００残基ないし３００残基である。一般には、ポリペプチドのリガンド・
ドメインはそのテザード・リガンドが固定されている表面から少なくとも約２０
ｎｍ（例えば、約２０ｎｍないし約６０ｎｍ）、又は少なくとも約３０ｎｍ離し
て（すなわち、その上方に）提示される。態様においては、リガンド・ドメイン
・ペプチドは表面の上方約３０−４０ｎｍに提示される。リガンド・ドメインの
伸長の測定は、典型的には、重金属シャドーイングの後に電子顕微鏡によって行
われる（例えば、Fong et al., 2000, J Exp Med 188:1413-19 を参照）。
【００４５】 リガンド・ドメインを表面から離して上昇させることに加えて、スターク・ド
メインの柔軟性がリガンド・ドメインに様々な方向を取らせ、それが受容体との
強力な相互作用の可能性を高め、他のリガンドの固定化又は提示方法、例えば、
標準ＥＬＩＳＡと比較して予期せぬ利点を有するものと信じられる。典型的には
、スターク・ドメインはリガンドを上昇させるのに十分な剛性を有するが、リガ
ンド・ドメインに様々な方向を取らせる柔軟性を有するように選択される。
【００４６】 一態様において、スターク・ドメインはフラクタルカイン・ポリペプチドから
誘導される（Bazan et al., 1997, Nature 385:640-644；WO 97/27299 も参照の
こと）。フラクタルカインは、長ムチン様スタークにつながれたケモカイン・ド
メインを含む天然１型膜タンパク質である。ヒト・フラクタルカインｃＤＮＡ（
Genbank 受付番号 U84487）は２４残基の推定シグナルペプチドを有する３９７
残基の膜タンパク質、７６残基のケモカイン・ドメイン、Ｏ−グリコシル化セリ
ン及びトレオニン残基のモチーフに富む１７変性ムチン様反復を含む２４１残基
のスターク領域、１９残基の膜貫通セグメント、及び３７残基の細胞質ドメイン
をコードする。
【００４７】 したがって、例示的態様においては、スターク領域は表３Ａ又は３Ｂに示され
る配列を有する。他の態様においては、スターク領域はフラクタルカイン・スタ
ーク領域に由来する少なくとも１つのムチン反復セグメント、例えば、表４に示
されるヒト配列を含む。関連する態様において、スターク領域はフラクタルカイ
ン・スターク領域の少なくとも１０、少なくとも２５、又は少なくとも５０の隣
接残基、例えば、表３Ａ又は３Ｂに示されるものを有する（例えば、それらの部
分配列又は相互作用）。
【００４８】表３Ａ ヒト・フラクタルカイン・ムチン反復領域 IGEVKPRTTPAAGGMDESVVLEPEATGESSSLEPTPSSQEAQRALGTSPELPTGVT GSSGTRLPPTPKAQDGGPVGTELFRVPPVSTAATWQSSAPHQPGPSLWAEAKTS EAPSTQDPSTQASTASSPAPEENAPSEGQRVWGQGQSPRPENSLEREEMGPVP AHTDAFQDWGPGSMAHVSVVPVSSEGTPSREPVASGSWTPKAEEPIHATMDPQR LGVLITPVP（配列番号３）
【００４９】表３Ｂ ヒト・フラクタルカイン・ムチン反復配列残基１００−３３６ GGTFEKQIGEVKPRTTPAAGGMDESVVLEPEATGESSSLEPTPSSQEAQRALGTS PELPTGVTGSSGTRLPPTPKAQDGGPVGTELFRVPPVSTAATWQSSAPHQPGPSL WAEAKTSEAPSTQDPSTQASTASSPAPEENAPSEGQRVWGQGQSPRPENSLERE EMGPVPAHTDAFQDWGPGSMAHVSVVPVSSEGTPSREPVASGSWTPKAEEPIHA TMDPQRLGVLITPVPDAQA（配列番号４）
【００５０】表４ ムチン反復ドメイン １．ＩＧＥＶＫＰＲＴＴＰ （配列番号５） ２．ＧＧＭＤＥＳＶＶＬＥＰ （配列番号６） ３．ＴＧＥＳＳＳＬＥＰＴＰ （配列番号７） ４．ＬＧＴＳＰＥＬＰＴＧ （配列番号８） ５．ＴＧＳＳＧＴＲＬＰＰＴＰ （配列番号９） ６．ＶＧＴＥＬＦＲＶＰＰＶＳ （配列番号１０） ７．ＡＡＴＷＱＳＳＡＰＨＱ （配列番号１１） ８．ＰＧＰＳＬＷＡＥＡＫＴＳ （配列番号１２） ９．ＥＡＰＳＴＱＤＰＳＴ （配列番号１３） １０．ＱＡＳＴＡＳＳＰＡＰ （配列番号１４） １１．ＶＷＧＱＧＱＳＰＲＰ （配列番号１５） １２．ＳＬＥＲＥＥＭＧＰＶＰ （配列番号１６） １３．ＡＨＴＤＡＦＱＤＷＧ （配列番号１７） １４．ＰＧＳＭＡＨＶＳＶＶＰ （配列番号１８） １５．ＥＧＴＰＳＲＥＰＶＡ （配列番号１９） １６．ＳＧＳＷＴＰＫＡＥＥＰ （配列番号２０） １７．ＱＲＬＧＶＬＩＴＰＶＰ （配列番号２１）
【００５１】 関連する態様において、テザード・リガンドのスターク領域は非ヒト種、例え
ば、マウス（Lloyd et al, 1997, Nature 387:611-617 を参照；Genbank受付番
号ＡＦ０１０５８６）及び他の哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット
、ウサギ、及び非ヒト霊長類）のフラクタルカインに由来する配列を有する。
【００５２】 関連する態様において、スターク・ドメインは他のムチン・ファミリーのメン
バー、例えば、ＭＵＣ型ムチンから誘導される。ＭＵＣ型ムチンは、多数がグリ
コシル化され、かつ呼吸器管、消化管、及び生殖管の上皮において発現する構造
的に関連する分子、例えば、ＭＵＣ１（GenBank受付番号ＡＦ１２５５２５）、
ＭＵＣ２（Ｌ２１９９８）、ＭＵＣ３（ＡＦ１１３６１６）、ＭＵＣ４（ＡＪ０
００２８１）、ＭＵＣ５ＡＣ（Ｕ８３１３９）、ＭＵＣ５Ｂ（ＡＪ００１４０２
）、ＭＵＣ６（Ｕ９７６９８）、ＭＵＣ７（Ｌ１３２８３）、ＭＵＣ８（Ｕ１４
３８３）、ＭＵＣ９（オビダクチン）（ＡＷ２７１４３０）のファミリーである
。他の態様においては、スターク・ドメインはＭＡｄＣＡＭ−１、ＧｌｙＣＡＭ
−１、ＣＤ３４に由来する配列（例えば、Girard & Springer 1995；Van Klinke
n et al., 1988, Anal Biochem 265:103-16 を参照）、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セ
レクチン、もしくはＬ−セレクチン、又はウイルス糖タンパク質スパイク（例え
ば、ウイルス起源、例えば、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒト免疫不全、又
はタバコモザイクウイルスの糖タンパク質）に由来するコンセンサス反復を有す
る。特には、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼタンパク質（受付番号
０９１７４４）、とりわけ、アミノ酸３６ないし９０を含む（すなわち、HFKQYE
CSSPPNNQVIPCQPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLVEYRNWSKP（配列番号２２）及びそ
れらの連鎖を含む）高頻度可変性スターク領域がスタークにとって固定化リガン
ドを提示するのに有用である。
【００５３】 さらなるスターク配列を、下記実施例１に記載されるアッセイではあるが実施
例１のフラクタルカイン・ドメインの代わりにその新規スターク配列を用いるア
ッセイを用いて（本発明の方法において用いるための適合性について）試験する
ことができる。簡単に述べると、新規の適切なスターク領域配列を同定するため
、潜在的な提示スタークをコードする配列を発現ベクター［例えば、pcDNA3.1/M
yc-His(-)B（InvitrogenTM Corp、Carlsbad、ＣＡ）もしくは他の適切なベクタ
ー（例えば、pcDNA3.1/Myc-His(-)A/C（InvitrogenTM Corp.））又は類似のベク
ター］に、例えば、EcoRI連結ＰＣＲ断片としてクローン化し、アミノ末端にＥ
ＬＣリガンドを、かつカルボキシ末端に6xHis配列を有する融合タンパク質を形
成する。すなわち、スターク・エンコーディング配列を上流の、ＤＬＣ−スタル
コカインのフラクタルカイン・ドメインに用いられたものと同様の位置（すなわ
ち、ＥＬＣ結合モチーフとポリヒスチジン固定化ドメインとの間）に挿入する。
例えば実施例１に記載されるように、得られるプラスミドを哺乳動物細胞（例え
ば、２９３細胞）内で発現させ、テザード・リガンド・タンパク質を発現させる
。その後、テザード・リガンドを、以下に記載されるように、ＣＣＲ１０を発現
する細胞の結合に介在する能力についてアッセイする。このアッセイの変形は当
業者には明らかであろう。
【００５４】 ３．３固定化ドメイン 様々な態様において、固体基体へのタンパク質の固定化を促進するため、融合
タンパク質は固定化ドメインを有する。しばしば、固定化ドメインは短い（すな
わち、１０残基未満）エピトープ・タグ（すなわち、抗体、典型的には、モノク
ローナル抗体によって認識される配列）、例えば、ポリヒスチジン（Bush et al
, 1991, J. Biol Chem 266:13811-14）、ＳＥＡＰ（Berger et al, 1988, Gene
66:1-10)、又はＭ１及びＭ２フラグ（例えば、米国特許第5,011.912号；第4,851
,341号；第4,703,004号；第4,782,137号を参照）である。本発明の幾つかの態様
において、テザード・リガンドは別個の固定化ドメインを持たない。その代わり
に、スターク・ドメインが基体に直接結合し、そのスターク・ドメインは抗スタ
ーク（すなわち、ムチン）配列抗体により、又は幾つかの他の固定化方法によっ
て固定される。
【００５５】 ３．４テザード・リガンドの産生 前述のように、融合タンパク質を構築及び発現させるための方法は公知である
。融合タンパク質は、一般には、Ausubel et al., 前出、Kroll et al., 1993,
DNA Cell Biol. 12:441、及び Imai et al., 1997, Cell 91:521-30 に記載され
ている。
【００５６】 本発明のテザード・リガンド融合タンパク質は、（１）所望のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列をコードするベクター（例えば、プラスミド、
ファージ又はファージミド）を構築し、（２）そのベクターを適切な発現系（例
えば、原核動物、昆虫、哺乳動物、又は細胞非含有発現系）に挿入し、（３）融
合タンパク質を発現させ、かつ（４）任意に、融合タンパク質を精製することに
よって作製する。
【００５７】 （１）一態様において、テザード・リガンド融合タンパク質の発現は、コーデ
ィング配列を適切な発現系（すなわち、用いられる発現系に必要な挿入コーディ
ング配列の転写及び翻訳に必要な要素、例えば、エンハンサ、プロモーター、転
写ターミネータ、複製起点、適切な開始コドン（例えば、メチオニン）、読み取
り枠、及び翻訳調節シグナル（例えば、リボソーム結合部位、終止コドン及びポ
リアデニル化配列）を含むベクター）に挿入することを含む。用いられるベクタ
ー系及び宿主に応じて、いかなる数の適切な転写及び翻訳要素（構成及び誘導プ
ロモーターを含む）をも用いることができる。
【００５８】 テザード・リガンド融合タンパク質のコーディング配列は、本明細書の他所に
記載されるように、リガンド、スターク及び固定化ドメインを含む。各ドメイン
のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは当該技術分野において公知の様
々な方法で得ることができる；典型的には、これらのポリヌクレオチドは、熟練
者によって決定され、又は、より頻繁には、公に入手可能な（例えば、GenBank
により）配列に基づいて設計されるプライマーを用いる、クローン化プラスミド
、ｃＤＮＡライブラリ、及びＲＮＡの逆転写によって産生されるｃＤＮＡのＰＣ
Ｒ増幅によって得られる。典型的には、融合構築体の産生におけるクローン化及
び操作を促進するため、これらのプライマーはリンカー領域（例えば、制限部位
を含む配列）を含む。リガンド、スターク、及び固定化領域に対応するポリヌク
レオチドはイン・フレームで結合して融合タンパク質コーディング配列を産生す
る。
【００５９】 本発明のテザード・リガンド・タンパク質は分泌タンパク質又は非分泌タンパ
ク質として発現させることができる。好ましくは、融合タンパク質を分泌させる
。天然リガンドがシグナルペプチド（例えば、ケモカイン・リガンド）を含む場
合、分泌は融合遺伝子内にシグナル配列エンコーディングＤＮＡを含めることに
よって容易に達成することができる。その代わりに、リガンドが自然状態では分
泌しない場合、異種又は人工シグナルペプチドを融合タンパク質に含める（例え
ば、Luil et al, 1993, PNAS USA, 90:8957-61 を参照）。
【００６０】 （２）テザード・リガンド融合タンパク質ベクターは様々な方法によって細胞
（例えば、、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物細胞）に導入することができる。
本発明の核酸発現ベクター（典型的には、ｄｓＤＮＡ）は公知法、例えば、塩化
カルシウム形質転換（細菌系用）、電気穿孔法、リン酸カルシウム処理、リポソ
ーム介在形質転換、注入及び微量注入、バリスティック法、ビロゾーム、免疫リ
ポソーム、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウ
イルス構造タンパク質ＶＰ２２（Elliot and O'Hare, Cell 88:223）への融合、
ＤＮＡの作用物質増強取り込み、及び当該技術分野において公知の他の方法によ
って選択された宿主に移すことができる。前出の Ausubel を参照のこと。
【００６１】 （３）テザード・リガンドの発現に適する様々な発現系が当該技術分野におい
て公知である。有用な細菌発現系には、大腸菌（E.coli）、桿菌（例えば、枯草
菌）、他の腸内細菌（例えば、サルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナ
ス種）又は他の細菌宿主（例えば、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptoc
occus cremoris）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）、
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ロイコ
ノストック・シトロボルム（Leuconostoc citrovorum）、ロイコノストック・メ
センテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルス・アシドフィ
ルス（Lactobacillus acidophilus）、乳酸菌（Lactobacillus lactis）、ビフ
ィドバクテリウム・ビフィズム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテ
リウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、及びビフィドバクテリウム・ロン
ガム（Bifidobacterium longum））が含まれる。原核生物において有用なテザー
ド・リガンド融合タンパク質発現構築体には、組換えバクテリオファージ、プラ
スミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターが含まれ、典型的には、プロモーター配
列を含む。例証的なプラスミドは誘導性プロモーター、例えば、lacプロモータ
ー、Bluescript7ファージミド（Stratagene、La Jolla、ＣＡ）もしくはpSport1
（Gibco BRL）のハイブリッドlacZプロモーター；ファージ・ラムダ・プロモー
ター系；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；及びptrp-lacハイブリッド
等を含む。細菌発現構築体は、任意に、リボゾーム結合部位及び転写終止シグナ
ル調節配列を含む。発現に有用な特定のベクターの実例には、例えば、pTrcHis2
（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）が含まれる。
【００６２】 テザード・リガンド融合タンパク質が酵母において発現する場合、プラスミド
及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを含む多くの適切なベクターが利用可能
である。ベクターは、典型的には、記述されるように、発現制御配列、例えば、
構成もしくは誘導性プロモーター（例えば、アルファ因子、アルコールオキシダ
ーゼ、ＰＧＨ、及び３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素）、並び
に複製起点、終止配列等を含む。ピッチア（Pichia）において用いるのに適する
ベクターには、pPICZ、His6/pPICZB、pPICZalpha、pPIC3,5K、pPIC9K、pA0815、
pGAP2A、B及びC、pGAP2alphaA、B、及びC（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）並び
