JP2010512160A - トランスフェリン融合タンパク質ライブラリー - Google Patents

トランスフェリン融合タンパク質ライブラリー Download PDF

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Abstract

トランスフェリン部分およびインテグリン結合ドメインを含む融合タンパク質ならびにそのペプチドライブラリーを開示する。本発明には、宿主細胞によって発現される融合タンパク質中でディスプレイされるトランスフェリンおよびインテグリンペプチドライブラリーをスクリーニングする方法が含まれる。本発明の融合タンパク質には、酵母中での発現が可能なトランスフェリン融合タンパク質が含まれる。

Description

関連出願
本出願は、２００５年６月１７日出願の米国仮特許出願第６０／６９１，２２９号の優先権を主張する２００６年６月１９日出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３７４２号に関連するものである。本出願はまた、すべてその全体が参考として組み込まれている、２００４年１１月２３日出願の米国特許出願第１０／５１５，４２９号；２００３年７月９日出願の米国仮特許出願第６０／４８５，４０４号；２００３年３月１０日出願の米国特許出願第１０／３８４，０６０号；および２００２年８月３０日出願の米国仮特許出願第６０／４０６，９７７号にも関連する。
本発明は、融合タンパク質、融合タンパク質ライブラリー、およびリガンド、例えばインテグリン結合ペプチドの結合活性をスクリーニングするための融合タンパク質の使用に関する。
細胞表面ディスプレイシステム
コンビナトリアルライブラリースクリーニングおよび選択方法は、一般的な研究ツールとなっている（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ他（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５９：９４〜１２３）。最も広く知られている技術の１つはファージディスプレイであり、これは、タンパク質を、バクテリオファージコートタンパク質とのポリペプチド融合物として発現させ、続いて、固定化または可溶性のビオチン標識リガンドと結合させることによってスクリーニングするものである。ランダムペプチドの提示は、多くの場合、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１などの糸状バクテリオファージの外表面上に発現されるキメラタンパク質を構築することによって達成される。ファージディスプレイは、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、および酵素への応用に成功している。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：６２〜７０；Ｌａｄｎｅｒ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３：４２６〜４３０；Ｌｏｗｍａｎ他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２〜１０８３８；Ｍａｒｋｌａｎｄ他（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：８０４５〜８０５７；およびＭａｔｔｈｅｗｓ他（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：１７２７〜１７３４を参照されたい。
ファージディスプレイに加えて、いくつかの細菌細胞表面ディスプレイ方法が開発されている。Ｇｅｏｒｇｉｏｕ他（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：２９〜３４を参照されたい。細菌細胞表面ディスプレイ方法で用いる一手法は、ピリンタンパク質（ＴｒａＡ）またはその一部分と、線毛を形成する能力を有する細菌宿主細胞の外表面上にライブラリーペプチドを表示している異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を使用することであった。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，５１６，６３７号を参照されたい。
ＦＬＩＴＲＸ（商標）ランダムペプチドライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）では、細菌鞭毛タンパク質ＦｌｉＣおよびチオレドキシンＴｒｘＡを使用して、十二量体のランダムペプチドライブラリーを立体構造が規制された形で大腸菌の表面上にディスプレイさせる。Ｌｕ他（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：３６６を参照されたい。これらのシステムは、抗体エピトープのマッピング、生細菌ワクチン送達系の開発および構築、ならびに環境浄化目的および診断学のための全細胞生体接着剤の作製に応用されている。腫瘍由来上皮細胞上の腫瘍特異的標的と結合するペプチド配列も、ＦＬＩＴＲＸ（商標）システムを用いて同定されている。Ｂｒｏｗｎ他（２０００）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、７（１０）：７４３を参照されたい。
酵母細胞表面ディスプレイシステムがライブラリースクリーニングのために開発されており、ファージおよび細菌のディスプレイシステムの制限の一部に打ち勝つことに成功している。ｐＹＤ１酵母ディスプレイベクターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの酵母表面ディスプレイシステムでは、芽酵母のａ−凝集素受容体を使用して外来タンパク質を細胞表面上にディスプレイさせる。ａ−凝集素受容体は、ＡＧＡ１遺伝子およびＡＧＡ２遺伝子によってコードされている２つのサブユニットからなる。Ａｇａ１タンパク質（Ａｇａ１ｐ、７２５個のアミノ酸）は、細胞から分泌され、酵母細胞壁の細胞外基質中のβ−グルカンと共有結合する。Ａｇａ２タンパク質（Ａｇａ２ｐ、６９個のアミノ酸）は、２つのジスルフィド結合を介してＡｇａ１ｐと結合し、分泌後、Ａｇａ１ｐとの接触を介して細胞に結合したままである。Ａｇａ２ｐのＮ末端部分はＡｇａ１ｐとの結合に必要であるが、酵母細胞表面上での提示のためにＣ末端とはタンパク質およびペプチドが融合することができる。凝集素とは、通常は特異的接着接点として機能して接合中に酵母細胞を融合させる、ネイティブ酵母タンパク質である。したがって、これは、細胞壁構成要素から過剰な立体障害を受けることなくタンパク質間結合に関して進化している。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｂｏｄｅｒ他、「タンパク質の発現、親和性、および安定性の定向進化のための酵母表面ディスプレイ（Ｙｅａｓｔ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」、キメラ遺伝子およびハイブリッドタンパク質の応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、（Ｊｅｒｅｍｙ Ｔｈｏｒｎｅｒ他）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２０００、第３２８巻、ページ４３０〜４３９；米国特許第６，６９９，６５８号；および米国特許第６，４２３，５３８号。
しかし、このシステムの欠点の１つは、Ａｇａ２ｐタンパク質が細胞壁に係留されるためには、Ａｇａ２ｐ−融合タンパク質とＡｇａ１ｐとがジスルフィド結合を形成する必要があるので、ディスプレイの効率は比較的低く、酵母細胞の４０％〜６０％しかタンパク質を表面上に有効に表示しない。Ｆｅｌｄｈａｕｓｅ他（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１（２）：１６３〜７０を参照されたい。ライブラリーのタンパク質のすべて、またはそうでなければほとんどを、細胞表面上に提示する、酵母ディスプレイシステムの必要性が存在する。
Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐの酵母ディスプレイシステムの別の欠点は、スクリーニングされるリガンドを、Ａｇａ２ｐのＣ末端に結合させることが必要なことである。その結果、このシステムは、遊離Ｎ末端が結合に必要であり、かつ／または活性に必要であるペプチドの選択に使用することができない。したがって、リガンドのＮ末端と酵母細胞タンパク質との結合を必要としない、柔軟なディスプレイシステムの必要性が存在する。
トランスフェリン融合タンパク質
血清トランスフェリン（Ｔｆ）とは、循環血液中の鉄と結合し、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介してそれを様々な組織へと輸送する、分子量８０，０００ダルトンの単量体糖タンパク質である（Ａｉｓｅｎ他（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：３５７〜３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ他（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：３５４３〜３５５３；および米国特許第５，０２６，６５１号）。Ｔｆは最も一般的な血清分子の１つであり、全血清タンパク質の約５〜１０％までを構成する。炭水化物欠乏トランスフェリンは、アルコール依存症の個体の血液中でレベルが上昇して生じ、グリコシル化されたトランスフェリン（約７〜１０日間）よりも長い半減期（約１４〜１７日間）を示す。ｖａｎ Ｅｉｊｋ他（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１３２：１６７〜１７１；Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７：２０２９〜２０３７；Ａｒｎｄｔ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４７（１）：１３〜２７；およびＳｔｉｂｌｅｒ他、「炭水化物欠乏消費（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）」、生物科学の進化（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、（Ｅｄ Ｎｏｒｄｍａｎｎ他）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、１９８８、第７１巻、ページ３５３〜３５７）を参照されたい。Ｔｆの構造は十分に特徴づけられており、受容体結合、鉄結合および放出ならびに炭酸イオン結合の機構が解明されている。すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，０２６，６５１号、第５，９８６，０６７号およびＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ他（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８（６）：３５４３〜３５４６を参照されたい。
ムチンとは、高度にグリコシル化されたタンパク質のファミリーである。マイクロアレイから相当な距離で融合タンパク質のリガンドドメインを上昇させるために、ムチンおよびムチン様タンパク質が用いられている。リガンドを基質から顕著な距離上昇させることにより、リガンドと受容体を発現する細胞中でディスプレイされる受容体との結合が増加すると仮説が立てられている。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている国際公開公報ＷＯ０１／４６６９８を参照されたい。
本発明の発明者らは、トランスフェリン融合タンパク質ライブラリーを以前に開発している。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第１０／５１５，４２９号を参照されたい。本発明は、立体障害を減少させてリガンド結合を増加させるように設計されている、ムチンまたはムチン様タンパク質などのストーク様部分を含有するトランスフェリン融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、発現されたトランスフェリン融合タンパク質をペプチドスクリーニングのプラットフォームとして使用できるように、酵母などの宿主細胞の表面上に発現およびディスプレイさせることができる。さらに、融合タンパク質のトランスフェリンおよびリガンド部分を切断して治療剤として使用することができる。Ｎ末端と融合したＡｇａ２タンパク質の除去はトランスフェリンと連結した小リガンドの立体構造に影響を与える可能性が高いので、これは既存の酵母ディスプレイ技術では達成が可能でない場合がある。
以下にさらに詳述するように、本発明には、トランスフェリン（Ｔｆ）部分を有する融合タンパク質が含まれる。本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、トランスフェリン部分、ストーク部分、および細胞壁連結基を含む。本発明のこの実施形態では、融合タンパク質は細胞の細胞表面上で発現され、細胞壁連結基によって細胞壁と連結している。本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、アンカー、例えばＧＰＩアンカーを介して細胞膜と連結しているトランスフェリン部分を含む。
特許請求した本発明のトランスフェリン部分は、トランスフェリンタンパク質またはその一部分を含有する。例えば、トランスフェリン部分は、トランスフェリンタンパク質のＮドメインの一部分、すなわちローブであることができる。Ｔｆ部分は、融合タンパク質のＴｆ部分が野生型Ｔｆと比較して減少したグリコシル化を示すような改変Ｔｆタンパク質であることができる。本発明の一実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分はグリコシル化を示さない。本発明の別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、野生型トランスフェリンと比較して鉄、炭酸水素に対して低下した親和性および／またはトランスフェリン受容体に対して低下した親和性を示すように、改変されている。トランスフェリン部分は、トランスフェリン受容体、鉄または炭酸水素と結合できないように改変されていてもよい。したがって、本発明には、トランスフェリン部分が、グリコシル化部位、鉄結合部位、ヒンジ部位、炭酸水素部位、および受容体結合部位からなる群からの１つまたは複数の部位で改変されている、改変トランスフェリン部分が含まれる。
特許請求した本発明のリガンドは、様々な様式でトランスフェリン部分と複合体形成または融合することができる。さらに、トランスフェリン部分には複数のリガンドが会合していてもよい。リガンド部分は、トランスフェリン部分のＮ末端、Ｃ末端と融合しているか、またはトランスフェリン部分の内部に位置していてもよい。本発明の一実施形態では、リガンドは、アミノ酸位置Ａｓｐ３３、Ａｓｎ５５、Ａｓｎ７５、Ａｓｐ９０、Ｇｌｙ２５７、Ｌｙｓ２８０、Ｈｉｓ２８９、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ１０５、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１６６、Ｇｌｎ１８４、Ａｓｐ１９７、Ｌｙｓ２１７、Ｔｈｒ２３１およびＣｙｓ２４１からなる群から選択される、Ｎローブ（Ｎ１またはＮ２）の１つまたは複数のアミノ酸位置で挿入されている。
本発明にはまた、トランスフェリン部分の露出したループ上に位置するリガンドも含まれる。融合タンパク質は、リガンド部分がトランスフェリン部分に対してインフレームであるように、例えば、宿主細胞内でトランスフェリン融合タンパク質およびリガンドをコードしているベクターを発現させることによって、構築することができる。
別の実施形態では、リガンド部分は、トランスフェリン部分内の１つまたは複数のランダム化された表面露出アミノ酸残基を含み得る。例えば、トランスフェリン部分は、少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０個以上のランダム化された表面露出アミノ酸残基を含有し得る。一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質またはトランスフェリンタンパク質のライブラリーは、約６個の表面露出アミノ酸残基を用いて構築する。トランスフェリンの表面露出アミノ酸は、当分野で知られている突然変異誘発方法を用いてランダム化することができる。ランダム化されたアミノ酸残基は、露出した領域内で連続しているまたは密集していてよい。トランスフェリンの表面露出領域には、それだけには限定されないが、位置約８５から位置約９２、位置約２７６から位置約２９８または位置約２０７から約２１７のアミノ酸が含まれる。
リガンドは、それだけには限定されないが、単鎖抗体、抗体、抗体断片、抗体可変領域、ランダムペプチド、または抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた多くの形態を取ることができる。リガンドは、可変またはランダム領域および不変領域を含有し得る。一実施形態では、リガンドはランダムペプチドである。トランスフェリン部分を用いて発現させるランダムペプチドリガンド部分は、それだけには限定されないが、エラープローンＰＣＲおよびＤＮＡシャフリングを含めた多くの当分野で知られている方法によって作製することができる。また、リガンド部分は、トランスフェリン融合タンパク質が既に翻訳された後にそれに付加することもできる。
リガンドは、目的のリガンドまたはリガンドのライブラリー中の１つのリガンドであることができる。リガンドは、ペプチド、抗原、受容体、抗体、毒素、代謝物、および核酸などの１つまたは複数の受容体または薬剤と結合する能力を有し得る。
本発明の一実施形態では、リガンドは、リガンド結合配列内またはリガンド結合配列に近接して１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含有する、既知のリガンド結合配列である。例えば、リガンドは、１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸残基がＲＧＤ配列の片側または両側に隣接する、インテグリン結合配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）であることができる。本発明の一実施形態では、リガンドはＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣであり、Ｘはランダム化されたアミノ酸残基である。本発明のさらなる実施形態では、リガンドはＸＸＸＲＧＤＸＸＸである。
上述のように、一実施形態では、融合タンパク質はストーク部分を含む。ストーク部分は、そのＮ末端がトランスフェリン部分と融合し、そのＣ末端が細胞内、例えば細胞壁内に位置するように方向付けることができる。一実施形態では、ストーク部分のＣ末端がアンカー部分と融合している。一実施形態では、本発明のストーク部分は酵母細胞の細胞壁にまたがり、一般に、中程度から高度にグリコシル化されたペプチドである。細胞壁にまたがることによって、ストーク部分は、細胞壁を介して融合タンパク質を係留させる細胞壁連結メンバーとして働き得る。本発明の別の実施形態では、ストーク部分は細胞壁にまたがり、細胞表面上に部分的にディスプレイされる。ストーク部分の組成により、これが竿様の立体構造となる場合があり、これは、そうでなければ融合タンパク質、特にリガンドと宿主細胞との間に存在する立体障害を減少させる。
ストーク部分は、ムチン、ムチン変異体またはその断片を含有する、またはそれからなり得る。ムチンドメインには、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１０、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ２１およびその変異体が含まれ得る。一実施形態では、ストーク部分は、配列番号５の核酸配列またはその断片に対応するペプチドなど、ヒトＭＵＣ１ドメインを含有する。別の実施形態では、ストーク部分は、ムチンの２つ以上の反復、例えばＭＵＣ１またはＭＵＣ３の２つ以上の反復を含む。さらなる実施形態では、ストーク部分は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１０、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０およびＭＵＣ２１からなる群からの２つ以上のムチンタンパク質またはその変異体もしくは断片を含む。ムチン変異体および他のストークタンパク質の変異体は、当分野で知られている方法、例えばランダム化突然変異誘発によって遺伝子操作することができる。
ストーク部分はまた、ネイティブ酵母壁タンパク質を含めた、中程度から高度にグリコシル化された他のタンパク質も含有する、またはそれからなり得る。例えば、本発明の一実施形態では、ストーク部分は、Ａｇａ１、Ａｇａ１の変異体、またはその断片を含有する、またはそれからなる。
本発明の融合タンパク質にはまた、融合タンパク質を宿主細胞に固定または係留させるように作用する細胞壁連結メンバーも含まれ得る。細胞壁連結メンバーは、本発明の融合タンパク質を酵母細胞壁に共有結合または非共有結合させることができる。本発明の一実施形態では、融合タンパク質のストーク部分は、細胞壁連結メンバーである。例えば、ストーク部分からのＯ−グリカンは、細胞壁のβグルカンと架橋結合することができる。他の細胞壁連結メンバーには、それだけには限定されないが、遊離システイン残基を含有するペプチドが含まれる。例えば、１つまたは複数の非対合のシステイン残基を含有するストーク部分またはアンカー部分は、細胞壁内のタンパク質の１つまたは複数の非対合のシステイン残基とジスルフィド結合（複数可）を形成することができる。
本発明の融合タンパク質は、アンカー部分を含有していてもよく、これも、トランスフェリン融合タンパク質を宿主細胞に固定または係留させるように作用する。アンカー部分は、細胞壁連結メンバーであるか、または融合タンパク質を細胞膜に係留させることができる。
本発明の融合タンパク質を酵母細胞膜に係留させることができるアンカードメインの１つは、とりわけ、配列番号１５に提供するシグナルペプチド配列など、翻訳後タンパク質修飾を介してＧＰＩシグナルペプチド配列中のω部位に付加される、グリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）ペプチドアンカーである。ＧＰＩペプチドアンカーはまた、本発明の融合タンパク質を高等真核細胞膜、例えば哺乳動物細胞膜または植物細胞膜にアンカーさせるためにも使用し得る。本発明の一実施形態では、修飾されたＧＰＩシグナル配列によって提供されるものなどのアンカーは、融合タンパク質を宿主細胞膜または細胞壁に一過的に係留させ後に切断される。切断された後、ストーク部分からのグリカンが細胞壁のβグルカン内に架橋結合された結果、融合タンパク質は、細胞壁連結メンバーを介して細胞に係留されたまま保たれる。
本発明の別の実施形態では、アンカーは膜貫通ドメインである。膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、１回貫通のＩ型もしくはＩＩ型の膜タンパク質の領域またはマルチスパン膜タンパク質のいくつかの膜貫通領域の任意の１つであることができる。
本発明にはまた、特許請求した融合タンパク質をコードしている核酸分子も含まれる。核酸をベクター内に挿入し、酵母などの宿主細胞を形質転換させるために使用することができる。本発明の核酸で形質転換させた後、宿主細胞が融合タンパク質を発現することができる。融合タンパク質の発現の誘導は、当分野で知られている方法、例えば誘導性プロモーターを使用することによって調節することができる。本発明には、宿主細胞のコレクション、例えば、ランダム化されたペプチドを表示する本発明の融合タンパク質を発現する酵母細胞のコレクション中で発現された融合タンパク質のライブラリーが含まれる。
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質を用いてリガンドまたは薬剤の結合活性をスクリーニングする。特許請求した融合タンパク質を発現することができる宿主細胞のライブラリーを、それだけには限定されないが、抗原または受容体を含めた薬剤に曝露し、その後、結合活性についてスクリーニングすることができる。細胞表面ディスプレイライブラリーは、それだけには限定されないが、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズを含めた当分野で知られている方法を用いてスクリーニングすることができる。
トランスフェリン融合タンパク質上にディスプレイされたランダムペプチドまたはＣＤＲライブラリーおよびリガンドと標的との結合を示す図である。 酵母ＹＩＲ０１９Ｃ ＧＰＩアンカーのペプチド配列を示す図であり、ハイライトは細胞膜結合を担うアミノ酸を示す。 ｐＲＥＸ０５４９のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ０９９５のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ０６６７のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ１０１２のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ０７５９のベクターマップを示す図である。 ２回のＭＡＣＳ分離後のＦｌａｇタグ付けした酵母の存在を示す図である。 ｐＲＥＸ０８５５のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ１０８７のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ１１０６のベクターマップを示す図である。 ＭＵＣ１およびＡＧＡ１を用いたＦＡＣＳ分析を示す図である。 ｐＲＥＸ１１０６を、プライマーＰ１９８０／Ｐ２１８１およびＰ２１２７／Ｐ１１７３を用いて増幅することによって得られた断片ＡおよびＢを示す図である。 ＲＧＤトランス体とインテグリンの直接結合を示す図である。 ＲＧＤトランス体結合の競合的結合分析を示す図である。 ＲＧＤトランス体クローンによるマウス血小板の凝集の阻害を示す図である。 酵母中で発現されたｈＭＵＣ３変異体のＦＡＣＳ分析を示す図である。 ｐＲＥＸ０７５７のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ１２３４のベクターマップを示す図である。 ｐＲＥＸ１２３５のベクターマップを示す図である。 Ｆｌａｇタグ付けしたトランスフェリンを発現し、抗Ｆｌａｇまたは抗トランスフェリン抗体でプローブした哺乳動物細胞からの溶解物を用いて調製したウェスタンブロットを示す図である。 露出した血漿膜タンパク質のウェスタンブロットを示す図である。 ｐＲＥＸ１２３５のＦＡＣＳ分析を示す図である。
全体的な説明
本発明の発明者らは、例えば、ライブラリー、例えばランダムペプチドまたはＣＤＲライブラリーをスクリーニングするための細胞表面ディスプレイシステムの一部として使用することができる多機能融合タンパク質を開発した。融合タンパク質には、１つまたは複数のリガンドと複合体形成または融合したトランスフェリン部分が含まれる。トランスフェリン部分はまた、表面露出アミノ酸残基をランダム化することによって、リガンドとしても役割を果たすことができる。
本発明には、トランスフェリン以外のタンパク質を含有する融合タンパク質が含まれるが、ただし、他のタンパク質は可溶性であり、かつ融合タンパク質の残りの部分から切断された場合、または融合タンパク質の残りの部分なしで再構築された場合に、融合した１つまたは複数のリガンドに血清半減期の増加を与えることができる。例えば、アルブミンまたはその変異体もしくは断片をトランスフェリンの代わりに使用することができる。
本発明の一実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、中程度から高度にグリコシル化されているストーク部分と融合している。本発明のこの実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質を酵母細胞の細胞壁に共有結合または非共有結合させることができる細胞壁連結メンバーを含有する。
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、膜貫通ドメインなどのアンカー部分を含有する。融合タンパク質はまた、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜にアンカーされていてもよい。そのようなアンカーを使用して本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞上で発現させることができる。本発明の融合タンパク質はストーク部分およびアンカー部分をどちらも含有し得るが、本発明には、ストーク部分を含み、アンカー部分を含まない融合タンパク質、およびアンカー部分を含み、ストーク部分を含まないものも含まれる。
本発明の一実施形態では、融合タンパク質は酵母中で発現される。そのような融合タンパク質は、Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐ酵母ディスプレイシステムと比較して細胞表面にディスプレイされたペプチドを有するクローンの割合の増加を提供することを含めて、従来技術を超える利点を提供する。本発明の融合タンパク質はまた、結合するために、利用可能なＮ末端を必要とする、リガンドのスクリーニングの柔軟性も提供する。さらに、本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞膜にアンカーさせることにより、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞上で発現および提示されることも可能である。
本発明にはまた、融合タンパク質またはその一部分を含む治療組成物、および融合タンパク質またはその一部分を、そのような治療剤を必要としている対象に投与することによって、疾患または障害を治療、予防または寛解させる方法も含まれる。本発明の融合タンパク質には、推定上の治療タンパク質の少なくとも断片または変異体がリガンド部分として含まれる。本発明の一実施形態では、トランスフェリンおよびリガンド、すなわち融合タンパク質の治療部分を細胞から切断し、生物製剤またはワクチンを調製するために使用することができる。例えば、融合タンパク質の治療部分をストーク部分またはアンカーから切断することができる。
定義
本明細書中で使用する用語「生物活性」とは、生物学的状況において、すなわち、生物中またはそのｉｎ ｖｉｔｒｏ複写中において、治療分子、リガンド部分、タンパク質またはペプチドによって行われる機能または一組の活性をいう。生物活性には、それだけには限定されないが、特許請求した融合タンパク質の治療分子部分の機能、例えば、それだけには限定されないが、応答性細胞系からの細胞外基質の分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、化学走性の誘導、有糸分裂誘発の誘導、分化の誘導、または応答性細胞の細胞分裂の阻害が含まれ得る。本発明の融合タンパク質またはペプチドは、その治療タンパク質のネイティブ対応物の１つまたは複数の生物活性を示す場合に、生物活性を有するとみなされる。
本明細書中で使用する、トランスフェリン配列中の「に対応するアミノ酸」または「均等アミノ酸」は、第１のトランスフェリン配列と少なくとも第２のトランスフェリン配列との間の同一性または類似度を最大にするために、アラインメントによって同定する。第２のトランスフェリン配列中の均等アミノ酸を同定するために使用する数字は、第１のトランスフェリン配列中の対応するアミノ酸を同定するために使用する数字に基づいている。特定の場合では、これらの語句を、ウサギ血清トランスフェリン中の特定の残基と比較した、ヒトトランスフェリン中のアミノ酸残基を説明するために使用し得る。
本明細書中で使用する用語「Ｔｆ部分」、「Ｔｆタンパク質の断片」もしくは「Ｔｆタンパク質」、または「Ｔｆタンパク質の一部分」とは、天然に存在するＴｆタンパク質またはその突然変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列をいう。
本明細書中で使用する用語「遺伝子」とは、生物学的機能に関連する任意のＤＮＡセグメントをいう。したがって、遺伝子には、それだけには限定されないが、その発現に必要なコード配列および／または調節配列が含まれる。遺伝子にはまた、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントも含まれることができる。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすることまたは既知もしくは予測される配列情報から合成することを含めて、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列が含まれ得る。
本明細書中で使用する「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「異種遺伝子」または「異種配列」または「外因性ＤＮＡセグメント」とは、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来するか、または、同じ供給源に由来する場合は、その最初の形態から改変されている、ポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントをいう。宿主細胞中の異種遺伝子には、特定の宿主細胞に対して内在性であるが、改変されている遺伝子が含まれる。したがって、この用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるか、または細胞に対して相同的であるが、宿主細胞の核酸内で、その要素が通常見つからない位置にある、ＤＮＡセグメントをいう。例として、酵母細胞に対してネイティブであるが、ヒトＴｆ配列に結合しているシグナル配列は、異種である。
本明細書中で使用する「単離した」核酸配列とは、アガロースゲル電気泳動によって決定して、他の核酸配列を本質的に含まない、例えば、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは約６０％純粋、さらにより好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、さらに最も好ましくは約９５％純粋な核酸配列をいう。例えば、単離した核酸配列は、核酸配列をその天然の位置からそれが複製される別の部位へと再配置するために遺伝子操作で使用される、標準のクローニング手順によって得ることができる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む所望の核酸断片の切除および単離、ベクター分子内への断片の挿入、ならびに宿主細胞内への組換えベクターの取り込みを含む場合があり、ここで核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製される。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、またはその任意の組合せであり得る。
本明細書中で使用する、２つ以上のＤＮＡコード配列は、ＤＮＡコード配列間のインフレーム融合の結果、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳される場合に、「連結（ｊｏｉｎｅｄ）」または「融合」しているといわれる。融合タンパク質に関連する用語「融合」は、リガンド部分、ストーク部分、およびアンカー部分を含む。Ｔｆ融合タンパク質はトランスフェリン部分とストーク部分との融合であり、細胞壁結合メンバーを含有する。
本明細書中で使用する「改変トランスフェリン」とは、野生型トランスフェリンと比較して、そのアミノ酸配列の少なくとも１つの改変を示すトランスフェリン分子をいう。
本明細書中で使用する「改変トランスフェリン融合タンパク質」とは、ストーク部分と融合したリガンドと複合体形成または融合した改変トランスフェリン（またはその断片もしくは変異体）の少なくとも１つの分子の融合によって形成されるタンパク質をいう。
本明細書中で使用する用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーをいう。具体的に限定しない限りは、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸が包含される。別段に指定しない限りは、特定の核酸配列には、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示した配列も暗黙的に包含される。具体的には、縮重コドン置換は、１つもしくは複数の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ他（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌ他（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ他（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１〜９８）。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされているｍＲＮＡと互換性があるように使用される。
