ES2337245T3 - Bibliotecas de proteinas de fucion de la transferrina. - Google Patents

Abstract

Biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR).

Description

Bibliotecas de proteínas de fusión de la transferrina.

Solicitudes relacionadas

La presente invención reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/485.404, presentada el 9 de julio de 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 10/384.060, presentada el 10 de marzo de 2003, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.997 presentada el 30 de agosto de 2002.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a bibliotecas de fagos que contienen proteínas o péptidos con estabilidad en suero y/o semivida circulatoria in vivo ampliadas, particularmente a proteínas o péptidos fusionados a o insertados en una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la unión al receptor de la transferrina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas o péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son moléculas típicamente lábiles que presentan cortos periodos de estabilidad en suero o cortas semividas circulatorias in vivo. Adicionalmente, estas moléculas son a menudo extremadamente lábiles cuando están en una formulación, particularmente cuando se formulan en disoluciones acuosas con objetivos diagnósticos y terapéuticos.

Existen pocas soluciones prácticas para prolongar o potenciar la estabilidad in vivo o in vitro de las moléculas proteináceas terapéuticas. Polietilenglicol (PEG) es una sustancia que se puede unir a una proteína, dando como resultado una actividad sostenida, de mayor duración, de la proteína. Si la actividad de la proteína se prolonga mediante la unión a PEG, se puede disminuir la frecuencia en la que se necesita administrar la proteína. La unión a PEG, sin embargo, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de la proteína. Aunque en algún caso la unión a PEG puede reducir la inmunogenicidad de la proteína, en otros ejemplos puede aumentar la inmunogenicidad.

Las proteínas o péptidos terapéuticos se han estabilizado también mediante fusión a una proteína capaz de prolongar la semivida circulatoria in vivo de la proteína terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas a albúmina o a fragmentos de anticuerpos pueden presentar semivida circulatoria extendida in vivo en comparación con la proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.876.969 y 5.766.883.

Otra proteína sérica, la transferrina humana glicosilada (Tf), se ha usado para realizar fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir la administración hacia el interior de las células o para trasportar agentes a través de la barrera hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden la Tf humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de crecimiento nervioso (NGF) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera hematoencefálica fusionando la Tf de longitud completa con el agente. Véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la porción Tf de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro, que son necesarios para la unión de la Tf con su receptor en una célula y, según los inventores de estas patentes, para dirigir la administración del resto NGF o el CNTF a través de la barrera hematoencefálica. Park y col (Journal of Drug Targeting Vol 6, Nº 1 pp 53-64) exploran la capacidad de usar fusiones genéticas o transferrina como vehículo para la dirección y la administración en el cerebro. Se han producido también proteínas de fusión de la transferrina insertando una secuencia diana de la proteasa de VIH-1 en los bucles expuestos a la superficie de la transferrina glicosilada para investigar la capacidad de producir otra forma de la Tf de fusión para la dirigir la administración al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073). Véase también Shin y col (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp 2820-2824).

La transferrina sérica (Tf) es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 dalton que se une al hierro en la circulación y trasporta esto a diverso tejidos mediante el receptor de la transferrina (TfR) (Aisen y col. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray y col. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de los Estados Unidos 5.026.651). Tf es una de las moléculas séricas más comunes, que comprende hasta aproximadamente un 5-10% de las proteínas séricas totales. Se produce transferrina deficiente en carbohidratos en grandes cantidades en la sangre de individuos alcohólicos y presenta una semivida más larga (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glicosilada) (aproximadamente 7-10 días) Véanse van Eijk y col. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler y col. en "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann y col.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353-357).

Se ha caracterizado bien la estructura de Tf y el mecanismo de la unión al receptor, la unión y liberación de hierro y se ha elucidado la unión al ión carbonato (Patentes de los Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray y col. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).

Se han usado también transferrina y los anticuerpos que se unen al receptor de la transferrina para administrar o trasportar agentes tóxicos a células tumorales como terapia para el cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y se ha usado transferrina como un vector no vírico de terapia génica para administrar ADN a las células (Frank y col, 1994; Wagner y col, 1992). Se ha demostrado la capacidad de liberar proteínas en el sistema nervioso central (SNC) usando el receptor de la transferrina como punto de entrada con diversas proteínas y péptidos entre los que se incluyen CD4 (Walus y col, 1996), el factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge y col, 1994), factor neurotrófico derivado de la glia (Albeck y col), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel y col, 1993), un péptido beta-amiloide (Saito y col, 1995), y un oligonucleótido de sentido contrario (Pardridge y col, 1995).

Sin embargo, las proteínas de fusión de la transferrina no se han modificado o construido mediante ingeniería genética para prolongar la semivida circulatoria in vivo de una proteína ni de un péptido terapéutico o para aumentar la biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glicosilación del resto de Tf ni para reducir o evitar la unión al receptor de Tf y/o el hierro.

Resumen de la invención

Según se describe con más detalle a continuación, la presente invención incluye una biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado a al menos un segundo polipéptido, en el que el péptido Tf tiene afinidad reducida por un receptor de la transferrina (TfR).

En una realización preferida, las proteínas de fusión Tf modificadas comprenden un resto Tf de transferrina humana que se ha modificado para reducir o evitar la unión al hierro y al receptor y opcionalmente la glicosilación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Muestra una alineación de la Regiones N y C de la transferrina (Tf) Humana (Hu) (aminoácidos 1-331 y 332-679 de la SEC DE ID Nº: 3, respectivamente) con las similitudes e identidades resaltadas.

Figura 2A-2B. Muestra una alineación de las secuencias de transferrina de diferentes especies animales. Sombreo claro: Similitud; Sombreo oscuro: Identidad. Las especies son como sigue: conejo (SEC DE ID Nº: 37), rata (SEC DE ID Nº: 38); ratón (SEC DE ID nº: 39), caballo (SEC DE ID Nº: 40), bovino (SEC DE ID Nº: 41), cerdo (SEC DE ID Nº: 42) y pollo (SEC DE ID Nº: 43.

Figura 3. Muestra la localización de un número de emplazamientos de inserción de Tf expuestos a la superficie en proteínas, polipéptidos o péptidos terapéuticos.

Figuras 4A-4B. Muestran las regiones V_{H} y V_{L} de numerosos anticuerpos anti-TNF\alpha usados para producir proteínas de fusión Tf modificadas. Las regiones V_{H} son como sigue: V_{H} de ScFv sintético, Nº de Acceso al GenBank AAK83057 (SEC DE ID Nº: 44), V_{H} de la SEC DE ID Nº: 5 de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.698.195 (SEC DE ID Nº: 45), V_{H} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18250 (SEC DE ID Nº: 46), V_{H} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18252 (SEC DE ID Nº: 47), V_{H} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18254 (SEC DE ID Nº: 48); V_{H} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18256 (SEC DE ID Nº: 49); V_{L} de ScFv sintético, Nº de Acceso al GenBank AAK83057 (SEC DE ID Nº: 70), V_{L} de la SEC DE ID Nº: 3 de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.698.195 (SEC DE ID Nº: 71), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18251 (SEC DE ID Nº: 72), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18253 (SEC DE ID Nº: 73), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18255 (SEC DE ID Nº: 74) y V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18257 (SEC DE ID Nº: 75).

Figura 5. Muestra la mutación de la secuencia pUC18 para la inserción de un emplazamiento NcoI (SEC DE ID N^{os}: 50 y 51, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran también los cebadores de la mutagénesis usados (P 180 y P 181, SEC DE ID N^{os}: 52 y 53, respectivamente.

Figuras 6A-6B). Muestran la secuencia de M13 pIII generada mediante la PCR para la inserción en pUC18/NcoI (SEC DE ID N^{os}. 54 y 55, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran también los cebadores de clonación usados, P182 y P183 (SEC DE ID N^{os}: 56 y 57, respectivamente).

Figura 7. Muestra el emplazamiento de inserción en la región N de la transferrina (SEC DE ID N^{os}: 58 y 59, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran también los cebadores usados para generar la secuencia de reconocimiento SacII, P184 y P185 (SEC DE ID N^{os}: 60 y 61, respectivamente).

Figuras 8A-8B. Muestran el resultado de la mutagénesis mediante la PCR de la región N para la inserción en pUC18pIIISacII (SEC DE ID N^{os}: 62 y 63, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran también los cebadores de clonación usados (P186 y P187, SEC DE ID N^{os}: 64 y 65, respectivamente).

Figura 9. Muestra la PCR mutagénica (dos ciclos).

Figura 10. Muestra los cebadores mutagénicos para la inserción de una región variable de ocho aminoácidos, (X)_{8},
cebadores P0234 y P0235 (SEC DE ID N^{os}: 68 y 69, respectivamente). Se muestra también la región de los vectores M13-pUC18 generados mediante reacción con estos cebadores (SEC DE ID N^{os}: 66 y 67, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente).

Descripción detallada Descripción general

Se ha descubierto que se puede estabilizar una proteína terapéutica (por ejemplo, un polipéptido, anticuerpo, o péptido, o sus fragmentos y variantes) para prolongar la semivida sérica y/o retener la actividad de la proteína terapéutica durante largos periodos de tiempo in vivo fusionando genéticamente o conjugando químicamente la proteína, polipéptido o péptido terapéutico en toda o en una porción de la transferrina modificada lo suficiente para prolongar su semivida en el suero. Las proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una proteína o región de la transferrina unida covalentemente a una proteína o péptido terapéutico, en la que la porción de la transferrina se ha modificada para contener una o más sustituciones, inserciones o delecciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de transferrina natural. Las proteínas de fusión Tf se pueden construir mediante ingeniería genética para reducir o evitar la glicosilación en el interior de Tf o una región de Tf, o la proteína Tf o la(s) región(es) Tf se pueden modificar para presentar una unión reducida o ninguna unión al ión hierro o carbonato, o para tener una afinidad reducida o ninguna unión al receptor de Tf (TfR).

La presente invención incluye una biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado a al menos un segundo polipéptido, en el que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por un receptor de transferrina (TfR). La proteína de fusión de la transferrina puede incluir al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la transferrina modificada, que están asociadas entre sí, mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de la transferrina está generada por la traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de una proteína terapéutica se une en marco con un polinucleótido que codifica toda o una porción de la transferrina modificada). La proteína terapéutica y la proteína transferrina, una parte de la proteína de fusión de la transferrina, puede denominarse como una "porción", "región" o "resto" de la proteína de fusión de la transferrina (por ejemplo, una "porción de proteína terapéutica" o una "porción de la proteína transferrina").

A no ser que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que una persona normalmente experta en la técnica entiende comúnmente a la que esta invención pertenece. Aunque se puede usar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos.

Definiciones

Según se usa en el presente documento, el término "actividad biológica" se refiere a una función o conjunto de actividades llevadas a cabo por una molécula, proteína o péptido terapéutico en un contexto biológico (es decir, en un organismo o un organismo facsímil in vitro del anterior). Las actividades biológicas pueden incluir, pero no se limitan a, las funciones de la porción de molécula terapéutica de las proteínas de fusión reivindicadas, tales como, pero sin limitarse a, la inducción de la secreción de la matriz extracelular procedente de las líneas celulares sensibles, la inducción de la secreción de la hormona, la inducción de la quimiotaxis, la inducción de la mitogénesis, la inducción de la diferenciación, o la inhibición de la división celular de las células sensibles. Se considera que una proteína o péptido de fusión de la invención es biológicamente activa si presenta una o más actividades biológicas de su contraparte natural de la proteína terapéutica.

Según se usa en el presente documento "un aminoácido que corresponde a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de la transferrina se identifica mediante alineamiento para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de la transferrina y al menos una segunda secuencia de la transferrina. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de la transferrina se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la primera secuencia de la transferrina. En algunos casos, se pueden usar estas frases para describir los restos de aminoácidos en la transferrina humana en comparación con algunos restos en la transferrina del suero de conejo.

Según se usa en el presente documento, los términos "fragmento de una proteína Tf" o "proteína Tf", o "porción de una proteína Tf" se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% o 100% de una proteína Tf que se produce naturalmente o mutante de la misma.

Según se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. De esta manera, los genes incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de codificación y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes pueden incluir también segmentos de ADN no expresado que, por ejemplo, forman las secuencias de reconocimiento de otras proteínas. Se pueden obtener genes de una variedad de fuentes, entre las que incluyen la clonación de una fuente de interés o sintetizarlos a partir de información de una secuencia predicha o conocida y pueden incluir secuencias diseñadas para que tengan los parámetros deseados.

Según se usa en el presente documento, un "polinucleótido heterólogo" o un "ácido nucleico heterólogo" o un "gen heterólogo" o una "secuencia heteróloga" o un "segmento de ADN exógeno" se refiere a un polinucleótido, ácido nucleico o segmento de ADN que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped concreta, o, si procede de la misma fuente, está modificada a partir de su forma original. Un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno para la célula huésped concreta, pero que se ha modificado. De esta manera, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición en el interior del ácido nucleico en la célula huésped en la que el elemento no se encuentra ordinariamente. Como ejemplo, es heteróloga una secuencia señal natural en una célula de levadura pero unida a la secuencia Tf humana.

Según se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico "aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% pura, más preferiblemente aproximadamente un 60% pura, incluso más preferible aproximadamente un 80% pura, lo más preferible aproximadamente un 90% pura, e incluso lo más preferible aproximadamente un 95% pura, según se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, se puede obtener, mediante procedimientos de clonación normalizados una secuencia de ácido nucleico aislado, usada en ingeniería genética para reubicar la secuencia de ácido nucleico desde su localización natural a un emplazamiento diferente en el que se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la excisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en la molécula vector, y la incorporación del vector recombinante a una célula huésped en la que se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia del ácido nucleico. La secuencia de ácido
nucleico puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualquiera de sus combinaciones.

Según se usa en el presente documento, dos o más secuencias que codifican ADN se dice que se "unen" o "fusionan" cuando, como resultado de fusiones en marco entre las secuencias que codifican el ADN, las secuencias que codifican el ADN se traducen en un polipéptido de fusión.

Según se usa en el presente documento, el término "fusión" en referencia a las fusiones de Tf incluye, pero no se limita a, la unión de al menos una proteína, polipéptido o péptido terapéutico, preferiblemente la región variable de un anticuerpo, al extremo N terminal de Tf, la unión al extremo C terminal de Tf, la inserción entre dos aminoácidos cualquiera en el interior de Tf, y/o la sustitución de una porción de la secuencia de Tf tal como el bucle de Tf.

"Transferrina modificada", según se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de transferrina que presenta al menos una modificación de su secuencia de aminoácidos, en comparación con la transferrina natural. "Proteína de fusión de la transferrina modificada", según se usa en el presente documento, se refiere a una proteína formada por la fusión de al menos una molécula de transferrina modificada (o uno de sus fragmentos o variantes) en al menos una molécula de una proteína terapéutica (o uno de sus fragmentos o variantes).

Según se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refieren a dexosirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros tanto en forma única como en doble cadena. A no ser que se limite de manera específica, los términos abarcan los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos que se producen naturalmente. A no ser que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico concreto abarca también implícitamente sus variantes modificadas conservativamente (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que está sustituida la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) con restos de base mixta y/o dexosiinosina (Batzer y col. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka y col. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Cassol y col. (1992); Rossolini y col. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, ADNc, y ARNm codificado por un gen.

Según se usa en el presente documento, un segmento de ADN se denomina como "unido de manera operable" cuando se sitúa en una relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, el ADN de la secuencia señal se une de manera operable al ADN que codifica una proteína de fusión de la invención si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de la proteína de fusión; un promotor o un potenciador se une de manera operable a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. Generalmente, las secuencias de ADN que se unen de manera operable son contiguas, y en el caso de una secuencia señal o de la proteína de fusión, ambas son contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos con las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. La unión, en este contexto, se lleva a cabo mediante ligadura en emplazamientos de restricción convenientes o en adaptadores o enlazantes insertados en su lugar.

Según se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una región de ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Según se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una célula, tejido u organismo que ha experimentado transformación con una nueva combinación de genes o ADN.

Según se usa en el presente documento, una entidad, proteína, polipéptido o péptido diana se refiere a una molécula que se une específicamente a un tipo de célula concreto [normal (por ejemplo, linfocitos) o anormal (por ejemplo, célula cancerosa)] y por tanto se puede usar para dirigir una proteína o compuesto de fusión de Tf (fármaco, o agente citotóxico) específicamente hacia este tipo celular.

Según se usa en el presente documento "proteína terapéutica" se refiere a proteínas, polipéptidos, péptidos o sus variantes, que tienen una o más actividades terapéutica(s) y/o biológica(s). Las proteínas terapéuticas abarcadas por la invención incluyen, pero no se limitan a proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, y compuestos biológicos. Los términos péptidos, proteínas, y polipéptidos se usan de manera intercambiable en el presente documento. Adicionalmente, el término "proteína terapéutica" puede referirse a la correlación que se produce de manera endógena o natural de una proteína terapéutica. Por un polipéptido que muestra una "actividad terapéutica" o una proteína que es "terapéuticamente activa" se entiende un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas asociadas con una proteína terapéutica tal como una o más de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento o conocidas de otra manera en la técnica. Como ejemplo no limitante, una "proteína terapéutica" es una proteína que es útil para tratar, evitar o mejorar una enfermedad, dolencia o trastorno, Dicha enfermedad, dolencia o trastorno puede ser en seres humanos o en animales no humanos, por ejemplo, de uso veterinario.

Según se usa en el presente documento, el término "transformación" se refiere a la transferencia de ácido nucleico (es decir, un polímero de nucleótidos) en el interior de una célula. Según se usa en el presente documento, el término "transformación genética" se refiere a la transferencia y a la incorporación de ADN, especialmente ADN recombinante, en el interior de una célula.

Según se usa en el presente documento, el término "transformante" se refiere a una célula, tejido u organismo que ha experimentado transformación.

Según se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a un ácido nucleico que se inserta en un organismo, célula huésped o vector de manera que asegura su función.

Según se usa en el presente documento, el término "transgénico" se refiere a células, cultivos celulares, organismos, bacterias, hongos, animales, plantas, y la progenie de cualquiera de los anteriores, que ha recibido un gen extraño o modificado y en concreto un gen que codifica una proteína de fusión de Tf modificada mediante uno de los diversos procedimientos de transformación, en el que el gen extraño o modificado es de la misma o diferentes especies que las especies del organismo que recibe el gen extraño o modificado.

"Variantes o variante" se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o polipéptido de referencia, pero reteniendo sus propiedades esenciales. Generalmente, las variantes son globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia. Según se usa en el presente documento, "variante" se refiere a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención, que difiere en la secuencia de una proteína terapéutica natural pero que retiene al menos una de sus propiedades funcional y/o terapéutica según se describe en otra parte en el presente documento o se conoce de otra manera en la técnica.

Según se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere ampliamente a cualquier plásmido, fagómido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. El término se construye también para incluir compuestos no plásmidos, no fagómidos y no víricos que facilitan la transferencia del ácido nucleico en viriones o células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector vírico que sea adecuado como vehículo de administración para la administración del ácido nucleico, o uno de sus mutantes, a una célula, o el vector puede ser un vector no vírico que sea adecuado para el mismo objetivo. Se conocen bien en la técnica los ejemplos de vectores víricos y no víricos para la liberación de ADN en las células y tejidos y se describen, por ejemplo en Ma y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746). Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, un virus vaccinia recombinante, un adenovirus recombinante, un virus adenoasociado recombinante, un virus de la viruela aviar recombinante, y similares (Cranage y col., 1986, EMBO J. 5: 3057-3063; Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/17810, publicada el 18 de agosto de 1994; Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/23744, publicada el 27 de Octubre de 1994). Los ejemplos de vectores no víricos incluyen, pero no se limitan a, liposomas, poliaminas derivadas de ADN, y similares.

Según se usa en el presente documento, el término de "tipo natural" se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que se produce naturalmente.

Según se usa en el presente documento, "proteína adaptadora", "polipéptido adaptador", o "adaptadora" se refiere a una proteína a la cual se pueden fusionar las secuencias de aminoácidos tales como péptidos aleatorios. Estos péptidos son exógenos a la adaptadora.

Según se usa en el presente documento "secuencia de péptido aleatorio" se refiere a una secuencia de aminoácidos compuesta por dos o más monómeros de aminoácidos y construida mediante un procedimiento estocástico o aleatorio. Un péptido aleatorio puede incluir el marco de trabajo de motivos adaptadores, que puede comprender secuencias invariantes.

Según se usa en el presente documentos "biblioteca de péptidos aleatorios" se refiere a un conjunto de secuencias de polinucleótidos que codifica un conjunto de péptidos aleatorio, y al conjunto de péptidos aleatorios codificados por aquellas secuencias de polinucleótidos, así como a las proteínas de fusión que contienen los péptidos aleatorios.

\newpage

Según se usa en el presente documento, el término "pseudoaleatorio" se refiere a un conjunto de secuencias que tienen una variabilidad limitada, de tal manera que por ejemplo, el grado de variabilidad del resto en una posición es diferente del grado de variabilidad del resto en otra posición, pero se permite algún grado de variación del resto en cualquier posición pseudoaleatoria, sin embargo restringida.

Según se usa en el presente documento, el término "marco de trabajo de la secuencia definida" se refiere a un conjunto de secuencias definidas que se seleccionan sobre una base no aleatoria, generalmente sobre la base de datos experimentales o datos estructurales, por ejemplo, un marco de trabajo de la secuencia definida puede comprender un conjunto de secuencias de aminoácidos que se predice que forman una estructura de lámina \beta, un motivo de repetición heptad en cremallera de leucina, una región con dedos de cinc, entre otras variaciones. Un "kemal de secuencia definida" es un conjunto de secuencias que abarca un alcance limitado de variabilidad. Mientras que (1) una secuencia de 10-mer completamente aleatoria de los 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquier de (20)^{10} secuencias, y (2) una secuencia de 10-mer pseudoaleatoria de los 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquiera de (20)^{10}
secuencias pero presentará un sesgo para algunos restos en algunas posiciones y/o globalmente, (3) un kemal de secuencia definida es un subconjunto de secuencias que es menor del número máximo de secuencias potenciales si se permitió a cada posición del resto ser cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales permisibles (y/o los amino/iminoácidos no convencionales permisibles). Un kemal de secuencia definida comprende generalmente posiciones variantes e invariantes del resto y/ comprende posiciones variantes del resto que pueden comprender un resto seleccionado procedente de un subconjunto defmed de restos de aminoácidos, y del mismo tipo, tanto segmentariamente como sobre la longitud completa de la secuencia de miembros de la biblioteca seleccionados individualmente. Los kemales de secuencias definidas pueden referirse tanto a secuencias de aminoácidos como a secuencias de polinucleótidos. Para ilustración y sin limitación las secuencias (NNK)10 (SEC DE ID Nº : 31) y (NNM)10 (SEC DE ID Nº: 32), en las que N representa A, T, G, u C; K representa G o T; y M representa A o C, son los kemales de secuencias definidas.

Según se usa en el presente documento, "enlazante" o "separador" se refiere a una molécula o grupo de moléculas que conecta dos moléculas tales como una proteína de unión al ADN y un péptido aleatorio, y sirve para colocar las dos moléculas en una configuración preferida, por ejemplo, de tal manera que el péptido aleatorio pueda unirse a un receptor con impedimento estérico mínimo procedente de la proteína de unión al ADN.

Según se usa en el presente documento, el término "segmento variable" se refiere a una porción de un péptido nascente que comprende una secuencia kemal aleatoria, pseudoaleatoria, o definida. Un segmento variable puede comprender las posiciones de los restos variantes e invariantes, y el grado de variación del resto en la posición del resto variante puede ser limitada; ambas opciones se seleccionan a discreción por el especialista. Normalmente, los segmentos variables son aproximadamente de 5 a 20 restos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, 8 a 10), aunque los segmentos variables pueden ser más largos y pueden comprender porciones de anticuerpos o proteínas receptoras, tales como un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión al ácido nucleico, una proteína receptora, y similares.

Según se usa en el presente documento, el término "epitopo" se refiere a la porción de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión que interactúa con el bolsillo de unión de la región variable de un anticuerpo. Normalmente, dicha interacción de unión se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o más restos de aminoácidos de una CDR.

Según se usa en el presente documento, el término "receptor" se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores se pueden producir naturalmente o como moléculas sintéticas. Se pueden emplear receptores en un estado inalterado o en forma de agregados con otras especies. Los receptores Se pueden unir, covalente o no covalentemente, a un miembro de unión, tanto en forma directa como mediante una sustancia específica de la unión. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos (tales como en virus, células, u otros materiales), receptores de membranas celulares, carbohidratos y glicoproteínas complejos, enzimas, y receptores de hormonas.

Según se usa en el presente documento, el término "ligando" se refiere a una molécula, tal como un péptido aleatorio o secuencia de segmento variable, que está reconocida por un receptor concreto. Como una persona experta en la técnica reconocerá, una molécula (o complejo macromolecular) puede ser un receptor y un ligando. En general, el compañero de unión que tiene un peso molecular más pequeño se denomina ligando y el compañero de unión que tiene un peso molecular mayor se denomina receptor. Según se usa en el presente documento, "fusionado" o "unido de manera operable" se entiende que el péptido aleatorio y la proteína adaptadora se unen conjuntamente, de tal manera que minimizan la perturbación de la estabilidad de la estructura adaptadora.

Según se usa en el presente documento, el término "anticuerpo de cadena única" se refiere a un polipéptido que comprende una región V_{H} y una región V_{L} unidas entre sí con un enlace peptídico, unidas generalmente mediante un péptido separador (por ejemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{x}) (SEC DE ID Nº: 33), y que puede comprender secuencias adicionales de aminoácidos en los términos amino y/o carboxilo. Por ejemplo, un anticuerpo de cadena única puede comprender un segmento de cuerda para la unión con el polipéptido codificante. Como ejemplo, un scFv es un anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos de cadena única son generalmente proteínas constituidas por uno o más segmentos de polipéptidos de al menos 10 aminoácidos contiguos codificados sustancialmente por genes de la superfamilia de la inmunoglobulina (por ejemplo, véase The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams y A. N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, y T. H. Rabbitts, eds., (1989) Academic Press: San Diego, Calif., pp. 361-387, que se incorpora por referencia en el presente documento, lo más frecuentemente, codificado por un roedor, primate no humano, aves, porcino, bovino ovino, cabra, la secuencia del gen de la cadena ligera o de la cadena pesada humana. Un anticuerpo de cadena única general contiene una porción suficiente de un producto génico de la superfamilia de la inmunoglobulina de tal manera que retiene la propiedad de unión a una molécula diana específica, normalmente un receptor o antígeno (epitopo).

Según se usa en el presente documento, el término "región determinante de la complementaridad" y "CDR" se refieren al término reconocido en la técnica como ejemplificado por las definiciones de CDR de Kabat y Chothia conocidas generalmente también como regiones hipervariables o bucles hipervariables (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia y col. (1989) Nature 342: 877; E. A. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987); y Tramontano y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 175). Los dominios de las regiones variables comprenden normalmente los 105-115 aminoácidos aproximadamente aminoterminales de la cadena de inmunoglobulina que se produce de manera natural (por ejemplo, los aminoácidos 1-110), aunque
regiones variables algo más cortas o más largas son también adecuadas para formar anticuerpos de cadena única.

Una región variable de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina está constituida por una región "FW" interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas también CDR. Se ha definido con precisión la extensión de la región FW y de las CDR (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat y col., 4^{a} Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Md. (1987)). Las secuencias de las regiones FW de las diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie. Según se usa en el presente documento, "una región FW humana" es una región FW que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más, normalmente 90-95% o más) a la región FW de la inmunoglobulina humana que se produce naturalmente. La región FW de un anticuerpo, esto es, las regiones FW combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes sirven para situar y alinear las CDR. Las CDR son principalmente responsables de la unión a un epitopo de un antígeno.

Transferrina y modificaciones de la transferrina

Se puede usar cualquier transferrina para realizar las proteínas de fusión de la Tf modificada. Como ejemplo, la Tf humana natural (Tf es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (no se tuvo en cuenta la glicosilación), con dos regiones principales, la N (aproximadamente 330 aminoácidos) y la C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecen originarse a partir de la duplicación de un gen. Véanse los números de acceso al GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/) así como las SEC DE ID N^{os}: 1, 2 y 3. Las dos regiones han divergido en el tiempo pero retienen un elevado grado de identidad/similitud (Fig. 1).

Cada una de las regiones N y C se divide adicionalmente en dos subregiones, N1 y N2, C1 y C2, La función de Tf es trasportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está mediado por el receptor de Tf (TfR), que se expresa en todas las células, de manera particularmente activa en las células en crecimiento. TfR reconoce la forma unida al hierro de Tf (se unen dos moléculas de cada por receptor), a continuación se produce la endocitosis, de esta manera, el complejo TfR/Tf se trasporta al endosoma, en ese momento la disminución localizada del pH da como resultado la liberación del hierro unido y la recirculación del complejo TfR/Tf a la superficie celular y la liberación de Tf (conocida como apoTf en su forma no unida al hierro). La unión al receptor se produce a través de la región C de Tf. Los dos emplazamientos de glicosilación en la región C no parecen estar implicados en la unión al receptor, ya que la Tf no glicosilada unida al hierro se une al receptor.

Cada molécula de Tf puede trasportar dos iones hierro (Fe^{3+}). Estos se complejan en el espacio entre las subregiones N1 y N2, C1 y C2 dando como resultado un cambio conformacional en la molécula. Tf cruza la barrera hematoencefálica (BBB) mediante el receptor Tf.