に当該技術分野において公知であるか、又は開発される多くの他のものが含まれ
る。一態様においては、ベクターHis6/pPICZB（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）
を酵母ピッチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるHis6−テザード・リ
ガンド融合タンパク質の発現に用いる。サッカロミセス属において有用なベクタ
ーの例はpYES2（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）である。
【００６３】 テザード・リガンド融合タンパク質の発現のために本発明によって提供される
他の発現系は昆虫系である。好ましい系はバキュロウイルス・ポリヘドリン・プ
ロモーターを用いる。そのような系の１つにおいては、スポドプテラ・フルギペ
ルダ細胞又はトリコプルシア（Trichoplusia）幼生において外来遺伝子を発現さ
せるのにオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体
病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いる。関心のある遺伝子をコード
する配列をウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリン遺伝子にクローン化し
、ポリヘドリン・プロモーターの制御下におくことができる。例えばテザード・
リガンド融合タンパク質をコードする、配列の挿入の成功はポリヘドリン遺伝子
を不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次に、この
組換えウイルスをＳ．フルギペルダ細胞又はトリコプルシア幼生の感染に用い、
次いで、そこでテザード・リガンド融合タンパク質配列を発現させる（一般的な
方法については、Smith et al., 1983, J. Virol., 46:584；Engelhard et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-7 を参照）。バキュロウイルスの発現
に有用なベクターには、pBlueBacHis2A、B及びC、pBlueBac4.5、pMelBacB並びに
当該技術分野において公知であるか、又は開発される多くの他のものが含まれる
。昆虫細胞において有用なテザード・リガンド融合タンパク質発現構築体の実例
が下記実施例６に示される。
【００６４】 本発明は、哺乳動物及び哺乳動物細胞における発現系も提供する。前述のよう
に、多量のテザード・リガンド融合タンパク質ポリペプチドを産生させるために
テザード・リガンド融合タンパク質ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞（例えば、
ヒト細胞）において発現させることができ、これは当該技術分野において公知で
あり、かつ下記§５．１．１に記載されるものが含まれる。
【００６５】 最適発現時間は、分泌されたタンパク質を（例えば。通常のエピトープ・タグ
、例えば、ポリヒスチジンを用いる）検出用ウェスタンブロット分析によって分
析することにより好都合に決定される。
【００６６】 （４）分泌されたテザード・リガンド融合タンパク質を細胞培地から精製する
ことが時折望ましいものであり、一般には、非分泌タンパク質は使用前に精製す
る必要がある。精製は様々な方法を用いて行うことができ、この方法には、例え
ば、ポリヒスチジン・トラクト（tract）（例えば、Ｈｉｓ６）を含む癒合タン
パク質の金属キレート・アフィニティクロマトグラフィー、プロテインＡドメイ
ンもしくは断片（これは、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にする）、及び
ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製システム（Immunex Corp、Seattle、ＷＡ）
において用いられるドメインが含まれる。
【００６７】 融合タンパク質はあらゆる適切な条件（例えば、凍結）下で貯蔵することがで
き、かつ完全性を保存することができ、例えば、保存された幾つかのスタルコカ
インは長期貯蔵及び反復凍結・解凍に感受性であるように思われた。過剰の分解
を回避するため、タンパク質溶液を等分し、−２０℃又は−８０℃で長期間貯蔵
した。スタルコカインを含む上清にプロテアーゼ阻害剤を添加することで分解の
レベルが低下し、品質が高まった。
【００６８】 ３．４．１活性アッセイ 所望であれば、融合タンパク質を試験してそれが単離リガンドの生物学的活性
を保持することを確認することができる。例えば、ケモカイン・リガンドの場合
、実施例に記載されるように、テザード・リガンドを用いて（例えば、固定化の
前に）標準結合及び化学走性アッセイを行うことができる。
【００６９】 ４．固定化及びアレーの調製 ４．１基体上への固定化 幾つかの態様においては、本発明のテザード・リガンド（例えば、スタルコカ
イン）を固体表面上に固定する。テザード・リガンドを結合させる基体は様々な
形態、例えば、マイクロタイターディッシュ、試験管、ディップスティック、微
量遠心管、ビーズ、回転可能なディスク等のいずれであってもよい。適切な材料
にはガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ＰＶＣ、ポリプロピレン、
プロスチレン等）、タンパク質、紙、炭水化物、及び他の固体支持体が含まれる
。用いることができる他の材料にはセラミック、金属、非金属、半導体材料、セ
メント等が含まれる。
【００７０】 前述のように、融合タンパク質をアレーとして組織化する。「アレー」という
用語は、本明細書で用いられる場合、固定された融合タンパク質の順序付けられ
た配置を指し、そこでは特定の異なる融合タンパク質（すなわち、異なるリガン
ド・ドメインを有する）が基体上の異なる予め決定された部位に位置する。アレ
ー上の特定の融合タンパク質の位置は既知であるため、その位置への受容体結合
性細胞の結合はその細胞が提示する受容体（１つもしくは複数）及び融合タンパ
ク質のリガンド（例えば、ケモカイン）ドメインの特異的結合に相関し得る。
【００７１】 ビーズ上の（個々の、又は群をなしての）融合タンパク質の固定化は別の特に
有用なアプローチである。一態様においては、個々のテザード・リガンド融合タ
ンパク質をビーズ上に固定し、同族受容体を発現する細胞に結合させ、得られる
複合体を未結合細胞から分離する。一態様においては、識別可能なビーズの混合
物を用いる。識別可能なビーズは、サイズ、磁気特性、色（例えば、ＦＡＣＳを
用いて）又はアフィニティ・タグ（例えば、プロテインＡでコートしたビーズは
ＩｇＧアフィニティ法を用いることによりプロテインＡでコートしていないビー
ズから分離することができる）に基づいて互いに分離することができるビーズで
ある。一態様によると、各々の識別可能なビーズをリガンド融合タンパク質の種
又は特定の組合せと会合させる。特定のテザード・リガンド融合タンパク質に結
合する細胞を決定することができる；同様に、試験化合物（すなわち、結合のア
ゴニスト及びアンタゴニスト）の効果を決定することができる。
【００７２】 ４．２固定化のための基体及び方法 タンパク質を固定する方法は当該技術分野において公知であり、共有結合及び
非共有結合法が含まれる。方法の選択は、部分的には、選択される基体及び検出
システムに依存することは理解されるであろう。
【００７３】 ４．２．１非共有結合固定化 適切な固定化法の１つは抗体介在固定化である。この方法によると、テザード
・リガンドの「固定化ドメイン」の配列に特異的な抗体自体を（例えば、吸着に
より）基体上に固定する。このアプローチの利点の１つは、単一抗体を基体に結
合させ、（同じ固定化ドメインを共有する）幾つかの異なるテザード・リガンド
の固定化に用いることができることである。例えば、ポリヒスチジンからなる固
定化ドメイン（Bush et al, 1991, J. Biol Chem 266:13811-14）は抗ヒスチジ
ンモノクローナル抗体（R&D Systems、Minneapolis、ＭＮ）によって結合させる
ことができ；分泌アルカリホスファターゼ（「ＳＥＡＰ」）からなる固定化ドメ
イン（Berger et al, 1988, Gene 66:1-10）は抗ＳＥＡＰ（Sigma Chemical Com
pany、St. Louis、ＭＯ）によって結合させることができ：ＦＬＡＧエピトープ
からなる固定化ドメインは抗ＦＬＡＧによって結合させることができる。他のリ
ガンド−抗リガンド固定化法も適切である（例えば、プロテインＡ配列からなる
固定化ドメイン（Harlow and Lane, 1988, ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL, C
old Spring Harbor Laboratory；Sigma Chemical Co.、St. Louis、ＭＯ）はＩ
ｇＧによって結合させることができ；及びストレプトアビジンからなる固定化ド
メインはビオチンによって結合させることができる（Harlow & Lane、前出；Sig
ma Chemical Co.、St Louis、ＭＯ）。
【００７４】 抗体介在固定化法を用いる場合、ガラスが特に有用な基体である（例えば、顕
微鏡品質のガラススライド）。アレーが望ましい場合、ガラス基体に疎水性（例
えば、テフロン）マスクを用いて印刷してウェルを形成することができる。１４
．５ｃｍ２スライド当たり３、１０及び２１ウェルの「作業領域」を有する予め
印刷されたスライドグラスを、例えば、SPI Supplies、West Chester、ＰＡから
入手することができる：米国特許第4,011,350号も参照のこと。特定の用途にお
いては、９６ウェル・フォーマットで印刷された大フォーマット（１２．４ｃｍ
×８．３ｃｍ）スライドグラスが用いられる；このフォーマットは、自動液体取
り扱い機器の使用及び様々なタイプ（蛍光、比色、シンチレーション）の９６ウ
ェル・フォーマット・プレートリーダーの利用を促進する。しかしながら、より
高い密度を用いることができる（例えば、ｃｍ２当たり１を上回るテザード・リ
ガンド）。しばしば、テザード・リガンド・アレーは少なくとも約３、少なくと
も約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０又はそれを上
回る異なるリガンドを含む。
【００７５】 典型的には、吸着によって抗体を基体（例えば、ガラス基体）に結合させる。
適切な吸着条件は当該技術分野において公知であり、バッファ（ＰＢＳ、又は５
０ないし３００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、酢酸バッ
ファ）中、ｐＨ６．５ないし８、４℃ないし３７℃で１時間ないし２４時間を上
回る０．５−５０μｇ／ｍｌ（例えば、１０μｇ／ｍｌ）ｍＡｂのインキュベー
ションが含まれる。
【００７６】 抗体介在固定化は、リガンド・ドメインが追加の方向をとることを可能にする
抗体ヒンジ領域の柔軟性のため、他の固定化法法を上回る利点を提供する。
【００７７】 通常、融合タンパク質は受容体発現性細胞と接触させる前に固定するが、幾つ
かの態様においては、固定化が接触工程に続く。
【００７８】 ４．２．２共有結合固定化 前述のように、テザード・リガンドは非特異的結合によって共有結合又は非共
有結合させることができる。融合タンパク質と表面との共有結合が望ましい場合
、表面は通常多官能性であるか、又は多官能化することができる。表面上に存在
することができ、かつ連結に用いられる官能基には、カルボン酸、アルデヒド、
アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が含まれ
得る。多様な化合物を様々な表面に連結する方式が公知であり、文献において十
分に説明されている。
【００７９】 ５．スタルコカインの追求及びスタルコカイン・アレー 本発明によると、受容体（例えば、ケモカイン受容体）を発現する細胞を１以
上のテザード・リガンド融合タンパク質（例えば、個別のリガンド又は異なるテ
ザード・リガンドのアレー）と、リガンド及び（存在するのであれば）同族受容
体の間の結合が生じる条件下で接触させる。
【００８０】 典型的には、結合条件は、受容体−リガンド相互作用が生じるか、又は生じる
ことが期待される生理学的条件である。したがって、一態様においては、緩衝溶
液（例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ等）中で細胞をテザード・リガンドと接触させる。
【００８１】 結合は、典型的には、１４℃ないし３７℃（例えば、室温）で０．５ないし１
０時間（典型的には、０．５ないし３時間、例えば、１．５時間）、穏やかに攪
拌しながら、又は攪拌なしに進行させる。結合に好ましい細胞濃度は０．５−５
×１０５／ｍｌの範囲（例えば、１−２×１０６／ｍｌ）であるが、この範囲外
の濃度を用いることもできる（例えば、患者サンプルに由来する希な細胞の場合
）。
【００８２】 幾つかの態様においては、アレー又は個別のテザード・リガンドと共にインキ
ュベートする前に細胞を前処理する。例えば、細胞を蛍光標識抗体（例えば、抗
ＣＤ３細胞マーカー）で修飾するか、又はCalcein（Molecular Probes、Eugene
、ＯＲ）のような蛍光色素で細胞内標識するか、又は放射性同位体を用いて標識
することができる。このような標識はテザード・リガンド（例えば、アレー上の
部位）への細胞の結合の定量化に加えて、結合性細胞の特徴付けを容易にする。
例えば、Ｔリンパ球上で発現するケモカイン受容体を分析する実験において、Ｐ
ＢＭＣを単離し、Ｔ細胞をフルオレセイン標識抗ＣＤ４及びローダミン標識抗Ｃ
Ｄ８で染色することができる。典型的には、細胞を３０分間染色し、ＰＢＳで３
×洗浄し、ＰＢＳ中にｍｌ当たり１×１０６細胞で再懸濁させる。次に、これら
の細胞を本明細書に記載されるテザード・リガンド・アレーと接触させ、室温で
１時間結合させる。次いで、スライドを洗浄して未結合細胞を除去し、蛍光プレ
ートリーダーを用いて付着細胞を検出する。Ｔ細胞の共存同定を用いてフルオレ
セイン・タグ及びローダミン・タグを別々に検出する。
【００８３】 各々の細胞型が結合するテザード・ケモカイン、及び２つのシグナルの比の分
析により、特定のテザード・リガンドに局在する細胞型を決定することができる
（すなわち、細胞を特徴付け、細胞を定量することができる）。（例えば、多発
性硬化症又は関節リウマチの患者に由来する）細胞の不均一集団を染色すること
により、例えば診断の目的で、特定の受容体又は受容体の組合せを発現する細胞
の下位集団を同定することができることは明らかであろう。同様に、このプロト
コルは薬物の開発において有用である（例えば、テザード・ケモカインへの個々
のＴ細胞の結合パターンを変化させる化合物のスクリーニング）。
【００８４】 ５．１受容体を発現する組換え細胞を用いる追求 一態様においては、受容体を発現する組換え細胞（すなわち、関心のある受容
体タンパク質をコードする発現ベクターで一時的に、又は安定にトランスフェク
トした細胞）を用いて本発明の方法を実施する。
【００８５】 ５．１．１細胞発現組換え受容体タンパク質 アッセイにおいて用いられる組換え発現受容体タンパク質は様々な結合性タン
パク質、例えば、７回膜貫通Ｇタンパク質結合受容体クラス（例えば、ケモカイ
ン受容体）、受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦ受容体、インシュリン受
容体、ＩＧＦ−１受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、
ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体）及び前記表２に列挙されるあらゆるリガンド又
はリガンドクラスの受容体のいずれであってもよい。例示的受容体が表１に示さ
れる。配列データベースへのリンクを含む７回膜貫通受容体のさらなる説明が h
ttp://swift.embl-heidelberg.de/7tm/phylo/phylo.html に見出される。多くの
さらなるタンパク質結合性受容体が文献及び／又はGenBankにおいて説明されて
いる。この情報を用いて、当業者は様々な受容体を発現する細胞を定型的な技術
を用いて調製することができる。
【００８６】 関心のある受容体を発現する形質転換細胞株及び／又は様々な受容体をコード
する発現ベクターが公知である（例えば、American Type Culture Collection、
10801 University Boulevard Manassas、VA 20110-2209；http://www.atcc.org/
を参照）。その代わりに、遺伝子のＤＮＡ配列又は受容体をコードするｃＤＮＡ
を提供することで、組換えタンパク質を発現させるための定型的な方法を用いて
受容体を発現させることができる。通常、完全長又は天然受容体配列を発現させ
る必要がないことは理解されるであろう；リガンドを結合することができる部分
、変種又は断片で十分である。
【００８７】 通常、関心のある受容体コーディング配列を「組換え発現カセット」発現ベク
