JPH07147987A - ユビキチン接合性酵素（ｅ２）融合タンパク質 - Google Patents

ユビキチン接合性酵素（ｅ２）融合タンパク質

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JPH07147987A
JPH07147987A JP6115081A JP11508194A JPH07147987A JP H07147987 A JPH07147987 A JP H07147987A JP 6115081 A JP6115081 A JP 6115081A JP 11508194 A JP11508194 A JP 11508194A JP H07147987 A JPH07147987 A JP H07147987A
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dna
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fusion protein
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JP6115081A
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Richard David Vierstra
ディヴィッド ヴィアストラ リチャード
Mark Mattnew Gosink
マシュー ゴーシンク マーク
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 標的タンパク質にユビキチンを付加させるこ
とができかつユビキチン統制タンパク質分解プロセスを
引き起こすことができる融合タンパク質を作る。 【構成】 アミノ末端からカルボキシル末端までに、Ｅ
２タンパク質由来のコア領域であってＥ１タンパク質か
らのユビキチンタンパク質へのチオール結合をエステル
交換によって機能的に形成できるコア領域；少なくとも
４アミノ酸のスペーサー；及び少なくとも１つの標的タ
ンパク質に対して特異的結合親和性を有するタンパク質
結合性リガンド；を含むＥ２融合タンパク質であって、
該全Ｅ２融合タンパク質が少なくとも１つのユビキチン
部分へのチオール結合を形成し、該標的タンパク質に結
合し、そして該ユビキチン部分を該標的タンパク質に移
動させて共有結合を形成させることができるＥ２融合タ
ンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には分子生物学
の分野に関し、特定的には合成ヌクレオチド配列及びそ
れから得られる融合タンパク質であって、選択した標的
タンパク質にユビキチンを付加させることができかつユ
ビキチン統制 (ubiquitin-directed)タンパク質分解プ
ロセスを引き起こすことができる融合タンパク質を作り
出す方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生きている細胞は、代謝並びに構造維持
のために細胞内でタンパク質を定常的に製造している。
タンパク質は、細胞の細胞質に存在する個々のアミノ酸
から製造される。同時に、個々の細胞は、量が余分であ
るか又は細胞発達のその時点における段階にはもはや必
要でなはい過剰のタンパク質を定常的に分解している。
一般に、タンパク質は個々のアミノ酸に定常的に分解さ
れ、次いでその時点で細胞が必要とする異なるタンパク
質に別々に再構築される。タンパク質合成のメカニズム
は広く理解され研究もされているが、タンパク質分解の
メカニズムはあまり充分に明らかにされていない。かな
りの量の情報が明るみに出ている１つの系は、ユビキチ
ン統制タンパク質分解経路である。この系は図１に示さ
れており、本明細書でも簡単に説明する。
【０００３】図１を参照すると、右側に１２で示されて
いるのは、複数のユビキチンタンパク質である。ユビキ
チンは、全ての真核生物内で見られる高度に保存された
７６アミノ酸のタンパク質である。ユビキチン配列は厳
格に保存されているので、既に研究された全ての植物及
び動物ユビキチンタンパク質の間で３つのアミノ酸が相
違しているだけである。かくして、天然ユビキチン分子
の本当の３次元形状は、図１に示した形状、即ち、カル
ボキシル末端５アミノ酸から構成されるひも状又は尾状
物が付いた球に似ている。ユビキチン統制代謝経路にお
いて、ユビキチンは分解されるべきタンパク質と共有結
合して、タンパク質分解のためにそれらを“標識”す
る。このプロセスは、細胞内のフリーのユビキチンがＥ
１又はユビキチン活性化酵素として知られているタンパ
ク質と結合して開始される。エネルギー消費反応におい
てＡＭＰがユビキチンタンパク質のカルボキシル末端に
結合し、次いで、１４で示すように、ユビキチンのカル
ボキシル末端がチオールエステル結合を介してＥ１分子
上のシステイン基に結合する。次いで、ユビキチン接合
性酵素（ＵＢＣ）又はユビキチン運搬タンパク質として
も知られている、該カスケードと関係する第２酵素タン
パク質、つまりＥ２が、Ｅ１分子と相互作用して、ユビ
キチン部分がＥ１タンパク質からＥ２タンパク質に移動
する。その際、それは再びＥ２内の独特なシスチンへの
チオールエステル結合によって結合する。この反応は１
６で示されている。
【０００４】真核細胞は、かなりの数の異なるＥ２タン
パク質を有している。それぞれのＥ２はコア領域又は主
要部分を有しており、種々のＥ２のコア領域は高度に保
存されている。多くのＥ２タンパク質はカルボキシル末
端尾状部分も含んでおり、Ｅ２タンパク質の尾状部分の
間には高い度合いの配列変化がある。植物のシロイスナ
ズナでは、少なくとも１５の異なるＥ２タンパク質が同
定されており、それは３０或いはそれより多いかも知れ
ない。それぞれのＥ２のイソフォーム(isoform) は、タ
ンパク質の特定のクラスに対して特異的であると考えら
れる。例えば、１つの特定のＥ２は、ヒストンについて
の特異性を有していることが知られている。幾つかのＥ
２はフリーのユビキチンに特異的に結合する。幾つかの
Ｅ２は独立に作用してそれらの機能を発揮することがで
きるが、他のものはＥ３又はユビキチン−タンパク質リ
ガーゼと言われる追加の酵素を必要とする。
【０００５】Ｅ２分子又はユビキチン接合性酵素の機能
は、分解のために印を付けるタンパク質を認識して標識
することである。Ｅ２分子は、まだ充分に理解されてい
ないメカニズムを介して、分解されるべき標的タンパク
質と相互作用し、ユビキチンタンパク質を分解されるべ
き該タンパク質と結合させることによってこの標識化を
行う。図１において、その左中央には、１８で示した標
的タンパク質がある。２０で示した反応において、Ｅ２
はユビキチン部分又はリシン残基を該標的タンパク質に
移動させる。その標的タンパク質は、幾つかの結合した
ユビキチンを伴って該図の中央に示されている。in viv
o の細胞内では、多くのユビキチン繰り返し体が同じよ
うにして分解されるべきタンパク質に付加している。こ
れは、一続きのユビキチンが分解されるべきタンパク質
に１段階で付加するために起こっても、１個のユビキチ
ンが分解されるべきタンパク質に付加した後に一続きの
ユビキチンがそのユビキチンに続いて付加して起こって
もよい。１個のユビキチンだけが結合した幾つかのタン
パク質は変化した形態で生き残ることができるが、今日
までの研究では、複数のユビキチン標識で標識された全
てのタンパク質は即座に分解される。いずれにしても、
ユビキチン繰り返し体が結合した、図１において２２で
示したタンパク質は、プロテオソーム (proteosome) と
して知られている真核細胞内にin vivo で存在する粒子
により認識される。プロテオソームは、ユビキチン“標
識”によりタンパク質を認識し、次いで該印を付けられ
たタンパク質をその構成アミノ酸に迅速かつ効果的に分
解するタンパク質分解酵素の複合体である。ユビキチン
は該タンパク質から離れて、この同じプロセスにおいて
再利用される。こうして生成したアミノ酸は細胞質の中
に放出される。
【０００６】生きている生物内で発現された天然タンパ
ク質を標的にして分解することができる分子生物学の手
段は現在のところ存在しない。この技術に類似する分子
生物学の最近の手段はアンチセンスのイボルビング・テ
クノロジー(evolving technology) である。アンチセン
ス技術においては、アンチセンスＲＮＡ転写産物を産生
するように設計された遺伝子を生きている細胞の中に導
入する。該アンチセンスＲＮＡ転写産物は、in vivo 条
件下で、該細胞内で天然に存在するｍＲＮＡ転写産物と
ハイブリダイズするように意図されている。それら２つ
のＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションは二本鎖の複合
体を作り出すが、まだ明らかになっていない細胞メカニ
ズムによってその後に分解される。最終的には、標的Ｒ
ＮＡを作り出す遺伝子の発現レベルが劇的に減少するか
又は場合によっては実質上なくなってしまう。不要なタ
ンパク質の発現を抑制するために、フリーのアンチセン
スＲＮＡ分子を脊椎動物の血流の中に送り込むことも提
案されている。ユビキチンタンパク質分解経路を用い
て、標的タンパク質のユビキチン化及び分解を人工的に
誘発させようとする先行技術は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、選択した標
的タンパク質にユビキチンを付加させることができかつ
ユビキチン統制タンパク質分解プロセスを引き起こすこ
とができる融合タンパク質を作ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、主要部分、天
然又は合成尾状部分のいずれか、及び該尾状部分のカル
ボキシル末端に結合した異種のタンパク質結合リガンド
を含む合成Ｅ２分子を作り出すことを要旨とする。かか