En la transferrina humana, los emplazamientos de unión al hierro comprenden al menos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82 de la SEC DE ID Nº: 2 que incluye la secuencia señal de la Tf natural), Asp 392 (Asp 411 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 95 (Tyr 114 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 426 (Tyr 445 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 188 (Tyr 207 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 514 o 517 (Tyr 533 o Tyr 536 de la SEC DE ID Nº:2), His 249 (His 268 de la SEC DE ID Nº: 2), e His 585 (His 604 de la SEC DE ID Nº: 2) de la SEC DE ID Nº: 3. Las regiones bisagra comprenden al menos los restos de aminoácidos 94-94-96, 245-247 y/o 316-318 de la región así como la región C los restos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 de la SEC DE ID Nº: 3. Los emplazamientos de unión al carbonato comprenden al menos los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la SEC DE ID Nº: 2), Thr 452 (Thr 471 de la SEC DE ID Nº: 2), Arg 124 (Arg 143 de la SEC DE ID Nº: 2), Arg 456 (Arg 475 de la SEC DE ID Nº: 2), Ala 126 (Ala 145 de la SEC DE ID Nº: 2), Ala 458 (Ala 477 de la SEC DE ID Nº: 2), Gly 127 (Gly 146 de la SEC DE ID Nº: 2), y Gly 459 (Gly 478 de la SEC DE ID Nº: 2) de la SEC DE ID Nº: 3.

En una realización de la invención, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye una transferrina humana modificada, aunque se puede usar cualquier molécula de Tf animal para producir las proteínas de fusión de la invención, incluyendo las variantes de la Tf humana, de vaca, cerdo, oveja, perro, conejo, rata, ratón, hámster, echnida, platypus, pollo, rana, gusano del tabaco, mono, así como otras especies de bovinos, caninos y aves (véase la Fig. 2 de un conjunto representativo de secuencias de Tf). Todas estas secuencias de la TF están fácilmente disponibles en el GenBank y otras bases de datos públicas. Las secuencia de nucleótidos de la Tf humana está disponible (véanse las SEC DE ID N^{os}: 1, 2 y 3 y los números de acceso descritos anteriormente y disponibles en (www.ncbi.nlm.nih.gov) y se pueden usar para llevar a cabo fusiones genéticas entre Tf o una región de Tf y la molécula terapéutica de elección. Se pueden llevar a cabo también fusiones a partir de moléculas relacionadas tales como lacto transferrina (lactoferrina) Acceso
al GenBank: NM_002343) o melanotransferrina (Acceso al GenBank NM_013900, melanotransferrina de murino).

Melanotransferrina es una proteína glicosilada que se encuentra en grandes cantidades en las células de melanoma maligno y se denominó originalmente antígeno p97 de melanoma humano (Brown y col., 1982, Nature, 296: 171-173). Posee una elevada homología de la secuencia con la transferrina sérica humana, la lactoferrina humana, y la transferrina de pollo (Brown y col., 1982, Nature, 296: 171-173; Rose y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 1261-1265). Sin embargo, a diferencia de estos receptores, no se ha identificado receptor celular para la melanotransferrina. Melanotransferrina se une reversiblemente al hierro y existe en dos formas, una de las cuales se une a las membranas celulares mediante un anclaje de glicosil fosfatidilinositol mientras que la otra forma es soluble y se segrega activamente (Baker y col., 1992, FEBS Lett, 298: 215-218; Alemany y col., 1993, J. Cell Sci., 104: 1155-1162; Food y col., 1994, J. Biol. Chem. 274: 7011-7017).

Lactoferrina (Lf), una proteína defensiva natural de unión al hierro, se ha encontrado que posee actividad antibacteriana, antimicótica, antivírica, antineoplásica y antiinflamatoria. La proteína está presente en secreciones exocrinas que están expuestas comúnmente a la flora normal: leche, desgarros, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos gastrointestinales, moco cervicovaginal y fluido seminal. Adicionalmente, Lf es un constituyente principal de los gránulos específicos secundarios de los neutrófilos polimorfonucleares circulantes (PMN). La apoproteína se libera en la desgranulación de los PMN en áreas sépticas. Una función principal de Lf es la de secuestrar el hierro libre en fluidos y zonas inflamadas de tal manera que suprime el daño mediado por radicales libres y disminuye la disponibilidad del metal para invadir las células microbianas y neoplásicas. En un estudio que examinó la velocidad de renovación de ^{125}I Lf en adultos, se demostró que Lf se capturaba rápidamente por el hígado y el bazo, y la radioactividad persistió durante algunas semanas en el hígado y el bazo (Bennett y col. (1979), Clin. Sci. (Lond.) 57: 453-460).

En una realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la invención incluye una variante de corte y empalme de la transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la transferrina puede ser una variante de corte y empalme de la transferrina humana. En una realización específica, la variante de corte y empalme de la transferrina humana puede ser la del Acceso al Genbank AAA61140.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la invención incluye una variante de corte y empalme de la lactoferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la lactoferrina sérica humana puede ser una novedosa variante de corte y empalme de una lactoferrina neutrófila. En una realización específica, la variante de corte y empalme de la lactoferrina neutrófila puede ser la del Acceso al Genbank AAA59479. En otra realización específica, la variante de corte y empalme de la lactoferrina neutrófila puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos EDCIALKGEADA (SEC DE ID Nº: 8), que incluye la novedosa región de varianza de corte y empalme.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la invención incluye una variante de la melanotransferrina.

Se pueden realizar fusiones de la Tf modificada con cualquier proteína, fragmento, región, o región construida mediante ingeniería genética de la Tf. Por ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión usando la secuencia de la Tf de longitud completa, con o sin la secuencia señal de la Tf natural. Se pueden preparar las proteínas de fusión de la Tf usando una región de Tf única, tal como la región N o C individual o una forma modificada de la Tf que comprende las regiones 2N o 2C (véase la solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.977, presentada el 30 de agosto de 2002). En algunas realizaciones, se pueden producir las fusiones de una proteína terapéutica con una región C única, en la que la región C está alterada para reducir, inhibir o evitar la glicosilación. En otras realizaciones, es ventajoso el uso de una región N única ya que los emplazamientos de glicosilación de Tf residen en la región C y en la región N, por sí mismos. Una realización preferida es la proteína de fusión de la Tf que tiene una región N única que se expresa a un elevado nivel.

Según se usa en el presente documento, una región o lóbulo C terminal modificado para funcionar como una región de tipo N está modificada para presentar modelos de glicosilación o propiedades de unión al hierro sustancialmente similares a las de una región o lóbulo N nativa o natural. En una realización preferida, la región o lóbulo C está modificada de tal manera que no está glicosilada y no se une al hierro mediante sustitución de las regiones o aminoácidos relevantes del dominio C por las presentes, en las correspondientes regiones o emplazamientos de una región N nativa o natural.

Según se usa en el presente documento, un resto Tf que comprende "dos regiones o lóbulos N" incluye una molécula Tf que está modificada para sustituir la región o lóbulo C natural con una segunda región o lóbulo N nativa o natural o una región o lóbulo N modificada o que contiene una región C que se ha modificado para funcionar sustancialmente de manera similar a una región N natural o modificada. Véase la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.977. El análisis de dos regiones mediante la superposición de la estructura tridimensional de las dos regiones (Swiss PDB Viewer 3.7b2, Iterative Magic Fit) y mediante la alineación directa de los aminoácidos (alineación múltiple ClustalW) desvela que las regiones han divergido con el tiempo. La alineación de los aminoácidos muestra una identidad del 42% y una similitud del 59% entre las dos regiones. Sin embargo, aproximadamente el 80% de la región N tiene una equivalencia estructural correspondiente con la de la región C. La región C tiene también algunos enlaces disulfuro extra en comparación con la región N.

La alineación de los modelos moleculares de las regiones N y C desvela los siguientes equivalentes estructurales:

1

Los enlaces disulfuro de las dos regiones se alinean como sigue:

2

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la Tf incluye al menos dos lóbulos n terminales de la transferrina. En las realizaciones adicionales, la porción de la transferrina de la proteína de fusión de la Tf incluye al menos dos lóbulos terminales de la transferrina derivados de la transferrina sérica humana.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye, comprende, o está constituida por al menos dos lóbulos N terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, e His249 de la SEC DE ID Nº: 3.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión modificada incluye un lóbulo N terminal de la transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en la Lys206 o la His207 de la SEC DE ID Nº: 3.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye, comprende o está constituida por dos lóbulos C terminales de transferrina. En las realizaciones adicionales, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina derivados de la transferrina sérica humana.

En una realización adicional, el lóbulo C terminal mutante incluye además una mutación de al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC DE ID Nº: 3, que no permite la glicosilación. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a iones metálicos. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr517 e His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos y funciona de manera sustancialmente similar a una región N.

En algunas realizaciones, Tf o la porción de Tf tendrán longitud suficiente para aumentar la semivida circulatoria in vivo, estabilidad en suero, estabilidad en disolución in vitro o biodisponibilidad de la región variable del anticuerpo en comparación con la semivida circulatoria in vivo, estabilidad en suero (semivida), estabilidad in vitro o biodisponibilidad de la región variable del anticuerpo en un estado no fusionado. Dicho aumento de la estabilidad, semivida circulatoria in vivo o biodisponibilidad puede ser de aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90% o más aumento respecto de la región variable del anticuerpo no fusionado. En algunos casos, los trans-cuerpos que comprenden la transferrina modificada presentan una semivida en suero de aproximadamente 10-20 o más días, aproximadamente 12-18 días o aproximadamente 14-17 días.

Cuando la región C de Tf es parte de la proteína de fusión los dos emplazamientos de glicosilación unidos a N, restos de aminoácidos que corresponden a N413 y N611 de la SEC DE ID Nº: 3, pueden mutarse para expresión en un sistema de levaduras para evitar la glicosilación o hipermanosilación y prolongar la semivida circulatoria in vivo de la proteína de fusión y/o de la proteína terapéutica (para producir asialo-, o en algunos ejemplos monosialo-Tf o disialo-Tf). Adicionalmente, en los aminoácidos de Tf que corresponden a N413 y n611, las mutaciones pueden ser restos adyacentes dentro del emplazamiento de glicosilación N-X-S/T para evitar o reducir sustancialmente la glicosilación. Véase la Patente de los Estados Unidos 5.986.067 de Funk y col. Se ha informado también de que la región N de la Tf expresada en Pichia pastoris se vuelve glicosilada unida a O con una única hexosa en S32 que se puede mutar o modificar también para evitar dicha glicosilación. Es más, se puede reducir o eliminar la glicosilación unida a O en una célula huésped de levadura con mutaciones en los genes PMT.

Según esto, en una realización de la invención, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada que presenta glicosilación reducida, incluyendo pero sin limitarse a formas asialo, monosialo y disialo de Tf. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que está mutado para evitar la glicosilación. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que está completamente glicosilado. En una realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que está mutado para evitar la glicosilación, en el que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC DE ID Nº: 3 están mutados en un aminoácido que no permite la glicosilación. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que está mutado para evitar o reducir sustancialmente la glicosilación, en la que las mutaciones pueden ser en los restos adyacentes dentro del emplazamiento de glicosilación N-X-S/T. Es más, se puede reducir o evitar la glicosilación mutando el resto de serina o treonina. Además, se conoce el cambio de X por prolina para inhibir la glicosilación.

Tal como se discute a continuación con más detalle, se pueden construir también mediante ingeniería genética las proteínas de fusión de la Tf para que no se una al hierro y no se una al receptor de Tf. Cuando la unión al hierro está retenida, se puede usar la capacidad de Tf de dos manera, una, para administrar una proteína o péptido(s) terapéutico(s)
en el interior de una célula y/o a través de la BBB. Estas realizaciones con unión al hierro y/o al receptor de Tf, se construirán a menudo mediante ingeniería genética para reducir o evitar la glicosilación para prolongar la semivida en suero de la proteína terapéutica. La región N sola no se unirá al TfR cuando se cargue con el hierro, y la región C unida a hierro se unirá al TfR pero sin la misma afinidad que la molécula completa.

En las bibliotecas de la invención, el péptido Tf tiene una afinidad reducida por un receptor de la transferrina.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural. En una realización alternativa, la porción de transferrina da la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina. En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por el receptor de la transferrina que la de la transferrina sérica natural.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones carbonato. En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural. En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una realización alternativa, un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a iones metálicos. En otra realización, un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionados entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr517 y His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos.

En otra realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la transferrina sérica humana natural (véase la Patente de los Estados Unidos 5.986.067, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad). En una realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones metálicos que la de la transferrina sérica humana natural. En una realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante no se une a iones metálicos.

Se puede usar cualquier técnica disponible para preparar las proteínas de fusión de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a las técnicas moleculares comúnmente disponibles, por ejemplo, las descritas en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótidos usando técnicas para realizar mutagénesis específica del emplazamiento que se conocen bien en la técnica, los cambios en los aminoácidos modificados son preferiblemente de naturaleza menor, esto es, sustituciones conservativas de aminoácidos, aunque se contemplan también otras sustituciones no conservativas, particularmente cuando producen una porción de transferrina modificada de una proteína de fusión de la Tf, por ejemplo, una proteína de fusión de la Tf modificada que presenta glicosilación reducida, unión al hierro reducida y similares. Se contemplan específicamente sustituciones de aminoácidos, pequeñas delecciones o inserciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos, inserciones entre las regiones de la transferrina; pequeñas extensiones amino o carboxil terminales, tales como un resto de metionina amino terminal, o pequeños péptidos enlazantes de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 restos o la unión a una proteína transferrina y a una proteína o péptido terapéutico; o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tramo de poli-histidina, un epitopo antigénico o una región de unión.

Los ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos son sustituciones hechas en el interior del mismo grupo tales como en el interior del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tal como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).

Las sustituciones no conservativas abarcan las sustituciones de aminoácidos en un grupo por aminoácidos del otro grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservativa incluiría la sustitución de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford y col. (1991), Prot. Exp. Pur. 2: 95-107. Las sustituciones, delecciones e inserciones no conservativas son particularmente útiles para producir las proteínas de fusión de Tf de la invención que presentan ninguna o reducida unión del hierro, ninguna o reducida unión de la proteína de fusión al receptor de Tf.

En el polipéptido y las proteínas de la invención, se sigue el siguiente sistema para designar los aminoácidos según la siguiente lista convencional.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA DE AMINOÁCIDOS

3

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede reducir o perturbar la unión al hierro y/o la unión al receptor mediante mutación, que incluye delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los restos Asp63, Tyr95, Tyr188, His249 de la región N de Tf y/o los restos Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o His 585 de la SEC DE ID Nº: 3 de la región C. Puede estar también afectada la unión al hierro mediante mutación en los aminoácidos Lys206, His207 o Arg632 de la SEC DE ID Nº: 3. Se puede reducir o perturbar la unión al carbonato, mediante mutación, que incluye delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más restos de los aminoácidos Thr120, Arg124, Ala126, Gly 127 de la región N de Tf y/o los restos Thr 452, Arg 456, Ala 458 y/o Gly 459 de la SEC DE ID Nº: 3 de la región C. una reducción o perturbación de la unión al carbonato puede afectar adversamente la unión al hierro y/o al receptor.

La unión al receptor de Tf puede estar reducida o perturbada mediante mutación, que incluye delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponde a uno o más de los restos de la región N de Tf descritos anteriormente para la unión al hierro.

Tal como se ha discutido anteriormente, se puede reducir o evitar la glicosilación mediante mutación, que incluye delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponde a uno o más de los restos de la región C de Tf alrededor de los emplazamientos N-X-S/T que corresponden a los restos N413 y/o N611 de la región C (Véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.986.067. Por ejemplo, el N413 y/o el N611 pueden estar mutados en los restos Glu.

En ejemplos en los que las proteínas de fusión de Tf no están modificadas para evitar la glicosilación, la unión al hierro, la unión al carbonato y/o la unión al receptor, la glicosilación, los iones de hierro y/o carbonato pueden estar eliminados o escindidos de la proteína de fusión, en particular los restos de azúcar unidos a la porción de Tf, se pueden usar enzimas de levaduras deficientes en la glicosilación para evitar la glicosilación y/o se pueden hacer crecer células recombinantes en presencia de un agente que evite la glicosilación, por ejemplo, tunicamicina.

Los carbohidratos de la proteína de fusión pueden también reducirse o eliminarse enzimáticamente de manera completa tratando la proteína de fusión con deglicosilasas. Las deglicosilasas se conocen bien en la técnica. Los ejemplos de deglicosilasas incluyen, pero no se limitan a galactosidasa, PNGasa F, glucosidasa, mannosidasa, fucosidasa, y Endo H deglicosilasa.

Se pueden realizar mutaciones adicionales con Tf para alterar la estructura tridimensional de Tf, dichas modificaciones en la región bisagra evitan el cambio conformacional necesario para la unión al hierro y el reconocimiento del receptor de Tf. Por ejemplo, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de los restos de los aminoácidos 94-96, 245-247 y/ 316-318 de la región N así como los restos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 de la región C. Adicionalmente, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de las regiones que flanquean estos emplazamientos para alterar la estructura y función de Tf.

En un aspecto de la invención, la proteína de fusión de la transferrina puede funcionar como una proteína vehículo para prolongar la semivida o la biodisponibilidad de la proteína terapéutica así como, en algunos ejemplos, administrar la proteína terapéutica al interior de una célula y/o a través de la barrera hematoencefálica. En una realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina no retiene la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica.

En otra realización, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al interior de las células. En una realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al interior de las células.

En realizaciones adicionales, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al interior de las células y retiene la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica. En una realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica, pero no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al interior de las células.

Proteínas de fusión de la transferrina modificada

Las proteínas de fusión en las bibliotecas de la invención pueden contener una o más copias de la proteína o polipéptido terapéutico unido al término N y/o al término C de la proteína Tf. En algunas realizaciones, la proteína o el péptido terapéutico se unen a los términos N y C de la proteína Tf y la proteína de fusión puede contener uno o más equivalentes de la proteína o el polipéptido terapéutico en cualquiera de ambos extremos de Tf. En otras realizaciones, la proteína o el polipéptido terapéutico se inserta en regiones conocidas de la proteína Tf, por ejemplo, en uno o más de los bucles de Tf (véase Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073). En otras realizaciones, la proteína terapéutica o el péptido terapéutico se insertan entre las regiones N y C de Tf.

Generalmente, la proteína de fusión de la transferrina puede tener una región derivada de la transferrina modificada y una región derivada de la proteína terapéutica. Se pueden usar, sin embargo, múltiples regiones de cada proteína para preparar una proteína de fusión de la transferrina. De manera similar, se puede usar más de una proteína terapéutica para preparar una proteína de fusión de la transferrina produciendo de esta manera una proteína de fusión de la Tf modificada multifuncional.

La presente invención proporciona bibliotecas de fagos que contienen una proteína de fusión de la transferrina que contiene una proteína o polipéptido o porción del mismo fusionada a una molécula de transferrina o porción de la misma, que tiene afinidad reducida por un receptor de la transferrina. En una realización, la proteína de fusión de la invención contiene una proteína o polipéptido terapéutico fusionado al término N de una molécula de transferrina. En una realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina contiene una proteína terapéutica fusionada al término C de una molécula de transferrina. En otras realizaciones, la proteína de fusión de la transferrina puede contener una proteína o polipéptido o porción terapéutica del mismo fusionada a una molécula de transferrina modificada o porción de la misma.

En otras realizaciones, la proteína de fusión de la transferrina contiene una proteína terapéutica fusionada al término N y al término C de la transferrina modificada. En otra realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N y C son las mismas proteínas terapéuticas. En una realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N y C son proteínas terapéuticas diferentes. En otra realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para tratar o evitar la misma enfermedad, trastorno, o dolencia. En otra realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para tratar o evitar enfermedades o trastornos que se sabe en la técnica que se producen comúnmente en pacientes de manera simultánea.

Adicionalmente a la proteína de fusión de la transferrina modificada en la que la porción de la transferrina modificada se fusiona con el N terminal y/o el C terminal de la porción de proteína terapéutica, se puede producir también la proteína de fusión de la transferrina insertando la proteína o el péptido terapéutico de interés (por ejemplo, una proteína o péptido terapéutico como se da a conocer en el presente documento, o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única que se une a una proteína terapéutica o a un fragmento o variante de la misma) en una región interna de la transferrina modificada. Las regiones internas de la transferrina modificada incluyen, pero no se limitan a, los emplazamientos de unión al hierro, las regiones bisagra, los emplazamientos de unión al bicarbonato, o la región de unión al receptor.

Dentro de la secuencia de la proteína de la molécula de la transferrina modificada, existen numerosos bucles o vueltas, que se estabilizan mediante enlaces disulfuro. Estos bucles son útiles para la inserción, o la fusión interna, de péptidos terapéuticamente activos, particularmente los que requieren una estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas terapéuticas para generar una molécula de transferrina modificada con actividad biológica específica.

Cuando se insertan las proteínas o péptidos terapéuticos en o se sustituye al menos un bucle de una molécula de Tf, se pueden realizar inserciones en el interior de cualquiera de las regiones bucle expuestas superficialmente, adicionalmente a otras áreas de la Tf. Por ejemplo, se pueden realizar inserciones en el interior de los bucles que comprenden los aminoácidos 32-33, 74-75, 256-257, 279-280 y 288-289 de Tf (Ali y col, más arriba) (véase la Fig. 3). Según se ha descrito anteriormente, se pueden realizar también inserciones en el interior de otras regiones de Tf tales como los emplazamientos para la unión del hierro y el bicarbonato, las regiones bisagra, y la región de unión al receptor según se describe con más detalle a continuación. Se pueden usar también los bucles en la secuencia de la proteína Tf que son adecuados para la modificación/sustitución para la inserción de proteínas o péptidos para el desarrollo de una librería rastreable de insertos de péptidos aleatorio. Se puede usar cualquier procedimiento para producir insertos de ácido nucleico para la generación de bibliotecas de péptidos, incluyendo los sistemas de fagos disponibles y de presentación de bacterias, antes de la clonación en una región de Tf y/o la fusión con los extremos de Tf. En otras realizaciones, la biblioteca se prepara directamente en o sobre los extremos de un péptido Tf según se describe a continuación.

El término N de Tf está libre y apunta hacia fuera del cuerpo de la molécula. Las fusiones de las proteínas o los péptidos en el término N pueden por tanto ser una realización preferida. Dichas fusiones pueden incluir una región enlazante, tal como, pero sin limitarse a un tramo de poliglicina, para separar la proteína o el péptido terapéutico de Tf. Debe prestarse atención a la unión entre la secuencia líder, la elección de la secuencia líder, y la estructura del ARNm mediante la manipulación/optimización del codón (sin bucles en los tallos principales para inhibir el progreso del ribosoma) aumentará la secreción y se puede llevar a cabo fácilmente usando técnicas estandarizadas de proteínas recombinantes.

El término C de Tf parece estar más hundido y asegurado mediante un enlace disulfuro en 6 aminoácidos del término C. En la Tf humana, el aminoácido c terminal es una prolina que, dependiendo de la manera en que está orientada, apuntará una fusión tanto fuera de cómo en el interior del cuerpo de la molécula. Se puede usar un resto enlazante o separador en el término C en algunas realizaciones de la invención. Existe también una prolina próxima al término N. En un aspecto de la invención, se puede cambiar la prolina en los términos N y/o C. En otro aspecto de la invención, se puede eliminar el enlace disulfuro C terminal para desligar el término C.

En otras realizaciones adicionales, se pueden complejar pequeñas moléculas terapéuticas con hierro y cargarse en una proteína de fusión de la Tf modificada para liberarse en el interior de las células y a través de la BBB. Se puede usar la adición de un péptido director o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única (SCA) para dirigir la carga útil hacia un tipo celular concreto, por ejemplo, una célula cancerosa.

Ácidos nucleicos

La presente invención proporciona también bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos. Estas codifican un proteína de fusión de la Tf que comprende una proteína transferrina o una porción de una proteína transferrina que tiene afinidad reducida por un receptor de la transferrina enlazado o unido covalentemente a al menos un segundo péptido. Tal como se discute con más detalle a continuación, se puede usar cualquier proteína terapéutica. La proteína de fusión puede comprender además una región enlazante, por ejemplo, una enlazante menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácidos. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden estar purificadas o no.

Se proporcionan también las células y vectores huéspedes para la replicación de las moléculas de ácido nucleico y para expresar las proteínas de fusión codificadas. Se puede usar cualquier vector o célula huésped, tanto procariota como eucariota, pero se pueden preferir los sistemas de expresión eucariotas, en concreto, los sistemas de expresión de levaduras. Se conocen en la técnica muchos vectores y células huésped para dichos objetivos. Está bien comprendido dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica seleccionar un conjunto apropiado para la aplicación deseada.

Se pueden clonar las secuencias de ADN que codifican la transferrina, porciones de la transferrina y las proteínas terapéuticas de interés a partir de una variedad de bibliotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica. Las técnicas para aislar dichas secuencias de ADN usando procedimientos basados en sondas son técnicas convencionales y bien conocidas de las personas expertas en la técnica. Las sondas para aislar dichas secuencias de ADN pueden basarse en secuencias publicadas de ADN o proteínas (véase, por ejemplo, Baldwin, G.S. (1993) Comparison of Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem. Physiol. 106B/1: 203-218 y todas las referencias citadas en el presente documento) Alternativamente, se puede usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), procedimiento que dieron a conocer Mullis y col. (Patente de los Estados Unidos. Nº. 4.683.195) y Mullis (Patente de los Estados Unidos. Nº. 4.683.202). La elección de la biblioteca y la selección de las sondas para el aislamiento de dichas secuen-
cias de ADN están comprendidas dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.

Según se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polinucleótidos o polipéptidos se determina comparando la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y sus sustitutos de nucleótidos o de aminoácidos conservados de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. Se conoce también en la técnica la "identidad", que significa el grado de relación de la secuencia entre dos secuencias de polipéptidos o dos polinucleótidos según se determina mediante la identidad de la secuencia entre dos cadenas de dichas secuencias. se pueden calcular fácilmente la identidad y la similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad y la similitud entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, los términos "identidad" y "similitud" son bien conocidos de los técnicos expertos (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencia incluyen, pero no se limitan a los que se dan a conocer en la Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988).

Los procedimientos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor correspondencia entre las dos secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos. Los procedimientos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete del programa CGC (Devereux, y col., Nucl. Acid Res. 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, y col., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o de identidad referidas a lo anterior se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias, que a menudo indica una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. Se puede determinar el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos por medio de un programa informático conocido en la técnica como GAP facilitado en el paquete del programa GCG (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)). Con el objeto de determinar el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, se usa GAP con las siguientes configuraciones: penalización por creación de huecos de 0,5 y penalización por extensión de huecos de 0,3.

Optimización del codón

La degeneración del código genético permite variaciones en la secuencia de nucleótidos de una proteína transferrina y/o la proteína terapéutica de interés, produciendo adicionalmente a la vez un polipéptido que tiene idéntica secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN natural. El procedimiento, conocido como "optimización del codón" (descrito en la Patente de los Estados Unidos 5.547.871) proporciona un medio de diseñar dicha secuencia de ADN alterada. El diseño de los genes optimizados del codón debería tener en cuenta una variedad de factores, incluyendo la frecuencia de uso del codón en un organismo, las frecuencias semejantes más próximas, la estabilidad del ARN, el potencial de formación de la estructura secundaria, la ruta de síntesis y las manipulaciones futuras previstas del ADN de este gen. En concretos, se pueden usar los procedimientos disponibles para alterar los codones que codifican una proteína de fusión dada con los más fácilmente reconocidos por la levadura cuando se usan sistemas de expresión de levaduras.

La degeneración del código genético permite codificar y traducir la misma secuencia de aminoácidos de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, leucina, serina y arginina está codificados cada uno por seis codones diferentes, mientras que valina, prolina, treonina, alanina y glicina están codificados cada uno por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de dichos codones sinónimos varía de genoma a genoma entre eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los modelos de elección de codones sinónimos entre mamíferos son muy similares, mientras que organismos evolutivamente distantes tales como levaduras (tal como S. cerevisiae), bacterias (tal como E. coli) e insectos (tal como D. melanogaster) desvelan un modelo claramente diferente de frecuencias de uso del codón genómico (Grantham, R, y col., Nucl. Acid Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R., y col., Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Maroyarna, T., y col., Nucl. Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., y col., Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., y col., Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). Estas diferencias en los modelos de elección del codón parecen contribuir a los niveles de expresión global de los genes individuales modulando las velocidades de elongación de los péptidos (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); Randall, L. L., y col., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., y col., J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., y col., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).

Las frecuencias de uso preferido del codón de un gen sintético deberían reflejar los usos del codón de los genes nucleares derivados del genoma exacto (o tan estrechamente relacionado como sea posible) de la célula/organismo que se prevé que se va a usar para la expresión de la proteína recombinante, particularmente de las especies de levaduras. Según se ha discutido anteriormente, en una realización preferida de la secuencia de la Tf humana se optimiza el codón, antes o después de la modificación como se describe en el presente documento para la expresión de la levadura como puede ser la(s) secuencia(s) del(os) nucleótido(s) de la proteína terapéutica.

Vectores

Las unidades de expresión para uso en la presente invención comprenderán generalmente los siguientes elementos, unidos de manera operable en una orientación 5' a 3'; un promotor transcripcional, una secuencia señal secretora, una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la Tf modificada que comprende la proteína transferrina o una porción de una proteína transferrina unida a una secuencia de ADN que codifica una proteína o péptido terapéutico de interés y un terminador transcripcional. Según se ha discutido anteriormente, se puede usar cualquier disposición de la proteína o péptido terapéutico fusionado a o en el interior de la porción de Tf en los vectores de la invención. La célula huésped seleccionada determinará la selección de los promotores adecuados, las secuencias señal y los terminadores y será evidente para una persona experta en la técnica y se discute más específicamente a
continuación.

Los vectores de levaduras adecuados para uso en la presente invención se describen en la Patente de los Estados Unidos 6.291.212 e incluyen YRp7 (Struhl y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach y col., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores de plásmidos de levaduras útiles incluyen también pRS403-406, pRS413-416 y los vectores de Pichia disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos Integrantes de Levaduras (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levaduras HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-41.6 son plásmidos Centrómeros de Levaduras (YCps).

