CN101519449A - 经修饰的运铁蛋白融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了运铁蛋白和治疗性蛋白质或肽的经修饰的融合蛋白，其血清半寿期延长或血清稳定性增加。优选的融合蛋白包括经过修饰使运铁蛋白组分不显示或显示降低的糖基化、与铁的结合和/或与运铁蛋白受体的结合的那些融合蛋白。

Description

经修饰的运铁蛋白融合蛋白

此案是申请日为2002年8月30日、中国申请号为02821637.7、发明名称为“经修饰的运铁蛋白融合蛋白”的发明申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2001年8月30日提交的美国临时申请60/315,745和2001年11月30日提交的美国临时申请60/334,059的优先权，这两份申请都全文列入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及血清稳定性增加或血清半寿期延长的治疗性蛋白质或肽，具体涉及与运铁蛋白分子融合或插入运铁蛋白分子的治疗性蛋白质或肽，所述分子经过修饰，从而降低或抑制了糖基化、铁结合和/或运铁蛋白受体结合。

背景技术

天然状态或重组产生的治疗性蛋白质或肽一般是不稳定的分子，其表现出短时间的血清稳定性或短的血清半寿期。另外，当对这些分子进行配制，尤其是配制成水溶液供诊断和治疗用时，它们经常十分不稳定。

实践中，有几种方法可以延长或促进蛋白质类治疗性分子的体内或体外稳定性。聚乙二醇(PEG)是一种能与蛋白质结合，导致蛋白质作用时间延长、活性得以持续的物质。如果与PEG的结合能延长蛋白质的活性，施用蛋白质的频率即可降低。然而，PEG结合经常会降低或破坏蛋白质的治疗活性。

与能延长治疗性蛋白质的血清半寿期的异源蛋白质融合也能使治疗性蛋白质或肽稳定化。例如，与非融合状态的治疗性蛋白质相比，与白蛋白和抗体片段融合的治疗性蛋白质表现出延长的血清半寿期，参见美国专利5,876,969和5,766，88。

另一种血清蛋白质，即糖基化的人运铁蛋白(Tf)也被用于与治疗性蛋白质融合，从而在细胞内进行靶向传递，或者携带异源物质穿越血-脑屏障。通过使全长Tf与神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)融合，用这些含有糖基化人Tf的融合蛋白使NGF或CNTF靶向穿越血-脑屏障。参见美国专利5,672,683和5977,307。在这些融合蛋白中，分子的Tf部分被糖基化并与两个铁原子结合，这是Tf与细胞上的Tf受体结合所必需的，根据所述专利发明人的说法，这也是Tf穿越血-脑屏障靶向传递NGF或CNTF组成成分所必需的。通过将HIV-1蛋白酶序列插入糖基化运铁蛋白表面暴露的环中，也可产生运铁蛋白融合蛋白，籍此研究产生另一种Tf融合蛋白形式的能力，所述融合蛋白经由Tf受体靶向传递至细胞内部(Ali等，(1999)J.Biol.Chem.274(34)：24066-24073)。

血清运铁蛋白(Tf)是分子量为80,000道尔顿的单体糖蛋白，它与循环中的铁结合，并经由运铁蛋白受体(TfR)将铁转运至多个组织(Aisen等，(1980)Ann.Rev.Biochem.49：357-393；MacGillivray等，(1981)J.Biol.Chem.258：3543-3553，美国专利5,026,651)。Tf是最常见的血清分子之一，它含有高达约5-10％的总血清蛋白质。在酗酒者的血液中，糖缺损运铁蛋白的水平与糖基化运铁蛋白相比有所升高，且表现出较长的半寿期(约14-17天)。参见vanEijk等，(1983)Clin.Chim.Acta132：167-171，Stibler(1991)Clin.Chem.37：2029-2037(1991)，Arndt(2001)Clin.Chem.47(1)：13-27和Stibler等，“Carbohydrate-deficient consumption”，Advances in the Biosciences，(EdNordmann等)，Pergamon，1988，Vol.71，pages 353-357)。

已清楚了解Tf的结构，并阐明受体结合、铁结合与释放以及碳酸根离子结合的机理(美国专利5,026,651，5,986,067和MacGillivray等，(1983)J.Biol.Chem.258(6)：3543-3546)。

作为一种癌症疗法，已使用运铁蛋白和能结合运铁蛋白受体的抗体传递或携带毒性药剂至肿瘤细胞(Baselga和Mendelsohn，1994)，运铁蛋白已被用作非-病毒基因治疗载体，用于将DNA传递至细胞中(Frank等，1994；Wagner等，1992)。已用几种蛋白质和肽阐明：使用运铁蛋白受体作为入点能将蛋白质传递至中枢神经系统(CNS)，所述蛋白质和肽包括CD4(Walus等，1996)，得自脑的神经营养因子(Pardridge等，1994)，得自胶质的神经营养因子(Albeck等)，vasointestinal肽类似物(Bickel等，1993)，β淀粉样肽(Saito等，1995)，和反义寡核苷酸(Pardridge等，1995)。

然而，尚未修饰或改造过运铁蛋白融合蛋白，以延长治疗性蛋白质或肽的血清半寿期，或通过降低或抑制Tf组成成分的糖基化来提高生物可用性，或降低或防止铁和/或Tf受体结合。

发明简述

如下文所详述，本发明包括经修饰的Tf融合蛋白，其含有至少一种治疗性蛋白质、多肽或肽实体，其中Tf部分已被改造以延长分子的血清半寿期或提高其生物可用性。本发明还包括含有该融合蛋白的药物制剂和组合物，通过与经修饰的运铁蛋白融合以增强治疗性蛋白质的血清稳定性、延长血清半寿期和提高生物可用性的方法，编码经修饰Tf融合蛋白的核酸分子等。本发明的另一方面涉及用经修饰的Tf融合蛋白治疗患者的方法。

在优选实施方案中，经修饰的Tf融合蛋白含有经修饰可降低或防止糖基化和/或铁和受体结合的人运铁蛋白Tf组成成分。

本发明还涉及：

1.含有与至少一种治疗性蛋白质或肽融合的运铁蛋白(Tf)蛋白质的融合蛋白，所述运铁蛋白表现出降低的糖基化。

2.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽的血清半寿期高于治疗性蛋白质或肽在非融合状态的血清半寿期。

3.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的C-末端融合。

4.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的N-末端融合。

5.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入Tf的至少一个环中。

6.项1的融合蛋白，其中Tf蛋白对TfR的亲和性降低。

7.项1-5中任一项的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。

8.项6的融合蛋白，其中TF蛋白不与TfR结合。

9.项1的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁的亲和性降低。

10.项9的融合蛋白，其中Tf蛋白不与铁结合。

11.项1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有至少一个能防止糖基化的突变。

12.项11的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。

13.项1的融合蛋白，它在衣霉素的存在下表达。

14.项1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白C结构域的一部分。

15.项14的融合蛋白，其中桥连肽将治疗性蛋白质或肽与Tf连起来。

16.项14的融合蛋白，其中所述治疗性蛋白质、肽或多肽被插入Tf蛋白的N结构域和C结构域之间。

17.项1的融合蛋白，其中Tf蛋白在绞链区具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。

18.项17的融合蛋白，其中所述绞链区选自大约残基94至大约残基96，大约残基245至大约残基247，大约残基316至大约残基318，大约残基425至大约残基427，大约残基581至大约残基582和大约残基652至大约残基658。

19.项1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白在选自下列的位置处具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加：Asp 63，Gly 65，Tyr 95，Tyr 188，Lys 206，His 207，His 249，Asp 392，Tyr 426，Tyr 514，Tyr 517，His 585，Thr 120，Arg 124，Ala 126，Gly 127，Thr 452，Arg 456，Ala 458和Gly 459。

20.项5的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽取代至少一个环。

21.项11的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413，N611的氨基酸残基。

22.项6或8的融合蛋白，其中Tf在对应于选自下列氨基酸的氨基酸残基处含有至少一个氨基酸取代、缺失或添加：Asp 63，Gly 65，Tyr 95，Tyr 188，Lys 206，His 207，His 249，Asp 392，Tyr 426，Tyr 514，Tyr 517，His 585，Thr 120，Arg 124，Ala 126，Gly 127，Thr 452，Arg 456，Ala 458和Gly 459。

23.含有与至少一种治疗性蛋白质或肽融合的运铁蛋白(Tf)蛋白质的融合蛋白，所述运铁蛋白表现出降低的对运铁蛋白受体(TfR)的亲和性。

24.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽的血清半寿期高于治疗性蛋白质或肽在非融合状态的血清半寿期。

25.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的C-末端融合。

26.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的N-末端融合。

27.项1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入Tf的至少一个环中。

28.项23的融合蛋白，其中TF蛋白不与TfR结合。

29.项23的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁的亲和性降低。

30.项9的融合蛋白，其中Tf蛋白不与铁结合。

31.项23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白表现出降低的糖基化，或不表现出糖基化。

32.项31的融合蛋白，含有至少一个能防止糖基化的突变。

33.项23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白C结构域的一部分。

34.项33的融合蛋白，其中桥连肽将治疗性蛋白质或肽与Tf连起来。

35.项33的融合蛋白，其中所述治疗性蛋白质、肽或多肽被插入Tf蛋白的N结构域和C结构域之间。

36.项23的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf绞链区具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。

37.项36的融合蛋白，其中所述绞链区选自大约残基94至大约残基96，大约残基245至大约残基247，大约残基316至大约残基318，大约残基425至大约残基427，大约残基581至大约残基582和大约残基652至大约残基658。

38.项23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白在选自下列的位置处具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加：Asp 63，Gly 65，Tyr 95，Tyr 188，Lys 206，His207，His 249，Asp 392，Tyr 426，Tyr 514，Tyr 517，His 585，Thr 120，Arg 124，Ala 126，Gly 127，Thr 452，Arg 456，Ala 458和Gly 459。

39.项25的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽取代至少一个环。

40.项31的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413，N611的氨基酸残基。

41.编码项1或23中任一项的融合蛋白的核酸分子。

42.含有项41的核酸分子的载体。

43.含有项42的载体的宿主细胞。

44.含有项41的核酸分子的宿主细胞。

45.表达Tf融合蛋白的方法，包括在能表达所编码的融合蛋白的条件下培养项43的宿主细胞。

46.表达Tf融合蛋白的方法，包括在能表达所编码的融合蛋白的条件下培养项44的宿主细胞。

47.项43的宿主细胞，其中细胞是原核或真核细胞。

48.项44的宿主细胞，其中细胞是原核或真核细胞。

49.项47的宿主细胞，其中细胞是酵母细胞。

50.项48的宿主细胞，其中细胞是酵母细胞。

51.含有项41的核酸分子的转基因动物。

52.生产Tf融合蛋白的方法，包括从项51的转基因动物中分离融合蛋白。

53.项52的方法，其中Tf融合蛋白含有乳铁蛋白。

54.项53的方法，其中融合蛋白从转基因动物的生物液体分离。

55.项53的方法，其中液体是血清或乳汁。

56.治疗患者疾病或疾病症状的方法，包括施用项1或项23的融合蛋白的步骤。附图简述

图1显示了人(Hu)运铁蛋白(Tf)N结构域和C结构域的序列比对结果，图中突出了相似性和同一性。

图2A-2B显示了得自不同物种的运铁蛋白序列的比对结果。浅色阴影：相似性；深色阴影：同一性。

图3显示了Tf表面暴露的多个治疗性蛋白质、多肽或肽插入位点的位置。

图4A-4B显示了产生经修饰Tf融合蛋白所用的多个优选抗-TNFα抗体的VH和VL区域。

图5显示了pREX0010。

图6显示了pREX0011。

图7显示了pREX0012。

图8显示了pREX0013。

图9显示了pREX0014。

图10显示了pREX0015。

发明详述

一般性描述

已发现：通过使治疗性蛋白质、多肽或肽与足以延长其血清半寿期的经修饰运铁蛋白的全部或部分进行基因融合或化学偶联，可以稳定治疗性蛋白质(如多肽、抗体或肽，或其片段和变体)以延长血清半寿期和/或在体内将治疗性蛋白质的活性维持更长时间。经修饰的运铁蛋白融合蛋白包括与治疗性蛋白质或肽共价连接的运铁蛋白或运铁蛋白结构域，其中与野生型运铁蛋白序列相比，运铁蛋白部分经修饰后含有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。在一个实施方案中，Tf融合蛋白经改造后可以减少或防止Tf或Tf结构域内的糖基化。在其它实施方案中，Tf蛋白或Tf结构域经修饰后与铁或碳酸根离子的结合减弱或消失，或与Tf受体(TfR)的亲和性减弱或不与该受体结合。

因此，本发明包括运铁蛋白融合蛋白，含有该融合蛋白的治疗性组合物，通过施用该融合蛋白治疗、预防或改善疾病的方法。本发明的运铁蛋白融合蛋白包括治疗性蛋白质的至少一个片断或变体和经修饰运铁蛋白的至少一个片断或变体，两者彼此相连，优选通过基因融合(即通过翻译核酸产生运铁蛋白融合蛋白，在所述核酸中，编码全部或部分治疗性蛋白质的多核苷酸与编码全部或部分经修饰运铁蛋白的多核苷酸在框内进行连接)或化学偶联彼此相连。治疗性蛋白质和运铁蛋白一旦成为运铁蛋白融合蛋白的一部分，即可称之为运铁蛋白融合蛋白“部分”、“区域”或“组成成分”(例如“治疗性蛋白质部分”或“运铁蛋白部分”)。

在一个实施方案中，本发明提供了运铁蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质和经修饰的血清运铁蛋白，或者由这两种组分组成。在其它实施方案中，本发明提供了运铁蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性片断和经修饰的运铁蛋白，或者由所述治疗性蛋白质片断和经修饰的运铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供了运铁蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性变体和经修饰的运铁蛋白，或者由所述治疗性蛋白质变体和经修饰的运铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供了运铁蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质以及经修饰运铁蛋白的生物活性和/或治疗活性片断。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是活性形式的治疗性蛋白质。

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义都与本发明所属技术领域普通技术人员一般理解的意思相同。本发明的实践或试验中可以使用任何与本文所述类似或等同的方法和材料，但本文描述了优选的方法和材料。

定义

本文所用术语“生物活性”指的是治疗性分子、蛋白质或肽在生物环境(即生物体或其体外复制物)中行使的功能或一整套活性。生物活性包括但不限于所要求融合蛋白的治疗性分子部分的功能，例如但不限于诱导效应细胞系的细胞外基质分泌，诱导激素分泌，诱导趋化性，诱导有丝分裂发生，诱导分化或抑制效应细胞的细胞分裂。如果本发明的融合蛋白或肽表现出其治疗性蛋白质的天然配对物的一个或多个生物活性，即可认为它们具有生物活性。

通过序列比对鉴定出本文所用的与运铁蛋白序列“相对应的氨基酸”或“等同的氨基酸”，从而使第一个运铁蛋白序列和至少第二个运铁蛋白序列之间的同一性或相似性最大化。用于鉴定第二个运铁蛋白序列中的等同氨基酸的数字基于鉴定第一个运铁蛋白序列中的相应氨基酸所用的数字。在某些情况下，可以使用这些短语来描述与兔血清运铁蛋白中的某些残基相比较而言的人运铁蛋白中的氨基酸残基。

本文所用术语“Tf蛋白的片断”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白的部分”指的是含有天然Tf蛋白或其突变体的至少约5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列。

本文所用术语“基因”指的是与生物学功能相关的任何DNA区段。因此，基因包括但不限于编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因也可包括非表达的DNA区段，例如形成其它蛋白质的识别序列的区段。可由多个来源获得基因，包括从感兴趣的来源克隆，或由已知或推测的序列信息合成，基因可包括经设计后具有所需参数的序列。

本文所用的“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“异源基因”或“异源序列”或“外源性DNA区段”指的是源自相对于特定宿主细胞而言为外源的多核苷酸、核酸或DNA区段，或指来源相同，但对其原始形式进行过修饰的多核苷酸、核酸或DNA区段。宿主细胞中的异源基因包括相对于特定宿主细胞而言虽为内源性的，但已被修饰过的基因。因此，该术语指的是对细胞而言为外源或异源的DNA区段，或者指与细胞同源，但在宿主细胞核酸内的某个位置处，一般不会出现该元件的DNA区段。例如，与人Tf序列结合的酵母细胞天然信号序列是异源的。

本文所用的“分离的”核酸序列指的是经琼脂糖凝胶电泳测定，基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，甚至最优选约95％纯的核酸序列。例如，通过基因工程中所用的标准克隆方法，将核酸序列从其天然位置处转移至欲重新产生该序列的不同位点处，即可获得分离的核酸序列。克隆方法包括切下和分离所需的核酸片断，该片断含有编码多肽的核酸序列，将所述片断插入载体分子，再将重组载体掺入宿主细胞，即可在所述细胞中复制多拷贝或多克隆的核酸序列。核酸序列可以源自基因组、cDNA、RNA、半合成、合成或其任意组合。

当DNA编码序列之间的框内融合导致DNA编码序列被翻译成多肽融合物时，即可认为两个或多个DNA编码序列是“连接的”或“融合的”。与Tf融合物有关的术语“融合”包括但不限于：至少一种治疗性蛋白质、多肽或肽与Tf的N-末端结合，与Tf的C-末端结合，和/或在Tf内的任意两个氨基酸之间插入。

本文所用的“经修饰的运铁蛋白”指的是：与野生型运铁蛋白相比，氨基酸序列中存在至少一个修饰的运铁蛋白分子。

本文所用的“经修饰的运铁蛋白融合蛋白”指的是：至少一个经修饰的运铁蛋白分子(或其片断或变体)与至少一个治疗性蛋白质分子(或其片断或变体)融合形成的蛋白质。

本文所用术语“核酸”或“多核苷酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有限定，该术语包括含有天然核苷酸的类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸类似的结合特性，并以类似于天然核苷酸的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列也暗含其经保守修饰的变体(如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地说，通过产生一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合的-碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，即可获得简并密码子取代(Batzer等，(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；Cassol等，(1992)；Rossolini等，(1994)Mol.Cell.Probes8：91-98)。术语核酸可以与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。

当使某个DNA区段处于与另一个DNA区段的功能关系中时，可认为前者是“可操作相连的”。例如，当信号序列的DNA被表达成参与融合蛋白分泌的前蛋白质时，可认为它与编码本发明融合蛋白的DNA可操作相连；如果启动子或增强子促进序列转录，可认为它们与编码序列可操作相连。一般说来，可操作相连的DNA序列是邻接的，对于信号序列或融合蛋白而言，所述DNA序列既是邻接的也是处于读码期的。然而，增强子无需与在其控制下转录的编码序列邻接。在此上下文中，通过在方便的限制性位点或所述位点中插入的衔接子或接头处进行连接来完成连接。

本文所用术语“启动子”指的是参与结合RNA聚合酶以起始转录的DNA区域。

本文所用术语“重组的”指的是经重组DNA转化的细胞、组织或生物体。

本文所用的靶向实体、蛋白质、多肽或肽指的是与特定细胞类型[正常的(如淋巴细胞)或异常的(如癌细胞)]特异性结合，因此可用于将Tf融合蛋白或化合物(药物或细胞毒性剂)特异性靶向该细胞类型的分子。

本文所用的“治疗性蛋白质”指的是具有一种或多种治疗和/或生物活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片断或变体。本发明包含的治疗性蛋白质包括但不限于蛋白质、多肽、肽、抗体和生物制品。本文中的术语肽、蛋白质和多肽可以互换使用。另外，术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性的或天然的关联物。显示出“治疗活性”的多肽或有“治疗活性”的蛋白质指的是：具有一种或多种与治疗性蛋白质(例如，如本文所述的或本领域已知的一种或多种治疗性蛋白质)有关的已知生物活性和/或治疗活性的多肽。作为一个非限制性的例子，“治疗性蛋白质”是可用于治疗、预防或改善疾病的蛋白质。所述疾病可以是人或非人动物的疾病，例如可以用于兽医。

本文所用术语“转化”指的是将核酸(即核苷酸聚合物)转移至细胞内。本文所用术语“基因转化”指的是将DNA，特别是重组DNA转移和掺入至细胞内。

本文所用术语“转化子”指的是经转化的细胞、组织或生物体。

本文所用术语“转基因”指的是以确保其功能的方式插入生物体、宿主细胞或载体中的核酸。

本文所用术语“转基因的”指的是：通过多种转化方法中的一种，接受了外源基因或经修饰基因，特别是编码经修饰Tf融合蛋白的基因的细胞、细胞培养物、生物体、细菌、真菌、动物、植物及其后代，其中相对于接受外源基因或经修饰基因的生物体物种而言，外源基因或经修饰基因得自相同或不同的物种。

“变体”指的是与参照核酸或多肽有所不同，但能保持其基本特性的多核苷酸或核酸。一般说来，变体整体上非常相似，在很多区域中，与参照核酸或多肽相同。本文所用的“变体”指的是本发明运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分，该部分的序列与天然治疗性蛋白质序列有所不同，但保持了天然蛋白质如本文所述的或本领域已知的至少一种功能性和/或治疗性特性。

本文所用术语“载体”宽泛地指任何编码外源性核酸的质粒、噬粒或病毒。该术语也包括便于将核酸转移至毒粒或细胞中的非-质粒、非-噬粒和非-病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物等。载体也可以是适用作传递载体以将核酸或其突变体传递至细胞中的病毒载体，或者载体也可以是适用于相同目的的非-病毒载体。用于将DNA传递至细胞和组织中的病毒和非-病毒载体的例子是本领域众所周知的，描述于例如Ma等，(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12744-12746)。病毒载体的例子包括但不限于：重组痘苗病毒，重组腺病毒，重组逆转录病毒，重组腺伴随病毒，重组禽痘病毒等(Cranage等，1986，EMBO J.5：3057-3063；国际专利申请号WO94/17810，公开于1994年8月18日；国际专利申请号WO94/23744，公开于1994年10月27日)。非-病毒载体的例子包括但不限于：脂质体，DNA的多胺衍生物等。

本文所用术语“野生型”指的是天然的多核苷酸或多肽序列。

运铁蛋白和运铁蛋白修饰

可以使用任何运铁蛋白制备本发明的经修饰Tf融合蛋白。野生型人Tf(Tf)是679个氨基酸的蛋白质，约为75kDa(不计糖基化)，它具有两个似乎源自基因复制的主要结构域，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)。参见GenBank登录号NM001063，XM002793，M12530，XM039845，XM039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)(皆全文列入本文作为参考)以及SEQ ID NO：1，2和3。这两个结构域随着时间的变化也发生了异化，但保持了高水平的同一性/相似性(图1)。

N结构域和C结构域进一步被分成两个亚结构域，N1和N2，C1和C2。Tf的功能是将铁转运至体细胞中。该过程由所有细胞，特别是处于活性生长中的细胞上表达的Tf受体(TfR)介导。TfR识别铁结合型Tf(两个铁结合型Tf与一个受体结合)，然后发生内吞作用，从而将TfR/Tf复合物转运至内体中，此时局部pH值的降低导致结合铁的释放，TfR/Tf复合物重新循环至细胞表面并释放出Tf(已知为非-铁结合型apoTf)。受体结合需通过Tf的C结构域。由于与非糖基化铁结合的Tf能结合受体，因此C结构域中的两个糖基化位点似乎并不参与受体结合。

每个Tf分子可携带两个铁原子。它们在N1和N2，C1和C2亚结构域之间的间隙中复合，导致分子构象改变。Tf经由Tf受体跨越血脑屏障(BBB)。

在人运铁蛋白中，铁结合位点至少含有氨基酸Asp63(含有天然Tf信号序列的SEQ ID NO：2的Asp82)；Asp392(SEQ ID NO：2的Asp411)；Tyr95(SEQ ID NO：2的Tyr114)；Tyr426(SEQ ID NO：2的Tyr445)；Tyr188(SEQ IDNO：2的Tyr207)；Tyr514或517(SEQ ID NO：2的Tyr533或Tyr536)；His249(SEQ ID NO：2的His268)；His585(SEQ ID NO：2的His604)，绞链区至少含有N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318，以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658，碳酸盐结合位点至少含有氨基酸Thr120(SEQ ID NO：2的Thr139)；Thr452(SEQ ID NO：2的Thr471)；Arg124(SEQ ID NO：2的Arg143)；Arg456(SEQ ID NO：2的Arg475)；Ala126(SEQ ID NO：2的Ala145)；Ala458(SEQ ID NO：2的Ala477)；Gly127(SEQ ID NO：2的Gly146)；Gly459(SEQ ID NO：2的Gly478)。

在本发明的一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的人运铁蛋白，但任何动物Tf分子都可用于产生本发明的融合蛋白，包括人Tf变体，奶牛、猪、绵羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠、echnida、鸭嘴兽、鸡、青蛙、天蛾幼虫、猴以及其它牛、犬和禽类(参见图2中的一套有代表性的Tf序列)。所有这些Tf序列都可以从GenBank和其它公共数据库中方便地获得。人Tf核苷酸序列可以获得(参见SEQ ID NO：1，2和3以及上文所述的登录号，它们可得自www.ncbi.nlm.nih.gov/)，可以使用这些序列来制备Tf或Tf结构域与所选择的治疗性分子之间的基因融合物。融合物也可以制备自相关的分子，如乳运铁蛋白(乳铁蛋白，GenBank登录号NM_002343)。

已发现天然防御性铁-结合蛋白乳铁蛋白(Lf)具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤和抗炎症活性。该蛋白质存在于外泌物中，所述外泌物通常暴露于正常菌群、乳汁、眼泪、鼻分泌液、唾液、支气管粘液、胃肠液、宫颈-阴道粘液和精液中。另外，Lf是循环多形核嗜中性白细胞(PMN)的次级特异性颗粒的主要成分。在脓毒性区域，PMN脱粒后即释放出脱辅基蛋白质。Lf的主要功能是清除液体和发炎区域的游离铁，从而抑制自由基-介导的损害，并降低金属的可用性以侵害微生物和肿瘤细胞。在检查成人¹²⁵ILf周转率的研究中，证实Lf能被肝脏和脾脏快速吸收，放射性可在肝脏和脾脏中维持几周(Bennett等，(1979)，Clin.Sci.(Lond.)57：453-460)。

在另一个实施方案中，本发明运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括运铁蛋白剪接变体。在一个例子中，运铁蛋白剪接变体可以是人运铁蛋白剪接变体。在一个具体实施方案中，人运铁蛋白剪接变体可以是Genbank登录号AAA61140。在另一个实施方案中，本发明运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括乳铁蛋白剪接变体。在一个例子中，人血清乳铁蛋白剪接变体可以是嗜中性粒细胞乳铁蛋白的新剪接变体。在一个具体实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪接变体可以是Genbank登录号AAA59479。在另一个具体实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪接变体可含有下列氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQ ID NO：8)，其包括新的剪接-变异区域。