る分子は、該タンパク質結合性リガンドにより認識され
た標的タンパク質にユビキチン粒子を付加できることが
証明された。本発明の更なる目的は、かかる合成Ｅ２タ
ンパク質認識分子の発現を異種宿主内で起こすことので
きる遺伝子配列を明らかにすることである。かかる合成
Ｅ２タンパク質認識分子を用いることにより、トランス
ジェニック生物内の生来のタンパク質を分解の標的にす
ることができることも本発明の特徴である。本発明の他
の目的、効果、及び特徴は、添付の図面及び配列表を併
せて考慮すれば、以下の説明から明らかになるであろ
う。
【０００９】本発明により、新規なクラスのＥ２誘導融
合タンパク質が構築される。この新規なクラスのＥ２誘
導融合タンパク質は、原型として図２に示されている。
このクラスのＥ２タンパク質は、ユビキチン部分を標的
タンパク質に特異的に付加させるように構築されてお
り、図２に示すように３つの主構成部分から成ってい
る。２４で示した第１構成部分は、天然又は人工Ｅ２タ
ンパク質コア領域である。２６で示した第２構成部分
は、人工的に構築されたものであっても天然Ｅ２イソフ
ォームからの尾状物領域であってもよいスペーサーであ
る。図２において２８で示した第３構成部分は、興味の
対象である標的タンパク質への特有の特異性を有するタ
ンパク質結合性リガンドであって、やはり天然物であっ
ても人工物であってもよい。上記のＥ２融合タンパク質
分子の機能は、１又は２以上のユビキチン残基を興味の
対象である標的タンパク質に付加させることである。か
かるタンパク質は図２において３０で示されている。細
胞内におけるin vivo でのユビキチン統制タンパク質分
解の経路は、分解されるべきタンパク質へのユビキチン
の付加により始動するので、特異性タンパク質へのかか
るユビキチンタンパク質標識の付加がそれらの分解を起
こすことは明らかである。このように、上に記載したも
のの如き新規なＥ２タンパク質を用いることにより、特
異性タンパク質を分解の標的にすることが可能になる。
【００１０】上に簡単に記載したように、ユビキチン接
合性酵素又はＥ２と呼ばれるクラスのタンパク質それぞ
れは、２つの主構成ドメインのうちの１又は両方からな
る。全ての既知のＥ２イソフォームは、通常長さが約１
５０アミノ酸のコア領域を含む。該コア領域は、図１に
示したサイクルに必要なユビキチン−Ｅ２チオールエス
テル中間体の形成に必要である独特なシステイン残基を
その中に含む。そのシステインが独特でなければならな
いかどうかは明らかでなない。種々のＥ２のコア領域
は、チオールエステル形成速度の増加と関係する、ヒド
ロキシル化され荷電されていない残基を含有する領域を
有するアミノ末端を含むことができる。以下の配列番
号：１及び３に記載した配列は、２つの異なる植物種か
ら単離した２つの異なるＥ２のコーディング領域であ
る。該２つの配列は、類似するが同一ではないコア領域
を含有するタンパク質（配列番号：２及び４）をコード
する。これら２つの配列は代表例であり、幾つかの他の
Ｅ２コア領域配列も配列決定され公表されている。Ｅ２
コア領域で要求されることは、Ｅ２コア領域とユビキチ
ンとのチオール−エステル結合を形成するエステル交換
プロセスにおいて、該ユビキチンに連結したＥ１タンパ
ク質に関与できることである。Ｅ２コア領域は、図２及
び以下に記載するようにしてユビキチンを標的タンパク
質に移動させる能力もなければならない。Ｅ２タンパク
質の起源の供給源に何らかの臨界性があるとは考えてい
ない。ユビキチンタンパク質は全ての真核生物の間で驚
くほど高度に保存されており、しかもここに記載する方
法に要求される化学的相互作用はＥ２分子とユビキチン
の間のものなので、事実上全ての真核性供給源からのＥ
２分子からのコア領域は、in vivo で等しく充分に内因
性ユビキチンに結合して移動させることができる筈であ
る。以下でも証明されているように、植物起源Ｅ２コア
領域は、動物又はウィルス起源のタンパク質にユビキチ
ンを付加させることができ、かつ植物及び動物起源のい
ずれのユビキチンも用いることができる。このことか
ら、Ｅ２ドメインの起源に対して種若しくは界特異性は
殆ど又は全く存在しないと考えられる。同様に、相応し
いユビキチンを発現するあらゆる真核生物がこのアプロ
ーチの標的である。全ての既知の真核性ユビキチンがこ
の規準に適合し、このことから、あらゆる真核性供給源
からのＥ２が、あらゆる標的宿主内に存在するユビキチ
ンの接合に用いることがきると考えられる。
【００１１】以下の実施例で用いる２つの真核性Ｅ２イ
ソフォームの間には相違がある。ＵＢＣ１はシロイスナ
ズナから単離したＥ２であり、ＵＢＣ４は小麦から単離
したＥ２である。Ｅ２であるＵＢＣ１とＵＢＣ４とは、
それらの特異性とそれらの作用の方式の両方において相
違している。天然のＵＢＣ４Ｅ２は、 in vitro でユビ
キチンタンパク質リガーゼ或いはＥ３分子を必要とせず
に単独で標的タンパク質に結合することができる。ＵＢ
Ｃ４は、ＵＢＣ４の強酸性カルボキシル末端尾状物と塩
基性ヒストン分子との間の相互作用により、ヒストンと
強く結合している。従って、ＵＢＣ４は、証明されてい
ないとはいえ、その天然の系においてヒストン分解に関
与しているかも知れない。ＵＢＣ１は、標的細胞へのユ
ビキチン付加を行うために、ユビキチンタンパク質リガ
ーゼ或いはＥ３分子の存在を必要とする。ＵＢＣ１とＵ
ＢＣ４を比較すると、構造レベルでの主要な相違は、Ｕ
ＢＣ４がそのタンパク質配列のカルボキシル末端におい
て尾状物領域を有するのに対して、ＵＢＣ１はそのよう
な尾状物を有さないという事実である。これら２つの例
は、Ｅ３依存及びＥ３非依存Ｅ２イソフォームの間の相
違を説明するものである。本発明者らは以前に、ＵＢＣ
４からＵＢＣ１へＵＢＣ４尾状物を移行させるとＵＢＣ
１タンパク質にヒストンに対する親和性が生ずることを
報告した。このことから、Ｅ２の尾状部分は、分解の信
号を発することとなるタンパク質への親和性の原因であ
ると推定される。これとは別に、ＵＢＣ１の如き尾状物
のないＥ２のカルボキシル末端とタンパク質結合性リガ
ンドとの間にスペーサー領域が存在しないと、Ｅ２融合
タンパク質戦略によって基質タンパク質にユビキチンを
付加させることができないことを、今回ここに報告す
る。かくして尾状物のないＥ２変異体は、天然又は人工
のスペーサー若しくは尾状物をそのカルボキシル末端に
付け加えなければ、本発明の方法に用いることができな
い。逆に、以下に記載するように、ＵＢＣ１タイプＥ２
のコア領域とタンパク質結合性リガンドの間に合成スペ
ーサー領域を付け加えると、Ｅ３から独立して作用する
Ｅ２融合タンパク質としてのＵＢＣ１タイプＥ２分子の
機能的な利用が可能になる。従って、選択したＥ２のコ
ア領域とタンパク質結合性リガンドとの間にスペーサー
が存在することが、本発明に効果のあるＥ２融合タンパ
ク質分子の要件である。天然Ｅ２の尾状物はこのスペー
サーとして役立つ。さもなければ、人工的に構築された
アミノ酸配列がスペーサーとして更に充分に働く。ま
た、スペーサーをタンパク質結合性リガンドの一部分と
して付け加えることも可能である。例えば、多くの単鎖
(single chain) 抗体配列は、スペーサーとして役立ち
得る硬性アミノ末端ドメインを含む。Ｅ２コア領域の適
切な機能発揮及びユビキチンが付加する基質に対するタ
ンパク質結合性リガンドの適切な結合と特異性の両方を
可能にするために、スペーサーは少なくとも４アミノ酸
長であるのが最適であることが分かった。
【００１２】図２には、標的タンパク質に対する特異的
な親和性を有するように意図されたタンパク質結合性リ
ガンド２８もＥ２融合タンパク質の一部分として示され
ている。該タンパク質結合性リガンドは、該コードされ
たリガンドが興味の対象である標的タンパク質への特異
的結合を提供する限り、如何なる可能なアミノ酸配列で
あってもよい。可能なタンパク質結合性リガンドには多
くの例がある。タンパク質科学では、タンパク質ホルモ
ンとその膜結合レセプタータンパク質との間にはそれら
を正常に相互作用させる特異的親和性が存在することが
広く知られている。従って、これらタンパク質のいずれ
か１つ、つまりレセプター又はホルモンのいずれかを他
方についてのタンパク質結合性リガンドとして用いるこ
とが可能である。全縁タンパク質よりはむしろ、ホルモ
ン又はレセプターのいずれかの該相互作用の原因となる
結合性ドメインも用いることができる。以下に記載する
ように、抗体に特異的に結合するリガンドとしてプロテ
インＡを用いることが可能である。また、その天然型に
おいて他の類似のタンパク質とin vivo でダイマーを形
成する単独のタンパク質を、該関連するタンパク質への
ユビキチン付加を標的にするためにin vivo で用いるこ
とも以下に説明されている。これは、天然のタンパク質
−タンパク質結合を、タンパク質結合性リガンドの同定
に用いることができることを証明するものである。タン
パク質結合性リガンドとして、特定の抗体により特異的
に結合されるエピトープを用いることが可能である。し
かしながら、大抵の状況では、最終的にタンパク質結合
性リガンドに望まれるものは、抗体又は単鎖断片抗体の
如き少なくとも抗体の認識部分であろう。それらに対す
る特異的引力を有する他のタンパク質の存在が知られて
いないタンパク質については、標的タンパク質に特異的
な抗体認識ドメインを作り出すか又は利用する能力が必
須である。タンパク質結合性リガンドに抗体認識配列を
用いることにより、Ｅ２融合タンパク質を用いるここに
記載したやり方で、ユビキチン付加及びユビキチン統制
タンパク質分解のための生物学的系において事実上あら
ゆるタンパク質を標的にすることが可能である。ユビキ
チンが結合できる少なくとも１つのリシン残基を有する
ことだけが標的タンパク質に要求されると思われる。
【００１３】ユビキチン統制タンパク質分解に用いる図
２のＥ２融合タンパク質は、多様な方法により作ること
が可能である。例えば、図２に示したクラスのＥ２融合