本明細書中で使用するＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントと機能的な関係で配置されている場合に、「作動可能に連結している」といわれる。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、融合タンパク質の分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合に、本発明の融合タンパク質をコードしているＤＮＡと作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を刺激する場合に、コード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結しているＤＮＡ配列は連続的であり、シグナル配列または融合タンパク質の場合は、連続的かつ読取り相にある。しかし、エンハンサーは、それらが調節する転写のコード配列と連続的である必要はない。この状況では、連結は、好都合な制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって達成する。
本明細書中で使用する用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始することに関与するＤＮＡの領域をいう。
本明細書中で使用する用語「組換え」とは、組換えＤＮＡを用いた形質転換を受けた細胞、組織または生物をいう。
本明細書中で使用する、標的化部分、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとは、特定の細胞型、例えば、リンパ球などの正常細胞、または癌細胞などの異常細胞と特異的に結合し、したがって、Ｔｆ融合タンパク質または化合物（薬物もしくは細胞毒性剤）をその細胞型に対して特異的に標的化するために使用し得る分子をいう。
本明細書中で使用する「治療タンパク質」とは、１つまたは複数の治療活性および／または生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはその断片もしくは変異体をいう。本発明によって包含される治療タンパク質には、それだけには限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物剤が含まれる。用語、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは、本明細書中で互換性があるように使用される。さらに、用語「治療タンパク質」とは、治療タンパク質の内在性または天然に存在する相関物をいい得る。「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療上の活性がある」タンパク質とは、本明細書中に記載の治療タンパク質のうちの１つもしくは複数または他に当分野で知られているものなどの治療タンパク質に関連する、１つまたは複数の既知の生物学的活性および／または治療活性を保有するポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療タンパク質」とは、疾患、状態または障害を治療、予防または寛解させるために有用なタンパク質である。そのような疾患、状態または障害は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば獣医学的使用におけるものであり得る。
本明細書中で使用する用語「形質転換」とは、細胞内への核酸、すなわちヌクレオチドポリマーの移動をいう。本明細書中で使用する用語「遺伝子形質転換」とは、細胞内へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移動および取り込みをいう。
本明細書中で使用する用語「形質転換体」とは、形質転換を受けた細胞、組織または生物をいう。
本明細書中で使用する用語「導入遺伝子」とは、その機能が保証される様式で生物、宿主細胞またはベクター内に挿入された核酸をいう。
本明細書中で使用する用語「トランスジェニック」とは、様々な形質転換方法のうちの１つによって、外来または改変遺伝子、特に改変Ｔｆ融合タンパク質コードしている遺伝子を受け取っており、外来または改変遺伝子を受け取る生物の種と外来または改変遺伝子が同じまたは異なる種由来である、細胞、細胞培養物、生物、細菌、真菌、動物、植物、および前述のうちの任意のものの子孫をいう。
「複数の変異体または変異体」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸をいう。一般に、変異体は全体的に非常に類似しており、多くの領域において参照核酸またはポリペプチドと同一である。本明細書中で使用する「変異体」とは、配列がネイティブ治療タンパク質とは異なるが、本明細書中の他の箇所に記載した、または他に当分野で知られている少なくとも１つのその機能特性および／または治療特性を保持している、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分をいう。
本明細書中で使用する用語「ベクター」とは、広く、外因性核酸をコードしている任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスをいう。この用語にはまた、例えばポリリシン化合物などの、ビリオンまたは細胞内への核酸の移動を促進する非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物も含まれると解釈される。ベクターは、核酸もしくはその突然変異体を細胞に送達するための送達ビヒクルとして適切なウイルスベクターであるか、または、ベクターは、同じ目的に適した非ウイルスベクターであり得る。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当分野で周知であり、例えば、Ｍａ他（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２７４４〜１２７４６）に記載されている。ウイルスベクターの例には、それだけには限定されないが、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えトリポックスウイルスなどが含まれる（Ｃｒａｎａｇｅ他、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：３０５７〜３０６３；１９９４年８月１８日公開の国際特許出願ＷＯ９４／１７８１０；１９９４年１０月２７日公開の国際特許出願ＷＯ９４／２３７４４）。非ウイルスベクターの例には、それだけには限定されないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体、などが含まれる。
本明細書中で使用する用語「野生型」とは、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をいう。
本明細書中で使用する「骨格タンパク質」、「骨格ポリペプチド」、または「骨格」とは、ランダムペプチドなどのアミノ酸配列を融合させることができるタンパク質をいう。ペプチドは骨格に対して外因性である。
本明細書中で使用する「ランダムペプチド配列」とは、２つ以上のアミノ酸単量体からなり、確率的またはランダムプロセスによって構築されるアミノ酸配列をいう。ランダムペプチドにはフレームワークまたは骨格モチーフが含まれることができ、これは不変配列を含み得る。ランダムペプチド配列は、非変異、すなわち非ランダムのアミノ酸の一部分を含有し得る。
本明細書中で使用する「ランダムペプチドライブラリー」とは、一組のランダムペプチドをコードしている一組のポリヌクレオチド配列、これらのポリヌクレオチド配列によってコードされている一組のランダムペプチド、およびこれらのランダムペプチドを含有する融合タンパク質をいう。
本明細書中で使用する用語「擬似ランダム」とは、例えば、１つの位置での残基の可変性の度合が別の位置での残基の可変性の度合と異なるが、どの擬似ランダム位置でも、いかに制限されていようとある程度の残基の可変性が許容されるように可変性が制限されている、一組の配列をいう。
本明細書中で使用する用語「定義された配列フレームワーク」とは、非ランダム基準、一般に実験データまたは構造データの基準に基づいて選択された一組の定義された配列をいい、例えば、定義された配列フレームワークは、β−シート構造を形成すると予測される一組のアミノ酸配列を含み得るか、または、他の変異のうち、とりわけロイシンジッパーの７つ組の反復モチーフ、亜鉛−フィンガードメインを含み得る。「定義された配列カーネル」とは、制限された範囲の可変性を包含する一組の配列である。２０種の慣用のアミノ酸の完全にランダムな１０量体配列は（２０）１０個の配列のうちの任意のものであることができ、２０種の慣用のアミノ酸の擬似ランダム１０量体配列は（２０）１０個の配列のうちの任意のものであることができるが、特定の位置および／または全体的に特定の残基に対して偏りを示す一方で、定義された配列カーネルは、それぞれの残基の位置が許容される２０種の慣用のアミノ酸（および／または許容される慣用でないアミノ／イミノ酸）のうちの任意のものであることを可能にした場合の潜在的な配列の最大数よりも少ない、配列の部分組である。定義された配列カーネルは、一般に、変異および不変残基の位置を含み、かつ／または、アミノ酸残基の定義された部分組などから選択された残基を含むことができる変異残基の位置を、セグメントとしてもしくは個々の選択されたライブラリーメンバー配列の全長にわたって含む。定義された配列カーネルとは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のどちらをいうこともできる。
本明細書中で使用する「リンカー」または「スペーサー」とは、ＤＮＡ結合タンパク質およびランダムペプチドなどの２つの分子を接続する分子または分子群をいい、例えば、最小限のＤＮＡ結合タンパク質からの立体障害でランダムペプチドが受容体と結合できるように、２つの分子を望ましい立体配置に配置する役割を果たす。
本明細書中で使用する用語「可変セグメント」とは、ランダム、擬似ランダム、または定義されたカーネル配列を含む、新生ペプチドの一部分をいう。可変セグメントは、変異および不変残基の位置をどちらも含むことができ、変異残基の位置での残基の可変性の度合は制限され得る。どちらの選択肢も、従事者の判断で選択される。典型的には、可変セグメントは約３〜２０個のアミノ酸残基の長さ、例えば、８〜１０個のアミノ酸の長さであるが、可変セグメントはより長くてもよく、また、抗体断片、核酸結合タンパク質、受容体タンパク質などの抗体部分または受容体タンパク質を含み得る。
本明細書中で使用する用語「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作用を形成することができる、抗原または他の巨大分子の一部分をいう。典型的には、そのような結合相互作用は、ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として現れる。
本明細書中で使用する用語「受容体」、「標的」、または「薬剤」とは、所定のリガンドに対して親和性を有する分子をいう。受容体は、天然に存在する分子または合成分子であることができる。受容体は、変更していない状態または他の種との凝集体として用いることができる。受容体は、結合メンバー、すなわちリガンドと、直接または特異的結合基質を介して、共有結合または非共有結合していることができる。受容体の例には、それだけには限定されないが、モノクローナル抗体および特異的抗原性決定要因（ウイルス、細胞、または他の物質上など）と反応性を有する抗血清を含めた抗体、細胞膜受容体、抗原、分子を含有するエピトープ、複合多糖および糖タンパク質、酵素ならびにホルモン受容体が含まれる。
本明細書中で使用する用語「リガンド」または「リガンド部分」とは、特定の受容体または薬剤によって認識される、ランダムペプチドまたは可変セグメント配列などの分子をいう。当業者には理解されるように、分子（または巨大分子複合体）は、受容体およびリガンドの両方であることができる。
本明細書中で使用する「融合した」、「複合体形成した」または「作動可能に連結している」とは、骨格構造の安定性に対する混乱が最小限となるような様式で、ランダムペプチドと骨格タンパク質とは一緒に連結されていることを意味する。
本明細書中で使用する用語「単鎖抗体」とは、ポリペプチド結合、一般にスペーサーペプチド（例えば［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｘ配列番号１７）を介した連結で、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、アミノおよび／またはカルボキシ末端で追加のアミノ酸配列を含み得る、ポリペプチドをいう。例えば、単鎖抗体は、コードされているポリヌクレオチドを連結するための係留セグメントを含み得る。例として、ｓｃＦｖは単鎖抗体である。単鎖抗体は、一般に、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされている少なくとも１０個の連続的なアミノ酸の、１つまたは複数のポリペプチドセグメントからなるタンパク質であり（例えば、本明細書中に参考として組み込まれている、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ、免疫グロブリン遺伝子（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ）、Ｔ．Ｈｏｎｊｏ、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ、およびＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ編、（１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ページ３６１〜３８７参照）、最も頻繁には、げっ歯類、非ヒト霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト重鎖もしくは軽鎖の遺伝子配列によってコードされている。機能的な単鎖抗体は、一般に、特異的な標的分子、典型的には受容体または抗原（エピトープ）と結合する特性が保持されるように、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含有する。
本明細書中で使用する用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」とは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義によって例示されるように当分野で認識されている用語をいい、また、一般に超可変領域または超可変ループとしても知られる。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ他（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７；Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ他、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（国立衛生研究所、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）（１９８７）；ならびにＴｒａｍｏｎｔａｎｏ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：１７５を参照されたい。可変領域ドメインは、典型的には、アミノ末端で天然に存在する免疫グロブリン鎖の約１０５〜１１５個のアミノ酸、例えばアミノ酸１〜１１０を含むが、若干短いまたは長い可変ドメインも単鎖抗体の形成に適している。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、ＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている。「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、Ｅ．Ｋａｂａｔ他、第４版、米国保険社会福祉省、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９８７）を参照されたい。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。本明細書中で使用する「ヒトフレームワーク領域」とは、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、通常は９０〜９５％以上）なフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖および重鎖の合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置および整列させる役割を持つ。ＣＤＲは、抗原のエピトープと結合することを主に担っている。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および専門用語は、本発明の属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものに類似または均等なすべての方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
トランスフェリンおよびトランスフェリンの改変
本発明の融合タンパク質には、ランダムペプチドまたはＣＤＲなどのリガンドを受容体または薬剤に提示することができる、トランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質またはその一部分が含まれる。Ｔｆ部分はストーク部分のＮ末端と融合している。融合タンパク質のＴｆタンパク質またはその一部分は、融合タンパク質のＴｆ「の一部分」、「領域」または「部分」と呼ばれ得る。本明細書中で使用する、トランスフェリン融合タンパク質とは、ストーク部分と融合したトランスフェリンタンパク質もしくは部分であり、細胞壁連結メンバーを含有し、アンカー部分を含有していてもよいか、または、細胞膜アンカーと直接融合したトランスフェリンタンパク質もしくは部分である。
任意のトランスフェリンを用いて本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を作製し得る。例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａ（グリコシル化を考慮に入れず）の６７９個のアミノ酸のタンパク質であり、２つの主ローブまたはドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有し、これは遺伝子複製に起源すると考えられている。すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれているＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、ならびに配列番号１、２および３を参照されたい。２つのドメインは時間と共に分岐しているが、高い度合の同一性／類似度を保持している。
ＮおよびＣドメインのそれぞれは、２つのサブドメイン、すなわち、Ｎ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２へとさらに分けられる。Ｔｆの機能は、鉄を身体の細胞へと輸送することである。このプロセスは、すべての細胞、特に活発に成長中の細胞上で発現されるＴｆ受容体（ＴｆＲ）によって媒介される。ＴｆＲは鉄と結合した形態のＴｆ（２つの鉄分子が１個の受容体と結合している）を認識し、その後、エンドサイトーシスが起こり、ここでＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、この時点でｐＨが局所的に低下する結果、結合した鉄が放出され、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体が細胞表面へと再循環され、Ｔｆ（その鉄が結合していない形態ではアポＴｆとして知られる）が放出される。受容体結合は、主にＴｆのＣドメインを介するものである。グリコシル化されていない鉄と結合したＴｆは受容体と結合するので、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は受容体結合に関与していないと考えられる。
それぞれのＴｆ分子は２つの鉄イオン（Ｆｅ３＋）を保有することができる。これらは、Ｎ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２サブドメインの間の空間中に複合体形成されており、分子の立体構造変化をもたらす。
ヒトトランスフェリンでは、鉄結合部位は、少なくとも配列番号３のアミノ酸、Ａｓｐ６３（ネイティブＴｆシグナル配列が含まれる配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）、およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）を含む。ヒンジ領域は、少なくとも配列番号３のＮドメインアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８を含む。炭酸結合部位は、少なくとも配列番号３のアミノ酸、Ｔｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）、およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）を含む。
本発明の一実施形態では、融合タンパク質には改変ヒトトランスフェリンが含まれるが、ヒトＴｆ変異体、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、類人猿、ならびに他のウシ科、イヌ科およびトリ科の種を含めた、任意の動物Ｔｆ分子を用いて本発明の融合タンパク質を生成し得る。これらのＴｆ配列はすべて、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の公開データベースから入手可能である。ヒトＴｆヌクレオチド配列が利用可能であり（配列番号１、２および３ならびに上述したｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能な受託番号を参照）、これを用いて、ＴｆまたはＴｆのドメインと選択した治療分子との遺伝子融合体を作製することができる。融合体はまた、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３４３）またはメラノトランスフェリンなどの関連分子からも作製し得る。
ラクトフェリン（Ｌｆ）は天然の防御鉄結合タンパク質であり、抗細菌、抗糸状菌、抗ウイルス、抗新生物および抗炎症性活性を保有することが判明している。このタンパク質は、常在菌叢に一般的にさらされている外分泌液、すなわち乳、涙、経鼻浸出液、唾液、気管支粘液、胃腸管液、頚膣粘液および精液中に存在する。さらに、Ｌｆは循環多形核好中球（ＰＭＮ）の二次特異的顆粒の主要な構成要素である。敗血性領域におけるＰＭＮの脱顆粒の際にアポタンパク質が放出される。Ｌｆの主な機能は、フリーラジカルに媒介される損傷を抑制し、浸潤する微生物および新生細胞の金属利用能を減少させるために、流体中および炎症領域中の遊離鉄を捕捉することである。成体における１２５Ｉ Ｌｆの代謝回転率を検査した研究では、Ｌｆは肝臓および脾臓によって迅速に取り込まれ、放射活性が肝臓および脾臓中で数週間持続したことが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ他（１９７９）、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．、（ロンドン）５７：４５３〜４６０）。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリンスプライシング変異体が含まれる。一例では、トランスフェリンスプライシング変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライシング変異体であることができる。具体的な一実施形態では、ヒトトランスフェリンスプライシング変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ６１１４０のものであることができる。
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質のトランスフェリン部分には、ラクトフェリンスプライシング変異体が含まれる。一例では、ヒト血清ラクトフェリンスプライシング変異体は、好中球ラクトフェリンの新規スプライシング変異体であることができる。具体的な一実施形態では、好中球ラクトフェリンスプライシング変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ５９４７９のものであることができる。別の具体的な実施形態では、好中球ラクトフェリンスプライシング変異体は、アミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号４）を含むことができ、これには新規のスプライス変異領域が含まれる。
融合はまた、メラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３９００、ネズミメラノトランスフェリン）を用いても作製し得る。メラノトランスフェリンとは、悪性黒色腫細胞中に高レベルで見つかるグリコシル化されたタンパク質であり、最初にヒト黒色腫抗原ｐ９７と命名された（Ｂｒｏｗｎ他、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３）。これは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリン、およびニワトリトランスフェリンと高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎ他、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３；Ｒｏｓｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８６、８３：１２６１〜１２６５）。しかし、これらのタンパク質とは異なり、メラノトランスフェリンに対する細胞受容体は同定されていない。メラノトランスフェリンは鉄と可逆的に結合し、２つの形態で存在し、その一方はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜に結合し、他方の形態は可溶性かつ活発に分泌される（Ｂａｋｅｒ他、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２９８：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙ他、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２；Ｆｏｏｄ他、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：７０１１〜７０１７）。
改変Ｔｆ融合は、任意のＴｆタンパク質、断片、ドメイン、または遺伝子操作したドメインを用いて作製し得る。例えば、融合タンパク質は、ネイティブＴｆシグナル配列を有するまたは有さない完全長Ｔｆ配列を用いて作製し得る。トランス体も個々のＮまたはＣドメインなどの単一のＴｆドメインを用いて作製し得る。トランス体はまた、２つのＮドメインまたは２つのＣドメインなどの２つのＴｆドメインを用いても作製し得る。一部の実施形態では、グリコシル化、鉄結合および／またはＴｆ受容体結合を減少、阻害または防止するようにＣドメインが変更されている、治療タンパク質と単一のＣドメインとの融合を生成し得る。他の実施形態では、Ｔｆグリコシル化部位はＣドメイン中に存在し、Ｎドメインはそれ自体では鉄またはＴｆ受容体と結合しないので、単一のＮドメインの使用が有利である。一実施形態では、Ｔｆ融合タンパク質は、高レベルで発現される単一のＮドメインを有する。
本明細書中で使用する、Ｎ様ドメインとして機能するように改変したＣ末端ドメインまたはローブは、ネイティブまたは野生型Ｎドメインもしくはローブと実質的に同様のグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変されている。一実施形態では、Ｃドメインまたはローブは、グリコシル化されておらず、かつ関連するＣドメイン領域またはアミノ酸がネイティブまたは野生型Ｎドメインの対応する領域または部位中に存在するものへと置換されることによって鉄を結合しないように、改変されている。
本明細書中で使用する「２つのＮドメインまたはローブ」を含むＴｆ部分には、ネイティブＣドメインまたはローブを第２のネイティブまたは野生型Ｎドメインもしくはローブまたは改変したＮドメインもしくはローブで置き換えるように、または、野生型または改変Ｎドメインと実質的に同様に機能するように改変されているＣドメインを含有するように、改変されたＴｆ分子が含まれる。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国仮特許出願６０／４０６，９７７号を参照されたい。
２つのドメインの三次元構造を重ね合わすこと（Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ ３．７ｂ２、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍａｇｉｃ Ｆｉｔ）、および直接アミノ酸アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメント）による、２つのドメインの分析により、２つのドメインが時間と共に分岐していることが明らかとなっている。アミノ酸のアラインメントにより、２つのドメイン間で４２％の同一性および５９％の類似度が示されている。しかし、Ｎドメインの約８０％が構造的等価性についてＣドメインと一致する。Ｃドメインはまた、Ｎドメインと比較していくつかの余分なジスルフィド結合も有する。
ＮおよびＣドメインの分子モデルのアラインメントにより、以下の構造的等価性が明らかとなっている。
Figure 2010512160
２つのドメインのジスルフィド結合は、以下のようにアラインメントされる。
Figure 2010512160
一実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブが含まれる。さらなる実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブが含まれる。
別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、およびＨｉｓ２４９からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブが含まれるか、それを含むか、またはそれからなる。
別の実施形態では、改変された融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリンＮ末端ローブ突然変異体が含まれる。
別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれるか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれる。
さらなる実施形態では、Ｃ末端ローブ突然変異体にはさらに、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つの突然変異が含まれ、これはグリコシル化を許容しない。
別の実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は金属イオンと結合する能力を保持している。代替実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は金属イオンと結合する能力を保持しておらず、Ｎドメインと実質的に同様に機能する。
一部の実施形態では、ＴｆまたはＴｆ部分は、融合タンパク質のＴｆまたはＴｆ部分およびリガンドが融合タンパク質の残りの部分から切断されている場合に、融合していない状態、すなわちＴｆと融合していないリガンドのｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期、血清安定性（半減期）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性または生体利用度と比較して、リガンド、すなわち治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期、血清安定性、ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶液安定性または生体利用度が増加するために十分な長さである。安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期または生体利用度のそのような増加は、融合していないリガンド部分領域を超えて約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％以上の増加であり得る。一部の事例では、改変トランスフェリンを含むリガンド部分は、融合していない状態のリガンドと比較して約１日以上、１〜２日以上、３〜５日以上、５〜１０日以上、１０〜１５日以上、１０〜２０日以上、約１２〜１８日または約１４〜１７日の血清半減期を示す。
ＴｆのＣドメインが融合タンパク質の一部である場合、２つのＮ結合型グリコシル化部位、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基は、酵母系中で発現させるために、グリコシル化または過マンノシル化を防止し、融合タンパク質の血清半減期を延長させるために、突然変異させ得る（アシアロ−、または一部の例ではモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆを産生するため）。Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆアミノ酸に加えて、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内またはそれに隣接する残基の突然変異は、グリコシル化を防止または実質的に減少させる。Ｆｕｎｋ他の米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい。例えば、本発明には、アミノ酸Ｓ４１５およびＴ６１３の改変が含まれる。一実施形態では、トランスフェリン部分は、Ｓ４１５ＡおよびＴ６１３Ａの改変を含有する。本実施形態では、アミノ酸の改変は、配列番号３のＳ４１５およびＴ６１３に対応する。
ピキア・パストリス中で発現されるＴｆのＮドメインは、Ｓ３２において単一の六単糖でＯ結合型グリコシル化されることも報告されており、これも、そのようなグリコシル化を防止するために突然変異または改変し得る。さらに、Ｏ結合型グリコシル化は、酵母宿主細胞中で、ＰＭＴ遺伝子のうちの１つまたは複数における突然変異を用いて減少または排除し得る。
したがって、本発明の一実施形態では、融合タンパク質には、トランスフェリンが、それだけには限定されないが、Ｔｆのアシアロ−、モノシアロ−およびジシアロ−形態を含めて減少したグリコシル化を示す、改変トランスフェリン分子が含まれる。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止するために突然変異させた組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。さらなる実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止するために突然変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つが、グリコシル化を許容しないアミノ酸へと突然変異している。別の実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止または実質的に減少させるために突然変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の残基に対するものであり得る。さらに、グリコシル化は、セリンまたはスレオニン残基を突然変異させることによって減少または防止し得る。例えば、本発明の一実施形態では、融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止するために突然変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、配列番号３のＳｅｒ４１５およびＴｈｒ６１３のうちの少なくとも１つが、グリコシル化を許容しないアミノ酸へと突然変異している。さらに、Ｘをプロリンに変更することでグリコシル化が阻害されることが知られている。