Dichos vectores incluirán generalmente un marcador seleccionable, que puede ser uno de cualquier número de genes que presente un fenotipo dominante para el cual exista un ensayo fenotípico que permita seleccionar los transformantes. Los marcadores seleccionables preferidos son los que complementan la auxotrofia de la célula huésped, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten a una célula utilizar fuentes específicas de carbono, e incluyen LEU2 (Broach y col. ibid.), URA3 (Botstein y col., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl y col., ibid.) o POT1 (Kawasaki y Bell, documento EP 171,142). Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen CAT, que confiere resistencia al cloranfenicol en células de levaduras. Los promotores preferidos para uso en levaduras incluyen los promotores de los genes glicolíticos de las levaduras (Hitzeman y col., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311) o los genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y col., (eds.), p. 355, Plenum, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983) a este respecto, los promotores particularmente preferidos son el promotor TPI1 (Kawasaki, Patente de los Estados Unidos. Nº 4.599.311) y el ADH2-4^{C} (véase el promotor de la Patente de los Estados Unidos 6.291212 (Russell y col., Nature 304: 652-654, 1983). Las unidades de expresión pueden incluir también un terminador transcripcional. Un terminador transcripcional preferido es el terminador TPI1 (Alber y Kawasaki, ibid.) otros vectores preferidos y componentes preferidos tales como los promotores y terminadores de un sistema de expresión de levadura se dan a conocer en las Patentes Europeas EP 0258067, EP 0286424, EP0317254, EP 0387319, EP 0386222, EP 0424117, EP 0431880, y EP 1002095; Publicaciones de Patentes Europeas EP 0828759, EP 0764209, EP 0749478, y EP 0889949;publicación PCT WO 00/44772 y WO 94/04687; y las Patentes de los Estados Unidos 5.739.007; 5.637.504; 5.302.697; 5.260.202; 5.667.986; 5.728.553; 5.783.423; 5.965.386; 6150.133; 6.379.924; y 5.714.377.

Adicionalmente a las levaduras, se pueden expresar las proteínas de fusión modificadas en hongos filamentosos, por ejemplo, cepas de los hongos Aspergillus, Los ejemplos de promotores útiles incluyen los derivados de los genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 (McKnight y col., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) y el promotor tpiA, Un ejemplo de un terminador adecuados es el terminador adh3 (McKnight y col., ibid.). Las unidades de expresión que utilizan dichos componentes se pueden clonar en el interior de vectores que sean capaces de la inserción en el ADN cromosómico de Aspergillus, por ejemplo.

Los vectores de expresión en mamíferos incluirán un promotor capaz de dirigir la transcripción de la proteína de fusión de la Tf modificada. Los promotores preferidos incluyen promotores víricos y promotores celulares, los promotores víricos preferidos incluyen el promotor tardío mayor de adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199, 1982) y el promotor de SV40 (Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981). Los promotores celulares preferidos incluyen el promotor de la metalotioneina 1 de ratón (Palmiter y col., Science 222: 809-814, 1983) y el promotor V_{\kappa} de ratón (véase la patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Grant y col., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987). Un promotor particularmente preferido es un promotor V_{H} de ratón (véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Loh y col, ibid). Dichos vectores de expresión pueden contener también un conjunto de emplazamientos de corte y empalme del ARN localizados en la dirección 3' del promotor y en la dirección 5' de la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de la transferrina. Los emplazamientos de corte y empalme del ARN preferidos se pueden obtener de los genes de adenovirus y/o de la inmunoglobulina.

Contenida también en los vectores de expresión está una señal de poliadenilación localizada en la dirección 3' de la secuencia de codificación de interés. Las señales de poliadenilación incluyen las señales de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación procedente de la región E1B de adenovirus 5 y el terminador del gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto y col., Nucl. Acid Res. 9: 3719-3730, 1981). Una señal de poliadenilación particularmente preferida es el terminador del gen V_{H} (véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Loh y col, ibid.). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder vírica no codificante, tal como la líder tripartita de adenovirus 2, localizada entre el promotor y los emplazamientos de corte y empalme del ARN. Los vectores preferidos pueden incluir también secuencias potenciadoras, tales como el potenciador de SV40 y el potenciador \mu de ratón (véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Gillies, Cell 33: 717-728, 1983). Los vectores de expresión pueden incluir también secuencias que codifican los ARN de adenovirus VA.

Transformación

Son bien conocidas en la bibliografía las técnicas para transformar hongos, y se han descrito, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), y Russell (Nature 301: 167-169, 1983). Se pueden usar otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células fúngicas, tales como la electroporación (Becker y Guarente, Methods in Enzymol. 194: 182-187, 1991). El genotipo de la célula huésped contendrá generalmente un defecto genético que está complementado por el marcador seleccionable presente en el vector de expresión. La elección de un huésped y el marcador seleccionable concretos está bien comprendida dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.

Se pueden introducir las secuencias de ADN clonado que comprenden las proteínas de fusión de la Tf modificada en células de mamífero cultivadas mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y col., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973. Se pueden usar también otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células de mamíferos, tales como la electroporación (Neumann y col., EMBO J. 1: 841-845, 1982), o la lipofección. Con el fin de identificar las células que tienen integrado el ADN, se introduce generalmente un marcador seleccionable en las células junto con el gen del ADNc de interés. Los marcadores seleccionables preferidos para uso en células de mamífero cultivadas incluyen los genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es el gen DHFR. Un marcador amplificable particularmente preferido es el ADNc de DHFR' (véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Simonsen y Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly revisó los marcadores seleccionables (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.) y la elección de los marcadores seleccionables está bien comprendida dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.

Células huésped

La presente solicitud describe también una célula, preferiblemente una célula de levadura transformada para expresar una proteína de fusión de la transferrina modificada. Adicionalmente a las propias células huésped transformadas, la solicitud describe también un cultivo de dichas células, preferiblemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si se segrega el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células si se han separado por filtración o centrifugación.

Las células huésped par uso en la práctica de la presente invención incluyen células eucariotas, y en algunos casos células procariotas, capaces de transformarse o transfectarse con ADN exógeno y crecer en cultivo, tal como células de mamífero, insecto, hongo, planta y bacteria.

Las células fúngicas, incluyendo las especies de levaduras (por ejemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp.) se pueden usar como células huésped dentro de la presente invención. Los ejemplos de hongos que incluyen levaduras como huéspedes para expresar la proteína de fusión de la transferrina son Pichia (algunas especies de las cuales se clasificaban anteriormente como Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y similares. Los ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Los ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora adecuada es T. delbrueckii. Los ejemplos de Pichia spp. son P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anomala (anteriormente H. anomala) y P. pastoris.

Las células huésped particularmente útiles para producir las proteínas de fusión de la Tf son la Pichia pastoris metilotrófica (Steinlein y col. (1995) Protein Express. Purif. 6: 619-624). Se ha desarrollado Pichia pastoris para que sea un huésped destacado para la producción de proteínas extrañas debido a que su promotor de la alcohol oxidasa ha sido aislado y clonado; se informó por primera vez de su transformación en 1985. P. pastoris utiliza metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa. El sistema de expresión de P. pastoris puede usar el promotor de la alcohol oxidasa inducida por metanol (AOX1), que controla el gen que codifica la expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo del metanol. Este promotor se ha caracterizado e incorporado a una serie de vectores de expresión de P. pastoris. Debido a que las proteínas producidas en P. pastoris se pliegan normalmente de manera correcta y se segregan en el medio, la fermentación de P. pastoris construida mediante ingeniería genética proporciona una excelente alternativa a los sistemas de expresión en E. coli. Se han producido numerosas proteínas usando este sistema, incluyendo el fragmento de la toxina del tétanos, la pertactina de Bordetella pertussis, la albúmina y la lisozima del suero humano.

Las cepas de Saccharomyces cerevisiae son otro huésped preferido. En una realización preferida, se usa una célula de levadura, o más específicamente, una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que contiene una deficiencia genética en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina de las glicoproteínas. Se pueden preparar las células huésped de S. cerevisiae que tienen dichos defectos usando las técnicas estandarizadas de mutación y selección, aunque se han modificado muchas cepas de levadura disponibles para evitar o reducir la glicosilación o la hipermanosilación. Ballou y col. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) han descrito el aislamiento de los mutantes de la biosíntesis de la mannoproteína que son defectivos en los genes que afectan a la glicosilación ligada a asparagina. Gentzsch y Tanner (Glycobiology 7:481-486, 1997) han descrito una familia de al menos seis genes (PMT1-6) que codifican las enzimas responsables de la primera etapa en la O-glicosilación de las proteínas en levadura. Los mutantes defectivos en uno o más de estos genes muestran una reducida glicosilación ligada a O y/o una alteración en la especificidad de la O-glicosilación.

Para optimizar la producción de las proteínas heterólogas, se prefiere también que la cepa huésped trasporte una mutación, tal como la mutación pep4 en S. cerevisiae (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), que da como resultado una actividad proteolítica reducida. Las cepas huésped que contienen mutaciones en otras regiones que codifican la proteasa son particularmente útiles para producir grandes cantidades de las proteínas de fusión de la Tf.

Las células huésped que contienen constructos de ADN se hacen crecer en un medio de crecimiento apropiado. Según se usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento celular puede incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, los aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. El medio de crecimiento será generalmente selectivo para las células que contienen el constructo de ADN mediante, por ejemplo, selección mediante fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se complementará por el marcador seleccionable en el constructo de ADN o transfectarse simultáneamente con el constructo de ADN. Las células de levadura, por ejemplo, se hacen crecer preferiblemente en un medio definido químicamente, que comprende una fuente de carbono, por ejemplo, sacarosa, una fuente de nitrógeno no de aminoácidos, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de aminoácidos esenciales. El pH del medio se mantiene preferiblemente a un pH mayor de 2 y menor de 8, preferiblemente a pH 5,5-6,5. Los procedimientos para mantener un pH estable incluyen controlar el tamponamiento y el pH constante. Los agentes tamponantes preferidos incluyen ácido succínico y Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). las células de levadura que tienen un defecto en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina se hacen crecer preferiblemente en un medio que contiene un estabilizante osmótico. Un estabilizante osmótico preferido es sorbitol suplementado en el medio a una concentración entre 0,1 M y 1,5 M, preferiblemente a 0,5 M o 1,0 M.

Se hacen crecer las células de mamífero cultivadas en medios libres de suero o que contienen suero comercialmente disponible. La selección de un medio apropiado para la línea celular concreta usada está comprendida dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica. Se dejaron crecer las células de mamífero transfectadas durante un periodo de tiempo, normalmente 1-2 días, hasta el comienzo de la expresión de la(s) secuencia(s) de
ADN de interés. A continuación se aplicó la selección mediante fármaco para seleccionar el crecimiento de las células que expresaban el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador seleccionable amplificable, se puede aumentar la concentración del fármaco en una manera por etapas para seleccionar el aumento del número de copias de las secuencias clonadas, aumentando por tanto los niveles de expresión.

El Sistema de Expresión de Baculovirus BacPAK^{TM} (BD Biosciences (Clontech)) expresa las proteínas recombinantes en grandes cantidades en células huésped de insectos. Se insertó el gen diana en un vector de transferencia, que se transfectó simultáneamente en células huésped de insectos con el ADN vírico de BacPAK6 linealizado. El ADN de BacPAK6 carece de una porción esencial del genoma de baculovirus. Cuando el ADN se recombina con el vector, se restaura el elemento esencial y el gen diana se transfiere al genoma de baculovirus. Tras la recombinación, se repican y purifican unas pocas placas víricas, y se verifica el fenotipo recombinante. A continuación se pueden amplificar los virus recombinantes aislados recientemente y usarse para infectar cultivos de células de insectos para producir grandes cantidades de la proteína deseada.

Se pueden producir también las proteínas de fusión de la Tf usando plantas y animales transgénicos. Por ejemplo, ovejas y cabras pueden fabricar la proteína terapéutica en su leche. O las plantas de tabaco pueden incluir la proteína en sus hojas. La producción de proteínas en plantas y animales transgénicos comprende añadir un nuevo gen que codifica la proteína de fusión en el genoma del organismo. No sólo puede el organismo transgénico producir una nueva proteína, sino que también puede pasar esta capacidad en su progenie.

Secuencias señal secretoras

Los términos "secuencia señal secretora" o "secuencia señal" o "secuencia líder de secreción" se usan de manera intercambiable y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 6.291.212 y la Patente de los estados Unidos 5.547.871. las secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líder de secreción codifican péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína madura procedente de una célula. Los péptidos secretores se caracterizan generalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran normalmente (pero no exclusivamente) en los términos amino de las proteínas recientemente sintetizadas. Muy a menudo los péptidos secretores se escinden de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener emplazamientos de procesamiento que permiten romper el péptido señal a partir de la proteína madura a medida que ésta pasa a través de la ruta secretora. Los emplazamientos de procesamiento pueden estar codificados en el interior del péptido señal o se pueden añadir al péptido señal, mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro.

Se pueden usar los péptidos secretores para dirigir la secreción de las proteínas de fusión de la Tf modificada. Uno de dichos péptidos secretores que se puede usar en combinación con otros péptidos secretores es la secuencia líder del factor de apareamiento alfa. Se requieren secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líder de secreción en una serie compleja de etapas de procesamiento post-traduccionales que dan como resultado la secreción de una proteína. Si está presente una secuencia señal intacta, la proteína que se está expresando entra en la luz del retículo endoplásmico rugoso y a continuación se trasporta a través del aparato de Golgi hasta las vesículas secretoras y finalmente se trasporta fuera de la célula. Generalmente, la secuencia señal sigue inmediatamente al codón de inicio y codifica un péptido señal en el extremo amino terminal de la proteína que se va a secretar. En la mayor parte de los casos, la secuencia señal se rompe mediante una proteasa específica, denominada una peptidasa señal. Las secuencias señal preferidas mejoran el procesamiento y exportan la eficacia de la expresión de la proteína recombinante mediante vectores de expresión víricos, de mamíferos o de levaduras. En algunos casos, se puede usar la secuencia señal de la Tf natural para expresar y segregar las proteínas de fusión.

Enlazantes

El resto Tf y el(los) resto(s) de la proteína terapéutica se pueden fusionar directamente o usando un péptido enlazante de diversas longitudes par proporcionar mayor separación física y permitir más movilidad espacial entre las proteínas fusionadas y de esta manera, maximizar la accesibilidad de la porción de proteína terapéutica, por ejemplo, para la unión de su receptor análogo. El péptido enlazante puede estar constituido por aminoácidos que sean flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un enlazante tal como pero sin limitarse a un tramo de poliglicina. El enlazante puede ser menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20, ó 10 restos de aminoácidos. El enlazante se puede unir covalentemente a y entre la proteína transferrina o su porción y la proteína terapéutica.

Detección de las proteínas de fusión de la Tf

Los ensayos para la detección de proteínas de fusión terapéuticas de la transferrina modificada biológicamente activas pueden incluir la transferencia Western, la transferencia de proteínas o el filtro de colonias así como ensayos basados en la actividad que detectan la proteína terapéutica fusionada. Se puede preparar un filtro de transferencia Western usando el procedimiento descrito por Towbin y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). De manera breve, las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Las proteínas en el gel se transfirieron electroforéticamente a papel de nitrocelulosa. Se pueden preparar filtros de transferencia de proteínas filtrando las muestras o concentrados de sobrenadante a través de filtros de nitrocelulosa usando, por ejemplo, un Minifold (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.). Se pueden preparar filtros de colonias haciendo crecer las colonias sobre un filtro de nitrocelulosa que se ha extendido a través de un medio de crecimiento apropiado. En este procedimiento, se prefiere un medio sólido: Se dejan crecer las células sobre los filtros durante al menos 12 horas. Las células se retiran de los filtros lavándolos con un tampón apropiado que no elimina las proteínas unidas a los filtros. Un tampón preferido comprende Tris-base 25 mM, glicina 19 mM, pH 8,3, metanol al 20%.

Se pueden detectar también las proteínas de fusión evaluando la actividad del resto de proteína terapéutica. Dichos ensayos están fácilmente disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a, los ensayos descritos en la Tabla 1 de la Publicación Internacional PCT Nº WO 03/020746. Específicamente, se pueden evaluar las proteínas de fusión para la actividad funcional (por ejemplo, la actividad biológica o la actividad terapéutica) usando el ensayo que e referencia en la columna "Ensayo de Actividad a modo de Ejemplo" de la Tabla 1. Adicionalmente, una persona experta en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los fragmentos de una proteína terapéutica que corresponde a una porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión, usando para la actividad los ensayos que se referencian en su correspondiente fila de la Tabla 1. Adicionalmente, una persona experta en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los fragmentos de una proteína de la transferrina modificada par la actividad usando los ensayos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, en una realización en la que se está evaluando la capacidad de una proteína de fusión de la transferrina de unirse o competir con una proteína terapéutica para la unión a un anticuerpo del polipéptido antiterapéutico y/o el anticuerpo de la antitransferrina, se pueden usar diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como los radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunosorbente unido a enzima), inmunoensayos de tipo sándwich, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación mediante difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcas de enzimas o radioisótopos, por ejemplo), transferencias western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detectó la unión con el anticuerpo detectando una marca en el anticuerpo primario. En otra realización, se detectó el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo o reactivo secundario con el anticuerpo primario. En una realización adicional, se marcó el anticuerpo secundario. Se sabe de muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo.

En una realización adicional, en la que se identificó un compañero de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando), se puede evaluar la unión a este compañero de unión mediante una proteína de fusión de la transferrina que contiene la proteína terapéutica como la porción de la proteína terapéutica de la fusión, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductor y no reductor, cromatografía de afinidad de proteínas, y transferencia por afinidad. El técnico experto conocerá otros procedimientos.

Aislamiento y purificación de las proteínas de fusión de la transferrina modificada

Se pueden aislar las proteínas de fusión de la transferrina modificada segregadas biológicamente activas a partir del medio de crecimiento de las células huésped en condiciones que permitan la secreción de las proteínas de fusión biológicamente activas. El material celular se retira del medio de cultivo, y las proteínas de fusión biológicamente activas se aíslan usando las técnicas de aislamiento conocidas en la técnica. Las técnicas de aislamiento adecuadas incluyen la precipitación y el fraccionamiento mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, que incluyen la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de afinidad.

Un procedimiento de purificación particularmente preferido es la cromatografía de afinidad en una columna enlazante de hierro o quelante de metales o una cromatografía de inmunoafinidad usando un anticuerpo dirigido contra la transferrina o proteína terapéutica o la porción del péptido del polipéptido de fusión. El anticuerpo se inmoviliza o se une preferiblemente a un soporte o sustrato sólido. Un sustrato particularmente preferido es Sepharose activada por CNBr (Pharmacia LKB Technologies, Inc., Piscataway, N.J.). mediante este procedimiento, el medio se combina con el anticuerpo/sustrato en condiciones que permitan que se produzca la unión. Se puede lavar el complejo para eliminar el material no unido, y la proteína de fusión de la transferrina se libera o eluye mediante el uso de condiciones desfavorables para la formación del complejo. Los procedimientos de elución particularmente útiles incluyen cambios en el pH, en el que el anticuerpo inmovilizado tiene una elevada afinidad por el ligando a un primer pH y una afinidad reducida a un segundo pH (mayor o menor); cambios en la concentración de algunos agentes caótropos; o mediante el uso de detergentes.

Proteínas de fusión de la transferrina modificada marcadas

Las proteínas de fusión de la transferrina también se pueden marcar con un radioisótopo u otro agente de formación de imagen y usarse con objetivos diagnósticos in vivo. Los agentes radioisótopos para formación de imágenes preferidos incluyen yodo-125 y tecnecio-99, siendo particularmente preferido tecnecio-99. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para producir conjugados de proteína-isótopo, y se describen en, por ejemplo, Eckelman y coll. (Patente de los Estados Unidos Nº 4.652.440), Parker y col. (documento WO 87/05030) y Wilber y col. (documento EP 203,764). Alternativamente, las proteínas de fusión de la transferrina se pueden unir a potenciadores de marca de espin y usarse para formación de imagen mediante resonancia magnética (RM). Los potenciadores de marca de espin adecuados incluyen, compuestos de radicales libres, estables, estéticamente impedidos, tales como nitróxidos. Los procedimientos para marcar ligandos para la formación de imágenes mediante RM se dan a conocer, por ejemplo, en Coffman y col. (Patente de los Estados Unidos Nº 4.656.026). Para la administración, las proteínas de fusión de la transferrina marcada se combinan con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina estéril o agua estéril. La administración es preferiblemente mediante inyección de bolo, preferiblemente por vía intravenosa.

Producción de proteínas de fusión

La presente solicitud describe además los procedimientos para producir una proteína de fusión modificada usando las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, la producción de una forma recombinante de una proteína implica normalmente las siguientes etapas.

Se obtiene en primer lugar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la transferrina de la invención. A continuación la molécula de ácido nucleico se coloca preferiblemente de manera operable con las secuencias de control adecuadas, según se ha descrito anteriormente, para formar una unidad de expresión que contenga el marco de lectura abierto de la proteína, las unidades de expresión se usan para transformar un huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva en condiciones que permitan la producción de la proteína recombinante. La proteína recombinante se aísla opcionalmente a partir del medio o a partir de las células; puede no ser necesaria la recuperación y la purificación de la proteína en algunos casos en los que se pueden tolerar algunas impurezas.

Se puede llevar a cabo cada una de las anteriores etapas en una variedad de maneras. Por ejemplo, la construcción de vectores de expresión que son operables en una variedad de huéspedes se lleva a cabo usando replicones y secuencias de control apropiados, como se muestra anteriormente. Las secuencias de control, los vectores de expresión, y los procedimientos de transformación son dependientes del tipo de células huésped usada para expresar el gen y se han discutido en detalle anteriormente y las personas expertas en la técnica los conocen. Los emplazamientos de restricción adecuados pueden, si no están normalmente disponibles, añadirse a los extremos de la secuencia de codificación de tal manera que proporcionen un gen escindible para insertar en estos vectores. Un técnico experto puede adaptar fácilmente cualquier sistema de huésped/expresión conocido en la técnica para uso con las moléculas de ácido nucleico de la invención para producir una proteína recombinante deseada.

Según se ha discutido anteriormente, se puede usar cualquier sistema de expresión, incluyendo sistemas de levaduras, bacterias, animales, plantas eucariotas y procariotas. En algunas realizaciones, se prefieren los sistemas de levaduras, cultivo de células de mamíferos, y producción de animales o plantas transgénicos. En otras realizaciones, se puede usar sistemas de levaduras que se han modificado para reducir la glicosilación, la hiperglicosilación o la actividad proteolítica de las levaduras naturales.

Moléculas terapéuticas

Se puede usar cualquier molécula terapéutica como compañero de fusión de Tf según los procedimientos y las composiciones de la presente invención. Según se usa en el presente documento, una molécula terapéutica es normalmente una proteína o péptido capaz de ejercer un efecto biológico beneficioso in vitro o in vivo e incluye las proteínas o los péptidos que ejercen un efecto beneficioso en relación con la homeostasis, la fisiología o un estado de enfermedad normal. Las moléculas terapéuticas no incluyen los compañeros de fusión comúnmente usados como marcadores o auxiliares de la purificación de proteínas, tales como las galactosidasas bacterianas (véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5, 986, 067 y Aldred y col. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122: 960-965). Por ejemplo, un efecto beneficioso que se relaciona con un estado de enfermedad incluye cualquier efecto que sea ventajoso para el sujeto tratado, incluyendo la prevención de la enfermedad, la estabilización de la enfermedad, la disminución o el alivio de los síntomas de la enfermedad o una modulación, alivio o cura del defecto subyacente que produce un efecto beneficioso en el sujeto tratado.

Una proteína de fusión de la transferrina modificada incluye al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de la transferrina sérica modificada, que se asocian entre sí, preferiblemente mediante fusión genética.

En una realización, la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina modificada unida a un agente neurofarmacéutico. En otra realización, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el término carboxilolo unida a un agente neurofarmacéutico en el término amino. En una realización alternativa, la proteína de fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el término amino unida a un agente neurofarmacéutico en el término carboxilo. En realizaciones específicas el agente neurofarmacéutico es tanto el factor de crecimiento nervioso como el factor neutrófico ciliar.

En realizaciones adicionales, una proteína de fusión de la transferrina modificada puede contener al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. En una realización adicional, las proteínas de fusión de la transferrina pueden contener fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de proteínas o anticuerpos en los que la variante o fragmento retiene al menos una actividad biológica o terapéutica. Las proteínas de fusión de la transferrina pueden contener proteínas terapéuticas que pueden ser fragmentos de péptido o variantes de péptidos de al menos aproximadamente 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, o al menos aproximadamente 70 o más aminoácidos de longitud fusionados a los términos N y/o C, insertados en el interior, o insertados en un bucle de una transferrina modificada.

En otra realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que pueden ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como los polipéptidos que tienen uno o más restos borrados del término amino de la secuencia de aminoácidos.

En otra realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos borrados del término carboxilo de la secuencia de aminoácidos.

En otra realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos borrados de los términos amino y carboxilo.

En otra realización, las moléculas de fusión de la transferrina modificada contienen una porción de proteína terapéutica que es al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la proteína terapéutica de referencia que se muestra en el presente documento, o sus fragmentos. En realizaciones adicionales, las moléculas de fusión de la transferrina contienen una porción de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a los polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos de las delecciones N y C terminales según se describe anteriormente.

En otra realización, las moléculas de la transferrina modificada contienen la porción de la proteína terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos nativa o natural de una proteína terapéutica. Se proporcionan también fragmentos de estos polipéptidos.

Las proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina modificada, tal como proteínas superficiales celulares y secretoras, s pueden modificar mediante la unión de uno o más grupos de oligosacáridos. La modificación denominada como glicosilación puede afectar significativamente las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción, y localización de la proteína. La glicosilación se produce en localizaciones específicas a lo largo del esqueleto del polipéptido. Existen normalmente dos tipos principales de glicosilación: la glicosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N, que se unes a restos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser/Thr, en la que X puede ser un aminoácido excepto prolina. Variables tales como la estructura de la proteína y el tipo celular influencian el número y la naturaleza de las unidades de carbohidrato en el interior de las cadenas en diferentes emplazamientos de glicosilación. Son comunes también las glicosilaciones de los isómeros en el mismo emplazamiento en el interior de un tipo de célula dado, Por ejemplo, se glicosilan diversos tipos de interferón humano.

Se pueden modificar las proteínas terapéuticas que corresponden a un porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención, así como sus análogos y variantes, de tal manera que se altere la glicosilación en uno o más sitios como resultado de la(s) manipulación(es) de su secuencia de ácido nucleico por la célula huésped en la que se expresan, o debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, se puede producir la glicosilación de los isómeros eliminando o introduciendo los emplazamientos de glicosilación, por ejemplo, mediante sustitución o delección de restos de aminoácidos, tales como la sustitución de glutamina por asparagina, o se pueden producir proteínas recombinantes no glicosiladas expresando las proteínas en células huésped que no las glicosilarán, por ejemplo, en levaduras deficientes en glicosilación. Se conocen en la técnica estas soluciones.

Se conocen bien en la técnica las proteínas terapéuticas y su ácido nucleico y están disponibles en bases de datos públicas tales como las Chemical Abstracts Services Databases (por ejemplo, el Registro CAS), GenBank, y GenSeq.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión de la transferrina son capaces de una actividad terapéutica y/o actividad biológica, que corresponde a la actividad terapéutica y/o la actividad biológica de la proteína relacionada en la correspondiente fila de la Tabla 1 de la Publicación Internacional PCT Nº WO 03/020746, y en otra parte en esta solicitud (Véanse, por ejemplo, las columnas de la Tabla 1 "Actividad Biológica" y "proteína Terapéutica X"). En realizaciones adicionales, las porciones de proteína terapéuticamente activa de las proteínas de fusión de la transferrina son fragmentos o variantes de las secuencias de referencia citadas en el presente documento.

Incluso si la delección de uno o más aminoácidos del término N de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la porción de proteína terapéutica, se pueden retener adicionalmente otras actividades terapéuticas y/o actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizar, capacidad de unirse a un ligando). Por ejemplo, la capacidad de los polipéptidos con delecciones N terminales de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completa o madura de los polipéptidos se retendrán generalmente con menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo eliminado del término N. Si un polipéptido concreto carece de los restos N terminales de un polipéptido completo, retiene dichas actividades inmunológicas que se puede evaluar mediante los procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es improbable que un mutante con un gran número de restos de aminoácido N terminales borrados pueda retener alguna actividad biológica o inmunógena. De hecho, péptidos compuestos por tan poco como seis restos de aminoácidos pueden evocar a menudo una respuesta inmune.

Igual como se ha mencionado anteriormente, incluso si la delección de uno o más aminoácidos da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, se pueden retener adicionalmente otras actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizar, capacidad de unirse a un ligando) y/o actividades terapéuticas. Por ejemplo, se retendrá generalmente la capacidad de los polipéptidos con delecciones C-terminales de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconoces las formas completa o madura del polipéptido, cuando menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo o maduro se eliminan del término C. Si un polipéptido concreto carece de los restos N terminal y/o se pueden determinar fácilmente los restos C terminales de un polipéptido de referencia que retienen la actividad terapéutica, mediante los procedimientos rutinarios que se describen en el presente documento y/o de otra manera conocida en la técnica.

Los fragmentos de péptidos de las proteínas terapéuticas pueden ser fragmentos que comprendan, o alternativamente, estén constituidos por, una secuencia de aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/ una actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica) de la secuencia de polipéptidos de la proteína terapéutica de la cual la secuencia de aminoácidos es un fragmento.