タンパク質をそっくりそのままコードするＤＮＡ配列を
クローン化及び／又は構築することが可能である。該Ｄ
ＮＡコーディング配列は、実際に役立つ５’から３’ま
でに、第１に、以下の配列表に記載した天然配列の如き
選択されたＥ２コア領域をコードする配列を含むことが
でき、又はコンセンサス若しくは人工Ｅ２コア領域配列
を含むことができる。次いで、該ＤＮＡコーディング配
列は、コア領域配列に対して３’側にスペーサー又はＥ
２からの尾状部領域をコードする配列を含む。やはり、
このタンパク質は天然であっても人工であってもよく、
以下のＵＢＣ４の場合のように、コア領域及びスペーサ
ーの両方が、単一の天然Ｅ２からのものであってもよ
い。最後に、その３’末端において、該コーディング配
列はタンパク質結合性リガンドをコードする領域を含ん
でもよい。Ｅ２融合タンパク質をコードするかかる領域
を、選んだ宿主内に、有効なプロモーターの後ろであっ
て転写ターミネーターに対して５’側に配置したとき
は、図２に示した如きＥ２融合タンパク質を発現する組
換え配列についての発現カセットが作り出される。次い
で、その発現カセットを異種宿主内に形質転換して発現
させる。植物及び動物についての種々の形質転換技術
は、当該技術分野で既知であるのでここで更に説明する
必要はない。次いで、こうして発現されたＥ２融合タン
パク質は、興味の対象である標的タンパク質へのユビキ
チン付加をin vivo で行う。このユビキチン標識が行わ
れると、その正常なプロセスを用いて、細胞による標的
タンパク質の分解が行われる。このようにして、それら
の天然又は非形質転換祖先とは異なるトランスジェニッ
ク生物を、特異的な不要タンパク質の積極的分解によっ
て作り出すことができる。このようにして、発現するの
が望ましくないタンパク質を“消し去る”ことが可能で
ある。このアプローチにより、活性なユビキチン統制タ
ンパク質分解経路を有する動物、植物系、微生物又は細
菌系に用いて、不要な構造、特徴又は活性を消し去るこ
とができる。
【００１４】一方、図２に示したものの如きＥ２融合タ
ンパク質をある宿主内で発現させることにより産生さ
せ、最終的に他の宿主に送り込むことができる。例え
ば、プロモーターが適当に選ばれることだけを前提とし
て、先に説明したような合成コーディング配列を用いて
真核性宿主内でその配列を発現させて、Ｅ２融合タンパ
ク質を産生させることが可能である。例えば、真核性細
菌の醗酵によって目的のタンパク質を製造し、続いて単
離しそして精製することによって、治療用タンパク質を
製造するのが全く普通である。この様式において、役立
つ量のＥ２融合タンパク質を製造及び単離することがで
きる。次いで、該タンパク質を治療又は他の処理をする
ためにある生物に送り込む。Ｅ２融合タンパク質の産生
が該宿主の外側で行われる場合は、Ｅ２融合タンパク質
の更なる処理又は修飾が望まれると考えられる。例え
ば、Ｅ２融合タンパク質をリポソームで包めば、標的細
胞へのそれらの導入が促進される。また、更なるタンパ
ク質ドメインをＥ２融合タンパク質のアミノ末端に付け
加えて細胞性レセプターを標的にして、標的細胞内への
該タンパク質のin vivo での導入を誘発することができ
る。
【００１５】この技術についてきわめて多様な応用が考
えられる。植物系においては、特異性酵素を分解の標的
にして不要な植物代謝経路を消し去ることが可能にな
る。例えば、不要な二次代謝産物のためのカスケードに
おける１又は２以上の酵素を分解の標的にすることによ
って、植物の二次代謝産物を変化させることが可能にな
る。このＥ２融合タンパク質アプローチにより、感染し
た植物細胞内でのウィルスの複製又は活性に必要なウィ
ルスコートタンパク質又は１若しくは２以上のウィルス
酵素のいずれか、例えば、転写酵素の分解を標的にする
ことによる、植物におけるウィルス感染の制御のための
別のメカニズムが見込める。また、何らかの環境的刺激
に曝すことにより引き起こされる１又は２以上の望まし
くない作用に対する感受性を低下させるために、特異性
細胞性レセプターを分解の標的にすることも可能にな
る。植物の活力及び成長を変化させるために、特異性植
物フィトクロム酵素を分解の標的にすることが可能であ
る。
【００１６】哺乳動物系においては、この技術について
の類似の応用も考えられる。ウィルスの複製又は感染に
必要なウィルスコートタンパク質又は酵素のいずれかを
分解の標的にすることにより、ウィルスの病原性を妨害
することができる。腫瘍形成プロセスを遅くするか又は
変化させるのに可能な治療戦略として、腫瘍タンパク質
を分解の標的にすることが可能である。不要な成長因子
又は血餅形成の如き短期間遮断するのが望ましいプロセ
スと関係する因子を分解の標的にすることが可能であ
る。一般に、この技術は、広く特異性内因性タンパク質
を分解の標的にする能力を与え、かくしてタンパク質の
異なる態様での天然発現を阻害する能力を与えると考え
られる。こうして、この技術は、天然の細胞プロセスを
全く特異的なやり方で妨害するメカニズムとして“アン
チセンス”技術の代わりになるものである。このアプロ
ーチは“アンチセンス”技術を越える１つの有意な利点
を有している。アンチセンスは、効果的であるにはＲＮ
Ａレベルで配列同一性を必要とするので、幾つかのアイ
ソザイムにより生ずる活性のために、それぞれのアイソ
ザイムを別々に標的にしなければならない。本発明のア
プローチは、活性ドメインを標的にして該ドメインを有
する全てのタンパク質を分解する。従って、単一のＥ２
融合タンパク質並びに特異性タンパク質でタンパク質フ
ァミリーを標的にすることができる。
【００１７】
【実施例】
１．共通の方法及び原料 Ａ．原料 以下の配列表に記載したオリゴヌクレオチドは、Ｅ．
Ｉ．デュポンにより合成され提供を受けたものである。
制限酵素、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、及びＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼは、ニューイングランド・バイオ
ラブスから購入した。ＶＣＳ−Ｍ１３は、ストラタジェ
ンから購入した。シュリンプアルカリ性ホスファターゼ
（ＳＡＰ）は、ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカ
ルから購入した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、パーキ
ン・エルマー・シータスから購入した。Ｅ１タンパク質
は、ハットフィールド (Hatfield) 及びビエルストラ
(Vierstra), J. Biol. Chem., 265:15813-15817 (1992)
に記載されたＴａＵＢＣ１遺伝子を用いて大腸菌内で
合成し、次いでシーチャノバー(Ciechanover) ら, J. B
iol. Chem., 257:2537-2542 (1982)に記載された方法に
より精製した。ヒトユビキチンを用い、ハース (Haas)
及びウィルキンソン (Wilkinson), Biochem. Prep., 1
5:49-60 (1985) の方法により精製し、次いでシーチャ
ノバーら, Proc. Natle. Acad. Sci. USA, 77:1365-136
8 (1980)に記載されたクロラミン−Ｔ法によってキャリ
ヤーなしのＮａ 125Ｉで放射標識した。ウサギ網状赤血
球抽出物（未処理）は、プロメガ・コーポレーションか
ら購入した。小麦胚芽抽出物は、ハットフィールド及び
ビエルストラ, Biochem., 28:735-743 (1989) の方法に
従って調製した。クローン９Ｅ１０から誘導した抗−
（ｃ−ｍｙｃ）モノクローナル抗体及びｃ−ｍｙｃペプ
チドは、別々にオンコジェン・サイエンス社から購入し
た。アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスイムノ
グロブリンは、キルケガード (Kirkegaard) 及びペリー
・ラボラトリーズ社から購入した。表皮成長因子レセプ
ター（ＥＧＦＲ）を含有するヒト表皮細胞膜及び精製し
た表皮成長因子（ＥＧＦ）は譲り受けたものである。形
質転換成長因子α（ＴＧＦα）遺伝子のｃＤＮＡコピー
は個人的に譲り受けたものであるが、デリック(Derric
k) ら, Cell,38:287-297 (1984) に記載されている。リ
ボソームタンパク質Ｓ３に対するモノクローナル抗体
は、譲り受けたものである。他の全ての試薬はシグマか
ら購入した。
【００１８】パーバル (Perbal), A Practical Guide t
o Molecular Clonings (1984) に大腸菌について記載さ
れたようにして、黄色ブドウ球菌からの染色体ＤＮＡを
精製した。Ｍ１３で感染した大腸菌細胞抽出物は、１２
μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地に１
／１００容量のＸＬ１−ブルーの大腸菌株の一晩培養液
を接種することにより調製した。該培養液を激しく震盪
しながら３７℃で１時間インキュベートし、ＶＳＣ−Ｍ
１３（ストラタジェン）で１０回複数感染させた。感染
した細胞を更に１時間インキュベートした後、１００μ
ｇ／ｍｌまでカナマイシンを添加し、培養液を更に６時
間インキュベートした。大腸菌培養に続く誘発について
サリバン (Sallivan) 及びビエルストラ, J. Biol. Che
m., 266:23878-23885 (1991)に記載されたようにして、
細胞を採取して細胞溶解させた。Ｍ１３未感染細胞抽出
物は、Ｍ１３ファージ及びカナマイシンを省いた以外は
上記のようにして調製した。
【００１９】Ｂ．ＵＢＣ１及びＵＢＣ４発現ベクターカ
セットの構築 特に断らない限り、サムブルーク (Sambrook) ら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols.