以下により詳述するように、本発明の改変Ｔｆを含む改変Ｔｆ融合タンパク質はまた、鉄と結合しないおよび／またはＴｆ受容体と結合しないように遺伝子操作してもよい。本発明の他の実施形態では、鉄結合は保持され、Ｔｆの鉄結合能力を用いて、治療タンパク質またはペプチド（複数可）を細胞の内部および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて送達し得る。Ｎドメインは、鉄をロードした場合に単独ではＴｆＲと結合せず、鉄と結合したＣドメインはＴｆＲと結合するが、全分子と同じ親和性ではない。
別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分には、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体は金属イオンと結合する能力を保持していない。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の金属イオンに対する結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも弱い。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の金属イオンに対する結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも強い。
別の実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体は、トランスフェリン受容体と結合する能力を保持していない。代替実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体のトランスフェリン受容体に対する結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも弱い。代替実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体のトランスフェリン受容体に対する結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも強い。
別の実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体は、炭酸イオンと結合する能力を保持していない。代替実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の炭酸イオンに対する結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも弱い。代替実施形態では、トランスフェリン部分には突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の炭酸イオンの結合親和性は、野生型血清トランスフェリンよりも強い。
別の実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体は金属イオンと結合する能力を保持している。代替実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体であり、突然変異体は金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体であり、突然変異体は金属イオンと結合する能力を保持していない。
別の実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の金属イオンに対する結合力は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強い（その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，９８６，０６７号参照）。代替実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体の金属イオンに対する結合力は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも弱い。さらなる実施形態では、トランスフェリン部分には、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体は金属イオンと結合しない。
それだけには限定されないが、一般的に利用可能な分子技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に開示されているものを含めた任意の利用可能な技術を使用して、本発明の融合タンパク質を生成し得る。当分野で周知の部位特異的突然変異誘発を達成するための技術を用いてヌクレオチド置換を実施する場合、コードされているアミノ酸の変化は、好ましくは軽微な性質のもの、すなわち保存的アミノ酸置換であるが、他の非保存的置換も、特に改変トランスフェリン部分、例えば、減少したグリコシル化、減少した鉄結合などを示す改変融合タンパク質を生成する場合に、企図される。アミノ酸置換、小さな欠失または挿入、典型的には約３０個のアミノ酸のうちの１つ、トランスフェリンドメイン間の挿入、小さなアミノもしくはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、またはトランスフェリンドメイン間の５０、４０、３０、２０もしくは１０個未満の残基の小さなリンカーペプチドまたはトランスフェリンタンパク質と治療タンパク質もしくはペプチド、リガンド、または抗体可変領域もしくはストーク領域との連結、または、ポリヒスチジン路、抗原性エピトープまたは結合ドメインなどの精製を促進する小さな伸長が、特に企図される。
保存的アミノ酸の置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジンなど）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸など）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギンなど）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど）ならびに小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニンなど）の群内など、同じ群内で行う置換である。
非保存的置換とは、１つの群のアミノ酸を別の群のアミノ酸で置換することを包含する。例えば、非保存的置換には、極性アミノ酸で疎水性アミノ酸を置換することが含まれる。ヌクレオチド置換の一般的な説明には、例えば、Ｆｏｒｄ他（１９９１）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．、２：９５〜１０７を参照されたい。非保存的置換、欠失および挿入は、Ｔｆ受容体に対する鉄の結合を示さないもしくは減少した結合を示す、および／または融合タンパク質の結合を示さないもしくは減少した結合を示す、本発明のＴｆ融合タンパク質、好ましくはトランス体を生成するために特に有用である。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質では、以下の慣用のリストに従ってアミノ酸を指定するために、以下のシステムに従う。
Figure 2010512160
鉄結合および／または受容体結合は、配列番号３のＴｆ Ｎドメイン残基Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９ならびに／またはＣドメイン残基Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／もしくはＨｉｓ５８５のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはその中への挿入を含めた突然変異によって、減少または混乱させ得る。鉄結合はまた、配列番号３のアミノ酸Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２への突然変異によっても影響を与え得る。炭酸結合は、配列番号３のＴｆ Ｎドメイン残基Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７ならびに／またはＣドメイン残基Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／もしくはＧｌｙ４５９のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはその中への挿入を含めた突然変異によって、減少または混乱させ得る。炭酸結合の減少または混乱は、鉄および／または受容体結合に有害な影響を与え得る。
Ｔｆ受容体の結合は、鉄結合について上述したＴｆ Ｎドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはその中への挿入を含めた突然変異によって、減少または混乱させ得る。
上述のように、グリコシル化は、Ｃドメイン残基Ｎ４１３および／またはＮ６１１に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位内のＴｆ Ｃドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはその中への挿入を含めた突然変異によって、減少または防止し得る。米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１をＧｌｕ残基に突然変異させてもよく、隣接アミノ酸であってもよい。一実施形態では、Ｓ４１５および／またはＴ６１３をＡｌａ残基に突然変異させる。
本発明のＴｆ融合タンパク質がグリコシル化、鉄結合、炭酸結合および／または受容体結合を防止するように改変されていない場合は、グリコシル化、鉄および／または炭酸イオンを融合タンパク質から剥ぎ取るまたは切断除去し得る。例えば、利用可能な脱グリコシラーゼを用いて、グリコシル化残基、特にＴｆ部分と結合している糖残基を融合タンパク質から切断してもよく、グリコシル化酵素を欠く酵母を用いて、グリコシル化を防止してもよく、かつ／または組換え細胞を、グリコシル化を防止する薬剤、例えばツニカマイシンの存在下で成長させてもよい。
融合タンパク質の炭水化物はまた、融合タンパク質を脱グリコシラーゼで処理することによって、酵素的に減少または完全に取り除いてもよい。脱グリコシラーゼは当分野で周知である。脱グリコシラーゼの例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅ Ａ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、およびＥｎｄｏ Ｈ脱グリコシラーゼが含まれる。
鉄結合およびＴｆ受容体の認識に必要な立体構造変化を防止するためにヒンジ領域を改変することなど、Ｔｆの三次元構造を変更するためにさらなる突然変異をＴｆに行い得る。例えば、突然変異を、Ｎドメインアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８ならびにＣドメインアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８の中または周辺に行い得る。さらに、Ｔｆの構造および機能を変更するために、これらの部位のフランキング領域の中または周辺に突然変異を行い得る。
本発明の一態様では、融合タンパク質は、リガンドの半減期または生体利用度を延長するため、および一部の例ではリガンドを細胞内に送達するために、担体タンパク質として機能することができ、血液脳関門を横断する能力を保持している。代替実施形態では、融合タンパク質には改変トランスフェリン分子が含まれ、トランスフェリンは、血液脳関門を横断する能力を保持していない。
別の実施形態では、融合タンパク質には改変トランスフェリン分子が含まれ、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体と結合して抗体可変領域を細胞内に輸送する能力を保持している。代替実施形態では、融合タンパク質には改変トランスフェリン分子が含まれ、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体と結合して抗体可変領域を細胞内に輸送する能力を保持していない。
さらなる実施形態では、融合タンパク質には改変トランスフェリン分子が含まれ、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体と結合して抗体可変領域を細胞内に輸送する能力を保持しているが、血液脳関門を横断する能力を保持していない。代替実施形態では、融合タンパク質には改変トランスフェリン分子が含まれ、トランスフェリン分子は、血液脳関門を横断する能力を保持しているが、トランスフェリン受容体と結合して抗体可変領域を細胞内に輸送する能力を保持していない。
トランスフェリン融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と結合したリガンド、抗体可変領域またはランダムペプチドを１つまたは複数コピー含有し得る。一実施形態では、リガンド部分は、Ｔｆタンパク質のＮ末端に結合している。一部の実施形態では、リガンド、可変領域またはペプチドは、Ｔｆタンパク質のＮおよびＣ末端の両方に結合しており、融合タンパク質は、これらの領域の１つまたは複数の均等物を、Ｔｆの片方または両方の末端に含有し得る。
他の実施形態では、１つまたは複数のリガンドは、Ｔｆのループの１つまたは複数内などの、トランスフェリンペプチド内に、例えばＴｆタンパク質の既知のドメイン内に挿入する。Ａｌｉ他（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３を参照されたい。
本発明の一実施形態では、リガンドをトランスフェリンのＮローブ内に挿入する。例えば、以下の表に示すように、本発明にはまた、１つまたは複数の挿入を、ＮローブのＮ１およびＮ２ドメイン内の他の位置またはその周辺で行うことができることも含まれる。
Figure 2010512160
さらに別の実施形態では、リガンドは、トランスフェリンタンパク質の表面露出アミノ酸残基でランダム化されたアミノ酸残基を含む。ランダム化されたアミノ酸残基は、表面露出アミノ酸の一領域内または表面露出アミノ酸の複数の領域内に位置することができる。例えば、ランダム化されたアミノ酸は、配列番号３のアミノ酸残基約８５〜アミノ酸残基約９２、アミノ酸残基約２７６〜アミノ酸残基約２９８、またはアミノ酸残基約２０７〜アミノ酸残基約２１７からなる領域のうちの１つまたは複数内に含有されることができる。本発明の一実施形態では、ランダム化されたアミノ酸残基は、配列番号３の位置Ｙ８５、Ｇ８６、Ｓ８７、Ｅ８９、Ｄ９０およびＱ９２に位置する。別の実施形態では、ランダム化されたアミノ酸残基は、配列番号３の位置Ｋ２７６、Ｄ２７７、Ｋ２８０、Ｑ２８３、Ｓ２８６およびＤ２９７に位置し、Ｓ２９８に位置していてもよい。さらに別の実施形態では、ランダム化されたアミノ酸残基は、配列番号３の位置Ｈ２０７、Ｓ２０８、Ｆ２１１、Ｅ２１２およびＡ２１５に位置し、Ｎ２１６および／またはＫ２１７に位置していてもよい。
一領域あたりのランダム化されたアミノ酸残基の数は変動することができるが、好ましくは、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９または少なくとも約１０個以上のアミノ酸残基が一領域あたりランダム化されている。
本発明の一実施形態では、リガンド部分は、それだけには限定されないが、α４インテグリン（例えば、ａ４ｂ１およびａ４ｂ７）を含めた、インテグリンと結合することができるリガンド配列などの既知のリガンド結合配列を含有する。そのようなリガンドには、それだけには限定されないが、ＶＣＡＭおよびＭａｄＣＡＭが含まれる。その全体がすべての目的のために本明細書中に組み込まれているＪａｃｋｓｏｎ、２００２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ．＊：１２２９〜１２５３を参照されたい。
組織損傷および疾患をもたらす炎症プロセスが、白血球細胞表面上に発現される、α４インテグリンであるａ４ｂ１およびａ４ｂ７によって部分的に媒介されている。これらの糖タンパク質受容体は、患部組織中で発現される、その主なリガンドである血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）および粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）との相互作用を介して、細胞接着を変調する。結合の際、一緒になったインテグリン／ＣＡＭの細胞表面での相互作用により、白血球が血管壁に堅く接着し、次いで患部組織内に侵入することがもたらされる。様々な器官内における上昇した細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現は、いくつかの自己免疫疾患と関連づけられている。本発明の一実施形態では、α４インテグリンまたはそのＣＡＭリガンドと結合することができる１つまたは複数のペプチドを含有するトランス体（すなわち、トランスフェリンおよびリガンドを含む融合タンパク質）を、炎症を治療および／または媒介するために、対象に投与することができる。本発明の一実施形態では、α−４インテグリンまたはそのＣＡＭリガンドと結合することができる１つまたは複数のペプチドを含有するトランス体を、自己免疫疾患を治療するために対象に投与することができる。
本発明の別の実施形態では、リガンド部分は、既知のリガンド結合配列およびランダム化されたアミノ酸残基を、リガンド結合配列内またはリガンド結合配列の片側もしくは両側のいずれかに含む。例えば、本発明には、ランダム化されたアミノ酸残基によって取り囲まれたインテグリン結合配列ＲＧＤを含有するトランスフェリン融合タンパク質が含まれる。そのような融合タンパク質は、トランスフェリン部分内、例えば、配列番号３のアミノ酸２８９および２９０の間に挿入することができる。本発明の一実施形態では、インテグリン結合配列およびランダム化されたペプチドのリガンド部分はＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣであり、Ｘはランダム化されたアミノ酸残基である。本発明の別の実施形態では、インテグリン結合配列およびランダム化されたペプチドのリガンド部分はＸＸＸＲＧＤＸＸＸである。本発明にはまた、それだけには限定されないが、ランダム化されたペプチドによって取り囲まれたインテグリン結合配列ＫＧＤおよびランダム化されたペプチドによって取り囲まれたインテグリン結合配列ＬＤＶも含まれる。
本発明の別の実施形態では、リガンド部分は抗体可変領域である。本実施形態では、一般に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、１つの改変トランスフェリン由来の領域および１つの抗体可変領域を有し得る。しかし、複数の抗体可変領域を用いて本発明のトランスフェリン融合タンパク質を生成し、それにより多機能の改変Ｔｆ融合タンパク質を生成し得る。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子またはその一部分と融合した抗体可変領域またはその一部分を含有する。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＮ末端と融合した抗体可変領域を含有する。代替実施形態では、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＣ末端と融合した抗体可変領域を含有する。さらなる実施形態では、本発明の融合タンパク質は、抗体可変領域のＮ末端と融合したトランスフェリン分子を含有する。代替実施形態では、本発明の融合タンパク質は、抗体可変領域のＣ末端と融合したトランスフェリン分子を含有する。
本発明はまた、改変トランスフェリン分子またはその一部分と融合した抗体可変領域またはその一部分を含有する融合タンパク質も提供する。
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、改変トランスフェリンのＮ末端およびＣ末端の両方と融合した抗体可変領域を含有する。別の実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合した抗体可変領域は、同じ抗原と結合する。また、同じ抗原と結合する抗体可変領域は異なる抗体に由来していてもよく、したがって、同じ標的上の異なるエピトープと結合する。代替実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合した抗体可変領域は、異なる抗原と結合する。別の代替実施形態では、ＮおよびＣ末端と融合した抗体可変領域は、異なる抗原と結合し、これは、疾患、障害、または状態を治療または予防するために２つの異なる細胞を活性化させるために有用であり得る。別の実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合した抗体可変領域は、異なる抗原と結合し、これは、一般的に患者内で同時に起こることが当分野で知られている疾患または障害を治療または予防するために２つの異なる抗原を架橋するために、有用であり得る。
さらに、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、目的の抗体可変領域、例えば治療タンパク質またはその断片もしくは変異体と結合する単鎖抗体を、改変トランスフェリンの内部領域内に挿入することによっても生成し得る。改変トランスフェリンの内部領域には、それだけには限定されないが、ループ領域、鉄結合部位、ヒンジ領域、炭酸水素結合部位または受容体結合ドメインが含まれる。
改変トランスフェリン分子のタンパク質配列内にはいくつかのループまたはターンが存在し、これらはジスルフィド結合によって安定化されている。これらのループは、特異的生物活性を有する改変トランスフェリン分子を作製するための、治療上の活性があるペプチド、好ましくは抗体可変領域、特に機能的となるために二次構造を要するもの、または治療タンパク質、好ましくは抗体可変領域の挿入、または内部融合に有用である。
抗体可変領域、好ましくはＣＤＲなどのリガンドが、Ｔｆ分子の少なくとも１つのループ内に挿入されたまたはそれを置き換えた場合、挿入は、表面露出ループ領域のうちの任意のものの内部およびＴｆの他の領域に行い得る。例えば、挿入は、Ｔｆのアミノ酸３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０および２８８〜２８９を含むループ内に行い得る。Ａｌｉ他、上記を参照されたい。上述のように、挿入はまた、以下にさらに詳述するように、鉄および炭酸水素の結合の部位、ヒンジ領域、ならびに受容体結合ドメインなどのＴｆの他の領域内にも行い得る。タンパク質またはペプチドの挿入に関して改変／置き換えを受け入れられるＴｆタンパク質配列中のループも、ランダムペプチド挿入物のスクリーニング可能なライブラリーの開発に使用し得る。利用可能なファージおよび細菌ディスプレイシステムを含めたペプチドライブラリーを作製するために、Ｔｆドメイン内にクローニングおよび／またはＴｆの末端と融合させる前に、任意の手順を用いて核酸挿入物を生成し得る。
ＴｆのＮ末端は遊離しており、融合タンパク質の本体から離れる方に向いている。トランスフェリンのＮ末端とのリガンドまたは複数のリガンドの融合は、本発明の一実施形態である。そのような融合には、それだけには限定されないが、リガンドとＴｆを隔てるためのポリグリシンストレッチまたはＰＥＡＰＴＤリンカー（配列番号１８）などのリンカー領域が含まれ得る。
ＴｆのＣ末端は、埋まっているまたは部分的に埋まっており、Ｃ末端から６番目のアミノ酸でジスルフィド結合によって固定され得ると考えられる。ヒトＴｆでは、Ｃ末端アミノ酸はプロリンであり、これは、その方向付けに応じて、融合タンパク質を分子の本体から離れる方にまたはその内部に向くようにする。本発明の一部の実施形態では、Ｃ末端のリンカーまたはスペーサー部分を使用し得る。また、Ｎ末端付近にはプロリンも存在する。本発明の一態様では、Ｎ末端および／またはＣ末端のプロリンは別のアミノ酸で修飾または置換されていてもよい。本発明の別の態様では、Ｃ末端の係留を解くためにＣ末端ジスルフィド結合を排除し得る。
ストーク部分
本発明のストーク部分は、そのＮ末端でトランスフェリン部分またはリガンドと融合しており、そのＣ末端でアンカー部分と融合していてもよい。酵母細胞中で発現させた場合、ストーク部分のＣ末端は、細胞内、例えば細胞壁内に位置する。本発明の一実施形態では、ストーク部分は、融合タンパク質を酵母細胞の細胞壁と共有結合または非共有結合させる細胞壁連結メンバーとして作用する。
本発明のストーク部分は、竿様またはブラシ様の立体構造を有する。この種の立体構造は、中程度から高度にグリコシル化されたペプチドに典型的である。本発明のストーク部分は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンを含有する。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，１１４，１４７号を参照されたい。Ｏ−グリカンにより、Ｎ−グリカンと比較して、ストーク部分が伸長した竿様の立体構造を取りやすくなるので、Ｏ−グリカンの存在はＮ−グリカンよりも好ましい。ストーク部分はまた、セリンおよびスレオニングリコシル化部位の中程度から高度なグリコシル化も含有し得る。
本発明の融合タンパク質のストーク部分は、中程度から高い割合のセリンまたはスレオニン残基を含有する。例えば、本発明には、少なくとも約５％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約１０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約２０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約３０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約４０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約５０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約６０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約７０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約８０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、または少なくとも約９０％以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基を有するストーク部分が含まれる。本発明の一実施形態では、ストーク部分は、約２０〜３０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜４０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約３０〜４０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜５０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約３０〜５０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜６０のセリンおよび／もしくはスレオニン残基または約３０〜６０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基を含有する。
ストーク部分は、少なくとも約５重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約１０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約２０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約３０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約４０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約５０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約６０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約７０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約８０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、または少なくとも約９０重量％以上のＮ−もしくはＯ−グリカンを含有し得る。本発明の一実施形態では、ストーク部分は、約２０〜３０重量％のＯ−グリカン、約２０〜４０重量％のＯ−グリカン、約３０〜４０重量％のＯ−グリカン、約２０〜５０重量％のＯ−グリカン、約３０〜５０重量％のＯ−グリカン、約２０〜６０重量％のＯ−グリカンまたは約３０〜６０％のＯ−グリカンを含有する。別の実施形態では、グリカン、特にＯ−グリカンの存在により、ストーク部分が細胞壁のタンパク質中に存在するβグルカンと架橋結合することが可能となる。したがって、本発明のストーク部分は、細胞壁連結メンバーとして機能することができる。
ストーク部分は、ムチンタンパク質またはムチンタンパク質の一部分、すなわち、ＭＵＣ型タンパク質のメンバーを含むことができる。ＭＵＣ型ムチンとは、高度にグリコシル化されており、気道、胃腸管、および生殖器系の上皮中で発現される、構造的に関連する分子のファミリーであり、例えば、ＭＵＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１２５５２５）、ＭＵＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２１９９８）、ＭＵＣ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１３６１６）、ＭＵＣ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０００２８１）、ＭＵＣ５ＡＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３１３９）、ＭＵＣ５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１４０２）、ＭＵＣ６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９７６９８）、ＭＵＣ７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１３２８３）、ＭＵＣ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１４３８３）、ＭＵＣ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ２７１４３０）がある。本発明の一実施形態では、ストーク部分は、ｈＭＵＣ１またはｈＭＵＣ１タンパク質の一部分、例えば、配列番号７０の核酸によってコードされている配列番号７１および配列番号５の核酸によってコードされているポリペプチドを含有する。本発明の別の実施形態では、ストーク部分は、ｈＭＵＣ３またはｈＭＵＣ３タンパク質の一部分を含有する。例えば、本発明には、配列番号６８の核酸によってコードされている、配列番号６９のｈＭＵＣ３のストークが含まれる。
本発明の融合タンパク質にはまた、ムチンタンパク質、ムチン様タンパク質およびその一部分の類似体および誘導体などの変異体を含むストークも含まれる。変異体は、細胞の表面上でのタンパク質のディスプレイを最適化するために作製し得る。変異体は、当分野で知られている方法によって作製することができる。例えば、変異体は、反復アミノ酸残基を除去することならびに／またはペプチドをランダム突然変異誘発および選択に供することによって遺伝子操作することができる。
本発明のストーク部分はまた、それだけには限定されないが、ＡＧＡ１（例えば配列番号７２の核酸配列によってコードされている配列番号７３）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、もしくはＬ−セレクチン由来のコンセンサス反復、またはウイルス糖タンパク質スパイク（インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒト免疫不全、もしくはタバコモザイクウイルスなど）ならびにその変異体および断片を含めた、ムチン以外のグリコシル化されたタンパク質から誘導することもできる。すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、国際公開公報ＷＯ０１／４６６９８、Ｇｉｒａｒｄ他（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２：１１３〜１２３、およびＶａｎ Ｋｉｎｋｅｎ他（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６５：１０３〜１１６を参照されたい。本発明には、２つ以上のグリコシル化されたタンパク質の反復またはその断片、および２つ以上の種類のグリコシル化されたタンパク質の組合せが含まれる。
本発明の別の実施形態では、ストークは、１つまたは複数の遊離システイン残基を含有するように遺伝子操作されている。１つまたは複数の遊離システイン残基は、酵母細胞の細胞壁中のタンパク質の遊離システイン残基とジスルフィド結合を形成することができる。細胞壁内での１つまたは複数のジスルフィド結合の形成は、細胞壁結合メンバーとして機能することができるストーク部分を遺伝子操作して設計するために使用することができる別の方法を表す。
本発明の融合タンパク質を酵母細胞中で発現させる場合、ストーク部分は、酵母細胞の細胞壁全体にわたるように十分な長さであることが好ましい。好ましくは、ストーク部分のＮ末端は細胞壁の外側に位置し、最も好ましくは、トランスフェリン部分およびリガンドと宿主酵母細胞との間の立体障害を減少させるために、酵母細胞から離れるように竿様の立体配置で伸長している。ストーク部分は、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約７５個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１２５個のアミノ酸、少なくとも約１５０個のアミノ酸、少なくとも約１７５個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２２５個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸、少なくとも約２７５個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３２５個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約３７５個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約４２５個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約４７５個のアミノ酸の長さ、少なくとも約５００個のアミノ酸の長さ、少なくとも約５２５個のアミノ酸の長さ、少なくとも約５５０個のアミノ酸の長さ、少なくとも約５７５個のアミノ酸の長さ、少なくとも約６００個のアミノ酸の長さ、少なくとも約６２５個のアミノ酸の長さ、または少なくとも約６５０個のアミノ酸の長さであるべきである。一実施形態では、ストーク部分は約５００個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、ストーク部分は約３００〜６００個のアミノ酸の長さである。
アンカー部分
本発明の融合タンパク質のアンカー部分は、融合タンパク質を宿主細胞表面または基質表面に物理的に係留させる融合タンパク質の一部分である。本発明の一実施形態では、アンカー部分は、融合タンパク質を、それだけには限定されないが哺乳動物細胞膜などの細胞膜に係留させる。本発明の別の実施形態では、アンカー部分は、融合タンパク質を、それだけには限定されないが酵母細胞壁などの細胞壁に係留または固定することができる。アンカーが融合タンパク質を細胞壁に係留させる場合、これは細胞壁連結メンバーである。
アンカー部分は、融合タンパク質を細胞壁または細胞膜に一過的に係留させることができる。本発明の一実施形態では、アンカー部分は、融合タンパク質を細胞壁または細胞膜に一過的に係留させ、これにより、ストーク部分が細胞壁と共有結合または非共有結合する機会が提供される。例えば、細胞中のアンカーの一過性の係留は、ストーク部分由来のＯ−グリカンが細胞壁のβグルカンと架橋結合することを可能にし得る。
本発明の一実施形態では、アンカー部分は、微生物、例えば酵母およびカビなどの下等真核生物、ならびに哺乳動物細胞系などの哺乳動物細胞の細胞膜または壁内に付着する。アンカー部分は、プロリンなどのアミノ酸を用いて細胞膜または細胞壁中にアンカーする、長いＣ末端を有し得る（Ｋｏｋ（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、８７：１５〜４２）。