可以用任何Tf蛋白、片断、结构域或经改造的结构域制备经修饰的Tf融合蛋白。例如，可使用含或不含天然Tf信号序列的全长Tf序列制备融合蛋白。也可使用单个Tf结构域，如单个N或C结构域制备Tf融合蛋白。在一些实施方案中，使用单个N结构域较为有利，因为Tf糖基化位点存在于C结构域中，N结构域本身不与铁或Tf受体结合。在其它实施方案中，可制备治疗性蛋白质与单个C结构域的融合蛋白，其中C结构域已被改变，以降低、抑制或防止糖基化，铁结合和/或Tf受体结合。

在一些实施方案中，Tf或Tf部分应足够长，从而与非融合状态的治疗性蛋白质的血清稳定性(半寿期)、体外溶液稳定性或生物可用性相比，增加治疗性蛋白质的血清稳定性、体外溶液稳定性或生物可用性。所述稳定性、血清半寿期或生物可用性的增加可以是超过未融合治疗性蛋白质的约30％，50％，70％，80％，90％或更高的增加。在一些情况下，经修饰的运铁蛋白融合蛋白表现出约10-20或更多天，约12-18天或约14-17天的血清半寿期。

当Tf的C结构域是融合蛋白的一部分时，可突变两个N-联糖基化位点，即对应于SEQ ID NO：3的N413和N611的氨基酸残基，以在酵母系统中表达，从而防止糖基化或高甘露糖基化并延长融合蛋白和/或治疗性蛋白质的血清半寿期(产生脱唾液酸-，或在有些情况下产生单唾液酰-Tf或双唾液酰-Tf)。除了对应于N413和N611的Tf氨基酸外，也可对N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基进行突变以防止或大大减少糖基化。参见Funk等的美国专利5,986,067。据报道巴斯德毕赤氏酵母中表达的TfN结构域在S32处被单个己糖O-联糖基化，也可对此位点进行突变或修饰以防止这种糖基化。

因此，在本发明的一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白表现出降低的糖基化，其包括但不限于脱唾液酸-，单唾液酰-和双唾液酰-形式的Tf。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括经突变后可防止糖基化的重组运铁蛋白突变体。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括完全被糖基化的重组运铁蛋白突变体。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括经突变后可防止糖基化的重组人血清运铁蛋白突变体，其中SEQ ID NO：3的Asn413和Asn611中的至少一个被突变成不允许糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括经突变后可防止或大大降低糖基化的重组人血清运铁蛋白突变体，其中可对N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基进行突变。

正如下文所详细讨论的那样，可以对本发明的经修饰Tf融合蛋白进行改造以使其不与铁结合和/或不与Tf受体结合。在本发明的其它实施方案中，铁结合得以保留，可以以两种方式使用Tf的铁结合能力，一种是将治疗性蛋白质或肽传递至细胞内部和/或使其穿越BBB。经常需改动这些结合铁和/或Tf受体的实施方案，以降低或防止糖基化，从而延长治疗性蛋白质的血清半寿期。当负载有铁时，单独的N结构域不与TfR结合，与铁结合的C结构域会与TfR结合，但结合亲和性不同于完整的分子。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体未能保留结合金属的能力。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对金属具有较弱的结合亲和性。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对金属具有较强的结合亲和性。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体未能保留结合运铁蛋白受体的能力。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对运铁蛋白受体具有较弱的结合亲和性。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对运铁蛋白受体具有较强的结合亲和性。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体未能保留结合碳酸盐的能力。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对碳酸盐具有较弱的结合亲和性。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中相对于野生型血清运铁蛋白而言，突变体对碳酸盐具有较强的结合亲和性。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组人血清运铁蛋白突变体，其中至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585的氨基酸残基具有突变，其中突变体保留了结合金属的能力。在可替代的实施方案中，重组人血清运铁蛋白突变体在至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585的氨基酸残基中具有突变，其中突变体结合金属的能力降低。在另一个实施方案中，重组人血清运铁蛋白突变体在至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr517和His585的氨基酸残基中具有突变，其中突变体未保留结合金属的能力。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组人血清运铁蛋白突变体，其中SEQ ID NO：3的Lys206或His207中具有突变，其中与野生型人血清运铁蛋白相比，突变体对金属具有较强的结合亲和性(参见美国专利5,986,067，其全文列入本文作为参考)。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组人血清运铁蛋白突变体，其中SEQ ID NO：3的Lys206或His207中具有突变，其中与野生型人血清运铁蛋白相比，突变体对金属具有较弱的结合亲和性。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组人血清运铁蛋白突变体，其中SEQ ID NO：3的Lys206或His207中具有突变，其中突变体不与金属结合。

可以使用任何能利用的技术来制备本发明的融合蛋白，包括但不限于常用的分子技术，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中公开的技术。当使用本领域众所周知的定点诱变技术进行核苷酸取代时，优选对编码氨基酸的次要特性进行改变，即进行保守的氨基酸取代，但是，也可以进行其它非保守的取代，尤其是当产生Tf融合蛋白的经修饰运铁蛋白部分，例如表现出降低的糖基化、降低的铁结合等的经修饰Tf融合蛋白时，可以进行非保守取代。具体预期的是氨基酸取代、小的缺失或插入(一般为1至约30个氨基酸)；运铁蛋白结构域之间的插入；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的甲硫氨酸残基，或运铁蛋白结构域之间或连接运铁蛋白和治疗性蛋白质或肽的少于50，40，30，20或10个残基的小接头肽；或便于纯化的小延伸，如聚-组氨酸序列段，抗原表位或结合结构域。

保守氨基酸取代的例子有：相同组氨基酸内的取代，如碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)组内发生的取代。

非-保守取代包括用一组氨基酸取代另一组氨基酸。例如，非-保守取代包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。有关核苷酸取代的一般性描述，可参见例如Ford等，(1991)，Prot.Exp.Pur.2：95-107。非-保守取代、缺失和插入可特别用于产生本发明的TF融合蛋白，所述融合蛋白与铁的结合降低或消失，融合蛋白与Tf受体的结合降低或消失和/或糖基化降低或消失。

在本发明的多肽和蛋白质中，根据下述常规列表，按照下列系统设计氨基酸：

氨基酸表

 

氨基酸	单字母代码	三字母代码
			丙氨酸	A	Ala
精氨酸	R	Arg
			天冬酰胺	N	Asn

 

氨基酸	单字母代码	三字母代码
			天冬氨酸	D	Asp
半胱氨酸	C	Cys
			谷氨酰胺	Q	Gln
谷氨酸	E	Glu
			甘氨酸	G	Gly
组氨酸	H	His
			异亮氨酸	I	Ile
亮氨酸	L	Leu
			赖氨酸	K	Lys
甲硫氨酸	M	Met
			苯丙氨酸	F	Phe
脯氨酸	P	Pro
			丝氨酸	S	Ser
苏氨酸	T	Thr
			色氨酸	W	Trp
酪氨酸	Y	Tyr
			缬氨酸	V	Val

通过在对应于一个或多个Tf N结构域残基Asp63，Tyr95，Tyr188，His249和/或C结构域残基Asp392，Tyr426，Tyr514和/或His585的氨基酸残基中进行突变，包括缺失、取代或插入，即可降低或破坏铁结合和/或受体结合。通过突变氨基酸Lys206，Hys207或Arg632也可影响铁结合。通过在对应于一个或多个TfN结构域残基Thr120，Arg124，Ala126，Gly127和/或C结构域残基Thr452，Arg456，Ala458和/或Gly459的氨基酸残基中进行突变，包括缺失、取代或插入，即可降低或破坏碳酸盐结合。碳酸盐结合的降低或破坏反过来可影响铁和/或受体结合。

通过在对应于一个或多个上文针对铁结合所述的TfN结构域残基的氨基酸残基中进行突变，包括缺失、取代或插入，即可降低或破坏与Tf受体的结合。

如上所述，通过对对应于C结构域残基N413和/或N611的N-X-S/T位点附近的一个或多个Tf C结构域残基所对应的氨基酸残基进行突变，包括缺失、取代或插入，即可降低或防止糖基化(参见美国专利5,986,067)。例如，可将N413和/或N611突变成Glu残基。

当未修饰本发明的Tf融合蛋白以防止糖基化、铁结合、碳酸盐结合和/或受体结合时，可从融合蛋白上去除或剥离糖基化、铁和/或碳酸根离子。例如，可使用可获得的去糖基化酶从融合蛋白上裂解糖基化残基，特别是与Tf部分结合的糖残基，可使用糖基化酶有缺陷的酵母防止糖基化，和/或可在能防止糖基化的试剂(如衣霉素(tunicamycin))存在时培养重组细胞。

可对Tf进行其它的突变以改变TF的三维结构，如对绞链区进行修饰以防止出现铁结合和Tf受体识别所需的Tf折叠。例如，可在以下氨基酸残基中或其附近进行突变：N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658。另外，可在这些位点的侧翼区内或其附近进行突变以改变Tf结构和功能。

在本发明的一个方面，运铁蛋白融合蛋白可用作载体蛋白以延长治疗性蛋白质的半寿期或生物可用性，以及在某些情况下，使治疗性蛋白质传递至细胞内部和/或穿越血脑屏障。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白未保留穿越血脑屏障的能力。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留了与运铁蛋白受体结合并将治疗性肽转运至细胞内部的能力。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子未保留与运铁蛋白受体结合并将治疗性肽转运至细胞内部的能力。

在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留了与运铁蛋白受体结合并将治疗性肽转运至细胞内部的能力，但未保留穿越血脑屏障的能力。在可替代的实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留了穿越血脑屏障的能力，但未保留与运铁蛋白受体结合并将治疗性肽转运至细胞内部的能力。

经修饰的运铁蛋白融合蛋白

本发明蛋白质的融合物可含有一个或多个拷贝的与Tf蛋白N-末端和/或C-末端结合的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质与Tf蛋白的N-末端和C-末端结合，融合蛋白可在Tf的任一端或两端含有一个或多个治疗性蛋白质的等同物。在其它实施方案中，治疗性蛋白质或多肽被插入Tf蛋白的已知结构域，例如插入一个或多个Tf环中(参见Ali等，(1999)J.Biolog.Chem.274(34)：24066-24073)。在其它实施方案中，治疗性蛋白质或治疗性肽被插入Tf的N结构域和C结构域之间。

一般说来，本发明的运铁蛋白融合蛋白可具有一个经修饰的得自运铁蛋白的区域和一个得自治疗性蛋白质的区域。然而，可以使用每种蛋白质的多个区域制备本发明的运铁蛋白融合蛋白。类似地，可以使用一种以上的治疗性蛋白质制备本发明的运铁蛋白融合蛋白，从而产生多-功能的经修饰Tf融合蛋白。

在一个实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与运铁蛋白分子或其部分融合的治疗性蛋白质或其部分。在另一个实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与运铁蛋白分子的N末端融合的治疗性蛋白质。在可替代的实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与运铁蛋白分子的C末端融合的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与治疗性蛋白质的N末端融合的运铁蛋白分子。在可替代的实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与治疗性蛋白质的C末端融合的运铁蛋白分子。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白分子含有与可能成为治疗性肽N末端的部分融合的运铁蛋白分子的N末端。在可替代的实施方案中，经修饰的运铁蛋白分子含有与治疗性肽C末端融合的运铁蛋白分子的N末端。在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白分子含有与可能成为治疗性肽C末端的部分融合的运铁蛋白分子的C末端。在可替代的实施方案中，经修饰的运铁蛋白分子含有与治疗性肽N末端融合的运铁蛋白分子的C末端。

在其它实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白含有与经修饰运铁蛋白的N-末端和C-末端融合的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，与N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在可替代的实施方案中，与N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一个可替代的实施方案中，与N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质，但这些蛋白质可用于治疗或预防相同的疾病。在另一个实施方案中，与N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质，所述蛋白质可用于治疗或预防本领域已知一般同时在患者中出现的疾病。

除了使经修饰的运铁蛋白部分与治疗性蛋白质部分的N末端和/或C-末端融合可以获得本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白外，通过将感兴趣的治疗性蛋白质或肽(如本文所述的治疗性蛋白质或肽，或者，例如，与治疗性蛋白质或其片段或其变体结合的单链抗体)插入经修饰运铁蛋白的内部区域，也可以产生本发明的运铁蛋白融合蛋白。经修饰运铁蛋白的内部区域包括但不限于：铁结合位点、绞链区、碳酸氢盐结合位点或受体结合结构域。

在经修饰运铁蛋白分子的蛋白质序列内，存在多个通过二硫键稳定化的环或转角。这些环可用于插入或内部融合有治疗活性的肽，特别是那些需要二级结构以成为功能性或治疗性蛋白质的肽，从而实质上产生具有特定生物活性的经修饰运铁蛋白分子。

当治疗性蛋白质或肽被插入或置换至少一个Tf分子的环时，除了在表面暴露的任何环区域内进行插入外，还可在Tf的其它区域进行插入。例如，可以在含有TF氨基酸32-33，74-75，256-257，279-280和288-289的环内进行插入(Ali等，文献同上)(见图3)。如上所述，也可以在Tf的其它区域内进行插入，例如在下文将要详细描述的铁和碳酸氢盐结合位点、绞链区和受体结合结构域进行插入。也可以使用Tf蛋白序列中适于修饰/置换以插入蛋白质或肽的环来开发随机肽插入物的可筛选文库。在克隆至Tf结构域和/或与Tf末端融合之前，可以使用任何方法制备核酸插入物以产生肽文库，包括可利用的噬菌体和细菌展示系统。

Tf的N-末端是自由的，并指向背离分子体的方向。因此，N-末端上的蛋白质或肽融合物是一个优选实施方案。所述融合物包括将治疗性蛋白质或肽与Tf分开的接头区域，例如但不限于一段聚-甘氨酸序列。对前导序列之间的连接的关注、前导序列的选择以及经密码子操作/最优化的mRNA结构(不是主要的茎环以抑制核糖体发展)会增加分泌，使用标准的重组蛋白质技术可以容易地完成这些任务。

由于C-末端6个氨基酸中存在二硫键，因此，Tf的C-末端似乎更加隐蔽和安全。在人Tf中，C-末端氨基酸是脯氨酸，根据其定向的方式，要么将融合物指向背离的方向，要么将融合物指向分子体内部。在本发明的一些实施方案中，可在C-末端使用接头或间隔区组成成分。

在其它实施方案中，可以使小分子治疗剂与铁复合，并荷载于经修饰的Tf蛋白融合物上，用于将治疗剂传递至细胞内部并穿越BBB。添加靶向肽，或例如SCA可将有效荷载靶向特定的细胞类型，如癌细胞。

核酸

本发明还提供了核酸分子。它们编码经修饰的Tf融合蛋白，所述融合蛋白含有与治疗性蛋白质共价连接或连接的运铁蛋白或运铁蛋白的一部分。如下文所详细讨论的，可以使用任何治疗性蛋白质。融合蛋白可进一步含有接头区，例如少于约50，40，30，20或10个氨基酸残基的接头。接头可在运铁蛋白或其部分以及治疗性蛋白质之间进行共价连接。本发明的核酸分子可以是纯化的，也可以是非纯化的。

本发明还提供了用于复制核酸分子并表达编码的融合蛋白的宿主细胞和载体。可以使用任何载体或宿主细胞，包括原核或真核细胞，特别优选酵母表达系统。本领域已知多种用于此目的的载体和宿主细胞。针对所需的用途，本领域技术人员能容易地选择适当的宿主细胞和载体。

编码运铁蛋白、运铁蛋白部分和所需治疗性蛋白质的DNA序列可克隆自多种本领域已知的基因组或cDNA文库。使用基于探针的方法分离所述DNA序列的技术是常规技术，并且是本领域技术人员众所周知的技术。分离所述DNA序列的探针可基于公开的DNA或蛋白质序列(参见例如Baldwin，G.S.(1993)Comparison of Transferrin Sequences from DifferentSpecies.Comp.Biochem.Physiol.106B/1：203-218和其中提及的所有参考文献，这些文献皆全文列入本文作为参考)。或者，也可以使用通过参考文献掺入本文的、由Mullis等，(美国专利4,683,195)和Mullis(美国专利4,683,202)公开的聚合酶链反应(PCR)法。文库的选择和分离所述DNA序列所用探针的选择是本领域普通技术人员的水平所能掌握的。

本领域已知：通过将一种多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守的核苷酸或氨基酸取代物与另一种多核苷酸或多肽的序列进行比较，即可测定两种多核苷酸或多肽之间的“相似性”。本领域还已知：“同一性”指的是两种多肽或两种多核苷酸序列之间的序列相关程度，所述相关程度是通过两行序列之间匹配的同一性测定的。同一性和相似性都是容易计算的(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。

尽管有多种方法可用于测定两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性和相似性，但术语“同一性”和“相似性”是本领域技术人员众所周知的(Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，New York，1991；和Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988))。常规用于测定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，SanDiego，1994，和Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.48：1073(1988)中公开的方法。

将测定同一性的优选方法设计成可使两个受测试序列之间出现最大程度的匹配。计算机程序整理出测定同一性和相似性的方法。测定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序法包括但不限于：GCG程序包(Devereux等，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul等，J.Molec.Biol.215：403(1990))。将上文所指的相似性或同一性程度测定为两个序列之间的同一性程度，它能表示第一个序列与第二个序列的差异。通过本领域已知的计算机程序，如GCG程序包中提供的GAP(Needleman and Wunsch(1970)Journal of Molecular Biology48：443-453)，可以测定两个核酸序列之间的同一性程度。为了在本发明中测定两个核酸序列之间的同一性程度，使用具有下列设置的GAP:GAP产生罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。

密码子最优化

遗传密码的简并性使得可以对运铁蛋白和/或所需治疗性蛋白质的核苷酸序列进行变异，但仍会产生氨基酸序列与天然DNA序列所编码多肽的氨基酸序列相同的多肽。已知为“密码子最优化”的方法(描述于美国专利5,547,871，其全文列入本文作为参考)为人们提供了一种设计经改变的DNA序列的方法。密码子最优化基因的设计应考虑多个因素，包括生物体中的密码子使用频率、近邻的频率、RNA稳定性、形成二级结构的潜能、合成路径和该基因将采用的DNA操作。特别是，当使用酵母表达系统时，可以使用可利用的方法，用最容易被酵母识别的密码子来改变编码给定融合蛋白的密码子。

遗传密码的简并性允许以多种不同的方法编码和翻译相同的氨基酸序列。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸各由6个不同的密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸各由4个不同的密码子编码。然而，在真核生物和原核生物中，不同基因组之间的同义密码子有所不同。例如，哺乳动物的同义密码子-选择模式非常类似，而在进化上关系较远的生物体，如酵母(酿酒酵母)、细菌(如大肠杆菌)和昆虫(如D.melanogaster)的基因组密码子使用频率模式明显不同(Grantham，R等，Nucl.Acids Res.，8，49-62(1980)；Grantham，R等，Nucl.Acids Res.，9，43-74(1981)；Maroyama，T等，Nucl.Acids Res.，14，151-197(1986)；Aota，S等，Nucl.Acids Res.，16，315-402(1988)；Wada，K等，Nucl.Acids Res.，19Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，FEBS Letters，285，165-169(1991))。密码子-选择模式的差异似乎通过调节肽延长速率，来对各个基因的表达水平产生影响(Kurland，C.G.，FEBSLetters，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBO J.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L等，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.，and Yarus，M.，J.Mol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。

合成基因的优选密码子使用频率应反映核基因的密码子使用，所述基因得自欲用于重组蛋白质表达的细胞/生物体(特别是酵母)的原样(或尽可能密切相关的)基因组。如上所述，在一个优选实施方案中，在对治疗性蛋白质核苷酸序列进行本文所述的适于在酵母中进行表达的修饰之前或之后，对人Tf序列的密码子进行最优化。

载体

用于本发明的表达单位一般含有以5’至3’方向可操作相连的下述元件：转录启动子；分泌信号序列；编码经修饰的Tf融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白含有与编码所需治疗性蛋白质或肽的DNA序列连接的运铁蛋白或运铁蛋白部分；和转录终止子。如上所述，与Tf部分融合或位于Tf部分内部的治疗性蛋白质或肽的任何排布都可用于本发明的载体中。由选定的宿主细胞确定适当启动子、信号序列和终止子的选择，这一点对于本领域技术人员而言是显而易见的，下文将要更具体地进行讨论。

可用于本发明的适当酵母载体描述于美国专利6,291,212，其包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1035-1039，1978)，YEp13(Broach等，Gene8：121-133，1979)，pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275：104-108，1978)，pPPC0005，pSeCHSA，pScNHSA，pC4及其衍生物。有用的酵母质粒载体还包括可得自Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA的pRS403-406，pRS413-416和毕赤氏酵母载体。质粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)，其中掺入了酵母选择标记HIS3，7RPI，LEU2和URA3。质粒pRS413～41.6是酵母着丝粒质粒(Ycp)。

所述载体一般包括选择标记，所述选择标记是多种表现出显性表型的基因之一，对所述表型而言，应存在可选择转化子的表型试验。优选的选择标记是能补偿宿主细胞营养缺陷、提供抗生素抗性或使细胞能利用特定碳源的标记，其包括LEU2(Broach等，文献同上)，URA3(Botstein等，Gene8：17，1979)，HIS3(Struhl等，文献同上)或POT1(Kawasaki和Bell，EP171,142)。其它适当的选择标记包括能赋予酵母细胞氯霉素抗性的CAT基因。用于酵母的优选启动子包括酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman等，JBiol.Chem.225：12073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1：419-434，1982；Kawasaki，美国专利4,599,311)或乙醇脱氢酶基因的启动子(Young等，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，(eds.)，p.355，Plenum，N.Y.，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101：192-201，1983)。在此方面，特别优选的启动子是TPI1启动子(Kawasaki，美国专利4,599,311)和ADH2-4.sup.C[参见美国专利6,291,212]启动子(Russell等，Nature 304：652-654，1983)。表达单位还可包括转录终止子。优选的转录终止子是TPI1终止子(Alber和Kawasaki，文献同上)。

除了酵母，还可以在丝状真菌，如曲霉属真菌菌株中表达本发明的经修饰融合蛋白。有用启动子的例子包括得自Aspergillus nidulans糖酵解基因的启动子，如ADH3启动子(McKnight等，EMBO J.4：2093-2099，1985)和tpiA启动子。适当终止子的例子是ADH3终止子(McKnight等，文献同上)。可将利用上述组分的表达单位克隆至载体中，所述载体能插入例如曲霉的染色体DNA。

用于实施本发明的哺乳动物表达载体包括能介导经修饰的Tf融合蛋白转录的启动子。优选的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。优选的病毒启动子包括腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol.2：1304-13199，1982)和SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1：854-864，1981)。优选的细胞启动子包括小鼠金属硫蛋白1启动子(Palmiter等，Science222：809-814，1983)和小鼠V.sub..kappa.[参见美国专利6,291,212]启动子(Grant等，Nuc.Acids Res.15：5496，1987)。特别优选的启动子是小鼠V.sub.H[参见美国专利6,291,212]启动子(Loh等，文献同上)。所述表达载体还可含有一套位于启动子下游和编码运铁蛋白融合蛋白之DNA序列上游的RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可得自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。

表达载体中还可含有位于所需编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号包括SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufman and Sharp，文献同上)，腺病毒5E1B区的聚腺苷酸化信号和人生长激素基因终止子(DeNoto等，Nuc.Acids Res.9：3719-3730，1981)。特别优选的聚腺苷酸化信号是V.sub.H[参见美国专利6,291,212]基因终止子(Loh等，文献同上)。表达载体可包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，如腺病毒2三联前导序列。优选的载体还可包括增强子序列，如SV40增强子和小鼠.mu.[参见美国专利6,291,212]增强子(Gillies，Cell 33：717-728，1983)。表达载体还可包括编码腺病毒VARNA的序列。

转化

转化真菌的技术已在文献中公开，所述技术描述于例如Beggs(文献同上)，Hinnen等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929-1933，1978)，Yelton等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1740-1747，1984)和Russell(Nature301：167-169，1983)。宿主细胞的基因型一般含有基因缺陷，该缺陷可由表达载体中存在的选择标记补偿。特定宿主和选择标记的选择对本领域技术人员而言是显而易见的。

通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro andPearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981；Graham and Van der Eb，Virology52：456，1973.)，可将含有本发明的经修饰Tf融合蛋白的克隆DNA序列导入培养的哺乳动物细胞。也可以使用其它将克隆的DNA序列导入哺乳动物细胞的技术，例如电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)或脂质转染法。为了鉴定出整合了克隆DNA的细胞，一般将选择标记与所需基因或cDNA一起导入细胞。用于经培养的哺乳动物细胞的优选选择标记包括赋予药物抗性的基因，如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤抗性基因。选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增选择标记是DHFR基因。特别优选的可扩增标记是DHFR.sup.r[参见美国专利6,291,212]cDNA(Simonsen andLevinson，Proc.Natl.Adac.Sci.USA 80：2495-2499，1983)。Thilly对选择标记进行了评述(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.)，选择标记的选择是本领域技术人员容易掌握的。

宿主细胞

本发明还包括经转化可以表达本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的细胞，优选为酵母细胞。除了经转化的宿主细胞本身外，本发明还包括这些细胞在营养培养基中的培养物，优选为单克隆(克隆均一)的培养物，或衍生自单克隆培养物的培养物。如果多肽被分泌出来，培养基中会含有多肽与细胞，或者经过滤或离心后不含细胞，仅含多肽。

用于实施本发明的宿主细胞包括能被外源DNA转化或转染、并能在培养基中生长的真核细胞，有些情况下也包括原核细胞，例如，经培养的哺乳动物、昆虫、真菌、植物和细菌细胞。

真菌细胞，包括酵母类(例如糖酵母，裂殖糖酵母，毕赤氏酵母)可用作本发明的宿主细胞。预期可在本发明的实践中用作宿主以表达本发明的运铁蛋白融合蛋白的酵母属例子有：毕赤氏酵母(以前被分类为汉逊氏酵母)，糖酵母，克鲁维氏酵母，曲霉，假丝酵母，球拟酵母，有孢圆酵母，裂殖糖酵母，固囊酵母，Pachysolen，接合糖酵母，德巴利氏酵母，木霉，头孢，腐质霉，毛霉，链孢霉，Yarrowia，梅奇酵母，红冬孢，Leucosporidium，Botryoascus，锁掷酵母，Endomycopyis等。糖酵母的例子有：酿酒酵母，意大利糖酵母和鲁氏糖酵母。克鲁维氏酵母的例子有：脆壁克鲁维氏酵母，乳克鲁维氏酵母和马克斯克鲁维氏酵母。适当的有孢圆酵母是戴尔凯氏有孢圆酵母。毕赤氏酵母(汉逊氏酵母)的例子是P.angusta(以前被称为多形汉逊氏酵母)，P.anomala(以前被称为异常汉逊氏酵母)和巴斯德毕赤氏酵母。