1-3 (1989)に記載された手順に従って、全操作を行っ
た。予定した部位定方向型 (site-directed versions)
が作り出せたかどうか及び以下に記載した種々のＤＮＡ
断片を適当な方向で挿入できたかどうかは、その後の配
列分析によって確認した。全ての研究は、ストラタジェ
ンからのファージミド (Phagemid) 、ｐＵＣ１１８又は
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にそれぞれ含有される、サリバ
ン及びビエルストラ, J. Biol. Chem., 266:23878-2388
5 (1991)に記載された小麦（トリチクム・バルガレ(Tri
ticum vulgare)）からのＵＢＣ４遺伝子、及びサリバン
及びビエルストラ，1991，前記文献からのシロイスナズ
ナからのＵＢＣ１遺伝子のｃＤＮＡコピーで始めた。ク
ンケル (Kunkel) ら,Methods in Enzymol., 154:367-38
2 (1987) に記載されたようにして行った部位定方向突
然変異誘発により、独特なＸｈｏＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位をＵＢＣ１及びＵＢＣ４両方のコーディング領
域内に翻訳終結部位のすぐ上流に設けた。この部位定方
向突然変異誘発は、以下にそれぞれ配列番号：６及び５
として示したオリゴヌクレオチドＲＶ１５５及びＲＶ１
３１を用いて行った。次いで、突然変異誘発したＵＢＣ
１ｃＤＮＡを、ＵＢＣ１遺伝子（サリバン及びビエルス
トラ，1991）をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩカセットとして含
有するｐＥＴ３ａプラスミドベクター内に連結して、野
生型ＵＢＣ１遺伝子と置き換えた。この置換により、ｐ
ＥＴ−ＵＢＣ１と称する発現プラスミドが作り出され
た。突然変異誘発したＵＢＣ４ｃＤＮＡを、ＵＢＣ４遺
伝子（サリバン及びビエルストラ，1991）をＳｐｈＩ／
ＢａｍＨＩカセットとして含有するｐＥＴ３ａプラスミ
ドベクター内に連結して、そのベクター内の野生型ＵＢ
Ｃ４遺伝子と置き換えた。この置換により、ｐＥＴ−Ｕ
ＢＣ４と称する発現プラスミドが作り出された。ＵＢＣ
１及びＵＢＣ４内へのＸｈｏＩ部位の挿入により、それ
ぞれのＤＮＡ発現プラスミドによりコードされる各タン
パク質の天然タンパク質配列のカルボキシル末端にジペ
プチド、つまりＬｅｕ−Ｇｌｕが付加された。
【００２０】Ｃ．カルボキシル末端付加物を有するＵＢ
Ｃ１及びＵＢＣ４タンパク質の合成 ＵＢＣ１及びＵＢＣ４タンパク質のカルボキシル末端へ
の付加を、それぞれのタンパク質をコードする対応ＤＮ
Ａ配列の３’末端におけるＸｈｏＩ部位内に適当な合成
オリゴヌクレオチド対又は二本鎖ＤＮＡ断片を連結する
ことによって行った。まず、リン酸基を合成ヌクレオチ
ドの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
付加した。6.６７μＭの最終濃度のオリゴヌクレオチ
ド、４００μＭ ＡＴＰ、及び0.３３ユニット／μｌの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する反応液をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液中に溶解して、３７℃
で３０分間インキュベートした。１／１０容量の１０×
アニーリング緩衝液（バイオラッド）を添加することに
より、該相補的オリゴヌクレオチド対をお互いにアニー
ルし、該混合液を８０℃に加熱した。次いで、反応混合
液を約1.５時間かけて室温まで冷却させた。発現プラス
ミド、つまりｐＥＴ−ＵＢＣ１及びｐＥＴ−ＵＢＣ４内
にカルボキシル末端付加物を含む該変異ＤＮＡコーディ
ング配列を挿入する前に、該プラスミドをＸｈｏＩで消
化し、シュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）
で処理して自己連結の頻度を低減させた。供給業者によ
って説明された方法を用い、ＳＡＰを用いてＸｈｏＩ消
化プラスミドの脱リンを行った。脱リン後、全反応混合
液を７０℃に加熱し１０分間保持することによって残存
する酵素を変性させた。
【００２１】Ｄ．ｃ−ｍｙｃ発現ベクターの構築 この実施例は、タンパク質結合性リガンドとしてエピト
ープを使用できることを証明するものである。そのモノ
クローナル抗体が得られ易いことから、ｃ−ｍｙｃをエ
ピトープとして選んだ。それぞれ配列番号：７及び９と
して以下に示したＲＶ１３８及びＲＶ１３９と称するオ
リゴヌクレオチド対は、クローン９Ｅ１０と称するマウ
スモノクローナル抗体により認識される１０アミノ酸エ
ピトープ（配列番号：８）をコードする二本鎖ＤＮＡカ
セットである。該マウスモノクローナル抗体クローン９
Ｅ１０は、エバン (Evan) ら, Mol. Cel. Biol., 5:12:
3610-3616 (1985)に記載された腫瘍遺伝子タンパク質ｃ
−ｍｙｃに対して生成したものであり、該抗ｃ−ｍｙｃ
抗体についての１０アミノ酸エピトープは、コレッジー
(Koledziej) 及びヤング (Young), Methods Enzymol. 1
94:508-519 (1991)に記載されている。該ｃ−ｍｙｃエ
ピトープカセットをｐＥＴ−ＵＢＣ１及びｐＥＴ−ＵＢ
Ｃ４のＸｈｏＩ部位内に連結して、ｐＥＴ−ＵＢＣ１−
（ｃ−ｍｙｃ）及びｐＥＴ−ＵＢＣ４−（ｃ−ｍｙｃ）
と称する２つのプラスミドを作り出した。これら各プラ
スミドで発現したタンパク質上でのｃ−ｍｙｃエピトー
プの存在は、これらプラスミドにより産生したＥ２タン
パク質の発現を誘導し、次いでｃ−ｍｙｃ特異性抗体を
用いる免疫ブロット分析法によりｃ−ｍｙｃ陽性株につ
いてスクリーニングすることにより確認した。このよう
にして、該プラスミドが、その抗体によって認識される
エピトープを適切に発現することが保証された。
【００２２】Ｅ．ＵＢＣ１−スペーサー−（ｃ−ｍｙ
ｃ）発現ベクターの構築 ｃ−ｍｙｃエピトープをＵＢＣ１Ｅ２タンパク質のカル
ボキシル末端に連結したベクターの構築に加えて、ＵＢ
Ｃ１Ｅ２分子のコア領域とこの場合はｃ−ｍｙｃエピト
ープであるタンパク質結合性リガンドとの間にスペーサ
ーを付け加えることも望まれた。これを行うために、以
下に配列番号：１６及び１８として記載したＲＶ１３６
及びＲＶ１３７と称するオリゴヌクレオチド対を設計し
た。このオリゴヌクレオチド対は、アニールして宿主内
で発現させると、配列番号：１７に記載したアミノ酸か
らなる１０アミノ酸のスペーサーを作り出すように意図
されている。このカセットは、更にｐＥＴ−ＵＢＣ１の
ＸｈｏＩ部位内に連結するように設計された。スペーサ
ーオリゴヌクレオチドを連結すると、ｐＥＴ−ＵＢＣ１
内のもとのＸｈｏＩ部位が失われて、スペーサーカセッ
トの３’末端に新たなＸｈｏＩ部位が作り出され、更な
る挿入が可能になる。スペーサーカセットを挿入した
後、ｐＥＴ−ＵＢＣ１−スペーサーのスペーサー内のＸ
ｈｏＩ部位内にｃ−ｍｙｃカセットを連結し、ｐＥＴ−
ＵＢＣ１−スペーサー−（ｃ−ｍｙｃ）と称する新たな
発現ベクタープラスミドを作り出した。この構築は、Ｅ
２のコアタンパク質とタンパク質結合性リガンドとの間
の人工スペーサーでも充分であることを証明することを
意図したものであった。この構築体及びその使用方法を
図３に概略的に示す。
【００２３】Ｆ．ＵＢＣ４−ＴＧＦα発現ベクターの構
築 ＴＧＦαコーディング領域の配列を得るために、ヒトペ
プチドホルモン形質転換成長因子α（ＴＧＦα）のアミ
ノ酸４１〜８９をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲによっ
てクローン化することにした。ＴＧＦαホルモンの活性
は、人体の多くの細胞内において細胞性レセプターとし
て存在する表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）として
知られている特異性細胞性レセプターへのその接合から
生じることが確認されている。ＴＧＦα遺伝子のコーデ
ィング配列のタンパク質（天然タンパク質のアミノ酸４
１〜８９）は、ＥＧＦＲに生来的に結合する結合性リガ
ンドを含んでいる。以下の配列番号：１０及び１１にＲ
Ｖ１５１及びＲＶ１５４と称するオリゴヌクレオチドの
対を示した。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によりＴＧＦαからの望ましいコーディング領域を
増幅するためのプライマーとなるように設計されたもの
である。ＰＣＲの鋳型は、その配列をジェンバンク受託
番号Ｍ３１１７２に見出すことのできるＴＧＦα前駆体
ホルモン型のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドから
なるものであった。ＸｈｏＩ部位をコードさせるため
に、追加のＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドＲＶ１５１
に付け加えた。該鋳型でＰＣＲを行って複数コピー数の
ＰＣＲ産物を作り出した。次いで、ＳａｌＩ部位を用い