ターにクローン化し、適切な宿主細胞に導入（例えば、トランスフェクト）する
。
【００８８】 受容体は、膜結合受容体タンパク質の発現が可能な様々の細胞型（例えば、昆
虫等）において発現させることができるが、本発明において用いられる受容体は
、典型的には、哺乳動物細胞において発現させる。
【００８９】 受容体の発現に有用な宿主細胞には、これらに限定されるものではないが、組
換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系、哺乳動物細胞発現系等が含まれる。例えば、前出のAusubelらを参照のこと
。哺乳動物宿主細胞においては、多くの発現系、例えば、pCMV-myc（Clonetech
、Palo Alto ＣＡ）のような構成性発現ベクター、pTRE2（Clonetech、Palo Alt
o ＣＡ）（テトラサイクリン誘導を用いる）のような誘導性発現ベクター、受容
体及び薬物耐性遺伝子を駆動することが可能な bicistonic ベクター pIRES（Cl
onetech、Palo Alto ＣＡ）等を利用することができる。加えて、挿入配列の発
現を調節するか、又は望まれる特別な方式で遺伝子産生物を修飾及び処理する（
例えば、タンパク質産生物の修飾（例えば、グリコシル化）及び処理（例えば、
開裂）はそのタンパク質の機能にとって重要なものであり得る）宿主細胞株を選
択することができる。この目的のため、遺伝子産生物の一次転写、グリコシル化
、及びホスホリル化を適切に処理するための細胞機構を有する真核生物宿主細胞
を用いることができる。そのような宿主細胞には、これらに限定されるものでは
ないが、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３；Graham et al., J. Gen. Virol. 36
:59 (1977)）；ベイビー・ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １
０）；ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１及びＣＲＬ ９６１８）；マウスセルト
リ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞
（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；ミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロー
ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（
Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８
０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；
ＴＲＩ細胞（Mather. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982)）；
ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４及びＣＲＬ ６２５３）；ＨＥＫ ２９
３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）；並びにＷＩ−３８細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ７５；ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection、Rockville、ＭＤ
）が含まれる。ポリペプチドの発現への哺乳動物組織細胞の使用は、Winnacker,
FROM GENES TO CLONES（VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987）に一般に論じら
れている。
【００９０】 組換えタンパク質の長期の高収率産生には安定な発現が好ましい。例えば、受
容体を安定に発現する細胞株を加工することができる。ウイルスの複製起点を含
む発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、
エンハンサ、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御
された受容体エンコーディングＤＮＡ、及び選択可能マーカーで宿主細胞を形質
転換することができる。適切であるならば、コドンの用法を非ヒト細胞又は非哺
乳動物細胞における発現用に変更することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて
、加工細胞を富化培地において１−２日間成長させ、次いで選択培地に切り替え
ることができる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーはこの選択に対する耐
性を付加し、細胞がそのプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、かつ成
長して病巣を形成することを可能にし、次にその病巣をクローン化し、細胞株内
に広げることができる。この方法は、細胞表面上に受容体タンパク質を発現する
細胞株の加工に有利に用いることができる。多くの選択系を用いることができ、
これには、これらに限定されるものではないが、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ− またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルス・チミ
ジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、及びアデニン・ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:817）遺伝子が含まれる。また、代謝拮
抗剤耐性を、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al
., 1980, Natl. Acad, Sci. USA 77:3567；O'Hare et al., 1981. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78:1527）；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ
（Mulligan & Berg, 1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグ
リコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapin et al.,
1981. J. Mol. Biol. 150:1）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する
ｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）の選択の基礎として用いる
こともできる。さらなる選択可能な遺伝子も記述されており、すなわち、細胞が
トリプロファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細
胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（
Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047）；オルニチ
ンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、
ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（Mc
Conlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Laboratory ed.）及びグルタミンシンセターゼ（Bebbington et
al., 1992, Biotech 10:169）である。その代わりに、細胞（例えば、ネズミ胚
性幹細胞）にＤＮＡを導入するのに有利な部位への相同組換えを用いることもで
きる。
【００９１】 テザード・リガンド又はテザード・リガンド・アレーを組換え細胞で追求する
場合、アッセイの前に細胞を１−２日サブクローン化する（「分裂させる」）と
きに良好なシグナルが生じることが観察されている。
【００９２】 ５．１．２オーファン受容体の特徴付け 一態様において、本発明の試薬及び方法はオーファン受容体に結合するリガン
ドの同定に有用である。公知のリガンドを持たない、様々な予想生物学的機能を
有する多くの推定受容体が存在する。本発明によると、本明細書に記載されるよ
うにクローン化オーファン受容体を組換えで発現させ、様々なテザード・リガン
ドへのオーファン受容体発現細胞の結合を試験する。結合のプロフィールに基づ
き、リガンド（１種類もしくは複数種類）を受容体に割り当てることができる。
【００９３】 通常、当業者は、配列相同性又は他の特徴に基づいてオーファン受容体を特定
のクラスの受容体に割り当てることができる。そのような場合、オーファン受容
体に相当するテザード・リガンドを、通常は、又は最初は、このクラスの受容体
を結合することが知られるか、又はそう信じられるリガンドで追求することは認
められるであろう。例えば、ＣＸＣケモカイン受容体との相同性を有するオーフ
ァン受容体は、最初に、ＣＸＣケモカイン受容体と相互作用することが知られる
リガンドで追求する。同様に、１以上のクラスのケモカイン受容体との相同性を
有するオーファン受容体は、通常、又は最初に、ケモカイン・リガンドで追求す
る。
【００９４】 ５．２細胞集団での追求 様々な態様において、本発明は細胞集団の受容体（例えば、ケモカイン受容体
）プロフィールを分析するための方法を提供する。「受容体プロフィール」又は
「受容体発現のプロフィール」という用語（交換可能に用いられる）は、アッセ
イにおいて検出されるような、細胞型（例えば、細胞株もしくは精製細胞型）上
の、又は不均一細胞集団（例えば、患者に由来する細胞サンプル）中の細胞表面
提示された受容体（すなわち、膜結合細胞外受容体）の補集合を指す。したがっ
て、一組のケモカイン受容体のアッセイにおいて、細胞株の「受容体プロフィー
ル」という用語はその細胞株の細胞によって提示されるケモカイン受容体の組を
指す（提示される他の受容体、例えば、成長因子受容体は問わない）。同様に、
細胞の不均一混合物の「受容体プロフィール」という用語は、全ての細胞が同じ
受容体の組を提示し得るとは限らないものの、その集団の細胞によって提示され
る受容体の組を指す。以下に論じられるように、細胞集団の受容体プロフィール
には、幾つかの受容体の各々を結合する集団における細胞の数及び／又は型に関
する情報も含まれ得る。
【００９５】 細胞集団の受容体プロフィールの決定は、患者（又は医用モデルを含む非ヒト
動物）における診断又は疾患の予後；個体の集合のプロフィール作成；患者に対
する薬物又は治療の効果の評価等を含む様々な用途において有用である。
【００９６】 ５．２．１診断及び予後 異なる型の細胞は異なる細胞外受容体を発現する。さらに、あらゆる特定の細
胞型によって発現される受容体は、その細胞の発達段階、細胞環境、及び場所に
応じて変化し得る。例えば、ウイルス感染細胞は同様の非感染細胞とは異なる受
容体を発現することがある。さらに、特定の位置での特定の受容体を発現する細
胞（すなわち、特定の受容体プロフィールを有する細胞集団）の有無は個体の健
康状態を示すものである。例には、炎症部位での白血球及び他の細胞の存在、並
びにサンプル中の悪性細胞の存在が含まれる。
【００９７】 したがって、本発明は、疾患を患うことが疑われる患者から細胞集団を得、か
つその集団の受容体プロフィールを本明細書に記載されるアッセイ法（すなわち
、細胞集団を１以上の固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、か
つ集団中の細胞が結合するリガンドを同定する）を用いて決定する診断方法を提
供する。その後、受容体プロフィールを疾患状態のプロフィール特性及び健常状
態のプロフィール特性と比較し、診断はその比較に基づく。
【００９８】 細胞集団の例には、限定することなしに、（１）疾患組織及び液体に由来する
細胞、（２）患者集団に由来する細胞、（３）疾患又は治療が進行する間の様々
な時期に患者から採取された細胞が含まれる。したがって、一態様においては、
疾患を患う個体に由来する組織又は液体、例えば、関節リウマチを患う個体に由
来する滑液；多発性硬化症及びアルツハイマー病を患う個体に由来する脳脊髄液
、喘息、サルコイドーシス、結核、成人呼吸促進症候群、並びに他の炎症性及び
感染性疾患を患う個体に由来する気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、胎児細胞、組織
、及び（例えば、筋肉、骨髄、リンパ節、肝臓、脳等の組織からの）生検から細
胞を得る。本発明の試薬及び方法を、集団において発現する受容体（例えば、ケ
モカイン受容体、すなわち「ＣＫＲ」）の集団を決定し、それを正常（例えば、
非疾患）組織において発現するＣＫＲと比較するのに用いる。正常かつ非疾患組
織は同じ被検体に由来するものであっても、２もしくは数体の異なる被検体に由
来するものであってもよい。異なるように発現したＣＫＲは治療処置のための特
定の分子疾患標的を定義する。
【００９９】 細胞は様々な疾患のいずれかを患う患者から得ることができ、この疾患には、
限定されることなく、炎症、感染及び癌に関連する疾患及び状態、例えば；（１
）炎症もしくはアレルギー性疾患、例えば、全身アナフィラキシーもしくは過敏
性応答、薬物アレルギー、昆虫刺傷アレルギー；炎症性腸疾患、例えば、クロー
ン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎；膣疾患；乾癬及び炎症性皮膚疾患、例え
ば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、蕁麻疹；血
管炎；脊椎関節症；強皮症；呼吸器アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギ
ー性鼻炎、過敏性肺疾患等、（２）自己免疫疾患、例えば、関節炎（リウマチ様
及び乾癬性）、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、糖尿病、糸球体腎炎等、
（３）移植片拒絶（同種移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む）、並びに（４）
望ましくない炎症性応答を阻害すべきである他の疾患（例えば、アテローム性動
脈硬化症、筋肉炎）；癌、血管形成もしくは血管新生が役割を果たす疾患（新生
物疾患、網膜症及び黄班変性症）、感染性疾患及び免疫抑制性疾患が含まれる。
【０１００】 １以上のリガンドに結合する細胞を定量化及び／又は特徴付けることにより（
例えば、計数、分類、免疫染色等により）、集団に関するさらなる情報が得られ
る。
【０１０１】 ５．２．２薬物の評価 本発明の試薬及び方法は、患者に対する薬物又は治療の効果を監視するのにも
有用である。個体又は非ヒト動物に由来する細胞を、疾患の治療の前後、又は疾
患の進行の開始前後、病原体に露出する前後、免疫の前後等に得、それらの結果
を比較することによって受容体発現のプロフィールの変化をアッセイする。（例
えば、計数、分類、免疫染色等によって）１以上のリガンドに結合する細胞の定
量及び／又は特徴付けにより、その集団に関するさらなる情報を得る。薬物の評
価は治療の過程で繰り返し行うことができる。
【０１０２】 ５．２．３集団のプロフィール作成 別の関連態様においては、本発明の方法を個体の集団の「プロフィール作成」
に用いる。例示的態様においては、個体を特定の受容体プロフィールを発現する
個体のコホート、又は（例えば、特定の細胞上に）特定の受容体を発現する個体
のコホートにグループ分けするため、特定の個体集団に由来する細胞（例えば、
血液細胞又は白血球）の受容体プロフィール（例えば、ＣＫＲプロフィール）を
決定することが有用である。例えば、（例えば、喘息における好酸球の活性を遅
延させる治療のため）好酸球上で発現するＣＣＲ３へのエオタキシンの結合を阻
害するＣＣＲ３アゴニストについての臨床試験を計画するため、ＣＣＲ３の存在
について一般集団内の個体の大サンプルのプロフィールを作成することが有用で
ある。エオタキシン−スタルコカインに結合する好酸球が欠乏する集団のサブセ
ットを同定し、臨床試験から排除することができる。同様に、ＣＣＲ３の発現は
他の特徴又はマーカー（例えば、性別、年齢、又は遺伝的もしくは倫理的変種）
と相関し得る。
【０１０３】 ５．３膜調製品での追求 関心のある受容体を発現する組換え又は天然細胞での追求に加えて、膜調製品
をそのような細胞及び／又は細胞ホモジネートから得、本発明のアッセイにおい
て用いることができる。膜調製品は定型的な方法、例えば、低張溶解及び遠心を
用いて調製することができる（例えば、Dairaghi et al, 1999, J. Biol. Chem.