对于产生本发明的Tf融合蛋白特别有用的宿主细胞是甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母(Steinlein等，(1995)Protein Express.Purif.6：619-624)。因其醇氧化酶启动子已被分离和克隆，巴斯德毕赤氏酵母已被开发成一个用于产生外源蛋白质的优越宿主；1985年首次报道了巴斯德毕赤氏酵母的转化。缺乏葡萄糖时，巴斯德毕赤氏酵母可利用甲醇作为碳源。巴斯德毕赤氏酵母表达系统可使用甲醇-诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，该启动子能控制编码醇氧化酶表达的基因，所述酶可催化甲醇代谢中的第一步。已鉴定出该启动子，并将其掺入一系列巴斯德毕赤氏酵母表达载体中。由于巴斯德毕赤氏酵母中产生的蛋白质一般能正确折叠并分泌至培养基中，因此，发酵经基因工程改造的巴斯德毕赤氏酵母即可提供极好的大肠杆菌表达系统替代物。使用该系统已制备出多种蛋白质，包括破伤风毒素片断，百日咳杆菌pertactin，人血清白蛋白和溶菌酶。

例如，可按Malardier等，(1989)Gene 78：147-156所述进行尖孢镰孢(F.Oxysporum)的转化。

酿酒酵母菌株是另一种优选的宿主。在优选实施方案中，使用了在糖蛋白的与天冬酰胺-有联系的糖基化所需基因中含有基因缺陷的酵母细胞，或更具体地为酿酒酵母宿主细胞。使用标准的突变和选择技术即可制备具有所述缺陷的酿酒酵母宿主细胞，但是，也有很多可以获得的酵母菌株已被修饰，可防止或降低糖基化或高甘露糖基化。Ballou等，(J.Biol.Chem.255：5986-5991，1980)描述了甘露糖蛋白生物合成突变体的分离，所述突变体的基因有缺陷，影响到与天冬酰胺-有联系的糖基化。

为了最优化异源蛋白质的生产，也优选宿主菌株携有突变，如酿酒酵母pep4突变(Jones，Genetics 85：23-33，1977)，所述突变导致蛋白酶解活性降低。在其它蛋白酶编码区中含有突变的宿主菌株对于大量生产本发明的Tf融合蛋白特别有用。

在适当的生长培养基中培养含有本发明的DNA构建体的宿主细胞。本文所用术语“适当的生长培养基”指的是含有细胞生长所需营养物质的培养基。细胞生长所需营养物质可包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。生长培养基一般通过例如药物选择或必需营养物质的缺陷来选择含有DNA构建体的细胞，所述缺陷由位于DNA构建体上或与DNA构建体一起被共转染的选择标记补偿。例如，优选在化合物确定的培养基中培养酵母细胞，所述培养基含有非-氨基酸氮源、无机盐、维生素和必需氨基酸补剂。优选将培养基的pH维持在pH大于2小于8，优选为pH6.5。维持稳定pH的方法包括缓冲和恒定pH控制，优选通过添加氢氧化钠。优选的缓冲剂包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。优选在含有渗透稳定剂的培养基中培养与天冬酰胺-有联系的糖基化所需基因中具有缺陷的酵母细胞。优选的渗透稳定剂是以0.1M至1.5M，优选为0.5M或1.0M的浓度添加至培养基中的山梨醇。

一般在市售的含血清或不含血清的培养基中培养经培养的哺乳动物细胞。本领域技术人员容易选择适用于所用的特定细胞系的培养基。将经转染的哺乳动物细胞培养一段时间，一般为1-2天以开始表达所需的DNA序列。然后使用药物选择以选择出以稳定形式表达选择标记的细胞的生长。对于已被可扩增选择标记转染的细胞而言，可逐步增加药物浓度以选择出拷贝数有所增加的克隆序列，从而提高表达水平。

也可以使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产本发明的经修饰Tf融合蛋白。BacPAK^TM杆状病毒表达系统(BD Biosciences(Clontech))在昆虫宿主细胞中高水平表达重组蛋白质。将靶基因插入转移载体，所述载体与线性化的BacPAK6病毒DNA一起被共转染至昆虫宿主细胞。BacPAK6DNA缺失杆状病毒基因组的必需部分。当DNA与载体重组时，可恢复必需元件，靶基因被转移至杆状病毒基因组。重组之后，挑选几个病毒噬斑并纯化之，证实重组表型。然后扩增新分离的重组病毒，并用于感染昆虫细胞培养物以产生大量所需蛋白质。

分泌信号序列

术语“分泌信号序列”或“信号序列”或“分泌前导序列”可以互换使用，其描述于例如美国专利6,291,212和美国专利5,547,871(皆全文列入本文作为参考)。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列编码分泌肽。分泌肽是能介导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌出来的氨基酸序列。一般说来，分泌肽的特征在于疏水氨基酸核心，它一般(也不排除其它情况)出现于新合成蛋白质的氨基末端。分泌肽经常在分泌过程中从成熟的蛋白质上裂解下来。分泌肽可含有当其经过分泌途经时，能从成熟蛋白质上裂解信号肽的加工位点。信号肽内可编码加工位点，或者可通过例如体外诱变将加工位点添加至信号肽中。

可以使用分泌肽介导本发明的经修饰Tf融合蛋白的分泌。一种可以与其它分泌肽联合使用的分泌肽是酵母屏障蛋白的第三结构域。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列是一系列复杂的、导致蛋白质分泌的翻译后加工步骤所必需的。如果存在完整的信号序列，被表达的蛋白质进入粗糙内质网的内腔，然后通过高尔基体转运至分泌载体，最终运送至细胞外。一般说来，信号序列紧接在起始密码子之后，并在待分泌蛋白质的氨基末端编码信号肽。在大多数情况下，通过特定的蛋白酶，即信号肽酶裂解信号序列。优选信号序列能改善使用病毒、哺乳动物或酵母表达载体的重组蛋白质表达的加工和输出效率。在一些情况下，可以使用天然Tf信号序列表达和分泌本发明的融合蛋白。

接头

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的Tf组成成分和治疗性蛋白质组成成分可以直接融合，或者使用多种长度的接头肽使两者融合，以提供较大的物理间距，使融合蛋白质之间的空间灵活性更大，从而最大化治疗性蛋白质部分的易靠近性，例如，用于与其关联受体结合。接头肽可由柔性或更刚性的氨基酸组成。例如，接头可以是例如但不限于一段聚-甘氨酸序列。接头可以少于约50，40，30，20或10个氨基酸残基。接头可以在运铁蛋白或其部分和治疗性蛋白质之间与它们共价连接。

检测Tf融合蛋白

检测有生物活性的、经修饰运铁蛋白-治疗性蛋白质融合蛋白的试验包括：Western转移、蛋白质印迹或菌落滤膜以及检测融合治疗性蛋白质的基于活性的试验。使用Towbin等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350-4354，1979)所述的方法可以制备Western转移滤膜。简单地说，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳样品。将凝胶中的蛋白质电泳转移至硝酸纤维素滤膜。通过使用例如Minifold(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)的硝酸纤维素滤膜过滤上清液样品或浓缩物，即可制备蛋白质印迹滤膜。通过在涂抹了适当生长培养基的硝酸纤维素滤膜上培养菌落，即可制备菌落滤膜。在此方法中，优选固体培养基。使细胞在滤膜上培养至少12小时。通过用适当缓冲液冲洗从滤膜上除去细胞，所述缓冲液不会除去与滤膜结合的蛋白质。优选的缓冲液含有25mM Tris-base，19mM甘氨酸，pH8.3，20％甲醇。

通过分析治疗性蛋白质组成成分的活性也可检测本发明的融合蛋白。所述试验是容易实施的，包括但不限于表1所述的试验。具体地说，可以使用表1“例举的活性试验”一栏中提及的试验，来分析本发明运铁蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性或治疗活性)。另外，本领域技术人员可以使用表1相应行中提及的试验，常规检测对应于本发明融合蛋白之治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质片断的活性。另外，本领域技术人员可以使用本领域已知的试验常规检测经修饰运铁蛋白之片断的活性。

例如，在一个检测本发明运铁蛋白融合蛋白结合或与治疗性蛋白质竞争结合抗-治疗性多肽抗体和/或抗-运铁蛋白抗体之能力的实施方案中，可以使用本领域已知的多种免疫测定法，包括但不限于竞争性和非-竞争性检测系统，所述系统使用了如下技术：放射性免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附试验)、夹心免疫测定法、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫测定法(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集试验(如凝胶凝集试验)、补体固定试验、免疫荧光试验、A蛋白试验和免疫电泳试验等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在另一个实施方案中，对第二抗体进行标记。在免疫测定法中检测结合的多种方法是本领域已知的，它们也落入本发明的范围之内。

在另一个实施方案中，当鉴定出治疗性蛋白质的结合配对物(如受体或配体)时，通过本领域众所周知的方法可检测含有该治疗性蛋白质作为融合蛋白的治疗性蛋白质部分的运铁蛋白融合蛋白与所述结合配对物的结合，所述方法如还原和非-还原的凝胶层析、蛋白质亲合层析和亲和印迹。其它方法也为本领域技术人员所知，并且落入本发明的范围之内。

分离/纯化经修饰的运铁蛋白融合蛋白

在允许有生物活性的融合蛋白分泌的条件下培养宿主细胞，从其培养基中分离被分泌的、有生物活性的经修饰运铁蛋白融合蛋白。从培养基中除去细胞材料，使用本领域已知的分离技术分离出有生物活性的融合蛋白。适当的分离技术包括沉淀和通过多种层析法的分级分离，所述层析法包括凝胶过滤、离子交换层析和亲合层析。

特别优选的纯化方法是在铁结合或金属鳌合柱上进行的亲合层析，或使用抗体的免疫亲合层析，所述抗体抗运铁蛋白或治疗性蛋白质或多肽融合物的肽部分。优选使抗体固定或结合于固体支持物或底物。特别优选的底物是CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通过此方法，在允许发生结合的条件下将培养基与抗体/底物混合。冲洗复合物以除去未结合的物质，通过使用不利于复合物形成的条件释放或洗脱运铁蛋白融合蛋白。特别有用的洗脱方法包括：改变pH，其中固定化抗体在第一个pH下对配体具有高亲和性，而在第二个(较高或较低)pH下亲和性降低；改变某个离液剂的浓度；或使用去污剂。

被标记的经修饰运铁蛋白融合蛋白

也可以用放射性同位素或其它显像剂标记本发明的运铁蛋白融合蛋白，并将其用于体内诊断目的。优选的放射性同位素显像剂包括碘-125和鍀-99，特别优选的是鍀-99。产生蛋白质-同位素偶联物的方法是本领域众所周知的，其描述于例如Eckelman等，(美国专利4,652,440)，Parker等，(WO87/05030)和Wilber等，(EP 203,764)。或者，运铁蛋白融合蛋白可与自旋标记增强剂结合，并用于磁共振(MR)成像。适当的自旋标记增强剂包括稳定的、有空间位阻的、自由基化合物，如硝基氧。标记配体以进行MR成像的方法描述于例如Coffiman等，(美国专利4,656,026)。为了进行给药，可将经标记的运铁蛋白融合蛋白与药物可接受载体或稀释剂，如无菌盐水或无菌水混合。优选通过造影剂注射，优选为静脉内注射进行给药。

制备融合蛋白

本发明还提供了使用本文所述的核酸分子制备本发明的经修饰融合蛋白的方法。一般说来，制备重组形式的蛋白质一般包括下述步骤。

首先需获得编码本发明运铁蛋白融合蛋白的核酸分子。然后优选使所述核酸分子与上文所述的适当控制序列可操作相连，以形成含有蛋白质开放阅读框的表达单位。使用所述表达单位转化适当宿主，并在允许产生重组蛋白质的条件下培养经转化的宿主。任选从培养基或细胞中分离重组蛋白质；在允许有一些杂质存在的情况下，蛋白质的回收和纯化不是必需的。

可以用多种方法完成上述步骤中的每一步。例如，使用如上所述的适当复制子和控制序列完成可在多种宿主中使用的表达载体的构建。控制序列、表达载体和转化方法取决于表达基因所用宿主细胞的类型，这一点已在上文中详细讨论过，或已为本领域技术人员所知。可以在编码序列的末端添加适当的限制性位点(如果该位点一般不是现成的)，以提供可切下的基因插入这些载体中。本领域技术人员能容易地改动本领域已知的任何宿主/表达系统，以与本发明的核酸分子联合使用，产生所需的重组蛋白质。

如上所述，可以使用任何表达系统，包括酵母、细菌、动物、植物、真核和原核系统。在一些实施方案中，优选酵母、哺乳动物细胞培养物和转基因动物或植物生产系统。在其它实施方案中，可以使用经修饰降低了天然酵母糖基化、高-糖基化或蛋白酶解活性的酵母系统。

治疗性分子

在本发明的方法和组合物中，任何治疗性分子都可用作Tf的融合配对物。本文所用的治疗性分子一般为能在体外或体内发挥有利生物学作用的蛋白质或肽，包括能发挥与正常稳态、生理学或疾病状态相关的有利作用的蛋白质或肽。治疗性分子不包括常用作标记或蛋白质纯化辅助物的融合配对物，例如半乳糖苷酶(参见例如美国专利5,986,067和Aldred等，(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.122：960-965)。例如，与疾病状态有关的有利作用包括对治疗受试者有利的任何作用，包括疾病预防、疾病稳定化、减轻或缓和疾病症状或调节、缓和或治愈潜在缺陷以产生对被治疗的受试者有利的作用。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白至少包括治疗性蛋白质的片断或变体以及经修饰血清运铁蛋白的片断或变体，优选通过基因融合或化学偶联使两者彼此相连。

在一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括与神经药剂相连的经修饰运铁蛋白分子。在另一个实施方案中，经修饰运铁蛋白融合蛋白包括羧基末端与神经药剂的氨基末端相连的运铁蛋白。在可替代的实施方案中，经修饰运铁蛋白融合蛋白包括氨基末端与神经药剂的羧基末端相连的运铁蛋白。在具体实施方案中，神经药剂是神经生长因子或睫状神经营养因子。

在另一个实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白至少含有治疗性蛋白质的片断或变体，和/或抗体片断或变体。在其它实施方案中，运铁蛋白融合蛋白可含有蛋白质或抗体的肽片断或肽变体，其中变体或片断保留了至少一种生物学或治疗活性。运铁蛋白融合蛋白可含有长度为至少约4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少约40，至少约50，至少约55，至少约60或至少约70或更多个氨基酸的、与经修饰运铁蛋白的N和/或C末端融合、插入其中、或插入其环中的肽片断或肽变体作为治疗性蛋白质。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合分子含有可以是治疗性蛋白质片断的治疗性蛋白质部分，它包括全长蛋白质以及从氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合分子含有可以是治疗性蛋白质片断的治疗性蛋白质部分，它包括全长蛋白质以及从氨基酸序列的羧基末端缺失了一个或多个残基的多肽。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合分子含有可以治疗性蛋白质部分，所述部分从氨基和羧基末端缺失了一个或多个氨基酸。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合分子含有治疗性蛋白质部分，所述部分与本文所述的参照治疗性蛋白质或其片断至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合分子含有治疗性蛋白质部分，所述部分与上文所述的氨基酸序列N-和C-末端有缺失的参照多肽至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

在另一个实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合分子含有治疗性蛋白质部分，所述部分与例如治疗性蛋白质的天然或野生型氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同。

通过与一个或多个寡糖基团结合，可以修饰对应于本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质，如细胞表面和分泌蛋白质。被称为糖基化的修饰可显著影响蛋白质的物理特性，对于蛋白质的稳定性、分泌和定位也是至关重要的。糖基化在沿着多肽主链的特定位置发生。通常有两种主要的糖基化形式：特征在于O-联寡糖的糖基化，所述寡糖与丝氨酸或苏氨酸残基结合；以及特征在于N-联寡糖的糖基化，所述寡糖与Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺残基结合，其中X可以是除脯氨酸外的氨基酸。蛋白质结构和细胞类型的变化影响链内不同糖基化位点的糖类单位的数目和特性。在给定细胞类型内，相同位点处也能常常见到糖基化异构体。例如，几种类型的人干扰素被糖基化。

可以修饰对应于本发明运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质及其类似物和变体，使得作为由表达它们的宿主细胞操纵其核酸序列的结果，或因其其它的表达条件导致一个或多个位点处的糖基化有所改变。例如，通过废除或导入糖基化位点，如通过取代或缺失氨基酸残基，如用谷氨酰胺取代天冬酰胺即可产生糖基化异构体，或者，可以通过在不会使其糖基化的宿主细胞，如糖基化有缺陷的酵母中表达蛋白质，即可产生非糖基化的重组蛋白质。这些方法是本领域已知的。

治疗性蛋白质及其核酸序列是本领域众所周知的，可得自公共数据库，如Chemical Abstracts Services Databases(如CAS Registry)，GenBank和GenSeq。下文提及的登录号和序列都全文列入本文作为参考。

在其它实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白具有对应于表1相应栏和本申请其它地方所述的治疗性蛋白质之治疗活性和/或生物活性的治疗活性和/或生物活性(参见例如表1的“生物活性”和“治疗性蛋白质X”栏)。在其它实施方案中，本发明运铁蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白质部分是本文所述参照序列的片断或变体。

本发明还涉及含有本文所述的治疗性蛋白质片断的经修饰Tf融合蛋白。即使从蛋白质的N-末端缺失一个或多个氨基酸会导致治疗性蛋白质部分的一种或多种生物学功能的修饰或丢失，但仍会保留其它治疗活性和/或功能活性(如生物活性、多聚化的能力、结合配体的能力)。例如，从N-末端除去完整多肽的少部分残基后，N-末端有缺失的多肽诱导和/或结合能识别完整或成熟形式之多肽的抗体的能力一般仍能保留下来。通过本文所述和本领域已知的常规方法，可以测定缺乏完整多肽的N-末端残基的特定多肽是否仍能保留所述免疫学活性。N-末端缺失了大量氨基酸残基的突变体也有可能保留一些生物学或免疫学活性。实际上，由少至6个氨基酸残基组成的肽经常能引发免疫应答。

如上所述，即使从治疗性蛋白质的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸会导致蛋白质一种或多种生物学功能的修饰或丢失，但仍会保留其它功能活性(如生物活性、多聚化的能力、结合配体的能力)和/或治疗活性。例如，从C-末端除去完整或成熟多肽的少部分残基后，C-末端有缺失的多肽诱导和/或结合能识别完整或成熟形式之多肽的抗体的能力一般仍能保留下来。通过本文所述和/或本领域已知的常规方法，可以容易地测定缺乏参照多肽的N-末端和/或C-末端残基的特定多肽是否仍能保留治疗活性。

治疗性蛋白质的肽片断可以是片断，所述片断含有能显示出衍生得到该片断的治疗性蛋白质之多肽序列的治疗活性和/或功能活性(如生物活性)的氨基酸序列，或由所述序列组成。

其它多肽片断是生物活性片断。生物活性片断是表现出与本发明所用治疗性蛋白质的活性相似、但不必相同之活性的片断。片断的生物活性可包括改善的合乎需要的活性或降低的不必要的活性。

一般说来，蛋白质的变体整体上非常类似，在很多区域都与对应于本发明运铁蛋白融合蛋白之治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质的氨基酸序列相同。本发明也包括编码这些变体的核酸。

本发明可以使用的其它治疗性多肽是由在本领域技术人员已知的严紧杂交条件下能与编码治疗性蛋白质氨基酸序列之核酸分子的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。(参见例如Ausubel，F.M.等，eds.，1989Currentprotocol in Molecular Biology，Green Publishing Associates，Inc.，and JohnWiley & Sons Inc.，New.York)。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

具有与本发明的问题氨基酸序列至少例如95％“相同的”氨基酸序列的多肽指的是：除了受试多肽序列可在问题氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多达5个氨基酸改变外，受试多肽的氨基酸序列与问题序列相同。换句话说，为了获得具有与问题氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，受试序列中多达5％的氨基酸残基可被插入、缺失或用另一种氨基酸取代。参照序列的这些改变可发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或发生在所述末端位置之间的任何位置，或单个散布于参照序列的残基中，或散布于参照序列内的一个或多个邻近基团中。

在实践中，使用已知的计算机程序可以常规测定任何特定多肽是否与例如，本发明的运铁蛋白融合蛋白或其片断(例如运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分或运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分)的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。使用基于Brufiag-等，(Comp.App.Biosci 245-(1990))之算法的FASTDB计算机程序，即可确定测定问题序列(本发明的序列)和受试序列之间的最佳全面匹配的优选方法，所述方法也被称为完全序列比对。

本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区或这两处含有改变。可以使用含有改变的多核苷酸变体制备经修饰的Tf融合蛋白，所述改变能产生沉默的取代、添加或缺失，但不会改变所编码多肽的特性或活性。可以利用因遗传密码简并性所致的沉默取代产生的核苷酸变体。另外，可以利用以任意组合取代、缺失或添加了少于约50，少于40，少于30，少于20，少于10，或5-50，5-25，5-10，1-5或1-2个氨基酸的多肽变体。产生多核苷酸变体的原因可以有多个，例如针对特定宿主最优化密码子的表达(将人mRNA的密码子改变为被上述宿主，如酵母或大肠杆菌优选的密码子)。

在其它实施方案中，与野生型序列相比，治疗性蛋白质组成成分具有保守取代。“保守取代”欲指组内交换，如脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的取代；和小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的取代。例如，Bowie等在＂Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions，＂Science 247：1306-1310(1990)中提供了有关如何进行表型沉默的氨基酸取代的指导。在具体实施方案中，本发明的多肽含有本文所述治疗性蛋白质和/或运铁蛋白，和/或本发明的经修饰运铁蛋白的氨基酸序列的片段或变体，或由所述片段或变体组成，其中当与参照氨基酸序列相比时，所述片段或变体具有1-5，5-10，5-25，5-50，10-50或50-150个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。在其它实施方案中，氨基酸取代是保守的。本发明还包括编码这些多肽的核酸。

本发明的经修饰融合蛋白由通过肽键或经修饰肽键彼此连接的氨基酸组成，它可含有除20个基因-编码氨基酸以外的氨基酸。可以通过任一种天然方法，例如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰技术来修饰多肽。基础教材和更详细的专题著作以及多卷研究文献中详细描述了所述修饰。

修饰可发生在多肽的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应理解在给定多肽的几个位点处，存在相同或不同程度的相同类型的修饰。给定多肽也可含有很多种修饰。多肽也可以因为例如遍在蛋白化而出现分支，它们也可以是分支或不分支的环形分子。环形、分支、以及分支环形多肽可以由翻译后的天然加工过程获得，也可以由合成方法制备。修饰包括乙酰基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素共价结合、与血红素组成成分共价结合、与核苷酸或核苷酸衍生物共价结合、与脂质或脂质衍生物共价结合、与phosphotidylinositol共价结合、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、prenylation、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硫酸盐化、蛋白质中由转运-RNA介导的氨基酸添加，如精氨酰化和遍在蛋白化(参见例如

，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New′York，pgs.1-12(1983)；Seifter等(1990)Meth.Enzymol.182：626-646；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62。

可以与Tf融合或插入Tf中的治疗性分子包括但不限于：激素、基质蛋白质、免疫抑制剂、支气管扩张药、心血管药剂、酶、CNS药剂、神经递质、受体蛋白质或肽、生长激素、生长因子、抗病毒肽、融合抑制肽、细胞因子、淋巴因子、单核因子、白细胞介素、集落刺激因子、分化因子、血管生成因子、受体配体、癌症-相关蛋白、抗肿瘤剂、病毒肽、抗菌肽、血液蛋白质、拮抗剂蛋白质、转录因子、抗-血管生成因子、拮抗剂蛋白质或肽、受体拮抗剂、抗体、单链抗体和细胞粘附分子。不同的治疗性分子可与单个融合蛋白混合以产生双或多功能的治疗性分子。也可以联合使用不同的分子以产生具有治疗实体和靶向实体的融合蛋白。

细胞因子是由免疫系统的细胞释放的可溶性蛋白质，它通过特定的受体发挥非酶解作用以调节免疫应答。细胞因子与激素的相似之处在于：它们能在低浓度下起作用，以高亲和性与特定受体结合。本文所用术语“细胞因子”用于描述能在具有该细胞因子的受体的细胞中引发特异性生物反应的天然或重组的蛋白质，及其类似物和片段。细胞因子优选包括白细胞介素，如白细胞介素-2(IL-2)(GenBank登录号S77834)，IL-3(GenBank登录号M14743)，IL-4(GenBank登录号M23442)，IL-5(GenBank登录号J03478)，IL-6(GenBank登录号M14584)，IL-7(GenBank登录号NM_000880)，IL-10(GenBank登录号NM_000572)，IL-12(GenBank登录号AF180562和GenBank登录号AF180563)，IL-13(GenBank登录号U10307)，IL-14(GenBank登录号XM_170924)，IL-15(GenBank登录号X91233)，IL-16(GenBank登录号NM_004513)，IL-17(GenBank登录号NM_002190)和IL-18(GenBank登录号NM_001562)，造血因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(GenBank登录号X03021)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(GenBank登录号X03656)，血小板活化因子(GenBank登录号NM_000437)和促红细胞生成素(GenBank登录号X02158)，肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα(GenBank登录号X02910)，淋巴因子，如淋巴毒素-α(GenBank登录号X02911)，淋巴毒素-β(GenBank登录号L11016)，白细胞调节素，巨噬细胞迁移抑制因子(GenBank登录号M25639)，和神经白细胞素(GenBank登录号K03515)，代谢过程调节剂，如leptin(GenBank登录号U43415)，干扰素，如干扰素α(IFNα)(GenBank登录号M54886)，IFNβ(GenBank登录号V00534)，IFNγ(GenBank登录号J00219)，IFNo(GenBank登录号NM_002177)，血小板反应蛋白1(THBS1)(GenBank登录号NM_003246)，THBS2(GenBank登录号L12350)，THBS3(GenBank登录号L38969)，THBS4(GenBank登录号NM_003248)和趋化因子。优选本发明的经修饰运铁蛋白-细胞因子融合蛋白显示出细胞因子生物活性。