アンカー部分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを使用することによって細胞にアンカーされることができる。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ他、ＥＭＢＯ、９：６５３〜６６１ならびにＬｉｐｋｅおよびＯｖａｌｌｅ（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０：３７３５〜３７４０を参照されたい。本明細書中に開示するＧＰＩシグナルペプチドなどのＧＰＩシグナル配列ペプチドは、ＧＰＩと融合タンパク質のＣ末端との結合をシグナルする。ＧＰＩシグナル自体は３つのドメイン、すなわち、ＧＰＩ結合部位（ω部位）＋ω部位の下流の第１および第２のアミノ酸を含有する領域、５〜１０個のアミノ酸のスペーサー、ならびに１０〜１５個のアミノ酸の疎水性ストレッチを有する。ＧＰＩシグナルを含有するタンパク質はω部位で切断され、その結果生じるタンパク質のカルボキシ末端がＧＰＩ部分と共有結合する。この反応は小胞体内で起こる。ＧＰＩ部分によって膜と会合した後、ＧＰＩと結合したタンパク質は、その後、細胞表面に輸送され、タンパク質が短いωマイナス領域中に塩基性残基（Ｒおよび／またはＫ）を含有する場合は、ＧＰＩにアンカーされたタンパク質として形質膜上に留まる。ω−４／−５部位でＶ、Ｉ、またはＬを有し、ω−２部位でＹまたはＮを有するＧＰＩと会合したタンパク質は、細胞膜内に取り込まれる。Ｈａｍａｄａ他（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：３８８６〜３８８９；Ｎｕｏｆｆｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１０５５８〜１０５６３；Ｄｅ Ｎｏｂｅｌ他（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：４２〜４５．；Ｈａｍａｄａ他（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２５８：５３〜５９；およびＶａｎ Ｄｅｒ Ｖａａｒｔ他（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１５：３８７〜４１１を参照されたい。
本発明の一実施形態では、酵母ＧＰＩ ＹＩＲ０１９Ｃを用いてトランスフェリン融合タンパク質のアンカー部分を提供する。図２にＧＰＩ ＹＩＲ０１９Ｃの図を提供する。アミノ酸配列中のω部位（配列番号１５）はグリシンであり、その片側に空間を有するように例示されている。空間はω部位の片側のスペーサー領域の指標である。太字のＩおよびＹアミノ酸は、それぞれω−５／−４および−２部位である。
いくつかのサッカロマイセスアンカー部分が当分野で知られており、これを用いて本発明の融合タンパク質を構築することができる。酵母ＧＰＩシグナルタンパク質の他の例には、それだけには限定されないが、ＹＤＲ５３４Ｃ、ＹＮＬ３２７Ｗ、ＹＯＲ２１４Ｃ、ＹＤＲ１３４Ｃ、ＹＰＬ１３０、ＹＯＲ００９Ｗ、ＹＥＲ１５０Ｗ、ＹＤＲ０７７Ｗ、ＹＯＲ３８３Ｃ、ＹＪＲ１５１Ｃ、ＹＪＲ００４、ＹＪＬ０７８Ｃ、ＹＬＲ１１０Ｃ、およびＹＮＬ３００Ｗが含まれる。さらに、ＧＰＩシグナルタンパク質は、カニジダ・グラブラタのＥＰＡ１、カンジダ・アルビカンスのＨｗｐ１ｐ、またはトリパノソーマ・ブルセイのＶＳＧのＧＰＩなどの他の生物から使用することができる。
本発明の一実施形態では、アンカー部分は、哺乳動物部分またはその誘導体もしくは断片である。本発明の別の実施形態では、ＧＰＩシグナルペプチドは、哺乳動物ＧＰＩシグナルタンパク質である。例えば、本発明には、表１に開示されているものなどの、ヒトＭＤＰ ＧＰＩシグナルタンパク質の誘導体が含まれる（実施例５参照）。
本発明にはまた、１つまたは複数の未結合のシステイン残基を有するアンカー部分を含む融合タンパク質も含まれる。システイン残基は、細胞壁中のタンパク質のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することによって、融合タンパク質を細胞に係留させるように作用することができる。
本発明には、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）をアンカー部分として含む融合タンパク質が含まれる。本発明の一実施形態では、ＴＭＤは、１回貫通のＩ型またはＩＩ型の膜タンパク質の領域である。例えば、本発明には、それだけには限定されないが、ＦＵＳ１の残基７０〜９８が含まれる。
本発明の別の実施形態では、ＴＭＤは、マルチスパン膜タンパク質のいくつかの膜貫通領域のうちの１つまたは複数を含む。本発明の一実施形態では、ＴＭＤは、約１０〜６０個のアミノ酸、約１５〜６０個のアミノ酸、約２０〜６０個のアミノ酸、約３０〜６０個のアミノ酸または約２５〜５０個のアミノ酸を含むマルチスパン膜タンパク質の疎水性領域である。例えば、本発明には、それだけには限定されないが、残基２５〜３０、７３〜１００、１７１〜１９８、２４９〜２７７、７１４〜７４２、７６１〜７８９、８３８〜８５８、８６４〜８８４、９４０〜９６７および９７９〜１０００（サッカロマイセスゲノムデータベースのアノテーション）からなる群からのサッカロマイセスのＳＴＥ６由来の、１つまたは複数のＴＭＤが含まれる。
別の実施形態では、アンカー部分を用いて、トランスフェリン融合タンパク質をマイクロアレイなどの固体形基質に係留させる。アンカー部分は、好ましくは、ポリヒスチジン、ＳＥＡＰ、またはＭ１およびＭ２フラグなどの、短いエピトープタグ（すなわち、抗体、典型的にはモノクローナル抗体によって認識される配列）である。すべてその全体が参考として組み込まれている、Ｂｕｓｈ他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１３８１１〜１３８１４、Ｂｅｒｇｅｒ他（１９８８）Ｇｅｎｅ、６６：１〜１０、米国特許第５，０１１，９１２号、米国特許第４，８５１，３４１号、米国特許第４，７０３，００４号、および米国特許第４，７８２，１３７号を参照されたい。一実施形態では、ストークドメインは、抗ムチン抗体などの抗ストーク配列抗体によって基質に係留している。
アルブミン
本発明にはまた、リガンドを標的に「提示」するためにトランスフェリン以外のタンパク質またはタンパク質断片を用いる融合タンパク質も含まれる。適切なタンパク質は、可溶性かつ少なくとも約５０個のアミノ酸以上の長さのものである。本発明の一実施形態では、タンパク質またはタンパク質断片は、トランスフェリンと類似の二次構造を含有する。
タンパク質またはその断片が、融合タンパク質のストーク部分から切断し、治療剤として使用した場合に、リガンドの半減期を増加させることができることが好ましい。例えば、本発明は、アルブミン部分、ストーク部分および細胞壁連結メンバーを含有する融合タンパク質の使用を想定している。本発明はまた、アルブミン部分およびアンカー部分を含有する融合タンパク質の使用も想定している。アルブミン部分は、融合タンパク質のアルブミンおよびリガンド部分を融合タンパク質の残りの部分から切断し、リガンドを治療剤として必要としている患者に投与した場合に、リガンド、すなわち治療剤に血清半減期の増加を与えることができる。
アルブミン部分を含有する融合タンパク質は、アルブミンタンパク質、アルブミン変異体またはその断片を含有し得る。一実施形態では、アルブミンタンパク質は、配列番号６６の核酸配列によってコードされている配列番号６７のアミノ酸配列を含む。本発明には、当分野で知られているアルブミンの改変が含まれる。
核酸
核酸分子も本発明によって提供する。これらは、リガンド部分と共有結合または連結したトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部分を含む改変Ｔｆ融合タンパク質をコードしている。融合タンパク質はさらに、リンカー領域、例えば、約５０、４０、３０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基リンカーをさらに含み得る。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部分とリガンド部分の間で共有結合していることができる。本発明の核酸分子は精製してもしていなくてもよい。
核酸分子を複製し、コードされている融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターも提供する。原核であれ真核であれ、任意のベクターまたは宿主細胞を使用し得るが、真核発現系、特に酵母発現系および哺乳動物発現系が好ましい場合がある。多くのベクターおよび宿主細胞が、そのような目的のために当分野で知られている。所望の用途のために適切な組を選択することは、十分に当分野の技術範囲内にある。
目的のトランスフェリン、トランスフェリンの一部分および治療タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を、当分野で知られている様々なゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングし得る。プローブに基づいた方法を用いてそのようなＤＮＡ配列を単離する技術は慣用技術であり、当業者に周知である。そのようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開されているＤＮＡまたはタンパク質配列に基づき得る（例えば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）様々な種由来のトランスフェリン配列の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ）、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６Ｂ／１：２０３〜２１８およびその中で引用されるすべての参考文献を参照）。あるいは、本明細書中に参考として組み込まれている、Ｍｕｌｌｉｓ他（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）に開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を使用し得る。そのようなＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は、当分野の通常の技術レベルの範囲内にある。
当分野で知られている、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の「類似度」は、一方のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列およびその保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸置換体を、第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定する。また、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合を意味する「同一性」も、当分野で知られており、これは、２本のそのような配列間の一致の同一性によって決定する。同一性および類似度はどちらも容易に計算することができる（計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；配列データのコンピュータ分析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ）、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびに配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
２つのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列間の同一性および類似度を測定するいくつかの方法が存在し、用語「同一性」および「類似度」は当業者に周知である（分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）。２つの配列間の同一性または類似度を決定するために一般的に用いられる方法には、それだけには限定されないが、巨大コンピュータの手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが含まれる。
同一性を決定する好ましい方法は、試験する２つの配列間の最大一致を与えるように設計されている。同一性および類似度を決定するための方法は、コンピュータプログラムにコードされている。２つの配列間の同一性および類似度を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、それだけには限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０））が含まれる。上述の類似度または同一性の度合は、２つの配列間の同一性の度合として決定し、これはしばしば、第１の配列の第２の配列からの派生を示す。２つの核酸配列間の同一性の度合は、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰなどの、当分野で知られているコンピュータプログラムの手段によって決定し得る（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３（１９７０））。本発明のために２つの核酸配列間の同一性の度合を決定する目的では、ＧＡＰを以下の設定で使用する：ＧＡＰ作成ペナルティ５．０およびＧＡＰ伸長ペナルティ０．３。
コドンの最適化
遺伝暗号の縮重は、ネイティブＤＮＡ配列によってコードされているポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生しつつ、目的のトランスフェリンタンパク質および／または治療タンパク質のヌクレオチド配列の可変性を可能にする。「コドンの最適化」として知られるこの手順は（その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，５４７，８７１号に記載）、そのような変更されたＤＮＡ配列を設計する手段を提供する。コドンが最適化された遺伝子の設計は、その遺伝子の生物中のコドン使用頻度、最近傍頻度、ＲＮＡ安定性、二次構造形成の潜在性、合成経路および意図する将来のＤＮＡ操作を含めた、様々な要素を考慮すべきである。具体的には、利用可能な方法を用いて、所定の融合タンパク質コードしているコドンを、酵母発現系を用いた場合に酵母によって最も容易に認識されるものに変更し得る。
遺伝暗号の縮重は、同一のアミノ酸配列が様々な異なる様式でコードおよび翻訳されることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは、それぞれ６つの異なるコドンによってコードされており、バリン、プロリン、スレオニン、アラニンおよびグリシンは、それぞれ４つの異なるコドンによってコードされている。しかし、そのような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物間でゲノムごとに異なる。例えば、哺乳動物間の同義コドンの選択パターンは非常に類似している一方で、酵母（出芽酵母）、細菌（大腸菌等）および昆虫（キイロショウジョウバエ等）などの進化的に遠い生物は、明白に異なるゲノムコドン使用頻度のパターンを示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、８、４９〜６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、９、４３〜７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９補遺、１９８１〜１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１））。これらのコドン選択パターンの差異は、ペプチド伸長率を変調することによって、個々の遺伝子の全体的な発現レベルに寄与していると考えられている。（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、３、２８９５〜２８９８（１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．、およびＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９（１９８１））。
合成遺伝子のコドン使用頻度は、組換えタンパク質の発現に使用することを意図する細胞／生物、特に酵母種の正確な（または可能な限り密に関連している）ゲノムに由来する核遺伝子のコドン使用頻度を反映すべきである。上述のように、一実施形態では、酵母発現のために本明細書中に記載したように改変する前または後に、ヒトＴｆ配列のコドンを最適化し、治療タンパク質ヌクレオチド配列（複数可）もそうである。
ベクター
本発明で使用するための発現ユニットは、一般に、５’から３’の方向で作動可能に連結している、以下の要素を含む：転写プロモーター、分泌シグナル配列、目的の治療タンパク質またはペプチドをコードしているＤＮＡ配列と連結したトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部分を含む改変Ｔｆ融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、および転写ターミネーター。上述のように、Ｔｆ部分と融合したまたはその中にある治療タンパク質またはペプチドの任意の配置を、本発明のベクターで使用し得る。適切なプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選択は、選択した宿主細胞によって決定され、当業者には明らかであり、以下にさらに詳述する。
本発明で使用するための適切な酵母ベクターは米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１０３５〜１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ他、Ｇｅｎｅ、８：１２１〜１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：１０４〜１０８、１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４ならびにその誘導体が含まれる。有用な酵母プラスミドベクターにはまた、ｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ、９２０３７から入手可能なピキアベクターも含まれる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
そのようなベクターには、一般に、形質転換体の選択を可能にするために表現型アッセイが存在する、優性の表現型を示す多数の遺伝子のうちの１つであり得る選択マーカーが含まれる。好ましい選択マーカーは、宿主細胞栄養要求性を補完する、抗生物質耐性を与える、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするものであり、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ他、同書）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎｅ、８：１７、１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ他、同書）またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、欧州特許第１７１，１４２号）が含まれる。他の適切な選択マーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子が含まれる。酵母で使用するための好ましいプロモーターには、酵母解糖遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２５：１２０７３〜１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：４１９〜４３４、１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）またはアルコール脱水素酵素遺伝子（Ｙｏｕｎｇ他、化学物質のための微生物の遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ他（編）、ページ３５５、ニューヨーク州Ｐｌｅｎｕｍ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０１：１９２〜２０１、１９８３）由来のプロモーターが含まれる。この観点から、使用できるプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６，２９１，２１２号参照プロモーターである（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０４：６５２〜６５４、１９８３号）。発現ユニットにはまた、転写ターミネーターも含まれ得る。１つの転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーターである（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、同書）。
酵母に加えて、本発明の改変融合タンパク質は、糸状菌、例えば真菌アスペルギルスの株中でも発現させることができる。有用なプロモーターの例には、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：２０９３〜２０９９、１９８５）およびｔｐｉＡプロモーターなどの、アスペルギルス・ニデュランスの解糖遺伝子に由来するものが含まれる。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、同書）。そのような構成要素を利用する発現ユニットを、例えばアスペルギルスの染色体ＤＮＡ内に挿入されることができるベクター内にクローニングし得る。
本発明の実施において使用するための哺乳動物発現ベクターには、改変Ｔｆ融合タンパク質の転写を指示することができるプロモーターが含まれる。プロモーターには、それだけには限定されないが、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが含まれる。例えば、ウイルスプロモーターには、アデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２：１３０４〜１３１９９、１９８２）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１：８５４〜８６４、１９８１）が含まれる。細胞プロモーターには、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２：８０９〜８１４、１９８３）およびマウスＶ６（米国特許第６，２９１，２１２号参照）プロモーター（Ｇｒａｎｔ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：５４９６、１９８７）が含まれる。１つのそのようなプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号参照）プロモーターである（Ｌｏｈ他、同書）。そのような発現ベクターはまた、プロモーターの下流かつトランスフェリン融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の上流に位置する一組のＲＮＡスプライシング部位も含有し得る。ＲＮＡスプライシング部位は、例えば、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。
発現ベクター中にはまた、目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含有される。ポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域由来のポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、９：３７１９〜３７３０、１９８１）が含まれる。１つのそのようなポリアデニル化シグナルは、ＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号参照）遺伝子ターミネーターである（Ｌｏｈ他、同書）。発現ベクターには、プロモーターとＲＮＡスプライシング部位との間に位置するアデノウイルス２トリパータイトリーダーなどの、非コードウイルスリーダー配列が含まれ得る。好ましいベクターにはまた、ＳＶ４０エンハンサーおよびマウス（米国特許第６，２９１，２１２号参照）エンハンサーなどのエンハンサー配列も含まれ得る（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ、３３：７１７〜７２８、１９８３）。発現ベクターにはまた、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードしている配列も含まれ得る。
形質転換
真菌を形質転換させる技術は文献で周知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９〜１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１７４０〜１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ、３０１：１６７〜１６９、１９８３）に記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝的欠陥を含有する。具体的な宿主および選択マーカーの選択は、当分野の通常の技術レベルの範囲内にある。
本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を含むクローニングしたＤＮＡ配列を、例えばリン酸カルシウム媒介の形質移入によって、培養した哺乳動物細胞内に導入し得る（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ、１４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、１９７３）。クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞内に導入するための他の技術、例えば、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１〜８４５、１９８２）、またはリポフェクションも使用し得る。クローニングしたＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するために、一般に選択マーカーを目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞内に導入する。培養した哺乳動物細胞で使用するための好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。１つの増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。１つの増幅可能なマーカーはＤＨＦＲｒ（米国特許第６，２９１，２１２号参照）ｃＤＮＡである（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２４９５〜２４９９、１９８３）。選択マーカーはＴｈｉｌｌｙ（哺乳動物細胞技術（Ｍａｍｍａｌｉｃａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、マサチューセッツ州Ｓｔｏｎｅｈａｍ）によって総説されており、選択マーカーの選択は、十分に当分野の通常の技術レベルの範囲内にある。
宿主細胞
本発明にはまた、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質を発現するように形質転換させた細胞、例えば酵母細胞または哺乳動物細胞も含まれる。形質転換させた宿主細胞自体に加えて、本発明にはまた、これらの細胞の培養物、例えば、モノクローナル（クローン的に均質な）培養物、または栄養素培地中のモノクローナル培養物に由来する培養物も含まれる。ポリペプチドが分泌される場合、培地は細胞と共に、または細胞を濾過もしくは遠心分離して取り除いた場合は細胞なしで、ポリペプチドを含有する。
本発明の実施において使用するための宿主細胞には、哺乳動物、昆虫、真菌、植物および細菌の培養細胞などの、外因性ＤＮＡで形質転換または形質移入することができ、かつ培養中で成長することができる真核細胞、および一部の事例では原核細胞が含まれる。
酵母の種（例えば、サッカロマイセスｓｐｐ．、シゾサッカロマイセスｓｐｐ．、ピキアｓｐｐ．）を含めた真菌細胞を、本発明で宿主細胞として使用し得る。本発明の実施において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を発現させるための宿主として有用であることが企図される酵母の例示的な属は、ピキア（以前はハンゼヌラとして分類されていた種を含む）、サッカロマイセス、クルイベロマイセス、アスペルギルス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、シゾサッカロマイセス、シテロマイセス、パキソレン、ザイゴサッカロマイセス、デバロマイセス、トリコデルマ、セファロスポリウム、フミコラ、ケカビ、ニューロスポラ、ヤロウイア、メツニコビア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスカス、スポリジオボラス、エンドマイコプシスなどである。サッカロマイセスｓｐｐ．の例は、出芽酵母、エス・イタリクスおよびエス・ルーキシである。クルイベロマイセスｓｐｐ．の例はケー・ラクチスおよびケー・マルキシアヌスである。適切な種はティー・デルブリュッキである。ピキア（ハンゼヌラ）ｓｐｐ．の例は、ピー・アングスタ（以前はエイチ・ポリモルファ）、ピー・アノマラ（以前はエイチ・アノマラ）およびピー・パストリスである。
本発明のＴｆ融合タンパク質を産生するために特に有用な宿主細胞は、メタノール栄養性ピキア・パストリスである（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ他（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ．、６：６１９〜６２４）。ピキア・パストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローニングされて以来、外来タンパク質を産生させるための極めて優れた宿主となるように開発されている。その形質転換は、１９８５年に最初に報告されている。ピー・パストリスは、グルコースが存在しない場合にメタノールを炭素源として利用することができる。ピー・パストリス発現系は、メタノールの代謝の最初のステップを触媒する酵素であるアルコールオキシダーゼの発現をコードしている遺伝子を調節する、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは特徴づけられ、一連のピー・パストリス発現ベクター内に取り込まれている。ピー・パストリス内で産生されるタンパク質は、通常は正しく折り畳まれて培地中に分泌されるので、遺伝子操作したピー・パストリスの発酵は、大腸菌発現系の優れた代替系を提供する。破傷風毒素断片、ボルダテラ百日咳ペルタクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームを含めたいくつかのタンパク質が、この系を用いて産生されている。
エフ・オキシスポラムの形質転換は、例えば、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ他（１９８９）Ｇｅｎｅ、７８：１４７〜１５６に記載のように実施し得る。
酵母の出芽酵母の株が別の好ましい宿主である。一実施形態では、糖タンパク質のアスパラギン結合のグリコシル化に必要な遺伝子の遺伝子欠損を含有する酵母細胞、より具体的には出芽酵母の宿主細胞を使用する。そのような欠損を有する出芽酵母の宿主細胞は、突然変異および選択の標準技術を用いて調製し得るが、グリコシル化または過マンノシル化を防止または減少するために、利用可能な酵母株が改変されている。Ｂａｌｌｏｕ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：５９８６〜５９９１、１９８０）は、アスパラギン結合のグリコシル化に影響を与える遺伝子が欠損している、マンノタンパク質生合成突然変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７：４８１〜４８６、１９９７）は、酵母におけるタンパク質のＯ−グリコシル化の最初のステップを担っている酵素をコードしている、少なくとも６つの遺伝子（ＰＭＴ１〜６）のファミリーを記載している。これらの遺伝子のうちの１つまたは複数が欠損している突然変異体は、Ｏ結合型グリコシル化の減少および／または変更されたＯ−グリコシル化の特異性を示す。
異種タンパク質の産生を最適化するためには、宿主株が、タンパク質分解活性の減少をもたらす、出芽酵母ｐｅｐ４突然変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３〜３３、１９７７）などの突然変異を保有することが好ましい場合がある。大量の本発明のＴｆ融合タンパク質を産生するためには、他のプロテアーゼコード領域中に突然変異を含有する宿主株が特に有用である。
本発明のＤＮＡ構築体を含有する宿主細胞は、適切な成長培地中で成長させる。本明細書中で使用する用語「適切な成長培地」とは、細胞の成長に必要な栄養素を含有する培地を意味する。細胞成長に必要な栄養素には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、鉱物および成長因子が含まれ得る。成長培地は、一般に、例えば、ＤＮＡ構築体上のまたはＤＮＡ構築体と共に同時形質移入した選択マーカーによって補完される、薬物選択または必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築体を含有する細胞を選択する。例えば、酵母細胞は、好ましくは、炭素源、例えばスクロース、非アミノ酸窒素源、無機塩、ビタミンおよび必須アミノ酸の添加物を含む、既知組成の培地中で成長させる。培地のｐＨは、好ましくは、２より高く８未満のｐＨ、好ましくはｐＨ５．５〜６．５で維持する。安定なｐＨを維持するための方法には、緩衝化および好ましくは水酸化ナトリウムを加えることによる持続的なｐＨ調節が含まれる。好ましい緩衝剤には、コハク酸およびビス−トリスが含まれる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）。アスパラギン結合のグリコシル化に必要な遺伝子の欠損を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定化剤を含有する培地中で成長させる。１つのそのような浸透圧安定化剤は、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で培地に添加したソルビトールである。
培養した哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地中で成長させる。使用する特定の細胞系に適切な培地の選択は、当分野の通常の技術レベルの範囲内にある。形質移入した哺乳動物細胞を一定期間、典型的には１〜２日間成長させて、目的のＤＮＡ配列（複数可）の発現を開始させる。その後、薬物選択を適用して、選択マーカーを安定した様式で発現している細胞の成長を選択する。増幅可能な選択マーカーで形質移入した細胞では、薬物濃度を段階的に増加させて、クローニングした配列のコピー数が増加したもの、ひいては発現レベルが増加したものを選択し得る。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系もまた、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を産生するために使用し得る。ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））は、組換えタンパク質を昆虫宿主細胞中、高レベルで発現する。標的遺伝子を運搬ベクター内に挿入し、これを、直鎖状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡと共に昆虫宿主細胞内に同時形質移入する。ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの必須部分を欠いている。ＤＮＡがベクターと組み換わる際、必須要素が修復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移される。組換え後、いくつかのウイルス溶菌斑を選択して精製し、組換え表現型を確認する。その後、新しく単離された組換えウイルスを増幅し、昆虫細胞培養物を感染させて大量の所望のタンパク質を産生させるために、使用することができる。
分泌シグナル配列