274:21569-74を参照）。
【０１０４】 ６．検出方法 テザード・リガンド及びアレーに結合する細胞は幾つかの方法で検出及び定量
することができる。細胞は、前染色の有り無しにかかわらず、視覚的に（すなわ
ち、顕微鏡を用いて）観察（及び計数）することができる。その代わりに、自動
及び半自動検出システム（例えば、蛍光定量的画像プレートリーダー、シンチレ
ーションカウンタ、「９６ウェル」プレートリーダー）を、特には受容体結合性
細胞が検出可能な標識で標識されているとき、特定のテザード・リガンド（例え
ば、アレー上の部位）に関連するシグナルの測定に用いることができる。本明細
書で用いられる場合、「検出可能な標識」は当該技術分野における通常の意味を
有し、（例えば、物理的又は化学的特性のため）検出するか、分子の存在の指示
するか、又は共有結合もしくは他の方法で会合する別の分子の結合を可能にする
のに用いられ、又は用いることができる原子（例えば、放射性核種）、分子（例
えば、フルオレセイン）、もしくは複合体を指す。本発明における使用に適する
検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光
学的又は化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物が含まれる。本発明にお
いて有用な標識には、標識ストレプトアビジン結合体で標識するためのビオチン
、磁気ビーズ（例えば、DynabeadsTM）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、T
exas red、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、リサミ
ン（lissamine）、フィコエリトリン、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Flu
orX［Amersham］、SyBR Green I 及び II［Molecular Probes］等）、放射標識
（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、ヒ
ドロラーゼ、特には、アルカリホスファターゼのようなホスファターゼ、エステ
ラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドレダクターゼ、特には、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、並びにＥＬＩＳＡにおいて通常
用いられる他のもの）、基質、補因子、阻害剤、化学発光基、色素産生剤、及び
比色用標識、例えば、コロイド状金又は着色ガラスもしくはプラスチック（例え
ば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズが含まれる。そのよ
うな標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；
第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；及び第4,366,
241号が含まれる。このような標識を検出する手段は当業者に公知である。
【０１０５】 一態様においては、受容体及びテザード・リガンドの会合を、http://www.ece
.neu.edu/edsnu/zavracky/mfl/programs/relay/relay.html に記載されるマイク
ロスイッチ技術を用いて検出する。
【０１０６】 所望であれば、検出の前に、（例えば、グルタルアルデヒドのような架橋剤を
用いて）細胞を固定することができる。
【０１０７】 前述のように、本発明に従って細胞をテザード・リガンドと接触させる前、又
は後に、受容体担持細胞を染色することが時折好都合である。例証態様の１つに
おいては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ２０抗体
をＢ細胞のマーク付けに用い、ローダミン標識抗ＣＤ３をＴ細胞のマーク付けに
用いる。ＵＶ照明下での可視化及び定量並びに正しい波長フィルタ・セットによ
って異なる細胞型が識別される。
【０１０８】 ７．データ解析 本発明のテザード・リガンド及びアレーへの受容体担持細胞の結合の解析方法
は、本開示のガイダンスに従い、当業者には明らかであろう。典型的には、テザ
ード・アレーへの受容体発現細胞株の結合の解析は、計数、蛍光、又はシンチレ
ーションによって細胞の結合を定量した後に行う。通常、結合を３回行い、その
値の平均（平均値）を解析に用いる。
【０１０９】 最初に、非特異的結合の基線を決定する。非結合性テザード・リガンド（例え
ば、サブクラスのテザード・ケモカイン及び試験ケモカイン受容体を結合しない
）が適切な基線の役割を果たすウェルの測定。非リガンド含有固定化スターク（
すなわち、リガンド・ドメインを欠く「テザード・リガンド」）についての結合
を測定することにより、さらなる適切な基線を決定することができる。加えて、
トランスフェクション・プロトコルによって処理はされているがテザード・リガ
ンドを作製することができるいかなるプラスミド（例えば、親ベクターpcDNA3.1
）をも含まない細胞株の上清を含む、偽トランスフェクトした対照を用いること
ができる。幾つかの態様においては陽性対照を用いることもできる（例えば、特
定の受容体担持細胞に結合することが知られるテザード・リガンド）。適切な陽
性対照は、少なくとも基線より約２倍多く、しばしば基線より約１０倍多く、頻
繁には少なくとも基線より約１００倍多い結合を示す。
【０１１０】 真正の結合（例えば、トランスフェクトされた細胞及びテザード・リガンドに
よって生じる結合）は競合アッセイによって検証することができる。一態様にお
いては、可溶性形態のリガンド（例えば、テザード・リガンドのリガンド・モチ
ーフに相当する）又は可溶性（非固定化）形態のテザード・リガンドを、受容体
を発現する細胞株に、前インキュベーション期間（例えば５ないし２０分、典型
的には１５分）、過剰に添加する。結合に対する効果は前述のように決定する。
真正の結合は可溶性リガンドの添加によって阻害される。時には、用いられる細
胞株上に発現する内在性受容体が結合に介在することがある。これを検出するの
に、平行解析における対照としての親（すなわち、非組換え）細胞株の使用が用
いられる。
【０１１１】 ８．結合アゴニスト及びアンタゴニスト 様々な態様において、本発明は、リガンドと受容体との、幾つかのリガンドと
受容体との、又は幾つかのリガンドと幾つかの受容体との相互作用を調節する試
験化合物の能力を同定するための方法を提供する。
【０１１２】 一態様においては、テザード・リガンドのアレー又は１以上の個々のテザード
・リガンドのいずれかを用いる本発明の結合アッセイを試験化合物の存在下又は
不在下において行う。試験化合物の存在下におけるテザード・リガンド（１つも
しくは複数）への受容体担持細胞の結合の減少は、その試験化合物が本発明のア
ンタゴニストとして作用していることを示す。試験化合物の存在下におけるテザ
ード・リガンド（１つもしくは複数）への受容体担持細胞の結合の増加は、その
試験化合物が本発明のアゴニストとして作用していることを示す。リガンド受容
体相互作用は（例えば、細胞代謝に対する）生理学的効果を有するため、本発明
のモジュレータはその効果を調節することが期待され、そのようなモジュレータ
は、例えば医薬組成物を製造するのに、しばしば治療上有用である。
【０１１３】 前で言及される試験化合物は、天然及び合成、有機及び無機の両者の、多種多
様な化合物のいずれであってもよく、これらにはポリマー（例えば、オリゴペプ
チド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチド）、小分子、
抗体、糖、脂肪酸、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、天然構造の類似体（
例えば、ペプチド模倣体、核酸類似体等）、並びに多くの他の化合物が含まれる
。典型的には、試験化合物は、例えば約１ｎｇないし約１ｇ／ｍｌ、より頻繁に
は１μｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌの範囲の、様々な濃度で添加される。典型的
には、試験作用物質は、例えば１ピコモル濃度ないし１モル濃度、より頻繁には
１ナノモル濃度ないし１ミリモル濃度の範囲の、様々なモル濃度で添加される。
典型的には、試験作用物質は、例えば約１十億分率ないし約１百分率、より頻繁
には約１百万分率ないし約１千分率の範囲の、様々な濃度で添加される。
【０１１４】 一態様においては、「試験化合物」は、受容体が相互作用する、テザード・リ
ガンドの可溶性形態のリガンド部分である。例えば、ケモカイン、ＥＬＣ、ＴＥ
ＣＫ及びＳＬＣが、ＥＬＣリガンド・ドメインを有するテザード・リガンド（す
なわち、ＥＬＣ−スタルコカイン）へのＣＣＲ１０発現性細胞の結合を阻害する
（すなわち、競合により）ことが示されている。実施例１を参照のこと。より頻
繁には、「試験化合物」は「合成試験化合物」、通常は非ポリペプチド化合物で
あり、すなわち、天然ポリペプチドの配列は持たない。
【０１１５】 試験作用物質の調節活性の評価において、試験作用物質を、細胞（１つもしく
は複数）及びテザード・リガンド（１つもしくは複数）を接触させる前に受容体
担持細胞（１つもしくは複数）と共にインキュベートすることができ；細胞（１
つもしくは複数）及びテザード・リガンド（１つもしくは複数）を接触させた後
に添加することができ；細胞（１つもしくは複数）及びテザード・リガンド（１
つもしくは複数）を接触させるのと同時に添加することができる。試験作用物質
を動物に、又はイン・ビトロもしくはエキソ・ビボ細胞もしくは組織に投与し、
特定の標的組織又は動物モデルにおける細胞集団の結合の効果をアッセイするこ
ともできる。
【０１１６】 本発明の一態様においては、特定のテザード・リガンドと特定の受容体との相
互作用に対する試験作用物質（１種類もしくは複数種類）の効果を試験する。こ
のアプローチは、例えば、受容体（例えば、オーファン受容体）と特定のリガン
ドとの見かけの相互作用の検証、及び特定の受容体−リガンド相互作用を阻害す
る作用物質の高スループット・スクリーニング（それにより、受容体又はリガン
ドの生物学的機能を調節する）に有用である。高スループット・スクリーニング
の方法は公知である（例えば、Williams, 2000, Curr. Opin. Biotechnology 11
:42-46、及びそこに引用される参考文献を参照）。
【０１１７】 別の態様においては、本発明のアレーを、複数のリガンドへの細胞集団の結合
プロフィールに対する試験作用物質の効果をアッセイするのに用いる。
【０１１８】 ９．キット 本発明の一側面では、（１）本発明のテザード・リガンド・アレー、又は（２
）例えば別々のバイアル内の、本発明のテザード・リガンド融合タンパク質の１
つもしくは複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも５つ、もしくは少なくと
も１０の異なるテザード・リガンドの組合せ）、又は（３）テザード・リガンド
融合タンパク質のうちの少なくとも２つが異なる固体基体（例えば、プレート、
スライド、ビーズ等）、例えば、異なる基体（例えば、異なるビーズ）に固定化
されている、１つ、２つもしくは複数のテザード・リガンド融合タンパク質を含
むキットが提供される。
【０１１９】 １０．実施例 以下の例を請求される発明の説明のために提供するが、それを限定するもので
はない。
【０１２０】実施例１ この例は、オーファン受容体のリガンド特異性の決定への本発明の使用を示す
。 Ａ．略語 ＥＬＣ、ＥＢｌ１リガンド・ケモカイン；ＳＬＣ、二次リンパ−組織ケモカイ
ン；ＴＥＣＫ、胸腺発現ケモカイン；ＨＥＫ２９３、ヒト胚性腎臓２９３細胞；
ＰＥＩ、ポリエチレンイミン；ＣＣＲ、ＣＣケモカイン受容体。
【０１２１】 Ｂ．材料及び方法 ヒト、ウイルス及びネズミ組換えケモカインは R&D Systems（Minneapolis、
ＭＮ；http://cytokine.mdsystems.com/cyt_cat/cyt_cat.html）から入手した。 １２５ Ｉ標識ＥＬＣ及びＴＥＣＫは Amersham から入手した。完全長ＣＣＲ１０
発現構築体は、ＦＬＡＧエピトープ・タグ及びプロラクチン・シグナル配列を有
する pIRESpuro 発現ベクター（Clontech、Palo Alto、ＣＡ）に作製し、ＨＥＫ
２９３細胞内に安定なトランスフェクタントを産生させるのに用いた。ＣＣＲ１
０及びスタルコカインの一時的及び安定なトランスフェクションは、Superfect
試薬（Qiagen、Valencia、ＣＡ）を製造者のプロトコルに従って用いて行った。
安定にトランスフェクトした細胞を２μｇ／ｍｌプロマイシン中で７日間選択す
ることによって産生させ、抗ＦＬＡＧ Ｍ１（Sigma、St. Louis、ＭＯ）及び２
’抗マウスＰＥ結合体（Coulter Immunoteck、Miami、ＦＬ）を用いるＦＬＡＧ
エピトープのＦＡＣＳ分析により発現を確認した。
【０１２２】 Ｃ．ＣＣＲ１０タンパク質の安定な発現 「ＣＣＸ ＣＫＲ」又は「ＣＣＲ１０」と呼ばれる新規ヒトケモカイン受容体
のクローン化及び特徴付けが Gosling et al., 2000, "Cutting edge: identifi
cation of a novel chemokine receptor that binds dendritic cell- and T ce
ll-active chemokines including ELC, SLC, and TECK" J Immunol. 164:2851-6 に記載されており、これは参照することによりその全体が全ての目的のために
本明細書に組み込まれる。ＣＣＲ１０のコーディング配列は図２に示される。
【０１２３】 ＣＣＲ１０ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の、潜在的なケモカイ
ン結合プロフィールを含む機能的特性を入手するため、ＣＣＲ１０に加えて追加
されたＮ末端Ｆｌａｇエピトープをコードする発現プラスミドを構築した。これ
は、最も高度に発現する安定なトランスフェクタントの、抗Ｆｌａｇ ｍＡｂを
用いる検出及び選択を可能にした。Ｍ１ Ｆｌａｇエピトープ・タグ付加ＣＣＲ
１０を安定に発現するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞をＦＡＣＳによ
って確認し、さらなる分析のために選択した（ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞）
。
【０１２４】 Ｄ．スタルコカインへの結合による受容体の追求 ＣＣＲ１０へのリガンドの結合を決定するため、ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細
胞をケモカイン「スタルコカイン」（ＳＫ）、すなわち、別々のケモカイン・ド
メインが伸長されたスターク構造の末端に繋がれるように操作された分子の追求
に用いた。スタルコカインの追求は、まず抗Ｈｉｓ係留抗体（anti-His anchori
ng antibody）でコートし（ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ、ＲＴで一晩）、それを
洗浄して「ブロック」（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ／０．５％ＢＳＡ）した８ウェル
・チャンバー・スライドを用いて行い；２５０μｌのＨＥＫ２９３細胞スタルコ
カイン上清で処理し（３７℃で１時間）５００，０００のＨＥＫ２９３−ＣＣＲ
１０トランスフェクタントと共にインキュベートした（ＲＴで１．５時間）。可
溶性ケモカインとの競合による結合の阻害を、細胞を５−１０μｇ／ｍｌの組換
えケモカインと共にインキュベートすることにより行った。全ての場合において
、ＰＢＳで洗浄することにより非結合細胞を除去した；残留する結合細胞を１％
グルタルアルデヒドで固定し、光画像化（photoimaged）してカウントした。一
次スクリーニングとして、この結合で推定受容体−リガンド相互作用が明らかと
なった。
【０１２５】 ＣＣＲ１０発現性細胞はＥＬＣスタルコカインに非常に良く結合した（ＥＬＣ
−ＳＫ；図３Ａ）。さらに、ＥＬＣ−ＳＫ介在結合は競合体としての可溶性未変
性ＥＬＣの存在下において消失した（図３Ａ、最上列）。可溶性ＳＬＣに加えて
可溶性ＴＥＣＫの存在下においてＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞のＥＬＣ−ＳＫ
介在結合の大きな減少も観察されたが、可溶性ＭＣＰ−３の存在下では観察され
なかった（図３Ａ、最下列）。これらの実験は幾つかの独立した試験で行って定
量したが、その一例が図３Ｂに示されており、再現性が高いことが見出された。
さらに、濃度が漸増する非標識ＥＬＣの存在下における伝統的な相同競合アッセ
イにおいて放射標識ＥＬＣを用いた。その結果から、ＥＬＣがＨＥＫ２９３−Ｃ
ＣＲ１０細胞にかなり結合するが、野生型（ｗｔ）ＨＥＫ２９３細胞には結合し
ないことが明らかになった（図３Ｃ）。冷ＴＥＣＫを用いる放射標識ＴＥＣＫの
相同競合においてもほぼ同一の結果が得られた（図示せず）。まとめると、スタ
ルコカイン・ベースの結合及び放射標識リガンド結合／相同競合アッセイにより
、ＣＣＲ１０がケモカインの新規補体に結合する新規ケモカイン受容体であるこ
とが示された。
【０１２６】 ＣＣＲ１０に結合するリガンドのスペクトルには、ＥＬＣ、ＳＬＣ、及びＴＥ
ＣＫが高親和性で、ＢＬＣ及びｖＭＩＰＩＩが低親和性で含まれる。
【０１２７】実施例２ この例は、スタルコカインの構築及び発現、並びに固定化スタルコカインへの
受容体発現性細胞の結合を説明する。 Ａ．スタルコカイン発現プラスミドの調製 １．ＣＫリガンド配列の増幅 ケモカイン（「ＣＫ」）コーディング配列を、表５に示されるように、刊行文
献に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を用いて生成した。増幅したＣＫコーディング配列を、ヒト・フラクタル
カイン・スターク領域コーディング配列及びｃ末端エピトープ・タグ（ポリヒス
チジン）をコードする発現ベクターにクローン化した。ＰＣＲ反応の出発物質に
は、表に示されるように、予めクローン化したプラスミド、ｃＤＮＡライブラリ
、及びＲＮＡの逆転写によって産生されたｃＤＮＡが含まれていた。
【０１２８】 増幅は、クローン化のための独自制限エンドヌクレアーゼ部位（ほとんどの場
合においてはEcoR1、あるいはEcoRVもしくはSmal）を含むオリゴヌクレオチドを
用いて行った。増幅されたケモカイン断片は開始メチオニンコドン及びリーダー
・ペプチド配列を含んでおり、その結果分泌産生物が生じた。
【０１２９】 例えば、全ＭＣＰ２ケモカインをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅に
よって生成した。これらの増幅オリゴヌクレオチドは各々EcoRI部位を含んでい
た。ＰＣＲ断片は未処理ケモカイン全体（リーダー配列に加えて成熟タンパク質
）をコードする領域を含み、これは開始メチオニンのコドン、リーダー配列、及
び停止コドンまでの全ケモカイン・コーディング配列を含んでいたが、停止コド
ンは含んでいなかった（アミノ酸１（ｍｅｔ）ないし１０９（ｐｒｏ）を含む、
Genbank受付番号X99886）。
【０１３０】 ケモカイン・ドメイン配列の増幅に続き、そのＤＮＡ断片を、ヒト・フラクタ
ルカイン・ムチン・スターク配列（以下に記載）をコードする、pcDNA3.1とベー
スとする改変ベクターのEcoRI（又はEcoRV部位）にサブクローン化した。図４を
参照のこと。リガンド・モチーフはこの断片のＰＣＲ合成用のオリゴヌクレオチ
ドの構築によってイン・フレームとなるように設計し、構築体の配列はＤＮＡ配
列決定によって決定する。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】 Ｂ．スターク発現カセット 発現ベクターpcDNA-FRACのポリリンカー領域のEcoR1又はEcoRV部位にＣＫリガ
ンド・コーディング配列をクローン化した。このベクターは、抗体の繋索及び配
列の精製に用いられるｍｙｃエピトープ及びポリヒスチジン・コーディング領域
に融合するヒト・フラクタルカイン・スターク・コーディング領域の上流にポリ
リンカーを含む。このコーディング領域はＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０１３３】 ベクターpcDNA3.1(-)/Myc-HisバージョンB（Invitrogen）［以下、「pcDNA3.1
」］のEcoRI及びHindIII制限部位にフラクタルカイン・ムチン・スターク・コー
ディング配列（ヒト・フラクタルカイン（Genebank受付番号U84487）のアミノ酸
１００ないし３３６（包括的）に相当）を挿入することによりpcDNA-FRACを構築
した。得られたベクター（pcDNA3.1-FRAC）を様々なケモカイン・リガンドの発
現に用いた。これは、ＰＣＲ増幅リガンド配列をこのベクターのスターク・ドメ
インの上流に、それとイン・フレームで挿入することにより達成した。得られた
ベクター（及びコードされるタンパク質）は、一般に、「ケモカイン−FRAC」、
例えば、「MDC-FRAC」、「TARC-FRAC」等と呼ばれる。
【０１３４】 pcDNA3.1に由来する多クローン化部位ポリリンカー領域の領域はケモカイン・
リガンド・ドメインの最後のアミノ酸とフラクタルカイン・ムチン・スターク領
域の最初のアミノ酸（グリシン）との間に存在する。ケモカインをコードするＰ
ＣＲ断片をポリリンカーに挿入することでそのコーディング領域がイン・フレー
ムとなり、融合タンパク質の適正な完全長翻訳が生じる。ポリリンカー領域は、
ケモカイン・ドメインのクローン化に用いられる制限部位に応じて、様々なアミ
ノ酸をコードする。例えば、EcoR1連結ケモカイン・ドメインをpcDMA3.1-FRACの