本文所用术语“激素”用于描述多种生物活性物质中的任一种，所述物质由某种细胞或组织产生，并能导致位于身体别处的另一种细胞或组织产生特异性生物学变化或活性。优选激素包括胰岛素原(GenBank登录号V00565)，胰岛素(GenBank登录号NM_000207)，生长激素1(GenBank登录号V00520)，生长激素2(GenBank登录号F006060)，生长激素释放因子(GenBank登录号NM_021081)，胰岛素-样生长因子I(GenBank登录号M27544)，胰岛素-样生长因子II(GenBank登录号NM_000612)，胰岛素-样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)(GenBank登录号M59316)，IGFBP-2(GenBank登录号X16302)，IGFBP-3(GenBank登录号NM_000598)，IGFBP-4(GenBank登录号Y12508)，IGFBP-5(GenBank登录号M65062)，IGFBP-6(GenBank登录号NM_002178)，IGFBP-7(GenBank登录号NM_001553)，绒毛膜促性腺素β链(GenBank登录号NM_033142)，绒毛膜促性腺素α链(GenBank登录号NM_000735)，促黄体素β(GenBank登录号X00264)，促滤泡激素β(GenBank登录号NM_000510)，促甲状腺素β(GenBank登录号NM_000549)，促乳素(GenBank登录号NM_000948)，阿黑皮素原(GenBank登录号V01510)，促肾上腺皮质素(ACTH)，β-促脂解素，α-促黑激素(α-MSH)，γ-促脂解素，β-MSH，β-内啡肽和中间叶促皮质样肽(CLIP)。

本文所用术语“生长因子”用于描述任何与受体结合以促进细胞增殖的蛋白质或肽。生长因子优选包括血小板-衍生生长因子-α(PDGF-α)(GenBank登录号X03795)，PDGF-β(GenBank登录号X02811)，类固醇激素，表皮生长因子(EGF)(GenBank登录号NM_001963)，成纤维细胞生长因子，如成纤维细胞生长因子1(FGF1)(GenBank登录号NM_000800)，FGF2(GenBank登录号NM_002006)，FGF3(GenBank登录号NM_005247)，FGF4(GenBank登录号NM_002007)，FGF5(GenBank登录号M37825)，FGF6(GenBank登录号X57075)，FGF7(GenBank登录号NM_002009)，FGF8(GenBank登录号AH006649)，FGF9(GenBank登录号NM_002010)，FGF10(GenBank登录号AB002097)，FGF11(GenBank登录号NM_004112)，FGF12(GenBank登录号NM_021032)，FGF13(GenBank登录号NM_004114)，FGF14(GenBank登录号NM_004115)，FGF16(GenBank登录号AB009391)，FGF17(GenBank登录号NM_003867)，FGF18(GenBank登录号AF075292)，FGF19(GenBank登录号NM_005117)，FGF20(GenBank登录号NM_019851)，FGF21(GenBank登录号NM_019113)，FGF22(GenBank登录号NM_020637)和FGF23(GenBank登录号NM_020638)，血管生成素(GenBank登录号M11567)，脑-衍生的神经营养因子(GenBank登录号M61176)，睫状神经营养生长因子(GenBank登录号X60542)，转化生长因子-α(TGF-α)(GenBank登录号X70340)，TGF-β(GenBank登录号X02812)，神经生长因子-α(NGF-α)(GenBank登录号NM_010915)，NGF-β(GenBank登录号X52599)，金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)(GenBank登录号NM_003254)，TIMP2(GenBank登录号NM_003255)，TIMP3(GenBank登录号U02571)，TIMP4(GenBank登录号U76456)和巨噬细胞刺激因子1(GenBank登录号L11924)。

本文所用术语“基质蛋白质”用于描述通常存在于细胞外基质中的蛋白质或肽。这些蛋白质对于强度、过滤或粘附功能至关重要。基质蛋白质优选包括胶原，如胶原I(GenBank登录号Z74615)，胶原II(GenBank登录号X16711)，胶原III(GenBank登录号X14420)，胶原IV(GenBank登录号NM_001845)，胶原V(GenBank登录号NM_000393)，胶原VI(GenBank登录号NM_058175)，胶原VII(GenBank登录号L02870)，胶原VIII(GenBank登录号NM_001850)，胶原IX(GenBank登录号X54412)，胶原X(GenBank登录号X60382)，胶原XI(GenBank登录号J04177)和胶原XII(GenBank登录号U73778)，层粘连蛋白，如LAMA2(GenBank登录号NM_000426)，LAMA3(GenBank登录号L34155)，LAMA4(GenBank登录号NM_002290)，LAMB1(GenBank登录号NM_002291)，LAMB3(GenBank登录号L25541)，LAMC1(GenBank登录号NM_002293)，巢蛋白(GenBank登录号NM_002508)，α-tectorin(GenBank登录号NM_005422)，β-tectorin(GenBank登录号NM_058222)和纤连蛋白(GenBank登录号X02761)。

术语“血液蛋白质”的传统定义为来源于血浆的蛋白质，但目前常由重组方法生产血液蛋白质，其包括但不限于天然血清蛋白质，其衍生物、片断和突变体或变体，凝血因子，其衍生物、突变体、变体和片断(包括因子VII，VIII，IX，X)，蛋白酶抑制剂(抗凝血酶3，α-1抗胰蛋白酶)，尿激酶型纤溶酶激活物，免疫球蛋白，von Willebrand因子和von Willebrand突变体，纤连蛋白，血纤蛋白原，凝血酶和血红蛋白。

本文所用术语“酶”用于描述任何能催化特异性反应，而自身永远不会被改变或破坏的蛋白质或蛋白质类物质。酶优选包括凝结因子，如F2(GenBank登录号XM_170688)，F7(GenBank登录号XM_027508)，F8(GenBank登录号XM_013124)，F9(GenBank登录号NM_000133)，F10(GenBank登录号AF503510)等，基质金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶I(GenBank登录号MMP1)(GenBank登录号NM_002421)，MMP2(GenBank登录号NM_004530)，MMP3(GenBank登录号NM_002422)，MMP7(GenBank登录号NM_002423)，MMP8(GenBank登录号NM_002424)，MMP9(GenBank登录号NM_004994)，MMP10(GenBank登录号NM_002425)，MMP12(GenBank登录号NM_002426)，MMP13(GenBank登录号X75308)，MMP20(GenBank登录号NM_004771)，腺苷脱氨酶(GenBank登录号NM_000022)，促分裂原活化蛋白激酶，如MAPK3(GenBank登录号XM_055766)，MAP2K2(GenBank登录号NM_030662)，MAP2K1(GenBank登录号NM_002755)，MAP2K4(GenBank登录号NM_003010)，MAP2K7(AF013588)和MAPK12(NM_002969)，激酶，如JNKK1(GenBank登录号U17743)，JNKK2(GenBank登录号AF014401)，JAK1(M64174)，JAK2(NM_004972)和JAK3(NM_000215)以及磷酸酶PPM1A(GenBank登录号NM_021003)和PPM1D(GenBank登录号NM_003620)。

本文所用术语“转录因子”用于描述任何参与蛋白质编码基因之转录的蛋白质或肽。转录因子包括Sp1，Sp2(GenBank登录号NM_003110)，Sp3(GenBank登录号AY070137)，Sp4(GenBank登录号NM_003112)，NFYB(GenBank登录号NM_006166)，Hap2(GenBank登录号M59079)，GATA-1(GenBank登录号NM_002049)，GATA-2(GenBank登录号NM_002050)，GATA-3(GenBank登录号X55122)，GATA-4(GenBank登录号L34357)，GATA-5，GATA-6(GenBank登录号NM_005257)，FOG2(NM_012082)，Eryf1(GenBank登录号X17254)，TRPS1(GenBank登录号NM_014112)，NF-E2(GenBank登录号NM_006163)，NF-E3，NF-E4，TFCP2(GenBank登录号NM_005653)，Oct-1(GenBank登录号X13403)，同源框蛋白，如HOXB2(GenBank登录号NM_002145)，HOX2H(GenBank登录号X16665)，无毛同系物(GenBank登录号NM_005144)，抗母体decapentaplegic蛋白，如MADH1(GenBank登录号NM_005900)，MADH2(GenBank登录号NM_005901)，MADH3(GenBank登录号NM_005902)，MADH4(GenBank登录号NM_005359)，MADH5(GenBank登录号AF009678)，MADH6(GenBank登录号NM_005585)，MADH7(GenBank登录号NM_005904)，MADH9(GenBank登录号NM_005905)，以及转录蛋白的信号转导物和激活物，如STAT1(GenBank登录号XM_010893)，STAT2(GenBank登录号NM_005419)，STAT3(GenBank登录号AJ012463)，STAT4(GenBank登录号NM_003151)，STAT5(GenBank登录号L41142)和STAT6(GenBank登录号NM_003153)。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性分子是非-人或非-哺乳动物蛋白质。例如，优选HIV gp120，HIV Tat，其它病毒(如肝炎病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒和RSV)的表面蛋白，其它HIV组分，寄生虫表面蛋白，如疟疾抗原，以及细菌表面蛋白。这些非-人蛋白质可用作例如抗原，或因其有用的活性而被使用。例如，治疗性分子可以是链激酶、葡激酶、尿激酶或其它具有有用酶解活性的蛋白质。

在可替代的实施方案中，治疗性分子是具有生物活性的配体-结合蛋白。所述配体-结合蛋白可以例如(1)阻断细胞表面的受体-配体相互作用；或(2)中和血液液相中分子的生物活性，从而防止其到达细胞靶。在一些实施方案中，经修饰的运铁蛋白融合蛋白包括与受体的配体-结合结构域融合的经修饰运铁蛋白分子，所述受体选自，但不限于低密度脂蛋白(LDL)受体，乙酰基化LDL受体，肿瘤坏死因子α受体，转化生长因子β受体，细胞因子受体，免疫球蛋白Fc受体，激素受体，葡萄糖受体，糖脂受体和糖胺聚糖受体。在其它实施方案中，配体-结合蛋白包括CD2(M14362)，CD3G(NM_000073)，CD3D(NM_000732)，CD3E(NM_000733)，CD3Z(J04132)，CD28(NM_006139)，CD4(GenBank登录号NM_000616)，CD1A(GenBank登录号M28825)，CD1B(GenBank登录号NM_001764)，CD1C(GenBank登录号NM_001765)，CD1D(GenBank登录号NM_001766)，CD80(GenBank登录号NM_005191)，GNB3(GenBank登录号AF501884)，CTLA-4(GenBank登录号NM_005214)，细胞间粘附分子，如ICAM-1(NM_000201)，ICAM-2(NM_000873)，和ICAM-3(NM_002162)，肿瘤坏死因子受体，如TNFRSF1A(GenBank登录号X55313)，TNFR1SFB(GenBank登录号NM_001066)，TNFRSF9(GenBank登录号NM_001561)，TNFRSF10B(GenBank登录号NM_003842)，TNFRSF11B(GenBank登录号NM_002546)和TNFRSF13B(GenBank登录号NM_006573)，和白细胞介素受体，如IL2RA(GenBank登录号NM_000417)，IL2RG(GenBank登录号NM_000206)，IL4R(GenBank登录号AF421855)，IL7R(GenBank登录号NM_002185)，IL9R(GenBank登录号XM_015989)和IL13R(GenBank登录号X95302)。优选本发明的Tf-配体-结合蛋白融合物显示出配体-结合蛋白的生物活性。

本文所用术语“癌症-相关蛋白”用于描述其表达与癌症或维持受控细胞生长相关的蛋白质或多肽，例如由肿瘤抑制基因或癌基因编码的蛋白质。癌症-相关蛋白可以是p16(GenBank登录号AH005371)，p53(GenBank登录号NM_000546)，p63(GenBank登录号NM_003722)，p73(GenBank登录号NM_005427)，BRCA1(GenBank登录号U14680)，BRCA2(GenBank登录号NM_000059)，CTBP相互作用蛋白(GenBank登录号U72066)，DMBT1(GenBank登录号NM_004406)，HRAS(GenBank登录号NM_005343)，NCYM(GenBank登录号NM_006316)，FGR(GenBank登录号NM_005248)，myb(GenBank登录号AF104863)，raf1(GenBank登录号NM_002880)，erbB2(GenBank登录号NM_004448)，VAV(GenBank登录号X16316)，c-fos(VGenBank登录号01512)，c-fes(GenBank登录号X52192)，c-jun(GenBank登录号NM_002228)，MAS1(GenBank登录号M13150)，pim-1(GenBank登录号M16750)，TIF1(GenBank登录号NM_003852)，c-fms(GenBank登录号X03663)，EGFR(GenBank登录号NM_005228)，erbA(GenBank登录号X04707)，c-src酪氨酸激酶(GenBank登录号XM_044659)，c-abl(GenBank登录号M14752)，N-ras(GenBank登录号X02751)，K-ras(GenBank登录号M54968)，jun-B(GenBank登录号M29039)，c-myc(GenBank登录号AH001511)，RB1(GenBank登录号M28419)，DCC(GenBank登录号X76132)，APC(GenBank登录号NM_000038)，NF1(GenBank登录号M89914)，NF2(GenBank登录号Y18000)和bcl-2(GenBank登录号M13994)。

本文所用术语“融合抑制剂肽”用于描述显示出抗病毒活性，抗-膜融合能力，和/或调节细胞内过程(如参与卷曲螺旋肽结构)之能力的肽。抗病毒活性包括但不限于抑制HIV-1，HIV-2，RSV，SIV，EBV，麻疹病毒，流感病毒或CMV传播至非感染细胞。另外，肽的抗融合能力，抗病毒活性或细胞内调节活性仅需要肽的存在，具体地说，不需要刺激抗所述肽的宿主免疫应答。抗融合指的是：相对于缺乏肽时两种或多种组成成分之间发生的膜融合水平而言，所述肽能抑制或降低所述组成成分之间的膜融合事件的水平。组成成分可以是例如细胞膜或病毒结构，如病毒包膜或纤毛。本文所用术语“抗病毒肽”指的是所述肽能抑制病毒对细胞的感染，或能抑制一些经由例如细胞-细胞融合或游离病毒感染的生产性病毒感染和/或病毒病理所需的病毒活性。所述感染可包括发生于有包膜病毒中的膜融合，或者一些其它的与病毒结构和细胞结构有关的融合事件。融合抑制剂肽和抗病毒肽常具有得自一种以上病毒蛋白质的氨基酸序列(例如得自HIV-1，HIV-2，RSV和SIV的多肽)。

融合抑制剂肽和抗病毒肽的例子见于WO 94/2820，WO 96/19495，WO96/40191，WO 01/64013和美国专利6,333,395，6,258,782，6,228,983，6,133,418，6,093,794，6,068,973，6,060,065，6,054,265，6,020,459，6,017,536，6,013,263，5,464,933，5,346,989，5,603,933，5,656,480，5,759,517，6,245,737，6,326,004和6,348,568(皆列入本文作为参考)。在优选实施方案中，抗融合肽选自HIVT-20(FWNWLSAWKDLELLEQENKE QQNQSEEILSHILSTY，SEQ ID NO：4)，HIVT-1249，RSV T786(VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELL ENV，SEQ ID NO：5)，RSV T1584(AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL，SEQ ID NO：6)和RSV T112(VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV，SEQ ID NO：7)。

其它类型的肽的例子包括本文所述治疗性蛋白质的片断，特别是保留了亲代分子的至少一种活性的人蛋白质片断。可用于生产本发明的经修饰TF融合蛋白的肽还包括模拟肽和表现出治疗性蛋白质的生物活性，但序列或三维结构与全长治疗性蛋白质不同的肽。作为非-限制性的例子，肽包括Johnson等.(2000)Nephrol.Dial.Transplant 15(9)：1274-7，Kuai等.(2000)J.Pept.Res.56(2)：59-62，Barbone等.(1999)Nephrol.Dial.Transplant.14 Supp2：80-4，Middleton等.(1999)J.Biol.Chem.274(20)：14163-9，Johnson等.(1998)Biochemistry 37(11)：3699-710，Johnson等.(1997)Chem.Biol.12：939-50，Wrighton等.(1997)Nat.Biotechnol.15(12)：1261-5，Livnah等.(1996)Science273：464-71，和Wrighton等，(1996)Science 273：458-64中公开的促红细胞生成素模拟肽。

治疗性蛋白质还包括过敏原蛋白质及其经消化的片断。其包括豚草、黑麦、六月草、果园草、香春(sweet vernal)草、红顶(red top)草、梯牧草、黄色阔叶野草、小麦、玉米、蒿属植物、早熟禾、加利福利亚一年生草、苋、狗牙草、细叶钾猪毛菜、山雪松、橡树、羽叶槭、悬铃木、枫树、榆树等的花粉过敏原，尘螨，蜂毒，食物过敏原，动物皮屑和其它昆虫毒液。

其它治疗性分子包括微生物疫苗，所述疫苗包括病毒、细菌和原生动物疫苗及其多种组分，如表面抗原。所述疫苗包括含有糖蛋白，蛋白质或衍生自这些蛋白质的肽的疫苗。所述疫苗制备自金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、克雷白氏杆菌、变形菌、霍乱弧菌、弯曲杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、百日咳博德特氏杆菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、梅毒密螺旋体、衣原体、破伤风类毒素、白喉类毒素、流感病毒、腺病毒、副粘病毒(腮腺炎病毒，麻疹病毒)、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、狂犬病毒、HIV-1、HIV-2、RSV和乳头瘤病毒。

优选的融合分子可含有抗-HIV病毒肽，抗-RSV肽，人生长激素，α和或β干扰素，促红细胞生成素(EPO)，EPO样肽，粒细胞-集落刺激因子(GCSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，胰岛素，胰岛素-样生长因子(IGF)，血小板生成素，对应于抗体CDR的肽，胰岛新生相关蛋白(INGAP)，降钙素，制管张素，endostatin，白细胞介素-2，生长激素释放因子，人甲状旁腺激素，抗-肿瘤坏死因子(TNF)肽，白细胞介素-1(IL-1)受体和/或单链抗体。

本发明的融合蛋白也可被制备成包括得自肽文库的肽或多肽，以筛选出具有新功能的分子。所述肽文库包括可商购或能为公众获得的肽文库，例如American Peptide Co.Inc.，Cell Sciences Inc.，Invitrogen Corporation，Phoenix Pharmaceuticals Inc.，United States Biological，以及通过可利用的技术产生的肽文库，如使用标准方法制备的噬菌体和细菌展示文库。

在本发明的其它实施方案中，可使用本领域已知的治疗性蛋白质组成成分来制备Tf融合蛋白，由FDA(www.fda.gov/cber/efoi/approve.htm)以及PCT专利公开号WO 01/79258，WO 01/77137，WO 01/79442，WO 01/79443，WO01/79444和WO 01/79480(皆全文列入本文作为参考)最新认可的肽和蛋白质即是所述融合蛋白的例子。

表1(改编自PCT国际公开号WO 01/79444)提供了非穷举的治疗性蛋白质列表，所述蛋白质对应于本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。“治疗性蛋白质X”一栏公开了治疗性蛋白质分子，其后面的括号中包含学名和商品名，所述分子含有治疗性蛋白质分子或其片断或其变体，或由它们组成。本文所用“治疗性蛋白质X”指的是各个治疗性蛋白质分子(由得自CAS和Genbank登录号的氨基酸序列限定)，或指与该栏公开的给定治疗性蛋白质分子相关的整组治疗性蛋白质。“例举的标识符”一栏提供了Chemical Abstracts Services(CAS)登录号(由American Chemical Society公开)和/或Genbank登录号(例如通过网址为www.ncbi.nlm.nih.gov的国立生物技术信息中心(NCBI)的网页即可获得基因座ID，NP-XXXXX(参照序列蛋白质)，和XP-XXXXX(模型蛋白质)标识符)，所述登录号相当于CAS Registry或Genbank数据库的入口，所述数据库含有治疗性蛋白质分子或其片断或变体的氨基酸序列。另外，表1还给出GenSeq登录号和/或期刊出处以鉴定所例举的一些多肽的氨基酸序列。

与所述CAS和Genbank和GenSeq登录号以及所提及的期刊出版物中的每一个都相关的摘要页是可以获得的(例如PubMed ID号(PMID))，其全文列入本文作为参考。PCT/专利参考文献一栏提供了对应于描述治疗性蛋白质分子的专利和/或公开的专利申请的美国专利号或PCT国际公开号，它们皆全文列入本文作为参考。生物活性一栏描述了与治疗性蛋白质分子相关的生物活性。例举的活性试验一栏提供了描述试验的参考文献，所述试验可用于检测治疗性蛋白质或含有治疗性蛋白质X部分的本发明的运铁蛋白融合蛋白的治疗和/或生物活性。这些参考文献也全文列入本文作为参考。“优选适应症Y”一栏描述了治疗性蛋白质X或含有治疗性蛋白质X部分的本发明的运铁蛋白融合蛋白可以治疗、预防、诊断或改善的疾病。

表1

将药物或治疗性蛋白质传递至细胞内部和/或使其穿越血脑屏障(BBB)

在本发明的范围内，经修饰的运铁蛋白融合蛋白可用作载体，用于将与运铁蛋白的高铁离子复合的分子或小分子治疗剂传递至细胞内部，或使其穿越血脑屏障。在这些实施方案中，一般需对Tf融合蛋白进行改造或修饰以抑制、防止或消除糖基化，从而延长融合蛋白和/或治疗性蛋白质部分的血清半寿期。特别希望添加靶向肽或例如单链抗体以进一步将Tf融合蛋白靶向至特定的细胞类型，例如癌细胞。

在一个实施方案中，将含铁的抗贫血药物铁-山梨醇-柠檬酸盐复合物负载于本发明的经修饰Tf融合蛋白上。已证实铁-山梨醇-柠檬酸盐(FSC)可在体外抑制多种鼠癌细胞的增殖，并能在体内导致肿瘤消退，但对非-恶性细胞的增殖却无任何影响(Poljak-Blazi等，(June2000)Cancer Biotherapy andRadiopharmaceuticals(美国)，15/3：285-293)。

在另一个实施方案中，将抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin)和/或化疗药物博来霉素(已知这两种药物能与铁离子形成复合物)负载于本发明的Tf融合蛋白上。在其它实施方案中，可以制备药物的盐，如柠檬酸盐或碳酸盐，将所述盐与铁离子复合，然后与Tf结合。由于肿瘤细胞经常显示出较高的铁周转率；经修饰后携有至少一种抗-肿瘤剂的运铁蛋白可使药剂更多地暴露于肿瘤细胞，或者使肿瘤细胞的药剂负荷增加(Demant，E.J.，(1983)Eur.J.of Biochem.137/(1-2)：113-118；Padbury等，(1985)J.Biol.Chem.260/13：7820-7823)。

药物配制剂和治疗方法

可以使用标准的给药方法给需要治疗的患者施用本发明的经修饰融合蛋白。例如，本发明的经修饰Tf融合蛋白可以单独施用，也可与调节特定生理过程的其它药剂联合或有顺序地联合施用。在本文中，当同时施用或以使药剂同时或几乎同时发挥作用的方式独立施用两种药剂时，即称为联合施用两种药剂。

可经由非肠道、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、经皮和口腔途经施用本发明的药剂。例如，可以经由微量灌注将药剂局部施用于受伤位点。或者，或同时通过口服、吸入、鼻或肺途经进行非入侵性给药。给药剂量取决于受试者的年龄、健康状况和体重，同时治疗的类型，必要时还取决于治疗频率和所需疗效的特性。

本发明还提供了含有一种或多种本发明的融合蛋白的组合物。尽管个体需要有差异，但本领域技术人员容易确定各个成分有效量的最佳范围。典型的剂量含有约1pg/kg至约100mg/kg体重。全身性给药的优选剂量含有约100ng/kg至约100mg/kg体重或约100-200mg蛋白质/剂量。经由微量灌注对某个位点直接给药的优选剂量含有约1ng/kg至约1mg/kg体重。当经由直接注射或微量灌注给药时，可对本发明的经修饰融合蛋白进行改造以使其与铁的结合降低或不结合，从而部分防止局部的铁毒性。

除了有药物学活性的融合蛋白外，本发明的组合物可含有适当的药物可接受载体，所述载体含有便于将活性化合物加工成可将活性成分传递至作用位点的药用制品的赋形剂和辅剂。非肠道给药的适当制剂包括水溶形式(如水溶性盐形式)的活性化合物水溶液。另外，可以施用适当油性注射悬浮液形式的活性化合物悬浮液。适当亲脂性溶剂或载体包括脂肪油类，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如乙基油酸酯或甘油三酯。含水注射悬浮液可含有能增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠，山梨醇和葡聚糖。任选悬浮液还含有稳定剂。也可使用脂质体包裹药剂以传递至细胞内。

可配制本发明全身性给药用的药物制剂以进行肠、非肠道或局部给药。实际上，可以同时使用这三种类型的制剂以获得活性成分的全身性给药。口服所用的适当制剂包括硬或软明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，悬浮剂，糖浆或吸入剂及其控释形式。

在实施本发明的方法时，本发明的药剂可以单独或联合用药，或与其它治疗剂或诊断剂联合使用。在某些优选实施方案中，可以同时施用本发明的化合物以及根据普遍被接受的医学实践为这些疾病建议的其它化合物。本发明的化合物可以在体内使用，一般在哺乳动物，如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠体内使用，也可以在体外使用。

本发明的经修饰融合蛋白可用于诊断、预测、预防和/或治疗与内分泌系统、神经系统、免疫系统、呼吸系统、心血管系统、生殖系统、消化系统的疾病和失调有关的疾病和/或失调，与细胞增殖有关的疾病和/或失调，和/或与血液相关的疾病或失调。

在本发明的其它实施方案中，经修饰的Tf融合蛋白可用于诊断、预测、预防和/或治疗疾病和/或失调，所述疾病和/或失调与已知与治疗性蛋白质组成成分相关或可由这些组成成分治疗的疾病和失调相关，所述组成成分是本领域公知的，PCT专利公开号WO 01/79258，WO 01/77137，WO 01/79442，WO 01/79443，WO 01/79444和WO 01/79480(皆全文列入本文作为参考)中例举了这些组成成分。因此，本发明包括治疗表1“优选适应症Y”一栏中所列疾病或失调的方法，所述方法包括给需要这种治疗、预防或改善的患者施用本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白，其中含有对应于表1“治疗性蛋白质X”一栏中公开的治疗性蛋白质的治疗性蛋白质部分，其含量足以有效治疗、防止或改善疾病或失调。

在某些实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白可用于诊断和/或预测疾病和/或失调。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测免疫系统疾病。另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定免疫系统疾病或失调的标记或检测剂。