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」または「分泌リーダー配列」は、互換性があるように使用され、例えば、どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第５，５４７，８７１号に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は分泌ペプチドをコードしている。分泌ペプチドとは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは一般に、疎水性アミノ酸の核を特徴とし、典型的には（ただし排他的ではない）新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見つかる。非常に多くの場合、分泌ペプチドは分泌中に成熟タンパク質から切断される。分泌ペプチドは、分泌経路を通る際に成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能にする、プロセッシング部位を含有し得る。プロセッシング部位は、シグナルペプチド内にコードされているか、または、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によってシグナルペプチドに付加されていてもよい。
分泌ペプチドを用いて本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質の分泌を指示し得る。他の分泌ペプチドと組み合わせて使用し得る１つのそのような分泌ペプチドは、酵母バリアタンパク質の第３ドメインである。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列が、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後プロセッシングステップに必要である。インタクトなシグナル配列が存在する場合、発現されるタンパク質が粗面小胞体の細胞内腔に入り、その後、ゴルジ体を介して分泌小胞に輸送され、最後に細胞外に輸送される。一般に、シグナル配列は開始コドンの直後にあり、分泌されるタンパク質のアミノ末端でシグナルペプチドをコードしている。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的プロテアーゼによって切断除去される。好ましいシグナル配列は、ウイルス、哺乳動物または酵母発現ベクターを用いた組換えタンパク質の発現のプロセッシングおよび輸出効率を向上させる。一部の事例では、ネイティブＴｆシグナル配列を用いて本発明の融合タンパク質を発現および分泌させ得る。
リンカー
本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質のＴｆ部分とリガンドとは、より大きな物理的分離をもたらし、融合したタンパク質間でより多くの空間的な可動性を可能にすることで、抗体可変領域の、例えばその同族受容体と結合するための接触性を最大限にするために、直接または様々な長さのリンカーペプチドを用いて融合させることができる。リンカーペプチドは、柔軟またはより強固なアミノ酸からなり得る。一実施形態では、本発明には、（ＰＥＡＰＴＤ）ｎ（配列番号１８）などの、実質的にヘリックスでないリンカーが含まれる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリグリシンストレッチを有するリンカーを含有する。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基であることができる。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部分と抗体可変領域との間で共有結合していることができる。
リンカーはまた、リガンドまたは複数のリガンド内の抗体可変領域を連結させるためにも使用し得る。抗体可変領域を連結させるための適切なリンカーは、全抗体の結合特異性を維持する三次元構造へと折り畳まれる抗体可変領域を可能にするものである。
スクリーニング方法
本発明の融合タンパク質ライブラリーをスクリーニングによって同定され得るリガンドが対する、可能な標的分子の数は、事実上無限大である。例えば、標的分子、すなわち受容体または薬剤は、抗体（もしくはその結合部分）または抗原であり得る。抗体が結合する抗原は既知であってもよく、場合によっては配列決定されていてもよく、その場合、本発明を用いて抗原のエピトープのマップ作成を行い得る。特定の自己免疫疾患などの場合のように抗原が未知の場合、例えば、疾患に罹患している患者由来の血清、体液、組織、または細胞を用いて、自己免疫応答を誘発するペプチド、ひいては抗原を同定するためのスクリーニング方法を提示することができる。ペプチドが同定された後、そのペプチドは、ワクチン、治療剤、診断試薬などを開発するための基準として役割を果たす、またはそれを提供することができる。対するリガンドをスクリーニングし得る標的分子のリストには、すべての目的のためにその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、国際公開公報ＷＯ０１／４６６９８を参照されたい。
スクリーニングは、当分野の従事者に周知の方法のうちの１つを用いて、例えばバイオパニング、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどによって行い得る。本発明の一実施形態では、受容体の活性化についてスクリーニングを行う。標的は、精製した溶液中にあるか、または表面結合もしくは細胞と会合していることができる。標的は、例えば、ビオチンを用いて、または当分野で知られている他の方法によって標識し得る。
所望の特性を有するポリペプチドおよびペプチドを単離し、対応する核酸配列の配列決定またはアミノ酸配列決定または質量分析によって同定することができる。続く最適化は、部分配列を異なる配列、好ましくはランダム配列で置き換えること、および１回または複数回のスクリーニングステップの繰り返しによって、行い得る。
ペプチドライブラリーが構築された後、宿主細胞をライブラリーベクターで形質転換させる。成功した形質転換体は、典型的には、選択培地または選択的条件下、例えば、適切な成長培地または使用するベクターに応じた他のもの中で成長させることによって選択する。この選択は、固体または液体の成長培地で行い得る。固体培地上での細菌細胞の成長では、細胞を、高密度（約１０８〜１０９個の形質転換体／ｍ２）で、例えば選択的抗生物質を含有するＬ−寒天の広い表面上で成長させて、本質的にコンフルエントな菌叢を形成させる。液体培養物中での成長には、細胞をＬ−ブロス（抗生物質選択を有する）中で、約１０回以上の倍加で成長させ得る。ライブラリーの大きさが理由で、液体培養物中での成長がより好都合であり得る一方で、固体培地上での成長は、増幅プロセス中の偏りの可能性がより低くなる可能性が高い。
トランスフェリン融合タンパク質のペプチドライブラリーを酵母細胞表面ディスプレイによってスクリーニングする場合、酵母細胞は、トランスフェリン融合タンパク質をコードしている発現ベクターを用いて形質転換させる。エラープローンポリメラーゼ連鎖反応およびＤＮＡシャフリングなど、一連の突然変異誘発方法が酵母表面ディスプレイライブラリーの構築と矛盾がない。Ｂｏｄｅｒ他（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３２８：４３０〜４４４を参照されたい。あるいは、発現された融合タンパク質のトランフェリン部分がランダムペプチド配列またはＣＤＲの骨格として役割を果たすことができる。
酵母細胞トランスフェリン融合タンパク質のペプチドライブラリーが作製された後、望ましいペプチドを同定するためのいくつかの手法が当分野で知られている。例えば、比較的低い親和性濃度の場合（Ｋｄ＞ｎＭ、または、新規結合特異性を単離するためにライブラリーをスクリーニングしている場合は親和性なし）、低濃度の蛍光標識した標的、すなわち受容体または薬剤との平衡結合によって、ペプチドを識別することができる。密に結合するタンパク質を進化させるために設計された用途には、リガンドモル濃度の過剰を維持するために過剰に大量の希釈標的溶液が必要であり得、これは試料の取扱いを複雑化させる。そのような場合、解離動力学の変化によって結合親和性の向上を近似し得る。化学量論的に制限される標的の動力学的競合を用いて、集団内の改善されたクローンを同定することができる（Ｈａｗｋｉｎｓ他（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９）。しかし、この手法ではスクリーニング手法の定量的な予測可能性が排除され、一般的には推奨されない。Ｂｏｄｅｒ他（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３２８：４３０〜４４４を参照されたい。
標的は、ビオチン標識もしくは蛍光標識するか、または目的のリガンド、すなわちトランスフェリン上にディスプレイされるペプチドを標識することができる。好ましくは、標的は標識されている。標識した標的、例えばビオチン標識した標的を、トランスフェリン融合タンパク質のペプチドライブラリーと共にインキュベーションすることができる。ライブラリーは、少なくとも約１０４個のメンバー（すなわちディスプレイされたペプチド）、少なくとも約１０５個のメンバー、少なくとも約１０６個のメンバー、少なくとも約１０７個のメンバー、少なくとも約１０８個のメンバー、少なくとも約１０９個のメンバー、少なくとも約１０１０個のメンバー、少なくとも約１０１１個のメンバー、少なくとも約１０１２個のメンバー、少なくとも約１０１３個のメンバー、少なくとも約１０１４個のメンバー、少なくとも約１０１５個のメンバー、または少なくとも約１０１６個のメンバーを有し得る。
インキュベーション後、細胞を、二次抗体、ステプトアビジンで標識した分子、または当分野で知られている他の方法などの第２の標識で標識することができる。二次抗体は抗ビオチン抗体であることができる。ストレプトアビジンで標識した分子には、それだけには限定されないが、ストレプトアビジン−フィコエリスリンまたはストレプトアビジンマイクロビーズが含まれる。
フローサイトメトリーを用いて、当分野で知られているように細胞集団を分析することができる。これを行った場合、集団のうちの表示している画分のみが分析される。どちらもその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｂｏｄｅｒ他（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３２８：４３０〜４４４およびＫｏｎｄｏ他（２００４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６４：２８〜４０を参照されたい。
あるいは、標識したビーズからなる第２の標識、すなわち、抗ビオチンまたはストレプトアビジンで標識したビーズを使用する場合、リガンドおよび標的分子の混合物は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＹｅｕｎｇ他（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１８：２１２〜２２０に記載されているように、磁気分別プロトコルを用いて分別することができる。ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズキットをこのスクリーニングプロトコルと共に使用することができる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）。磁気分別はＦＡＣＳと併せて使用することができる。
本発明の一実施形態では、酵母細胞中で発現される単一の目的リガンドを特徴づけることが望ましい。発現されたタンパク質は様々な方法でスクリーニングし得る。タンパク質が機能を有する場合は、これを直接アッセイし得る。例えば、酵母表面上で発現された単鎖抗体は完全に機能的であり、抗原との結合に基づいてスクリーニングし得る。タンパク質が、容易にアッセイできる検出可能な機能を有さない場合は、リガンドの発現は抗体を用いて監視し得る。酵母細胞はファージよりもはるかに大きいため、単一の酵母細胞上のタンパク質の表現型を監視するためにフローサイトメトリーを使用することができる。
本発明の別の実施形態では、リガンド部分と受容体または薬剤との結合を、ＥＬＩＳＡ、標的のネイティブ結合パートナーが知られている場合は競合結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、その結合がペプチドライブラリーによって遮断される放射性リガンドを用いた放射性受容体アッセイなどの、細胞表面ディスプレイ以外の当分野で知られている手段によって行う。これらの方法では、Ｔｆ融合タンパク質のペプチドライブラリーで形質転換させた宿主細胞を溶解する。Ｔｆ融合タンパク質ペプチドは、それだけには限定されないが抗ＭＵＣ１抗体などの適切なアンカー部分を介して、アッセイ基質にアンカーされている。スクリーニングプロセスは、Ｔｆペプチドライブラリーを目的の標的と反応させて、ベースライン結合レベルを確立することを含み、これを、続くペプチドライブラリーの結合活性と比較する。アッセイの性質は、標的と結合するまたはそれと競合する少量のペプチドを検出するために十分に高感度である限りは重要でない。アッセイ条件は、様々な目的の結合基質の最適な結合条件または他の生物活性を考慮するために変化させ得る。したがって、ｐＨ、温度、塩濃度、体積および結合時間などは、すべて、目的環境に似ている条件下でペプチドと標的との結合を達成するために変化させ得る。
Ｔｆペプチドライブラリーが目的の標的と結合するペプチドまたは複数のペプチドを保有することが決定された後、本発明の方法を用いて、混合物中のペプチド（複数可）の配列を同定することができる。標的と結合するペプチドを表示している細胞を、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳスクリーニングによってライブラリーの全集団から単離することができる。非特異的結合剤をすべて枯渇させるために、最初の単離物にスクリーニングプロセスを２〜３回繰り返す。その後、結合親和性に基づいて単離するためのＦＡＣＳ分別によるスクリーニングの最終回を行う。プラスミドＤＮＡを単離した細胞から回収し、挿入領域のＤＮＡを配列決定してタンパク質配列を決定する。その後、単離物間の共通モチーフを決定することができる。
治療リガンド分子
本発明のリガンドは、推定または既知の治療分子であることができる。本明細書中で使用する、治療分子とは、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで有益な生物学的効果を発揮することができるタンパク質またはペプチドであり、正常な恒常性、生理学または病状に関連して有益な効果を発揮するタンパク質またはペプチドが含まれる。治療分子には、ガラクトシダーゼなどのマーカーまたはタンパク質精製補助剤として一般的に使用されている融合パートナーは含まれない（例えば、米国特許第５，９８６，０６７号およびＡｌｄｒｅｄ他（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２２：９６０〜９６５参照）。例えば、病状に関連する有益な効果には、疾患の予防、疾患の安定化、疾患の症状の軽減もしくは緩和または変調、治療した対象に有益な効果をもたらす根底にある欠損の緩和または治癒を含めた、治療した対象に有利な任意の効果が含まれる。
治療リガンドは、上述のように、トランスフェリン部分と直接、またはリンカー部分を介して間接的に、融合していてよい。一実施形態では、融合タンパク質を切断して、トランスフェリンおよび融合タンパク質のリガンド部分を融合タンパク質の残りの部分から分離することが望ましい場合がある。別の実施形態では、リガンドを融合タンパク質の残りの部分から切断することが望ましい場合がある。
本発明の融合タンパク質のリガンド部分は、治療タンパク質の少なくとも断片もしくは変異体、および／または抗体の少なくとも断片もしくは変異体を含有し得る。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質または抗体のペプチド断片またはペプチド変異体を含有することができ、変異体または断片は、少なくとも１つの生物学的活性または治療活性を保持している。融合タンパク質は、Ｎおよび／もしくはＣ末端と融合した、その中に挿入された、または改変トランスフェリンのループ内に挿入された、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０または少なくとも約７０個以上のアミノ酸の長さのペプチド断片またはペプチド変異体であることができる、治療タンパク質を含有することができる。
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質のリガンド部分は、完全長タンパク質およびアミノ酸配列のアミノ末端から１つまたは複数の残基が欠失したポリペプチドが含まれる治療タンパク質の断片であることができる、治療タンパク質部分を含有する。
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質のリガンド部分は、完全長タンパク質およびアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つまたは複数の残基が欠失したポリペプチドが含まれる治療タンパク質の断片であることができる、治療タンパク質部分を含有する。
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質のリガンド部分は、アミノおよびカルボキシの両末端から１つまたは複数のアミノ酸が欠失していることができる治療タンパク質部分を含有する。
別の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書中に記載した参照治療タンパク質と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である治療タンパク質部分、すなわちリガンド部分、またはその断片を含有する。さらなる実施形態では、トランスフェリン融合分子は、上述のＮ末端およびＣ末端が欠失したアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である治療タンパク質部分を含有する。
別の実施形態では、融合タンパク質は、例えば治療タンパク質のネイティブまたは野生型アミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な治療タンパク質部分を含有する。これらのポリペプチドの断片も提供する。
細胞表面および分泌タンパク質などの、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質は、１つまたは複数のオリゴ糖基を結合することによって修飾することができる。グリコシル化と呼ばれる修飾は、タンパク質の物理特性に顕著な影響を与えることができ、タンパク質の安定性、分泌、および局在化に重要となることができる。グリコシル化はポリペプチド主鎖に沿った特定の位置で起こる。通常は２つの主要な種類のグリコシル化、すなわち、セリンまたはスレオニン残基と結合したＯ結合型オリゴ糖を特徴とするグリコシル化、およびＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸であることができる）中のアスパラギン残基と結合しているＮ結合型オリゴ糖を特徴とするグリコシル化が存在する。タンパク質の構造および細胞型などの可変要素は、様々なグリコシル化部位における、鎖内の炭水化物単位の数および性質に影響を与える。グリコシル化異性体も、所定の細胞型内の同じ部位で一般的である。例えば、数種のヒトインターフェロンがグリコシル化されている。
本発明の融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質、ならびにその類似体および変異体は、１つまたは複数の部位におけるグリコシル化が、それらが発現される宿主細胞によるその核酸配列の遺伝子操作（複数可）の結果、またはその発現の他の条件が原因で変更されているように、改変し得る。例えば、グリコシル化異性体を、グリコシル化部位を廃止もしくは導入することによって、例えば、グルタミンでアスパラギンを置換することなどのアミノ酸残基の置換または欠失によって産生するか、または、グリコシル化されていない組換えタンパク質を、タンパク質を、それをグリコシル化しない宿主細胞中、例えばグリコシル化欠損酵母中で発現させることによって産生し得る。これらの手法は当分野で知られている。
治療タンパク質およびその核酸配列は当分野で周知であり、化学情報検索サービス（例えばＣＡＳレジストリ）、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＧｅｎＳｅｑなどの公開データベースから入手可能である。以下で言及する受託番号および配列は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
本発明は、本明細書中に記載の治療タンパク質の断片を含む融合タンパク質にさらに向けられている。タンパク質のＮ末端からの１つまたは複数のアミノ酸の欠失が治療タンパク質部分の１つまたは複数の生物学的機能の改変または損失をもたらす場合でも、他の治療活性および／または機能的活性（例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンドと結合する能力）は依然として保持され得る。例えば、Ｎ末端欠失を有するポリペプチドが、ポリペプチドの完全もしくは成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそれと結合する能力は、一般に、完全ポリペプチドの残基の大部分未満がＮ末端から除去された場合に保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持しているかどうかは、本明細書中に記載のおよび他の様式で当分野において知られているルーチン方法によってアッセイすることができる。多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有する突然変異体が一部の生物学的または免疫原性活性を保持し得ることは、多分にある。実際、わずか６個のアミノ酸残基から構成されるペプチドが、しばしば免疫応答を誘起し得る。
また、上述のように、治療タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１つまたは複数のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つまたは複数の生物学的機能の改変または損失をもたらす場合でも、他の機能的活性、例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンドと結合する能力、および／または治療活性は、依然として保持され得る。例えば、Ｃ末端欠失を有するポリペプチドがポリペプチドの完全もしくは成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそれと結合する能力は、一般に、完全または成熟ポリペプチドの残基の大多数未満がＣ末端から除去された場合に保持される。参照ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが治療活性を保持しているかどうかは、本明細書中に記載のおよび／または他の様式で当分野において知られているルーチン方法によって、容易に決定することができる。
治療タンパク質のペプチド断片は、そのアミノ酸配列が断片である治療タンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／もしくは機能的活性、例えば、生物活性を表示するアミノ酸配列を、含む、またはそれからなる断片であることができる。
他のポリペプチド断片は、生物活性のある断片である。生物活性のある断片とは、本発明で使用する治療タンパク質の活性と類似しているが、必ずしも同一ではない活性を示すものである。断片の生物活性には、向上した所望の活性、または減少した望ましくない活性が含まれ得る。
一般に、タンパク質の変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域中で、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの変異体をコードしている核酸も、本発明によって包含される。
本発明で使用し得るさらなる治療ポリペプチドは、当業者に知られているストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、治療タンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸分子の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされている、ポリペプチドである。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他編、１９８９、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋを参照されたい。これらのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも、本発明によって包含される。
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列に問い合わせアミノ酸配列のそれぞれ１００個のアミノ酸あたり５個のアミノ酸の変更が含まれ得る以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であることを意図する。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換されていてよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端の位置またはこれらの末端位置間の任意の箇所で、参照配列中の残基間で個々に分散して、または参照配列内の１つもしくは複数の連続的な群で、起こり得る。
実際、任意の特定のポリペプチドが、例えば本発明の融合タンパク質またはその断片（融合タンパク質の治療タンパク質部分またはその一部分など）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。グローバル配列アラインメントとしても呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体一致を決定するための一方法は、Ｂｒｕｆｉａｇ他（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ、２４５〜（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方の変更を含有し得る。サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされているポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含有するポリヌクレオチド変異体を用いて、改変リガンド部分を生成し得る。遺伝暗号の縮重が原因のサイレント置換によって生成されたヌクレオチド変異体を利用することができる。さらに、約５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、または付加されているポリペプチド変異体も、利用することができる。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（上述のように、ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを酵母または大腸菌などの宿主によって好ましいものに変更する）ために生成することができる。
他の実施形態では、治療タンパク質部分、すなわちリガンド部分は、野生型配列と比較して保存的置換を有する。「保存的置換」とは、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの交換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの交換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの交換、ならびに小サイズアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの交換などの、群内の交換を意図する。表現型がサイレントなアミノ酸置換の作製に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅ他、「タンパク質配列中のメッセージの解読：アミノ酸置換の許容度（Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に提供されている。具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載の治療タンパク質のアミノ酸配列および／または血清トランスフェリン、および／または本発明の改変トランスフェリンタンパク質の断片または変異体を含む、またはそれからなり、断片または変異体は、参照アミノ酸配列と比較した場合に１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失を有する。さらなる実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードしている核酸も、本発明によって包含される。
本発明の改変融合タンパク質は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸から構成されることができ、２０種の遺伝子にコードされているアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシングなどの天然のプロセス、または当分野で周知の化学修飾技術のどちらかによって修飾され得る。そのような修飾は基本的な教科書およびより詳細な専攻論文、ならびに膨大な研究文献中に十分に記載されている。
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含めた、ポリペプチド中の任意の箇所で起こることができる。同じ種類の修飾が同じまたは異なる度合で、所定のポリペプチド中のいくつかの部位に存在し得ることを理解されよう。また、所定のポリペプチドは、多種類の修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果分枝鎖状であってもよく、また、分岐を有するまたは有さない環状であってもよい。環状、分枝鎖状、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然のプロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製し得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、アルギニン化などのトランスファー−ＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる。（例えば、タンパク質−構造および分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；タンパク質の翻訳後共有修飾（ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ページ１〜１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ他（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２：６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３：４８〜６２を参照されたい。
リガンド部分として使用し得る治療分子には、それだけには限定されないが、ホルモン、マトリックスタンパク質、免疫抑制剤、気管支拡張剤、心血管作動剤、酵素、ＣＮＳ剤、神経伝達物質、受容体タンパク質またはペプチド、成長ホルモン、成長因子、抗ウイルスペプチド、膜融合阻害ペプチド、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、コロニー刺激因子、分化因子、血管形成因子、受容体リガンド、癌関連タンパク質、抗新生物剤、ウイルスペプチド、抗生物質ペプチド、血液タンパク質、拮抗タンパク質、転写因子、抗血管形成因子、拮抗タンパク質またはペプチド、受容体拮抗剤、抗体、単鎖抗体および細胞接着分子が含まれる。様々な治療分子を単一の融合タンパク質に合わせて、二重または多重機能的治療分子を生成し得る。また、様々な分子を組み合わせて使用して、治療部分および標的化部分を有する融合タンパク質も生成し得る。治療分子は、本発明のストーク部分と直接融合させるか、または、Ｔｆ部分もしくはアルブミン部分などの提示部分と融合もしくはその中に挿入することができる。
サイトカインとは、特定の受容体を介して非酵素的に作用して免疫応答を制御する、免疫系の細胞によって放出される可溶性タンパク質である。サイトカインは、低濃度で、特定の受容体と高い親和性で結合して作用するという点で、ホルモンに似ている。本明細書中で使用する用語「サイトカイン」とは、そのサイトカインに対する受容体を有する細胞中で特異的な生物学的応答を誘発する、天然に存在するまたは組換えのタンパク質、その類似体、およびその断片を説明するものである。サイトカインには、好ましくは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７７８３４）、ＩＬ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７４３）、ＩＬ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２３４４２）、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３４７８）、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４５８４）、ＩＬ−７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８８０）、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５７２）、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８０５６２やＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８０５６３）、ＩＬ−１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１０３０７）、ＩＬ−１４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿１７０９２４）、ＩＬ−１５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９１２３３）、ＩＬ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５１３）、ＩＬ−１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１９０）およびＩＬ−１８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５６２）などのインターロイキン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０２１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３６５６）、血小板活性化因子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４３７）およびエリスロポエイチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２１５８）などの造血因子、ＴＮＦα（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２９１０）などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンフォトキシン−α（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２９１１）、リンフォトキシン−β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１１０１６）、ロイコレグリン、マクロファージ遊走阻害因子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２５６３９）、およびニューロロイキン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０３５１５）などのリンホカイン、レプチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４３４１５）などの代謝プロセスの制御因子、インターフェロンα（ＩＦＮα）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５４８８６）、ＩＦＮβ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ００５３４）、ＩＦＮγ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２１９）、ＩＦＮｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１７７）などのインターフェロン、トロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２４６）、ＴＨＢＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１２３５０）、ＴＨＢＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３８９６９）、ＴＨＢＳ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２４８）、ならびにケモカインが含まれる。好ましくは、本発明の改変トランスフェリン−サイトカイン融合タンパク質はサイトカイン生物活性を示す。