て該ＰＣＲ産物をｐＥＴ−ＵＢＣ４のＸｈｏＩ部位内に
連結し、ＵＢＣ４とＴＧＦαのコーディング領域の間に
インフレーム (in-frame) コーディング領域融合体を作
り出した。同じようにして、オリゴヌクレオチドＲＶ１
５４を、ＳａｌＩがその後に続くホルモンコーディング
領域の３’末端に停止コドンを含有するように設計し
た。ＰＣＲ増幅産物をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化し、
次いでｐＥＴ−ＵＢＣ４のＸｈｏＩ部位内に連結して、
その５’末端におけるＸｈｏＩ部位を維持しながらＵＢ
Ｃ４とＴＧＦαタンパク質のインフレーム融合体を作り
出した。このプラスミドをｐＥＴ−ＵＢＣ４−ＴＧＦα
と称した。この融合タンパク質及びその使用方法を図４
に概略的に示す。
【００２４】Ｇ．ＵＢＣ４−ＧＥＮＥ Ｖ発現ベクター
の構築 ＧＥＮＥ ＶはＭ１３ファージからのタンパク質であ
る。その天然型においては、該タンパク質はホモダイマ
ーになっている。この実施例は、本発明の範囲内でタン
パク質結合性リガンドとして役立つダイマーの単一のサ
ブユニットの能力を試験することを意図している。やは
り、興味の対象であるタンパク質コーディング配列をＰ
ＣＲ反応により調製した。オリゴヌクレオチド対、つま
りそれぞれ配列番号：１３及び１２であるＲＶ２２０及
びＲＶ２２１を、ジェンバンク受託番号ＶＢ００１８に
記載されているバクテリオファージＭ１３からのＧＥＮ
ＥＶタンパク質の完全コーディング領域をＰＣＲにより
増幅するように設計した。該オリゴヌクレオチドも独特
なＸｈｏＩ及びＳａｌＩ部位を含んでいるので、上記の
ＵＢＣ４−ＴＧＦα構築で記載した同じ方法により、Ｐ
ＣＲにより増幅したＧＥＮＥ Ｖコーディング領域をＸ
ｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、次いで生成した２７１塩
基対断片をｐＥＴ−ＵＢＣ４のＸｈｏＩ部位内に連結で
きる。やはり、同じように、この構築体は、ＵＢＣ４タ
ンパク質とＧＥＮＥ Ｖタンパク質ドメインとのインフ
レーム融合体を形成した。該構築体をｐＥＴ−ＵＢＣ４
−ＧＥＮＥ Ｖと称した。この構築体及びその使用方法
を図５に図式的に示す。
【００２５】Ｈ．ＵＢＣ４−プロテインＡ発現ベクター
の構築 黄色ブドウ球菌からのプロテインＡは、多くのクラスの
抗体に対して高い天然の親和性を有している。プロテイ
ンＡの抗体結合性領域は、その抗原認識部位よりむしろ
抗体のＦｃ部分に結合する。抗体が破壊の標的にされる
かどうかを見るための試験にこれを用いた。とはいえ、
この試験は抗体に対しては広く通用できても該抗体によ
って認識されるエピトープに対しては特異的でないであ
ろう。この実施例は、複数のクラスのタンパク質を認識
するタンパク質結合性リガンドのドメインを用いること
により、複数のクラスのタンパク質が標的にされ得るこ
とを証明することも意図している。やはり、ジェンバン
ク受託番号Ｍ１８２６４に記載されているプロテインＡ
の抗体結合性Ｄドメイン（アミノ酸９０〜１９３）のコ
ーディング領域をＰＣＲにより増幅することにした。配
列番号：１４及び１５として記載されているＲＶ２４２
及びＲＶ２３８と称するオリゴヌクレオチドプライマー
の対を、ＰＣＲ産物を増幅できかつ該ＰＣＲ産物の末端
に望ましい制限部位を付け加えれるように設計した。Ｐ
ＣＲ法は、黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡで行った。や
はり、増幅した断片をＸｈｏＩで消化してからｐＥＴ−
ＵＢＣ４のＸｈｏＩ部位内に連結できるように、該オリ
ゴヌクレオチドの各末端に独特のＸｈｏＩ部位を備え
た。これを挿入することにより、ＵＢＣ４タンパク質と
プロテインＡのＤドメインとのインフレーム融合体が作
り出され、生成したプラスミドをｐＥＴ−ＵＢＣ４−プ
ロテインＡと称した。発現したｐＥＴ−ＵＢＣ４−プロ
テインＡ構築体内の抗体結合性ドメインの存在は、大腸
菌内での発現及びアルカリ性ホスファターゼ接合イムノ
グロブリンＧを用いる免疫ブロット分析により証明し
た。生成した融合タンパク質を図６に図式的に示す。
【００２６】２．ユビキチン接合分析 Ａ．ＵＢＣ１及びＵＢＣ４構築体の発現及び分析 ＵＢＣ１及びＵＢＣ４発現カセットを含有する全てのｐ
ＥＴ３ａ発現プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）
内に形質転換した。対数増殖期の培養液にイソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加してｐＥＴ３
ａ発現カセットを誘発させた後、サリバン及びビエルス
トラ，(1991)，前記文献に記載されたようにして、細胞
を採取して溶解させた。全ての実験は、誘発されたプラ
スミドを含有する細胞の粗溶解産物を用いて行った。こ
れら溶解産物でのユビキチン接合分析は、全分析につい
てインキュベーション時間を２時間にした以外は、サリ
バン及びビエルストラ，(1991)，前記文献に以前に記載
されたようにして行った。各反応液は、総容量が２０μ
ｌで、発現したＥ２融合タンパク質分子を含む１〜４μ
ｌの細菌抽出物、１２μｇ／ｍｌの精製Ｅ１、0.５２μ
ｇの 125Ｉ−ユビキチン、５０ｍＭトリス２０μｌ中の
１ユニットの無機ピロホスファターゼ（ピロホスフェー
ト・ホスホヒドロラーゼ，ＥＣ3.6.1.１）（２５℃でｐ
Ｈ7.６）、１０ｍＭ ＭｇＣl2、１ｍＭ ＡＴＰ、0.１
ｍＭジチオスレイトール及び種々の濃度の基質を含有す
るものであった。これら接合分析を行う前に、各Ｅ２融
合分子の活性をサリバン及びビエルストラ，(1991)，前
記文献に記載された方法により、活性化したユビキチン
をＥ１から単独で受け入れてチオールエステル結合を介
して該ユビキチンに結合するその能力によって測定し
た。このチオールエステル分析に基づき、当量のＥ２活
性を含有する細菌抽出物の容量を各構築体について決定
した。この標準化した容量を種々の接合分析物に添加し
た。等容量の２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ6.８）、５％
（ｖ／ｖ）グリセロール、４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸
ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノー
ルを該反応液に添加して１００℃に５分間加熱すること
によって、該接合分析を終結させた。ラエムリ (Laemml
i), Nature, 227:680 (1970)の系を用いて、サンプルを
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、ゲルをクマシーブ
ルーで染色し、セロファンのシートの間で乾燥し、そし
てオートラジオグラフィーに用いた。これは、放射標識
ユビキチンに結合したあらゆるタンパク質のサイズを可
視化して、放射標識ユビキチン分子が予期したサイズの
標的タンパク質に適切に結合しているかどうかを示そう
とするものである。
【００２７】Ｂ．真核性抽出物の存在下でのイムノグロ
ブリンへのユビキチンの接合 小麦胚芽抽出物又はウサギ網状赤血球溶解産物の存在下
でのユビキチン−抗体接合体の形成は、小麦胚芽につい
てハットフィールド及びビエルストラ(1989),前記文献
に記載されている通りに行った。これら反応についての
反応混合液は、総容量が２０μｌで、１２μｇ／ｍｌの
精製小麦Ｅ１、５０μｇ／ｍｌのヒトユビキチン、１０
０μｇ／ｍｌの抗Ｓ３モノクローナル抗体、３０ユニッ
ト／ｍｌのクレアチンキナーゼ、及び８０ｍＭトリス
（２５℃でｐＨ8.５）中の４μｌの小麦胚芽抽出物又は
ウサギ網状赤血球溶解産物（プロメガ）、２０ｍＭのク
レアチン・ホスフェート、7.５ｍＭ ＭｇＣl2、２ｍＭ
ＡＴＰ、及び２ｍＭジチオスレイトールを含有するも
のであった。各反応は、２μｌのＥ２融合タンパク質抽
出物を添加することによって開始し、３０℃で所定時間
インキュベートした。上記の発現接合分析と同じやり方
で反応を終結させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
し、タンパク質をイモビロン−Ｐ(Immobilon-P) に電気
的にブロッティングした。サリバン及びビエルストラ,
前記文献に以前に記載されたようにして、アルカリ性ホ
スファターゼ接合ヤギ抗マウスイムノグロブリンを用い
る免疫ブロット分析法により抗体接合体を同定した。
【００２８】Ｃ．接合分析の結果 全ての場合において、大腸菌がキメラＵＢＣ１及びＵＢ
Ｃ４遺伝子を発現できること及び予期しかつ期待したサ
イズの合成Ｅ２融合タンパク質を合成できることが確認
された。こうして作り出した全てのＥ２融合タンパク質
は、ユビキチンへのチオールエステル結合の形成を介し
てユビキチンと相互作用するそれらの能力を基準として
酵素的に活性であった。未修飾ＵＢＣ１又はＵＢＣ４を
ユビキチン接合分析法で試験したが、試験した目的の基
質に対する接合は殆ど又は全く認められなかった。逆
に、適切な融合体を試験した場合には、種々の基質に対
する高度に特異的な接合が認められた。これは、予期し