在优选实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作加强免疫缺陷个体的免疫反应性的药剂。在具体实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作加强B细胞和/或T细胞免疫缺陷个体的免疫反应性的药剂。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测自身免疫病。很多自身免疫病是由免疫细胞将自身不恰当地识别为外来物质而引起的。这种不恰当的识别导致能破坏宿主组织的免疫应答。因此，施用能抑制应答，特别是能抑制T-细胞增殖、分化或趋化性的本发明融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸是预防自身免疫病的有效疗法。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、预测和/或诊断造血细胞疾病。本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血细胞，包括多能干细胞的分化和增殖，旨在治疗或预防与某些(或多种)类型的造血细胞减少有关的疾病，所述疾病包括但不限于白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、贫血和血小板减少症。

或者，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血细胞，包括多能干细胞的分化和增殖，旨在治疗或预防与某些(或多种)类型的造血细胞增加有关的疾病，所述疾病包括但不限于组织细胞增多病。

使用本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸还可以治疗、预防、诊断和/或预测过敏反应和疾病，如哮喘(特别是过敏性哮喘)或其它呼吸问题。另外，可以使用这些分子治疗、预防、预测和/或诊断对抗原分子的过敏性，超敏反应或血型的不相容性。

另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测IgE-介导的过敏反应。所述过敏反应包括但不限于哮喘、鼻炎和湿疹。在具体实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在体外或体内调节IgE浓度。

另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗炎症。例如，由于本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制参与炎症反应的细胞的活化、增殖和/或分化，因此，这些分子可用于预防和/或治疗慢性和急性炎症。所述炎症包括但不限于例如与下述因素有关的炎症：感染(如脓毒性休克、脓毒病或全身性炎症反应综合征)，局部缺血-再灌注损伤，内毒素致死率，补体-介导的超急性排斥，肾炎，细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤，炎性肠病，节段性回肠炎，细胞因子(如TNF或IL-1)的过量产生，呼吸疾病(如哮喘和过敏症)；胃肠疾病(如炎性肠病)；癌症(如胃癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、肝癌和乳腺癌)；CNS疾病(如多发性硬化)；局部缺血性脑损伤和/或中风，外伤性脑损伤，神经变性疾病(如帕金森氏病和Alzheimer病)；与AIDS-相关的痴呆；和朊病毒病；心血管病(如动脉粥样硬化、心肌炎、心血管病和心肺旁路并发症)；以及多种特征在于炎症的其它疾病(例如肝炎、类风湿性关节炎、痛风、外伤、胰腺炎、肉样瘤病、皮炎、肾局部缺血性再灌注损伤、突眼性甲状腺肿、系统性红斑狼疮、糖尿病和同种异型移植物排斥)。

由于炎症是基本的防御机制，因此炎症事实上可影响身体的任何组织。因此，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗组织-特异性炎症，包括但不限于：肾上腺炎、牙槽炎、胆囊胆管炎、阑尾炎、龟头炎、睑炎、支气管炎、粘液囊炎、心炎、蜂窝织炎、子宫颈炎、胆囊炎、声带炎、耳蜗炎、大肠炎、结膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、脑炎、心内膜炎、食道炎、咽鼓管炎、纤维组织炎、毛囊炎、胃炎、肠胃炎、齿龈炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、脑膜炎、子宫炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、肾炎、神经炎、睾丸炎、骨软骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽炎、静脉炎、小儿麻痹症、前列腺炎、牙髓炎、视网膜炎、鼻炎、输卵管炎、巩膜炎、巩膜脉络膜炎、阴囊炎、窦炎、脊椎炎、脂肪组织炎、口腔炎、滑膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎和阴道炎。

在具体实施方案中，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗器官移植排斥和移植物-抗-宿主疾病。宿主免疫细胞通过免疫应答破坏移植组织时即会发生器官排斥。类似地，免疫应答也涉及GVHD，但此时外来的移植免疫细胞会破坏宿主组织。能抑制免疫应答，特别是能抑制T-细胞活化、增殖、分化或趋化性的本发明多肽、抗体或多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂是预防器官排斥或GVHD的有效疗法。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐剂以增强抗-病毒免疫应答。使用本发明的组合物作为佐剂即可增强的抗-病毒免疫应答包括本文所述或本领域已知的病毒和病毒相关疾病或症状。在具体实施方案中，将本发明的组合物用作佐剂来增强对选自AIDS、脑膜炎、登革热、EBV和肝炎(如乙型肝炎)的病毒、疾病或症状的免疫应答。在另一个具体实施方案中，将本发明的组合物用作佐剂来增强对选自HIV/AIDS、呼吸道合胞病毒、登革热、轮状病毒、乙型日本脑炎、甲型和乙型流感、副流感病毒、麻疹、巨细胞病毒、狂犬病、Junin、切昆贡亚热、雷付脱谷热、单纯疱疹病毒和黄热病的病毒、疾病或症状的免疫应答。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐剂以增强抗-细菌或抗-真菌免疫应答。使用本发明的组合物作为佐剂即可增强的抗-细菌或抗-真菌免疫应答包括本文所述或本领域已知的细菌或真菌以及细菌或真菌相关疾病或症状。在具体实施方案中，将本发明的组合物用作佐剂来增强对选自破伤风、白喉、肉毒中毒和乙型脑膜炎的细菌或真菌、疾病或症状的免疫应答。

在另一个具体实施方案中，本发明的组合物可用作佐剂以增强对选自霍乱弧菌、麻风分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、B型链球菌、志贺氏菌、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和布氏疏螺旋体的细菌或真菌、疾病或症状的免疫应答。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐剂以增强抗-寄生虫的免疫应答。使用本发明的组合物作为佐剂即可增强的抗寄生虫免疫应答包括本文所述或本领域已知的寄生虫和寄生虫相关疾病或症状。在具体实施方案中，将本发明的组合物用作佐剂来增强对寄生虫的免疫应答。在另一个具体实施方案中，将本发明的组合物用作佐剂来增强对疟原虫(疟疾)或利什曼原虫的免疫应答。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于通过防止补充和激活单核吞噬细胞来治疗感染疾病，所述疾病包括硅肺病、肉样瘤病和自发肺纤维化。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作抗原，用于产生抗体以抑制或增强抗本发明多肽的免疫介导反应。

在一个实施方案中，给动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪、小型猪、鸡、骆驼、山羊、马、奶牛、绵羊、狗、猫等非人灵长类动物和人，最优选人)施用本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸，以促进免疫系统产生增加量的一种或多种抗体(例如IgG，IgA，IgM和IaE)，促使较高亲和性抗体的产生和免疫球蛋白类别的转换(例如IgG，IgA，IgM和IaE)，和/或增强免疫应答。

在另一个实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于本文所述的一种或多种应用，例如可用于兽药。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于阻断针对外来物或自身物质的免疫应答的多个方面。需要阻断免疫应答的某些方面的疾病包括例如：自身免疫病，如狼疮和关节炎以及对皮肤过敏、炎症、肠病、损伤和病原体相关疾病/失调的免疫应答。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作预防与自身免疫病相关的B细胞增殖和Ig分泌的疗法，所述自身免疫病包括例如自发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮和多发性硬化。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作内皮细胞中B和/或T细胞迁移的抑制剂。该活性能破坏组织结构或相关反应，可用于例如破坏免疫应答和阻断脓毒病。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作疾病中的慢性血丙球蛋白过多事件的疗法，所述疾病包括例如意义不确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、瓦尔登斯特伦氏病、相关的自发性单克隆丙种球蛋白病和浆细胞瘤。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于例如在一些自身免疫病、慢性炎症和感染疾病中抑制巨噬细胞及其前体、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞和一些T-细胞亚型，如活化的和CD8细胞毒的T细胞以及自然杀伤细胞的多肽趋化性和活化。本文描述了自身免疫病的例子，它包括多发性硬化和胰岛素依赖型糖尿病。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通过例如防止单核细胞浸润至动脉壁中来治疗动脉粥样硬化。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促进创伤和组织修复，促进血管生成，和/或促进血管或淋巴疾病或失调的修复。另外，可以使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸促进粘膜表面的再生。

在具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、治疗和/或预防特征在于原发性或获得性免疫缺陷、缺损血清免疫球蛋白产生、复发感染和/或免疫系统机能异常的疾病。另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防关节、骨、皮肤和/或腮腺感染，血液携带的感染(如脓毒病、脑膜炎、脓毒性关节炎和/或骨髓炎)，自身免疫病(如本文公开的那些)，炎性疾病和恶性肿瘤，和/或任何与这些感染、疾病、失调和/或恶性肿瘤相关的疾病，包括但不限于：CVID、其它原发性免疫缺陷、HIV病、CLL、复发支气管炎、窦炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、肝炎、脑膜炎、带状疱疹(如重度带状疱疹)和/或卡氏肺囊虫。可以用本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸预防、诊断、预测和/或治疗的其它疾病和失调包括但不限于：HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴细胞减少症、吞噬细胞杀菌机能异常贫血症、血小板减少症和血红蛋白尿。

在具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗癌症或肿瘤，包括免疫细胞或免疫组织-相关癌症或肿瘤。可以用本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸预防、诊断或治疗的癌症或肿瘤的例子包括但不限于：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、何杰金氏病、非-何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞贫血(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、EBV转化疾病和/或本文中被提名为“过度增殖性疾病”的章节所描述的疾病和失调。

在另一个具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作降低大B-细胞淋巴瘤的细胞增殖的疗法。

在具体实施方案中，本发明的组合物可用作加强B细胞免疫缺损个体的免疫反应性的药剂，所述个体包括例如遭受了部分或完全脾切除术的个体。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节止血(停止出血)或溶栓(溶解血栓)活性。例如，通过增加止血或溶栓活性，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防血液凝集疾病(如无纤维蛋白原血症、因子缺乏、血友病)，血小板疾病(如血小板减少症)，或由外伤、手术或其它原因导致的创伤。或者，可以使用能降低止血或溶栓活性的本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸来抑制或溶解凝血。在治疗或预防心脏病发作(梗死)、中风或瘢痕形成时，这些分子可能是至关重要的。

在具体实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗血栓形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血栓栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗塞、瞬时局部缺血发作、不稳定的绞痛。在具体实施方案中，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防隐静脉移植物闭塞；降低可能与血管成形术过程相伴随的全程血栓形成的风险；降低心房纤维性颤动患者，包括非风湿性心房纤维性颤动患者中风的风险；降低与人工心脏瓣膜和/或二尖瓣疾病有关的栓塞风险。本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸的其它用途包括但不限于：预防外体装置(如血管内小管、血液透析患者体内的血管入口分流器、血液透析机和心肺旁路仪)闭塞。

在另一个实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗与表达本发明多肽的组织相关的血液病和/或血液形成器官的疾病。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节造血活性(形成血细胞)。例如，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加全部血细胞或血细胞亚型的数量，所述血细胞包括例如红细胞、淋巴细胞(B或T细胞)、髓细胞(如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。减少血细胞或血细胞亚型数量的能力可用于预防、检测、诊断和/或治疗下文所述的贫血和白细胞减少。或者，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于减少全部血细胞或血细胞亚型的数量，所述血细胞包括例如红细胞、淋巴细胞(B或T细胞)、髓细胞(如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。减少血细胞或血细胞亚型数量的能力可用于预防、检测、诊断和/或治疗白细胞增多，例如嗜酸性粒细胞增多。本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、治疗或诊断血质不调。

贫血是红细胞数目或其中的血红蛋白的量低于正常水平的疾病。大量出血、红细胞产量减少或红细胞破坏量增加(如溶血)会导致贫血。本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断贫血。可由本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防或诊断的贫血包括：缺铁性贫血、血红蛋白过少的贫血、小红细胞贫血、萎黄病贫血、遗传性成铁粒红细胞贫血、自发获得性成铁粒红细胞贫血、红细胞发育不全、巨成红细胞贫血(如恶性贫血(维生素B12缺乏)和叶酸缺乏性贫血)、发育不全性贫血、溶血性贫血(如自身免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血和夜间发作的血红蛋白尿)。本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与下述疾病相关的贫血，所述疾病包括但不限于与系统性红斑狼疮、癌症、淋巴瘤、慢性肾病和脾肿大相关的贫血。本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断由药物治疗引起的贫血，例如与甲基多巴、达普宋和/或磺胺药物有关的贫血。另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与红细胞结构异常相关的贫血，包括但不限于遗传性球形红细胞症、遗传性椭圆形红细胞症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷和镰状细胞贫血。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断血红蛋白异常(例如与镰状细胞贫血、血红蛋白C病、血红蛋白S-C病和血红蛋白E病有关的异常)。另外，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预防、预测和/或治疗地中海贫血，包括但不限于主要和次要形式的α-地中海贫血和β-地中海贫血。

在另一个实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗出血病，包括但不限于血小板减少(如自发性血小板减少性紫癜和形成血栓的血小板减少性紫癜)、遗传性假血友病、遗传性血小板病(如储存库疾病，如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak综合征、血栓烷A2机能异常、血小板机能不全和Bernard-Soulier综合征)、溶血性尿毒症综合征、血友病(如A型血友病或V-11因子缺乏和B型血友病或IX因子缺乏)、遗传出血性毛细管扩张(也称Rendu-Osler-Webe综合征)、过敏性紫癜(Henoch Schonlein purpura)和弥漫性血管内凝血。

在其它实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增加细胞因子产量的药剂。

在某些实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测过度增殖性疾病，包括肿瘤。本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过直接或间接相互作用来抑制疾病的增殖。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可增殖其它能抑制过度增殖性疾病的细胞。

例如，通过增强免疫应答，特别是增加过度增殖性疾病的抗原量，或通过增殖、分化或转移T-细胞，即可治疗过度增殖性疾病。通过增强现有的免疫应答，或通过起始新的免疫应答，即可增强免疫应答。或者，减弱免疫应答也不失为一种治疗过度增殖性疾病的方法，例如化疗药剂。

通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的过度增殖性疾病的例子包括但不限于下述部位的肿瘤：结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、脑垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和周围)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸和泌尿生殖道。

类似地，通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸也可以治疗或检测其它过度增殖性疾病。所述过度增殖性疾病的例子包括但不限于：儿童急性成淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金氏病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、与AIDS有关的淋巴瘤、与AIDS有关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童何杰金氏病、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉路径神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非-何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上初级神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉路径和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮T-细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、上皮癌、食管癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、Extraeranial生殖细胞瘤、性腺外的生殖细胞瘤、肝外的胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养层瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金氏病、何杰金氏淋巴瘤、丙球蛋白过多、咽下部癌、肠癌、眼内黑素瘤、小岛细胞癌、胰岛细胞癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增殖性疾病、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移的潜隐性原发鳞状颈癌、转移的原发鳞状颈癌、转移的鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠过程中的非-何杰金氏淋巴瘤、非-黑素瘤皮肤癌、非-小细胞肺癌、潜隐原发性转移的鳞状颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维性肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维性组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、异型蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、脑垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉样瘤病肉瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上初级神经外胚层和松果体瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉路径和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、Waldenstroin氏巨球蛋白血症、肾胚细胞瘤，和除肿瘤外，位于上述器官系统中的任何其它过度增殖性疾病。

在另一个优选实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗恶性前期疾病并防止它们发展成肿瘤或恶性肿瘤状态，所述疾病包括但不限于上述疾病。所述用途的适应症为已知或怀疑正往肿瘤或癌症方向发展的疾病，特别是非-肿瘤细胞生长由增生、组织转化组成，或最特别地是出现发育异常的疾病(有关异常生长疾病的综述可参见Robbins.and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79)。

增生是一种受控制的细胞增殖形式，包括组织或器官中的细胞数目增加，但结构或功能无显著改变。本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可诊断、预测和/或治疗的增生疾病包括但不限于：血管滤泡纵隔淋巴结增生、伴有嗜酸性粒细胞增多的血管淋巴增生、非典型性黑素细胞增生、基底细胞增生、良性大淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂增生、囊增生、乳腺囊增生、牙列增生、管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、灶性上皮增生、龈增生、炎性纤维性增生、炎性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺小结状增生、小结状再生增生、假上皮瘤增生、老年皮脂增生和疣增生。

在另一个实施方案中，如本文所述与毒素或放射性同位素偶联的、本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗包括但不限于本文所述的那些癌症和肿瘤。在另一个优选实施方案中，如本文所述与毒素或放射性同位素偶联的、本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗急性髓细胞性白血病。

另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可影响细胞凋亡，因此可用于治疗多种与增加的细胞存活或细胞凋亡抑制有关的疾病。例如，能通过本发明的多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂诊断、预测、预防和/或治疗的、与增加的细胞存活或细胞凋亡抑制有关的疾病包括癌症(如滤泡-淋巴瘤、伴有p53突变的癌症和激素-依赖型肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病，如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬变、贝切特氏病、节段性回肠炎、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫-相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎)和病毒感染(如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主疾病、急性移植物排斥和慢性移植物排斥。

在优选实施方案中，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制癌症，特别是上述癌症的生长、进行和/或转移。

其它能通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防和/或治疗的、与增加的细胞存活有关的疾病包括但不限于恶性肿瘤和相关疾病的进行和/或转移，所述疾病如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、前髓细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多淋巴瘤(如何杰金氏病和非-何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重链病、和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾胚细胞瘤、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

能通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防和/或治疗的、与增加的细胞凋亡有关的疾病包括AIDS；神经变性疾病(如Alzheimer病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、大脑变性和脑瘤或在此之前的相关疾病)；自身免疫病(如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬变、贝切特氏病、节段性回肠炎、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫-相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎)脊髓发育不良综合征(如再生障碍性贫血)，移植物抗宿主疾病，局部缺血性损伤(如由心肌梗塞、中风和消肿损伤造成的损伤)，肝损伤(如与肝炎有关的肝损伤，局部缺血/再灌注损伤，胆汁淤积(胆管损伤)和肝癌)；毒素-诱导的肝病(如由乙醇导致的肝病)，脓毒性休克，恶病质和厌食症。

另一个优选实施方案利用编码本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸，通过使用本发明的基因治疗和/或其蛋白质融合物或片段来抑制异常细胞分裂。

因此，本发明提供了通过在异常增殖的细胞中插入编码本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗细胞增殖性疾病的方法，其中所述多核苷酸能抑制所述表达。

本发明的另一个实施方案提供了治疗个体的细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括给一个或多个异常增殖细胞施用一个或多个本发明的活性基因拷贝。

通过使用用于将注射针头直接导向患病位点的显像装置，可将本发明的多核苷酸直接传递至内部器官、体腔等的细胞增殖性疾病患病位点。也可以在进行外科手术干预时将本发明的多核苷酸施用至患病位点。

细胞增殖性疾病指的是任何会影响到器官、体腔或身体的一部分中的任何一个或其任意组合的人或动物疾病或失调，其特征在于单发或多发的局部细胞、细胞群或组织的异常增殖，所述增殖可以是良性的，也可以是恶性的。

可以施用任意量的本发明的多核苷酸，只要它对欲治疗细胞的增殖具有生物抑制作用即可。

另外，可以给相同位点同时施用一种以上本发明的多核苷酸。“生物抑制”指的是部分或全部的生长抑制作用以及细胞增殖或生长速率的降低。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖细胞或组织的转移。抑制作用可作为施用这些运铁蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的直接结果而发生，也可以作为例如激活已知可抑制转移的蛋白质(如α整联蛋白)的表达的间接结果而发生(参见例如Curr Top Mirobiol Immunol 1998；231：141，列入本文作为参考)。本发明的这种疗效可以独立获得，也可以与小分子药物或佐剂联合获得。

在另一个实施方案中，本发明提供了将组合物传递至表达多肽的靶向细胞的方法，所述组合物含有本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明的运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述多肽与本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白结合。本发明的运铁蛋白融合蛋白可经由疏水、亲水、离子和/或共价作用与异源多肽、异源核酸、毒素或前药结合。

本发明的组合物可以诊断、预测、预防和/或治疗的肾病包括但不限于：急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉栓塞性肾衰竭、晚期肾衰竭、肾的炎性疾病(如急性肾小球肾炎、感染后的肾小球肾炎、快速进行的肾小球肾炎、肾炎综合征、膜肾小球肾炎、家族性肾炎综合征、膜增殖性肾小球肾炎和系膜增殖性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、急性管状间质肾炎、慢性管状间质肾炎、急性链球菌性肾小球肾炎(PSGN)、肾盂炎、狼疮性肾炎、慢性肾炎、间质肾炎和链球菌性肾小球肾炎)、肾血管病(如肾梗塞、动脉栓塞性肾病、皮质坏死、恶性肾硬化、肾静脉血栓形成、接受灌注的肾、肾视网膜病、肾局部缺血性再灌注、肾动脉栓塞和肾动脉狭窄)、和由尿道病引起的肾病(如肾盂炎、肾盂积水、尿石病(肾结石、肾石病)、回流性肾病、尿道感染、尿潴留和急性或慢性单侧梗塞性尿路病)。另外，可以使用本发明的组合物诊断、预测、预防和/或治疗肾的代谢和先天性疾病(如尿毒症、淀粉样变性、肾病性骨营养不良、肾小管酸中毒、肾糖尿、肾性尿崩症、胱氨酸尿症、范康尼氏综合征、肾性纤维囊状骨生成(肾病性佝偻病)、哈特奈扑病、Bartter氏综合征、利德尔综合征、多囊肾病、髓囊性疾病、髓质海绵肾、奥尔波特综合征、指甲髌骨综合征、先天性肾炎综合征、CRUSH综合征、马蹄形肾、糖尿病肾病、肾性尿崩症、镇痛剂肾病、肾结石和膜性肾病)以及肾的自身免疫病(如系统性红斑狼疮(SLE)、Goodpasture综合征、IgA肾病和ICFM系膜增生性肾小球肾炎)。

本发明的组合物也可用于诊断、预测、预防和/或治疗肾的硬化或lecrotic疾病(如肾小球硬化、糖尿病肾病、faca Fsegmental肾小球硬化(FSGS)、麻醉导致的肾小球肾炎和肾乳头坏死)，肾的癌症(如肾癌、肾上腺样癌、肾胚细胞瘤、肾细胞癌、移行细胞癌、肾腺癌、鳞状细胞癌和肾胚细胞瘤)和电解质失调(如肾钙沉着症、脓尿、水肿、肾盂积水、蛋白尿、血钠过少、血氮过多、血钾过少、血钾过高、血钙过少、血钙过高、血磷酸盐过少和血磷酸盐过多)。

可使用本领域已知的任何方法施用本发明的组合物，所述方法包括但不限于：直接用针头注射至传递位点、静脉内注射、局部给药、导管输注、biolistic注射器、微粒加速器、凝胶泡沫海绵长效药剂、其它可商购的储存材料、渗透泵、口服或栓剂固体药物制剂、手术过程中的倾注或局部应用、气雾剂传递。所述方法是本领域已知的。本发明的组合物也可以作为治疗剂的一部分被施用，这一点将在下文详细描述。

可以使用本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测心血管病，包括但不限于外周动脉病，如肢体局部缺血。

心血管病包括但不限于：心血管异常，如动脉瘘、动静脉瘘、大脑动静脉畸形、先天性心脏缺损、肺动脉瓣闭锁和弯刀综合征。

先天性心脏缺损包括但不限于：主动脉缩窄、三房心、冠状血管异常、十字形心脏、右位心、动脉导管未闭、Ebstein异常、艾森曼格尔复征、左心发育不全综合征、左位心、法洛四联症、主动脉肺动脉错位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、持续性动脉干、和心脏中隔缺损，如主动脉肺动脉中隔缺损、心内膜垫缺损、卢特包阿舍尔综合征、法洛三联症、室心中隔缺损。

心血管病还包括但不限于：心脏病，如心律失常、类癌心脏病、高心输出量、低心输出量、心脏填塞、心内膜炎(包括细菌)、心动脉瘤、心动停止、充血性心力衰竭、充血性心肌病、阵发性呼吸困难、心源性水肿、心脏肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗塞形成后的心脏破裂、室中隔破裂、心瓣膜疾病、心肌疾病、心肌局部缺血、心包积液、心包炎(包括缩窄的和结核性的)、心包积气、心包切开术后的综合征、肺心脏病、风湿性心脏病、室机能不良、充血、心血管妊娠并发症、弯刀综合征、心血管梅毒和心血管结核病。

心律失常包括但不限于：窦性心律失常、房性纤颤、房性扑动、心博徐缓、期前收缩、阿-斯综合征、束支传导阻滞、窦房传导阻滞、QT延长综合征、并行收缩、劳-甘-莱综合征、Mahaim-型预激综合征、沃-佩-怀综合征、病窦综合征、心动过速和心室颤动。心动过速包括阵发性心动过速、室上心动过速、加速性心室自主心律、房室结节折返心动过速、异位房性心动过速、异位接合心动过速、窦房结节折返心动过速、窦性心动过速、扭转峰值和室性心动过速。

心瓣膜疾病包括但不限于：主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、心脏杂音、主动脉瓣脱出、中性瓣脱出、三尖瓣脱出、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁、肺动脉瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、三尖瓣闭锁、三尖瓣闭锁不全和三尖瓣狭窄。

心肌病包括但不限于：酒精心肌病、充血性心肌病、肥大性心肌病、主动脉瓣膜下狭窄、肺瓣膜下狭窄、受限心肌病、恰加斯氏心肌病、心内膜弹力纤维增生症、心肌内膜纤维化、Kearns综合征、心肌再灌注损伤和心肌炎。

心肌局部缺血包括但不限于：冠状疾病，如心绞痛、冠状动脉瘤、冠状动脉硬化、冠状动脉血栓形成、冠状血管痉挛、心肌梗塞和心肌击昏(stuning)。

心血管病还包括血管病，如动脉瘤、血管发育不良、血管瘤病、杆菌性血管瘤病、Hippel-Lindau病、Klippel Trenaunay Weber综合征、Sturge Weber综合征、血管神经病水肿、主动脉病、Takayasu氏关节炎、主动脉炎、Leriche综合征、动脉闭塞病、关节炎、杵臼关节炎、结节性多动脉炎、脑血管病、糖尿病性血管病、糖尿病性视网膜病、栓塞、血栓形成、红斑性肢痛病、痔疮、肝静脉闭塞性疾病、高血压、低血压、局部缺血、外周血管病、静脉炎、肺静脉闭塞性疾病、雷诺氏病、CREST综合征、视网膜静脉闭塞、弯刀综合征、上腔静脉综合征、毛细管扩张、运动失调性毛细管扩张、遗传性出血性毛细管扩张、静脉节瘤、静脉曲张、静脉曲张性溃疡、脉管炎和静脉不足。

脑血管疾病包括但不限于：心脏-动脉疾病和呼吸疾病。可以使用本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测呼吸系统的疾病和/或失调。