EcoR1部位にクローン化する場合、リンカー領域は追加アミノ酸グルタメート−
フェニルアラニンをコードする。別の例として、EcoRV連結ケモカイン・ドメイ
ンをEcoRV部位にクローン化する場合、リンカー領域は追加アミノ酸アラニン−
グルタメート−フェニルアラニンをコードする。さらに別の例として、Smal連結
ケモカイン・ドメインをEcoRVドメインに（平滑末端ライゲーションとして）ク
ローン化する場合、リンカー領域は追加アミノ酸アラニン−イソロイシン−プロ
リン−アラニン−グルタメート−フェニルアラニンをコードする。
【０１３５】 標準プロトコル及びQiagen精製システムを用いて精製プラスミドをミリグラム
量で生成させることで最終的なプラスミドを大量に調製する。プラスミドは１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に２０℃で保存した。
【０１３６】 Ｃ．細胞培養物におけるスタルコカインの発現 スタルコカイン合成を、イン・ビトロ細胞培養物において、スタルコカイン発
現プラスミドで一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３（ATCC No. CRL-157
3）又は２９３Ｔ（Pear et at, 1993, PNAS 80:8392-6）細胞株を用いて行った
。トランスフェクションに先立ち、これらの細胞株を、抗生物質を含む１０％Ｆ
ＢＳを補足したＤＭＥＭにおいて６０％集密で成長させた。トランスフェクショ
ンの当日、以下のプロトコルによって細胞をトランスフェクトした：
【０１３７】 細胞をＰＢＳで洗浄した。１７μｇのプラスミドＤＮＡを８２５μｌの「Opti
-MEM」還元血清培地（Life Technologies、Rockville、ＭＤ）に再懸濁させた。
Superfect試薬（Qiagen）をプラスミドに添加して混合し、室温で２０分間イン
キュベートした。次に、それを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３時間イン
キュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を
含む完全ＤＭＥＭ培地を添加した。一晩培養した後、培地を吸引して２．５％Ｆ
ＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭと置き換えた。
【０１３８】 ２４、４８、７２にトランスフェクトした細胞から上清を回収した。トランス
フェクトした培養物に新鮮な培地を補足し、次の回収時間まで上記の通りインキ
ュベートした。上清を遠心してあらゆる培養残滓を除去した後、新鮮な管に移し
た。アリコートを幾つか作製し、それらのサンプルを必要になるまで−２０℃で
保存する。幾つかの実験においては、保存に先立ち、プロテアーゼ阻害剤カクテ
ルを清浄化上清に添加した。
【０１３９】 ポリヒスチジン・アフィニティクロマトグラフィーを用いてスタルコカインの
精製を行った。大規模トランスフェクションを行い、培養後の上清を透析してあ
らゆる小分子混入物を除去した。上清をニッケルカラムに２回通してイミダゾー
ルで溶出し、溶出液をＰＢＳに透析して分析した。通常、意義のある精製が合理
的な回収率で達成された。この物質をウェスタン分析によって未精製スタルコカ
インと比較し、合計タンパク質を決定した。精製した物質は、典型的には、純度
５０−７５％であった。
【０１４０】 精製は幾つかの理由で有用である：スタルコカインの安定性に対する有害効果
を有し得る混入分子を除去し、アッセイにおける等量の物質の容易な比較を可能
にし、かつテザード・リガンド・アレーの調製における品質管理を促進する。
【０１４１】 Ｄ．ウェスタンブロット法による発現の監視 融合タンパク質をウェスタンブロット分析によって分析し、融合タンパク質の
予想される長さ及びポリヒスチジン・テールの存在（これは、カルボキシ末端が
正しい読み取り枠内に存在することを確認する）を確認する。多くの場合、アミ
ノ末端ケモカイン・ドメインも、正しい枠内で作製されるタンパク質とのみ反応
するケモカイン特異的抗体を用いて調べるウェスタンブロット分析によって追求
する。
【０１４２】 細胞トランスフェクションの成功はウェスタンブロット法を用いて監視した。
典型的には、１０μｌの上清を還元剤（ＤＴＴ）を含む変性溶液と混合し、１０
０℃に５分間加熱した。その後、タンパク質サンプルを１０−２０％アクリルア
ミドトリシン・ゲル上にのせ、１００Ｖで４５分間電気泳動した。ゲルの内容物
を、標準移行プロトコルを用いてニトロセルロース膜に移した。移行効率は予め
染色した分子量マーカーの移行の完了によって決定した。この膜をＴｒｉｓ緩衝
生理食塩水、ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ-２０でブロックした。次に、その膜を一次
抗体、例えば、抗ＨＩＳ抗体又はケモカイン・ドメインを認識する抗体と共に１
時間インキュベートした。一次抗体を、穏やかに攪拌しながら５分間、ＴＢＳで
３回連続して洗浄することで洗い流した。その後、膜を一次抗体のＦｃドメイン
を認識する二次抗体と共に１時間インキュベートした。この二次抗体には、次の
可視化のためのセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素が共有結合している。二次
抗体を洗い流した後、可視バンドが生じるまで発色基質ＤＡＢと共にインキュベ
ートすることによって膜を可視化し、次いで水で洗浄することによって停止させ
た。図５を参照のこと。
【０１４３】 Ｅ．スタルコカイン活性 発現したスタルコカイン融合タンパク質のケモカイン・モチーフの機能的活性
を２つの方法によって評価した：走化性及び標識ケモカインの置換。
【０１４４】 図６は、放射標識トレーサー・ケモカインのその同族受容体への結合を用いる
、スタルコカインによる競合を示す置換アッセイを示す。ＣＣＲ４を発現するＣ
ＥＭ細胞を、Dairaghi et al, 1999, J. Biol. Chem. 274:21569-74に記載され
るように、放射標識ＭＤＣ又はＴＡＲＣを用いる結合アッセイにおいて用いた。
【０１４５】 簡単に述べると、ＣＥＭ細胞を、競合分子、例えば、可溶性ＭＤＣ−ＦＲＡＣ
（フラクタルカイン・スターク及びＭＤＣリガンド・ドメインを有するスタルコ
カイン）又はＴＡＲＣ−ＦＲＡＣ（フラクタルカイン・スターク及びＴＡＲＣリ
ガンド・ドメインを有するスタルコカイン）を発現する上清の存在下で放射標識
ケモカイン「トレーサー」（ＭＤＣ又はＴＡＲＣ）に添加した。これらの細胞及
びトレーサーをインキュベートして濾過により回収し、結合したトレーサーを捕
獲した。その後、その物質をカウントした。「合計」は競合なしに結合するトレ
ーサーの量である。「ＭＤＣ−ＳＫ」は可溶性ＭＤＣ−ＦＲＡＣ融合タンパク質
の存在下における結合の量であり、「ＴＡＲＣ−ＳＫ」はＴＡＲＣ−ＦＲＡＣ融
合タンパク質の存在下における結合の量であり、「ＣｏｎＳｕｐ」は対照上清（
いかなるスタルコカインをも発現しないＣＥＮ細胞からのならし培地）との競合
を指し、「ＭＤＣ−ＣＫ」は可溶性ＭＤＣケモカインとの競合であり、かつバッ
クグランド結合を示した。
【０１４６】 明らかなように、実験上清の存在下においてＭＤＣ又はＴＡＲＣトレーサーの
いずれかのＣＥＭ細胞への結合のかなりの阻害が存在する。この阻害の一部は対
照上清中に存在する他の要素によるものであるが、組換えＭＤＣ−ＦＲＡＣ又は
ＴＡＲＣ−ＦＲＡＣに特異的な有意のさらなる減少が存在する。ＭＤＣ−ＣＫ阻
害はバックグランド結合及び達成することができる競合の最大レベルを示す。
【０１４７】 走化性アッセイを、ケモカイン・リガンドの受容体を有することが知られる細
胞型に対して行った（Bacon et al, 1988, Br J Pharmacol 95:966-74）。
【０１４８】 図７は、ＣＥＭ細胞をＩＮＤＯ−１ＡＭ（Molecular Probes、Eugene、ＯＲ）
と共に「ロード」し、Dairaghi et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:28206-209に
記載されるカルシウム流動分析に処したアッセイを示す。
【０１４９】 簡単に述べると、ＣＣＲ４を発現するＣＥＭ細胞を蛍光計に入れ、全時間にわ
たって蛍光の変化を監視した。ＣＣＲ４の２種類の天然リガンドはＭＤＣ及びＴ
ＡＲＣである。ＴＡＲＣ−フラクタルカインもしくはＭＤＣ−フラクタルカイン
（融合タンパク質上清）、又は対照上清を以下の時間で添加した：実験１、対照
上清を５０秒で、ＴＡＲＫ−ＦＲＡＣを８０秒で添加した；実験２、対照上清を
５０秒で、ＭＤＣ−ＦＲＡＣを８０秒で添加した。対照上清はいかなるカルシウ
ムの流入も生じなかったが、それに対してＴＡＲＣ−ＦＲＡＣ又はＭＤＣ−ＦＲ
ＡＣは適度の流入を生じた。この実験は、ケモカイン・リガンド融合タンパク質
がシグナル伝達を生じ得ることを示す。
【０１５０】 Ｆ．固体表面へのスタルコカインの結合 スタルコカインを抗ヒスチジンｍＡｂｓへの結合によってガラス及びポリスチ
レン表面に固定した。ガラス基板は、８ウェル・チャンバ・スライド、又は疎水
性テフロン・マスクで印刷してウェルを生成したガラススライドのいずれかのス
ライドの形態であった。
【０１５１】 一組の実験においては、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの抗ｈｉｓ抗体（R&D Syst
ems、Minneapolis、ＭＮ）２５０μｌを５枚の８ウェル・チャンバ・スライド（
Lab-Tek II、Nalge Nunc International、Rochester、ＮＹ）の各ウェルに加え
、室温で一晩（典型的には１６時間）インキュベートした。続いて、各ウェル内
の液体を吸引し、５００μｌのＰＢＳで１回、約５分間洗浄した。その後、それ
らのウェルを２５０μｌのブロッキング溶液（２％ウシ胎児血清、ＰＢＳ中０．
５％のＢＳＡ）を添加することで「ブロック」（あらゆる追加のタンパク質結合
部位をブロック）し、室温（例えば、２０℃）で１時間インキュベートした。各
ウェル内の液体を吸引し、ケモカイン−スターク−固定化ドメイン融合タンパク
質（ＳＤＦ１ａ−ＦＲＡＣ、フィネタキシン−ＦＲＡＣ、ＣＣＬ２７−ＦＲＡＣ
、Ｉ３０９−ＦＲＡＣ、ＭＩＰ３ａ−ＦＲＡＣ、ＥＬＣ−ＦＲＡＣ、ＳＬＣ−Ｆ
ＲＡＣ、ＭＤＣ−ＦＲＡＣ、ＴＡＲＣ−ＦＲＡＣ、もしくはＢＲＡＫ−ＦＲＡＣ
）２５０μｌ又は対照上清を２つのウェルに加えた。各スライドは対照上清（偽
トランスフェクトした細胞に由来）を有する２つのウェル及び陽性対照ＳＤＦ１
ａ（遍在性ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を結合する）を有する２つのウェルを含
んでいた。他の４つのウェルは実験サンプル用であった。上清を室温（典型的に
は２０℃）で１時間インキュベートした後、３７℃でさらに１時間インキュベー
トした。上清を吸引し、各ウェルを５００μｌのＰＢＳで１回、５分間洗浄した
。これで、スライドはアッセイのための細胞の添加の準備ができた。
【０１５２】 ２枚の９６ウェル大フォーマット・ガラススライドを用いる第２の実験の組に
おいては、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌ抗ｈｉｓ抗体（R&D Systems、Minneapolis
、ＭＮ）５０μｌを各ウェルに添加し、室温で一晩（典型的には１６時間）、加
湿チャンバ内でインキュベートした。続いて、各ウェル内の液体を吸引し、５０
０μｌのＰＢＳで１回、約５分間洗浄した。その後、それらのウェルを５０μｌ
のブロッキング溶液（２％ウシ胎児血清、ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ）を添加す
ることで「ブロック」（あらゆる追加のタンパク質結合部位をブロック）し、室
温（２０℃）で１時間インキュベートした。各ウェル内の液体を吸引し、図５に
示される３２のケモカイン−スターク−固定化ドメイン融合タンパク質のうちの
１つを含む上清５０μｌを３つのウェルに加えた。各スライドは対照上清（偽ト
ランスフェクトした細胞に由来）を有する３つのウェル及び陽性対照ＳＤＦ１ａ
（遍在性ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を結合する）を有する３つのウェルを含ん
でいた。他のウェルは実験サンプル用であった。上清を室温（典型的には２０℃
）で１時間、加湿チャンバ内でインキュベートした後、３７℃でさらに１時間、
こちらも加湿チャンバ内でインキュベートした。上清を吸引し、各ウェルを５０
０μｌのＰＢＳで１回、５分間洗浄した。これで、スライドはアッセイのための
細胞の添加の準備ができた。
【０１５３】 Ｇ．細胞培養物におけるケモカイン受容体の発現 関心のある受容体、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣ
Ｒ８、ＣＸＣＲ４、ＣＭＶ ＵＳ２８の発現を駆動する哺乳動物発現ベクターを
含む、トランスフェクトしたマウス・ミエローマＮＳＯ細胞（R&D Systems（Min
neapolis、ＭＮ）からの贈り物）を含む幾つかの型の細胞を本発明のスタルコカ
インに対する結合アッセイにおいて用いた。この実験の結果を表６にまとめる。
【０１５４】表６ 細胞型 幾つかの公知リガンド スタルコカイン形態への結合 ＣＣＲ１−ＮＳＯ Ｃｋｂ８−１、ＭＣＰ３ 無、有 ＣＣＲ４−ＮＳＯ ＭＤＣ、ＴＡＲＣ 有、有 ＣＣＲ６−ＮＳＯ ＭＩＰ３ａ 有 ＣＣＲ７−ＮＳＯ ＥＬＣ、ＳＬＣ 有、無 ＣＣＲ８−ＮＳＯ １３０９、ｖＭＩＰ１ 有、有 ＣＣＲ１０−ＮＳＯ ＥＬＣ 有 ＣＸＣＲ４−ＮＳＯ ＦＫ、ｖＭＩＰII 有＊ 全ての場合において陰性対照（非結合性スタルコカイン）を実施した。 Ｃｋｂ８−１（別名、ＭＰＩＦ１）、ＥＬＣ（ＭＩＰ３ベータと同じ）、ＳＬＣ
（６Ｃｋｉｎｅ）。ＦＫ＝フラクタルカイン
【０１５５】 Ｈ．受容体発現性細胞及びスタルコカイン・アレーの接触 実験の１つにおいて、ＣＣＲ１−ＮＳＯ細胞を増殖させ、回収し、２×１０６ 細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液２５０μｌを、２つのウェ
ルを前述のようにＣＫｂ８−１ ＦＲＡＣ、ＭＣＰ３−ＦＲＡＣ、ＳＤＦＩａ−
ＦＲＡＣ（陽性対照）、又は偽トランスフェクトした上清（陰性対照）の各々で
コートした８ウェル・チャンバ・スライドの各ウェルに加えた。これらのスライ
ドを室温で１．５時間インキュベートした後、上清を穏やかに吸引した。（供給
者によって提供される装置を用いて）スライドのチャンバ部分を除去し、ＰＢＳ
を収容するペトリ皿に１ｃｍの深さまで穏やかに浸漬することによってスライド
を洗浄した。これを合計で３回繰り返し、スライドを１％グルタルアルデヒド溶
液（ＰＢＳ中）に室温で５分間浸漬した。細胞を検査し、顕微鏡によって視認計
数した。細胞はＭＣＰ３には結合したが、ＣＫｂ８テザード・リガンドには結合
しなかった。
【０１５６】 Ｉ．置換及び競合分析 実験の１つにおいて、ＣＣＲ４−ＮＳＯ細胞を結合競合の試験に用いた。回収
したＣＣＲ４ ＮＳＯ細胞をＰＢＳ中にｍｌ当たり２×１０６細胞で再懸濁させ
た。５００μｌの細胞アリコートをエッペンドルフ管に移し、５μｇの組換えヒ
ト・ケモカイン（ＭＤＣ又はＴＡＲＣ、R&D Systems、Minneapolis、ＭＮ）を添
加し（最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった）、簡単に混合して室温で１０分間イ
ンキュベートした。続いて、２５０μｌの細胞を、前述のようにＭＤＣ−ＦＲＡ
Ｃ又はＴＡＲＣ−ＦＲＡＣで予めコートされている８ウェル・チャンバ・スライ
ドの各々２つのウェルに添加した。可溶性ケモカインで前処理していない２５０
μｌの細胞をさらなるウェルに添加した。これらのスライドを室温で１．５時間
インキュベートした後、上清を穏やかに吸引した。（供給者によって提供される
装置を用いて）スライドのチャンバ部分を除去し、ＰＢＳを収容するペトリ皿に
１ｃｍの深さまで穏やかに浸漬することによってスライドを洗浄した。これを合
計で３回繰り返し、スライドを１％グルタルアルデヒド溶液（ＰＢＳ中）に室温
で５分間浸漬した。細胞を検査し、顕微鏡によって視認計数した。期待通り、細
胞はＭＤＣ−ＦＲＡＣ及びＴＡＲＣ−ＦＲＡＣの両者に結合した。期待通り、両
方の場合において、可溶性ＭＤＣ又はＴＡＲＣとの競合で結合がバックグランド
・レベルまで減少した。
【０１５７】 別の実験において、小分子化合物をｖＭＩＰII−ＦＲＡＣ及びＵＳ２８−ＮＳ
Ｏの結合に関して試験した。ケモカイン受容体ＵＳ２８とｖＭＩＰIIとの結合の
阻害剤として従来同定されている３種類の小有機化合物も、本発明を用いて、ｖ
ＭＩＰII−ＦＲＡＣ及びＵＳ２８発現性ＮＳＯ細胞の間の結合と競合し、かつそ
れを阻害することが観察された。
【０１５８】実施例３ この例は、受容体の結合特異性を決定するための、スタルコカインのアレーへ
のケモカイン受容体の結合を説明する。
【０１５９】 ケモカイン要素のパネルへのＣＣＲ１０の結合を追求するため、テザード・リ
ガンドのアレーを調製する。表５に列挙されるリガンド・ドメインの少なくとも
約３つ、少なくとも約５つ、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも
約２０又は全てを用いてｐｃ−ＦＲＡＣベースのスタルコカインを調製する。前
述のように抗ポリヒスチジン抗体で一晩、予めコートし、１時間ブロックした一
対の９６ウェル・スライド上にスタルコカインのアレーを調製する。各スタルコ
カインを３つのウェルに３０μｌの容積で入れ、加湿チャンバ内、３７℃で１．
５時間インキュベートする。陰性対照も３通りインキュベートし、これには（１
）偽トランスフェクトした上清、（２）固定化スターク領域（ケモカイン・ドメ
イン無し）、及び（３）ＰＢＳが含まれる。（遍在的に発現するケモカイン受容
体であるＣＸＣＲ４に結合する）ＳＤＦ１ａスタルコカインを陽性対照として用
いる。陽性及び陰性対照の組の各々を各プレート上でインキュベートする。
【０１６０】 上清を吸引し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄する。スタルコカインと共にインキ
ュベートする間、ＣＣＲ１０細胞株を調製する。この細胞株を培養フラスコから
トリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄する。これらの細胞をＰＢＳのｍｌ当たり
細胞１００万個の濃度で再懸濁させてプレートの各ウェルに添加し、室温で攪拌
することなく１．５時間インキュベートする。液滴を部分的に吸引し（表面上に
静止する細胞を乱さないよう注意を払いながら、約５μｌを残す）、ＰＢＳ（約
１５０ｍｌ、深さ１ｃｍ）を収容するトレーに徐々に入れた。９６ウェルプレー
トの４端の各々を、３つの連続するウェルの各々の内部の液面まで徐々に持ち上
げる。結合した細胞をSybrGreen 1（Molecular Probes、Eugene、ＯＲ）で３０
分間、ＰＢＳ中に１対５０００の希釈率で染色する。９６ウェルプレートを取り
除き、過剰の液体を排出させ、４８０ｎｍ励起、５３０ｎｍ発光のフィルターセ
ットを有するPackard Fluorescentプレートリーダーにおいてカウントする。さ
らなる分析のため、これらの結果をExcelファイルに移す。
【０１６１】 本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の刊行物又は特許出願の各々が
参照することによりそれらの全体が全ての目的のために組み込まれることが明確
に、かつ個別に意図されていたのと同じ程度まで、参照することによりそれら全
体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１６２】 当業者には明らかなように、本発明の多くの変形及び変種をその精神及び範囲
から逸脱することなくなすことができる。本明細書で説明される特定の態様は例
としてのみ提供されるものであり、本発明は、請求の範囲の権利が及ぶ等価物の
全範囲と共に、添付の請求の範囲の文言によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、テザード・リガンドの構造を示す。
【図２】 図２は、ヒトＣＣＲ１０のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＣＣＲ１
０ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】 図３は、スタルコカイン（stalkokaine）への結合によるＣＣＲ１０の同定を
示す。図３ＡはＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞による固定化スタルコカイン（Ｓ
Ｋ）の追求を示し、ここで、「対照」はスタルコカインを含まないウェルへのＨ
ＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞のバックグランド結合を示し（係留抗体のみが存在
する）；「ＥＬＣ−スタルコカイン（ＳＫ）」は係留抗体によって固定されてい
るＥＬＣ−スタルコカインを含む場所へのＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞の強い
結合を示し；「ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＥＬＣ」、「可溶性ＴＥＣＫ」、又は「可
溶性ＳＬＣ」は過剰濃度の示されるような可溶性組換え「未変性形態」ケモカイ
ンの存在下における結合の消失を示し；「ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＭＣＰ−３」は
多くの非競合性ケモカインの代表としてのＭＣＰ−３の存在下において結合の減
少がないことを示す。野生型ＨＥＫ２９３細胞はいずれの部位への結合も示さな
かった（図示せず）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、代表的な実験からの、可溶性ケモカインの存在下及び不在下におけ