たサイズのタンパク質が放射標識ユビキチンで標識され
たことを示す放射標識ブロット上の妥当なサイズのバン
ドの存在によって証明された。かくして、標的へのフリ
ー 125Ｉ標識ユビキチンのペプチド結合を介する結合に
よって該接合が検出された。かかるユビキチン−タンパ
ク質接合体の形成を、ユビキチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析の間の、フリー体の移動からユビキチンと基質タンパ
ク質の両方を含有すると予期されるタンパク質の移動へ
の移動シフトとして、オートラジオグラフィーによって
可視化した。
【００２９】例として、ＵＢＣ４はｃ−ｍｙｃモノクロ
ーナル抗体にユビキチンを接合させることができなかっ
たが、プラスミドｐＥＴ−ＵＢＣ４−（ｃ−ｍｙｃ）
（図３）により発現された融合タンパク質は、実際にｃ
−ｍｙｃモノクローナル抗体にユビキチンを接合させる
ことができた。この特有の実験において、１個のユビキ
チンが該抗体の重鎖に付加した。該ユビキチン−抗体接
合体は、１個のユビキチン部分（６ｋＤａ）の付加を伴
う該抗体の重鎖（５５ｋＤａ）の予期される分子量の位
置に移動した。該接合体内での抗体の存在は、プロテイ
ンＡによるその免疫認識により確認した。他のマウスモ
ノクローナル抗体がｐＥＴ−ＵＢＣ４−（ｃ−ｍｙｃ）
ベクターにより発現されたＥ２融合タンパク質により接
合されなかったという事実に基づいて及び過剰のｃ−ｍ
ｙｃペプチドを添加すると該抗体接合反応が遮断された
という事実により、該反応をｃ−ｍｙｃ抗体について特
異的であると判定した。ｃ−ｍｙｃエピトープがＵＢＣ
１コア領域に直接に融合したＵＢＣ１Ｅ２変異体を用い
て、抗体にユビキチン接合体を付加する類似の実験を行
おうとしたがうまく行かなかった。他の実験は、ＵＢＣ
４に既に存在するスペーサーアームがおそらく必要であ
ろうということを暗示した。従って、ｐＥＴ−ＵＢＣ１
−スペーサー−（ｃ−ｍｙｃ）と称する上記の構築体
は、人工のスペーサーアームがＵＢＣ１接合体を活性に
するのに充分であるか否かを試験するために構築したも
のである。ｐＥＴ−ＵＢＣ１−スペーサー−（ｃ−ｍｙ
ｃ）発現カセットにより発現された融合タンパク質を試
験して、ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体に放射標識ユビ
キチンを特異的に接合させ得ることが分かった。この結
果は、標的タンパク質に特異的な融合タンパク質上のタ
ンパク質結合性リガンドは、物理的に、かかる融合タン
パク質内のＥ２コア領域のボディの及ばない所に配置さ
れなければならないことを証明した。ＵＢＣ４−（ｃ−
ｍｙｃ）でそうであるように、ＵＢＣ１−スペーサー−
（ｃ−ｍｙｃ）を含む融合タンパク質により接合された
ユビキチンはｃ−ｍｙｃ抗体に対して特異的であり、他
のマウスモノクローナル抗体を修飾しなかった。また、
該融合タンパク質は、該反応混合液への過剰のフリーｃ
−ｍｙｃペプチドの添加によって遮断された。
【００３０】モノクローナル抗体にユビキチンを接合さ
せる該系の能力を更に試験するために、プロテインＡか
らのドメインＤを含む構築体も試験した。ｐＥＴ−ＵＢ
Ｃ４−プロテインＡと称するプラスミドにより作り出さ
れたＥ２融合タンパク質を、生来的にプロテインＡと相
互作用する精製した抗体を含有する接合反応液内に添加
した。これら反応において、該抗体の重鎖へのユビキチ
ン部分の結合が認められた。対照的に、同様な反応液で
野生型ＵＢＣ４を用いてもかかる接合は認められなかっ
た。該抗体にユビキチンを結合させる能力は、種々のク
ラスの抗体へのプロテインＡの既知の親和性と相関関係
を有していた。例えば、プロテインＡと強固に結合する
マウスイムノグロブリンＧは、ＵＢＣ４及びプロテイン
Ａを含有するＥ２融合タンパク質により、かなり効果的
に接合するのに反して、プロテインＡに結合するとして
も普通は弱くしか結合しないヤギからのイムノグロブリ
ンＧは同じようには接合しなかった。この結果は、やは
り、放射標識ブロッティングにより確認した。ホモダイ
マーとして存在しその複数が協同で一本鎖ＤＮＡと結合
しているＧＥＮＥ Ｖタンパク質の相互作用も、ＵＢＣ
４−ＧＥＮＥ Ｖ構築体を用いて試験した。まず、ＵＢ
Ｃ４タンパク質それ自体を発現する構築体はＧＥＮＥ
Ｖタンパク質にユビキチンを接合させることができない
ことを確認した。プラスミドｐＥＴ−ＵＢＣ４−ＧＥＮ
Ｅ Ｖにより作り出されたＥ２融合タンパク質を用いて
同様な実験を行った。その融合タンパク質は、ユビキチ
ン−ＧＥＮＥ Ｖ接合体を作り出せることが分かった。
この場合において、ＧＥＮＥ Ｖの認識が、野生型ＧＥ
ＮＥ Ｖと、ＵＢＣ４及びＧＥＮＥ Ｖの両方からなる
Ｅ２融合タンパク質のＧＥＮＥ Ｖドメインとの間のダ
イマー化により行われていることは明らかである。この
ことは、本発明により構築されたＥ２融合分子のタンパ
ク質結合性ドメインのダイマータイプの親和性で、該Ｅ
２融合分子が標的タンパク質に充分に結合して、それら
がユビキチン融合の標的でなるのを可能にしていること
を証明している。
【００３１】ホルモン又はそのレセプターにユビキチン
を接合させる、ここに記載したＥ２融合タンパク質戦略
の能力を試験するために、ＵＢＣ４とＴＧＦαからなる
Ｅ２融合タンパク質を用いた。ＴＧＦα及び関連するペ
プチドホルモン、つまり表皮成長因子の両方は、ＥＧＦ
Ｒに高度に特異的にかつ非常に強固に結合することがで
きる。プラスミドｐＥＴ−ＵＢＣ４−ＴＧＦαにより発
現されたＥ２融合タンパク質を粗製ヒト表皮膜に添加す
ると、ユビキチンとの接合によってＥＧＦＲタンパク質
が高度に特異的に修飾されるという結果が得られた。こ
の接合は、未修飾ＵＢＣ４タンパク質が該レセプターを
ユビキチン化することができなかったこと及び該反応混
合液中の過剰のフリー表皮成長因子が該反応を遮断して
ＥＧＦＲのユビキチン化を妨げたことにより判定して、
ＴＧＦα−ＥＧＦＲ対に対して特異的であった。この結
果も、Ｅ２とユビキチンの間の種間差はこの反応に臨界
的ではないことを明確に証明している。というのは、こ
の反応において、ＵＢＣ４植物起源は全く明らかに哺乳
動物起源の標的分子をユビキチン化できるからである。
Ｍ１３はバクテリオファージであるので、同じ現象が細
菌の標的にも適用できる。
【００３２】該ユビキチン統制タンパク質分解経路によ
る選択的タンパク質分解は、標的タンパク質への複数の
ユビキチンの接合を含むらしく、多くの場合には多ユビ
キチン鎖を形成するらしいことが認められた。細菌性発
現Ｅ２を用いる上記の接合分析においては、殆どの場
合、概して標的分子への１個のユビキチンの結合だけが
検出された。その結果、ここに記載したＥ２カルボキシ
ル末端融合タンパク質によるユビキチン化は、標的タン
パク質を分解経路に入らせるのに必要な多ユビキチン化
中間体を形成しなかったと断言できる。その限界が本当
であるか否かを試験するために、粗製真核細胞抽出物、
つまりウサギ網状赤血球抽出物又は小麦胚芽抽出物のい
ずれかをユビキチン接合分析物に添加する実験を行っ
た。かかる粗製抽出物は内因性の多ユビキチン鎖を含有
する場合が多いので、かかる多ユビキチン鎖が、ここに
記載したＥ２融合タンパク質により標的分子に付加され
ることを見るために試験するのが狙いである。標的分子
への多ユビキチン鎖のかかる結合が認められた。例え
ば、かかる抽出物の不存在下では、ＵＢＣ４−プロテイ
ンＡからなるＥ２融合タンパク質の存在下で１個のユビ
キチンがマウスイムノグロブリンＧに結合するに過ぎな
い。しかし、小麦胚芽抽出物又はウサギ網状赤血球抽出
物のいずれかを添加するとすぐに、同じ系で７〜８個も
のユビキチンの繰り返し体が結合したマウスイムノグロ
ブリンＧのユビキチン化体が生成した。今日までに入手
できる証拠に基づけば、このように重く修飾された形態
は、該ユビキチン系によるその後の分解にとって受入れ
可能な基質に該当するので、該系によって認識されてタ
ンパク質分解を受ける可能性が高い。この結果は、ここ
に記載したＥ２融合タンパク質が、真核細胞内に普通に
存在する他の内因性因子の助けでタンパク質分解性中間
体を生成できることを証明するものである。
【００３３】仮想的実施例 上の実験は、新たなタンパク質を分解の標的にするため
に、ユビキチン接合の特異性を予め決めた方法で変えら
れることを証明している。このアプローチの融通性は、
Ｅ２融合分子と結び付いてから興味の対象であるタンパ
ク質に結合することができるタンパク質結合性ドメイン
の同定に依存している。細胞内の多くのタンパク質と他
のタンパク質との間の相互作用の性質に関する情報は明
らかに限られているので、天然のタンパク質−タンパク
質相互作用を用いることは、充分に性質が明らかにされ
た僅かなタイプにだけこの技術を限定することになる。
しかしながら、抗体／抗原反応の利用はこの障害物を克
服する力を有している。もちろん、興味の対象である特
異性タンパク質の殆どに結合する抗体を作り出すことは
可能である。今日、重及び軽イムノグロブリン鎖の両方
からのアミノ酸を含むかかる抗体の結合性ドメイン（Ｆ
ａｂ）を、単鎖モノクローナル抗体と呼ばれる１個の短
いペプチドとして同定及び発現させることができる。該
単鎖モノクローナル抗体の遺伝子は、短い柔軟なスペー