呼吸系统的疾病和失调包括但不限于：鼻前庭炎、非过敏性鼻炎(如急性鼻炎、慢性鼻炎、萎缩性鼻炎、血管收缩性鼻炎)、鼻息肉和窦炎、幼年性血管纤维瘤、鼻癌和幼年性乳头状瘤、声带息肉、节结(歌唱家结节)、接触性溃疡、声带麻痹、喉膨出、咽炎(如病毒和细菌的)、扁桃体炎、扁桃体蜂窝织炎、副咽脓肿、喉炎、喉膨出和咽喉癌(如鼻咽癌、扁桃体癌、喉癌)、肺癌(如鳞状细胞癌、小细胞(燕麦形细胞)癌、大细胞癌和腺癌)、过敏性疾病(嗜酸性粒细胞肺炎、过敏性肺炎(如外源性过敏性肺泡炎、过敏性间质肺炎、有机粉末肺尘埃沉着病、过敏性支气管肺曲霉病、哮喘、Wegener肉芽肿(肉芽肿性脉管炎)、Goodpasture综合征))、肺炎(如细菌性肺炎(如肺炎链球菌(肺球菌性肺炎)、金黄色葡萄球菌(葡萄球菌性肺炎)、革兰氏阴性细菌肺炎(由例如克雷伯氏菌和假单胞菌导致的肺炎)、肺炎支原体肺炎、流感嗜血杆菌肺炎、嗜肺军团菌(军团病)和鹦鹉热衣原体(鹦鹉热))和病毒性肺炎(如流感病毒、鸡痘病毒(水痘))。

呼吸系统的其它疾病和失调包括但不限于：细支气管炎、脊髓灰质炎(小儿麻痹症)、哮吼、呼吸道合胞病毒感染、流行性腮腺炎、传染性红斑(第五病)、玫瑰疹、进行性风疹全脑炎)、风疹和亚急性硬化性全脑炎、真菌性肺炎(如组织胞浆菌病、球孢子菌病、芽生菌病、免疫系统严重受抑制的患者中的真菌感染(如由新生隐球菌导致的隐球菌病；由曲霉导致的曲霉病)；由念珠菌导致的念珠菌病；和毛霉菌病))、卡氏肺囊虫(肺炎肺囊虫)、非典型性肺炎(如支原体和衣原体)、机会性感染肺炎、院内获得性肺炎、化学性肺炎和吸入性肺炎、胸膜病(如胸膜炎、胸膜渗漏和气胸(如单纯自发性气胸、并发的自发性气胸、张力性气胸))、梗阻性导气管病(如哮喘、慢性梗阻性肺病(COPID)、肺气肿、慢性或急性支气管炎)、职业性肺病(如矽肺、黑肺(采煤工人肺尘埃沉着病)、石棉沉着病、铍中毒、职业性哮喘、棉屑肺和良性肺尘埃沉着病)、渗透性肺病(如肺纤维化(如纤维化肺泡炎、普通的间质性肺炎)、自发性肺纤维化、脱屑性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、组织细胞增多症(如莱特勒-西韦病、Hand-Schüller-Christian病、嗜酸性粒细胞肉芽肿)、自发性肺含铁血黄素沉着症、结节病和肺肺泡蛋白沉积症)、急性呼吸窘迫综合征(也称为成人呼吸窘迫综合征)、水肿、肺栓塞、支气管炎(如病毒、细菌)、支气管扩张、肺膨胀不全、肺脓肿(由金黄色葡萄球菌或嗜肺军团菌导致)和囊性纤维化。

可用本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的癌症包括但不限于：实体瘤，包括前列腺、肺、乳腺、卵巢、胃、胰腺、喉、食道、lesteg、肝脏、耳下腺、胆道、结肠、直肠、子宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移；黑素瘤；成胶质细胞瘤；卡波济氏肉瘤；平滑肌肉瘤；非-小细胞肺癌；结肠直肠癌；晚期恶性肿瘤；和血液肿瘤，如白血病。例如，可以局部传递本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸，以治疗诸如皮肤癌、头颈癌、乳腺癌和卡波济氏肉瘤的癌症。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗除癌症外的其它疾病，所述疾病与血管生成有关。所述疾病包括但不限于：良性肿瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和生脓性肉芽肿；动脉粥样硬化性斑块；眼血管生成疾病，如糖尿病性视网膜病、早熟视网膜病、斑点退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、潮红、成视网膜细胞瘤、眼色素层炎和眼翼状胬肉异常血管生长；类风湿性关节炎；牛皮癣；创伤治愈延迟；子宫内膜异位；血管发生；肉芽发生；肥厚性瘢痕(瘢痕瘤)；不连接性骨折；硬皮病；沙眼；血管粘连；心肌血管生成；冠状侧突；大脑侧突；动静脉畸形；局部缺血性肢体血管生成；Osler-Webber综合征；斑块肿瘤血管形成；毛细管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；纤维肌性发育不良；创伤肉芽形成；节段性回肠炎；和动脉粥样硬化。

因此，一方面，本发明的方法提供了治疗眼新生血管病的方法。

另外，可用本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的疾病包括但不限于：血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化性斑块、创伤治愈延迟、肉芽发生、血友病关节、肥厚性瘢痕、不连接性骨折、Osler-Webber综合征、生脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼和血管粘连。

另外，可用本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的病症和/或状态包括但不限于：实体瘤，血液瘤，如白血病，肿瘤转移，卡波济氏肉瘤，良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和生脓性肉芽肿、类风湿性关节炎、牛皮癣、眼血管生成疾病，如糖尿病性视网膜病、早熟视网膜病、斑点退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、潮红、成视网膜细胞瘤和眼色素层炎、创伤治愈延迟、子宫内膜异位、血管发生、肉芽发生、肥厚性瘢痕(瘢痕瘤)、不连接性骨折、硬皮病、沙眼、血管粘连、心肌血管生成、冠状侧突、大脑侧突、动静脉畸形、局部缺血性肢体血管生成、Osler-Webber综合征、斑块肿瘤血管形成、毛细管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、纤维肌性发育不良、创伤肉芽形成、节段性回肠炎、动脉粥样硬化、防止胚胎所需血管形成的节育药剂、控制月经的植入、以血管生成为病理结果的疾病，如猫抓病(Rochele nunalia quintosa)、溃疡(幽门螺杆菌)、巴尔通体病和杆菌性的血管瘤病。

在节育方法的一个方面，在发生性交和受精之前或之后，施用足够量的组合物，所述量应能阻断胚胎植入，从而提供有效的节育方法，有可能是“房事后进行的”方法。本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于控制月经，或者在治疗子宫内膜异位症时作为腹膜灌洗液或腹膜植入物施用。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多种外科手术方法。

使用本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗、预防、诊断和/或预测的、与增加的细胞存活或细胞凋亡抑制有关的疾病包括癌症(如滤泡淋巴瘤、伴有突变的癌症和激素-依赖型肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病，如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬变、贝切特氏病、节段性回肠炎、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫-相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎)和病毒感染(如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主疾病、急性移植物排斥和慢性移植物排斥。

在优选实施方案中，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制癌症，特别是上述癌症的生长、进行和/或转移。

其它能通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的、与增加的细胞存活有关的疾病包括但不限于恶性肿瘤和相关疾病的进行和/或转移，所述疾病如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、前髓细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多淋巴瘤(如何杰金氏病和非-何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重链病、和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾胚细胞瘤、颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

能通过本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测的、与增加的细胞凋亡有关的疾病包括但不限于AIDS；神经变性疾病(如Alzheimer病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和脑瘤或在此之前的相关疾病)；自身免疫病(如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬变、贝切特氏病、节段性回肠炎、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫-相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎)脊髓发育不良综合征(如再生障碍性贫血)，移植物抗宿主疾病，局部缺血性损伤(如由心肌梗塞、中风和再灌注损伤造成的损伤)，肝损伤(如与肝炎有关的肝损伤，局部缺血/再灌注损伤，胆汁淤积(胆管损伤)和肝癌)；毒素-诱导的肝病(如由乙醇导致的肝病)，脓毒性休克，恶病质和厌食症。

另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防糖尿病的发生。在刚刚被诊断为I和II型糖尿病的、尚保留有一些胰岛细胞功能的患者中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于维持胰岛功能，从而减轻、延迟或预防该病的长期临床表现。另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可在胰岛细胞移植中用作辅助剂以改善或促进胰岛细胞的功能。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断和/或治疗脑和/或神经系统的疾病、失调、损害或损伤。可以用本发明的组合物(例如本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸)治疗的、局限于神经系统的神经系统失调包括但不限于：会导致轴突断开、神经元减少或变性或脱髓鞘作用的损伤和疾病或失调。可根据本发明的方法治疗的、患者(包括人和非人哺乳动物患者)的神经系统损害包括但不限于下述中枢(包括脊髓、脑)或外周神经系统的损害：(1)局部缺血性损害，其中部分神经系统缺氧导致神经元损伤或死亡，包括脑梗塞或局部缺血，或脊髓梗塞或局部缺血；(2)外伤性损害，包括由躯体损伤导致的损害或与手术相关的损害，例如，断开部分神经系统的损害或挤压性损伤；(3)恶性损害，其中部分神经系统被恶性组织破坏或伤害，所述恶性组织是与神经系统相关的恶性肿瘤，或是衍生自神经系统组织的恶性肿瘤；(4)感染性损害，其中部分神经系统因感染的后果，例如脓肿而被破坏或伤害，或者与人免疫缺损病毒、带状疱疹病毒或单纯疱疹病毒或莱姆病、结核病或梅毒的感染有关；(5)退行性损害，其中部分神经系统因退行性过程的结果而被破坏或伤害，所述退行性过程包括但不限于与帕金森氏病、Alzheimer病、亨廷顿舞蹈病或肌萎缩侧索硬化(ALS)有关的退化；(6)与营养病或失调有关的损害，其中部分神经系统因代谢的营养病或失调的结果而被破坏或伤害，所述疾病或失调包括但不限于：维生素B12缺乏症、叶酸缺乏症、韦尼克病、烟草-酒精性弱视、Marchiafava-Blanami病(原发性胼胝体变性)、和酒精性脑变性；(7)与全身性疾病有关的神经损害，所述疾病包括但不限于：糖尿病(糖尿病性神经病、贝尔氏麻痹)、系统性红斑狼疮、癌或结节病；(8)由包括酒精、铅、或特别是神经毒素的毒性物质导致的损害；和(9)脱髓鞘损害，其中部分神经系统被脱髓鞘疾病破坏或伤害，所述疾病包括但不限于：多发性硬化、人免疫缺损病毒-相关的脊髓病、横贯性脊髓病或多种病因、进行性多灶性白质脑病和脑桥中央髓鞘溶解。

在一个实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保护神经细胞免受缺氧的损害作用。在另一个优选实施方案中，本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保护神经细胞免受脑缺氧的损害作用。

在具体实施方案中，本发明可以治疗的运动神经元疾病包括但不限于：诸如梗塞、感染、暴露于毒素、创伤、手术损害、变性疾病或可影响运动神经元以及神经系统其它组分的恶性肿瘤的疾病，以及选择性影响神经元的疾病，如肌萎缩侧索硬化，包括但不限于进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、原发性侧索硬化、婴幼儿肌肉萎缩、儿童进行性延髓性麻痹(Fazio-Londe综合征)、脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合征、以及遗传性运动感觉神经病(夏-马-图三氏病)。

另外，本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可在神经元存活；突触形成；传导；神经分化等中起作用。因此，本发明的组合物(包括本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸)可用于诊断和/或治疗或预防与这些作用有关的疾病或失调，包括但不限于学习和/或认知疾病。本发明的组合物也可用于治疗或预防神经变性疾病状态和/或行为失调。所述神经变性疾病状态和/或行为失调包括但不限于：Alzheimer病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、抽动-秽语综合征、精神分裂症、躁狂症、痴呆、偏执狂、强制性障碍、极度焦虑、学习能力缺失、ALS、精神病、孤独症和行为改变，包括饮食、睡眠模式、平衡和感觉疾病。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的神经病的例子包括脑病，如代谢性脑病，其包括苯丙酮尿症，如母体苯丙酮尿症，丙酮酸盐羧化酶缺乏，丙酮酸盐脱氢酶复合物缺乏，Wernicke′s脑病，脑水肿，脑肿瘤，如小脑肿瘤，包括幕下肿瘤，脑室肿瘤，如脉络丛肿瘤，下丘脑肿瘤，幕上肿瘤，脑海绵变性，小脑病，如小脑性共济失调，包括脊髓小脑变性，如毛细管扩张失调症，小脑协同失调，Friederich共济失调，马-约病，橄榄体脑桥小脑萎缩，小脑肿瘤，如幕下肿瘤，弥漫性脑硬化，如脑炎periaxialis，球状体细胞脑白质营养不良，异染性脑白质营养不良和亚急性硬化性全脑炎。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的其它神经病包括脑血管疾病(如颈动脉病，包括颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄和烟雾病)、大脑淀粉样血管病、大脑颈内动脉-后交通动脉动脉瘤、脑缺氧、大脑动脉硬化、大脑动静脉畸形、大脑动脉病、脑栓塞和血栓形成，如颈动脉血栓形成、窦血栓形成和Wallenberg综合征、脑出血，如表皮血肿、硬膜下血肿和蜘蛛膜下腔出血、脑梗塞、脑缺血，如瞬时脑缺血、锁骨下动脉盗血综合征和椎基底动脉供血不足、血管性痴呆，如多发性脑梗塞性痴呆、室周脑白质软化、血管性头痛，如丛集性头痛和偏头痛。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的其它神经病包括痴呆，如AIDS痴呆复征，早老性痴呆，如Alzheimer病和Creutzféldt-Jakob综合征，老年痴呆，如Alzheimer病和进行性核上性麻痹，血管性痴呆，如多发性脑梗塞性痴呆，脑炎，包括脑炎periaxialis，病毒性脑炎，如流行性脑炎，日本脑炎，St.Louis脑炎、蜱传脑炎和西尼罗河热，急性播散性脑脊髓炎，脑膜脑炎，如眼色素层脑膜脑炎综合征，脑膜炎后帕金森氏病和亚急性硬化性全脑炎，脑软化，如室周脑白质软化，癫痫，如全身性癫痫，包括婴儿痉挛，失神性癫痫，肌阵挛性癫痫，包括MERRF综合征，强直-阵挛性癫痫，部分癫痫，如复杂的部分癫痫，额叶癫痫和颞叶癫痫，创伤后癫痫，持续性癫痫，如持续性不全癫痫和哈-施综合征。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的其它神经病包括脑积水，如Dandy-Walker综合征和常压性脑积水，下丘脑病，如下丘脑肿瘤，脑型疟，发作性睡病，包括猝倒症，球脊髓灰质炎，脑假瘤，Rett综合征，Reye综合征，丘脑病，大脑弓形体病，颅内结核瘤和泽韦格综合征，中枢神经系统感染，如AIDS，痴呆复征，脑脓肿，硬膜下积脓，脑脊髓炎，如马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，引起坏死的出血性脑脊髓炎，绵羊脱髓鞘性脑白质炎和脑型疟。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的其它神经病包括脑膜炎，如蛛网膜炎，无菌性脑膜炎，如病毒性脑膜炎，包括淋巴细胞慢性脑膜炎，细菌性脑膜炎，包括嗜血杆菌脑膜炎，李斯特杆菌脑膜炎，脑膜炎球菌性脑膜炎，如Waterhouse-Fridericlisen综合征，肺炎球菌性脑膜炎和脑膜结核病，真菌性脑膜炎，如隐球菌性脑膜炎，硬脑膜下积液，脑膜脑炎，如眼色素层脑膜脑炎综合征，脊髓炎，如横贯性脊髓炎，神经梅毒，如脊髓痨，脊髓灰质炎，包括球脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合征，朊病毒病(如Creutzfeldt-Jakob综合征，牛海绵状脑病，Gerstmann-Straussler综合征，库鲁病，瘙痒病)和大脑弓形体病。

本发明的经修饰融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治疗或检测的其它神经病包括中枢神经系统肿瘤，如脑肿瘤，包括小脑肿瘤，如幕下肿瘤，脑室肿瘤，如脉络丛肿瘤，下丘脑肿瘤和幕上肿瘤，脑脊膜肿瘤，脊髓肿瘤，包括硬膜外肿瘤，脱髓鞘病，如脑海绵变性，弥散性大脑sculleries，包括sadreno脑白质营养不良，脑炎periaxialis，球状体细胞脑白质营养不良，泛化性脑硬化症，如异染性脑白质营养不良，过敏性脑脊髓炎，引起坏死的出血性脑脊髓炎，进行性多灶性白质脑病，多发性硬化，脑桥中央髓鞘溶解，横贯性脊髓炎，视神经脊髓炎，瘙痒病，摇摆病，慢性疲劳综合征，绵羊脱髓鞘性脑白质炎，高压神经综合征，假性脑脊膜炎，脊髓病，如先天性肌弛缓，肌萎缩性侧索硬化，脊髓性肌萎缩，如韦德尼希-霍夫曼综合征，脊髓受压，脊髓肿瘤，如硬膜外肿瘤，脊髓空洞症，脊髓痨，强直人综合征，智力低下，如Angelman综合征，猫叫综合征，德朗热综合征，唐氏综合征，神经节苷脂病，如G型神经节苷脂病(MI)，桑德霍夫病，泰-萨克斯病，哈特奈扑病，高胱氨酸尿症，Laurence-Moon-Bied综合征，Lesch-Nylian综合征，枫糖尿病，粘膜脂质沉积症，如岩藻糖苷贮积病，神经元腊样质fipofuscinosis，眼脑肾综合征，苯丙酮尿症，如母体苯丙酮尿症，普-威综合征，Rett综合征，Rubinstein-Taybi综合征，结节性硬化症，WAGR综合征，神经系统异常，如前脑无裂畸形，神经管缺陷，如无脑畸胎，包括积水性无脑畸形，Arnold-Chairi畸形，脑膨出，脑膜膨出，脊膜脊髓膨出，脊柱闭合不全，如囊性脊柱裂和隐性脊柱裂。

内分泌系统和/或激素失调和/或疾病包括子宫能动性疾病，包括但不限于妊娠和分娩并发症(如提前分娩，过月妊娠，自然流产以及分泌缓慢和停止)；和月经周期失调和/或疾病(如痛经和子宫内膜异位症)。

内分泌系统和/或激素失调和/或疾病包括胰腺失调和/或疾病，例如，糖尿病，尿崩症，先天性胰腺发育不全，嗜铬细胞瘤胰岛细胞瘤综合征；肾上腺失调和/或疾病，例如，Addison病，类皮质酮缺乏，男性化疾病，多毛症，库欣综合征，醛甾酮过多症，嗜铬细胞瘤；脑垂体失调和/或疾病，例如，垂体功能亢进，垂体功能减退，垂体性侏儒症，垂体腺瘤，全垂体功能减退，肢端肥大症，巨人症；甲状腺失调和/或疾病，包括但不限于甲状腺功能亢进，甲状腺功能减退，普鲁默病，突眼性甲状腺肿(毒性弥漫性甲状腺肿)，毒性结节性甲状腺肿，甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎，亚急性肉芽肿性甲状腺炎和休止的淋巴细胞性甲状腺炎)，PendreWs综合征，粘液性水肿，呆小病，甲状腺毒症，甲状腺激素偶联缺陷，胸腺发育不全，甲状腺的胡特勒细胞瘤，甲状腺癌，甲状腺癌，甲状腺髓样癌；甲状旁腺失调和/或疾病，例如甲状旁腺功能亢进，甲状旁腺功能减退；下丘脑失调和/或疾病。

另外，内分泌系统和/或激素失调和/或疾病还包括睾丸或卵巢失调和/或疾病，包括癌症。其它睾丸或卵巢失调和/或疾病还包括例如卵巢癌，多囊卵巢综合征，细精管发育障碍症，睾丸消失综合征(双侧无睾症)，先天性莱迪希细胞缺乏症，隐睾症，努南综合征，强直性肌营养不良，睾丸毛细管血管瘤(良性)，睾丸和新生睾丸瘤形成。

另外，内分泌系统和/或激素失调和/或疾病还包括如下失调和/或疾病：多腺缺乏综合征，嗜铬细胞瘤，成神经细胞瘤，多发性内分泌瘤病以及内分泌组织失调和/或癌症。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗或预防生殖系统疾病和/或失调。本发明的组合物可以治疗的生殖系统疾病包括但不限于：生殖系统损伤，感染，肿瘤疾病，先天性缺损，所述疾病或失调会导致不育、妊娠或分娩并发症以及产后困难。

生殖系统失调和/或疾病包括睾丸疾病和/或失调，包括睾丸萎缩，睾丸女性化，隐睾病(单侧和双侧)，无睾症，异位睾丸，附睾炎和睾丸炎(一般是由如下感染引起的：淋病，腮腺炎，结核病和梅毒)，睾丸扭转，输精管炎结节，生殖细胞肿瘤(如精原细胞瘤，胚胎细胞瘤，畸胎瘤，绒毛膜癌，卵黄囊瘤和畸胎瘤)，基质肿瘤(如莱迪希细胞瘤)，阴囊积水，鞘膜积血，精系静脉瘤，精液囊肿，腹股沟疝和精子产生的疾病(如纤毛不能移动综合征，精子，精子无活力，精子缺乏，精子减少症和畸形精子症)。

生殖系统疾病还包括前列腺疾病，例如急性非-细菌性前列腺炎，慢性非-细菌性前列腺炎，急性细菌性前列腺炎，慢性细菌性前列腺炎，前列腺张力失常，前列腺病，肉芽肿性前列腺炎，软化斑，良性前列腺肥大或增生，和前列腺肿瘤疾病，包括腺癌，移行细胞癌，导管癌和鳞状细胞癌。

另外，本发明的组合物可用于诊断、治疗和/或预防阴茎和尿道疾病，包括炎性疾病，例如阴茎头包皮炎，干燥性龟头炎，包茎，嵌顿包茎，梅毒，单纯疱疹病毒，淋病，非-淋菌性尿道炎，衣原体，支原体，毛滴虫，HIV，AIDS，Reiter综合征，尖锐湿疣，扁平湿疣和珍珠状阴茎丘疹，尿道异常，如尿道下裂，尿道上裂和包茎，恶变前损害，包括凯腊增殖性红斑，鲍恩病，鲍恩病样丘疹病，Buscke-Lowenstein的criant湿疣和疣状癌；阴茎癌，包括鳞状细胞癌，原位癌，疣状癌和弥散性阴茎癌；尿道肿瘤疾病，包括阴茎尿道癌，尿道球膜癌和前列腺尿道癌；和勃起疾病，如阴茎异常勃起，Peyronie病，勃起机能障碍和阳萎。

另外，输精管疾病和/或病症包括输精管炎和CBAVD(先天性双侧输精管缺失)；另外，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防精囊疾病和/或病症，包括棘球蚴病，先天性chioride腹泻和多囊肾病。

其它男性生殖系统失调和/或疾病包括例如：克兰费尔特综合征、Young综合征、早泄、糖尿病、囊性纤维化、Kartagener综合征、高热、多发性硬化和男子乳腺发育。

另外，本发明的多核苷酸、经修饰的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防阴道和外阴疾病和/或病症，包括细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、单纯疱疹病毒、软下疳、腹股沟肉芽肿、性病淋巴肉芽肿、疥疮、人乳头瘤病毒、阴道创伤、外阴创伤、腺病、衣原体性阴道炎、淋病、滴虫性阴道炎、尖锐湿疣、梅毒、触染性软疣、萎缩性阴道炎、Paaet病、苔癣硬结、扁平苔癣、外阴痛、中毒性休克综合征、阴道痉挛、外阴阴道炎、外阴前庭炎和肿瘤疾病，例如鳞状细胞增生、明细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、Bartholin腺癌和外阴intraepaelial瘤形成。

子宫病症和/或疾病包括：痛经、子宫后倾、子宫内膜异位症、纤维瘤、子宫内膜异位症、无排卵出血、无月经、Cushiner综合征、葡萄胎、子宫腔粘连综合征、早发绝经、青春期早熟、子宫息肉、功能障碍性子宫出血(例如由异常激素信号引起的子宫出血)和肿瘤疾病，例如腺癌、平滑肌肉瘤和肉瘤。另外，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防如下所述的先天性子宫异常，并可用作这些疾病的标记或检测剂，所述疾病包括例如：双角子宫、有隔子宫、单纯的单角子宫、具有非-腔性未成熟角的单角子宫、具有非-通腔性未成熟角的单角子宫、具有通腔性角的单角子宫、弓形子宫、双子宫和T-形子宫。

卵巢疾病和/或病症包括排卵、多囊卵巢综合征(Stein-Leventhal综合征)、卵巢囊肿、卵巢功能减退、卵巢对促性腺激素类不敏感、卵巢过量产生雄激素、右卵巢静脉综合征、无月经、多毛症和卵巢癌(包括但不限于原发性和继发性癌生长、Sertoli-Leydig肿瘤、卵巢子宫内膜样癌、卵巢乳头状浆液性腺癌、卵巢粘液腺癌和卵巢克鲁肯贝格瘤)。

子宫颈疾病和/或病症包括宫颈炎、慢性宫颈炎、粘液脓性宫颈炎和宫颈发育异常、宫颈息肉、Naboth囊肿、宫颈糜烂、宫颈功能不全和宫颈肿瘤(包括例如宫颈癌、鳞状上皮化生、鳞状细胞癌、腺鳞状细胞瘤形成和柱状细胞瘤形成)。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测感染因子。例如，通过增强免疫应答，特别是增强B和/或T细胞的增殖和分化，即可治疗感染性疾病。通过增强现有的免疫应答，或通过本发明的融合蛋白和/或起始新的免疫应答，即可增强免疫应答。或者，编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制感染因子，而不必引发免疫应答。

病毒是可导致疾病或症状的感染因子的一个例子，本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测所述疾病或症状。病毒的例子包括但不限于下述DNA和RNA病毒和病毒科：虫媒病毒、腺病毒科、沙粒病毒科、Arterivirus、Bimaviridae、布尼病毒科、嵌杯状病毒科、Circoviridae、冠状病毒科、登革病毒、EBV、HIV、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒、疱疹病毒科(例如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹)、Mononegavirus(如副粘病毒科、麻疹病毒、弹状病毒科)、正粘病毒科(如甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒)、乳头状瘤病毒、乳多空病毒科、细小病毒科、小RNA病毒科、痘病毒科(如小痘病毒或痘苗病毒)、呼肠病毒科(如轮状病毒)、逆转录病毒科(HTLV-I，HTLV-11，慢病毒)和披膜病毒科(如风疹病毒)。