Los fragmentos de péptidos de la proteína terapéutica pueden comprender sólo los términos N y C de la proteína, es decir, la porción central de la proteína terapéutica que se ha borrado. Alternativamente, los fragmentos de péptidos pueden comprender porciones no adyacentes y/o adyacentes de la parte central de la proteína terapéutica.

Otros fragmentos de polipéptido son fragmentos biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos son los que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de una proteína terapéutica usada en la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una mejora de la actividad deseada, o una disminución de la actividad indeseada.

\newpage

Generalmente, las variantes de las proteínas son globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica que corresponde a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes están también abarcados por la invención.

Los polipéptidos terapéuticos adicionales que se pueden usar en la invención son polipéptidos codificados por polinucleótidos que se hibridan con el complemento de un molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica en condiciones de hibridación restrictivas que las personas expertas en la técnica conocen (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y col., eds., 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., nueva. York).. los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están también abarcados por la invención.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a la secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia problema excepto en que la secuencia de polipéptidos sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos problema, se puede insertar, borrar, o sustituir por otros aminoácidos hasta un 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre las posiciones terminales, intercaladas tanto individualmente entre los restos en la secuencia de referencia, como en uno o más grupos contiguos en el interior de la secuencia de referencia.

En la práctica, se puede determinar convencionalmente si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de la transferrina o la porción de transferrina de proteína de fusión de la transferrina (tal como una porción de la proteína terapéutica de la proteína de fusión de la transferrina o la porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina) usando programas informáticos conocidos. Un procedimiento preferido para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, denominada también como alineación global de la secuencia, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brufiag y col. (Comp. App. Biosci 245 (1990)).

Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, las regiones no codificantes, o ambas. Se pueden usar las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o delecciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o las actividades del polipéptido codificado para producir proteínas de fusión de la Tf modificada. Se pueden utilizar variantes de nucleótidos producidas mediante sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Más aún, se pueden utilizar también variantes de polipéptidos en las que están sustituidos, borrados, o añadidos menos de aproximadamente 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, 0 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 0 1-2 aminoácidos. se pueden producir variantes de polinucleótidos por diferentes razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón de un huésped concreto (cambio de los codones en el ARNm humano por los preferidos por un huésped, tal como, una levadura o E. coli según se describe anteriormente).

En otras realizaciones, el resto de proteína terapéutica tiene sustituciones conservativas en comparación con la secuencia de tipo natural. Por "sustituciones conservativas" se entiende intercambios en el interior de grupos tales como la sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val; Leu e Ile; la sustitución de los restos hidroxilo de Ser y Thr; la sustitución de los restos ácidos de Asp y Glu; la sustitución de los restos amida de ASn y Gln, la sustitución de los restos básicos de Lys, Arg, e His; la sustitución de los restos aromáticos de Phe, Tyr, y Trp, y la sustitución de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. Se proporcionan las directrices con respecto a como realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas, por ejemplo, en Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990). Los polipéptidos de fusión pueden comprender, o alternativamente estar constituidos por, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica descrita en el presente documento y/o la proteína transferrina sérica, y/o la transferrina modificada, en la que los fragmentos o variantes tienen 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 o 50-150 adiciones, sustituciones, y/o delecciones de restos de aminoácidos cuando se las compara con la secuencia de aminoácidos de referencia. En las realizaciones adicionales, las sustituciones de aminoácidos son conservativas. Se describen también en el presente documento los ácido nucleicos que codifican estos polipéptidos.

Las proteínas de fusión modificadas pueden estar compuestas por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes. Se pueden modificar los polipéptidos tanto por procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional, como por técnicas de modificación químicas que se conocen bien en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa bibliografía de investigación.

Se pueden producir modificaciones en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las cadenas secundarias de aminoácidos y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en grados variables en diverso momentos en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, como resultado, por ejemplo, de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden ser el resultados de procesos naturales después de la traducción o se pueden preparar mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulado covalente, formación de cisteína, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación (Véanse, por ejemplo PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2^{a} Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y Colaboradores, Nueva York(1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter y col. (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-646; Rattan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62.

Las moléculas terapéuticas que se pueden fusionar a o insertarse en Tf incluyen, pero no se limitan a, hormonas, proteínas de la matriz, inmunosupresores, broncodilatadores, agentes cardiovasculares, enzimas, agentes del SNC, neurotransmisores, proteínas o péptidos del receptor, hormonas del crecimiento, factores de crecimiento, péptidos antivíricos, péptidos inhibidores fusogénicos, citocinas, linfocinas, monocinas, interleucinas, factores estimulantes de las colonias, factores de diferenciación, factores angiogénicos, ligandos del receptor, proteínas asociadas a cáncer, antineoplásicos, péptidos víricos, péptidos antibióticos, proteínas de la sangre, proteínas antagonistas, factores de transcripción, factores antiangiogénicos, proteínas o péptidos antagonistas, antagonistas del receptor, anticuerpos, anticuerpos de cadena única y moléculas de adhesión celular. Se pueden combinar diferentes moléculas terapéuticas en una proteína de fusión única para producir una molécula terapéutica bi o multifuncional. Se pueden usar también diferentes mo-
léculas en combinación para producir una proteína de fusión con una entidad terapéutica y una entidad directora.

Las citocinas son proteínas solubles liberadas por las células del sistema inmune, que actúan no enzimáticamente a través de receptores específicos para regular las respuestas inmunes. Las citocinas semejan hormonas en las que actúan a bajas concentraciones de unión con elevada afinidad hacia un receptor específico. El término "citocina" se usa en el presente documento para describir proteínas recombinantes o que se producen naturalmente, sus análogos, y sus fragmentos, que estimulan una respuesta biológica específica en una célula que tiene un receptor para esta citocina. Las citocinas incluyen preferiblemente interleucinas tales como interleucina-2 (IL-2) (Nº de Acceso al GenBank S77834), IL-3 (Nº de Acceso al GenBank M14743), IL-4 (Nº de Acceso al GenBank M23442), IL-5 (Nº de Acceso al GenBank J03478), IL-6 (Nº de Acceso al GenBank M14584), IL-7 (Nº de Acceso al GenBank NM_000880), IL-10 (Nº de Acceso al GenBank NM_000572), IL-12 (Nº de Acceso al GenBank AF180562 y Nº de Acceso al GenBank AF180563), IL-13 (Nº de Acceso al GenBank U10307), IL-14 (Nº de Acceso al GenBank XM_170924), IL-15 (Nº de Acceso al GenBank X91233), IL-16 (Nº de Acceso al GenBank NM_004513), IL-17 (Nº de Acceso al GenBank NM_002190) e IL-18 (Nº de Acceso al GenBank NM_001562), factores hematopoyéticos tales como factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Nº de Acceso al GenBank X03021), factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) (Nº de Acceso al GenBank X03656), factor de activación de plaquetas (Nº de Acceso al GenBank NM_000437) y eritropoyetina (Nº de Acceso al GenBank X02158), factores de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF\alpha (Nº de Acceso al GenBank X02910), linfocinas tales como linfotoxina \alpha (Nº de Acceso al GenBank X02911), linfotoxina-\beta (Nº de Acceso al GenBank L11016), leucoregulina, factor inhibidor de la migración de macrófagos (Nº de Acceso al GenBank M25639), y neuroleucina (Nº de Acceso al GenBank K03515), reguladores de los procesos metabólicos tales como leptina (Nº de Acceso al GenBank U43415), interferones tales como interferón \alpha (IFN\alpha) (Nº de Acceso al GenBank M54886), IFN\beta (Nº de Acceso al GenBank V00534), IFN\gamma (Nº de Acceso al GenBank J00219), IFNo (Nº de Acceso al GenBank NM_002177), trombospondina 1 (THBS1) (Nº de Acceso al GenBank NM_003246), THBS2 (Nº de Acceso al GenBank L12350), THBS3 (Nº de Acceso al GenBank L38969), THBS4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003248), y quimiocinas. Preferiblemente, la proteína de fusión de la transferrina-citocina modificada de la presente invención muestra actividad biológica de la citocina.

El término "hormona" se usa en el presente documento para describir una cualquiera de las numerosas sustancias biológicamente activas que están producidas por algunas células o tejidos y que producen cambios o actividades biológicas específicas que se producen en otra célula o tejido localizados en cualquier parte del cuerpo. Las hormonas incluyen preferiblemente proinsulina (Nº de Acceso al GenBank V00565), insulina (Nº de Acceso al GenBank NM_000207), hormona 1 del crecimiento (Nº de Acceso al GenBank V00520), hormona 2 del crecimiento (Nº de Acceso al GenBank F006060), factor de liberación de la hormona del crecimiento (Nº de Acceso al GenBank NM_021081), factor I de crecimiento de tipo insulina (Nº de Acceso al GenBank M27544), factor II de crecimiento de tipo insulina (Nº de Acceso al GenBank NM_000612), proteína 1 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBP-1) (Nº de Acceso al GenBank M59316), IGFBP-2 (Nº de Acceso al GenBank X16302), IGFBP-3 (Nº de Acceso al GenBank NM_ 000598), IGFBP-4 (Nº de Acceso al GenBank Y12508), IGFBP-5 (Nº de Acceso al GenBank M65062), IGFBP-6 (Nº de Acceso al GenBank NM_002178), IGFBP-7 (Nº de Acceso al GenBank NM_001553), cadena \beta de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso al GenBank NM_ 033142), cadena \alpha de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso al GenBank NM_000735), hormona \beta luteneizante (Nº de Acceso al GenBank X00264), hormona \beta estimuladora del folículo (Nº de Acceso al GenBank NM_000510), hormona \beta estimuladora del tiroides (Nº de Acceso al GenBank NM_000549), prolactina (Nº de Acceso al GenBank NM_000948), pro-opiomelanocortina (Nº de Acceso al GenBank V01510), corticotropina (ACTH), \beta-lipotropina, hormona estimuladora de los \alpha-melanocitos (\alpha-MSH), \gamma-lipotropina, \beta-MSH, \beta-endorfina, y péptido del lóbulo intermedio de tipo corticotropina (CLIP).

El término "hormona" incluye también el Péptido 1 de tipo Glucagón (GLP-1) que es una hormona gastrointestinal que regula la secreción de insulina que pertenece al así denominado eje enteroinsular. La secuencia de aminoácidos de GLP-1(7-36) y GLP-1(7-37) es la (SEC DE ID Nº: 34)

\quad

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X

en la que X es NH_{2} para GLP-1(7-36) y X es Gly para GLP-1(7-37).

\vskip1.000000\baselineskip

El término "factor de crecimiento" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido que se une a un receptor para estimular la proliferación celular. Los factores de crecimiento preferibles incluyen factor \alpha de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-\alpha) (Nº de Acceso al GenBank X03795), PDGF-\beta (Nº de Acceso al GenBank X02811), hormonas, factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Nº de Acceso al GenBank NM_ 001963), factores de crecimiento de los fibroblastos tales como factor 1 de crecimiento de los fibroblastos (FGF1) (Nº de Acceso al GenBank NM_000800), FGF2 (Nº de Acceso al GenBank NM_002006), FGF3 (Nº de Acceso al GenBank NM_005247), FGF4 (Nº de Acceso al GenBank NM_002007), FGF5 (Nº de Acceso al GenBank M37825), FGF6 (Nº de Acceso al GenBank X57075), FGF7 (Nº de Acceso al GenBank NM_002009), FGF8 (Nº de Acceso al GenBank AH006649), FGF9 (Nº de Acceso al GenBank NM_002010), FGF10 (Nº de Acceso al GenBank AB002097), FGF11 (Nº de Acceso al GenBank NM_004112), FGF12 (Nº de Acceso al GenBank NM_021032), FGF13 (Nº de Acceso al GenBank NM_004114), FGF14 (Nº de Acceso al GenBank NM_004115), FGF16 (Nº de Acceso al GenBank AB009391), FGF17 (Nº de Acceso al GenBank NM_003867), FGF18 (Nº de Acceso al GenBank AF075292), FGF19 (Nº de Acceso al GenBank NM_005117), FGF20 (Nº de Acceso al GenBank NM_019851), FGF21 (Nº de Acceso al GenBank NM_019113), FGF22 (Nº de Acceso al GenBank NM_020637), y FGF23 (Nº de Acceso al GenBank NM_020638), angiogenina (Nº de Acceso al GenBank M11567), factor neurotrófico derivado de cerebro (Nº de Acceso al GenBank M61176), factor de crecimiento neurotrófico ciliar (Nº de Acceso al GenBank X60542), factor-\alpha de crecimiento transformante (TGF-\alpha) (Nº de Acceso al GenBank X70340), TGF\beta (Nº de Acceso al GenBank X02812), factor-\alpha de crecimiento nervioso (NGF-\alpha) (Nº de Acceso al GenBank NM_010915), NGF-\beta (Nº de Acceso al GenBank X52599), inhibidor de tejido de la metaloproteinasa 1 (TIMP1) (Nº de Acceso al GenBank NM_003254), TIMP2 (Nº de Acceso al GenBank NM_003255), TIMP3 (Nº de Acceso al GenBank U02571), TIMP4 (Nº de Acceso al GenBank U76456) y estimulador 1 de macrófagos (Nº de Acceso al GenBank L11924).

El término "proteína de la matriz" se usa en el presente documento para describir las proteínas o péptidos que se encuentran normalmente en la matriz extracelular. Estas proteínas pueden ser funcionalmente importantes para la resistencia, la filtración, o la adhesión. Las proteínas de la matriz incluyen preferiblemente colágenos tales como colágeno I (Nº de Acceso al GenBank Z74615), colágeno II (Nº de Acceso al GenBank X16711), colágeno III (Nº de Acceso al GenBank X14420), colágeno IV (Nº de Acceso al GenBank NM_001845), colágeno V (Nº de Acceso al GenBank NM_000393), colágeno VI (Nº de Acceso al GenBank NM_058175), colágeno VII (Nº de Acceso al GenBank L02870), colágeno VIII (Nº de Acceso al GenBank NM_001850), colágeno IX (Nº de Acceso al GenBank X54412), colágeno X (Nº de Acceso al GenBank X60382), colágeno XI (nº de Acceso al GenBank. J04177), and colágeno XII (Nº de Acceso al GenBank U73778), proteínas laminina tales como LAMA2 (Nº de Acceso al GenBank NM_000426), LAMA3 (Nº de Acceso al GenBank L34155), LAMA4 (Nº de Acceso al GenBank NM_002290), LAMB1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002291), LAMB3 (Nº de Acceso al GenBank L25541), LAMC1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002293), nidogen (Nº de Acceso al GenBank NM_002508), \alpha-tectorina (Nº de Acceso al GenBank NM_005422), \beta-tectorina (Nº de Acceso al GenBank NM_058222), y fibronectina (Nº de Acceso al GenBank X02761).

El término "proteínas de la sangre" se define tradicionalmente como aquellas que se originan en el plasma, producidas muchas ahora comúnmente por medios recombinantes, e incluyen, pero no se limitan a proteínas séricas naturales, derivados, fragmentos y mutantes o sus variantes, factores de coagulación de la sangre, derivados, mutantes, variantes y fragmentos (que incluyen los factores VII, VIII, IX, X), inhibidores de la proteasa (antitrombina, antitripsina alfa-1), activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, inmunoglobulinas, factor de von Willebrand y mutantes de von Willebrand, fibronectina, fibrinógeno, trombina y hemoglobina.

El término "enzima" se usa en el presente documentos para describir cualquier proteína o sustancia proteínica que cataliza una reacción específica sin que ella misma quede permanentemente alterada o destruida. Las enzimas incluyen preferiblemente factores de coagulación tales como F2 (Nº de Acceso al GenBank XM_170688), F7 (Nº de Acceso al GenBank XM_027508), F8 (Nº de Acceso al GenBank XM_013124), F9 (Nº de Acceso al GenBank NM_000133), F10 (Nº de Acceso al GenBank AF503510) y otros, metaloproteinasas de la matriz tales como la metaloproteinasa I de la matriz I (Nº de Acceso al GenBank MMP1) (Nº de Acceso al GenBank NM_002421), MMP2 (Nº de Acceso al GenBank NM_004530), MMP3 (Nº de Acceso al GenBank NM_002422), MMP7 (Nº de Acceso al GenBank NM_002423), MMP8 (Nº de Acceso al GenBank NM_002424), MMP9 (Nº de Acceso al GenBank NM_004994), MMP10 (Nº de Acceso al GenBank NM_002425), MMP12 (Nº de Acceso al GenBank NM_002426), MMP13 (Nº de Acceso al GenBank X75308), MMP20 (Nº de Acceso al GenBank NM_004771), adenosina desaminasa (Nº de Acceso al GenBank NM_000022), proteína activadas por mitógeno tales como MAPK3 (Nº de Acceso al GenBank XM_055766), MAP2K2 (Nº de Acceso al GenBank N_030662), MAP2K1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002755), MAP2K4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003010), MAP2K7 (AF013588), y MAPK12 (NM_002969), quinasas tales como JNKK1 (Nº de Acceso al GenBank U17743), JNKK2 (Nº de Acceso al GenBank AF014401), JAK1 (M64174), JAK2 (NM_004972), y JAK3 (NM_000215), y fosfatasas tales como PPM1A (Nº de Acceso al GenBank NM_021003) and PPM1D (Nº de Acceso al GenBank NM_003620).

El término "factores de transcripción" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido implicado en la transcripción de los genes que codifican la proteína. Los factores de transcripción pueden incluir Sp1, Sp2 (Nº de Acceso al GenBank NM_003110), Sp3 (Nº de Acceso al GenBank AY070137), Sp4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003112) NFYB (Nº de Acceso al GenBank NM_006166), Hap2 (Nº de Acceso al GenBank M59079), GATA-1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002049), GATA-2 (Nº de Acceso al GenBank NM_002050), GATA-3 (Nº de Acceso al GenBank X55122), GATA-4 (Nº de Acceso al GenBank L34357), GATA-5, GATA-6 (Nº de Acceso al GenBank NM_005257), FOG2 (NM_012082), Eryfl (Nº de Acceso al GenBank X17254), TRPS1 (Nº de Acceso al GenBank NM_014112), NF-E2 (Nº de Acceso al GenBank NM_006163), NF-E3, NF-E4, TFCP2 (Nº de Acceso al GenBank NM_005653), Oct-1 (Nº de Acceso al GenBank X13403), proteínas homeobox tales como HOXB2 (Nº de Acceso al GenBank NM_002145), HOX2H (Nº de Acceso al GenBank X16665), homólogo sin pelo (Nº de Acceso al GenBank NM_005144), proteínas madre frente a decapentaplégicas tales como MADH1 (Nº de Acceso al GenBank NM_005900), MADH2 (Nº de Acceso al GenBank NM_005901), MADH3 (Nº de Acceso al GenBank NM_005902), MADH4 (Nº de Acceso al GenBank NM_005359), MADH5 (Nº de Acceso al GenBank AF009678), MADH6 (Nº de Acceso al GenBank NM_005585), MADH7 (Nº de Acceso al GenBank NM_005904), MADH9 (Nº de Acceso al GenBank NM_005905), y transductor de la señal y activador de las proteínas de la transcripción tales como STAT1 (Nº de Acceso al GenBank XM_010893), STAT2 (Nº de Acceso al GenBank NM_005419), STAT3 (Nº de Acceso al GenBank AJ012463), STAT4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003151), STAT5 (Nº de Acceso al GenBank L41142), y STAT6 (Nº de Acceso al GenBank NM_003153).

En otra realización adicional de la invención, la molécula terapéutica es una proteína no humana o no de mamífero. Por ejemplo, gp120 de VIH, Tat de VIH, se prefieren las proteínas superficiales de otros virus tales como hepatitis, herpes, gripe, adenovirus y RSV, otros componentes de VIH, proteínas superficiales parasíticas tales como antígenos de la malaria, y proteínas superficiales bacterianas. Se pueden usar estas proteínas no humanas, por ejemplo, como antígenos, o debido a que tienen actividades útiles. Por ejemplo, la molécula terapéutica puede ser estreptoquinasa, estafiloquinasa, asparaginasa, u otras proteínas con actividades enzimáticas útiles.

En una realización alternativa, la molécula terapéutica es una proteína de unión a ligando con actividad biológica. Tales proteínas de unión a ligando pueden, por ejemplo, (1) bloquear las interacciones receptor-ligando en la superficie celular; o (2) neutralizar la actividad biológica de una molécula en la fase fluida de la sangre, evitando por tanto que ésta no alcance a su diana celular. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una molécula de transferrina modificada fusionada a una región de unión a ligando de un receptor seleccionado entre el grupo constituido por, pero sin limitarse a, el receptor de una lipoproteína de baja densidad (LDL), un receptor de LDL acetilado, un receptor del factor \alpha de necrosis tumoral, un receptor del factor \beta de crecimiento transformante, un receptor de la citocina, un receptor de la inmunoglobulina Fc, un receptor de hormona, un receptor de glucosa, un receptor de glicolípido, y un receptor de glicosaminoglicano. En otras realizaciones, las proteínas de unión a ligando incluyen CD2 (M14362), CD3G (NM_000073), CD3D (NM_000732), CD3E (NM_000733), CD3Z (J04132), CD28 (NM_006139), CD4 (Nº de Acceso al GenBank NM_000616), CD1A (Nº de Acceso al GenBank M28825), CD1B (Nº de Acceso al GenBank NM_001764), CD1C (Nº de Acceso al GenBank NM_001765), CD1D (Nº de Acceso al GenBank NM_001766), CD80 (Nº de Acceso al GenBank NM_005191), GNB3 (Nº de Acceso al GenBank AF501884), CTLA-4 (Nº de Acceso al GenBank NM_005214), moléculas de adhesión intercelular tales como ICAM-1 (NM_ 000201), ICAM-2 (NM_000873), e ICAM-3 (NM_002162), receptores del factor de necrosis tumoral tales como TNFRSF1A (Nº de Acceso al GenBank X55313), TNFR1SFB (Nº de Acceso al GenBank NM_001066), TNFRSF9 (Nº de Acceso al GenBank NM_001561), TNFRSF10B (Nº de Acceso al GenBank NM_003842), TNFRSF11B (Nº de Acceso al GenBank NM_002546), and TNFRSF13B (Nº de Acceso al GenBank NM_006573), y receptores de interleucina tales como IL2RA (Nº de Acceso al GenBank NM_000417), IL2RG (Nº de Acceso al GenBank NM_000206), IL4R (Nº de Acceso al GenBank AF421855), IL7R (GenBank. Acc. No. NM_002185), IL9R (Nº de Acceso al GenBank XM_015989), e IL13R (Nº de Acceso al GenBank X95302). La proteína de fusión de unión al ligando de la Tf de la presente invención muestra la actividad biológica de la proteína de unión al ligando.

El término "proteínas asociadas a cáncer" se usa en el presente documento para describir proteínas o polipéptidos cuya expresión está asociada con cáncer o el mantenimiento de crecimiento celular controlado, tal como las proteínas codificadas por genes supresores del tumor u oncogenes. Las proteínas asociadas a cáncer puede incluir p16 (Nº de Acceso al GenBank AH005371), p53 (Nº de Acceso al GenBank NM_000546), p63 (Nº de Acceso al GenBank NM_003722), p73 (Nº de Acceso al GenBank NM_005427), BRCA1 (Nº de Acceso al GenBank U14680), BRCA2 (Nº de Acceso al GenBank NM_000059), proteína interactuante CTBP (Nº de Acceso al GenBank U72066), DMBT1 (Nº de Acceso al GenBank NM_004406), HRAS (Nº de Acceso al GenBank NM_005343), NCYM (Nº de Acceso al GenBank NM_006316), FGR (Nº de Acceso al GenBank NM_005248), myb (Nº de Acceso al GenBank AF104863), rafl (Nº de Acceso al GenBank NM_002880), erbB2 (Nº de Acceso al GenBank NM_004448), VAV (Nº de Acceso al GenBank X16316), c-fos (V Nº de Acceso al GenBank 01512), c-fes (Nº de Acceso al GenBank X52192), c-jun (Nº de Acceso al GenBank NM_002228), MAS1 (Nº de Acceso al GenBank M13150), pim-1 (Nº de Acceso al GenBank M16750), TIF1 (Nº de Acceso al GenBank NM_003852), c-fms (Nº de Acceso al GenBank X03663), EGFR (Nº de Acceso al GenBank NM_005228), erbA (Nº de Acceso al GenBank X04707), tirosina quinasa c-src (Nº de Acceso al GenBank XM_044659), c-abl (Nº de Acceso al GenBank M14752), N-ras (Nº de Acceso al GenBank X02751), K-ras (Nº de Acceso al GenBank M54968), jun-B (Nº de Acceso al GenBank M29039), c-myc (Nº de Acceso al GenBank AH001511), RB1 (Nº de Acceso al GenBank M28419), DCC (Nº de Acceso al GenBank X76132), APC (Nº de Acceso al GenBank NM_000038), NF1 (Nº de Acceso al GenBank M89914), NF2 (Nº de Acceso al GenBank Y18000), and bcl-2 (Nº de Acceso al GenBank M13994).

"Péptidos inhibidores fusogénicos" se usa en el presente documento par describir los péptidos que muestran actividad antivírica, competencia de función antimembrana, y/o una capacidad para modular los procesos intracelulares, por ejemplo, aquellos que implican estructuras superenrolladas de péptidos. La actividad antivírica incluye, pero no se limita a, la inhibición de VIH-1, VIH-2, VSR, SIV, VEB, virus del sarampión, virus de la gripe, o la transmisión del CMV a células no infectadas. Adicionalmente, la capacidad antifusogénica, la actividad antivírica o la actividad moduladora intracelular de los péptidos requiere meramente la presencia de los péptidos y no requiere específicamente la estimulación de una respuesta inmune del huésped dirigida contra dichos péptidos. Antifusogénico se refiere a la capacidad del péptido para inhibir o reducir el nivel de los episodios de fusión de la membrana entre dos o más restos en relación con el nivel de fusión de la membrana que se produce entre dichos restos en ausencia del péptido. Los restos pueden ser, por ejemplo, membranas celulares o estructuras víricas, tales como envolturas o pili víricos. El término "péptido antivírico", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del péptido para inhibir la infección vírica de células o alguna actividad vírica requerida para una infección vírica productiva y/o la patogénesis vírica mediante, por ejemplo, fusión célula-célula o infección de virus libre. Dicha infección puede implicar la fusión de la membrana, como se produce en el caso de los virus con envoltura, o algún otro episodio de fusión que implique una estructura vírica y una estructura celular. Los péptidos inhibidores fusogénicos y los péptidos antivíricos tienen a menudo secuencias de aminoácidos que se derivan de más de una proteína vírica (por ejemplo, un polipéptido derivado de VIH-1, VIH-2, VSR, y SIV).

Se pueden encontrar ejemplos de péptidos inhibidores fusogénicos y péptidos antivíricos en los documentos WO 94/2820, WO 96/19495, WO 96/40191, WO 01/64013 y en las patentes de los Estados Unidos 6.333.395, 6.258.782, 6.228.983, 6.133.418, 6.093.794, 6.068.973, 6.060.065, 6.054.265, 6.020.459, 6.017.536, 6.013.263, 5.464.933,
5.346.989, 5.603.933, 5.656.480, 5.759.517, 6.245.737; 6.326.004, y 6.348.568; todas las cuales se incorporan por referencia en el presente documento. En una realización preferida, los péptidos antifusogénicos se seleccionan entre el grupo constituido por T-20 de VIH (FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY, SEC DE ID NO: 4), T-1249 de VIH, T786 de VSR (VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV, SEC DE ID Nº: 5), T1584 de VSR AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL, SEC DE ID Nº: 6) y T112 de VSR (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEC DE ID Nº: 7).

Los ejemplos de otros tipos de péptidos, incluyen fragmentos de proteínas terapéuticas como se describe en el presente documento, en particular, los fragmentos de proteínas humanas que retienen al menos una actividad de la molécula parental. Los péptidos que se pueden usar para producir las proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención, incluye también péptidos miméticos y péptidos que presentan una actividad biológica de una proteína terapéutica pero difieren en la secuencia o en la estructura tridimensional de una proteína terapéutica de longitud completa. Como un ejemplo no limitado, los péptidos incluyen los péptidos miméticos de eritropoyetina que se dan a conocer en Johnson y col. (2000) Nephrol. Dial. Transplant 15(9): 1274-7, Kuai y col. (2000) J. Pept. Res. 56(2): 59-62, Barbone y col. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14 Supp 2: 80-4, Middleton y col. (1999) J. Biol. Chem. 274 (20): 14163-9, Johnson y col. (1998) Biochemistry 37 (11): 3699-710, Johnson y col. (1997) Chem. Biol. 12: 939-50, Wrighton y col. (1997) Nat. Biotechnol. 15 (12): 1261-5, Livnah y col. (1996) Science 273: 464-71, y Wrighton y col., (1996) Science 273: 458-64.

Las moléculas terapéuticas incluyen también proteínas alérgenas y sus fragmentos digeridos. Éstas incluyen alérgenos del polen de ambrosía, centeno, koeleria, dáctilo, cerrillo, agróstide blanca, festuca roja, lengua de vaca, trigo, maíz, artemisa, pasto azul, poa anual de California, bledo, grada americana, caramillo, cedro de montaña, encina, arce negundo, sicómoro, arce, olmo, etc., ácaros del polvo, veneno de abeja, alérgenos alimentarios, ácaros del pelo de los animales, y otros venenos de insectos.

Otras moléculas terapéuticas incluyen vacunas microbianas, bacterianas y protozoarias y sus diversos componentes tales como los antígenos superficiales. Estos incluyen vacunas que contienen glicoproteínas, proteínas o péptidos derivados de estas proteínas. Dichas vacunas se preparan a partir de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus neumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Vibrio cholera, Campylobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella neumophila, Tieponema pallidum, clamidia, toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, virus de la gripe, adenovirus, paramixovirus (paperas, sarampión), virus de la rubeola, virus de la polio, virus de la hepatitis, virus del herpes, virus de la rabia, VIH-1, VIH-2, VSR, y virus del papiloma.