るＥＬＣ−スタルコカインへのＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞の結合の定量を示
す。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、濃度が増加する冷ＥＬＣの存在下おいて放射標識ＥＬＣを用いる、
ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞（黒塗りの四角）又は野生型ＨＥＫ２９３細胞（
白抜きの四角）のいずれかに対する相同競合結合アッセイの結果を示す。
【図４】 図４は、ＥＬＣ−スタルコカインをコードする発現プラスミドの模式図を示す
。プラスミドの全ての詳細が示されているわけではない（例えば、ｐＡ部位、ポ
リリンカー、Ｏｒｉ、選択マーカーは示されない）。
【図５】 図５は、３２の異なるスタルコカインのウェスタンブロット分析を示す。個々
のスタルコカイン構築体の各々を２９３Ｔにトランスフェクトさせ、スタルコカ
インを含む上清を電気泳動、次いで抗ポリヒスチジン抗体を用いるウェスタンブ
ロット分析にかけた。各レーンにおいて等容積の上清を分析した。発現レベルは
ＭＣＰ３の場合の強い堆積から低レベルの堆積（ＩＬ−８）まで変化した。プロ
テアーゼ阻害剤を添加することによってスタルコカイン堆積の増強を達成するこ
とができる。グリコシル化のため、可溶性スタルコカインの見かけの分子量は典
型的な３５ｋＤａから約９０ｋＤａに増加した。部分的なグリコシル化は中間の
分子量を生じ、それはシグナルの非常に広いバンド又はスメアによって示された
。ＭＷマーカー＝９７．４、６８、４３、２９、１８．４、１４．３ｋＤａ。
【図６】 図６は、スタルコカインによる、放射標識トレーサー・ケモカインのその同族
受容体への結合での競合示す置換アッセイを示す。
【図７】 図７は、受容体依存様式でのカルシウム・シグナル伝達の誘導を示す、ＴＡＲ
Ｃ−スタルコカイン又はＭＤＣ−スタルコカインと接触させたＣＣＲ４受容体を
発現するＣＥＭ細胞を用いるカルシウム代謝アッセイを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月８日（２００２．７．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】 テザード・リガンド融合タンパク質が酵母において発現する場合、プラスミド
及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを含む多くの適切なベクターが利用可能
である。ベクターは、典型的には、記述されるように、発現制御配列、例えば、
構成もしくは誘導性プロモーター（例えば、アルファ因子、アルコールオキシダ
ーゼ、ＰＧＨ、及び３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素）、並び
に複製起点、終止配列等を含む。ピッチア（Pichia）において用いるのに適する
ベクターには、pPICZ、His6/pPICZB、pPICZalpha、pPIC3,5K、pPIC9K、pA0815、
pGAP2A、B及びC、pGAP2alphaA、B、及びC（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）並び
に当該技術分野において公知であるか、又は開発される多くの他のものが含まれ
る。一態様においては、ベクターHis6/pPICZB（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）
を酵母ピッチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるHis6(SEQ ID No: 101
)−テザード・リガンド融合タンパク質の発現に用いる。サッカロミセス属にお
いて有用なベクターの例はpYES2（Invitrogen、San Diego、ＣＡ）である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】 （４）分泌されたテザード・リガンド融合タンパク質を細胞培地から精製する
ことが時折望ましいものであり、一般には、非分泌タンパク質は使用前に精製す
る必要がある。精製は様々な方法を用いて行うことができ、この方法には、例え
ば、ポリヒスチジン・トラクト（tract）（例えば、Ｈｉｓ６；SEQ ID No: 101
）を含む癒合タンパク質の金属キレート・アフィニティクロマトグラフィー、プ
ロテインＡドメインもしくは断片（これは、固定化免疫グロブリンでの精製を可
能にする）、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製システム（Immunex Corp、
Seattle、ＷＡ）において用いられるドメインが含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、テザード・リガンドの構造を示す。
【図２】 図２は、ヒトＣＣＲ１０のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＣＣＲ１
０ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】 図３は、スタルコカイン（stalkokaine）への結合によるＣＣＲ１０の同定を
示す。図３ＡはＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞による固定化スタルコカイン（Ｓ
Ｋ）の追求を示し、ここで、「対照」はスタルコカインを含まないウェルへのＨ
ＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞のバックグランド結合を示し（係留抗体のみが存在
する）；「ＥＬＣ−スタルコカイン（ＳＫ）」は係留抗体によって固定されてい
るＥＬＣ−スタルコカインを含む場所へのＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞の強い
結合を示し；「ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＥＬＣ」、「可溶性ＴＥＣＫ」、又は「可
溶性ＳＬＣ」は過剰濃度の示されるような可溶性組換え「未変性形態」ケモカイ
ンの存在下における結合の消失を示し；「ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＭＣＰ−３」は
多くの非競合性ケモカインの代表としてのＭＣＰ−３の存在下において結合の減
少がないことを示す。野生型ＨＥＫ２９３細胞はいずれの部位への結合も示さな
かった（図示せず）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、代表的な実験からの、可溶性ケモカインの存在下及び不在下におけ
るＥＬＣ−スタルコカインへのＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞の結合の定量を示
す。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、濃度が増加する冷ＥＬＣの存在下おいて放射標識ＥＬＣを用いる、
ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ１０細胞（黒塗りの四角）又は野生型ＨＥＫ２９３細胞（
白抜きの四角）のいずれかに対する相同競合結合アッセイの結果を示す。
【図４】 図４は、ＥＬＣ−スタルコカインをコードする発現プラスミドの模式図を示す
。プラスミドの全ての詳細が示されているわけではない（例えば、ｐＡ部位、ポ
リリンカー、Ｏｒｉ、選択マーカーは示されない）。６ｘＨｉｓ＝ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １０１．
【図５】 図５は、３２の異なるスタルコカインのウェスタンブロット分析を示す。個々
のスタルコカイン構築体の各々を２９３Ｔにトランスフェクトさせ、スタルコカ
インを含む上清を電気泳動、次いで抗ポリヒスチジン抗体を用いるウェスタンブ
ロット分析にかけた。各レーンにおいて等容積の上清を分析した。発現レベルは
ＭＣＰ３の場合の強い堆積から低レベルの堆積（ＩＬ−８）まで変化した。プロ
テアーゼ阻害剤を添加することによってスタルコカイン堆積の増強を達成するこ
とができる。グリコシル化のため、可溶性スタルコカインの見かけの分子量は典
型的な３５ｋＤａから約９０ｋＤａに増加した。部分的なグリコシル化は中間の
分子量を生じ、それはシグナルの非常に広いバンド又はスメアによって示された
。ＭＷマーカー＝９７．４、６８、４３、２９、１８．４、１４．３ｋＤａ。
【図６】 図６は、スタルコカインによる、放射標識トレーサー・ケモカインのその同族
受容体への結合での競合示す置換アッセイを示す。
【図７】 図７は、受容体依存様式でのカルシウム・シグナル伝達の誘導を示す、ＴＡＲ
Ｃ−スタルコカイン又はＭＤＣ−スタルコカインと接触させたＣＣＲ４受容体を
発現するＣＥＭ細胞を用いるカルシウム代謝アッセイを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１５年１月３１日（２００３．１．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】 当業者には明らかなように、本発明の多くの変形及び変種をその精神及び範囲
から逸脱することなくなすことができる。本明細書で説明される特定の態様は例
としてのみ提供されるものであり、本発明は、請求の範囲の権利が及ぶ等価物の
全範囲と共に、添付の請求の範囲の文言によってのみ限定される。 「配列表」 SEQUENCE LISTING <110> Schall, Thomas J. Talbot, Dale Miao, Zhenhua Wei, Zheng ChemoCentryx, Inc. <120> Tethered Ligands and Methods of Use <130> 019934-001210PC <140> WO PCT/US00/34503 <141> 2000-12-18 <150> US 60/172,979 <151> 1999-12-20 <150> US 60/186,626 <151> 2000-03-03 <150> US 09/721,908 <151> 2000-11-24 <160> 101 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1147 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> nucleotide sequence for human CCR10 <220> <221> CDS <222> (1)..(1053) <400> 1 atg gct ttg gaa cag aac cag tca aca gat tat tat tat gag gaa aat 48 Met Ala Leu Glu Gln Asn Gln Ser Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Glu Asn 1 5 10 15 gaa atg aat ggc act tat gac tac agt caa tat gaa ctg atc tgt atc 96 Glu Met Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Leu Ile Cys Ile 20 25 30 aaa gaa gat gtc aga gaa ttt gca aaa gtt ttc ctc cct gta ttc ctc 144 Lys Glu Asp Val Arg Glu Phe Ala Lys Val Phe Leu Pro Val Phe Leu 35 40 45 aca ata gtt ttc gtc att gga ctt gca ggc aat tcc atg gta gtg gca 192 Thr Ile Val Phe Val Ile Gly Leu Ala Gly Asn Ser Met Val Val Ala 50 55 60 att tat gcc tat tac aag aaa cag aga acc aaa aca gat gtg tac atc 240 Ile Tyr Ala Tyr Tyr Lys Lys Gln Arg Thr Lys Thr Asp Val Tyr Ile 65 70 75 80 ctg aat ttg gct gta gca gat tta ctc ctt cta ttc act ctg cct ttt 288 Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Leu Pro Phe 85 90 95 tgg gct gtt aat gca gtt cat ggg tgg gtt tta ggg aaa ata atg tgc 336 Trp Ala Val Asn Ala Val His Gly Trp Val Leu Gly Lys Ile Met Cys 100 105 110 aaa ata act tca gcc ttg tac aca cta aac ttt gtc tct gga atg cag 384 Lys Ile Thr Ser Ala Leu Tyr Thr Leu Asn Phe Val Ser Gly Met Gln 115 120 125 ttt ctg gct tgt atc agc ata gac aga tat gtg gca gta act aaa gtc 432 Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Val Thr Lys Val 130 135 140 ccc agc caa tca gga gtg gga aaa cca tgc tgg atc atc tgt ttc tgt 480 Pro Ser Gln Ser Gly Val Gly Lys Pro Cys Trp Ile Ile Cys Phe Cys 145 150 155 160 gtc tgg atg gct gcc atc ttg ctg agc ata ccc cag ctg gtt ttt tat 528 Val Trp Met Ala Ala Ile Leu Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val Phe Tyr 165 170 175 aca gta aat gac aat gct agg tgc att ccc att ttc ccc cgc tac cta 576 Thr Val Asn Asp Asn Ala Arg Cys Ile Pro Ile Phe Pro Arg Tyr Leu 180 185 190 gga aca tca atg aaa gca ttg att caa atg cta gag atc tgc att gga 624 Gly Thr Ser Met Lys Ala Leu Ile Gln Met Leu Glu Ile Cys Ile Gly 195 200 205 ttt gta gta ccc ttt ctt att atg ggg gtg tgc tac ttt atc aca gca 672 Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Met Gly Val Cys Tyr Phe Ile Thr Ala 210 215 220 agg aca ctc atg aag atg cca aac att aaa ata tct cga ccc cta aaa 720 Arg Thr Leu Met Lys Met Pro Asn Ile Lys Ile Ser Arg Pro Leu Lys 225 230 235 240 gtt ctg ctc aca gtc gtt ata gtt ttc att gtc act caa ctg cct tat 768 Val Leu Leu Thr Val Val Ile Val Phe Ile Val Thr Gln Leu Pro Tyr 245 250 255 aac att gtc aag ttc tgc cga gcc ata gac atc atc tac tcc ctg atc 816 Asn Ile Val Lys Phe Cys Arg Ala Ile Asp Ile Ile Tyr Ser Leu Ile 260 265 270 acc agc tgc aac atg agc aaa cgc atg gac atc gcc atc caa gtc aca 864 Thr Ser Cys Asn Met Ser Lys Arg Met Asp Ile Ala Ile Gln Val Thr 275 280 285 gaa agc atc gca ctc ttt cac agc tgc ctc aac cca atc ctt tat gtt 912 Glu Ser Ile Ala Leu Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val 290 295 300 ttt atg gga gca tct ttc aaa aac tac gtt atg aaa gtg gcc aag aaa 960 Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys Asn Tyr Val Met Lys Val Ala Lys Lys 305 310 315 320 tat ggg tcc tgg aga aga cag aga caa agt gtg gag gag ttt cct ttt 1008 Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln Arg Gln Ser Val Glu Glu Phe Pro Phe 325 330 335 gat tct gag ggt cct aca gag cca acc agt act ttt agc att taa 1053 Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu Pro Thr Ser Thr Phe Ser Ile 340 345 350 aggtaaaact gctctgcctt ttgcttggat acatatgaat gatgctttcc cctcaaata 1113 aacatctgcc ttattctgaa aaaaaaaaaa aaam 1147 <210> 2 <211> 350 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> human CCR10 <400> 2 Met Ala Leu Glu Gln Asn Gln Ser Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Glu Asn 1 5 10 15 Glu Met Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Leu Ile Cys Ile 20 25 30 Lys Glu Asp Val Arg Glu Phe Ala Lys Val Phe Leu Pro Val Phe Leu 35 40 45 Thr Ile Val Phe Val Ile Gly Leu Ala Gly Asn Ser Met Val Val Ala 50 55 60 Ile Tyr Ala Tyr Tyr Lys Lys Gln Arg Thr Lys Thr Asp Val Tyr Ile 65 70 75 80 Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Trp Ala Val Asn Ala Val His Gly Trp Val Leu Gly Lys Ile Met Cys 100 105 110 Lys Ile Thr Ser Ala Leu Tyr Thr Leu Asn Phe Val Ser Gly Met Gln 115 120 125 Phe Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Val Thr Lys Val 130 135 140 Pro Ser Gln Ser Gly Val Gly Lys Pro Cys Trp Ile Ile Cys Phe Cys 145 150 155 160 Val Trp Met Ala Ala Ile Leu Leu Ser Ile Pro Gln Leu Val Phe Tyr 165 170 175 Thr Val Asn Asp Asn Ala Arg Cys Ile Pro Ile Phe Pro Arg Tyr Leu 180 185 190 Gly Thr Ser Met Lys Ala Leu Ile Gln Met Leu Glu Ile Cys Ile Gly 195 200 205 Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Met Gly Val Cys Tyr Phe Ile Thr Ala 210 215 220 Arg Thr Leu Met Lys Met Pro Asn Ile Lys Ile Ser Arg Pro Leu Lys 225 230 235 240 Val Leu Leu Thr Val Val Ile Val Phe Ile Val Thr Gln Leu Pro Tyr 245 250 255 Asn Ile Val Lys Phe Cys Arg Ala Ile Asp Ile Ile Tyr Ser Leu Ile 260 265 270 Thr Ser Cys Asn Met Ser Lys Arg Met Asp Ile Ala Ile Gln Val Thr 275 280 285 Glu Ser Ile Ala Leu Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val 