类似地，可导致能被本发明的运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的疾病或症状的细菌和真菌因子包括但不限于下述革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、细菌科和真菌：放线菌(如Norcardia)、不动杆菌、新生隐球菌、曲霉、芽孢杆菌科(如炭疽芽孢杆菌)、拟杆菌(如脆弱拟杆菌)、芽生菌、博德特氏菌、疏螺旋体(如布氏疏螺旋体)、布鲁氏菌、念珠菌、弯曲杆菌、衣原体、梭菌(如肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌)、球孢子菌、棒状杆菌(如白喉棒状杆菌)，隐球菌、皮肤真菌、大肠杆菌(如肠产毒性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)、肠杆菌(如产气肠杆菌)、肠杆菌科(克雷伯氏菌、沙门氏菌(如伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌、耶尔森氏菌、志贺氏菌)、丹毒丝菌、嗜血杆菌(如乙型流感嗜血杆菌)、螺杆菌、军团菌(如嗜肺军团菌)、钩端螺旋体、李斯特氏菌(如单核细胞增生李斯特氏菌)、支原体、分支杆菌(如麻风分支杆菌和结核分支杆菌)、弧菌(如霍乱弧菌)、奈瑟氏球菌(如淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌)、巴斯德氏菌科、变形菌、假单胞菌(如铜绿色假单胞菌)、立克次氏体科、螺旋体(如密螺旋体、钩端螺旋体、疏螺旋体)、志贺氏菌、葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌)、脑膜炎球菌、肺炎球菌和链球菌(如肺炎链球菌和A、B和C组链球菌)以及脲原体。

另外，可导致能被本发明的融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断的疾病或症状的寄生虫因子包括但不限于下述科或纲：阿米巴虫、巴贝西虫、球虫、隐孢子虫、双核阿米巴虫、马类椎虫、外寄生虫、贾第虫、蠕虫、利什曼原虫、血吸虫、泰累尔氏梨浆虫、弓形体、锥虫以及滴虫和孢子虫(如间日疟原虫、日发恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫)。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于分化、增殖和吸引细胞，导致组织再生(参见Science276：59-87(1997))。组织再生可用于修复、替代或保护被先天性缺损、创伤(伤口、烧伤、切口或溃疡)、年龄、疾病(如骨质疏松、骨关节炎、牙周疾病、肝衰竭)、手术(包括美容整形外科手术)、纤维症、再灌注损伤或全身性细胞因子损害而损害的组织。

使用本发明可以再生的组织包括器官(如胰腺、肝脏、肠、肾脏、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、脉管系统(包括血管和淋巴管)、神经、造血和骨骼(骨、软骨、跟腱和韧带)组织。优选发生再生时不结瘢或少结瘢。再生也可包括血管生成。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测胃肠道病症，包括炎性疾病和/或状态、感染、癌症(如肠癌(小肠类癌瘤、小肠非-何杰金氏淋巴瘤、小肠淋巴瘤))和溃疡，如消化性溃疡。

胃肠病症包括：吞咽困难、吞咽痛、食管炎症、消化食管炎、胃逆流、粘膜下纤维化和结构、Mallory-Weiss损害、平滑肌瘤、脂肪瘤、上皮癌、腺癌、胃潴留病、肠胃炎、胃萎缩、胃癌、胃息肉、自身免疫病(如恶性贫血)、幽门狭窄、胃炎(细菌性、病毒性、嗜酸性粒细胞性、紧张-诱发的、慢性侵蚀性、萎缩性、浆细胞性和Menetrier胃炎)和腹膜病(如乳糜性水腹、腹腔积血、肠系膜囊肿、肠系膜淋巴结炎、肠系膜血管阻塞、脂膜炎、肿瘤、腹膜炎、气腹、bubphrenic脓肿。

胃肠病症还包括与小肠有关的病症，如吸收不良综合征、膨胀、肠道易激综合征、糖不耐受、乳糜泻病、十二指肠溃疡、十二指肠炎、热带口炎性腹泻、惠普尔病、肠淋巴管扩张、节段性回肠炎、阑尾炎、回肠梗阻、美克耳氏憩室、多憩室、小肠和大肠完全旋转障碍、淋巴瘤以及细菌和寄生虫疾病(如旅行者腹泻，伤寒和副伤寒，以及霍乱、蛔虫(AscariasisItimbricoides)、钩虫(Anclostoma duodenale)、线虫(Enterobius vermicularis)、绦虫jaenia saginata、细粒棘球绦虫、裂头绦虫和T.SOHUM的感染)。

肝脏疾病和/或病症包括：肝内胆汁淤积(Alagille综合征、胆汁性肝硬化)、脂肪肝(酒精性脂肪肝、莱耶综合征)、肝静脉血栓形成、肝豆状核变性、肝大、肝肺综合征、肝肾综合征、门静脉高压(食管和胃静脉曲张)、肝脓肿(阿米巴性肝脓肿)、肝硬化(酒精性、胆和实验性肝硬化)、酒精性肝病(脂肪肝、肝炎、肝硬化)、寄生虫性肝病(肝棘球蚴病、片形吸虫病、阿米巴性肝脓肿)、黄疸(溶血、肝细胞和胆汁淤积型黄疸)、胆汁淤积、门静脉高压、肝肿大、腹水、肝炎(酒精性肝炎、aniffial肝炎、慢性肝炎(自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、药物-诱发的肝炎)、中毒性肝炎、病毒性人类肝炎(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、Wilson病、肉芽肿性肝炎、继发性胆汁性肝硬化、肝性脑病、门静脉高压、血管曲张、肝性脑病、原发性胆血管瘤、胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝细胞腺瘤、肝结石、肝衰竭(肝性脑病、急性肝衰竭)和肝肿瘤(血管肌脂瘤、钙化肝转移、囊性肝转移、上皮肿瘤、纤维层肝癌、灶性结节状增生、肝腺瘤、肝胆囊腺瘤、肝胚细胞瘤、肝细胞癌、肝细胞癌、肝癌、肝血管内皮瘤、间叶性错构瘤、肝间质瘤、结节再生性增生、良性肝肿瘤(肝囊肿、单纯性囊肿、多囊肝病、肝胆囊腺瘤、胆总管囊肿、间质肿瘤、间叶性错构瘤、婴儿血管内皮瘤、血管瘤、紫癜性肝炎、脂肪瘤、炎性假肿瘤、各种上皮肿瘤、胆管上皮(胆管错构瘤、胆管腺瘤)、肝细胞(腺瘤、灶性结节状增生、结节再生性增生)、恶性肝肿瘤(肝细胞、肝胚细胞瘤、肝细胞瘤、胆管细胞、胆管癌、囊腺癌、血管肿瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管内皮瘤、其它肿瘤、胚胎肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、癌肉瘤、畸胎瘤、类癌瘤、鳞状癌、原发性淋巴瘤))、肝紫癜、红肝卟啉症、肝卟啉症(急性间歇性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症)、Zelli Neger综合征)。

胰腺疾病和/或病症包括：急性胰腺炎、慢性胰腺炎(急性坏死性胰腺炎、酒精性胰腺炎)、肿瘤(胰腺腺癌、囊腺癌、胰岛瘤、胃泌素瘤和glucacronoma、cysticcitmeoplasms、胰岛细胞瘤、胰胚细胞瘤)以及其它胰腺疾病(如囊性纤维化、囊肿(胰腺假囊肿、胰腺瘘、胰腺不足))。

胆囊病包括胆结石(胆石病和胆总管结石病)、胆囊切除术的术后综合征、胆囊憩室病、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、胆管肿瘤和粘液囊肿。

大肠疾病和/或病症包括：与抗生素相关的结肠炎、憩室炎、溃疡性结肠炎、获得性巨结肠、脓肿、真菌和细菌感染、肛门直肠病(如肛裂、痔疮)、结肠病(大肠炎、结肠肿瘤、结肠癌、腺瘤性结肠息肉(如绒毛状腺瘤)、结肠癌、结肠直肠癌、结肠憩室炎、结肠憩室病、巨结肠、希尔施普龙病、中毒性巨结肠、乙状结肠病、直肠结肠炎、乙状结肠肿瘤、便秘、节段性回肠炎、腹泻(婴儿腹泻、痢疾)、十二指肠病(十二指肠肿瘤、十二指肠梗阻、十二指肠溃疡、十二指肠炎)、小肠炎(小肠结肠炎)、HIV小肠病、回肠病(回肠肿瘤、回肠炎)、免疫增殖性小肠病、炎性肠病(溃疡性结肠炎、节段性回肠炎)、肠闭锁、寄生虫病(异尖线虫病、小袋纤毛虫病、酵母菌感染、隐孢子虫病、双核阿米巴虫病、阿米巴痢疾、贾第虫病)、肠瘘(直肠瘘)、肠肿瘤(盲肠肿瘤、结肠肿瘤、十二指肠肿瘤、回肠肿瘤、肠息肉、空肠肿瘤、直肠肿瘤)、肠梗阻(输入袢综合征、十二指肠梗阻、大便嵌塞、肠假梗阻、盲肠扭转、肠套叠)、肠穿孔、肠息肉(结肠息肉、加德纳综合征、Peutz-jeghers综合征)、空肠病、空肠肿瘤)、养料吸收障碍综合征(盲袢综合征、乳糜泻、乳糖不耐受、短肠综合征、热带口炎性腹泻、惠普尔病)、肠系膜血管阻塞、肠壁囊样积气、损失蛋白质的小肠病(肠淋巴管扩张)、直肠病(肛门病、大便失禁、痔疮、直肠炎、直肠瘘、直肠脱垂、直肠膨出)、消化性溃疡(十二指肠溃疡、消化食管炎、出血、穿孔、胃溃疡、佐-埃综合征)、胃切除术后综合征(倾倒综合征)、胃病(如无胃酸、十二指肠胃反流(胆汁反流)、胃窦血管扩张、胃瘘、胃出口阻塞、胃炎(萎缩性或肥大性胃炎)、胃轻瘫、胃膨胀、胃憩室、胃肿瘤(胃癌、胃息肉、胃腺癌、增生性胃息肉)、胃破裂、胃溃疡、胃扭转)、结核病、内脏下垂、呕吐(如吐血、妊娠期强烈呕吐、术后恶心和呕吐)以及出血性大肠炎。

其它胃肠系统疾病和/或病症包括胆道疾病，如腹裂畸形、瘘(如胆管瘘、食管瘘、胃瘘、肠瘘、胰腺瘘)、肿瘤(如胆道肿瘤，食管肿瘤，如食管腺癌，食管鳞状细胞癌，胃肠肿瘤，胰腺肿瘤，如胰腺腺癌、胰腺粘液囊肿瘤、胰腺囊肿瘤、胰胚细胞瘤和腹膜肿瘤)、食管病(如大疱病、念珠菌病、glycoaenie棘皮症、溃疡、巴雷特食管血管曲张、闭锁、囊肿、憩室(如Zenker憩室)、瘘(如气管食管瘘)、动力病(如CREST综合征、吞咽病、失弛缓症、痉挛、胃食管反流)、肿瘤、穿孔(如Boerhaave综合征、马-韦综合征)、狭窄、食管炎、膈疝(如裂孔疝)；胃肠病，如胃肠炎(如霍乱疾病、诺瓦克病毒感染)、出血(如呕血、黑粪、消化性溃疡出血)、胃肿瘤(胃癌、胃息肉、胃腺癌、胃癌))、疝(如先天性膈疝、股疝、腹股沟疝、闭孔疝、脐疝、腹疝)以及肠病(如盲肠病(阑尾炎、盲肠肿瘤))。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有趋化活性。趋化分子将细胞(如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)吸引或移动至身体内的特定位点，如炎症、感染或过度增殖的位点。然后，被移动的细胞可以战胜和/或痊愈特定的创伤或异常。

本发明的经修饰运铁蛋白融合蛋白和/或编码本发明运铁蛋白融合蛋白的多核苷酸可增加特定细胞的趋化活性。然后通过使靶向身体特定位置的细胞的数目增加，将这些趋化分子用于治疗炎症、感染、过度增殖性疾病，或任何免疫系统疾病。

转基因动物

本发明的一个实施方案希望产生转基因非-人动物，所述动物含有本发明的经修饰运铁蛋白融合构建体，其具有增加的血清半寿期、增加的血清稳定性或增加的生物可用性。在一些实施方案中，可将乳铁蛋白用作融合蛋白的Tf部分，从而使融合蛋白产生并分泌至乳汁中。

很多专利和出版物，如美国专利6,291,740(2001年9月18日公开)、美国专利6,281,408(2001年8月28日公开)和美国专利6,271,436(2001年8月7日公开)(其内容皆列入本文作为参考)中已描述了转基因非人动物的成功产生。

改变动物，如家畜类哺乳动物(包括奶牛、猪、山羊、马、牛和绵羊)的基因组成的能力具有多种商业用途。这些用途包括：产生能以易于获得的方式(如表达至乳汁或血液中)表达大量外源蛋白质的动物，产生具有增加的体重、饲喂效率、躯体组成、乳汁产生或含量、疾病抗性和对特定微生物感染的抗性的动物，以及产生生长速率提高或繁殖特性增强的动物。基因组中含有外源性DNA序列的动物被称为转基因动物。

使用最广泛的、产生转基因动物的方法是将DNA微量注射至受精胚胎的前核(Wall等，J.Cell.Biochem.49：113[1992])。其它产生转基因动物的方法包括用逆转录病毒或逆转录病毒载体注射胚胎。已有人报道过用野生型或重组逆转录病毒感染植入前和植入后小鼠胚胎(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：1260[1976]；Janenich等，Cell 24：519[1981]；Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7151[1984]；Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA82：6927[1985]；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6148-6152[1985]；Stewart等，EMBO J.6：383-388[1987])。

另一种用逆转录病毒感染胚胎的方法是将病毒或病毒-生产细胞注射至小鼠胚胎的囊胚腔(Jahner，D.等，Nature 298：623[1982])。有人报道过使用微生境小鼠胚胎的子宫内逆转录病毒感染将转基因导入小鼠种系(Jahner等，文献同上[1982])。也有人报道过用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染牛和绵羊胚胎以产生转基因动物。这些方法包括将逆转录病毒颗粒或能排出逆转录病毒颗粒的生长停滞细胞(即经丝裂霉素C-处理过的细胞)微量注射至受精卵或早期胚胎的卵周隙(PCT国际申请WO90/08832[1990]；Haskell andBowen，Mol.Reprod.Dev.，40：386[1995])。PCT国际申请WO90/08832描述了将野生型猪白血病病毒B注射至2至8细胞期绵羊胚胎的卵周隙。已证实得自经注射胚胎的胎儿含有多个整合位点。

美国专利6,291,740(2001年9月18日公开)描述了通过使用转导分裂细胞的逆转录病毒载体(如衍生自鼠白血病病毒[MLV]的载体)，将外源性DNA导入成熟前的卵母细胞和成熟的未受精卵母细胞(即受精前的卵母细胞)以产生转基因动物。该专利还描述了巨细胞病毒启动子驱动以及小鼠乳腺肿瘤LTR表达多种重组蛋白质所用的方法和组合物。

美国专利6,281,408(2001年8月28日公开)描述了使用胚胎干细胞生产转基因动物的方法。简单地说，在与桑椹胚的混合细胞共-培养物中使用胚胎干细胞以产生转基因动物。在共培养之前通过例如电穿孔、微量注射或逆转录病毒传递将外源遗传物质导入胚胎干细胞。经由选择标记，如新霉素选择按照此方式转染的ES细胞用于整合基因。

美国专利6,271,436(2001年8月7日公开)描述了使用下述方法生产转基因动物，所述方法包括：分离原生殖细胞，培养这些细胞以产生衍生自原生殖细胞的细胞系，转化原生殖细胞和经培养的细胞系，使用这些经转化的细胞和细胞系产生转基因动物。产生转基因动物的效率大大提高，籍此可以使用同源重组来产生转基因的非-啮齿类动物。

基因治疗

本发明的一个实施方案希望使用经修饰的运铁蛋白融合构建体进行基因治疗，其中经修饰的运铁蛋白或运铁蛋白结构域与治疗性蛋白质或肽相连接。具有增加的血清半寿期或血清稳定性的本发明的经修饰运铁蛋白融合构建体非常适合基因治疗。

已有人描述过成功使用基因治疗表达出可溶性融合蛋白。简单地说，最近，Ijima等，(June 10，2001)Human Gene Therapy(美国)12/9：1063-77披露了经由注射腺病毒载体而进行的基因治疗，所述载体含有编码可溶性融合蛋白的基因，所述融合蛋白由细胞毒淋巴细胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分组成。在该基因治疗应用中，通过关节内注射载体成功治疗了由II型胶原引发的关节炎鼠模型。

基因治疗也描述于多篇美国专利，包括美国专利6,225,290(2001年5月1日公开)；美国专利6,187,305(2001年2月13日公开)；和美国专利6,140,111(2000年10月31日公开)。

美国专利6,225,290提供了方法和构建体，籍此可对哺乳动物受试者的肠上皮细胞进行基因改变，从而可操作地掺入能表达出具有所需疗效的蛋白质的基因。通过施用主要由裸DNA组成的制剂即可完成肠细胞转化，也可以口服DNA。口服或其它胃肠内给药途径提供了简单的给药方法，而使用裸核酸能避免与使用病毒载体完成基因治疗有关的并发症。表达出的蛋白质直接分泌至胃肠道和/或血流中以获得蛋白质的治疗性血液水平，籍此治疗需要所述蛋白质的患者。通过过量表达蛋白质，经转化的肠上皮细胞为与特定蛋白质缺乏有关或能适应该治疗的疾病提供了短期或长期的疗法。

美国专利6,187,305提供了在脊椎动物，特别是哺乳动物来源的细胞中进行基因或DNA靶向的方法。简单地说，通过同源重组或使已导入至原代或次级细胞基因组DNA的的DNA靶向至预先选择的位点，将DNA导入脊椎动物来源的原代或次级细胞。

美国专利6,140,111(2000年10月31日公开)描述了逆转录病毒基因治疗载体。公开的逆转录病毒载体包括所需基因的插入位点，并能在多种转染细胞类型中高水平表达衍生自所需基因的蛋白质。该专利还公开了一类逆转录病毒载体，所述载体缺乏选择标记，因此适于人类基因治疗，无需共-表达标记产物，如抗生素即可治疗多种疾病状态。这些逆转录病毒载体尤其适用于某些包装细胞系。逆转录病毒载体插入哺乳动物细胞基因组的能力使得它们成为特别有希望的人类和动物遗传病基因治疗的候选药物。基因治疗一般包括：(1)在体内将新的遗传物质添加至亲代细胞中，或(2)从体内除去亲代细胞，在细胞中添加新的遗传物质并将它们重新导入体内，即体外基因治疗。有关如何使用逆转录病毒载体在多种细胞中进行基因治疗的讨论可参见例如1989年9月19日公开的美国专利4,868,116和1990年12月25日公开的美国专利4,980,286(上皮细胞)，1989年8月10日公开的WO89/07136(肝细胞)，1990年7月25日公开的EP378,576(成纤维细胞)以及1989年6月15日公开的WO89/05345和1990年6月28日公开的WO/90/06997(内皮细胞)，所述专利的内容皆列入本文作为参考。

无需继续描述，就可以相信本领域技术人员可以使用上文的描述和下文例举的实施例制备和利用本发明，并且实践所要求的方法。例如，本领域技术人员可以容易地测定本发明融合蛋白构建体与其处于非融合状态的治疗性组成成分类似活性相比较的体外和体内生物活性。类似地，本领域技术人员可以容易地测定本发明构建体的血清半寿期和血清稳定性。因此，下文的工作实施例具体指出了本发明的优选实施方案，但不能将这些实施例理解为对其余内容的限制。

实施例

实施例1

通过融合一个或多个拷贝的编码抗融合HIV-1肽(T-20)的核苷酸序列与TF的核苷酸序列，制备出含该序列的经修饰Tf和所述肽的融合蛋白，所产生的融合蛋白具有与Tf的N-或C-末端融合的肽。

在一个实施方案中，融合蛋白的Tf部分被改造，使得当在酵母中生产时不会糖基化。如上所述，人运铁蛋白在大约N413和大约N611处有两个N-联糖基化位点。N-联糖基化位点含有序列N-X-S/T。在一个实施方案中，N(Asn)变为Q(Gln)；也可以进行其它改变，例如Asn变为Ala或Ser变为任何其它氨基酸。

具体地说，通过使用dut-和ung-法进行寡核苷酸定点诱变，将N413和N611密码子转变为GAT和GAC。参见Kunkel等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：488-492。合成致突变的寡核苷酸5’-GCAGAAAACTACGATAAGAGCGATAAT-3’(SEQ ID NO：9)和5’-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3’(SEQ ID NO：10)，使用这些寡核苷酸，根据Funk等(美国专利5,986,067)的方法诱变N413和N611密码子。

然后通过突变下述铁和/或碳酸根离子结合残基来破坏受体结合和/或铁或碳酸盐结合：

                        铁结合

N结构域                         C结构域

Asp63(SEQ ID NO：2的Asp 82)      Asp392(SEQ ID NO：2的Asp 411)

Tyr95(SEQ ID NO：2的Tyr 114)        Tyr426(SEQ ID NO：2的Tyr 445)

Tyr188(SEQ ID NO：2的Tyr 207)       Tyr514或517(SEQ ID NO：2的Tyr 533或Tyr 536)

His249(SEQ ID NO：2的His 268)       His585(SEQ ID NO：2的His 604)

                      碳酸根离子结合

N结构域                                  C结构域

Thr120(SEQ ID NO：2的Thr 139)       Thr452(SEQ ID NO：2的Thr 471)

Arg124(SEQ ID NO：2的Arg 143)       Arg456(SEQ ID NO：2的Arg 475)

Ala126(SEQ ID NO：2的Ala 145)       Ala458(SEQ ID NO：2的Ala 477)

Gly127(SEQ ID NO：2的Gly 146)       Gly459(SEQ ID NO：2的Gly 478)

通过多种技术可以完成铁结合缺损突变体的制备。参见美国专利5,986,067。使用Nelson，R.M.and Long，G.L.(1989)Analyt.Biochem.180：147-151的方法制备D63S取代。简单地说，将hTF/2N编码序列5’末端的HpaII/BamHI片段亚克隆至pUC18，然后用作模板以进行基于两步PCR的诱变程序。通过XbaI和BamHI消化从双链形式的测序载体中释放出片段，将所述片段与原先的人Tf构建体的BamHI/HindIII片段连接，产生全长的D63S-编码序列，通过限制性消化分析证实剪接的保真性。

为了在毕赤氏酵母中表达，可以使用RCT/Invitrogen的系统。可以获得三种适于多拷贝表达的载体pPIC9K，pPIC3.5K和pAO815。例如，可以使用允许分泌至生长培养基中的pPIC9K载体。

通过重叠PCR诱变来改变运铁蛋白cDNA的末端，从而将经修饰的运铁蛋白序列克隆至pPIC9K载体，产生载体pREX0010。从载体和编码序列内除去或在其中添加多个限制性位点以有助于后面的克隆步骤(图5)。

HIV抗-融合肽DP-178的序列也已知为T-20。该肽提供自身与运铁蛋白的N-或C-末端融合，因为该肽需要自由移动以满足其功能。

DP-178序列：YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO：4)

当反向翻译成DNA(使用最适于酵母的密码子)时，获得下列序列(SEQID NO：13和14)：

tacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaatta

  y  t  s  l  i  h  s  l  i  e  e  s  q  n  q  q  e  k  n  e  q  e  l

ttggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggttt

l  e  l  d  k  w  a  s  l  w  n  w  f

为了插入上述序列，用限制性酶Xba I/Kpn I消化具有经修饰运铁蛋白cDNA的载体pREX0010以在5’末端插入，用Sal I/Hind III消化所述载体以在3’末端插入。

为了在5’末端插入，合成两个在上文所述DP-178序列的5’末端形成XbaI突出端和在所述序列的3’末端形成Kpn I突出端的重叠寡核苷酸。然后使这些寡核苷酸一起退火(见下文)，连接至经Xba I/Kpn I消化的pREX0010载体。

  -----

1 ctagagaaaa ggtacactag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt

      tctttt ccatgtgatc gaattatgtg aggaattaac ttcttagcgt tttggtcgtt cttttcttac ttgttcttaa

    l  e  k   r  y  t   s  l  i  h   s  l  i   e  e  s   q  n  q  q   e  k  n   e  q  e

               >>.................................T-20..................................>

>>.........>>

                                               KpnI

                                               ----

81 attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt gtac

   taaccttaat ctatttaccc gttcaaacac cttaaccaaa                SEQ ID NOS：15和16

   l  l  e  l   d  k  w   a  s  l   w  n  w  f    v

                                                 >>>>

   >..................T-20..................>>

插入退火的寡核苷酸导致插入后丢失了Kpn I位点。导致产生载体pREX0011(图6)。

为了在C-末端插入，通过在5’末端添加SalI位点，在3’末端添加HindIII位点而采取类似的方法(图7)。

然后，按照Invitrogen Pichia Expression试剂盒操作手册所述进行转化、选择和表达。

实施例2

使用反向翻译的人INGAP氨基酸序列制备INGAP融合物。蛋白质序列如下：sp|Q92778|PBCG_HUMAN Human INGAPMMLPMTLCRMSWMLLSCLMFLSWVEGEESQKKLPSSRITCPQGSVAYGSYCYSLILIPQTWSNAELSCQMHFSGHLAFLLSTGEITFVSSLVKNSLTAYQYIW[IGLHDPSHGTLPNG]GWKWSSSNVLTFYNWERNPSIAADRGYCAVLSQKSGFQKWRDFNCENELPYICKFKV(SEQ ID NO：17)

反向翻译成DNA(最适于酵母的密码子)给出如下序列(SEQ ID NO：18和19)。

1    atgatgttgc caatgacttt gtgtagaatg tcttggatgt tgttgtcttg tttgatgttt

       m  m  l   p  m  t   l  c  r  m   s  w  m   l  l  s   c  l  m  f

61   ttgtcttggg ttgaaggtga agaatctcaa aaaaaattgc catcttctag aattacttgt

       l  s  w   v  e  g   e  e  s  q   k  k  l   p  s  s   r  i  t  c

121  ccacaaggtt ctgttgctta tggttcttat tgttattctt tgattttgat tccacaaact

       p  q  g   s  v  a   y  g  s  y   c  y  s   l  i  l   i  p  q  t

181  tggtctaatg ctgaattgtc ttgtcaaatg catttttctg gtcatttggc ttttttgttg

       w  s  n   a  e  l   s  c  q  m   h  f  s   g  h  l   a  f  l  l

241  tctactggtg aaattacttt tgtttcttct ttggttaaaa attctttgac tgcttatcaa

       s  t  g   e  i  t   f  v  s  s   l  v  k   n  s  l   t  a  y  q

301  tat[atttgga ttggtttgca tgatccatct catggtactt tgccaaatgg ttct]ggttgg

       y  i  w   i  g  l   h  d  p  s   h  g  t   l  p  n  g   s  g  w

361  aaatggtctt cttctaatgt tttgactttt tataattggg aaagaaatcc atctattgct

       k  w  s   s  s  n   v  l  t  f   y  n  w   e  r  n   p  s  i  a

421  gctgatagag gttattgtgc tgttttgtct caaaaatctg gttttcaaaa atggagagat

       a  d  r   g  y  c   a  v  l  s   q  k  s   g  f  q   k  w  r  d

481  tttaattgtg aaaatgaatt gccatatatt tgtaaattta aagtt

       f  n  c   e  n  e   l  p  y  i   c  k  f   k  v

最可能的前导序列裂解位点是上述下划线序列末端的KK。

一个可用于产生表达与运铁蛋白N-或C-末端融合的INGAP的构建体的方法学是合成一系列设计自上述序列(减去下划线的前导序列)的重叠寡核苷酸。退火这些引物可产生INGAP cDNA。使用为5’和3’末端设计的不同寡核苷酸，可将退火的cDNA连接至pREX0010中运铁蛋白的5’或3’末端。