Las moléculas de fusión preferidas pueden contener péptidos víricos anti-VIH, péptidos anti-VSR, hormona del crecimiento humana, interferones \alpha y/o \beta, eritropoyetina (EPO), péptidos de tipo EPO, factor de estimulación de las colonias de granulocitos (GCSF), factor de estimulación de las colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF), insulina, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), trombopoyetina, péptidos que corresponden a la CDR de un anticuerpo, Proteína Asociada a la Neogénesis de los Islotes (INGAP), calcitonina, angiostatina, endostatina, interleucina-2, factor de liberación de la hormona del crecimiento, hormona paratiroidea humana, péptidos del factor de necrosis antitumoral (TNF), receptor de la interleucina-1 (IL-1) y/o anticuerpos de cadena única.

Se pueden preparar también las proteínas de fusión usadas en las bibliotecas de la invención que incluyen los péptidos o polipéptidos derivados de las bibliotecas de péptidos para rastrear moléculas con funciones nuevas o novedosas: Dichas bibliotecas de péptidos pueden incluir los disponibles comercialmente o públicamente, por ejemplo, American Peptide Co. Inc., Cell Sciences Inc., Invitrogen Corporation, Phoenix Pharmaceuticals Inc., United States Biological, así como los producidos mediante las tecnologías disponibles, por ejemplo, bibliotecas de presentación de bacteriófagos y bacterias preparadas usando los procedimientos estandarizados.

En otras realizaciones adicionales de la invención, se pueden preparar proteínas de fusión de la Tf usando restos de proteínas terapéuticas conocidos en la técnica y ejemplificados mediante los péptidos y proteínas actualmente aprobados por la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos (Food and Drug Administration) (www.fda.gov/cber/
efoi/approve.htm) así como las Publicaciones de Patente PCT N^{os}. WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480.

La Tabla 1 de la Publicación Internacional PCT Nº WO 03/02746 proporciona una lista no exhaustiva de las proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la transferrina modificada de la invención. La columna "Proteína Terapéutica X" da a conocer las moléculas de proteínas terapéuticas seguidas por paréntesis que contienen los nombres científicos y comerciales que comprenden o están constituidos alternativamente por esta molécula de proteína terapéutica o uno de sus fragmentos o variantes. "Proteína Terapéutica X" como se usa en el presente documento puede referirse tanto a una molécula de proteína terapéutica individual (como se define mediante la secuencia de aminoácidos obtenible de los números de acceso del CAS y el GenBank), o al grupo completo de proteínas terapéuticas asociadas con una molécula de proteína terapéutica dada que se da a conocer en esta columna. La columna del "Identificador a modo de Ejemplo" proporciona los números del registro del Chemical Abstracts Services (CAS) (publicados por la American Chemical Society) y/o los Números de Acceso al Genbank (por ejemplo, ID del Locus, NP-XXXXX (Secuencia de Referencia de la Proteína), y los identificadores XP-XXXXX (Proteína Modelo) disponibles de la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), que corresponde a las entradas en el Registro CAS o la base de datos del Genbank que contienen una secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína o un fragmento o variante de la molécula de la proteína terapéutica. Adicionalmente, se proporcionan los números de Acceso del GenSeq y el índice de citas bibliográficas de publicaciones para identificar la secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de algunos
polipéptidos.

Están disponibles las páginas resumen asociadas con cada uno de estos Números de Acceso a CAS y a Genbank y a GenSeq así como el índice de citas bibliográficas de publicaciones (por ejemplo, el número de ID de PubMed (PMID)). La columna PCT/Referencia de Patente proporciona los números de Patente de los Estados Unidos o los Números de las Publicaciones Internacionales PCT que corresponden a las patentes y/o las solicitudes de patente publicadas que describen la molécula de proteína terapéutica. La columna de Actividad Biológica describe las actividades biológicas asociadas con la molécula de proteína terapéutica. La columna de Ensayo de Actividad a modo de Ejemplo proporciona las referencias que describen los ensayos que se pueden usar para ensayar la actividad terapéutica y/o biológica de una proteína terapéutica o una proteína de fusión de la transferrina de la invención que comprende una porción X de la proteína terapéutica. Estas referencias se incorporan también por referencia en el presente documento en su totalidad, La columna "Indicación Preferida Y" describe las enfermedades, trastornos, y/o dolencias que se pueden tratar, evitar, diagnosticar, o mejorar mediante la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de la transferrina de la invención que comprende una porción de la proteína X terapéutica.

Administración de un fármaco o la proteína terapéutica en el interior de una célula y/o a través de la barrera hematoencefálica (BBB)

Se pueden usar las proteínas de fusión de la transferrina modificada como un vehículo para liberar una molécula o molécula pequeña terapéutica complejada con el ión férrico de la transferrina en el interior de una célula o a través de la barrera hematoencefálica u otras barreras que incluyen el paso a través de la membrana celular de cualquier tipo de célula que exprese un receptor de Tf de forma natural o mediante construcción por ingeniería genética. En estas realizaciones, la proteína de fusión de la Tf se construirá normalmente mediante ingeniería genética o se modificará para inhibir, evitar o eliminar la glicosilación para prolongar la semivida en suero de la proteína de fusión y/o la porción de la proteína terapéutica. Se contempla específicamente la adición de un péptido director o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única para dirigir adicionalmente la proteína de fusión de la Tf hacia un tipo de célula concreto, por ejemplo, una célula cancerosa.

En una realización, se introduce el complejo férrico-sorbitol-citrato, fármaco antianémico que contiene hierro en una proteína de fusión de la Tf modificada de la invención. El complejo férrico-sorbitol-citrato (FSC) ha demostrado inhibir la proliferación de células cancerosas de murino in vitro y produce la regresión del tumor in vivo, a la vez que no tiene ningún efecto sobre la proliferación de células no malignas (Poljak-Blazi y col. (Junio de 2000) Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals (Estados Unidos), 15/3: 285-293).

En otra realización, el fármaco antineoplásico Adriamycin® (Doxorubicina) y/o el fármaco quimioterapéutico bleomicina, ambos conocidos por formar complejos con el ión férrico, se introducen en una proteína de fusión de la Tf de la invención. En otras realizaciones, se puede preparar y complejar una sal de un fármaco, por ejemplo, un sal de citrato o carbonato, con el ión férrico que se une a continuación a la Tf. Como las células tumorales muestran a menudo una mayor velocidad de renovación del hierro; la transferrina modificada para transportar al menos un agente antitumoral, puede proporcionar un medio de aumentar la exposición al agente o de introducirlo en las células tumorales. (Demant, E.J, (1983) Eur. J. Biochem. 137/(1-2): 113-118; Padbury y col. (1985) J. Biol. Chem. 260/13: 7820-7823).

Formulaciones farmacéuticas y procedimientos de tratamiento

Se pueden administrar las proteínas de fusión modificadas a un paciente necesitado de las mismas usando protocolos de administración normalizados. Por ejemplo, se pueden proporcionar las proteínas de fusión de la Tf modificada solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Según se usa en el presente documento, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes se administran simultáneamente o se administran independientemente de una manera tal que los agentes actuarán al mismo o casi al mismo tiempo.

Se pueden administrar los agentes mediante rutas parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica y bucal. Por ejemplo, se puede administrar un agente localmente en un lugar de la lesión mediante microinfusión. Alternativa, o concurrentemente, la administración puede ser no invasiva mediante cualquier ruta oral, por inhalación, nasal, o pulmonar. La dosificación administrada será dependiente de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si acaso, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.

La presente solicitud describe también composiciones que contienen uno o más trans-cuerpos de la invención. Aunque las necesidades varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficazs de cada componente está comprendida dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica. Las dosificaciones usuales comprenden aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones preferidas para la administración sistémica comprenden aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones preferidas para la administración directa en un emplazamiento diana mediante microinfusión comprenden aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Cuando se administran mediante inyección directa o microinfusión, se pueden construir mediante ingeniería genética las proteínas de fusión modificadas para presentar unión reducida o ninguna del hierro para evitar, en parte, la toxicidad localizada del hierro.

Adicionalmente a la proteína de fusión farmacológicamente activa, las composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente para liberar en el lugar de la acción. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Adicionalmente, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como inyecciones de suspensiones oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las inyecciones de suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. Se pueden usar también liposomas para encapsular el agente para la liberación en la célula.

La formulación farmacéutica para administración sistémica se puede formular para administración entérica, parenteral o tópica. Por tanto, se pueden usar los tres tipos de formulaciones simultáneamente para conseguir la administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, píldoras, comprimidos, que incluyen comprimidos recubiertos, elíxires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y sus formas de liberación controlada.

En la práctica de los procedimientos de tratamiento los agentes solos se pueden usar o en combinación, o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En algunas realizaciones preferidas, se pueden administrar simultáneamente los compuestos descritos en el presente documento junto con otros compuestos normalmente prescritos para estas dolencias según la práctica médica generalmente aceptada. Se pueden utilizar los compuestos in vivo, ordinariamente en mamíferos, tales como seres humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, ex vivo o in vitro.

Se pueden usar las proteínas de fusión modificadas en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las enfermedades y/o trastornos relacionados con las enfermedades y trastornos del sistema endocrino, el sistema nervioso, el sistema inmune, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema reproductor, el sistema digestivo, las enfermedades y/o trastornos relacionados con la proliferación celular, y/o las enfermedades o trastornos relacionados con la sangre.

En otras realizaciones adicionales, se pueden usar las proteínas de fusión de la Tf modificada en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las enfermedades y/o trastornos relacionados con las enfermedades y trastornos conocidos por asociarse con o poderse tratar con restos de la proteína terapéutica como se sabe en la técnica y se ejemplifica en las Publicaciones de Patentes PCT N^{os} WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480. Según esto, la presente solicitud describe un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno relacionado en la columna "Indicación Preferida Y" de la Tabla 1 del documento WO 03/020746 que comprende la administración a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora mediante una proteína de fusión de la transferrina modificada que comprende una porción de proteína terapéutica que corresponde a una proteína terapéutica que se da a conocer en la columna "Proteína Terapéutica X" de la Tabla 1 en una cantidad eficaz para tratar, evitar, o mejorar la enfermedad o el trastorno.

En algunas realizaciones, se puede usar una proteína de fusión de la transferrina para diagnosticar y/o pronosticar las enfermedades y/o trastornos.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de las enfermedades, trastornos, y/o dolencias del sistema inmune. Además, se pueden usar las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno concreto del sistema inmune.

En una realización preferida, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de la transferrina modificada se usarían como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre individuos inmunodeficientes. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre las células B y/o las células T de individuos inmunodeficientes.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico, y/o pronóstico de las enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de un reconocimiento inapropiado del material propio como extraño por las células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido del huésped. Por tanto, la administración de proteínas de fusión y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, que pueden inhibir una respuesta inmune, particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de las células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de los trastornos autoinmunes.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, pronóstico, y/o diagnóstico de las enfermedades, trastornos, y/o dolencias de las células hematopoyéticas. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían para aumentar la diferenciación y la proliferación de las células hematopoyéticas, que incluyen las células troncales pluripotentes, en un esfuerzo de tratar o evitar las enfermedades, trastornos y/o dolencias asociadas con una disminución en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a, leucopenia, neutropenia, anemia, y trombocitopenia.

Alternativamente, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían para aumentar la diferenciación y la proliferación de las células hematopoyéticas, incluyendo las células troncales pluripotentes, en un esfuerzo de tratar o evitar las enfermedades, trastornos, y/o dolencias asociadas con un aumento en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a, histiocitosis.

Se pueden tratar, evitar, diagnosticar y/o pronosticar también las reacciones y dolencias alérgicas, tales como asma (concretamente asma alérgico) u otros problemas respiratorios y usar las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina. Además, se pueden usar estas moléculas para tratar, evitar, pronosticar, y/o diagnosticar la anafilaxis, hipersensibilidad a una molécula antigénica, o la incompatibilidad del grupo sanguíneo.

Adicionalmente, se pueden usar Las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, para tratar, evitar, diagnosticar y/o pronosticar las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Dichas reacciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis, y eczema. En las realizaciones específicas, se pueden usar las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina para modular las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.

Además, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina tienen usos en el diagnóstico, pronóstico, prevención, y/o tratamiento de las dolencias inflamatorias. Por ejemplo, debido a que las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden inhibir la activación, proliferación, y/o la diferenciación de las células implicadas en una respuesta inflamatoria, se pueden usar estas moléculas para evitar y/o tratar las dolencias inflamatorias crónicas y agudas. Dichas dolencias inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque sépticos, sepsis, o síndrome sistémico de respuesta inflamatoria), lesión por reperfusión tras isquemia, letalidad de la endotoxina, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión de pulmón inducida por citocina o quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, sobreproducción de citocinas (por ejemplo, TNF o IL-1), trastornos respiratorios (por ejemplo, asma y alergia); trastornos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino); cánceres (por ejemplo, gástrico, de ovario, de pulmón, de vejiga, de hígado, y de mama); trastornos del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple, lesión isquémica de cerebro y/o apoplejía, lesión traumática de cerebro); trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer); (demencia relacionada con SIDA y enfermedad priónica); trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular, y complicaciones por derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades, dolencias, y trastornos adicionales que se caracterizan por inflamación (por ejemplo, hepatitis, artritis reumatoide, gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión de reperfusión tras isquemia renal, enfermedad de Grave, lupus sistémico eritematoso, diabetes mellitus, y rechazo alogénico al trasplante).

Debido a que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar virtualmente cualquier tejido del cuerpo. Según esto, Las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina tienen usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejido, que incluyen, pero no se limitan a, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustachitis, fibrositis, foliculitis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatoesplenitis, queratitis, laberintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miositis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis, tendonitis, tonsilitis, uretritis, y vaginitis.

En realizaciones específicas, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina son útiles para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar los rechazos al trasplante de órganos y la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Se produce el rechazo del órgano por la destrucción de las células inmunes del huésped del tejido trasplantado a través de una respuesta inmune. Similarmente, está también implicada una respuesta inmune en GVHD, pero, en este caso, las células inmunes trasplantadas extrañas destruyen los tejidos del huésped. Los polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos, y/o sus agonistas o antagonistas, que inhiben una respuesta inmune, particularmente la activación, proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de las células T, pueden ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo al órgano o GVHD.

En otra realización específica, las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usaron como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antivíricas: las respuestas inmunes antivíricas que se pueden potenciar usando la composiciones descritas en el presente documento como un adyuvante, incluyen enfermedades o síntomas víricos y asociados a virus descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. En realizaciones específicas, se usaron la composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo constituido por SIDA, meningitis, Dengue, VEB, y hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En otra realización específica, se usaron las composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo constituido por: VIH/SIDA, virus respiratorio sincitial; Dengue, rotavirus, encefalitis japonesa B, gripe A y B, virus paragripal, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chicungunya, Fiebre del Valle del Rift, herpes simple, y fiebre amarilla.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, pueden usarse también como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas. Las respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas que se pueden potenciar usando la composiciones descritas en el presente documento como un adyuvante incluyen las enfermedades o síntomas de bacterias u hongos y las asociadas a bacterias u hongos descritas en el presente documento o conocidas de otra manera en la técnica. En realizaciones específicas, se usaron las composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una enfermedad o síntoma por bacteria u hongo seleccionada entre el grupo constituido por tétanos, difteria, botulismo, meningitis tipo B, y candidiasis.

En otra realización específica, se usaron la composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una enfermedad o síntoma por bacteria u hongo seleccionadas entre el grupo constituido por Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis, Streptococcus neumoniae, Streptococcus Grupo B, Shigella spp., Escherichia coli Enterotoxigénica, E. coli Enterohemorrágica, Borrelia burgdorferi, y Candida.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar también como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antiparasíticas. Las respuestas inmunes antiparasíticas que se pueden potenciar usando las composiciones como un adyuvante incluyen las enfermedades o síntomas por parásitos o asociados a parásitos descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. Se pueden usar también las composiciones descritas en el presente documento como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un parásito. Se pueden usar también las composiciones descritas en el presente documento como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a Plasmodium (malaria) o
Leishmania.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden emplear también para tratar enfermedades infecciosas que incluyen silicosis, sarcoidosis, y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, evitando el reclutamiento y activación de los fagocitos mononucleares.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar también como un antígeno para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas inmunomediadas contra los polipéptidos de la invención.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden administrar a un animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdos, micro cerdos, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano, y ser humano, lo más preferible ser humano) para estimular el sistema inmune para producir cantidades crecientes de uno o más anticuerpos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, e IgE), para inducir la producción de anticuerpos con mayor afinidad y el cambio del tipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA, IgN, e IgE, y para aumentar una respuesta inmune.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar en una o más de las aplicaciones descritas en el presente documento, ya que se pueden aplicar a la medicina veterinaria.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar como medio para bloquear algunos aspectos de las respuestas inmunes a agentes extraños o propios. Los ejemplos de enfermedades o dolencias en las que se puede desear el bloqueo de algunos aspectos de las respuestas inmunes incluyen trastornos autoinmunes tales como lupus, y artritis, así como inmunosensibilidad a las alergias de la piel, inflamación, enfermedad del intestino, lesión, y enfermedades/trastornos asociados con patógenos.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para evitar la proliferación de células B y la secreción de Ig asociada con enfermedades autoinmunes tales como púrpura trombocitopénico idiopático, lupus sistémico eritematoso y esclerosis múltiple.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar como un inhibidor de la activación de las células B y/o T en las células endoteliales. Esta actividad perturba la arquitectura del tejido o las respuestas análogas y es útil, por ejemplo en la perturbación de las respuestas inmunes, y el bloqueo de la sepsis.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para la hipergammaglobulinemia crónica evidente en dichas enfermedades tales como la gammopatía monoclonal de significancia indeterminada (MGUS), la enfermedad de Waldenstrom, gammopatías monoclonales idiopáticas relacionadas, y plasmacitomas.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden emplear por ejemplo para inhibir la quimiotaxis de los polipéptidos y la activación de los macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B, y algunos subconjuntos de células T, por ejemplo, células T activadas y citotóxicas CD8, y las linfocitos citolíticos naturales, en algunas enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas e infectivas. Se describen en el presente documento enfermedades autoinmunes e incluyen la esclerosis múltiple, y la diabetes dependiente de insulina.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden emplear también para tratar la aterosclerosis, por ejemplo, evitando la infiltración de monocitos en la pared de la arteria.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden emplear para tratar el síndrome de dolor respiratorio en adultos (ARDS).

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles para estimular la reparación de heridas y tejidos, estimular la angiogénesis, y/o estimular la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o linfáticos. Adicionalmente, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para estimular la regeneración de superficies mucosales.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, tratar, y/o evitar un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción de inmunoglobulina en suero deficiente, infecciones recurrentes, y/o disfunción del sistema inmune. Además Las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para tratar o evitar infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glándulas parótidas, infecciones transmitidas por sangre (por ejemplo, sepsis, meningitis, artritis séptica, y/u osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, las que se dan a conocer en el presente documento), trastornos inflamatorios, y neoplasias malignas, y/o cualquier enfermedad o trastorno o dolencia asociadas con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o neoplasias malignas) incluyendo, pero sin limitarse a, Inmunodeficiencia variable Común (CVID), otras inmunodeficiencias primarias, enfermedad por VIH, Leucemia Linfocítica Crónica (CLL), bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zoster (por ejemplo, herpes zoster grave), y/o neumocistis carinii. Otras enfermedades y trastornos que se pueden evitar, diagnosticar, pronosticar, y/o tratar con las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción bactericida de los fagocitos, trombocitopenia, y hemoglobinuria.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar cánceres o neoplasmas que incluyen cánceres o neoplasmas de células inmunes o relacionados con tejido inmune. Los ejemplos de cánceres o neoplasmas que se pueden evitar, diagnosticar, o tratar mediante las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, leucemia Linfocítica aguda (ALL), leucemia Linfocítica crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, enfermedades transformadas por VEB, y/o las enfermedades y los trastornos descritos en la sección titulada "Trastornos Hiperproliferativos" en otra parte en el presente documento.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para disminuir la proliferación celular de los Linfomas de células B grandes.

Las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar como un agente para estimular la inmunosensibilidad entre los individuos inmunodeficientes en células B, tales como, por ejemplo, un individuo que experimenta una esplenectomía parcial o completa.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para modular la actividad hemostática (la detención del sangrado) o trombolítica (disolución del coágulo). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o trombolítica, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían para tratar o evitar las enfermedades, trastornos, y/o dolencias de coagulación de la sangre (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factores, hemofilia), las enfermedades, trastornos, y/o dolencias de las plaquetas de la sangre (por ejemplo, trombocitopenia), o las heridas resultantes de trauma, cirugía, u otras causas. Alternativamente, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, que pueden disminuir la actividad hemostática o trombolítica se usarían para inhibir o disolver los coágulos. Estas moléculas serían importantes en el tratamiento o prevención de los ataques al corazón (infartos), las apoplejías, o la cicatrización.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para evitar, diagnosticar, pronosticar, y/o tratar la trombosis, trombosis arterial, trombosis venosa, tromboembolismo, embolismo pulmonar, aterosclerosis, infarto de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para la prevención de la oclusión de los injertos de la safena, para reducir el riesgo de la trombosis periprocedural que puede acompañar a los procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de apoplejía en pacientes con fibrilación atrial que incluye fibrilación atrial no reumática, para reducir el riesgo de embolismo asociado a válvulas cardíacas mecánicas y/o enfermedad de las válvulas mitrales. Otros usos para las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, incluyen, pero no se limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (por ejemplo, canales intravasculares, vías de acceso en pacientes de hemodiálisis, equipos de hemodiálisis, y equipos de derivación cardiopulmonar).

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para evitar, diagnosticar, pronosticar, y/o tratar las enfermedades y trastornos de la sangre y/o los órganos que forman la sangre asociados con el(los) tejido(s) en los que el polipéptido se expresa.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para modular la actividad hematopoyética (la formación de células de la sangre). Por ejemplo, las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para aumentar la cantidad de todas o los subconjuntos de células de la sangre, tal como, por ejemplo, los eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocíticas, macrófagos) y las plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células de la sangre o de los subconjuntos de células de la sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico, y/o tratamiento de las anemias y las leucopenias descritas a continuación. Alternativamente, las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para disminuir la cantidad de todas o de los subconjuntos de células de la sangre, tales como, por ejemplo, los eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocíticas, macrófagos) y las plaquetas. La capacidad para disminuir la cantidad de células de la sangre o de los subconjuntos de células de la sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico, y/o tratamiento de la leucocitosis, tal como, por ejemplo, la eosinofilia. Las proteínas y/o los polinucleótidos de fusión modificados que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para evitar, tratar, o diagnosticar la discrasia de las células de la sangre.

Las anemias son dolencias en las que el número de glóbulos rojos de la sangre o la cantidad de hemoglobina (la proteína que transporta el oxígeno) en la misma está por debajo de lo normal. Se puede producir la anemia por sangrado excesivo, disminución de la producción de glóbulos rojos de la sangre, o aumento en la destrucción de glóbulos rojos de la sangre (hemolisis). Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de las anemias. Las anemias que se pueden tratar, evitar o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen anemia por deficiencia de hierro, anemia hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica idiopática adquirida, aplasia de glóbulos rojos, anemia megaloblástica (por ejemplo, anemia perniciosa, (deficiencia de vitamina B12, y anemia por deficiencia de ácido fólico), anemia aplásica, anemias hemolíticas (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica microangiopática, y hemoglobinuria nocturna paroxística). Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de las anemias asociadas con las enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, anemias asociadas con lupus sistémico eritematoso, cánceres, linfomas, enfermedad renal crónica, y bazo aumentado. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina puede ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de la anemia que se produce a partir de tratamientos con fármacos tales como las anemias asociadas con metildopa, dapsona, y/o sulfafármacos. Adicionalmente, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de las anemias asociadas con arquitectura anormal de los glóbulos rojos que incluye, pero no se limita a, esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, anemia de células falciformes.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de anormalidades de la hemoglobina (por ejemplo, las asociadas con anemia de células falciformes, enfermedad de la hemoglobina C, enfermedad de la hemoglobina S-C, y enfermedad de la hemoglobina E. Adicionalmente, las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el diagnóstico, prevención, y/o pronóstico en el tratamiento de talasemias, que incluyen, pero no se limitan a, formas mayores y menores de alfa-talasemia y beta-talasemia.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención, y/o tratamiento de los trastornos de sangrado que incluyen, pero no se limitan a, trombocitopenia (por ejemplo, púrpura trombocitopénico idiopático, y púrpura trombocitopénico trombótico), enfermedad de Von Willebrand, trastornos plaquetarios hereditarios (por ejemplo, la enfermedad por defecto en el compartimento de depósito tal como los síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción del tromboxano A2, tromboastenia, y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemoliticurémico, hemofilias tales como hemofilia A o deficiencia del Factor V11 y enfermedad de Navidad o deficiencia del Factor IX, Telangiectsia Hemorrágica hereditaria, conocida también como Síndrome de Rendu-Osler-Webe, púrpura alérgico (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles como un agente para aumentar la producción de citocina.

Las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, que incluyen neoplasmas. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles pueden inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Alternativamente, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden producir la proliferación de otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.

Por ejemplo, se pueden tratar los trastornos hiperproliferativos aumentando una respuesta inmune, particularmente, aumentando las calidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o proliferando, diferenciando, o movilizando las células T. se puede aumentar esta respuesta inmune, tanto potenciando una respuesta inmune existente, como iniciando una nueva respuesta inmune. Alternativamente, disminuir una respuesta inmune puede ser también un procedimiento para tratar trastornos hiperproliferativos tales como un agente quimioterapéutico.

Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a neoplasma localizado en el colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax, y tracto urogenital.

Similarmente, se pueden tratar o detectar otros trastornos hiperproliferativos mediante las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina. Los ejemplos de dichos trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a Leucemia Linfoblástica Aguda Infantil; Leucemia Linfoblástica Aguda, Leucemia Linfocítica Aguda, Leucemia Mieloide Aguda, Carcinoma Adrenocortical; Cáncer Hepatocelular en Adultos (Primario), Cáncer de Hígado en Adultos (Primario), Leucemia Linfocítica Aguda en Adultos, Leucemia Mieloide Aguda en Adultos; Enfermedad de Hodgkin en Adultos, Linfoma de Hodgkin en Adultos, Leucemia Linfocítica en Adultos, Linfoma no de Hodgkin en Adultos, Cáncer Primario de Hígado en Adultos, Sarcoma del Tejido Blando en Adultos, Linfoma Relacionado con SIDA, Neoplasias Malignas relacionadas con SIDA, Cáncer Anal, Astrocitoma, Cáncer de los Conductos biliares, Cáncer de Vejiga, Cáncer de Hueso, Glioma de Tronco Cerebral, Tumores Cerebrales, Cáncer de Mama, Cáncer de la Pelvis Renal y el Uréter, Linfoma del Sistema Nervioso Central (Primario), Linfoma del Sistema Nervioso Central, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral, Cáncer Cervical, Cáncer Hepatocelular Infantil (Primario), Cáncer de Hígado Infantil (Primario), Leucemia Linfoblástica Aguda Infantil, Leucemia Mieloide Aguda Infantil, Glioma de Tronco Cerebral Infantil, Astrocitoma Cerebelar Infantil; Astrocitoma Cerebral Infantil, Tumores Extracraneales de las Células Germinales Infantiles, Enfermedad de Hodgkin Infantil, Linfoma de Hodgkin Infantil, Glioma Hipotalámico y de la Ruta Visual Infantil, Leucemia Linfoblástico Infantil, Meduloblastoma Infantil; Linfoma No de Hodgkin Infantil, Tumores Neuroectodérmico Primitivo Supratentorial y Pineal Infantiles, Cáncer Primario de Hígado Infantil, Rabdomiosarcoma Infantil, Sarcoma del Tejido Blando Infantil, Glioma Hipotalámico y de la Ruta Visual, Leucemia Linfocítica Crónica, Leucemia Mielógena Crónica, Cáncer de Colon, Linfoma Cutáneo de Células T, Carcinoma Endocrino de las Células de los Islotes del Páncreas, Cáncer Endometrial, Ependimoma, Cáncer Epitelial, Cáncer Esofágico, Sarcoma de Ewing y Tumores Relacionados, Cáncer Pancreático Exocrino, Tumor Extracraneal de Células Germinales, Tumor Extragonadal de Células Germinales, Cáncer Extrahepático de los Conductos Biliares, Cáncer de ojo, Cáncer de Mama Femenino, Enfermedad de Gaucher, Cáncer de Vesícula Biliar, Cáncer gástrico, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumores Gastrointestinales, Tumores de Células Germinales, Tumor Trofoblástico gestacional, Leucemia de Células Pilosas, Cancer de Cabeza y Cuello, Cáncer Hepatocelular, Enfermedad de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, Hipergammaglobulinemia, Cáncer de Hipofaringe, Cánceres Intestinales, Melanoma Intraocular, Carcinoma de las Células de los Islotes, Cáncer pancreático de la Células de los Islotes, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñón, cáncer de Laringe, Cáncer de Labios y de la Cavidad Oral, Cáncer de Hígado, Cáncer de Pulmón, Trastornos Linfoproliferativos, Macroglobulinemia, Cáncer de Pecho masculino, Mesotelioma Maligno, Timoma Maligno, Meduloblastomia, Melanoma, Mesotelioma, Cáncer Escamoso Metastásico del Cuello con Tumor Primario Oculto, Cáncer Escamoso Metastásico del Cuello con Tumor Primario, Cáncer Escamoso Metastásico del Cuello, Mieloma Múltiple, Neoplasma de Células Plasmáticas/Mieloma Múltiple, Síndrome Mielodisplásico, Leucemia Mielógena, Leucemia Mieloide, Trastornos Mieloproliferativos, Cáncer de la Cavidad Nasal y del Seno Paranasal, Cáncer de Nasofaringe, Neuroblastoma, Linfoma No de Hodgkin Durante el Embarazo, Cáncer de Piel Sin melanoma, Cáncer de Pulmón de Células No Pequeñas, Cáncer Escamoso Metastásico del Cuello con Tumor Primario Oculto, Cáncer de Orofaringe, Osteosarcoma Fibroso Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno del hueso, Cáncer Epitelial de Ovario, Tumor de Células germinales de Ovario, Tumor de Ovario con Bajo Potencial Maligno, Cáncer de Páncreas, Paraproteinemias, Púrpura, Cáncer de Paratiroides, Cáncer de Pene, Feocromocitoma, Tumor de la Pituitaria, Neoplasma de Células Plasmáticas/Mieloma Múltiple, Linfoma Primario del Sistema nervioso Central; Cáncer Primario de hígado, Cáncer de Próstata, Cancer Rectal, Cáncer de Células Renales, Cáncer de pelvis Renal y Uréter, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de Glándulas Salivares, Sarcomas, Sarcoidosis, Síndrome de Sezary, Cáncer de piel, Cáncer de pulmón de Células Pequeñas, Cáncer de Intestino delgado, Sarcoma del Tejido Blando, Cáncer Escamoso del Cuello, Cáncer de Estómago, Tumores Neuroectodérmico Primitivo Supratentorial y Pineal, Linfoma de Células T, Cáncer de testículos, Timoma, Cáncer de Tiroides, Cáncer de Células de Transición de Pelvis Renal y Uréter, Cáncer de Transición de Pelvis Renal y Uréter, tumores Trofoblásticos, Cáncer de Células de Uréter y Pelvis Renal, Cáncer de Uretra, Cáncer de Útero, Sarcoma de Útero, Cáncer de vagina, Glioma de la Ruta Visual e Hipotalámico; Cáncer de Vulva; Macroglobulinemia de Waldenstron; Tumor de Wilm, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia localizada en u sistema de órgano relacionado anteriormente.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar dolencias premalignas y para evitar la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo, pero sin limitarse a, los trastornos descritos anteriormente. Se indican dichos usos en las dolencias conocidas o sospechosas de preceder a la progresión de neoplasia o cáncer, en concreto, cuando el crecimiento de células no neoplásicas está constituido por hiperplasia, metaplasia, o más concretamente, se ha producido displasia (para una revisión de dichas dolencias de crecimiento anormal véase Robbins. y Angell, 1976, Basic Pathology, 2^{a} Ed. W. B. Saunders Co., Filadelfia, pp. 68-79).

Hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada, que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. Los trastornos hiperplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar con las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia del nódulo linfático mediastinal angiofolicular, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de células basales, hiperplasia aguda de nódulo linfático gigante, hiperplasia del cemento, hiperplasia adrenal congénita, hiperplasia sebácea congénita, hiperplasia cística, hiperplasia cística de la mama, hiperplasia de la dentadura, hiperplasia ductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia nodular de la próstata, hiperplasia nodular regenerativa, hiperplasia psudoepiteliomatosa, hiperplasia sebácea senil, e hiperplasia verrucosa.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina conjugados con una toxina o un isótopo radioactivo, según se describe en el presente documento, se pueden usar para tratar cánceres y neoplasmas, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en el presente documento. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina conjugados con una toxina o un isótopo radioactivo, según se describe en el presente documento, se pueden usar también para tratar la leucemia mielógena aguda.

Adicionalmente, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden afectar la apoptosis, y por tanto, serían útiles en el tratamiento de numerosas enfermedades asociadas con un aumento en la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis. Por ejemplo, las enfermedades asociadas con un aumento en la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se podrían diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar por los polinucleótidos, polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas según se describe en el presente documento, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer de páncreas, melanoma, Retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, Osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide) e infecciones víricas (tales como los virus del herpes, poxvirus y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo agudo al injerto, y rechazo crónico al injerto.

Las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para inhibir el crecimiento, la progresión, y/o la metástasis de los cánceres, en concreto, los relacionados anteriormente.

Las enfermedades o dolencias adicionales asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podrían diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar mediante las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a progresión y/o metástasis de trastornos malignos y relacionados tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo., leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, fiposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.

Las enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis que se podrían diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar mediante las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos (tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebral, tumor cerebral o enfermedad asociada a priones); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogre, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso, y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto contra huésped Y, lesión isquémica (tal como la producida por infarto de miocardio, apoplejía y lesión por reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, lesión de hígado relacionada con hepatitis, lesión tras isquemia/reperfusión, colestosis (lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado), enfermedad del hígado inducida por toxina (tal como la producida por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar también para inhibir la división celular aberrante, mediante terapia génica, y/o las proteínas de fusión o sus fragmentos.

Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden liberar directamente en los emplazamientos de la enfermedad proliferativa celular desordenada, en órganos internos, cavidades corporales, y similares mediante el uso de dispositivos de formación de imagen usados para guiar una aguja de inyección directamente en el emplazamiento de la enfermedad, Se pueden administrar también los polinucleótidos en el emplazamiento de la enfermedad en el momento de la intervención quirúrgica.

Por enfermedad proliferativa celular se entiende se entiende cualquier enfermedad o trastorno humano o animal, que afecta uno cualquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades, o partes corporales, que se caracteriza por proliferaciones anormales locales únicas o múltiples de células, grupos de células, o tejidos, tanto benignas como malignas.

Se puede administrar cualquier cantidad de polinucleótidos siempre que tengan un efecto de inhibir biológicamente la proliferación de las células tratadas.

Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos simultáneamente en el mismo sitio. Por "inhibir biológicamente" se entiende la inhibición del crecimiento parcial o total así como las disminuciones en la velocidad de proliferación o el crecimiento de las células.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina son útiles en la inhibición de la metástasis de las células o los tejidos proliferativos. Se puede producir la inhibición como resultado directo de administrar estas proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos, o indirectamente, tal como activando la expresión de las proteínas conocidas por inhibir la metástasis, por ejemplo, las alfa integrinas (véase, por ejemplo, Curr. Top. Mirobiol. Immunol. 1998; 231: 1 41). Se pueden conseguir dichos efectos terapéuticos de la presente invención tanto solo como en combinación con pequeñas moléculas de fármacos o adyuvantes.

La presente solicitud describe también un procedimiento para liberar las composiciones que contienen las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina en células diana que expresan un polipéptido unido por, que se une a, o asociado con una proteína de fusión de la transferrina modificada. Se pueden asociar las proteínas de fusión de la transferrina con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o profármacos mediante interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes.

Las enfermedades del riñón que se pueden diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar con la composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica enfermedad renal terminal, enfermedades inflamatorias del riñón (por ejemplo, glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis post infecciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva, síndrome nefrítico, glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrítico familiar, glomerulonefritis proliferativa de membrana y glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis crónica, nefritis aguda túbulointersticial, nefritis tubulointersticial crónica, glomerulonefritis aguda post estreptocócica (PSGN), pielonefritis, nefritis por lupus, nefritis crónica, nefritis intersticial, glomerulonefritis post estreptocócica), trastornos de los vasos sanguíneos de los riñones (por ejemplo, infarto de riñón, enfermedad ateroembólica de riñón, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis de la vena renal, perfusión renal, retinopatía renal, reperfusión renal tras isquemia, embolismo de las arteria renal y estenosis de la arteria renal), trastornos del riñón como resultado de enfermedad del tracto urinario (por ejemplo., pielonefritis, hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis), nefropatía de reflujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria, y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica). Adicionalmente, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar trastornos metabólicos y congénitos del riñón (por ejemplo, uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, glicosuria renal, diabetes nefrogénica insípida, cistinuria, síndrome de Fanconi, osteosis fibrocística renal (raquitismo renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddle, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular, riñón medular en esponja, síndrome de Alport, síndrome de nail-patella, síndrome nefrítico congénito, síndrome de aplastamiento, riñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes nefrogénica insípida, nefropatía analgésica, piedras en el riñón, y nefropatía membranosa), y enfermedades autoinmunes del riñón (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso (SLE), síndrome de Goodpasture, nefropatía por IgA, y glomerulonefritis mesangial proliferativa según la CIPM).

Se pueden usar también las composiciones descritas en el presente documento para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón (por ejemplo, glomeruloesclerosis, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSFyG), glomerulonefritis narcotizante y necrosis papilar renal), cánceres del riñón (por ejemplo, nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células renales, cáncer de células transicionales, adenocarcinoma renal, cáncer de células escamosas, y tumor de Wilm), y desequilibrio de electrolitos (por ejemplo, nefrocalcinosis, piuria, edema, hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipernatremia, hipocalemia, hipercalemia, hipocalcemia, hipercalcemia, hipofosfatemia, e hiperfosfatemia).

Se pueden administrar las composiciones descritas en el presente documento usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección de aguja directa en el emplazamiento de liberación, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos tipo esponja de espuma de gel, otros materiales de depósito comercialmente disponibles, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o en forma de supositorio, aplicaciones para decantación o tópicas durante la cirugía, administración en aerosol. Se conocen dichos procedimientos en la técnica. Se pueden administrar las composiciones descritas en el presente documento como parte de una terapéutica, descrita con más detalle a continuación.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, se pueden usar para tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar trastornos cardiovasculares, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de las arterias periféricas, tales como isquemia límbica.

Los trastornos cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, anormalidades cardiovasculares, tales como fístula arterio arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos congénitos del corazón, atresia pulmonar y Síndrome de la Cimitarra.

Los defectos congénitos del corazón incluyen, pero no se limitan a, coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón en criss cross, dextrocardia, ductus arterioso permeable, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplástico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia tricuspídea, tronco arterioso persistente, defectos septales del corazón, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de almohadillas endocárdicas, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales ventriculares del corazón.

Los trastornos cardiovasculares incluyen también, pero no se limitan a, cardiopatía, tal como, arritmias, enfermedad carcinoide del corazón, gasto cardíaco elevado, gasto cardiaco bajo, tamponada cardiaca, endocarditis (que incluye bacterias), aneurisma de corazón, parada cardiaca, insuficiencia congestiva cardíaca, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxística, edema cardiaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, ruptura cardiaca después de infarto, ruptura ventricular septal, enfermedades de las válvulas cardiacas, enfermedades miocardiales, isquemia de miocardio, efusión pericardial, pericarditis (que incluye constrictiva y tuberculosa), mesotelioma primario del pericardio, síndrome después de pericardiotomía, cardiopatía pulmonar, cardiopatía reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares del embarazo, Síndrome de la Cimitarra, sífilis cardiovascular, y tuberculosis cardiovascular.

Las arritmias incluyen, pero no se limitan a, arritmia del seno, fibrilación atrial, flutter atrial, bradicardia, extrasístole, Síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, síndrome de QT largo, parasístole, Síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome de seno enfermo, taquicardias, y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia por reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia por reentrada nodal senoatrial, taquicardia del seno, taquicardia ventricular en entorchado, y taquicardia ventricular.

Las enfermedades de las válvulas cardiacas incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, murmullos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide, y estenosis de la válvula tricúspide.

Las enfermedades miocardiales incluyen, pero no se limitan a, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis endocardial, fibrosis endomiocardial, Síndrome de Kearns, lesión por reperfusión de miocardio, y miocarditis.

Las isquemias miocardiales incluyen, pero no se limitan a, enfermedad coronaria, tal como angina de pecho, aneurisma coronario, arterioesclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio, y miocardio aturdido.

Las enfermedades cardiovasculares incluyen también enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, Enfermedad de Hippel-Lindau, Síndrome de Klippel Trenaunay Weber, Síndrome de Sturge Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, Arteritis de Takayasu, aortitis, Síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolismos, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno oclusiva hepática, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retinal, síndrome de la Cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, ataxia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, vasculitis, e insuficiencia venosa.

Los trastornos cerebrovasculares incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardioarteriales sino que incluye trastornos respiratorios. Las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención se pueden usar para tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar las enfermedades y/o trastornos del sistema respiratorio.

Las enfermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a, vestibulitis nasal, rinitis no alérgica (por ejemplo, rinitis aguda, rinitis crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotora), pólipos nasales, y sinusitis, angiofibromas juveniles, cáncer de la nariz y papilomas juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos, nódulos de los cantantes, úlceras de contacto, parálisis de las cuerdas vocales, laringoceles, faringitis (por ejemplo, vírica y bacteriana), tonsilitis, celulitis tonsilar, acceso para faríngeo, laringitis, laringoceles, y cánceres de garganta (por ejemplo, cáncer de la nasofaringe, cáncer de amígdala, cáncer de laringe), cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas (célula pequeña), carcinoma de células grandes, y adenocarcinoma, trastornos alérgicos (neumonía eosinófila, neumonitis por hipersensibilidad (por ejemplo, alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica, neumoconiosis orgánica producida por polvo, aspergiliosis broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener (vasculitis granulomatosa), síndrome de Goodpasture), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae (neumonía neumocócica), Staphylococcus aureus (neumonía estafilocócica), neumonía por bacterias Gram negativas (producidas por, por ejemplo, Klebsiella y Pseudomonas spp.), neumonía por Mycoplasma pneumoniae, neumonía por Hemophilus influenzae; Legionella pneumophila (enfermedad del Legionario, y Chlamydia psittaci (Psitacosis)), y neumonía vírica (por ejemplo, gripe, varicela (varicela).

Las enfermedades y trastornos adicionales del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a bronquiolitis, polio (poliomelitis), croup, infección vírica respiratoria sincitial, paperas, eritema infecciosos (la quinta enfermedad), roséola infantil, panencefalitis progresiva por rubeola, sarampión alemán, panencefalitis esclerosante subaguda), neumonía fúngica (por ejemplo, Histoplasmosis, Coccidiomicosis, Blastomicosis, infecciones fúngicas en personas con sistemas inmunes gravemente suprimidos (por ejemplo, criptococosis, producida por Cryptococcus neoformans; aspergiliosis, producida por Aspergillus spp.), candidiasis, producida por Candida; y mucormicosis)), Pneumocystis acrinii (neumonía por neumocistis), neumonías atípicas (por ejemplo, Mycoplasma y Chlamydia spp.), neumonía por infección oportunista, neumonía nosocomial, neumonitis química, y neumonía por aspiración, trastornos pleurales (por ejemplo, pleuresía, derrame pleural, y neumotórax, (por ejemplo, neumotórax espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax por tensión), enfermedades obstructivas de las vías aéreas (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPID), enfisema, bronquitis aguda o crónica), enfermedades laborales del pulmón (por ejemplo, silicosis, pulmón negro (neumoconiosis de los mineros del carbón, asbestosis, beriliosis, asma laboral y bisiniosis), Enfermedad Infiltrativa Pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar (por ejemplo, pneumonía intersticial usual), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía interticial descamativa, neumonía intersticial linfoide (por ejemplo, enfermedad de Letterer-Siwe, enfermedad de Hand-Schüller-Christian, granuloma eosinófilo, hemosiderosis pulmonar idiopática sarcoidosis y proteinosis alveolar pulmonar), síndrome de dolor respiratorio agudo (denominado también, por ejemplo, síndrome de dolor respiratorio en adultos), edema, embolismo pulmonar, bronquitis (por ejemplo, vírica, bacteriana), bronquiectasis, atelectasis, abscesos del pulmón (producidos por, por ejemplo, Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila), y fibrosis quística.

Los cánceres que se pueden tratar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan tumores sólidos , que incluyen de próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, hígado, parótida, tracto biliar, colon, rectos, cerviz, útero, endometrio, riñón, vejiga, cáncer de tiroides; tumores y metástasis; melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorrectal; neoplasias malignas avanzadas; tumores hemáticos tales como leucemia. Por ejemplo, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden liberar tópicamente, con el fin de tratar cánceres tales como el cáncer de piel, los tumores de cabeza y cuello, y el sarcoma de Kaposi.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles, en el tratamiento de otros trastornos, además de cánceres, que implican la angiogénesis. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piógenos; placas ateroescleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis, y crecimiento anormal de los vasos sanguíneos del ojo por Pterigio; artritis reumatoide; soriasis, cicatrización retardada de la herida; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; escleroderma; tracoma; adhesiones vasculares; angiogénesis miocardial; coronarias secundarias; cerebrales secundarias; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis límbica isquémica; Síndrome de Osler-Webber; neovascularización de la placa; telangiectasia, articulaciones en hemofílicos; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de la herida; enfermedad de Chron; y
aterosclerosis.

Adicionalmente, los trastornos que se pueden tratar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, hemangioma, artritis, soriasis, angiofibroma, placas ateroescleróticas, cicatrización retardada de la herida, granulaciones, articulaciones en hemofílicos, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome de Osler-Weber, granuloma piógeno, escleroderma, tracoma; y adhesiones vasculares.

Además, los trastornos y/o estados que se pueden tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar con las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores hemáticos tales como leucemia, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piógenos, artritis reumatoide, soriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveítis, cicatrización retardada de la herida, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides, fracturas sin unión, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocardial, coronarias secundarias, cerebrales secundarias, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis límbica isquémica, Síndrome de Osler-Webber, neovascularización de la placa, telangiectasia, articulaciones en hemofílicos, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de la herida, enfermedad de Chron, ateroesclerosis, agente que controla el nacimiento evitando la vascularización requerida por el embrión, implante de control de la menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica tal como enfermedad por arañazo de gato (Rochele nunalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacular.

En un aspecto del procedimiento de control del embarazo, se administra una cantidad del compuesto suficiente para controlar el implante del embrión antes o después que se haya producido el coito y la fertilización, proporcionando de esta manera un procedimiento efectivo de control del embarazo, posiblemente un procedimiento del "día después". Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar también en el control de la menstruación o administrarse tanto como fluido de lavado peritoneal o como implante peritoneal en el tratamiento de la endometriosis.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden utilizar en una amplia variedad de procedimientos quirúrgicos.

\newpage

Las enfermedades asociadas con un aumento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se podrían tratar, evitar, diagnosticar, y/o inhibir usando las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, Osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus sistémico eritematoso t glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide) e infecciones víricas (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo agudo al injerto, y rechazo crónico al injerto.

Las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para inhibir el crecimiento, la progresión, y/o la metástasis de los cánceres, en particular, los relacionados anteriormente.

Las enfermedades o dolencias adicionales asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podría tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas y/los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a la progresión y/o la metástasis de las neoplasias malignas y los trastornos relacionados tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo, leucemia aguda linfocítica, leucemia aguda mielocítica (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesad, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, linfoangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumores de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de célula basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de Jung, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.

Las enfermedades asociadas con aumento de la apoptosis que se podrían tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar usando las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, incluyen, pero no se limitan a, SIDA; trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Esclerosis lateral amiotrófica, Retinitis pigmentosa, Degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada a priones); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, quimosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus sistémico eritematoso, y glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide), Síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto contra huésped, lesión isquémica (tal como la producida por infarto de miocardio, apoplejía y lesión por reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, de hígado relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis/lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado); enfermedad del hígado inducida por toxinas (tal como la producida por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Adicionalmente, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se podrían usar para tratar o evitar el comienzo de la diabetes mellitus, En pacientes recientemente diagnosticados con los tipos I y II de diabetes, en los que permanece alguna función celular de los islotes, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, se podrían usar para mantener la función de los islotes para de esta manera, aliviar, retrasar o evitar la manifestación permanente de la enfermedad. También, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se podrían usar como un auxiliar en el trasplante de las células de islotes para mejorar o promover la función celular de los islotes.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para el diagnóstico y/o el tratamiento de las enfermedades, trastornos, daños o lesiones del cerebro y/o el sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que se pueden tratar con la composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina, limitados al sistema nervioso incluyen, pero no se limita a, las lesiones y enfermedades o los trastornos que dan como resultado una desconexión de los axones, una disminución o degeneración de las neuronas, como la desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (que incluyen pacientes mamíferos humanos y no humanos), incluyen, pero no se limitan a, las siguientes lesiones tanto de los s nervioso central (incluyendo la médula espinal, el cerebro) como del periférico: (i) lesiones isquémicas, en las que una ausencia de oxígeno en una porción del sistema nervioso da como resultado una lesión o muerte neuronal, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o infarto o isquemia de la médula espinal, (2) lesiones traumáticas, que incluyen la lesiones producidas por lesión física o asociada con cirugía, por ejemplo, lesiones que dañan una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por tejido maligno que es tanto un carcinoma asociado al sistema nervioso como un carcinoma derivado del tejido del sistema nervioso, (4) lesiones infecciosas en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso, como resultado de la infección, por ejemplo, mediante un absceso o asociado con infección por el virus de la inmunodeficiencia, herpes zoster o el virus del herpes simple, o con la enfermedad de Lyme, tuberculosis, o sífilis, (5) lesiones degenerativas, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso como resultado de un proceso degenerativo que incluye, pero no se limita a, degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ALS); (6) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales, en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo que incluye, pero no se limita a, deficiencia de vitamina B 12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía producida por tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Blanami (degeneración primaria del cuerpo calloso), y degeneración cerebral alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas que incluyen, pero no se limitan a diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus sistémico eritematoso, carcinoma, o sarcoidoisis; (8) lesiones producidas por sustancias tóxicas que incluyen, alcohol, plomo, o en particular, neurotoxinas; y (9) lesiones desmielinizadas en las que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por una enfermedad desmielinizante que incluye, pero no se limita a, esclerosis múltiple, mielopatía asociada con virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa o diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva, y mielinosis central pontina.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para proteger células neurales de los efectos de daños de la hipoxia. Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar también para proteger las células neurales de los efectos del daño de la hipoxia cerebral.

Los trastornos de las neuronas motoras que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o neoplasia maligna que puede afectar a las neuronas motoras así como a otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan selectivamente las neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica, y que incluyen, pero no se limitan a, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva infantil (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome de post poli, y Neuropatía Sensora Motora Hereditaria (Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).

Adicionalmente, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden jugar un papel en la supervivencia neuronal; formación de la sinapsis; conductancia; diferenciación neural, etc. De esta manera, las composiciones descritas en el presente documento (que incluyen las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina) se pueden usar para diagnosticar y/o tratar o evitar las enfermedades o trastornos asociados con estos papeles, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos del aprendizaje y/o cognitivos. Las composiciones pueden ser también útiles en el tratamiento o la prevención de los estados de enfermedad neurodegenerativos y/o los trastornos del comportamiento. Dichos estados de enfermedad neurodegenerativos y/o los trastornos del comportamiento incluyen, pero no se limitan a, Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de pánico, discapacidades del aprendizaje, ALS, sicosis, autismo, y comportamientos alterados, que incluyen trastornos en la alimentación, modelos de sueño, equilibrio, y percepción.

Los ejemplos de enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, enfermedades cerebrales, tales como enfermedades cerebrales metabólicas que incluyen fenilcetonuria, tal como fenilcetonuria materna, deficiencia de piruvato carboxilasa, deficiencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa, Encefalopatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas hipotalámicos, neoplasmas supratentoriales, enfermedad de Canavan, enfermedades cerebelares tales como ataxia cerebelar que incluye degeneración espinocerebelar tal como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelar, Ataxia de Friederich, Enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmos cerebelares tales como neoplasmos infratentoriales, esclerosis cerebral difusa tal como encefalitis periaxialis, leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y panencefalitis esclerosante aguda.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de la arteria carótida que incluyen trombosis de la arteria carótida, estenosis de la carótida y Enfermedad de Moyamoya), angiopatía cerebral amiloide, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolismo cerebral y trombosis tal como trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno y Síndrome de Wallenger, hemorragia cerebral tal como hematoma epidérmico, hematoma subdural, y hemorragia subaracnoide, infarto cerebral, isquemia cerebral tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome de Robo de la Subclavia e insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular tal como demencia multi-infarto, leucomalacia periventricular, dolor de cabeza vascular tal como dolor de cabeza en racimo y migraña.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican la proteínas de fusión de la transferrina incluyen demencia tal como Demencia Compleja por SIDA, demencia presenil, tal como Enfermedad de Alzheimer, y Síndrome de Creutzfeldt-Jakob, demencia senil tal como Enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tal como demencia multi-infarto, encefalitis que incluye encefalitis periaxial, encefalitis vírica, encefalitis epidémica, Encefalitis Japonesa, Encefalitis de San Luis, encefalitis transmitida por garrapatas y Fiebre Del Nilo Occidental, encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como síndrome uveomeningoencefalítico, Enfermedad de Parkinson Postencefálica, y panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada, que incluye espasmos infantiles, epilepsia por ausencia, epilepsia mioclónica que incluye Síndrome de MERRF, epilepsia tónica-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia de lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia post-traumática, estado epiléptico tal como Epilepsia Parcial Continua, y Síndrome de Hallervorden-Spatz.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen hidrocéfalo tal como Síndrome de Dandy-Walker e hidrocéfalo con presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasmas hipotalámicos, malaria cerebral, narcolepsia que incluye catalexia, poliomelitis bulbar, seudotumor cerebral, Síndrome de Rett, Síndrome de Reye, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y Síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central tales como SIDA, Demencia compleja, Absceso Cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tal como Encefalomielitis Equina, Encefalomielitis Equina de Venezuela, Encefalomielitis Hemorrágica Necrotizante, Visna, y malaria cerebral.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen meningitis tal como aracnoiditis, meningitis aséptica tal como meningitis vírica que incluye meningitis linfocítica crónica, meningitis bacterianas, que incluyen Meningitis por Haemophilus, Meningitis por Listera, Meningitis Meningocócica tal como Síndrome de Waterhouse-Friedericlisen, Meningitis Pneumocócica, y tuberculosis meningeal, meningitis fúngica tal como meningitis Criptocócica, derrame subdural, meningoencefalitis, mielitis tal como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsal, poliomelitis que incluye poliomielitis bulbar, y síndrome post poliomielitis, enfermedades priónicas (tales como Síndrome de Creutzfeldt-Jakob, Encefalitis Espongiforme Bovina, Síndrome de Gertsmann-Straussler, Kuru, Scrapie), y toxoplasmosis cerebral.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen neoplasmas del sistema nervioso central tales como neoplasmas cerebrales que incluyen neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas hipotalámicos y neoplasmas supratentoriales, neoplasmas meningeales, neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales, enfermedades desmielinizantes tales como las Enfermedades de Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tal como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis hemorrágica Necrotizante, leucoencefalopatía multifocal progresiva, en esclerosis múltiple, mielinosis pontina central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, Scrapie; Swayback, Síndrome de Fatiga Crónica, Visna, Síndrome Nervioso de Presión Elevada, Meningismo, enfermedades de la médula espinal tales como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como Enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales, siringomielia, Tabes Dorsal, Síndrome de Stiff-Man, retraso mental tal como Síndrome de Angelman, Síndrome del Maullido del Gato, Sindrome de De Lange, Síndrome de Down, Gangliósidos tales como Gangliósidos G (MI), Enfermedad de Sandhoff, Enfermedad de Tay-Sachs, Enfermedad de Hartnup, homocistunuria, Síndrome de Laurence-Moon-Bied, Síndrome de Lesch-Nylian, Enfermedad de la Orina con Olor a Jarabe de Arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, lipofuscinosis ceroide neuronal, síndrome oculocerebrorenal, fenilcetonuria tal como fenilcetonuria materna, Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Rett, Síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis Tuberosa, Sindrome de WAGR, amormalidades del sistema nervioso tales como haloprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia que incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrafismo espinal tal como Espina bífida cística y espina bífida oculta.

El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas abarcan trastornos de la motilidad uterina que incluyen, pero no se limitan a complicaciones con el embarazo y el trabajo (por ejemplo, trabajo pre-término, embarazo pre-término, aborto espontáneo, y trabajo lento o parado); y los trastornos y/o enfermedades del ciclo menstrual (por ejemplo, dismenorrea y endometriosis).

El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas incluyen trastornos y/o enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agenesis pancreática congénita, Feocromocitoma, síndrome tumoral de las células de los islotes; trastornos y/o enfermedades de las glándulas adrenales tales como, por ejemplo, Enfermedad de Addison, deficiencia de corticoesteroides, enfermedad virilizante, hirsutismo, Síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo, Feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de las glándulas pituitarias, tales como, por ejemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanismo pituitario, adenoma de la pituitaria, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; trastornos y/o enfermedades del tiroides, que incluyen, pero no se limitan a, hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer, Enfermedad de Graves (bocio tóxico difuso), bocio tóxico nodular, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silenciosa), síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de la hormona tiroidea, aplasia tímica, tumores de células de Hurthle del tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides., Carcinoma medular de tiroides; trastornos y/o enfermedades de la paratiroides, tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.

Adicionalmente, el sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas pueden incluir los trastornos y/o las enfermedades de los testículos o los ovarios, incluyendo cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades de los testículos o los ovarios incluyen además, por ejemplo, cáncer de ovario, síndrome de ovario poliquístico, síndrome de Klinefelter, síndrome de testículos evanescentes, (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidismo, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar testicular (benigno), neoplasias testiculares y neotesticulares.

Además, el sistema endocrino y/o los trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas pueden incluir también trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo, síndromes por deficiencia poliglandular, Feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple, y trastornos y/o cánceres de los tejidos endocrinos.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para el diagnóstico, tratamiento, o prevención de las enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor. Los trastornos del sistema reproductor que se pueden tratar mediante las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, lesiones del sistema reproductor, infecciones, trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y las enfermedades o los trastornos infertilidad, complicaciones con el embarazo, trabajo, o parto, y dificultades después del parto.