本明細書中で使用する用語「ホルモン」とは、特定の細胞または組織によって産生され、身体の他の箇所に位置する別の細胞または組織で特異的な生物学的変化または活性が起こることを引き起こす、いくつかの生物活性のある物質のうちの任意のものを説明するものである。ホルモンには、好ましくは、プロインスリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ００５６５）、インスリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２０７）、成長ホルモン１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ００５２０）、成長ホルモン２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｆ００６０６０）、成長ホルモン放出因子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１０８１）、インスリン様成長因子Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２７５４４）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６１２）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５９３１６）、ＩＧＦＢＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１６３０２）、ＩＧＦＢＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５９８）、ＩＧＦＢＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１２５０８）、ＩＧＦＢＰ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５０６２）、ＩＧＦＢＰ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１７８）、ＩＧＦＢＰ−７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５５３）、絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１４２）、絨毛性ゴナドトロピンα鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３５）、黄体形成ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００２６４）、卵胞刺激ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１０）、甲状腺刺激ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５４９）、プロラクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００９４８）、プロオピオメラノコルチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０１５１０）、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、β−リポトロピン、α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、γ−リポトロピン、β−ＭＳＨ、β−エンドルフィン、およびコルチコトロピン様中間体ローブペプチド（ＣＬＩＰ）が含まれる。
また、用語「ホルモン」には、いわゆる腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ ａｘｉｓ）に属する、インスリン分泌を制御する胃腸管系ホルモンであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにＧＬＰ−１受容体作用剤であるエキセンディン（例えばエキセンディン−４およびその変異体）も含まれる。
本明細書中で使用する用語「成長因子」とは、受容体と結合して細胞増殖を刺激する任意のタンパク質またはペプチドを説明するものである。成長因子には、好ましくは、血小板由来成長因子−α（ＰＤＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３７９５）、ＰＤＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２８１１）、ステロイドホルモン、表皮成長因子（ＥＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９６３）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８００）、ＦＧＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００６）、ＦＧＦ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２４７）、ＦＧＦ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００７）、ＦＧＦ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３７８２５）、ＦＧＦ６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５７０７５）、ＦＧＦ７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００９）、ＦＧＦ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００６６４９）、ＦＧＦ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１０）、ＦＧＦ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ００２０９７）、ＦＧＦ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１１２）、ＦＧＦ１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１０３２）、ＦＧＦ１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１１４）、ＦＧＦ１４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１１５）、ＦＧＦ１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ００９３９１）、ＦＧＦ１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８６７）、ＦＧＦ１８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０７５２９２）、ＦＧＦ１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１１７）、ＦＧＦ２０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９８５１）、ＦＧＦ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９１１３）、ＦＧＦ２２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６３７）、およびＦＧＦ２３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６３８）などの線維芽細胞成長因子、アンジオゲニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１１５６７）、脳由来神経栄養因子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６１１７６）、毛様体神経栄養性成長因子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０５４２）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７０３４０）、ＴＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２８１２）、神経成長因子−α（ＮＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０９１５）、ＮＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５２５９９）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤１（ＴＩＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０２５７１）、ＴＩＭＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７６４５６）ならびにマクロファージ刺激１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１１９２４）が含まれる。
本明細書中で使用する用語「マトリックスタンパク質」とは、通常は細胞外基質中に見つかるタンパク質またはペプチドを説明するものである。これらのタンパク質は、強度、濾過、または接着に機能的に重要であり得る。マトリックスタンパク質には、好ましくは、コラーゲンＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７４６１５）、コラーゲンＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１６７１１）、コラーゲンＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４４２０）、コラーゲンＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８４５）、コラーゲンＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３９３）、コラーゲンＶＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８１７５）、コラーゲンＶＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０２８７０）、コラーゲンＶＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８５０）、コラーゲンＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４４１２）、コラーゲンＸ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０３８２）、コラーゲンＸＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４１７７）、およびコラーゲンＸＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７３７７８）などのコラーゲン、ＬＡＭＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４２６）、ＬＡＭＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４１５５）、ＬＡＭＡ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２９０）、ＬＡＭＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２９１）、ＬＡＭＢ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２５５４１）、ＬＡＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２９３）などのラミニンタンパク質、ナイドジェン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５０８）、α−テクトリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４２２）、β−テクトリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２２２）、ならびにフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２７６１）が含まれる。
用語「血液タンパク質」とは、伝統的に血漿を起源とするものと定義され、その多くは現在では一般的に組換え手段によって産生され、それだけには限定されないが、ネイティブ血清タンパク質、その誘導体、断片および突然変異体または変異体、血液凝固因子、誘導体、突然変異体、変異体および断片（第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子を含む）、プロテアーゼ阻害剤（抗トロンビン３、α−１抗トリプシン）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤、免疫グロブリン、フォンウィルブランド因子およびフォンウィルブランド突然変異体、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンビンならびにヘモグロビンが含まれる。
本明細書中で使用する用語「酵素」とは、自身が恒久的に変更または破壊されることなしに、特異的な反応を触媒する任意のタンパク質またはタンパク質性物質を説明するものである。酵素には、好ましくは、Ｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿１７０６８８）、Ｆ７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０２７５０８）、Ｆ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１３１２４）、Ｆ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１３３）、Ｆ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０３５１０）および他のものなどの凝固因子、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＭＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２１）、ＭＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５３０）、ＭＭＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２２）、ＭＭＰ７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２３）、ＭＭＰ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２４）、ＭＭＰ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９９４）、ＭＭＰ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２５）、ＭＭＰ１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４２６）、ＭＭＰ１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７５３０８）、ＭＭＰ２０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４７７１）などのマトリックスメタロプロテイナーゼ、アデノシンデアミナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００２２）、ＭＡＰＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０５５７６６）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０６６２）、ＭＡＰ２Ｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７５５）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３０１０）、ＭＡＰ２Ｋ７（ＡＦ０１３５８８）、およびＭＡＰＫ１２（ＮＭ＿００２９６９）などのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、ＪＮＫＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１７７４３）、ＪＮＫＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１４４０１）、ＪＡＫ１（Ｍ６４１７４）、ＪＡＫ２（ＮＭ＿００４９７２）、およびＪＡＫ３（ＮＭ＿０００２１５）などのキナーゼ、ならびにＰＰＭ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１００３）およびＰＰＭ１Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３６２０）などのホスファターゼが含まれる。
本明細書中で使用する用語「転写因子」とは、タンパク質をコードしている遺伝子の転写に関与している任意のタンパク質またはペプチドを説明するものである。転写因子には、Ｓｐ１、Ｓｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１１０）、Ｓｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０７０１３７）、Ｓｐ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１１２）ＮＦＹＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６１６６）、Ｈａｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５９０７９）、ＧＡＴＡ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０４９）、ＧＡＴＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０５０）、ＧＡＴＡ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５５１２２）、ＧＡＴＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４３５７）、ＧＡＴＡ−５、ＧＡＴＡ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２５７）、ＦＯＧ２（ＮＭ＿０１２０８２）、Ｅｒｙｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１７２５４）、ＴＲＰＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４１１２）、ＮＦ−Ｅ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６１６３）、ＮＦ−Ｅ３、ＮＦ−Ｅ４、ＴＦＣＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６５３）、Ｏｃｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１３４０３）、ＨＯＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１４５）、ＨＯＸ２Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１６６６５）などのホメオボックスタンパク質、無毛相同体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１４４）、ＭＡＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９００）、ＭＡＤＨ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９０１）、ＭＡＤＨ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９０２）、ＭＡＤＨ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５３５９）、ＭＡＤＨ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９６７８）、ＭＡＤＨ６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５５８５）、ＭＡＤＨ７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９０４）、ＭＡＤＨ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９０５）などのマザーズアゲンストデカペンタプレジックタンパク質（ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ならびにＳＴＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１０８９３）、ＳＴＡＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４１９）、ＳＴＡＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２４６３）、ＳＴＡＴ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１５１）、ＳＴＡＴ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ４１１４２）、およびＳＴＡＴ６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１５３）などの転写タンパク質のシグナル伝達物質および活性化剤が含まれ得る。
本発明のさらに別の実施形態では、治療分子は非ヒトまたは非哺乳動物タンパク質である。例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｔａｔ、肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、アデノウイルスおよびＲＳＶなどの他のウイルスの表面タンパク質、他のＨＩＶ構成要素、マラリア抗原などの寄生虫表面タンパク質、ならびに細菌表面タンパク質を使用し得る。これらの非ヒトタンパク質は、例えば抗原として、または有用な活性を有するので、使用し得る。例えば、治療分子は、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、アスパラギナーゼ、ウロキナーゼ、または有用な酵素活性を有する他のタンパク質であり得る。
本発明の代替実施形態では、治療分子は、生物活性を有するリガンド−結合タンパク質である。そのようなリガンド−結合タンパク質は、例えば、（１）細胞表面での受容体−リガンドの相互作用を遮断し得る、または（２）血液の液相中の分子の生物活性を中和することで、それがその細胞標的に達することを予防し得る。一部の実施形態では、改変トランスフェリン融合タンパク質には、それだけには限定されないが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、アセチル化ＬＤＬ受容体、腫瘍壊死因子α受容体、トランスフォーミング成長因子β受容体、サイトカイン受容体、免疫グロブリンＦｃ受容体、ホルモン受容体、グルコース受容体、糖脂質受容体、およびグリコサミノグリカン受容体からなる群から選択される受容体のリガンド−結合ドメインと融合した改変トランスフェリン分子が含まれる。他の実施形態では、リガンド−結合タンパク質には、ＣＤ２（Ｍ１４３６２）、ＣＤ３Ｇ（ＮＭ＿００００７３）、ＣＤ３Ｄ（ＮＭ＿０００７３２）、ＣＤ３Ｅ（ＮＭ＿０００７３３）、ＣＤ３Ｚ（Ｊ０４１３２）、ＣＤ２８（ＮＭ＿００６１３９）、ＣＤ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６１６）、ＣＤ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２８８２５）、ＣＤ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６４）、ＣＤ１Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６５）、ＣＤ１Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６６）、ＣＤ８０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１９１）、ＧＮＢ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０１８８４）、ＣＴＬＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２１４）、ＩＣＡＭ−１（ＮＭ＿０００２０１）、ＩＣＡＭ−２（ＮＭ＿０００８７３）、およびＩＣＡＭ−３（ＮＭ＿００２１６２）などの細胞間接着分子、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５５３１３）、ＴＮＦＲ１ＳＦＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０６６）、ＴＮＦＲＳＦ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５６１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８４２）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５４６）、およびＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６５７３）などの腫瘍壊死因子受容体、ならびにＩＬ２ＲＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４１７）、ＩＬ２ＲＧ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２０６）、ＩＬ４Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４２１８５５）、ＩＬ７Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１８５）、ＩＬ９Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０１５９８９）、およびＩＬ１３Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９５３０２）などのインターロイキン受容体が含まれる。好ましくは、本発明のリガンド−結合タンパク質の融合体は、リガンド−結合タンパク質の生物活性を表示する。
本明細書中で使用する用語「癌関連タンパク質」とは、癌抑制遺伝子または癌遺伝子によってコードされているタンパク質など、その発現が癌または調節された細胞成長の維持に関連しているタンパク質またはポリペプチドを説明するものである。癌関連タンパク質には、ｐ１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００５３７１）、ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５４６）、ｐ６３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３７２２）、ｐ７３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４２７）、ＢＲＣＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１４６８０）、ＢＲＣＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００５９）、ＣＴＢＰ相互作用タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７２０６６）、ＤＭＢＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４０６）、ＨＲＡＳ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５３４３）、ＮＣＹＭ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６３１６）、ＦＧＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２４８）、ｍｙｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１０４８６３）、ｒａｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２８８０）、ｅｒｂＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４８）、ＶＡＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１６３１６）、ｃ−ｆｏｓ（Ｖ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号０１５１２）、ｃ−ｆｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５２１９２）、ｃ−ｊｕｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２２８）、ＭＡＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１３１５０）、ｐｉｍ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１６７５０）、ＴＩＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８５２）、ｃ−ｆｍｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３６６３）、ＥＧＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８）、ｅｒｂＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０４７０７）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０４４６５９）、ｃ−ａｂｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７５２）、Ｎ−ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２７５１）、Ｋ−ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５４９６８）、ｊｕｎ−Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９０３９）、ｃ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００１５１１）、ＲＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２８４１９）、ＤＣＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７６１３２）、ＡＰＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００３８）、ＮＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８９９１４）、ＮＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１８０００）、およびｂｃｌ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１３９９４）が含まれ得る。
本明細書中で使用する「膜融合阻害ペプチド」とは、抗ウイルス活性、抗膜融合能力、および／または細胞内プロセスを変調する能力を示すペプチド、例えば、コイルドコイルペプチド構造を含むものを説明するものである。抗ウイルス活性には、それだけには限定されないが、未感染の細胞へのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶ、ＳＩＶ、ＥＢＶ、麻疹、ウイルス、インフルエンザウイルス、またはＣＭＶの感染の阻害が含まれる。さらに、ペプチドの抗膜融合能力、抗ウイルス活性または細胞内変調活性は、単にペプチドの存在だけを要し、そのようなペプチドに対する宿主の免疫応答の刺激を特に必要としない。抗膜融合とは、２つ以上の部分間の膜融合事象のレベルを、ペプチドが存在しない場合に前記部分間で起こる膜融合のレベルと比較して阻害または低下させる、ペプチドの能力をいう。部分は、例えば、細胞膜またはウイルス外被もしくは線毛などのウイルス構造であり得る。本明細書中で使用する用語「抗ウイルスペプチド」とは、細胞のウイルス感染、または例えば細胞間融合もしくは遊離ウイルス感染を介した、生産的なウイルス感染および／もしくはウイルス病因に必要な何らかのウイルス活性を阻害する、ペプチドの能力をいう。そのような感染は、外被に包まれたウイルスの場合で起こるような膜融合、またはウイルス構造および細胞構造に関与する何らかの他の融合事象を含み得る。膜融合阻害ペプチドおよび抗ウイルスペプチドは、多くの場合、複数のウイルスタンパク質に由来するアミノ酸配列（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶ、およびＳＩＶ由来のポリペプチド）を有する。
膜融合阻害ペプチドおよび抗ウイルスペプチドの例は、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、国際公開公報ＷＯ９４／２８２０、国際公開公報ＷＯ９６／１９４９５、国際公開公報ＷＯ９６／４０１９１、国際公開公報ＷＯ０１／６４０１３ならびに米国特許第６，３３３，３９５号、第６，２５８，７８２号、第６，２２８，９８３号、第６，１３３，４１８号、第６，０９３，７９４号、第６，０６８，９７３号、第６，０６０，０６５号、第６，０５４，２６５号、第６，０２０，４５９号、第６，０１７，５３６号、第６，０１３，２６３号、第５，４６４，９３３号、第５，３４６，９８９号、第５，６０３，９３３号、第５，６５６，４８０号、第５，７５９，５１７号、第６，２４５，７３７号、第６，３２６，００４号、および第６，３４８，５６８号中に見つけることができる。