サー領域により連結されたＦａｂ領域断片を発現する。
この概念は図７に示されている。かかる単鎖モノクロー
ナル抗体をＵＢＣ４のようなＥ２のカルボキシル末端に
融合させて、Ｆａｂ領域を介して興味の対象であるあら
ゆるタンパク質を標的にすることができるＥ２融合タン
パク質を作り出すことを意図している。なお、該タンパ
ク質は、そのモノクローナル抗体を入手できるか又は開
発できるものでなければならない。最近、このタイプの
抗体を構築するためのキットが販売されており、あらゆ
る好適な抗原タンパク質に対する単鎖抗体遺伝子の開発
が容易になっている。この技術の利用は、Ｆａｂタンパ
ク質リガンド結合性領域を有するＥ２融合タンパク質を
構築して、殆どあらゆるタンパク質をこの系を用いる分
解の標的にできるということを示唆するものである。
【配列表】
【００３４】配列番号：１ 配列の長さ：７５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：シロイスナズナ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：１００．．５５８ 配列
【００３５】
【表１】
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：１５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００３７】
【表２】
【００３８】配列番号：３ 配列の長さ：９８０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：トリチクム バルガレ (Triticum vulgare) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：６０．．６１４ 配列
【００３９】
【表３】
【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：１８４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００４１】
【表４】
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００４３】
【表５】
【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００４５】
【表６】
【００４６】配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：６．．３５ 配列
【００４７】
【表７】
【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００４９】
【表８】
【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００５１】
【表９】
【００５２】配列番号：１０ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００５３】
【表１０】
【００５４】配列番号：１１ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００５５】
【表１１】
【００５６】配列番号：１２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００５７】
【表１２】
【００５８】配列番号：１３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００５９】
【表１３】
【００６０】配列番号：１４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００６１】
【表１４】
【００６２】配列番号：１５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００６３】
【表１５】
【００６４】配列番号：１６ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：３．．３２
【００６５】
【表１６】
【００６６】配列番号：１７ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００６７】
【表１７】
【００６８】配列番号：１８ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
【００６９】
【表１８】
【図面の簡単な説明】
【図１】真核細胞内でのユビキチン統制タンパク質分解
サイクルの概略図である。
【図２】本発明に従って構築した原型分子の概略図であ
る。
【図３】ＵＢＣ４とｃ−ｍｙｃリガンドから構築した合
成分子及び標的抗体分子をユビキチンで標識するための
その使用方法の概略図である。Ｕｂｑはユビキチンを表
す。
【図４】ＵＢＣ４とＴＧＦαタンパク質から構成された
分子及び標的タンパク質へのユビキチン付加を行う際の
その使用方法の概略図である。Ｕｂｑはユビキチンを表
す。
【図５】ＵＢＣ４とＧＥＮＥ Ｖから構成された分子及
び標的タンパク質へのユビキチン付加を行う際のその使
用方法の概略図である。Ｕｂｑはユビキチンを表す。
【図６】ＵＢＣ４とプロテインＡから構成された分子及
び標的タンパク質へのユビキチン付加を行う際のその使
用方法の概略図である。Ｕｂｑはユビキチンを表す。
【図７】ＵＢＣ４とある抗体からなる仮想分子及びタン
パク質へのユビキチン結合を行う際のその使用方法の概
略図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 宿主の細胞内でプロモーターに対して
    ３’側に位置するタンパク質コーディング配列を発現す
    るのに効果的な該プロモーター；及び該プロモーターに
    対して３’側に位置するタンパク質コーディング配列；
    を含むＥ２融合タンパク質の発現をコードするＤＮＡ配
    列であって、該タンパク質コーディング配列が、５’か
    ら３’において、 Ｅ２コア領域をコードするＤＮＡコーディング配列；少
    なくとも４アミノ酸のスペーサーをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；及び標的タンパク質に対して親和性を
    有するタンパク質結合性リガンドをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；を含むＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 タンパク質結合性リガンドが、抗体の認
    識ドメインであって、該ドメインが標的タンパク質に対
    して結合特異性を有する、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  3. 【請求項３】 Ｅ２コア領域が植物Ｅ２からのものであ
    る、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  4. 【請求項４】 Ｅ２コア領域が、配列番号：１に見られ
    るＵＢＣ１及び配列番号：２に見られるＵＢＣ４のコア
    領域からなる群から選ばれる、請求項１記載のＤＮＡ配
    列。
  5. 【請求項５】 コア領域及びスペーサーの両方のＤＮＡ
    コーディング配列が、単一の天然Ｅ２コーディング領域
    からのものである、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  6. 【請求項６】 コア領域及びスペーサーの両方のＤＮＡ
    コーディング配列が、配列番号：２に見られるＵＢＣ４
    からのものである、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  7. 【請求項７】 スペーサーが人工アミノ酸配列である、
    請求項１記載のＤＮＡ配列。
  8. 【請求項８】 タンパク質結合性リガンドが、抗体に対
    して結合特異性を有するプロテインＡからのドメインで
    ある、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  9. 【請求項９】 タンパク質結合性リガンドが、タンパク
    質ホルモン及びタンパク質ホルモンの細胞性レセプター
    からなる群から選ばれる、請求項１記載のＤＮＡ配列。
  10. 【請求項１０】 タンパク質結合性リガンドが抗体によ
    り認識されるエピトープである、請求項１記載のＤＮＡ
    配列。
  11. 【請求項１１】 ゲノム内に請求項１記載のＤＮＡを含
    む非ヒトトランスジェニック真核生物。
  12. 【請求項１２】 植物である、請求項１１記載の非ヒト
    トランスジェニック真核生物。
  13. 【請求項１３】 アミノ末端からカルボキシル末端まで
    に、 Ｅ２タンパク質由来のコア領域であって、Ｅ１タンパク
    質からのユビキチンタンパク質へのチオール結合をエス
    テル交換によって機能的に形成できるコア領域； 少な