Los trastornos y/o las enfermedades del sistema reproductor incluyen enfermedades y/o trastornos de los testículos, que incluyen atrofia testicular, feminización testicular, criptorquismo (unilateral y bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimitis y orquitis (resultado normalmente de infecciones tales como, por ejemplo, gonorrea, paperas, tuberculosis, y sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa, tumores de las células germinales (por ejemplo, seminomas, carcinomas de las células embrionales, teratocarcinomas, coriocarcinomas, tumores del saco vitelino del testículo, y teratomas), tumores estromales (por ejemplo, tumores de las células de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hernia inguinal, y trastornos de la producción espermática (por ejemplo, síndrome de los cilios inmóviles, espermia, astenozooespermia, azooespermia, oligoespermia, y teratozooespermia).

Los trastornos del sistema reproductor incluyen también trastornos de la glándula prostática, tales como prostatitis no bacteriana aguda, prostatitis no bacteriana crónica, prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica, prostatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa, malacoplakia, hipertrofia o hiperplasia prostática benigna, y trastornos neoplásicos de la próstata, que incluyen adenocarcinomas, carcinomas de células transicionales, carcinomas ductales, y carcinomas de células escamosas.

Adicionalmente, las composiciones descritas en el presente documento pueden ser útiles en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de los trastornos o enfermedades del pene y la uretra, que incluyen trastornos inflamatorios, tales como balanopostitis, balanitis xerotica obliterans, fimosis, parafimosis, sífilis, síndrome de Reites, condiloma acuminado, condiloma latum, pápulas perladas del pene, anormalidades de la uretra, tales como hipospadias, epispadias, y fimosis, lesiones premalignas, que incluyen Eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, paplosis Bowenoide, condiloma gigante inguinal de Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrucoso, cánceres de pene, que incluyen carcinomas de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrucoso, y carcinoma diseminado del pene; trastornos neoplásicos de la uretra, que incluyen carcinoma de la uretra en el pene, carcinoma urotelial bulbomembranoso, y carcinoma prostaticuretral; y trastornos eréctiles, tales como priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunción eréctil, e impotencia.

Además, las enfermedades y/o los trastornos de los vasos deferentes incluyen vasculitis y CBAVD (ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes); adicionalmente, las proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina de la invención, se pueden usar en el diagnóstico, tratamiento, y/o prevención de enfermedades y trastornos de las vesículas seminales, que incluyen enfermedad hidatídica, cloridorrea congénita, y enfermedad del riñón poliquístico.

Otros trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, eyaculación prematura, diabetes mellitus, fibrosis quística, síndrome de Kartagener, fiebre elevada, esclerosis múltiple, y ginecomastia.

Adicionalmente, los polinucleótidos, las proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las enfermedades y/o trastornos de la vagina y la vulva, que incluyen vaginosis bacteriana, vaginitis por candida, virus del herpes simple, cancroide, granuloma inguinal, linfogranuloma venéreo, sarna, virus del papiloma humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenosis, vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas, condiloma acuminado, sífilis, molluscum contagiosum, vaginitis atrófica enfermedad de Paaet, liquen escleroso, liquen plano, vulvodimia, síndrome del choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis, vestibulitis vulvar, y trastornos neoplásicos, tales como hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células claras, carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de la glándula de Bartolino, y neoplasia y neoplasia intraepitelial vulvar.

Los trastornos y/o las enfermedades del útero incluyen dismenorrea, retrodesviación uterina, endometriosis, fibroides, adenomiosis, sangrado anovulatorio, amenorrea, síndrome de Cushiner, molas hidatídicas, síndrome de Asherman, menopausia prematura, pubertad precoz, pólipos uterinos, sangrado uterino disfuncional (por ejemplo, debido a señales hormonales aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas, keiomiosarcomas, y sarcomas. Adicionalmente, las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles como un marcador o detector de, así como, en el diagnóstico, tratamiento, y/o prevención de las anormalidades uterinas congénitas, tales como útero bicorne, útero septado, útero unicorne simple, útero unicorne con cuerno rudimentario sin cavidad, útero unicorne con cuerno rudimentario sin cavidad de comunicación, útero unicorne con cuerno con cavidad de comunicación, útero arcuado, útero didelfo, y útero con forma de T.

Las enfermedades y/o los trastornos de los ovarios incluyen una ovulación, síndrome de ovarios poliquísticos (síndrome de Stein-Leventhal), quistes ováricos, hipofunción de los ovarios, insensibilidad de los ovarios a las gonadotropinas, sobreproducción de andrógenos en los ovarios, síndrome de la vena del ovario derecho, en amenorrea, hirutismo, y cáncer de ovarios (que incluye, pero no se limita a crecimiento canceroso primario y secundario, tumores de Sertoli-Leydig, carcinoma endometrioide del ovario, adenocarcinoma seroso papilar ovárico, adenocarcinoma mucinoso ovárico, y tumores de Krukenberg de los Ovarios.

Las enfermedades y/o los trastornos cervicales incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta, y displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian, erosión cervical; incompetencia cervical, y neoplasmas cervicales (que incluyen, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa, carcinoma de células escamosas, neoplasia de células adenoescamosas, y neoplasia de células columnares.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, aumentando la respuesta inmune, concretamente, aumentando la proliferación y la diferenciación de las células B y/o T, se pueden tratar las enfermedades infecciosas. Se puede aumentar la respuesta inmune tanto potenciando una respuesta inmune existente, como mediante las proteínas de fusión de la invención y/o iniciando una nueva respuesta inmune. Alternativamente, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden inhibir también directamente el agente infeccioso sin estimular necesariamente una respuesta inmune.

Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede producir enfermedad o los síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a los siguientes virus y familias víricas de ADN y ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, VEB, VIH, Flaviviridae, Hepadnaviridae Hepatitis, Herpesviridae (tal como, Cytomegalovirus, Herpes Simplex; Herpes Zoster), Mononegavirus (por ejemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, Gripe A, gripe B, y virus paragripal), virus del Papilloma, Papovaviridae, Parvoviridae, Picomaviridae, Poxviridae (tal como Seudoviruela o Vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-11, -Lentivirus), y Togaviridae (por ejemplo, Rubivirus).

Similarmente, los agentes bacterianos y fúngicos que pueden producir enfermedades o los síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, las siguientes bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, familias bacterianas, y hongos: Actinomyces (por ejemplo., Norcardia), Acinetobacter, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (por ejemplo., Bacillus anthrasis), Bacteroides (por ejemplo, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por ejemplo, Borrelia burgdorferi), Brucella, Candida, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium (por ejemplo, Clostridium botulinum, Clostridium dificile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Coccidioides, Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium diptheriae), Cryptococcus, Dermatomicosis, E. coli (por ejemplo, E. coli Enterotoxigénico y E. coli Enterohemorrágico), Enterobacter (por ejemplo Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus influenzae tipo B), Helicobacter, Legionella (por ejemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (por ejemplo, Vibrio cholerae), Neisseriaceae (por ejemplo, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurellaceae, Proteus, Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, Espiroquetas (por ejemplo, Treponema. spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus), Meningococcus, Pneumococcus and Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y los Grupos A, B, y C de Streptococcus), y Ureaplasmas.

Además, los agentes parasíticos que producen enfermedades o que se pueden tratar, evitar, y/o diagnosticar mediante las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias o clases: Amebiasis, Babesiosis, Coccidiosis, Criptosporidiosis, Dientamoebiasis, Dourina, Ectoparasíticos, Giardias, Helmintiasis, Leishmaniasis, Esquistisomas, Teileriasis, Toxoplasmosis, Tripanosomiasis, y Tricomonas y Esporozoarios (por ejemplo, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale).

\newpage

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina que se pueden usar para diferenciar, proliferar, y las células atractoras que aportando a la regeneración de los tejidos (Véase, Science 276: 59-87 (1997)). Se podría usar la regeneración de los tejidos para reparar, sustituir o proteger del daño en el tejido por defectos congénitos, traumas (heridas, quemaduras, incisiones, o úlceras), la edad, las enfermedades (por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por reperfusión, o daño sistémico por citocinas).

Los tejidos que se podrían regenerar usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético, cardiaco, vasculatura (incluyendo la vascular y la linfática), tejido nervioso, hematopoyético, y esquelético (hueso, cartílago, tendón, y ligamento). Preferiblemente, se produce la regeneración con poca o ninguna cicatrización. La regeneración puede incluir también la angiogénesis.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, que incluyen enfermedades y/o dolencias inflamatorias, infecciones, cánceres (por ejemplo, neoplasmas intestinales (tumor carcinoide del intestino delgado, linfoma no de Hodgkin del intestino delgado, linfoma del intestino delgado), y úlceras, tales como úlceras pépticas.

Los trastornos gastrointestinales incluyen disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis y estructuración submucosal, lesiones de Mallory-Weiss, lipomas, cánceres epidérmicos, adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástrico/de estómago, pólipos de estómago, trastornos autoinmunes como anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, vírica, eosinófila, inducida por estrés, erosiva crónica, atrófica, de células plasmáticas, y de Menetrier) y enfermedades peritoneales (por ejemplo, quiloperitoneo, hemoperitoneo, quiste mesentérico, linfadenitis mesentérica, oclusión vascular mesentérica, paniculitis, neoplasmas, peritonitis, neumoperitoneo, absceso subfrénico.

Los trastornos gastrointestinales incluyen también trastornos asociados con el intestino delgado, tales como el síndrome de mala absorción, distensión, síndrome de intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprúe tropical, enfermedad de Whipple, linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del íleo, divertículo de Meckel, divertículos múltiples, fracaso de la rotación completa del intestino delgado y grueso, linfoma, y enfermedades bactrianas y parasíticas (tales como diarrea del Viajero, tifoideas y paratifoideas, cólera, infección por Áscaris (ascariasis lumbricoides), Anquilostomas (Ancylostoma duodenale), Oxiuros (Enterobius vermicularis), Acantocéfalos Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp. y T. solium).

Las enfermedades y/o los trastornos del hígado incluyen colestasis intrahepática (síndrome de Alagille, cirrosis hepático biliar), hígado graso (hígado graso alcohólico, síndrome de Reye), vena hepática, trombosis de la vena hepática, degeneración hepatolenticular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorenal, hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas), absceso hepático (absceso hepático amébico), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis, parasítica (equinococosis hepática, fascioliasis, absceso hepático amébico), ictericia (hemolítica, hepatocelular, y colestática), colestasis, hipertensión portal, alargamiento del hígado, ascites, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis intrafamiliar, hepatitis crónica (autoinmune, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis vírica humana (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria, encefalopatía hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatía hepática, hemangiomas biliares primarios, cirrosis biliar, colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, piedras, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda), y neoplasmas hepáticos (ancriomiolipoma, metástasis del hígado calcificado, metástasis del hígado quístico, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia focal nodular, adenoma hepático , adenoma quístico hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma Hepatocelular, hepatoma, cáncer de hígado, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimal, tumores mesenquimales del hígado, hiperplasia nodular regenerativa, tumores benignos de hígado (quistes hepáticos, quistes simples, enfermedad del hígado poliquístico, adenoma quístico hepatobiliar, quistes coledocales, tumores mesenquimales, hamartoma mesenquimal, hemangioendotelioma infantil, Hemangioma, Peliosis hepática, lipomas, seudotumor inflamatorio, tumores epiteliales variados, epitelio del conducto biliar (hamartoma del conducto biliar, adenoma del conducto biliar), hepatocitos (adenoma, hiperplasia focal nodular, hiperplasia nodular regenerativa), tumores malignos del hígado (hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma Hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, adenocarcinoma quístico, tumores de los vasos sangíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embriónico, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma carcinoide, carcinoma escamoso, linfoma primario)),peliosis hepática, porfiria eritrohepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutánea tardía), síndrome de Zelli Neger.

Las enfermedades y/o los trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis aguda Necrotizante, pancreatitis alcohólica), neoplasmas (adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma, gastrinoma, y glucacronoma, neoplasmas quísticos, tumores de las células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades pancreáticas (por ejemplo, fibrosis quística, quiste seudopancreático, fístula pancreática. Insuficiencia)).

\newpage

Las enfermedades de la vesícula biliar incluye piedras en la vesícula (colelitiasis y coledocolitiasis, síndrome de postcolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar, colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores del conducto biliar, y mucocele.

Las enfermedades y/o los trastornos del intestino grueso incluyen colitis asociada a antibióticos, diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorectales (por ejemplo, fisuras, hemorroides), enfermedades colónicas (colitis, neoplasia colónica, cáncer de colon, pólipos colónicos adenomatosos (por ejemplo, adenoma velloso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal, diverticulitis colónica, diverticulosis colónica, megacolon, enfermedad de Hirchsprung, megacolon tóxico, enfermedades de las sigmoideas, proctocolitis, neoplasmas sigmoideos, estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis) enteritis (enterocolitis) enteropatía por VIH, enfermedades letales (neoplasias letales, ileitis), enfermedades inmunoproliferativas del intestino delgado, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parasíticas (anisakiasis, balantidiasis, infecciones blastocísticas, criptoesporidiosis, Dientamoebiasis, disentería amebiana, giardiasis), fístula intestinal (fístula rectal), neoplasmas intestinales (neoplasmas cecales, neoplasmas colónicos, neoplasmas duodenales, neoplasmas letales, pólipos intestinales, neoplasias yeyunales, neoplasmas rectal), obstrucción intestinal (síndrome del bucle aferente, obstrucción duodenal, heces impactadas, seudoobstrucción intestinal, vólvulo cecal, intosuscepción, perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers), enfermedades yeyunales (neoplasmas yeyunales), síndromes de mala absorción (síndrome del bucle ciego, enfermedad celíaca, intolerancia a la lactosa, síndrome del intestino corto, esprúe tropical, enfermedad de Whipple), oclusión vascular mesentérica, neumatosis cistoides intestinales, enteropatías con pérdida de proteínas (linfagiectasis intestinal), enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia, perforación , ulcera de estómago, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes de postgastrectomía, (síndrome de dumping), enfermedades del estómago (por ejemplo, aclorhidria, reflujo duedenogástrico (reflujo biliar), ectasia vascular antral gástrica, fístula gástrica, obstrucción de la salid gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica), gastroparesis, dilatación del estómago, divertículos del estómagos, neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipo gástrico hiperplásico), rotura del estómago, úlcera de estómago, vólvulo de estómago), tuberculosis, viesceroptosis, vómitos (por ejemplo, hematemesis hiperemesis grávida, náuseas y vómitos después de operación) y colitis hemorrágica.

Las enfermedades y/o los trastornos del sistema gastrointestinal incluyen las enfermedades del tracto biliar, tales como, gastroesquisis, fístula (por ejemplo, fístula biliar, fístula esofágica, fístula gástrica, fístula pancreática), neoplasmas (por ejemplo, neoplasmas del tracto biliar, neoplasmas esofágicos, tales como adenocarcinoma del esófago, carcinoma de células escamosas esofágicas, neoplasmas gastrointestinales, neoplasmas pancreáticos, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasma quístico mucinoso del páncreas, neoplasmas quísticos pancreáticos, pancreatoblastoma, y neoplasmas peritoneales), enfermedad esofágica (por ejemplo, enfermedades bullosas, candidiasis, acantosis glicogénica, úlcera, varices esofágicas de Barrett, atresia, quistes, divertículos (por ejemplo, divertículos de Zenker), fístula (por ejemplo, fístula traqueoesofágica, trastornos de motilidad (por ejemplo síndrome de CREST, trastornos de la deglución, acalasia, espasmo, reflujo gastroesofágico), neoplasmas, perforación (por ejemplo, síndrome de Boerhaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia de diafragma (por ejemplo, hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como gastroenteritis (por ejemplo, cólera morboso, infección por virus de Norwalk), hemorragia (por ejemplo, hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica), neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, cáncer de estómago)), hernia (por ejemplo, hernia diafragmática congénita, hernia femoral, hernia inguinal, hernia obturadora, hernia umbilical, hernia ventral), y enfermedades intestinales (por ejemplo, enfermedades cecales (apendicitis, neoplasmas cecales)).

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o os polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden tener actividad quimiotáxica. Una molécula quimiotáxica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células mastocíticas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) en un emplazamiento concreto en el cuerpo, tal como inflamación, infección, o emplazamiento de hiperproliferación. Las células movilizadas pueden a continuación rechazar y/o sanar el trauma o anormalidad particular.

Las proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden aumentar la actividad quimiotáxica de las células concretas. Estas moléculas quimiotácticas se pueden usar a continuación para tratar la inflamación, infección, trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmune aumentando el número de células dirigidas hacia una localización concreta en el cuerpo.

Composiciones farmacéuticas orales y procedimientos de administración

Las proteínas de fusión de la Tf incluyen, pero no se limitan a las proteínas de fusión Tf modificada. Los procedimientos de preparación de la Tf y los procedimientos de administración de las proteínas de fusión de la Tf se discuten en la Solicitud de Patente PCT PCT/US03/________________, títulada, "Oral Delivery of Modified Transferrin Fusion Proteins", presentada el 28 de agosto de 2003.

En particular, algunas proteínas de fusión que se usaron para tratar algunos tipos de enfermedades o dolencias médicas pueden ser particularmente adecuadas para la formulación y la administración oral. Dichos tipos de enfermedades o dolencias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades agudas, crónicas y recurrentes. Las enfermedades crónicas y recurrentes incluyen, pero no se limitan a enfermedades o infecciones víricas, cáncer, enfermedades ametabólicas, obesidad, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatoria, alergia enfermedad de injerto contra huésped, infección microbiana sistémica, anemia, enfermedad cardiovascular, sicosis, enfermedades genéticas, enfermedades neurodegenerativas, trastornos de las células hematopoyéticas del sistema endocrino o los sistemas reproductores, enfermedades gastrointestinales. Los ejemplos de estos tipos de enfermedades incluyen diabetes, esclerosis múltiple, asma, infecciones por VHC o VIH, hipertensión, hipercolesterolemia, esclerosis arterial, artritis, y enfermedad de Alzheimer. En muchas enfermedades crónicas, las formulaciones orales de las proteínas de fusión de la Tf y los procedimientos de administración son particularmente útiles debido a que permiten la atención sanitaria y la terapia a largo plazo del paciente mediante la administración oral en su casa sin dependencia de tratamiento inyectable o protocolos farmacológicos.

Las formulaciones orales y los procedimientos de administración que comprenden proteínas de fusión de la Tf se aprovechan, en parte, de la transcitosis mediada por el receptor de la transferrina a través del epitelio gastrointestinal (GI). El receptor de la Tf se encuentra en una densidad muy elevada en el epitelio GI humano, la transferrina es muy resistente a la digestión tríptica y quimiotríptica y se han usado conjugados químicos de la Tf satisfactoriamente para administrar las proteínas y los péptidos a través del epitelio GI (Xia y col., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600; Xia y col. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2): 191-195; y Shah y col. (1996) J. Pharmaceutical Sci., 85(12): 1306-1311). Una vez trasportadas a través del epitelio GI, las proteínas de fusión de la Tf presentan una semivida prolongada en suero, esto es, la proteína o el(los) péptidos unidos o insertados en Tf presentan una semivida circulatoria in vivo prolongada, en comparación con la proteína o el péptido en su estado no fusionado.

Se pueden preparar formulaciones orales de las proteínas de fusión de la Tf de tal manera que sean adecuadas para el trasporte al epitelio GI y la protección del componente de la proteína de fusión de la Tf y otros componentes activos en el estómago. Dichas formulaciones pueden incluir los componentes del vehículo y el dispersante y pueden estar en cualquier forma adecuada, incluyendo aerosoles (para administración oral o pulmonar), jarabes, comprimidos, que incluyen comprimidos masticables, cápsulas, comprimidos gruesos, pastillas para chupar, sellos o bolitas granuladas y polvos. Contempladas también para el uso en el presente documento están otras formas de dosificación sólida orales, que se describen generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) en el Capítulo 89.

Muchas de las formulaciones orales pueden contener también ingredientes inertes que permiten la protección frente al ambiente del estómago, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino. Se conocen bien en la técnica dichas formulaciones, o recubrimientos entéricos. En una realización particularmente preferida, las composiciones farmacéuticas orales de la invención se formulan en forma líquida tamponada que se encapsula a continuación en cápsulas recubiertas de gelatina blanda o dura que se reviste a continuación con un revestimiento entérico apropiado. Para las composiciones de administración oral de la invención, la ubicación de la liberación puede ser cualquier parte del sistema GI, incluyendo el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno, o el íleo), o el intestino grueso.

Los vehículos o dispersantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones acuosos, sacarosa, lactosa, almidón, aceites grasos, ésteres de ácidos grasos, polisacáridos, monoglicéridos, triglicéridos, emulsificantes de fosfolípidos, emulsificantes no iónicos y arcillas coloidales refinadas. Se pueden formular también las composiciones farmacéuticas para la administración oral usando microesferas de poliéster, microesferas de zein, microesferas de proteinoides, microesferas de policianoacrilato, y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, Oral Delivery of Microencapsulated Proteins, ``in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). En otras realizaciones, las composiciones orales se formulas para liberar lentamente los ingredientes activos, incluyendo las proteínas de fusión de la Tf de la invención, en el sistema GI usando formulaciones conocidas de liberación retardada.

Las proteínas de fusión de la Tf de la invención para la administración oral son capaces de unirse al receptor de Tf que se encuentra en el epitelio GI. Para facilitar esta unión y el trasporte mediado por el receptor, las proteínas de fusión de la Tf de la invención se producen normalmente con hierro, y en algunos ejemplos, carbonato, unido al resto de Tf. Se conocen en la técnica las procesos y los procedimientos para introducir el resto de Tf de las composiciones de las proteínas de fusión de la invención con hierro y carbonato.

En algunas formulaciones farmacéuticas, el resto de Tf de la proteína de fusión de Tf se puede modificar para aumentar la afinidad o la avidez del resto de Tf por el hierro. Se conocen dichos procedimientos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la mutagénesis para producir restos de transferrina mutantes que se unen al hierro con más avidez que la transferrina natural. En la transferrina de suero humano, los aminoácidos que son ligandos para la quelación del ión metálico incluyen, pero no se limitan a los lóbulos N de los aminoácidos Asp63, Tyr 95, Tyr188, Lys206, His207 e His249; y los lóbulos C de los aminoácidos Asp392, Tyr426, Tyr517 e His584 (el número al lado del aminoácido indica la posición del resto de aminoácido en la secuencia principal de aminoácidos en el que la valina de la proteína madura se designa como posición 1) Véase la Patente de los Estados Unidos 5.986.067. En una realización, los restos de Lys206 e His207 en el interior del lóbulo N están sustituidos con Gln y Glu; respectivamente.

En algunas formulaciones farmacéuticas, la proteína de fusión de la Tf se construye mediante ingeniería genética para que contenga un emplazamiento de rotura entre la proteína o el péptido terapéutico y la del resto de Tf. Se conocen en la técnica dichos emplazamientos de rotura o enlazantes.

Las composiciones y procedimientos farmacéuticos pueden incluir la adición de un potenciador de la transcitosis para facilitar la transferencia de la proteína de fusión a través del epitelio GI. Se conocen dichos potenciadores en la técnica. Véase Xia y col., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295: 594-600; y Xia y col. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2): 191-195.

Las formulaciones farmacéuticas orales pueden incluir proteínas de fusión de Tf que comprenden un resto de Tf modificado que presenta una glicosilación reducida o ninguna glicosilación fusionada al extremo N terminal de una proteína o péptido de insulina o GLP-1 según se describe anteriormente. Se pueden usar dichas composiciones farmacéuticas para tratar trastornos de desequilibrio de glucosa tales como diabetes, mediante administración oral de la composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de la proteína de fusión.

Se puede medir de numerosos modos la dosis eficaz de la proteína de fusión, entre los que se incluyen las dosificaciones calculadas para aliviar los síntomas asociados con un estado específico de enfermedad en un paciente, síntomas como los de diabetes. En otras formulaciones, las dosificaciones se calculan para comprender una cantidad eficaz de la proteína de fusión para inducir un cambio detectable en los niveles de glucosa en sangre de entre aproximadamente un 1% y un 90%, o entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 80%. Estas disminuciones en los niveles de glucosa en sangre serán dependientes del estado de enfermedad que se está tratando y las composiciones farmacéuticas o los procedimientos de administración se pueden modificar para conseguir el resultado deseado para cada paciente. En otros ejemplo, se formulan las composiciones farmacéuticas y se modifican los procedimientos de administración para detectar un aumento en el nivel de actividad de la proteína o péptido terapéutico en el paciente, por ejemplo, aumentos detectables en las actividades de la insulina o GLP-1. Dichas formulaciones y procedimientos pueden liberar entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de la proteína de fusión, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 \mug/kg de peso corporal de la proteína de fusión, aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de la proteína de fusión, aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1 g de la proteína de fusión, aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 100 mg de la proteína de fusión o aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg de la proteína de fusión. Se pueden calcular también las formulaciones usando una medida unitaria de la actividad de la proteína terapéutica, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 unidades de insulina humana o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 unidades de insulina humana. Se pueden calcular las medidas ponderales o la actividad usando patrones conocidos de cada proteína o péptido terapéutico fusionado a Tf.

Se describen también en el presente documento los procedimientos para administrar oralmente las composiciones farmacéuticas. Dichos procedimientos pueden incluir, pero no se limitan a, etapas de administración oral de las composiciones por el paciente o un profesional sanitario. Dichas etapas de administración pueden incluir la administración en intervalos tales como una vez o dos veces por día dependiendo de la proteína de fusión de la Tf, la enfermedad o dolencia del paciente o el paciente individual. Dichos procedimientos incluyen también la administración de varias dosificaciones de la proteína de fusión de la Tf individual. Por ejemplo, la dosificación inicial de una composición farmacéutica puede ser a un nivel mayor para inducir un efecto deseado, tal como una reducción de los niveles de glucosa en sangre. A continuación se pueden disminuir las dosificaciones posteriores una vez se ha conseguido el efecto deseado. Se pueden llevar a cabo estos cambios o modificaciones en los protocolos de administración por el médico a cargo del paciente o el profesional sanitario. En algunos ejemplos, se pueden llevar a cabo los cambios en el protocolo de administración por el paciente individual, tal como cuando un paciente se vigila los niveles de glucosa en sangre y se administra una insulina-mTf o una composición oral de mTf-GLP-1.

Se describen también en el presente documento los procedimientos para producir composiciones orales o composiciones de medicamento que comprender formular una proteína de fusión de la Tf en una forma adecuada para administración oral. La solicitud describe también los procedimientos para producir composiciones o composiciones de medicamento que comprenden formular una proteína de fusión de la Tf en una forma adecuada para la administración oral.

Animales transgénicos

Se contempla la producción de animales transgénicos no humanos que contienen un constructo de fusión de la transferrina modificada con semivida prolongada en suero, estabilidad prolongada en suero o biodisponibilidad aumentada de la presente invención. Se puede usar lactoferrina como la porción de Tf de la proteína de fusión de tal manera que se produce y segrega la proteína de fusión en leche.

Se ha descrito la producción satisfactoria de animales transgénicos no humanos en numerosas patentes y publicaciones, tales como, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos 6.291.740 (otorgada el 18 de septiembre de 2001); la patente de los Estados Unidos 6.281.408 (otorgada el 28 de agosto de 2001); y la Patente de los Estados Unidos 6.271.436 (otorgada el 7 de agosto de 2001).

La capacidad de alterar el componente genético de animales, tal como de mamíferos domesticados que incluyen vacas, cerdos, cabras, caballos, ganado, y ovejas, permite numerosas aplicaciones comerciales. Estas aplicaciones incluyen la producción de animales que expresan grandes cantidades de proteínas exógenas en una forma fácilmente cosechable (por ejemplo, expresión en leche o sangre), la producción de animales con mayor ganancia de peso , eficiencia de la alimentación, composición de la carcasa, producción o contenido de leche, resistencia a enfermedad y resistencia a la infección por microorganismos específicos y la producción de animales que tienen índices de crecimiento o comportamiento reproductor potenciados. Los animales que contienen secuencias de ADN exógeno en su genoma se denominan animales transgénicos.

El procedimiento más ampliamente usado para la producción de animales transgénicos es la microinyección de ADN en los pronúcleos de los animales fertilizados (Wall y col., J. Cell. Biochem. 49:113 [1992]). Otros procedimientos para la producción de animales transgénicos incluyen la infección de embriones con retrovirus o con vectores retrovíricos. Se ha informado de la infección de embriones de ratón antes y después del implante con retrovirus de tipo natural o recombinante (Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260 [1976]; Janenich y col., Cell 24: 519 [1981]; Stuhlmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7151 [1984]; Jahner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6927 [1985]; Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6148-6152; Stewart y col., EMBO J. 6: 383-388 [1987]).

Un medio alternativo para infectar embriones con retrovirus es la inyección de virus o células que producen virus en el blastocele de embriones de ratón (Jahner, D. y col., Nature 298: 623 [1982]). Se ha informado de la introducción de transgenes en la línea germinal de ratones usando infección retrovírica intrauterina de embriones de ratón parcialmente gestados (Jahner y col., más arriba [1982]). Se ha informado de la infección de embriones de bovino y ovino con retrovirus o vectores retrovíricos para crear animales transgénicos. Estos protocolos implican la microinyección de partículas retrovíricas o células con el crecimiento detenido (es decir, tratadas con mitomicina C) que expiden partículas retrovíricas al espacio perivitelino de los huevos fertilizados o los embriones tempranos (La Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 [1990]; y Haskell y Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]. La Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 describe la inyección del virus B de la leucemia de felinos de tipo natural en el espacio perivitelino de embriones de oveja en las etapas celulares 2 a 8. Los fetos derivados de los embriones inyectados mostraron contener múltiples emplazamientos de integración.

La Patente de los Estados Unidos 6.291.740 (otorgada el 18 de septiembre de 2001) describe la producción de animales transgénicos mediante la introducción de ADN exógeno en los oocitos premaduros y maduros, los oocitos no fertilizados (es decir, la prefertilización de los oocitos) usando vectores retrovíricos que traducen las células en división (por ejemplo, vectores derivados del virus de la leucemia de murino [VLM]). Esta patente describe también los procedimientos y las composiciones para el promotor que impulsa el citomegalovirus, así como la expresión de diversas proteínas recombinantes de LTR en un tumor mamario de ratón.