他の種類のペプチドの例には、本明細書中に記載の治療タンパク質の断片、特に親分子の少なくとも１つの活性を保持しているヒトタンパク質の断片が含まれる。本発明のリガンド部分を生成するために使用し得るペプチドにはまた、模倣体ペプチドおよび治療タンパク質の生物活性を示すが配列または三次元構造が完全長の治療タンパク質とは異なるペプチドも含まれる。非限定的な例として、ペプチドには、Ｊｏｈｎｓｏｎ他（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５（９）：１２７４〜７、Ｋｕａｉ他（２０００）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．、５６（２）：５９〜６２、Ｂａｒｂｏｎｅ他（１９９９）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１４、補遺２：８０〜４、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ他（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（２０）：１４１６３〜９、Ｊｏｈｎｓｏｎ他（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７（１１）：３６９９〜７１０、Ｊｏｈｎｓｏｎ他（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１２：９３９〜５０、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ他（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５（１２）：１２６１〜５、Ｌｉｖｎａｈ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４６４〜７１、およびＷｒｉｇｈｔｏｎ他、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜６４に開示されているエリスロポエイチン模倣体ペプチドが含まれる。
治療分子にはまた、アレルゲンタンパク質およびその消化断片も含まれる。これらには、ブタクサ、ライムギ、ミノボロ、オーチャードグラス、ハルガヤ、コヌカグサ、チモシー牧草、イエロードック、コムギ、トウモロコシ、ヤマヨモギ、ブルーグラス、カリフォルニア一年草、アカザ、バミューダグラス、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｔｈｉｓｔｌｅ）、マウンテンシーダー（ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ）、オーク、トリネコバノカエデ、サイカモアカエデ、カエデ、ニレなどの花粉アレルゲン、塵ダニ、ハチ毒、食物アレルゲン、動物鱗屑、および他の昆虫毒も含まれる。
他の治療分子には、ウイルス、細菌および原虫ワクチンならびに表面抗原などのその様々な構成要素を含めた微生物ワクチンが含まれる。これらには、これらのタンパク質に由来する糖タンパク質、タンパク質またはペプチドを含有するワクチンが含まれる。そのようなワクチンは、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、肺炎球菌、骨髄炎菌、淋菌、サルモネラｓｐｐ．、シゲラｓｐｐ．、大腸菌、クレブシエラｓｐｐ．、プロテウスｓｐｐ．、コレラ菌、ピロリ菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、百日咳菌、ヒト結核菌、在郷軍人病菌、梅毒トレポネーマ、クラミジア、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス（流行性耳下腺炎、麻疹）、風疹ウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶおよびパピローマウイルスから調製する。
好ましい融合分子は、抗ＨＩＶウイルスペプチド、抗ＲＳＶペプチド、ヒト成長ホルモン、αおよび／またはβインターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ様ペプチド、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トロンボポエイチン、抗体のＣＤＲに対応するペプチド、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、カルシトニン、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターロイキン−２、成長ホルモン放出因子、ヒト副甲状腺ホルモン、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ペプチド、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体および／または単鎖抗体を含有し得る。
本発明の融合タンパク質はまた、新しいまたは新規の機能を有する分子をスクリーニングするために、ペプチドライブラリーに由来するペプチドまたはポリペプチドが含まれるように調製してもよい。そのようなペプチドライブラリーには、市販されているものまたは公的に入手可能なもの、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ならびに利用可能な技術によって生成したもの、例えば、標準手順を用いて作成したバクテリオファージおよび細菌ディスプレイライブラリーが含まれ得る。
本発明のさらに他の実施形態では、融合タンパク質は、当分野で知られている治療タンパク質部分を用いて調製してもよく、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、食品薬品局（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｂｅｒ／ｅｆｏｉ／ａｐｐｒｏｖｅ．ｈｔｍ）ならびにＰＣＴ特許公開の国際公開公報ＷＯ０１／７９２５８、国際公開公報ＷＯ０１／７７１３７、国際公開公報ＷＯ０１／７９４４２、国際公開公報ＷＯ０１／７９４４３、国際公開公報ＷＯ０１／７９４４４および国際公開公報ＷＯ０１／７９４８０によって現在認可されているペプチドおよびタンパク質によって例示されている。
本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ国際公開の国際公開公報ＷＯ０３／０２０７４６の表１は、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質部分、すなわちリガンド部分に対応する治療タンパク質の限定的なリストを提供する。「治療タンパク質Ｘ」の列は、治療タンパク質分子に続いて、治療タンパク質分子またはその断片もしくは変異体を含む、またはそれからなる学名および商標を含有する括弧を開示している。本明細書中で使用する「治療タンパク質Ｘ」とは、個々の治療タンパク質分子（ＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋ受託番号から入手可能なアミノ酸配列によって定義される）、またはこの列に開示されている所定の治療タンパク質分子に関連する治療タンパク質の群全体のどちらかに言及し得る。「例示的な識別子」の列は、タンパク質分子または治療タンパク質分子の断片もしくは変異体のアミノ酸配列を含有するＣＡＳレジストリまたはＧｅｎｂａｎｋデータベースの登録に対応する、化学情報検索サービス（ＣＡＳ）レジストリ番号（米国化学会によって公開）ならびに／または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号（例えば、座位のＩＤ、ＮＰ−ＸＸＸＸＸ（参照配列タンパク質）、およびＸＰ−ＸＸＸＸＸ（モデルタンパク質）の識別子を提供する。さらに、一部のポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を同定するために、ＧｅｎＳｅｑ受託番号および／または学術雑誌の論文の引用が提供されている。
これらのＣＡＳおよびＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受託番号ならびに引用された学術雑誌の論文のそれぞれに関連する要約のページが利用可能であり（例えばＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。ＰＣＴ／特許参考文献の列は、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、治療タンパク質分子を記載している特許および／または公開特許出願に対応する米国特許番号またはＰＣＴ国際公開番号を提供する。生物活性の列は、治療タンパク質分子に関連する生物活性を記載している。例示的な活性アッセイの列は、治療タンパク質または治療タンパク質Ｘの部分を含む本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療活性および／または生物活性を試験するために使用し得るアッセイについて記載している参考文献を提供する。これらの参考文献もその全体が本明細書中に参考として組み込まれている。「好ましい適応症Ｙ」の列は、治療タンパク質Ｘまたは治療タンパク質Ｘの部分を含む本発明のトランスフェリン融合タンパク質によって治療、予防、診断、または寛解させ得る疾患、障害、および／または状態を記載している。本発明には、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている国際公開公報ＷＯ０３／０２０７４６に提供されている治療タンパク質が含まれる。
（実施例１）
ＧＰＩアンカー、ｈＭＵＣ１、およびｍＴＦ発現カセットの調製
ｍＴｆ発現カセット（配列番号１６）を含有するｐＲＥＸ０５４９ベクターをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図３はｐＲＥＸ０５４９のベクターマップを提供する。プライマーＰ０９２２およびＰ０９２３（配列番号７および配列番号８）を一緒にアニーリングし、ｐＲＥＸ０５４９内にＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化部位でライゲーションした。Ｐ０９２２およびＰ０９２３によって形成されたリンカーは、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＸｂａＩ制限部位を含有しており、ＧＰＩアンカーおよびＭＵＣ１ストークをコードしている核酸分子を受け入れるように設計されていた。生じたベクターｐＲＥＸ０６２８は、Ｐ０９２２／Ｐ０９２３リンカーを有するｍＴｆ発現カセットを含有していた。
ｐＲＥＸ０６２８をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した。プライマーＰ０９２４およびＰ０９２５（配列番号９および配列番号１０）をアニーリングして、ＧＰＩアンカーＹＩＲ０１９ｃを形成した。ＹＩＲ０１９ｃを消化したｐＲＥＸ０６２８内にライゲーションして、ベクターｐＲＥＸ０６３４を作製した。
ｈＭＵＣ１のｃＤＮＡを、ヒト乳房腫瘍全ＲＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、プライマーＰ０９５８およびＰ０９５９（配列番号１１および配列番号１２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。生じたｃＤＮＡを、プライマーＰ１０１９およびＰ１０２０（配列番号１３および配列番号１４）を用いて増幅して、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を作製した。生じたＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｈＭＵＣ１を配列番号６に提供する。
ｐＲＥＸ０６３４をＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｈＭＵＣ１をベクター内にライゲーションした。生じたベクターｐＲＥＸ０６６３をディスプレイ発現カセット（ｍＴｆ−ＭＵＣ１−ＧＰＩ）として使用した。
ｐＲＥＸ０６６３を用いて高および低コピー数の酵母発現ベクターを作製した。高コピー数の酵母発現ベクターを作製するために、ベクターをＮｏｔＩで消化することによって、４．１ｋｂのディスプレイ発現カセットをｐＲＥＸ０６６３から除去した。その後、発現カセットを、ＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化されたｐＳＡＣ３５ベクター内にライゲーションして、ベクターｐＲＥＸ０６６７（酵母ディスプレイベクターＩ）がもたらされた。
低コピー数の酵母発現ベクターは、ｐＲＥＸ０６６３をＮｏｔＩで消化し、発現ベクターをＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化されたｐＲＥＸ０６９９内にライゲーションして、ｐＲＥＸ０７２１酵母ディスプレイ（酵母ディスプレイベクターＩＩ）をもたらすことによって作製した。
上述の酵母発現ベクターを用いて、当分野で知られているように酵母細胞および細菌細胞を形質転換させることができる。ベクターは、当分野で知られているように酵母中で発現させることができる。さらに、ランダムペプチドまたはＣＤＲなどのリガンド部分のライブラリーを表示することができる発現されたトランスフェリン融合タンパク質のコレクションを作製して、当分野で知られているように結合剤をスクリーニングするために使用することができる。
（実施例２）
１５量体のランダムライブラリーの構築
新規結合特徴を有するトランスフェリン変異体を選択するために、当分野で知られているＰＣＲニッティング（ｋｎｉｔｔｉｎｇ）手順によって、トランスフェリンのアミノ酸位置２８９〜２９０でランダムな１５量体のライブラリーを構築した（ＭａｒｔｉｎおよびＳｍｉｔｈ（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３９６（２）：２８７〜９５参照）。１５量体のライブラリーを設計したが、結合エピトープを形成するためには通常約７個のアミノ酸しか必要でなく、約１０９個までのライブラリーは設計したライブラリー（３．３×１０１９個）のわずかな一部のみしか及ばない。しかし、１０９個のライブラリーサイズでは、１５量体のライブラリーは、同じ大きさの７量体のライブラリーよりも６．４倍多くの７量体を網羅する。
Ｐ１１７４／Ｐ１２２７を用いてトランスフェリンのＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ配列を含有するＤＮＡ断片を得た後、２つのＰＣＲ反応（それぞれ単一のプライマーＰ１１７２およびＰ１１７３を用いる）を行って一本鎖ＤＮＡを得た。ｓｓＤＮＡを単離し、アニーリングして、ニッティング１５量体のライブラリーを形成した。この操作により、ライブラリーが合成オリゴヌクレオチドの元々の複雑さを維持していることが確実にされた。Ｐ１１７４／Ｐ１２２７を用いて二本鎖のニッティング１５量体のライブラリーをさらに増幅して、十分な量のＤＮＡが得られた。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩで消化し、適切なプラスミドベクター、例えばｐＲＥＸ０９９５（図４）またはｐＲＥＸ０６６７内にクローニングした。
Ｐ１１７２（配列番号１９）
２８９〜２９０の１５量体ランダムペプチドｌｉｂ挿入ニッティング順方向逆方向断片
Ｃ ＣＡＡ ＣＴＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ５６７ ＣＡＴ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＡＧ
ＤＮＡ配列中のそれぞれの位置にランダム性を導入するために、ＬａＢｅａｎおよびＫａｕｆｆｍａｎ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２：１２４９〜５４に従って、ヌクレオチドの混合物（Ａ、Ｇ、ＴおよびＣ）を、事前に決定した比でその位置に取り込ませた。以下に示す混合物は、ストップコドンの頻度を最小限にし、アミノ酸組成を天然のタンパク質と一致させる。
５ １３％のＴ、３２％のＧ、２０％のＣ、３５％のＡ
６ ２４％のＴ、２４％のＧ、２２％のＣ、３０％のＡ
７ ３７％のＴ、２６％のＧ、３７％のＣ
Ｐ１１７３（配列番号２０）
２８９〜２９０の１５量体ランダムペプチドｌｉｂニッティング逆方向プライマー、前方断片用
ＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＧＧ
Ｐ１１７４（配列番号２１）
２８９〜２９０の１５量体ランダムペプチドｌｉｂニッティング順方向プライマー、前方断片用
ＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＴＧＴＡＴＧ
Ｐ１２２７（配列番号２２）
２８９〜２９０の１５量体ランダムペプチドｌｉｂニッティング逆方向プライマー、後方断片用
ＴＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＣＡＧＴＣ
（実施例３）
Ｆｌａｇを表示している酵母細胞の選択
トランスフェリンのＮローブが、ストーク領域ｈｕＭＵＣ１とＧＰＩシグナル配列との融合によって酵母の表面上に表示されている、酵母ディスプレイシステムを確立した。結合剤の選択におけるこの系の有用性を実証するために、Ｆｌａｇタグ配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２３）、またはランダムの１５量体ペプチドライブラリーを、トランスフェリンＮローブのアミノ酸位置２８９に挿入した。その後Ｆｌａｇタグ付けしたトランスフェリンＮローブを表示している酵母ｐＲＥＸ１０１２（図６）を、ランダムの１５量体ペプチドを有するトランスフェリンＮローブを表示している酵母のプールに添加した。この混合集団から、Ｆｌａｇタグ付けしたトランスフェリンＮローブを表示している酵母のみを、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた選択によって回収した。
Ｆｌａｇタグ配列をトランスフェリンのアミノ酸位置２８９内に挿入するために、Ｆｌａｇタグ配列を組み込んだオリゴを合成し、ｐＲＥＸ０６６７ベクター内にＰＣＲニッティングしてｐＲＥＸ０７５９（図７）を作製した。その後、Ｆｌａｇタグ配列を含有するｐＲＥＸ０７５９のＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ断片を使用して、ｐＲＥＸ０９９５（図４）の同じ制限断片を置き換えた。生じたプラスミドｐＲＥＸ１０１２は、Ｆｌａｇタグ付けしたトランスフェリンＮローブ−ＭＵＣ１−ＧＰＩ融合タンパク質を発現する。
１５量体のライブラリーはまた、ｐＲＥＸ０９９５のＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ部位の間にもクローニングした。１５量体のライブラリーの調製を以下に記載する。ライゲーション試料を大腸菌ＤＨ５α内に形質転換させ、形質転換混合物を２つのＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍＬ）の寒天プレートにすべて植えた。すべてのコロニーを収集し、Ｑｉａｇｅｎプラスミドプレッププロトコルを用いて、いくつかのミニプレップカラムを使用して、プラスミドＤＮＡを抽出した。
ｐＲＥＸ１０１２および１５量体のライブラリーの両方のプラスミドＤＮＡを、出芽酵母株ＤＳ１１０１ｃｉｒ°内に形質転換させた。ｐＲＥＸ１０１２の単一コロニーを、スクロース（ＢＭＭ／Ｓ）を含む緩衝最少培地に接種し、終夜培養した。１５量体のライブラリーのすべてのコロニーを収集し、ＢＭＭ／Ｓに接種した。２つの終夜培養物の細胞計数を血球計算機によって決定し、以下の細胞混合物を調製した。
（Ａ）１０３個のｐＲＥＸ１０１２酵母細胞、１０９個の１５量体のライブラリーの酵母細胞と混合（１０：１０７）
（Ｂ）１０３個のｐＲＥＸ１０１２酵母細胞、１０８個の１５量体のライブラリーの酵母細胞と混合（１００：１０７）
細胞混合物を、１ｍｌの細胞遮断溶液（１×ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＢＳＡ）中、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離後（１３０００ｒｐｍで３０秒間）、細胞ペレットを、ビオチン標識した抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２５希釈）を含む１ｍｌの洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中に懸濁させ、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を１ｍｌの洗浄溶液で２回洗浄し、８００□ｌ（Ａ）または１６０□ｌ（Ｂ）の遮断溶液に懸濁させた。細胞懸濁液に２００□ｌ（Ａ）または４０□ｌ（Ｂ）のストレプトアビジンＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、氷上で３０分間インキュベーションした。標識した細胞を、ＭＳカラムを用いて、製造者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従って、未標識の細胞から分離した。標識した細胞を収集し、ＢＭＭ／Ｓアガロースプレートに植え、小コロニーが現れるまで３０℃でインキュベーションした。
２回目の選択は、それぞれのプレートからすべてのコロニーを収集、それらを終夜、３０℃で、５ｍｌのＢＭＭ／Ｓ中で成長させることによって行った。これらの培養物から、１．５のＯＤ６００に等しい細胞を、上述のようにさらなるＭＡＣＳ分離の回に供した。この２回目のスクリーニングからの細胞を、終夜、３０℃で、５ｍｌのＢＭＭ／Ｓ中で培養した。それぞれの選択の前および後の酵母細胞培養物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｇｙのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＡＰＣで標識したヤギ抗マウス検出抗体を用いたＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析は製造者の指示に従って行った。Ｆｌａｇタグ付けした酵母の存在が２回のＭＡＣＳ分離後に明らかとなった（図８）。
（実施例４）
Ａｇａ１ストークディスプレイ
酵母遺伝子ＡＧＡ１の核領域のＤＮＡ配列（成熟タンパク質の残基１１６〜６５８）は、以下のプライマーを用いたＳ２８８ｃ酵母ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得た。
Figure 2010512160
約１．５ｋｂまでのＰＣＲ産物を単離し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。断片を、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＲＥＸ０８５５（図９）内にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α内に形質転換させた。生じたすべてのコロニーを収集し、プラスミドＤＮＡを細胞から単離した。発現カセットをＮｏｔＩ消化によって回収し、ｐＳＡＣ３５内にライゲーションして酵母発現ベクターが得られた。
前述のように、酵母内への形質転換および抗Ｆｌａｇ抗体を用いたＦＡＣＳ。酵母コロニーは、匹敵するＭＵＣ１ストークに基づいた構築体よりも約１０倍高い、高レベルのＮローブの表示を示した（データ示さず）。
単一の酵母コロニーを単離し、プラスミドＤＮＡをこの酵母細胞から抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ消化した後にＮｏｔＩ発現カセットを回収し、ＮｏｔＩで消化したｐＲＥＸ０８５５内にライゲーションして、プラスミドｐＲＥＸ１０８７（図１０）、Ｆｌａｇ−Ｎローブ−Ａｇａ１−ＧＰＩ発現カセットを含有するｐＵＣに基づいたベクターが得られた。Ａｇａ１に対応するＤＮＡ配列の領域の配列決定を行って、その同一性を確認した。この発現カセットはまた、ｐＳＡＣ３５内に逆方向でも移して、ｐＲＥＸ１１０６（図１１）が得られた。
（実施例５）
酵母細胞中で機能する哺乳動物ＧＰＩ変異体の選択
哺乳動物ＧＰＩシグナルは、細胞内輸送、膜貫通シグナルの伝達およびクラスリン非依存性エンドサイトーシスなど、その酵母対応物が果たさない役割を果たす（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、１９９３、２９４：３０５〜３２４）。酵母細胞は、細胞膜を有するだけでなく、哺乳動物細胞には存在しない細胞壁も有し、酵母ＧＰＩの多くは、タンパク質を酵母細胞壁に標的化する独特な配列を有する（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９９、１８１：３８８６〜３８８９）。ヒト胎盤アルカリホスホターゼのＧＰＩは、酵母細胞中ではまったく機能しないことが示されている（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９９、３４：２４７〜２５６）。発現された組換えタンパク質を酵母細胞壁内に結合させることができる新規配列を得る手段として、ｐＲＥＸ０８８５（図９）に基づくが、ｈｕＭＤＰのＧＰＩ配列
Figure 2010512160
 を使用した酵母ディスプレイベクター。この配列は、４つの完全にランダムなコドン（Ｘ）およびいくつかの（下線）合理的な改変を取り込むように改変されており、
Figure 2010512160
 （配列番号２６）、Ｘは任意のアミノ酸である。
ＧＰＩ配列を上述のように改変したＦｌａｇタグ−Ｎローブ−ＭＵＣ１ストーク−ＧＰＩの融合タンパク質を発現する酵母ライブラリーを、出芽酵母株ＤＳ１１０１ｃｉｒ°内に形質転換させた。細胞壁に融合タンパク質が結合したすべての酵母細胞を、ビオチン標識した抗Ｆｌａｇ抗体を用いたＭＡＣＳによって単離した。
２つのオリゴ、Ｐ２０３５およびＰ２０３６（以下参照）をアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼを用いて伸長した。生じたＤＮＡ断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化したｐＲＥＸ０８５５（以下および図９参照）内にライゲーションした。
プライマー
Figure 2010512160
ライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ５α内に形質転換させて、約５×１０５個のコロニーが得られた。すべてのコロニーを収集し、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで消化して発現カセットを回収し、ＳＡＣ３５内にクローニングして酵母発現ライブラリーを作製した。このライブラリーを電気穿孔によってＤＳ１１０１ｃｉｒ°細胞内に形質転換させた。前述のライブラリーの終夜培養物を、ビオチン標識した抗Ｆｌａｇ抗体を用いたＭＡＣＳに供した。単離した細胞を、同じ抗体を用いたＭＡＣＳによってすぐに再度精製した。生じた細胞をＢＭＭＳプレートに植え、ＦＡＣＳおよびＤＮＡ配列分析によって２４個のコロニーを特徴づけた。（Ｆｌａｇスパイクに説明を参照。）
読取り可能な配列を与えた２２個のクローンのうち、７個のみが様々なレベルのディスプレイで完全長のＧＰＩアンカーを有しており（表１）、それらのうちの最良のものは、酵母ＧＰＩアンカーを有する同じ融合タンパク質を発現するｐＲＥＸ１００３ベクターよりも良好であった。
Figure 2010512160
予想外に、クローンの５０％がランダム化されたコドンのうちの１つでストップコドンによって切断されており、ＧＰＩアンカーシグナルが有効に欠失していた。これら１２個のクローンのうち、２つがｐＲＥＸ１００３よりも有意に良好なディスプレイレベルを有することが決定され、ストップコドンの直前にシステイン残基を含有することが見出された（ＣＱＩＧＧＳ＊（配列番号３４）およびＣＱ＊、＊＝ストップコドン）（図１２）。恐らく、これらの構築体は、細胞壁タンパク質中の遊離システイン残基とのジスルフィド結合を解して細胞壁内に架橋結合されていた。
（実施例６）
ＲＧＤライブラリーの構築およびスクリーニング
インテグリン□ＩＩｂ□３と結合し、血小板の凝集を阻害するトランスフェリン変異体の選択には、インテグリン結合配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）の片側に３つのランダム化されたアミノ酸を含むペプチドを、Ｔｆ骨格（ＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣ、Ｘはランダム化位置を表す）内に、トランスフェリンのアミノ酸位置２８９〜２９０でＰＣＲニッティング手順によって挿入することによって、ライブラリーを構築した。
プライマーＰ１９８０／Ｐ２１８１およびＰ２１２７／Ｐ１１７３を用いてｐＲＥＸ１１０６（図１１）を増幅して、断片ＡおよびＢが得られた（図１３）。
Ｐ１１７３
２８９〜２９０のニッティング逆方向プライマー、前方断片用
ＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＧＧ
Ｐ１９８０
ランダムペプチドライブラリーのニッティング順方向プライマーを含有する２８９〜２９０のＲＧＤ、後方断片用
ＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＧＴ５６７５６７５６７ＡＧＡＧＧＡＧＡＣ５６７５６７５６７ＴＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＧ
５ １３％のＴ、３２％のＧ、２０％のＣ、３５％のＡ
６ ２４％のＴ、２４％のＧ、２２％のＣ、３０％のＡ
７ ３７％のＴ、２６％のＧ、３７％のＣ
（ストップコドンの頻度を最小限にし、アミノ酸組成を天然タンパク質に一致するためのヌクレオチド混合物；Ｌａｂｅａｎ，ＴＨおよびＫａｕｆｆｍａｎ，ＳＡ、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２：１２４９〜１２５４）
Ｐ２１２７
２８９〜２９０のニッティング順方向プライマー、前方断片用
ＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧ
Ｐ２１８１
２８９〜２９０のニッティング逆方向プライマー、後方断片用
ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＴＴＧＧＧ
Ｐ２１３９
ギャップ修復ＧＰＩ ｌｉｂ
ＧＡＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧ
プライマーＰ１９８０はランダム化された配列を導入した。増幅したＤＮＡ断片をゲル精製し、単一のプライマー（断片ＡにはＰ２１８１、断片ＢにはＰ２１２７）を用いてさらに増幅して、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−Ａおよびｓｓ−Ｂ）が得られた。ｓｓ−Ａおよびｓｓ−ＢをｄＮＴＰおよびクレノウ酵素の存在下でアニーリングして、二本鎖断片を形成した。最後に、このアニーリング産物を、Ｐ２１２７およびＰ２１３９を用いて増幅し、ゲル精製して、ＲＧＤ−ライブラリー挿入物を作製した。この操作により、ライブラリーが合成オリゴヌクレオチドの元々の複雑さを維持していることが確実にされた。
挿入物を用いて、ＢａｍＨＩ−ＢｓｐＥＩで消化したｐＲＥＸ１１０６内へのギャップ修復によって、以下に提供する電気穿孔方法を使用して、７×１０８個のライブラリーを構築した。それぞれのギャップ修復反応について、１．４□ｇのＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩで消化したｐＲＥＸ１１０６を１□ｇの前述のＲＧＤ−ライブラリー挿入物と混合し、ＤＳ１１０１ｃｉｒ°酵母細胞内に電気穿孔した。
ライブラリーを構築するための酵母（ＤＳ１１０１ｃｉｒ°）の高効率電気穿孔
１）１００ｍＬのＹＥＰ／Ｓ（１％ｗ／ｖの酵母抽出物、２％ｗ／ｖのペプトン、２％ｗ／ｖのスクロース）をＯＤ６００＝０．２まで、ＤＳ１１０１ｃｉｒ°の新鮮な終夜培養物から接種する。
２）細胞を３０℃、２００ｒｐｍで０．８のＯＤ６００まで成長させる（約５時間）。
３）２，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を収集する。
４）上清を傾瀉し、ペレットを１８ｍＬのＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭのＥＤＴＡ）バッファーに再懸濁させる。その後、２ｍＬの１Ｍの酢酸リチウムを加える。
５）細胞を３０℃、ローラードラム内で４５分間インキュベーションする。
６）０．５ｍＬの１ＭのＤＴＴを加える。
７）１５分間、３０℃、ローラードラム内でインキュベーションする。
８）室温で８０ｍＬの滅菌水で洗浄する。
９）室温で１００ｍＬの滅菌水でペレットを洗浄する。
１０）１０ｍＬの氷冷の１Ｍのソルビトールでペレットを洗浄する。
１１）細胞を６０μＬの氷冷の１Ｍのソルビトール（６つの形質転換に十分）に再懸濁させる。
１２）細胞を氷上に保ち、滅菌微量遠心チューブ中で以下を混合する：
ｉ．５０μＬのコンピテントな酵母細胞
ｉｉ．１．４μｇのＤＮＡ（５μＬまで）
ｉｉｉ．５μｇのｓｓＤＮＡ（０．５μｌの１０ｍｇ／ｍＬ）
１３）律動前に氷上で５分間インキュベーションする。細胞／ＤＮＡ懸濁液を０．２ｃｍの氷冷キュベットの底に軽く叩き落し、１回律動をかける：
ｉ．電位 １．５Ｋｖ
ｉｉ．電気容量 ２５□Ｆ
ｉｉｉ．抵抗 ２００Ω
１４）すぐに１ｍＬのＹＥＰ／Ｓと１Ｍのソルビトールの５０：５０混合物を加え、酵母を微量遠心チューブに移し、３０℃で１時間、酵母を回復させる（回復の必要がない場合もある、試験が必要）。
１５）細胞を５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離によって収集し、１ｍＬの１Ｍのソルビトールで１回洗浄する。
１６）１ｍＬの１Ｍのソルビトールに再懸濁させ、ＢＭＭ／Ｓプレートに拡げる。３０℃でインキュベーションする。
□ＩＩｂ□３に対する高親和性トランス体を、ヒト血小板から精製したインテグリンでコーティングしたプレート上の酵母ディスプレイライブラリーから選択した。□ＩＩｂ□３インテグリンの精製は、軽微な変更を加えたＨｉｌｌｍａｎ他に従って実施した（Ｈｉｌｌｍａｎ他、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、２５（３）：４９４〜５０２）。インテグリンをコーティングバッファー（５０ｍＭのホウ酸バッファー、ｐＨ９．５）で希釈し（１：３０希釈）、ペトリ皿に終夜、４℃でコーティングした。バッファーＡ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｎＣｌ２）で３回すすいだ後、プレートを２時間、室温で、結合バッファー＋１％のＢＳＡを用いて遮断した。プレート上の４０ＯＤ６００単位の、ＢＭＭ／Ｓ（２％ｗ／ｖのスクロース）中、３０℃、２００ｒｐｍで成長させた終夜酵母ＲＧＤライブラリーを遠心分離によって収集し、１％のＢＳＡおよびＧＲＧＤＳＰ阻害ペプチド（１回目の選択には１□ｇ／ｍＬ、２回目の選択には１０□ｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬの結合バッファーに再懸濁させ、コーティングしたインテグリンと共に２時間、室温で穏やかに振盪しながらインキュベーションした。結合バッファーで３回洗浄することで未結合の細胞を洗浄除去し、結合した細胞を収集した。
可溶性タンパク質の産生
ＲＧＤ配列を含有するＮローブのＤＮＡコード領域を酵母ディスプレイベクターから回収し、酵母発現ベクター内にクローニングして、ＲＧＤ配列を含有する可溶性Ｔｆ分子を産生させた。これらは高細胞密度の流加発酵で発現させ、カラムクロマトグラフィーによって精製した。天然の□ＩＩｂ□３リガンドの配列と比較した選択されたクローンの配列の例を以下に提供する。
Figure 2010512160
インテグリン結合分析
ＲＧＤトランス体とインテグリンの直接結合をＥＬＩＳＡによって測定した。インテグリンをコーティングバッファーに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート上に終夜、４℃でコーティングした。プレートを、１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（結合バッファー）を含有するバッファーＡで、２時間、室温で振盪しながら遮断した。結合バッファーに希釈したトランス体をインテグリンと４℃、終夜で結合させた。未結合の物質を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（洗浄バッファー）を含有するバッファーＡで洗浄した。結合した物質を、結合バッファー中のビオチン標識した抗トランスフェリンおよびストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出し、それぞれのステップ後に洗浄バッファーで洗浄した。結合の定量は、ＳｐｅｃｒｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭおよびＳｏｆｔＭａｘソフトウェアで、ＱｕａｎｔａＢｌｕｅ蛍光基質を用いて行った。図１４を参照されたい。