括号中的序列是用于诱导INGAP活性的肽。因此，在全序列和这一最短必需序列之间的某些位点处，序列可以配对。

N-末端融合

对于N-末端而言，它应具有能在5’末端形成XbaI位点的突出端和能与3’末端的KpnI位点相容，但会导致KpnI位点被破坏的突出端。

     XbaI

     ---

1    ctagagaaaa ggttgccatc ttccagaatt acttgtccac aaggttctgt tgcttatggt

         tctttt ccaacggtag aaggtcttaa tgaacaggtg ttccaagaca acgaatacca

       l  e  k   r  l  p   s  s  r  i   t  c  p   q  g  s   v  a  y  g

61   tcttattgtt attctttgat tttgattcca caaacttggt ctaatgctga attgtcttgt

     agaataacaa taagaaacta aaactaaggt gtttgaacca gattacgact taacagaaca

       s  y  c   y  s  l   i  l  i  p   q  t  w   s  n  a   e  l  s  c

121  caaatgcatt tttctggtca tttggctttt ttgttgtcta ctggtgaaat tacttttgtt

     gtttacgtaa aaagaccagt aaaccgaaaa aacaacagat gaccacttta atgaaaacaa

       q  m  h   f  s  g   h  l  a  f   l  l  s   t  g  e   i  t  f  v

181  tcttctttgg ttaaaaattc tttgactgct tatcaatata tttggattgg tttgcatgat

     agaagaaacc aatttttaag aaactgacga atagttatat aaacctaacc aaacgtacta

       s  s  l   v  k  n   s  l  t  a   y  q  y   i  w  i   g  l  h  d

241  ccatctcatg gtactttgcc aaatggttct ggttggaaat ggtcttcttc taatgttttg

     ggtagagtac catgaaacgg tttaccaaga ccaaccttta ccagaagaag attacaaaac

       p  s  h   g  t  l   p  n  g  s   g  w  k   w  s  s   s  n  v  l

301  actttttaca attgggaaag aaatccatct attgctgctg atagaggtta ttgtgctgtt

     tgaaaaatgt taaccctttc tttaggtaga taacgacgac tatctccaat aacacgacaa

       t  f  y   n  w  e   r  n  p  s   i  a  a   d  r  g   y  c  a  v

361  ttgtctcaaa aatctggttt tcaaaaatgg agagatttta attgtgaaaa tgaattgcca

     aacagagttt ttagaccaaa agtttttacc tctctaaaat taacactttt acttaacggt

       l  s  q   k  s  g   f  q  k  w   r  d  f   n  c  e   n  e  l  p

                              KpnI

                             ----

421  tatatttgta aatttaaagt tgtac

     atataaacat ttaaatttca a             SEQ ID NOS：20和21

       y  i  c   k  f  k   v v

用XbaI和KpnI消化pREX0010，连接上述序列产生载体pREX0013(图8)。

C-末端融合

对于C-末端而言，5’末端会形成SalI位点，而3’末端具有终止密码子加上HindIII位点。

    SalI

     ---

1   tcgacctttg ccatcttcca gaattacttg tccacaaggt tctgttgctt atggttctta

        ggaaac ggtagaaggt cttaatgaac aggtgttcca agacaacgaa taccaagaat

       r  p  l   p  s  s   r  i  t   c  p  q  g   s  v  a   y  g  s

61  ttgttattct ttgattttga ttccacaaac ttggtctaat gctgaattgt cttgtcaaat

    aacaataaga aactaaaact aaggtgtttg aaccagatta cgacttaaca gaacagttta

    y  c  y  s   l  i  l   i  p  q   t  w  s  n   a  e  l   s  c  q

121 gcatttttct ggtcatttgg cttttttgtt gtctactggt gaaattactt ttgtttcttc

    cgtaaaaaga ccagtaaacc gaaaaaacaa cagatgacca ctttaatgaa aacaaagaag

    m  h  f  s   g  h  l   a  f  l   l  s  t  g   e  i  t   f  v  s

181 tttggttaaa aattctttga ctgcttatca atatatttgg attggtttgc atgatccatc

    aaaccaattt ttaagaaact gacgaatagt tatataaacc taaccaaacg tactaggtag

    s  l  v  k   n  s  l   t  a  y   q  y  i  w   i  g  l   h  d  p

241 tcatggtact ttgccaaatg gttctggttg gaaatggtct tcttctaatg ttttgacttt

    agtaccatga aacggtttac caagaccaac ctttaccaga agaagattac aaaactgaaa

    s  h  g  t   l  p  n   g  s  g   w  k  w  s   s  s  n   v  l  t

301 ttacaattgg gaaagaaatc catctattgc tgctgataga ggttattgtg ctgttttgtc

    aatgttaacc ctttctttag gtagataacg acgactatct ccaataacac gacaaaacag

    f  y  n  w   e  r  n   p  s  i   a  a  d  r   g  y  c   a  v  l

361 tcaaaaatct ggttttcaaa aatggagaga ttttaattgt gaaaatgaat tgccatatat

    agtttttaga ccaaaagttt ttacctctct aaaattaaca cttttactta acggtatata

    s  q  k  s   g  f  q   k  w  r   d  f  n  c   e  n  e   l  p  y

                        HindIII

                         -----

421 ttgtaaattt aaagtttaat a

    aacatttaaa tttcaaatta ttcga        SEQ ID NOS22和23

    i  c  k  f   k  v  -

用SalI和HindIII消化pREX0010，连接上述序列产生载体pREX0014(图9)。

然后，按照Invitrogen Pichia Expression试剂盒操作手册所述进行转化、选择和表达。

实施例3

已证实下文给出的肽可通过导致EPO受体的二聚体化来模拟EPO活性。环形的所述肽与EPO没有同源性。为了活性，所述肽不得不与另一种肽(即作为二聚体)一同起作用，使得两拷贝的受体靠得足够近以形成活性复合物。对很多种肽来说，肽二聚体仅有短暂的半寿期，它可以从与运铁蛋白的融合中获利得到延长的半寿期。在此实施例中，两个肽被添加至运铁蛋白骨架中。

1  ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggt

      g  g  t   y  s  c   h  f  g  p   l  t  w   v  c  k   p  q  g  gSEQ ID NO：24和25。

如Ali等人的详细描述，可以在运铁蛋白的His289和Gly290之间成功添加肽。运铁蛋白分子固有的重复(两个结构域互相反映)意味着可以将肽插入C结构域重复区域的Glu625和Thr626之间。

N  277  D-KSKE--FQ LFSSP

KDL LFKDSAHGFL KVPPRMDAKM YLGYEYVTAI

C  611  NVTDCSGNFC LFRS

KDL LFRDDTVCLA KLHDRNTYEK YLGEEYVKAVSEQ ID NO：26和27。

每个插入需合成两个重叠的致突变引物(见下文)。使用pREX0010作为模板，用每个致突变引物和得自Tf cDNA5’或3’末端的外部引物进行反应。然后混合这两个反应的产物，用外部引物进行进一步反应以将两个产物连接在一起。用XbaI和HpaI消化His289-Gly290插入物PCR产物以连接至经XbaI/HpaI消化的pREX0010。然后用HpaI和SalI消化所得载体以连接至经HpaI/SalI消化的Glu625-Thr626插入物PCR产物。

His289-Gly290插入物(SEQ ID NO：28)。

                                ←--------------

2031  agacaaatca [aaagaatttc aactattcag ctctcctcat ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca

      tctgtttagt tttcttaaag ttgataagtc gagaggagta ccaccatgaa [tgagaacagt aaaaccaggt

                                                >>.............EMOm..............>

      >....................................Tf....................................>

      >.................................N domain.................................>

2101  ttgacttggg tttgtaagcc] acaaggtggt gggaaggacc tgctgtttaa ggactctgcc cacgggtttt

      aactgaaccc aaacattcgg tgttccacca cccttcctgg acgacaaatt cctgagacgg] gtgcccaaaa

                       -----------→

      >............EMOm.............>>

>....................................Tf....................................>

>.................................N domain.................................>

Glu625-Thr626插入物(SEQ ID NO：29)。

                                                           ←-------------

3081  cctatttgga agcaacgtaa ctgactgctc[gggcaacttt tgtttgttcc ggtcggaagg tggtacttac

      ggataaacct tcgttgcatt gactgacgag cccgttgaaa acaaacaagg ccagccttcc accatgaat[g

      >.................................C domain.................................>

      >....................................Tf....................................>

                                             KpnI

                                           -------

3151  tcttgtcatt ttggtccatt gacttgggtt tgtaagccac]aaggtggtac caaggacctt ctgttcagag

      agaacagtaa aaccaggtaa ctgaacccaa acattcggtg ttccaccatg gttcctggaa gacaagtctc

                       -----------→

      >......................EPOm.......................>>

      >.................................C domain.................................>

      >....................................Tf....................................>

3221  atgacacagt atgtttggcc aaacttcatg acagaaacac atatgaaaaa tacttaggag aagaatatgt

      tactgtgtca]tacaaaccgg tttgaagtac tgtcLttgtg tatacttttt atgaatcctc ttcttataca

      >.................................C domain.................................>

      >....................................Tf....................................>

如此获得质粒pREX0015(图10)。按照Invitrogen Pichia Expression试剂盒操作手册所述进行转化、选择和表达。

其它可替代的能插入EPO模拟肽或任何其它肽的位点是运铁蛋白C结构域上的两个糖基化位点N413和N611。该位点的优点是：在一个和相同的事件中可获得插入，同时能通过破坏N-X-S/T序列防止糖基化。

实施例4

通过融合抗RSV融合抑制剂肽序列与Tf的N-或C-末端，或通过将所述序列插入Tf环中，即可制备出Tf和所述肽之间的融合蛋白，其中已对Tf进行过修饰使其不能结合铁和/或Tf经修饰后能防止糖基化。RSV肽可包括：T786：VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV(SEQ IDNO：5)和/或T1584：AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDL KNYIDKQL(SEQ ID NO：6)。

T786肽具有RK二肽，它可用作酵母蛋白酶Kex2p的裂解位点。这可导致产生截短的肽。因此，该肽可由RK修饰成RE。比T786更强的另一种形式的T786肽T112(VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV，SEQ ID NO：7)的非融合形式存在溶解性问题。因此，还需制备出由RK修饰为RE的T112形式，以产生与Tf融合的肽形式。

为了产生基因构建体，适当时可使用人、酵母或任何其它生物体的密码子偏好性将肽序列反向翻译成DNA。

实施例5

多种细胞因子可与Tf的N-、C-或N-和C-末端融合。使用经修饰运铁蛋白的不同部分或结构域，如N结构域或C结构域，也可构建这些融合物。可直接融合蛋白质，或使用不同长度的接头肽融合蛋白质。也可以在运铁蛋白骨架内融合全部或部分活性细胞因子。

可通过多种方法，例如通过RT-PCR由mRNA、从cDNA文库中分离所需细胞因子，如EPO的cDNA，通过由重叠寡核苷酸合成构建所述cDNA，通过PCR或其它本领域已知的方法分离得到所述cDNA(所有方法都使用标准方法)。所有这些蛋白质的核苷酸序列在例如美国专利4,703,008，4,810,643和5,908,763以及公共数据库，如GenBank中都是已知的和可以获得的。可对cDNA的5’和3’末端进行修饰以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将该cDNA克隆至含有运铁蛋白cDNA的载体中。细胞因子cDNA可以位于运铁蛋白序列的N-或C-末端，可以使用或不使用间隔序列，或者可将细胞因子的cDNA插入运铁蛋白的cDNA中。将细胞因子，如EPO和Tf cDNA克隆至载体中，然后从载体中切下完整的表达盒，插入表达载体以在酵母(或任何其它适当的表达系统)中表达融合蛋白。然后从培养基中收集和纯化酵母分泌的融合蛋白并检测其生物活性。

为了在哺乳动物细胞系中表达，可采用类似的方法，不同之处在于所用表达盒使用的是哺乳动物启动子、前导序列和终止子。然后切下表达盒，插入适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。

实施例6

多种干扰素可与经修饰运铁蛋白的N-、C-或N-和C-末端融合。使用运铁蛋白的不同部分或结构域，如N结构域或C结构域，也可构建这些融合物。可直接融合蛋白质，或使用不同长度的接头肽融合蛋白质。也可以在运铁蛋白骨架内融合全部或部分干扰素。

可与Tf融合的干扰素的具体例子是干扰素-β。可通过多种方法，例如通过RT-PCR由mRNA或cDNA、从cDNA文库中分离所需干扰素，如干扰素β的cDNA，通过由重叠寡核苷酸合成构建所述cDNA，通过PCR或其它本领域已知的方法分离得到所述cDNA(所有方法都使用标准方法)。干扰素，如IFNα，IFNβ和IFNγ的核苷酸序列在例如美国专利5,326,859、4,588,585和EP 32 134以及公共数据库，如GenBank中都是已知的和可以获得的。可对cDNA的5’和3’末端进行修饰以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将该cDNA克隆至含有经修饰运铁蛋白cDNA的载体中。干扰素cDNA可以位于运铁蛋白序列的N-、C-或N-和C-末端，可以使用或不使用间隔序列。将IFNβ(或其它干扰素)cDNA克隆至载体中，然后从载体中切下完整的表达盒，插入表达载体以在酵母中表达融合蛋白。然后从培养基中收集和纯化酵母分泌的融合蛋白并检测其生物活性。

为了在哺乳动物细胞系中表达，可采用类似的方法，不同之处在于所用表达盒使用的是哺乳动物启动子、前导序列和终止子。然后切下表达盒，插入适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。与运铁蛋白融合的IFN具有更长的半寿期，因此，融合蛋白的治疗剂量比IFN少得多。因此，融合干扰素效果更好而毒性却更低。

实施例7

起初发明多种单链抗体(SCA)是为了简化抗体选择和生产。然而，已证实由于它们太小以及体内半寿期短，因此疗效有限或根本无疗效。在SCA中添加运铁蛋白能显著延长SCA的体内半寿期。

SCA可与经修饰运铁蛋白的N-、C-或N-和C-末端融合。使用运铁蛋白的不同部分或结构域，如N结构域或C结构域，也可进行所述融合。可直接融合蛋白质，或使用不同长度的接头肽融合蛋白质。也可以在运铁蛋白骨架内融合全部或部分活性SCA。在这种情况下，通过将SCA的cDNA插入运铁蛋白的cDNA中来制备融合蛋白，从而在细胞中生产蛋白质。可与运铁蛋白融合的SCA的具体例子是抗-TNF(肿瘤坏死因子)。已使用抗-TNF治疗多种炎症和自身免疫病。TNF-SCA可与经修饰运铁蛋白的N-或C-末端融合，融合方式可以是TNF-SCA的编码N-末端与运铁蛋白C-末端氨基酸直接结合，或者是TNF-SCA的C-末端氨基酸与运铁蛋白N-末端氨基酸直接结合。或者，可在运铁蛋白和TNF-SCA之间插入肽接头以提供更大的间距，并使两个融合蛋白质的空间移动性更大。图4A-4B中显示了TNF-SCA的几个例子。

通过几种方法可以产生单链抗体，所述方法包括但不限于：从噬菌体文库中选择，通过克隆抗体的cDNA并使用侧翼恒定区作为引物克隆可变区，或通过合成对应于任何特定抗体的可变区的寡核苷酸来克隆特定抗体的可变区。可对cDNA的5’和3’末端进行修饰以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将该cDNA克隆至含有运铁蛋白cDNA的载体中。SCAcDNA可以位于运铁蛋白序列的N-或C-末端或N-和C-末端，可以使用或不使用间隔序列。将SCA分子cDNA克隆至载体中，然后从载体中切下完整的表达盒，插入表达载体以在酵母中表达融合蛋白。然后从培养基中收集和纯化酵母分泌的融合蛋白并检测其生物活性。为了在哺乳动物细胞系中表达，可采用类似的方法，不同之处在于所用表达盒使用的是哺乳动物启动子、前导序列和终止子。然后切下表达盒，插入适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。从培养基中纯化按照此方式产生的抗体，使用标准的免疫化学方法检测其与其抗原结合的能力。

实施例8

CDR是与抗原相互作用的抗体可变区。它通常由相对较短的一段肽序列组成。抗体重链和轻链一般各有3个CDR。一个或多个可与抗原相互作用的抗体CDR可与经修饰运铁蛋白融合以赋予运铁蛋白分子与抗原结合的活性。CDR可与运铁蛋白的N-，C-，N-和C-末端融合，或被插入运铁蛋白的内部骨架中。抗-TNF抗体的CDR序列的例子示于TNF-SCA(图4A-4B)。对应于一个或多个CDR的cDNA可与经修饰运铁蛋白融合以赋予运铁蛋白与TNF结合的活性。

实施例9

也可以使用运铁蛋白融合技术改善在多个系统，如噬菌体展示文库和肽文库中发现的肽的治疗特性。这些肽中有很多具有生物活性，但与天然蛋白质或肽无任何同源性。由于这些肽的体内半寿期短，因此是与经修饰运铁蛋白融合的良好候选者。由于它们很小，因此可与运铁蛋白分子的多个区域融合。除了N-和C-末端外，可将它们插入运铁蛋白内的多个区域，包括但不限于胱氨酸环。按照此方式，运铁蛋白内的肽三维结构表现得相对刚性。1拷贝以上的各种肽和一种以上的肽可与经修饰运铁蛋白融合。另外，可以使用肽序列替代运铁蛋白部分以赋予运铁蛋白治疗活性。由于大多数肽较短，可以合成所述肽的具有适当限制性位点的cDNA以插入经修饰运铁蛋白cDNA。然后可将cDNA插入含有运铁蛋白cDNA的载体中，使得肽被表达为运铁蛋白的一部分或与运铁蛋白分子融合的融合蛋白。或者，合成PCR引物，所述引物含有所需肽和适当的运铁蛋白片断。使用这些引物扩增运铁蛋白cDNA，导致肽与运铁蛋白上的选定位点融合。所述肽的例子是EPO模拟肽：GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO：11)；DREGCRRGWVGQCKAWFN(SEQ ID NO：12)；和QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY(SEQ ID NO：30)，它们与天然EPO没有同源性，但具有类似的生物活性，因为它们能激活用作激动剂的EPO受体。这些肽也需要具有特殊的构象来满足其最佳活性。可将EPO模拟肽插入(或替代)运铁蛋白的一个或多个胱氨酸环中。按照此方式，运铁蛋白可获得EPO活性。可与运铁蛋白融合的其它肽是具有与抗体类似的结合活性的肽。这些肽可以相对高的亲和性与蛋白质结合，并提供与抗体相同的生物学功能，但它们的体内半寿期非常短。将这些肽与运铁蛋白融合可赋予这些肽更长的半寿期，而不会破坏它们的结合活性。这些肽可与运铁蛋白分子的N-或C-末端或两端或内部融合。所述肽也可以取代部分运铁蛋白。另外，1拷贝以上的肽或几种不同的肽可与单个运铁蛋白分子结合。所述分子的例子是可结合TNF的肽。该肽与运铁蛋白的结合赋予运铁蛋白结合TNF并按照类似于抗-TNF抗体的方式起作用的能力。按照此方式，可以用更简单和经济的制备方法制备出抗体样分子。

实施例10

靶向Tf融合蛋白同时具有两种或多种与经修饰运铁蛋白融合的蛋白质或肽以用作双功能分子。此时，经修饰运铁蛋白与一种蛋白质或肽融合以具有新的生物活性，与另一种蛋白质或肽融合以进行靶向。所述蛋白质的例子是含有抑制性蛋白质如endostatin和靶向肽，如SCA或可识别肿瘤的结合肽的运铁蛋白。按照此方式，抑制性分子被靶向需要该分子的肿瘤。所需蛋白质的cDNA可分离自cDNA文库，或可使用标准的分子生物学方法，用几个重叠寡核苷酸引物合成制备所述cDNA。可在cDNA中导入适当的核苷酸以形成方便的限制性位点，并可以按照与形成其它融合蛋白类似的方法，使蛋白质的cDNA与运铁蛋白的cDNA结合。另外，靶向蛋白质或肽cDNA，如单链抗体或可以介导蛋白质进入细胞内部的肽，如核定位信号可以与运铁蛋白的另一端或其内部融合。将所需蛋白质和靶向肽克隆至允许与运铁蛋白cDNA融合的载体中。按照此方式，蛋白质/肽都可以与经修饰运铁蛋白融合。然后切下融合的cDNA，插入表达载体以在酵母中表达融合蛋白。

可以使用分子生物学的标准方法实施上述所有方法。从培养基中收集和纯化酵母分泌出的融合蛋白，并使用适当的生物化学和生物学试验检测其生物学活性及其靶向活性。也可以在其它系统，如哺乳动物组织培养物中使用适当载体和转染方法制备这些蛋白质。

实施例11

可通过多种方法，例如通过RT-PCR由mRNA、从cDNA文库中分离所需酶的cDNA，通过由重叠寡核苷酸合成构建所述cDNA，通过PCR或其它本领域已知的方法分离得到所述cDNA(所有方法都使用标准方法)。可对cDNA的5’和3’末端进行修饰以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将该cDNA克隆至含有经修饰运铁蛋白cDNA的载体中。酶cDNA可以位于运铁蛋白序列的N-或C-末端，可以使用或不使用间隔序列。将酶cDNA克隆至载体中，然后从载体中切下完整的表达盒，插入表达载体以在酵母中表达融合蛋白。然后从培养基中收集和纯化酵母分泌的融合蛋白并检测其生物活性。为了在哺乳动物细胞系中表达，可采用类似的方法，不同之处在于所用表达盒使用的是哺乳动物启动子、前导序列和终止子。然后切下表达盒，插入适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。

实施例12

使用噬菌体展示，分离出例如特异于肿瘤细胞表面特定细胞标记的肽。然后将所述肽与经修饰运铁蛋白的N-，C-或N-和C-末端融合以将融合蛋白靶向至特定的细胞类型。然后，使运铁蛋白融合蛋白荷载金属离子，所述离子的运铁蛋白结合特性类似于铁，但却具有细胞毒性，例如镓或放射性离子。通过此机理，镓或放射性离子被靶向该细胞类型。

尽管参照上述实施例详细描述了本发明，但应理解可在不背离本发明精神的情况下对本发明进行多种修饰。因此，本发明仅受下述权利要求书的限制。本申请中提及的所有专利、专利申请和出版物都全文列入本文作为参考。

序列表

<110>克里斯托弗.普赖尔(Prior，Christopher P.)

<120>经修饰的运铁蛋白融合蛋白

<130>MLB Ref.54710-5001-CN

<140>中国申请号

<141>2002-08-30

<150>US 60/315,745

<151>2001-08-30

<150>US 60/334,059

<151>2001-11-30

<150>PCT/US02/27637

<151>2002-08-30

<160>30

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2318

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(51)..(2147)

<223>GenBank编号NM_001063，运铁蛋白基因和蛋白

<220>

<221>sig-peptide

<222>(51)..(107)

<400>1

<210>2

<211>698

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>679

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟运铁蛋白

<400>3

<210>4

<211>36

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<223>抗融合肽

<400>4

<210>5

<211>35

<212>PRT

<213>人呼吸道合胞病毒

<220>

<223>抗融合肽

<400>5

<210>6

<211>51

<212>PRT

<213>人呼吸道合胞病毒

<220>

<223>抗融合肽

<400>6

<210>7

<211>35

<212>PRT

<213>人呼吸道合胞病毒

<220>

<223>抗融合肽

<400>7

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>乳铁蛋白剪接变体序列

<400>8

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于诱变的寡核苷酸

<400>9

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于诱变的寡核苷酸

<400>10

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：EPO模拟肽

<400>11

<210>12

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：EPO模拟肽

<400>12

<210>13

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：HIV抗融合序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(108)

<400>13

<210>14

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：HIV抗融合序列

<400>14

<210>15

<211>124

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：HIV融合蛋白的抗融合序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(123)

<400>15

<210>16

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：HIV融合蛋白的抗融合序列

<400>16

<210>17

<211>174

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>INGAP蛋白

<400>17

<210>18

<211>525

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：INGAP序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(525)

<400>18

<210>19

<211>175

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：INGAP序列

<400>19

<210>20

<211>445

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：融合蛋白的INGAP序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(444)

<400>20

<210>21

<211>148

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：融合蛋白的INGAP序列

<400>21

<210>22

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：融合蛋白的INGAP序列

<220>

<221>CDS

<222>(2)..(436)

<400>22

<210>23

<211>145

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：融合蛋白的INGAP序列

<400>23

<210>24

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：EPO模拟序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(60)

<400>24

<210>25

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：EPO模拟序列

<400>25

<210>26

<211>47

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：运铁蛋白肽插入区

<400>26

<210>27

<211>49

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：运铁蛋白肽插入区

<400>27

<210>28

<211>140

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：运铁蛋白肽插入区的DNA序列

<400>28

<210>29

<211>210

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：运铁蛋白肽插入区的DNA序列

<400>29

<210>30

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：EPO模拟肽

<400>30

Claims (10)

1.含有与至少一种治疗性蛋白质或肽融合的运铁蛋白(Tf)蛋白质的融合蛋白，所述运铁蛋白表现出降低的糖基化。

2.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽的血清半寿期高于治疗性蛋白质或肽在非融合状态的血清半寿期。

3.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的C-末端融合。

4.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽与Tf的N-末端融合。

5.权利要求1的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入Tf的至少一个环中。

6.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对TfR的亲和性降低。

7.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁的亲和性降低。

8.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有至少一个能防止糖基化的突变。

9.权利要求1的融合蛋白，它在衣霉素的存在下表达。

10.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白C结构域的一部分。

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