290 295 300 Phe Met Gly Ala Ser Phe Lys Asn Tyr Val Met Lys Val Ala Lys Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ser Trp Arg Arg Gln Arg Gln Ser Val Glu Glu Phe Pro Phe 325 330 335 Asp Ser Glu Gly Pro Thr Glu Pro Thr Ser Thr Phe Ser Ile 340 345 350 <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Fractalkine Mucin-Repeat Region <400> 3 Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr Pro Ala Ala Gly Gly Met Asp 1 5 10 15 Glu Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser Ser Leu 20 25 30 Glu Pro Thr Pro Ser Ser Gln Glu Ala Gln Arg Ala Leu Gly Thr Ser 35 40 45 Pro Glu Leu Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg Leu Pro 50 55 60 Pro Thr Pro Lys Ala Gln Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu Leu Phe 65 70 75 80 Arg Val Pro Pro Val Ser Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser Ala Pro 85 90 95 His Gln Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser Glu Ala 100 105 110 Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser Ser Pro 115 120 125 Ala Pro Glu Glu Asn Ala Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp Gly Gln 130 135 140 Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu Met Gly 145 150 155 160 Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro Gly Ser 165 170 175 Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr Pro Ser 180 185 190 Arg Glu Pro Val Ala Ser Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu Glu Pro 195 200 205 Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile Thr Pro 210 215 220 Val Pro 225 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Fractalkine Mucin-Repeat Sequence Residues 100-336 <400> 4 Gly Gly Thr Phe Glu Lys Gln Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gly Gly Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Ala 20 25 30 Thr Gly Glu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ser Gln Glu Ala 35 40 45 Gln Arg Ala Leu Gly Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly Val Thr Gly 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Arg Leu Pro Pro Thr Pro Lys Ala Gln Asp Gly Gly 65 70 75 80 Pro Val Gly Thr Glu Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser Thr Ala Ala 85 90 95 Thr Trp Gln Ser Ser Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala 100 105 110 Glu Ala Lys Thr Ser Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr Gln 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala Pro Ser Glu 130 135 140 Gly Gln Arg Val Trp Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser 145 150 155 160 Leu Glu Arg Glu Glu Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe 165 170 175 Gln Asp Trp Gly Pro Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val 180 185 190 Ser Ser Glu Gly Thr Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser Gly Ser Trp 195 200 205 Thr Pro Lys Ala Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg 210 215 220 Leu Gly Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala 225 230 235 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 5 Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 6 Gly Gly Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 7 Thr Gly Glu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 8 Leu Gly Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 9 Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg Leu Pro Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 10 Val Gly Thr Glu Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 11 Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser Ala Pro His Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 12 Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 13 Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 14 Gln Ala Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 15 Val Trp Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 16 Ser Leu Glu Arg Glu Glu Met Gly Pro Val Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <220> <223> Mucin Repeat Domain <400> 17 Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 18 Pro Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 19 Glu Gly Thr Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 20 Ser Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu Glu Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mucin repeat domain <400> 21 Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile Thr Pro Val Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:influenza virus neuraminidase protein hypervariable stalk region <400> 22 His Phe Lys Gln Tyr Glu Cys Ser Ser Pro Pro Asn Asn Gln Val Ile 1 5 10 15 Pro Cys Gln Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu Ile Val Tyr 20 25 30 Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys Leu Val Glu 35 40 45 Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro 50 55 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MDC forward primer <400> 23 ggtgaattca tggctcgcct acagactgc 29 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MDC reverse primer <400> 24 ggtgaattct tggctcagct tattgagaat ca 32 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC1 forward primer <400> 25 ggtgaattca tgaagatctc cgtggctgcc 30 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC1 reverse primer <400> 26 ggtgaattcg ttctccttca tgtccttgat atag 34 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SLC forward primer <400> 27 ggtgaattca tggctcagtc actggctctg 30 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SLC reverse primer <400> 28 ggtgaattct ggccctttag gggtctgtg 29 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIG forward primer <400> 29 ggtgaattca tgaagaaaag tggtgttctt ttcc 34 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIG reverse primer <400> 30 ggtgaattct gtagtcttct tttgacgaga acg 33 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IP10 forward primer <400> 31 ggtgaattca tgaatcaaac tgcgattctg a 31 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IP10 reverse primer <400> 32 ggtgaattca ggagatcttt tagacatttc cttg 34 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:H174/I-TAC forward primer <400> 33 gtggaattca tgagtgtgaa gggcatggc 29 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:H174/I-TAC reverse primer <400> 34 ggtgaattca aaattctttc tttcaacttt tttga 35 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Eotaxin1 forward primer <400> 35 ggtgaattca tgaaggtctc cgcagcactt c 31 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Eotaxin 1 reverse primer <400> 36 ggtgaattct ggctttggag ttggagattt ttg 33 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TARC forward primer <400> 37 ggtgaattca tggccccact gaagatgct 29 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TARC reverse primer <400> 38 ggtgaattca gacctctcaa ggctttgcag 30 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP3alpha forward primer <400> 39 ggtgaattca tgtgctgtac caagagtttg c 31 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP3alpha reverse primer <400> 40 ggtgaattcc atgttcttga cttttttact gagg 34 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ELC forward primer <400> 41 ggtgaattca tggccctgct actggccct 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ELC reverse primer <400> 42 ggtgaattca ctgctgcggc gcttcatct 29 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TECK forward primer <400> 43 ggtgaattca tgaacctgtg gctcctggc 29 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TECK reverse primer <400> 44 ggtgaattcc agtcctgaat tagctgatat cag 33 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PARC forward primer <400> 45 ggtgaattca tgaagggcct tgcagctgc 29 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PARC reverse primer <400> 46 ggtgaattcg gcattcagct tcaggtcgc 29 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SLC forward primer <400> 47 ggtgaattca tggctcagtc actggctctg 30 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SLC reverse primer <400> 48 ggtgaattct ggccctttag gggtctgtg 29 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:I309 forward primer <400> 49 ggtgaattca tgcagatcat caccacagcc c 31 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:I309 reverse primer <400> 50 ggtgaattct tttctttttg acgggcagtg c 31 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP1alpha forward primer <400> 51 ggtgaattca tgcaggtctc cactgctgc 29 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP1alpha reverse primer <400> 52 ggtgaattcg gcactcagct ctaggtcgct 30 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP-4 forward primer <400> 53 ggtgaattca tgaaagtctc tgcagtgctt ctg 33 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP-4 reverse primer <400> 54 ggtgaattca gtcttcaggg tgtgagcttt cc 32 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP1 forward primer <400> 55 ggtgaattca tgaaagtctc tgccgccctt 30 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP1 reverse primer <400> 56 ggtgaattca gtcttcggag tttgggtttg c 31 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP2 forward primer <400> 57 ggtgaattca tgaaggtttc tgcagcgct 29 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP2 reverse primer <400> 58 ggtgaattct ggcttcagat tttgaaatat ttg 33 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SDF1a forward primer <400> 59 ggtgaattca tgaacgccaa ggtcgtgg 28 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SDF1a reverse primer <400> 60 ggtgaattcc ttgtttaaag ctttctccag gt 32 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP5 forward primer <400> 61 ggtgatatca tgaagatttc cacacttcta tgcc 34 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MCP5 reverse primer <400> 62 ggtgatatcg cctagacatg aaggttcaag gatg 34 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC2 forward primer <400> 63 ggtgaattca tgaaggtctc cgtggctgc 29 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC2 reverse primer <400> 64 ggtgaattct attgagtagg gcttcagctt t 31 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Clone 