トランス体の結合はまた、競合ＥＬＩＳＡアッセイ様式でも評価した。インテグリンをコーティングし、プレートを上記のように遮断した。結合バッファー中のトランス体、または調節ペプチド、およびビオチン標識したフィブロネクチンを適切なウェルに加え、終夜４℃で結合させた。プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて結合したフィブロネクチンを検出した。結合の定量は上記のように行った。図１５を参照されたい。
血小板凝集分析
血小板凝集アッセイを、マウス血小板リッチな血漿（ＰＲＰ）を用いて行った。新鮮な血小板をＢ６マウスから得た。使用のために血小板を２．５×１０８個／ｍＬまで希釈した。血小板の凝集は、凝集系を用いて、３７℃で攪拌しながら（９００ｒｐｍ）測定した。試験試料をＰＲＰと共に１０分間インキュベーションした後、ＡＤＰ（１０μＭ）を加えた。血小板の凝集の程度を、濁度測定によって６分間連続的に監視し、光透過率の増加として表した。図１６を参照されたい。
（実施例７）
ＭＵＣ３ストークの遺伝子操作
酵母の表面にタンパク質を表示させるために、ヒトＭＵＣ３（ｈＭＵＣ３）タンパク質をディスプレイストークとして最適化した。反復の一部を除去し、酵母用に最適化した合成オリゴヌクレオチドコドンによる構築を可能にするためにｈＭＵＣ３のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０２２７２）を改変した。生じたｈＭＵＣ３ストークの配列（以下の配列参照）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙによって合成した。
改変ｈＭＵＣ３のＤＮＡは、酵母ディスプレイベクター内にある場合、大腸菌中で不安定であることが判明した。ｈＭＵＣ３のＤＮＡ配列を、ランダム突然変異誘発および大腸菌中で安定なクローンの選択によってさらに遺伝子操作した。ｈＭＵＣ３のＤＮＡ配列を、エラープローンＰＣＲ、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による２回のランダム突然変異誘発に供した。生じたＰＣＲ断片をＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＲＥＸ０８５５内にライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換させた。細胞を植え、終夜成長させ、バイオマスのすべてをプレートから回収した。プラスミドＤＮＡを回収し、ＮｏｔＩ／ＸｍｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。正しい大きさのＤＮＡバンドをゲルから切り出して精製した。ｈＭＵＣ３ストークを有するＮｏｔＩディスプレイカセットを含有する生じたＤＮＡを、酵母中のギャップ修復によって、ｐＳＡＣ３５に基づいた酵母ディスプレイベクターｐＲＥＸ１００３内にクローニングした。
生じたすべての酵母をＢＭＭ／Ｓ培地中で培養し、抗ＦＬＡＧ抗体でコーティングしたプレート上のパニング選択に供した。抗Ｆｌａｇ抗体（ＳｉｇｍａのＦ９２９１）をコーティングバッファー（５０ｍＭのホウ酸バッファー、ｐＨ９．５）に希釈し（１：２５希釈）、ペトリ皿上に終夜、４℃でコーティングした。結合バッファー（ＰＢＳ−Ｔ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）で３回すすいだ後、プレートを結合バッファーで２時間、室温で遮断した。４０ＯＤ６００単位の終夜酵母培養物を収集し、１０ｍＬの結合バッファーに懸濁させ、コーティングした抗体で２時間、室温で、穏やかに振盪しながらインキュベーションした。未結合の細胞を、結合バッファーを用いた３回の洗浄で洗浄除去し、結合した細胞を収集した。
ＦＡＣＳ分析によって実証されるように、結合剤は高レベルのタンパク質のディスプレイを示した（図１７）。個々のクローンを単離して、大腸菌中で安定であり、かつ酵母中で高レベルのディスプレイを与えるｈＭＵＣ３のＤＮＡ配列が得られた。
改変ヒトＭＵＣ３遺伝子（配列番号７６）
Figure 2010512160
（実施例８）
表面露出トランスフェリンアミノ酸残基のランダム化
トランスフェリン融合タンパク質ライブラリーは、Ｔｆ分子内のいくつかの点における表面露出アミノ酸残基、例えば６個の表面露出残基のランダム化によって作製することができ、すなわちこれは挿入ではない。これらの残基は連続的である必要はないが、好ましくは、分子の本体から離れて溶媒相中に突出している側鎖の領域として群化されている。６個の表面露出残基を有するライブラリーは、約１０７個までのタンパク質しか必要とせず、したがって、１つのライブラリーあたり２０〜４０個の形質転換しか必要としない（プライマーの品質に依存する）。
３つの可能な部位の例は、以下のとおりである。
Figure 2010512160
（実施例９）
哺乳動物細胞の表面上でのトランスフェリン融合タンパク質の発現
材料および方法
ＨＥＫ−２９３細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、およびＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で成長させて維持した。
ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＰ）ＧＰＩのＤＮＡ配列を、プライマーＰ０９２６およびＰ０９２７をアニーリングし、その後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで伸長させることによって作製した。
Figure 2010512160
ＰＣＲ反応条件は、９４℃で１分間、２５サイクルの９４℃で４０秒間、５５℃で４０秒間および７２℃で２分間、次いで７２℃で７分間の伸長であった。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ｐＲＥＸ０７５７（図１８）ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位内にクローニングし、これにより酵母のＧＰＩ配列が除去され、その後、配列決定した。生じたプラスミドｐＲＥＸ１２３４（図１９）は、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを有し、Ｃ末端にヒトＧＰＩ配列を有する改変トランスフェリン（ｍＴｆ）を含有していた。このｍＴｆカセットを、以下の条件下でプライマーＰ２２２５およびＰ２２２６を用いたＰＣＲによって哺乳動物発現ベクター内にクローニングするために、５’および３’末端を改変した：９４℃で１分間、２５サイクルの９４℃で４０秒間、５５℃で４０秒間および７２℃で２分間、次いで７２℃で７分間の伸長。
Figure 2010512160
このＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）内にクローニングしてｐＲＥＸ１２３５（図２０）を作製した。ｐＲＥＸ１２３５中のｍＴｆカセットの配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
ＨＥＫ−２９３細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者のプロトコルに従って、ｐＲＥＸ１２３５で形質移入した。細胞を１×リン酸緩衝液（１×ＰＢＳ）で洗浄し、細胞溶解バッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ）ならびにＨａｌｔ（商標）ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）の混合物を用いて、終夜４℃で溶解した。細胞を３０分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃でペレット化した。上清を収集し、抗Ｆｌａｇアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と２時間４℃で結合させた。ペレットを溶解バッファーで１回、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２回、および１×ＰＢＳで１回洗浄した。試料をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料ローディングバッファー＋試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶出させた。回収されたタンパク質をＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％のビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に流し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）移動バッファーを用いて製造者の指示に従って、ＰＶＤＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）膜に移した。ブロットをＰＢＳ−Ｔ（１×ＰＢＳ＋０．２％のＴｗｅｅｎ−２０）中に５％の無脂肪乾燥乳で、１時間室温で遮断し、ＦＬＡＧ（１：１０００のマウス抗ＦＬＡＧ ＢｉｏＭ２；Ｓｉｇｍａ）またはヒトトランスフェリン（１：４０００のビオチン標識したニワトリ抗ヒトトランスフェリン；Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のどちらかに対するビオチン標識した一次抗体を用いて２時間室温（ＲＴ）でプロービングし、ストレプアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）（１：２５００のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ストレプアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート；Ｐｉｅｒｃｅ）と共に１時間室温でインキュベートした。あるいは、表面ビオチン化実験には、ブロットを、ＳＡ−ＨＲＰ（１：２５００；Ｐｉｅｒｃｅ）のみを用いてプロービングした。すべてのブロットは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ長期間基質（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて展開し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（ｖ．４．５．０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＦｌｕｏｒ−Ｓ（商標）ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で可視化した。
ＨＥＫ−２９３細胞を上述のように２４時間形質移入した。細胞を滅菌した氷冷の１×ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を１×ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理し、揺れプラットフォーム上で２時間、４℃でインキュベーションした。表面ビオチン化後、細胞をクエンチバッファー（１×ＰＢＳ＋１００ｍＭのグリシン）で３回洗浄し、上述のように免疫沈降および免疫ブロッティングを行うために細胞溶解バッファーに再懸濁させた。
ＨＥＫ−２９３細胞を上述のように２４時間形質移入した。細胞を滅菌した１×ＰＢＳで１回洗浄し、その後、さらなる１×ＰＢＳに再懸濁させ、計数した。４．２５×１０５個の細胞／試料を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。細胞を４０００ｒｐｍ、３分間、４℃でペレット化した。その後、細胞を１×ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３０分間、室温で遮断し、遠心分離し、一次抗体（１：２５〜１：６２５のマウス抗ＦＬＡＧ ＢｉｏＭ２；Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させ、３０分間、室温でインキュベーションした。細胞を１×ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、二次抗体（１：１００のヤギ抗マウス−ＡＰＣ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に再懸濁させ、３０分間、室温でインキュベーションした。１×ＰＢＳ−Ｔで２回さらに洗浄した後、細胞を細胞バッファー（Ａｇｉｌｅｎｔ）に再懸濁させて細胞を２×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度にし、製造者の指示に従って細胞蛍光チップ（細胞蛍光ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット、Ａｇｉｌｅｎｔ）に載せた。すべてのＦＡＣＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーおよび２１００ソフトウェアを用いて行った。
結果
ｐＲＥＸ１２３５またはモックで形質移入した細胞のどちらかの溶解物を、抗ＦＬＡＧ−アガロースビーズを用いた免疫沈降、次いでウェスタンブロッティングに供した。抗ＦＬＡＧまたは抗トランスフェリン抗体のどちらかを用いたウェスタンブロットのプロービングにより、トランスフェリンおよびＦＬＡＧ部分の両方の存在が明らかに実証された（図２１）。
ｐＲＥＸ１２３５またはモックで形質移入した細胞を表面ビオチン標識した後、溶解し、抗ＦＬＡＧ−アガロースを用いた免疫沈降およびストレプアビジン−ＨＲＰを用いたウェスタンブロッティングに供した。表面ビオチン化は、露出した血漿膜タンパク質のみがウェスタンブロッティングで検出されることを確実にする。予測された分子量のＦＬＡＧで沈殿可能なタンパク質が観察され、これは、ＦＬＡＧ−トランスフェリンの融合が細胞表面上に発現されていることを実証している（図２２）。
さらに、形質移入した細胞を蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析に供した。ｐＲＥＸ１２３５で形質移入した細胞では、モックで形質移入した細胞と比較して４倍の染色の増加が観察され、これは、ＦＬＡＧ−トランスフェリンの融合の細胞表面発現を明らかに実証している（図２３）。
本発明を、上記実施例を参照しながら詳述したが、本発明の精神から逸脱せずに様々な改変を行うことができることを理解されよう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願中で言及したすべての引用した特許、特許出願および出版物は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。

Claims (118)

  1. （ａ）トランスフェリン（Ｔｆ）部分および
    （ｂ）インテグリン結合部分
    を含む融合タンパク質。
  2. 前記融合タンパク質がストーク部分をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記融合タンパク質が細胞壁連結メンバーをさらに含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. トランスフェリン部分がストーク部分と直接融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
  5. 融合タンパク質がアンカー部分をさらに含む、請求項１から３に記載の融合タンパク質。
  6. トランスフェリン部分がトランスフェリンタンパク質、改変トランスフェリンタンパク質またはその断片である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. トランスフェリンタンパク質がヒトトランスフェリンタンパク質である、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. トランスフェリン部分が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
  9. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＮドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  10. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＮドメインからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  11. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＮドメインの一部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  12. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＣドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  13. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＣドメインからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  14. Ｔｆ部分がＴｆタンパク質のＣドメインの一部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  15. Ｔｆ部分が減少したグリコシル化を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
  16. Ｔｆ部分が、トランスフェリン受容体に対して低下した結合親和性を示すように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  17. Ｔｆ部分がトランスフェリン受容体と結合しない、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  18. Ｔｆ部分が、鉄に対して低下した親和性を示すように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  19. Ｔｆ部分が鉄と結合しない、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  20. Ｔｆ部分が、炭酸水素に対して低下した親和性を有するように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  21. Ｔｆ部分が炭酸水素と結合しない、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  22. Ｔｆ部分が、グリコシル化部位、鉄結合部位、ヒンジ部位、炭酸水素部位、および受容体結合部位からなる群からの１つまたは複数の部位で改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  23. Ｔｆ部分が、グリコシル化を防止する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  24. 突然変異が、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを含むＮ結合型グリコシル化部位である、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  25. 配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔが、配列番号３のＮ４１３またはＮ６１１に対応するアミノ酸から開始される、請求項２３に記載の融合タンパク質。
  26. Ｎ、Ｘ、ＳまたはＴがプロリンに変更されている、請求項２４に記載の融合タンパク質。
  27. Ｔｆ部分が、配列番号３のアミノ酸Ｓ４１５およびＴ６１３での突然変異を含む、２２に記載の融合タンパク質。
  28. Ｔｆ部分が、配列番号３のアミノ酸Ｓ４１５またはＴ６１３での突然変異を含む、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  29. トランスフェリン部分が、グリコシル化を示さないように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  30. インテグリン結合部分がＴｆ部分のＮ末端と融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
  31. インテグリン結合部分がＴｆ部分のＣ末端と融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
  32. インテグリン結合部分がトランスフェリン部分内に挿入されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  33. インテグリン結合部分がトランスフェリンのアミノ酸位置２８９〜２９０（配列番号３）内に挿入されている、請求項２８に記載の融合タンパク質。
  34. インテグリン結合部分がトランスフェリン部分の表面露出ループ内に挿入されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
  35. インテグリン結合部分が、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、または２０個以上のアミノ酸からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  36. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＲＧＤを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  37. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸）を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  38. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＸＸＸＲＧＤＸＸＸ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸）を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  39. インテグリン結合部分がさらに、アミノ酸配列ＲＧＤのＮ末端およびＣ末端で１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  40. インテグリン結合部分がさらに、アミノ酸配列ＲＧＤのＮ末端またはＣ末端で１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  41. トランスフェリン部分およびインテグリン結合部分がトランス体を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  42. インテグリン結合部分がインテグリンαＩＩｂβ３と結合することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  43. インテグリン結合部分がα４インテグリンと結合することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  44. インテグリン結合部分が血小板の凝集を阻害することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
  45. トランスフェリン部分がストーク部分のＮ末端と融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
  46. ストーク部分がＴｆ部分のＣ末端と融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
  47. ストーク部分が高度にグリコシル化されたペプチドである、請求項２に記載の融合タンパク質。
  48. ストーク部分が酵母ＡＧＡ１タンパク質またはその断片を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  49. ストーク部分がムチンドメインまたはムチン様ドメインを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  50. ムチンドメインが、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１０、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０およびＭＵＣ２１ならびにその変異体、誘導体および類似体および断片からなる群のうちの１つまたは複数のタンパク質を含有する、請求項４８に記載の融合タンパク質。
  51. ストーク部分がヒトＭＵＣ１タンパク質またはその変異体もしくは断片を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  52. ストーク部分が配列番号５の核酸によってコードされている、請求項５０に記載の融合タンパク質。
  53. ストーク部分がヒトＭＵＣ３タンパク質またはその変異体もしくは断片を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  54. ストーク部分がトランスフェリン部分と宿主細胞または基質との間の立体障害を減少させるように機能する、請求項２に記載の融合タンパク質。
  55. ストーク部分がアンカー部分のＮ末端と融合している、請求項５に記載の融合タンパク質。
  56. アンカー部分がストーク部分のＣ末端と融合している、請求項５に記載の融合タンパク質。
  57. アンカー部分がグリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）またはその誘導体もしくは断片である、請求項５に記載の融合タンパク質。
  58. ＧＰＩが酵母ＧＰＩシグナル配列またはその断片を含む、請求項５６に記載の融合タンパク質。
  59. ＧＰＩシグナル配列が配列番号１５を含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
  60. ＧＰＩが哺乳動物のＧＰＩシグナル配列またはその断片を含む、請求項５６に記載の融合タンパク質。
  61. アンカー部分が改変ＧＰＩシグナル配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
  62. 改変ＧＰＩシグナル配列が配列番号２６の位置１でシステイン残基を含有する、請求項６０に記載の融合タンパク質。
  63. 改変ＧＰＩシグナル配列が、配列番号３４の最初の２個のアミノ酸ならびに配列番号３４、３６、および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項６０に記載の融合タンパク質。
  64. 細胞壁連結メンバーが細胞壁と共有結合している、請求項３に記載の融合タンパク質。
  65. 細胞壁連結メンバーが細胞壁と非共有結合している、請求項３に記載の融合タンパク質。
  66. 細胞壁連結メンバーがストーク部分である、請求項３に記載の融合タンパク質。
  67. 細胞壁連結メンバーがアンカー部分である、請求項３に記載の融合タンパク質。
  68. アンカー部分が膜貫通ドメインである、請求項６６に記載の融合タンパク質。
  69. 細胞壁連結メンバーが、細胞壁中の１つまたは複数のタンパク質とジスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数の遊離システイン残基を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
  70. 細胞壁連結メンバーが、細胞壁のβ−グルカンと架橋結合することができるストーク部分の１つまたは複数のグリカンを含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
  71. （ａ）アルブミン部分および
    （ｂ）インテグリン結合部分
    を含む融合タンパク質。
  72. ストーク部分をさらに含む、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  73. 細胞壁連結メンバーをさらに含む、請求項７０または７１に記載の融合タンパク質。
  74. アルブミン部分がアルブミンタンパク質、改変アルブミンタンパク質またはその断片である、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  75. アルブミンタンパク質がヒトアルブミンタンパク質である、請求項７２に記載の融合タンパク質。
  76. アンカー部分をさらに含む、請求項７０から７３に記載の融合タンパク質。
  77. 膜貫通ドメインをさらに含む、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  78. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＲＧＤを含む、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  79. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  80. インテグリン結合部分がアミノ酸配列ＸＸＸＲＧＤＸＸＸ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  81. さらにインテグリン結合部分が、アミノ酸配列ＲＧＤのＮ末端およびＣ末端で１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項７７に記載の融合タンパク質。
  82. さらにインテグリン結合部分が、アミノ酸配列ＲＧＤのＮ末端またはＣ末端で１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項７７に記載の融合タンパク質。
  83. インテグリン結合部分がインテグリンαＩＩｂβ３と結合することができる、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  84. インテグリン結合部分が血小板の凝集を阻害することができる、請求項７０に記載の融合タンパク質。
  85. 請求項１から８３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードしている核酸分子。
  86. 請求項８４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  87. 請求項１から８３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞。
  88. 酵母細胞である、請求項８５に記載の宿主細胞。
  89. 酵母細胞がサッカロマイセスまたはピキアである、請求項８７に記載の宿主細胞。
  90. 請求項１または７０に記載の複数の融合タンパク質を含むライブラリー。
  91. 請求項２または７１に記載の複数の融合タンパク質を含むライブラリー。
  92. 複数の融合タンパク質を含有するライブラリーであって、それぞれの融合タンパク質が少なくとも１つの第２のペプチドと融合した第１のトランスフェリン（Ｔｆ）ペプチドを含み、前記第２のペプチドがインテグリン結合配列を含有するライブラリー。
  93. インテグリン結合配列がアミノ酸配列ＲＧＤを含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  94. 第２のペプチドがアミノ酸配列ＣＸＸＸＲＧＤＸＸＸＣ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  95. 第２のペプチドがアミノ酸配列ＸＸＸＲＧＤＸＸＸ（式中、Ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  96. さらに第２のペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤの両側に１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  97. さらに第２のペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤの片側に１つまたは複数のランダム化されたアミノ酸を含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  98. トランスフェリンタンパク質および第２のペプチドがトランス体を含む、請求項９１に記載のライブラリー。
  99. インテグリン結合配列がインテグリンαＩＩｂβ３と結合することができる、請求項９１に記載のライブラリー。
  100. インテグリン結合配列が血小板の凝集を阻害することができる、請求項９１に記載のライブラリー。
  101. 請求項８９、９０または９１に記載の前記ライブラリーを薬剤に曝露し、少なくとも１つの融合タンパク質と前記薬剤との結合を検出することを含む、インテグリン結合配列の結合活性をスクリーニングする方法。
  102. ライブラリーが酵母細胞中で発現される、請求項１００に記載の方法。
  103. 薬剤がインテグリンである、請求項１００に記載の方法。
  104. 複数のトランスフェリンタンパク質を含むトランスフェリンタンパク質のライブラリーであって、それぞれのトランスフェリンタンパク質が少なくとも約３個のランダムに突然変異したアミノ酸残基を含有し、前記少なくとも約３個のランダムに突然変異したアミノ酸がトランスフェリンの１つの表面露出領域内に位置するライブラリー。
  105. それぞれのトランスフェリンタンパク質が少なくとも約４個のランダムに突然変異したアミノ酸残基を含む、請求項１０３に記載のライブラリー。
  106. 前記トランスフェリンタンパク質が少なくとも約５個のランダムに突然変異したアミノ酸残基を含む、請求項１０３に記載のライブラリー。
  107. 前記トランスフェリンタンパク質が少なくとも約６個のランダムに突然変異したアミノ酸残基を含む、請求項１０３に記載のライブラリー。
  108. 前記少なくとも３個のアミノ酸残基が、Ｙ８５、Ｇ８６、Ｓ８７、Ｅ８９、Ｄ９０、Ｑ９２、Ｋ２７６、Ｄ２７７、Ｋ２８０、Ｑ２８３、Ｓ２８６、Ｄ２９７、Ｓ２９８、Ｈ２０７、Ｓ２０８、Ｆ２１１、Ｅ２１２、Ａ２１５、Ｎ２１６およびＫ２１７からなる群から選択される、請求項１０３に記載のライブラリー。
  109. 前記トランスフェリンの表面露出領域が、アミノ酸残基約８５〜約９２、アミノ酸残基約２７６〜約２９８、およびアミノ酸残基約２０７〜約２１７からなる領域の群から選択される、請求項１０３に記載のライブラリー。
  110. さらにそれぞれのトランスフェリンタンパク質がストーク部分と融合している、請求項１０３に記載のライブラリー。
  111. （ａ）トランスフェリン部分、
    （ｂ）ストーク部分、および
    （ｃ）細胞壁連結メンバー
    を含む融合タンパク質。
  112. 前記トランスフェリン部分が少なくとも約３個の突然変異した表面露出アミノ酸残基を含む、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  113. 前記少なくとも約３個の突然変異した表面露出アミノ酸残基が、Ｙ８５、Ｇ８６、Ｓ８７、Ｅ８９、Ｄ９０、Ｑ９２、Ｋ２７６、Ｄ２７７、Ｋ２８０、Ｑ２８３、Ｓ２８６、Ｄ２９７、Ｓ２９８、Ｈ２０７、Ｓ２０８、Ｆ２１１、Ｅ２１２、Ａ２１５、Ｎ２１６およびＫ２１７からなる群から選択される、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  114. 前記少なくとも３個の突然変異したアミノ酸残基が、アミノ酸残基約８５〜約９２、アミノ酸残基約２７６〜約２９８、およびアミノ酸残基約２０７〜約２１７からなる領域の群から選択されるトランスフェリンの１つの表面露出領域内に位置する、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  115. 前記トランスフェリン部分が少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０個の表面露出アミノ酸残基を含む、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  116. ストーク部分が１つまたは複数のランダム化された突然変異を含有する、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  117. ストーク部分がＭＵＣ３変異体を含む、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
  118. ＭＵＣ３変異体が配列番号７６の配列を含む、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
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