    くとも４アミノ酸のスペーサー；及び少なくとも１つの
    標的タンパク質に対して特異的結合親和性を有するタン
    パク質結合性リガンド；を含むＥ２融合タンパク質であ
    って、該全Ｅ２融合タンパク質が少なくとも１つのユビ
    キチン部分へのチオール結合を形成し、該標的タンパク
    質に結合し、そして該ユビキチン部分を該標的タンパク
    質に移動させて共有結合を形成させることができるＥ２
    融合タンパク質。
  14. 【請求項１４】 タンパク質結合性リガンドが、抗体の
    認識ドメインであって、該ドメインが標的タンパク質に
    対して結合特異性を有する、請求項１３記載のＥ２融合
    タンパク質。
  15. 【請求項１５】 Ｅ２コア領域が植物Ｅ２由来である、
    請求項１３記載のＥ２融合タンパク質。
  16. 【請求項１６】 Ｅ２コア領域が、配列番号：１に見ら
    れるＵＢＣ１及び配列番号：２に見られるＵＢＣ４のコ
    ア領域からなる群から選ばれる、請求項１３記載のＥ２
    融合タンパク質。
  17. 【請求項１７】 コア領域及びスペーサーの両方のアミ
    ノ酸配列が、尾状物ドメインを天然に有するＥ２イソフ
    ォームの単一の天然Ｅ２コーディング領域からのもので
    ある、請求項１３記載のＥ２融合タンパク質。
  18. 【請求項１８】 コア領域及びスペーサーの両方のアミ
    ノ酸配列が、配列番号：２に見られるＵＢＣ４からのも
    のである、請求項１３記載のＥ２融合タンパク質。
  19. 【請求項１９】 スペーサーが人工アミノ酸配列であ
    る、請求項１３記載のＥ２融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 タンパク質結合性リガンドが、抗体に
    対して結合特異性を有するプロテインＡからのドメイン
    である、請求項１３記載のＥ２融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 タンパク質結合性リガンド配列が、タ
    ンパク質ホルモン及びタンパク質ホルモンの細胞性レセ
    プターからなる群から選ばれる、請求項１３記載のＥ２
    融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 タンパク質結合性リガンドが、抗体に
    より認識されるエピトープである、請求項１３記載のＥ
    ２融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 請求項１３記載のＥ２融合タンパク質
    を含む非ヒトトランスジェニック真核生物。
  24. 【請求項２４】 植物である、請求項２３記載の非ヒト
    トランスジェニック真核生物。
  25. 【請求項２５】 下記の工程を含む、標的タンパク質に
    ユビキチン部分を付加させる方法： （ａ）宿主の細胞内でプロモーターに対して３’側に位
    置するタンパク質コーディング配列を発現するのに効果
    的な該プロモーター；及び該プロモーターに対して３’
    側に位置するタンパク質コーディング配列；を含むＥ２
    融合タンパク質のためのＤＮＡ配列を構築する工程であ
    って、該タンパク質コーディング配列が、５’から３’
    において、 Ｅ２コア領域をコードするＤＮＡコーディング配列；少
    なくとも４アミノ酸のスペーサーをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；及び該標的タンパク質に対して親和性
    を有するタンパク質結合性リガンドをコードするＤＮＡ
    コーディング配列；を含む工程； （ｂ）工程（ａ）からのＤＮＡ配列を、そのプロモータ
    ーが該Ｅ２融合タンパク質を発現させることができる宿
    主に形質転換して、該Ｅ２融合タンパク質を該宿主内で
    産生させる工程；及び （ｃ）該Ｅ２融合タンパク質がＥ１からユビキチンを受
    け入れて、存在する該標的タンパク質に該ユビキチンを
    特異的に移動させるように、該Ｅ２融合タンパク質をユ
    ビキチン連結Ｅ１及びエネルギー供給源に曝す工程。
  26. 【請求項２６】 標的タンパク質が工程（ｂ）の宿主内
    にあり、工程（ｃ）が該宿主の細胞内でのＥ２融合タン
    パク質のin vivo 発現により行われる、請求項２５記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 標的タンパク質が工程（ｂ）の宿主内
    にない方法であって、該宿主内で発現されたＥ２融合タ
    ンパク質を回収する工程及び該Ｅ２融合タンパク質を該
    標的タンパク質が存在する別の宿主内に導入する工程を
    更に含む、請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 下記の工程を含む、標的タンパク質を
    分解させる方法： （ａ）宿主の細胞内でプロモーターに対して３’側に位
    置するタンパク質コーディング配列を発現するのに効果
    的な該プロモーター；及び該プロモーターに対して３’
    側に位置するタンパク質コーディング配列；を含むＥ２
    融合タンパク質のためのＤＮＡ配列を構築する工程であ
    って、該タンパク質コーディング配列が、５’から３’
    において、 Ｅ２コア領域をコードするＤＮＡコーディング配列；少
    なくとも４アミノ酸のスペーサーをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；及び該標的タンパク質に対して親和性
    を有するタンパク質結合性リガンドをコードするＤＮＡ
    コーディング配列；を含む工程； （ｂ）工程（ａ）からのＤＮＡ配列を、そのプロモータ
    ーが該Ｅ２融合タンパク質を発現させることができる宿
    主に形質転換して、該Ｅ２融合タンパク質を該宿主内で
    産生させる工程；及び （ｃ）該Ｅ２融合タンパク質がＥ１からユビキチンを受
    け入れて、存在する該標的タンパク質に該ユビキチンを
    特異的に移動させるように、該Ｅ２融合タンパク質を、
    ユビキチン連結Ｅ１、エネルギー供給源及びプロテオソ
    ームタンパク質分解複合体に曝して、該プロテオソーム
    により該標的タンパク質を分解する工程。
  29. 【請求項２９】 下記の工程を含む、宿主生物内で標的
    タンパク質を分解させる方法： （ａ）宿主の細胞内でプロモーターに対して３’側に位
    置するタンパク質コーディング配列を発現するのに効果
    的な該プロモーター；及び該プロモーターに対して３’
    側に位置するタンパク質コーディング配列；を含むＥ２
    融合タンパク質のためのＤＮＡ配列を構築する工程であ
    って、該タンパク質コーディング配列が、５’から３’
    において、 Ｅ２コア領域をコードするＤＮＡコーディング配列；少
    なくとも４アミノ酸のスペーサーをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；及び該標的タンパク質に対して親和性
    を有するタンパク質結合性リガンドをコードするＤＮＡ
    コーディング配列；を含む工程； （ｂ）該Ｅ２融合タンパク質が該標的タンパク質にユビ
    キチン部分を付加して、細胞タンパク質分解経路により
    該標的タンパク質を分解するように、工程（ａ）からの
    ＤＮＡ配列を該宿主生物内に形質転換する工程。
  30. 【請求項３０】 宿主が植物である、請求項２９記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】 下記の工程を含む、標的宿主内で標的
    タンパク質を分解させる方法： （ａ）宿主の細胞内でプロモーターに対して３’側に位
    置するタンパク質コーディング配列を発現するのに効果
    的な該プロモーター；及び該プロモーターに対して３’
    側に位置するタンパク質コーディング配列；を含むＥ２
    融合タンパク質のためのＤＮＡ配列を構築する工程であ
    って、該タンパク質コーディング配列が、５’から３’
    において、 Ｅ２コア領域をコードするＤＮＡコーディング配列；少
    なくとも４アミノ酸のスペーサーをコードするＤＮＡコ
    ーディング配列；及び該標的タンパク質に対して親和性
    を有するタンパク質結合性リガンドをコードするＤＮＡ
    コーディング配列；を含む工程； （ｂ）工程（ａ）からのＤＮＡ配列を、そのプロモータ
    ーが該Ｅ２融合タンパク質を発現させることができる産
    生宿主に形質転換して、該Ｅ２融合タンパク質を該産生
    宿主内で産生させる工程； （ｃ）該発現したＥ２融合タンパク質を該産生宿主から
    回収する工程；及び （ｄ）該回収したＥ２融合タンパク質を該標的宿主内に
    導入する工程。
  32. 【請求項３２】 標的宿主が哺乳動物である、請求項３
    １記載の方法。
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