391 forward primer <400> 65 ggtgaattca tgaaggtctt ctccttggtc atg 33 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Clone 391 reverse primer <400> 66 ggtgaattcc gttgaggtgt tgctcagctt c 31 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:BCA1 forward primer <400> 67 ggtgatatca tgaagtcatc tcgacatctc tg 32 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:BCA1 reverse primer <400> 68 ggtgatatcg ggaatctttc tcttaaacac tgg 33 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PF4a forward primer <400> 69 ggtgaattca tgagctccgc agccgggttc 30 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PF4a reverse primer <400> 70 ggtgaattca ctctccaaaa gtttcttaat tatttt 36 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBP-like1 forward primer <400> 71 ggtgaattca tgccaccctg cagctgtg 28 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBP-like 1 reverse primer <400> 72 ggtgaattct aaagccattg tgaatatgat ctg 33 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Eotaxin 2 forward primer <400> 73 ggtcccggga 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<400> 79 ggtgaattca tgagaaactc caagactgcc a 31 <210> 80 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MRP-1 reverse primer <400> 80 ggtgaattca gcaatgacct tgttcccaga t 31 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Lymphotactin (LYNT) forward primer <400> 81 ggtgaattca tgatacttct catcctggcc c 31 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Lymphotactin (LYNT) reverse primer <400> 82 ggtgaattcg ccagtcaggg tcacagctg 29 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC4 forward primer <400> 83 ggtgaattca tgaaggtctc cgaggctgc 29 <210> 84 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HCC4 reverse primer <400> 84 ggtgaattcc tgggagttga ggagctggg 29 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP-1gamma forward primer <400> 85 ggtgaattca tgaagccttt tcatactgcc c 31 <210> 86 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MIP-1gamma reverse primer <400> 86 ggtgaattct tgtttgtagg tccgtggttg t 31 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IL-8 forward primer <400> 87 ggtgatatca tgacttccaa gctggccg 28 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IL-8 reverse primer <400> 88 ggtgatatct gaattctcag ccctcttcaa a 31 <210> 89 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ENA-78 forward primer <400> 89 ggtgaattca tgagcctcct gtccagccg 29 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ENA-78 reverse primer <400> 90 ggtgaattcg ttttccttgt ttccaccgtc c 31 <210> 91 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GROgamma forward primer <400> 91 ggtgatatca tggcccacgc cacgctctc 29 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GROgamma reverse primer <400> 92 ggtgatatcg ttggtgctcc ccttgttcag 30 <210> 93 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GRObeta forward primer <400> 93 ggtgatatca tggcccgcgc cacgctctc 29 <210> 94 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GRObeta reverse primer <400> 94 ggtgatatcg ttggatttgc catttttcag c 31 <210> 95 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NAP-2 forward primer <400> 95 ggtgatatca tgagcctcag acttgatacc acc 33 <210> 96 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NAP-2 reverse primer <400> 96 ggtgatatca tcagcagatt catcacctgc c 31 <210> 97 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GROalpha forward primer <400> 97 ggtgatatca tggcccgcgc tgctctctc 29 <210> 98 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GROalpha reverse primer <400> 98 ggtgatatcg ttggatttgt cactgttcag catc 34 <210> 99 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:vMIP forward primer <400> 99 ggtgaattca tggcccccgt ccacgtttt 29 <210> 100 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:vMIP reverse primer <400> 100 ggtgaattca tggacaccaa gggcatcct 29 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:6XHis, His-6 polyhistidine tract <400> 101 His His His His His His 1 5
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／７２１，９０８ (32)優先日 平成12年11月24日(2000．11．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タルボット、デイル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94127、サンフランシスコ、ブレントウッ ド アベニュー 67 (72)発明者 ミアオ、ツェンファ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95129、サンノゼ、レインボウ ドライブ ２、7070 (72)発明者 ウェイ、ツェング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94063、レッドウッド シティ、デュアー ン ストリート 12、75 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA11 BA21 CA04 DA03 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ08 QR48 QS33 4C084 AA17 NA14 ZB072 ZB132 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 EA50 FA74

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アレーに組織化された複数の異なる固定化テザード・リガンド融合タンパク質
    を含むアッセイ装置であって、該リガンド・スターク融合タンパク質が： （ａ）リガンド・ドメイン、及び （ｂ）スターク・ドメイン、 を含む装置。
  2. 【請求項２】 アレーに組織化された複数の異なる固定化テザード・リガンド融合タンパク質
    を含むアッセイ装置であって、該リガンド・スターク融合タンパク質が： （ａ）リガンド・ドメイン； （ｂ）中間スターク・ドメイン；及び （ｃ）固定化ドメイン、 を含み、ここで、該リガンド・ドメイン及び該スターク・ドメインは天然タンパ
    ク質においては会合しない装置。
  3. 【請求項３】 固定化テザード・リガンド融合タンパク質がムチン誘導スターク配列を含む請
    求項２の装置。
  4. 【請求項４】 固定化テザード・リガンド融合タンパク質がフラクタルカイン・ムチン反復領
    域配列を含む請求項２の装置。
  5. 【請求項５】 少なくとも幾つかの固定化テザード・リガンド融合タンパク質がケモカインを
    コードするリガンド・ドメインを含む請求項２の装置。
  6. 【請求項６】 受容体とリガンドとの相互作用を同定するための方法であって、 （ａ）受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を固定化テザー
    ド・リガンド融合タンパク質と接触させ；及び （ｂ）該細胞及び融合タンパク質の結合を検出する、 ことを含み、ここで、融合タンパク質への細胞の結合は受容体と融合タンパク質
    のリガンド・ドメインに相当するリガンドとの相互作用に相関する方法。
  7. 【請求項７】 テザード・リガンドが請求項１のアッセイ装置に固定されている請求項６の方
    法。
  8. 【請求項８】 細胞が組換え受容体を発現する請求項６の方法。
  9. 【請求項９】 細胞が７回膜貫通受容体を発現する請求項６の方法。
  10. 【請求項１０】 細胞がケモカイン受容体又はサイトカイン受容体を発現する請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 細胞がオーファン受容体を発現する請求項６の方法。
  12. 【請求項１２】 受容体と１つを上回るリガンドとの相互作用が検出される請求項６の方法。
  13. 【請求項１３】 受容体とリガンドとの相互作用のモジュレータを同定するための方法であって
    、 （ａ）受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の
    不在下において固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ融合
    タンパク質への細胞の結合を測定し； （ｂ）受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の
    存在下において固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ融合
    タンパク質への細胞の結合を測定し；及び （ｃ）（ａ）及び（ｂ）における結合のレベルを比較する、 ことを含み、ここで、試験化合物の存在下における細胞の結合の減少はその試験
    化合物が受容体と該融合タンパク質のリガンド・ドメインに相当するリガンドと
    の相互作用の阻害剤であることを示し、試験化合物の存在下における細胞の結合
    の増加はその試験化合物が受容体と融合タンパク質のリガンド・ドメインに相当
    するリガンドとの相互作用のエンハンサであることを示す方法。
  14. 【請求項１４】 テザード・リガンドが請求項１のアッセイ装置上に固定されている請求項１３
    の方法。
  15. 【請求項１５】 受容体がケモカイン受容体である請求項１３の方法。
  16. 【請求項１６】 細胞集団中の細胞における受容体発現のプロフィールを検出するための方法で
    あって： （ａ）該細胞集団を固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、及
    び （ｂ）融合タンパク質への該細胞集団の細胞の結合を検出する、 ことを含み、ここで、融合タンパク質への細胞集団中の細胞の結合は融合タンパ
    ク質のリガンド・ドメインに相当するリガンドに結合する受容体の発現に相関す
    る方法。
  17. 【請求項１７】 工程（ａ）が集団を複数の異なる融合タンパク質と接触させることを含み、か
    つ工程（ｂ）がゼロ、１又は２以上の融合タンパク質への細胞の結合を検出する
    ことを含む請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 ゼロ、１又は２以上のテザード・リガンド融合タンパク質への前記集団の細胞
    の結合を検出することを含む請求項１７の方法。
  19. 【請求項１９】 テザード・リガンドが請求項１のアッセイ装置上に固定されている請求項１７
    の方法。
  20. 【請求項２０】 集合が不均一である請求項１６の方法。
  21. 【請求項２１】 集団が滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又は血液から得られる
    請求項２０の方法。
  22. 【請求項２２】 アレー内の各テザード・リガンド融合タンパク質への結合のレベルを定量する
    ことをさらに含む請求項１６の方法。
  23. 【請求項２３】 アレーの各セクタで結合する細胞を特徴付けることをさらに含む請求項２３の
    方法。
  24. 【請求項２４】 （ａ）疾患を患うことが疑われる患者から細胞集団を得、 （ｂ）該集団について受容体プロフィールを決定し；及び （ｃ）該受容体プロフィールを該疾患状態のプロフィール特性と比較する、 ことを含む診断方法。
  25. 【請求項２５】 （ａ）疾患を患うことが疑われる患者から細胞集団を得、 （ｂ）該集団についての受容体プロフィールを、 （ｉ）該細胞集団を請求項１の装置と接触させ；及び （ii）該集団の細胞が結合するアレー化テザード・リガンド融合タンパク
    質のサブセットと同定し、それにより受容体プロフィールを決定する； ことによって決定し、 （ｃ）該受容体プロフィールを該疾患状態のプロフィール特性と比較する、 ことを含む診断方法。
  26. 【請求項２６】 前記受容体プロフィールの決定がアレーの各セクターで結合する細胞を特徴付
    けることをさらに含む請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 特徴付けを免疫染色によって達成する請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 アレーの各セクタでの細胞の結合を定量することをさらに含む請求項２５の方
    法。
  29. 【請求項２９】 疾患が炎症もしくはアレルギー性疾患、又は自己免疫疾患である請求項２４の
    方法。
  30. 【請求項３０】 集団が滑液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、又は血液から得られる
    請求項２４の方法。
  31. 【請求項３１】 患者に対する薬物又は治療の効果を検出するための方法であって： （ａ）患者に由来する細胞集団の受容体プロフィールの第１の決定を行い； （ｂ）薬物又は治療を患者に施し； （ｃ）患者に由来する細胞集団の受容体プロフィールの第２の決定を行い、 （ｄ）（ａ）及び（ｃ）における受容体プロフィールを比較して患者における
    受容体発現細胞に対する薬物又は治療の効果を決定する、 ことを含む方法。
  32. 【請求項３２】 患者に対する薬物又は治療の効果を検出するための方法であって： （ａ）患者に由来する細胞集団の受容体プロフィールの第１の決定を、 （ｉ）該細胞集団を請求項１の装置と接触させ；及び （ii）該集団の細胞が結合するアレー化テザード・リガンド融合タンパク
    質のサブセットを同定し、それにより受容体プロフィールを同定する、 ことによって行い； （ｂ）薬物又は治療を患者に施し； （ｃ）患者に由来する細胞集団の受容体プロフィールの第２の決定を行い、 （ｄ）（ａ）及び（ｃ）において観察される受容体プロフィールを比較して患
    者における受容体発現細胞に対する薬物又は治療の効果を決定する、 ことを含む方法。
  33. 【請求項３３】 アレー内の各テザード・リガンド融合タンパク質への結合のレベルを定量する
    ことをさらに含む請求項３２の方法。
  34. 【請求項３４】 アレーの各セクターで結合する細胞を特徴付けることをさらに含む請求項３２
    の方法。
  35. 【請求項３５】 特徴付けを免疫染色によって達成する請求項３４の方法。
  36. 【請求項３６】 受容体とリガンドとの相互作用のモジュレータを同定するための方法であって
    、 （ａ）受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の
    存在下において固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ、かつ融合
    タンパク質への結合のレベルを決定し、 （ｂ）受容体又はそれらのリガンド結合性部分を発現する細胞を試験化合物の
    不在下において固定化テザード・リガンド融合タンパク質と接触させ；かつ融合
    タンパク質への結合のレベルを決定し、並びに （ｃ）（ａ）及び（ｂ）における固定化テザード・リガンド融合タンパク質へ
    の結合のレベルを比較する、 ことを含み、 ここで、該リガンド・スターク融合タンパク質は： （ｉ）リガンド・ドメイン； （ii）中間スターク・ドメイン；及び （iii）固定化ドメイン、 を含み、 該リガンド・ドメイン及び該スターク・ドメインは天然タンパク質においては
    会合せず、並びに 試験化合物の存在下における細胞の結合の減少は該試験化合物が受容体と該融
    合タンパク質のリガンド・ドメインに相当するリガンドとの相互作用の阻害剤で
    あることを示し、かつ試験化合物の存在下における細胞の結合の増加は該試験化
    合物が受容体と該融合タンパク質のリガンド・ドメインに相当するリガンドとの
    相互作用のエンハンサであることを示す方法。
  37. 【請求項３７】 スターク・ドメインがリガンドに対してカルボキシ末端側であり、かつ固定化
    ドメインがスターク・ドメインに対してカルボキシ末端側である請求項３１の方
    法。
  38. 【請求項３８】 細胞が組換え受容体を発現する請求項３１の方法。
  39. 【請求項３９】 細胞がケモカイン受容体を発現する請求項３１の方法。
  40. 【請求項４０】 細胞がオーファン受容体を発現する請求項３８の方法。
  41. 【請求項４１】 受容体と１つを上回るリガンドとの相互作用が検出される請求項３６の方法。
  42. 【請求項４２】 少なくとも２種類の異なる固定化リガンド融合タンパク質を含むキットであっ
    て、該少なくとも２種類の異なる固定化リガンド融合タンパク質が同じ基体上に
    は固定されていないキット。
  43. 【請求項４３】 融合タンパク質がビーズ又はスライド上に固定される請求項４２のキット。
  44. 【請求項４４】 テザード・リガンド融合タンパク質であって、該リガンド・ドメイン及び該ス
    ターク・ドメインが天然タンパク質においては会合しないテザード・リガンド融
    合タンパク質。
  45. 【請求項４５】 リガンド・ドメインがケモカイン配列以外である請求項４４のテザード・リガ
    ンド融合タンパク質。
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