La Patente de los Estados Unidos 6.281.408 (otorgada el 28 de agosto de 2001) describe los procedimientos para producir animales transgénicos usando células troncales embriónicas. De manera breve, se usaron células troncales embriónicas en un cultivo simultáneo de células mixtas con mórula para generar animales transgénicos. Se introdujo el material genético extraño en las células troncales embriónicas antes del cultivo simultáneo mediante, por ejemplo, electroporación, microinyección o liberación retrovírica. Se seleccionaron las células ES transfectadas de esta manera para las integraciones en el gen mediante un marcador de selección tal como neomicina.

La Patente de los Estado Unidos 6.271.436 (otorgada el 7 de agosto de 2001) describe la producción de animales transgénicos usando procedimientos que incluyen el aislamiento de células germinales primordiales, cultivando estas células para producir líneas de células derivadas de células germinales primordiales, transformando las células germinales primordiales y las líneas celulares cultivadas, y usando estas células transformadas y las líneas celulares para generar animales transgénicos. Se aumentó mucho la eficiencia a la cual se generaron los animales transgénicos, permitiendo por tanto el uso de la recombinación homóloga en la producción de especies animales transgénicas no roedores.

Terapia génica

Se contempla el uso de los constructos de transferrina modificada para la terapia génica en los que una proteína de transferrina modificada o región de transferrina se une a una proteína o péptido terapéutico. Los constructos de fusión de la transferrina modificada con semivida en suero o estabilidad en suero aumentadas son idealmente adecuados para los tratamientos de terapia génica.

Se ha descrito el uso satisfactorio de la terapia génica para expresar una proteína de fusión soluble. De manera breve, se demostró recientemente la terapia génica mediante inyección de un vector de adenovirus que contiene un gen que codifica una proteína de fusión soluble constituida por el antígeno 4 de los linfocitos citotóxicos (CTL4) y la porción Fc de la inmunoglobulina G1 humana en Ijima y col. (Human Gene Therapy (Estados Unidos) 12/9: 1063-77,2001). En esta aplicación de la terapia génica, se trató satisfactoriamente un modelo de artritis inducida por colágeno de tipo II en murino, mediante la inyección intraarticular del vector.

Se describe también la terapia génica en numerosas patentes de los Estados Unidos que incluyen la patente de los Estados Unidos 6.225.290 (otorgada el 1 de mayo de 2001); la Patente de los Estados Unidos 6.187.305 (otorgada el 13 de febrero de 2001); y la Patente de los Estados Unidos 6.140.111 (otorgada el 31 de octubre de 2000).

La Patente de los Estados Unidos 6.225.290 proporciona los procedimientos y constructos en los que células epiteliales intestinales de un sujeto mamífero se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen que expresa una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado. Se llevó a cabo la transformación celular intestinal mediante la administración de una formulación compuesta principalmente por ADN desnudo, y el ADN se puede administrar oralmente. Las rutas de administración oral y otras rutas gastrointestinales proporcionan un procedimiento sencillo de administración, mientras que el uso de ácido nucleico desnudo evita las complicaciones asociadas con el uso de vectores víricos para llevar a cabo la terapia génica. La proteína expresada se segregó directamente en el tracto gastrointestinal y/o el torrente sanguíneo para obtener niveles terapéuticos en sangre de la proteína tratando al paciente necesitado de la proteína. Las células epiteliales intestinales transformadas proporcionan curas terapéuticas a corto o largo plazo de las enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína concreta o que son adecuadas para el tratamiento mediante la sobreexpresión de una proteína.

La Patente 6.187.305 proporciona los procedimientos para dirigir un gen o ADN en células de vertebrados, particularmente de origen mamífero. Se introdujo el ADN en las células primarias o secundarias de origen vertebrado mediante la recombinación homóloga o dirigiendo el ADN, que se introdujo en el ADN genómico de las células primarias o secundarias en un emplazamiento preseleccionado.

La Patente de los Estados Unidos 6.140.111 (otorgada el 31 de octubre de 2000) describe vectores retrovíricos de terapia génica. Los vectores retrovíricos que se dan a conocer incluyen un emplazamiento de inserción para los genes de interés y son capaces de expresar elevados niveles de la proteína derivada de los genes de interés en una amplia variedad de tipos celulares transfectados. Se dan a conocer también los vectores retrovíricos que carecen de un marcador seleccionable, volviéndolos de esta manera adecuados para la terapia génica humana en el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad sin la expresión simultánea de un producto marcador, tal como un antibiótico. Estos vectores retrovíricos son especialmente adecuados para el uso en algunas líneas celulares de empaquetamiento. La capacidad de los vectores retrovíricos para insertarse en el genoma de las células de mamífero les hace ser candidatos particularmente prometedores para uso en la terapia génica de las enfermedades genéticas en seres humanos y animales. La terapia génica implica normalmente (1) añadir nuevo material genético a las células del paciente in vivo, o (2) eliminar células del paciente del cuerpo, añadir nuevo material genético a las células y reintroduciéndolo en el cuerpo, es decir, terapia génica in vitro. Se pueden encontrar discusiones sobre cómo llevar a cabo la terapia génica en una variedad de células usando vectores retrovíricos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 4.868.116, otorgada el 19 de septiembre de 1989, y 4.980.286, otorgada el 25 de diciembre de 1990 (células epiteliales), los documentos WO89/07136 publicado el 10 de agosto de 1989 (células hepatocitos), EP 378.576 publicado el 25 de julio de 1990 (células fibroblastos), y WO89/05345 publicado el 15 de Junio de 1989 y WO/90/06997, publicado el 28 de junio de 1990 (células endoteliales).

Bibliotecas de péptidos

Un aspecto cada vez más importante en el desarrollo biofarmacéutico de fármacos y de la biología molecular es la identificación de las estructuras de los péptidos, incluyendo las secuencias primarias de los aminoácidos de los péptidos o los peptidomiméticos que interactúan con las macromoléculas biológicas. Un procedimiento para identificar los péptidos que poseen una estructura o propiedad funcional deseada, tal como la unión a una macromolécula biológica predeterminada (por ejemplo, un receptor) implica el cribado de una gran biblioteca de péptidos de los miembros individuales de la biblioteca que poseen la estructura o la propiedad funcional deseada conferida por la secuencia de aminoácidos del péptido.

El cribado de las bibliotecas combinatorias para fármacos potenciales o antígenos diana terapéuticamente relevantes es un campo importante y en rápido desarrollo. Las bibliotecas de péptidos son un importante subconjunto de estas bibliotecas. Sin embargo, con el fin de expresar y posteriormente cribar los péptidos funcionales en las células, los péptidos necesitan expresarse en cantidad suficiente para superar mecanismos catabólicos tales como la proteólisis. Los péptidos pueden estabilizarse también conformacionalmente en relación con los péptidos lineales para permitir una mayor afinidad de unión por sus dianas celulares. Adicionalmente, la medida del nivel de expresión de estos péptidos puede ser difícil, puede ser generalmente difícil seguir la expresión de los péptidos en células específicas para discernir si cualquier célula concreta está expresando un miembro de la biblioteca.

Para superar estos problemas, la patente de los Estados Unidos 6.562.617 da a conocer proteínas de fusión que comprenden proteínas estructurales, incluyendo las variantes, y péptidos aleatorios que se fusionan de tal manera que la organización de la proteína estructural no se perturba significativamente y el péptido se estabiliza metabólica y conformacionalmente. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que se controla fácilmente, tanto en lo que concierne a su presencia en el interior de las células como a su cantidad. De esta manera, los péptidos en el interior o fusionados a una proteína estructural se muestran sobre o en la superficie de la estructura, siendo por tanto accesibles para la interacción con dianas funcionales potenciales.

La presente invención se dirige a fusiones de las proteínas transferrina (Tf), incluyendo variantes, y a los péptidos aleatorios que se fusionan de tal manera que la estructura del péptido se estabiliza metabólica y conformacionalmente. La presente invención proporciona Tf como una proteína estructural para generar bibliotecas de péptidos.

Proteína estructural

La presente invención proporciona bibliotecas de fagos con péptido que contienen proteínas de fusión de la transferrina que comprenden Tf y uno o más péptidos fusionados a ésta en la que el péptido de Tf tiene una afinidad reducida por un receptor de la transferrina (TfR). Tf actúa como proteína estructural para estabilizar y aumentar la semivida de los péptidos.

Por "proteína estructural", "polipéptido estructural", "estructura" o sus equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende una proteína a la cual se pueden fusionar secuencias de aminoácidos, tales como péptidos aleatorios. Los péptidos son exógenos respecto de la estructura, esto es, no se presentan normalmente en la proteína. Tras la fusión, la proteína estructural permite usualmente la presentación de péptidos aleatorios de tal manera que sean accesibles a otras moléculas. Las proteínas estructurales se clasifican en diversos tipos, incluyendo, proteínas indicadoras (que incluyen proteínas detectables, proteínas de supervivencia e, indirectamente, proteínas detectables), y las proteínas estructurales.

Por "proteína indicadora" o sus equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende una proteína que por su presencia en o sobre una célula o cuando se segrega en el medio permite que se pueda distinguir la célula de una célula que no contiene la proteína indicadora. La célula comprende normalmente un gen indicador que codifica la proteína indicadora. Los genes indicadores se clasifican en diversos tipos, según se ha reseñado anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a, genes de detección, genes indirectamente detectables, y genes de supervivencia.

La proteína estructural podría ser una proteína detectable. Una "proteína detectable" o "proteína de detección" (codificada por un gen detectable o de detección) es una proteína que se puede usar como una marca directa, esto es, la proteína es detectable (y preferiblemente, una célula que comprende la proteína detectable es detectable) sin manipulaciones o constructos adicionales. Una realización del cribado utiliza la clasificación celular (por ejemplo mediante FACS) para detectar la expresión de la estructura (y de esta manera la biblioteca de péptidos). De esta manera, el producto de la proteína del propio gen indicador puede servir para distinguir las células que expresan el gen detectable.

Las proteínas indicadoras son aquellas que permiten que las células que contienen proteínas indicadoras se distinguan de las que no las contienen. Las proteínas estructurales permiten que los péptidos tengan diferentes desviaciones estructurales y son a menudo deseables debido a que diferentes proteínas u otras dianas funcionales pueden requerir péptidos de diferentes estructuras específicas para interactuar estrechamente con su superficie o los emplazamientos de unión en hendidura. De esta manera, se pueden utilizar diferentes bibliotecas, cada una con diferente desviación estructural, para maximizar las posibilidades de tener miembros con elevada afinidad para una variedad de dianas diferentes. De esta manera, por ejemplo, se pueden preparar bibliotecas de péptidos aleatorios con una desviación helicoidal o la desviación de la estructura extendida mediante fusión con el término N y/o el término C de las proteínas Tf estructurales. Similarmente, se pueden preparar bibliotecas de péptidos aleatorios con una desviación superenrollada mediante fusión con el término N y/o el término C de las proteínas Tf estructurales. Se pueden preparar conformaciones extendidas de la biblioteca aleatoria usando inserciones entre proteínas Tf estructurales dimerizantes. Otras conformaciones de la biblioteca aleatoria utilizan formaciones en bucle mediante la inserción en bucles en las proteínas Tf estructurales; se pueden sustituir los restos de aminoácidos en el interior de la estructuras en bucle respectivas por la biblioteca de péptidos aleatorios o se puede insertar la biblioteca de péptidos aleatorios entre dos restos de aminoácidos localizados en el interior de una estructura en bucle.

Según esto, se pueden escoger los armazones de Tf con la estructura deseada para generar una biblioteca. Por ejemplo, la estructura podría contener únicamente la región N de Tf. También, la presente invención incluye Tf fusionada a una proteína indicadora o a una proteína detectable. Alternativamente, se podría etiquetar Tf para la detección.

Una proteína estructural tal como Tf o el gen que codifica ésta puede ser de tipo natural o variantes de la misma. Estas variantes se clasifican en uno o más de tres tipos: variante sustitucional, insercional o deleccional. Estas variantes se preparan ordinariamente mediante mutagénesis específica del emplazamiento de los nucleótidos en el ADN que codifica la proteína estructural, usando mutagénesis de casete o mediante la PCR u otras técnicas bien conocidas en la técnica, para producir un ADN que codifica la variante, y expresar a continuación el ADN en el cultivo celular recombinante tal como se ha reseñado en el presente documento. Sin embargo, se pueden preparar fragmentos variantes de la proteína que tienen hasta aproximadamente 100-150 restos mediante síntesis in vitro usando las técnicas establecidas. Las variantes de la secuencia de aminoácidos se caracterizan por la naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las separa de la variación alélica o interespecie que se produce naturalmente de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural. Las variantes presentan normalmente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo que se produce naturalmente, aunque se pueden seleccionar también variantes que tienen características modificadas que se reseñarán más completamente a continuación.

Como se discutió al principio, para generar proteínas de fusión de la Tf, el péptido se puede fusionar con el término N o el término C, o se puede insertar en la estructura de Tf. Se puede añadir el péptido a la estructura de la Tf o se puede sustituir o reemplazar una porción, tal como un bucle o parte de un bucle de la estructura de Tf.

En un aspecto de la invención se fusiona un péptido aleatorio a una estructura de Tf, para formar una proteína de fusión. La proteína de fusión podría incluir también elementos adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, compañeros y enlazantes de fusión.

Generación de bibliotecas de péptidos

El aislamiento de ligandos que se unen a dianas biológicas es fundamental para descubrir nuevas terapéuticas. La capacidad para Sintetizar ADN químicamente ha hecho posible la construcción de colecciones extremadamente grandes de ácido nucleico y secuencias de péptidos como potenciales ligandos. Procedimientos recientemente desarrollados permiten un eficiente cribado de las bibliotecas para las actividades de unión deseadas (véase Pluckthun y Ge, 1991, Angew. Chem. Int Ed. Engl. 30:296-298).

En general, se podrían generar bibliotecas de péptidos aleatorios para identificar tanto péptidos que se unen a moléculas diana de interés como productos génicos que modifican los péptidos o el ARN de una manera deseada. Los péptidos se producen a partir de bibliotecas de vectores de expresión de péptidos aleatorios que codifican los péptidos unidos a una proteína estructural. Un procedimiento de enriquecimiento por afinidad permite cribar una biblioteca muy grande de péptidos y seleccionar el vector que trasporta el(los) péptido(s) deseado(s). A continuación se puede aislar el ácido nucleico a partir del vector y secuenciarse para deducir la secuencia de aminoácidos del péptido deseado. Usando estos procedimientos se puede identificar un péptido que tenga una afinidad de unión deseada por una molécula. A continuación se puede sintetizar el péptido masivamente mediante medios convencionales.

Se pueden usar bibliotecas de péptidos aleatorios para identificar péptidos con afinidad por una amplia variedad de moléculas diana, tales como receptores, pequeñas moléculas, macromoléculas y similares. Los ejemplos de péptidos incluyen, pero no se limitan a factores de crecimiento, hormonas, sustratos de enzimas, interferones, interleucinas, mensajeros intracelulares e intercelulares, lectinas, moléculas de adhesión celular, y similares. La presente invención usa también bibliotecas de péptidos aleatorios para identificar análogos y miméticos de estos péptidos.

El documento US. 5.270.170 da a conocer una biblioteca de péptidos aleatorios construida transformando células huésped con una colección de vectores recombinantes que codifican una proteína de fusión comprendida por una proteína de unión al ADN y un péptido aleatorio y que codifica también un emplazamiento de unión para la proteína de unión al ADN que se va a usar para cribar los ligandos novedosos.

Se han propuesto en la técnica diversas soluciones para generar y cribar grandes bibliotecas de secuencias de péptidos aleatorios y seudoaleatorios adecuados para el cribado, selección e identificación de los miembros individuales de la biblioteca deseados.

En general, el camino más sencillo para crear un gran número de secuencias diversas implica la síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido aleatorio de longitud 24 codifica todos los péptidos posibles de longitud 8, un número que excede a diez billones. La biblioteca normalmente varía de tamaño desde al menos algunos cientos a aproximadamente cien millones de especies individuales. Dichas bibliotecas pueden implicar todos los péptidos posibles de longitud 6, o pueden implicar subconjuntos de bibliotecas compuestos de secuencias más largas.

También se pueden generar bibliotecas a partir de secuencias de ADN natural tales como ARNm o ADN genómico. Normalmente dichas bibliotecas se desviarían hacia las proteínas naturales y los fragmentos de proteínas. De esta manera, estas bibliotecas pueden contener una fracción significativa de las secuencias que codifican polipéptidos que interactúan con las proteínas naturales en la célula. Cuando dichos fragmentos se insertan en la estructura, pueden plegarse en una conformación que asemeja una región que procede de la proteína análoga natural de la cual se derivan (Bartel P. L., Roecklein J. A., y col. Nat Genet January 1996; 12(1): 72-77).

Usando técnicas conocidas de ADN recombinante (véase generalmente, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, incorporadas por referencia en el presente documento) se puede sintetizar un oligonucleótido que, entre otros, elimina emplazamientos de restricción no deseados y añade otros deseados, que reconstruyen las porciones correctas de cualquier secuencia que se ha eliminado, insertan los restos separadores, conservados, o del marco, si acaso, y corrige el marco de traducción (si es necesario) para producir una proteína de fusión activa constituida por una proteína estructural y un péptido aleatorio. La porción central del oligonucleótido contendrá generalmente una o más secuencias de codificación del péptido aleatorio (dominio de la región variable)y un separador o los restos del marco. Las secuencias se expresan de manera última como péptidos (con o sin separador o los restos del marco) fusionados a o en la proteína estructural.

El dominio de la región variable del oligonucleótido codifica una característica clave de la biblioteca: el péptido aleatorio. El tamaño de la biblioteca variará según el número de codones variables, y por tanto del tamaño de los péptidos, que se desean. Generalmente la biblioteca tendrá al menos 10^{6} a 10^{8} o más miembros, aunque en algunas circunstancias pueden ser bastante útiles bibliotecas más pequeñas. Para generar la colección de oligonucleótidos que forma una serie de codones que codifica una colección aleatoria de aminoácidos y que se clona finalmente en el vector, se usa un motivo de codón, tal como (NNK)_{x}, en el que N puede ser A, C, G, o T (nominalmente equimolar), K es G o T (nominalmente equimolar (y x es normalmente hasta aproximadamente 5, 6, 7 u 8 o más, produciéndose por tanto bibliotecas de penta, hexa, hepta, y octapéptidos o más. La tercera posición puede ser también G o C, designados "S". De esta manera, NNK o NNS (i) codifica todos los aminoácidos, (ii) codifica únicamente un codón de detención, y (iii) reduce el intervalo de desviación del codón desde 6: 1 a 3:1. Existen 32 posibles codones resultantes del motivo NNK. 1 para cada uno de 12 aminoácidos, 2 para cada uno de 5 aminoácidos, 3 para cada uno de 3 aminoácidos, y únicamente uno de los tres codones de detención. Con péptidos más largos, el tamaño de la biblioteca que se genera puede convertirse en una restricción en el procedimiento de clonación, pero se pueden muestrear bibliotecas más grandes.

Un motivo de codón (NNK)_{x} a modo de ejemplo produce 32 codones, uno para cada uno de 12 aminoácidos, dos para cada uno de cinco aminoácidos, tres para cada uno de tres aminoácidos y un codón de detención (ámbar). Aunque este motivo produce una distribución de codones tan igualitaria como es posible con los procedimientos estandarizados de síntesis de oligonucleótidos, da como resultado una desviación contra los péptidos que contienen restos con un de codón. Por ejemplo, una colección completa de hexacodones contiene una secuencia que codifica cada péptido compuesta por un único codón de aminoácidos, pero contiene 729 (3^{6}) secuencias que codifican cada péptido con tres codones de aminoácidos.

Una solución alternativa que minimiza la desviación frente a un resto de codón implica la síntesis de 20 trinucleótidos activados, representando cada uno el codón de uno de los 20 aminoácidos codificados genéticamente. Estos trinucleótidos se sintetizan por medios convencionales, se retiran del soporte con la base y los grupos protectores 5-OH intactos, y se activan mediante la adición de 3'-O-fosforoamidita (y protección del fosfato con grupos beta-cianoetilo) mediante el procedimiento usado para la activación de mononucleósidos descrito en McBride y Caruthers, 1983, Tetr. Letters 22: 245, que se incorpora por referencia en el presente documento.

Se prepararon "oligocodones" degenerados usando estos trímeros como bloques de construcción. Se mezclaron los trímeros a las relaciones molares deseadas y se instalaron en el sintetizador. Las relaciones serán usualmente equimolares, pero puede ser una relación desigual controlada para obtener desde la sobre-hasta la infrarrepresentación de algunos aminoácidos codificados por la colección de oligonucleótidos degenerados. Se llevó a cabo la condensación de los trímeros para formar los oligocodones esencialmente según se ha descrito para la síntesis convencional empleando mononucleósidos activados como bloques de construcción. Véase generalmente, Atkinson y Smith, 1984, Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.), pp. 35-82. Este procedimiento genera una población de oligonucleótidos para clonación que es capaz de codificar una distribución equitativa (o una distribución desigual controlada) de las posibles secuencias de péptidos. Esta solución puede ser especialmente útil en la generación de secuencias de péptidos más largas, debido a que aumenta el intervalo de desviación producido por el motivo (NNK)_{X} en tres veces con cada resto de aminoácido adicional.

Cuando el motivo del codón es (NNK)_{X}, según se ha definido anteriormente, y cuando X es igual a 8, existen 2,6 x 10^{10} octapéptidos posibles. Se puede producir una biblioteca que contenga la mayor parte de los octapéptidos, pero se puede construir más convenientemente un muestreo de los octapéptidos preparando únicamente un subconjunto de la biblioteca usando aproximadamente un 0,1% y hasta tanto como un 1%, 5%, o 10% de las posibles secuencias, cuyo subconjunto de vectores recombinantes se criba a continuación. A medida que el tamaño de la biblioteca aumenta, son aceptables porcentajes más pequeños. Si se desea, para extender la diversidad de un subconjunto de biblioteca se puede someter el subconjunto de vectores recuperado a mutagénesis y a continuación someterlos a posteriores ciclos de cribado. Esta etapa de mutagénesis puede llevarse a cabo de dos formas generales: se puede mutagenizar la región variable del fago recuperado o se pueden añadir aminoácidos variables adicionales a las regiones adjuntando las secuencias variables iniciales.

Los ejemplos de otros tipos de bibliotecas de péptidos aleatorios que se han construido incluyen los siguientes: (NNK)_{10}, TGT(NNK)_{n}TGT, (NNK)_{2}TGT(NNK)_{14}TGT (NNK)_{2}, TGT(NNK)_{9}, (NNK)_{2}TGT(NNK)_{18}.

Bibliotecas de péptidos de transferrina

La presente invención proporciona bibliotecas de fagos con péptidos de transferrina (Tf) que contienen una pluralidad de proteínas de fusión comprendiendo cada una de ellas una proteína transferrina o un polipéptido fusionado a un péptido, en el que el péptido de Tf tiene una reducida afinidad por un receptor de la transferrina (TfR). La proteína transferrina o el polipéptido actúa como estructura en la biblioteca de péptidos. La estructura de la transferrina podría ser una proteína transferrina natural o una proteína transferrina modificada (mTf) o polipéptido. Por ejemplo, la estructura de Tf podría ser una lactoferrina o la proteína Tf podría presentar una glicosilación reducida. La estructura de Tf comprendería al menos una sustitución, delección o adición de aminoácidos en cualquier región tal como un emplazamiento de glicosilación, región de unión al receptor o al hierro, u otras áreas tales como la región bisagra.

En una realización, la presente invención proporciona un sistema que utiliza la región N de la Transferrina, M13 y pIII. Otras combinaciones posibles son la secuencia completa de la transferrina o sus derivados, la región doble N (NN) de Tf, los vectores de fago alternativos, por ejemplo, T7 o las proteínas recubiertas, por ejemplo pVIII en M13.

Según se ha descrito anteriormente respecto a la generación de las proteínas de fusión de la Tf, se podrían unir diversas porciones de Tf y mTf con los péptidos terapéuticos. Por ejemplo, la estructura de Tf comprendería una porción de la región N de una proteína Tf, un péptido puente y una porción de la región C de un péptido Tf. Preferiblemente, la estructura de la transferrina comprende o está constituida por la región N de una proteína Tf. La estructura de la transferrina podría comprender también una porción o subdominio de la región N de una proteína Tf. Alternativamente, la estructura de Tf comprende o está constituida por la región C de una proteína Tf; la estructura de la transferrina podría comprender también una porción de la región C de una proteína Tf.

Los péptidos de la biblioteca podrían tener diferentes tamaños y secuencias. por ejemplo, los péptidos podrían contener 6 o más aminoácidos, aproximadamente 4 a 30 aminoácidos, aproximadamente 6 a 25 aminoácidos, aproximadamente 8 a 20 aminoácidos, aproximadamente 10 a 18 aminoácidos, y aproximadamente 12 a 16 aminoácidos. Adicionalmente, los péptidos podrían comprender aproximadamente 6, 9, 12, 16, o 19 aminoácidos. En algunas realizaciones, los péptidos tienen aproximadamente 6 aminoácidos, el tamaño de un epitopo.

Los péptidos se podrían fusionar al extremo C terminal de la estructura de Tf o al extremo N terminal de la estructura de Tf. Se podrían insertar también los péptidos en un bucle de un péptido de Tf. Los péptidos podrían también sustituir una porción del péptido de Tf. Los péptidos podrían también sustituirse o insertarse en uno o más de los bucles de la estructura de Tf. La presente memoria descriptiva proporciona las descripciones para preparar proteína de fusión de la Tf deseables. Por ejemplo, se podrían fusionar los péptidos a la estructura de Tf de la misma manera anteriormente descrita para las proteínas de fusión de la Tf.

Los péptidos se podrían fusionar a la estructura de Tf directamente o a través de uno o más ligantes o separadores. El objetivo del ligante o separador es permitir que el péptido retenga su conformación activa para enlazarse a su diana. El ligante o separador puede comprender restos de poliglicina para la flexibilidad o restos de poliprolina para la rigidez o una combinación de ambas. El ligante o el separador puede incluir también restos de Cy para añadir estabilidad mediante la formación de puentes disulfuro. El ligante o el separador pueden incluir también restos hidrófilos tales como Thr, His, Asn, Gln, Arg, Glu, Asp, Met, Lys, etc. El ligante o el separador puede comprender también restos hidrófobos tales como Phe, Leu, Ile, Gly, Val, Ala, etc. El número de restos en el ligante o el separador variará dependiendo de la proteína de fusión, y/o los péptidos aleatorios.

Existen muchas ventajas en el uso de la Tf como proteína estructural en una biblioteca de péptidos. En primer lugar, Tf es una proteína endógena y se puede usar directamente con objetivos terapéuticos en comparación con otros sistemas tales como la presentación de fago normalizada que utiliza una proteína completamente extraña que no se puede usar terapéuticamente debido a que producirá una reacción inmunógena. En una biblioteca de presentación de fago, la proteína Tf se puede insertar en la proteína del fago con un componente péptido, y, en algunos ejemplos, una proteína Tf puede sustituir la estructura de la proteína del fago. Segundo, los péptidos tienen una semivida corta in vivo y no son terapéuticamente útiles. Debido a que Tf y mTf tienen semividas prolongadas en circulación, los péptidos fusionados a Tf tienen una semivida prolongada. Los péptidos de las bibliotecas de péptidos de Tf pueden tener una semivida significativa in vivo debido a la presencia del esqueleto de Tf. Tercero, los péptidos son a menudo insolubles en disolución acuosa, mientras que la Tf es muy soluble, incluso a concentraciones elevadas. Los péptidos de las bibliotecas de péptidos de Tf son solubles por lo que pueden contribuir poco a las propiedades físicas globales de la proteína de fusión. De esta manera Tf es una estructura perfecta para los péptidos insolubles en disolución acuosa. Cuarto, se puede preparar Tf en sistemas microbianos tales como levaduras, lo que permite la producción a gran escala y el cribado de grandes bibliotecas de péptidos. Quinto, las bibliotecas de péptidos se preparan generalmente con los péptidos localizados en configuraciones tridimensionales específicas, a diferencia de las bibliotecas de péptidos de la presente invención. Puesto que se pueden usar diversas regiones de Tf para localizar las bibliotecas de péptidos tales como los términos N y C y los bucles expuestos en el interior de la proteína, se pueden construir bibliotecas con péptidos de movimiento libre en el término N o el C y restringirse estructuralmente los péptidos insertados en el interior de la transferrina. Sexto, la estructura de la transferrina permite múltiples copias de secuencias de péptidos únicos o múltiples péptidos diferentes para insertarse en la misma molécula de la Tf. De hecho, la estructura de Tf podría contener otros restos de péptidos que faciliten el cribado, la identificación, o la producción del péptido.

Existen numerosas bibliotecas para producir y cribar péptidos. Se han identificados numerosos péptidos con afinidad de unión a ligandos específicos usando estas bibliotecas. Sin embargo, el producto final identificado a partir de estas bibliotecas es normalmente un péptido corto con uso terapéutico limitado. También, en algunas bibliotecas, tal como una biblioteca de presentación de fago normalizada, el péptido funciona en el contexto de la proteína del fago, pero el péptido puede quedar inactivo cuando se escinde, o incluso cuando se vuelve a insertar en una nueva proteína estructural. Por otra parte, usando la biblioteca de péptidos de Tf de la presente invención, se puede identificar un péptido en la Tf o la MTf que se une a las moléculas deseadas o que tiene la propiedad deseada, en la que el resto de péptido está ya contenido en la proteína terapéutica final, es decir, la proteína de fusión de la Tf. Adicionalmente, se puede escalar la producción del péptido identificado con objetivos terapéuticos. Si la estructura de Tf es una porción de Tf, tal como la región N de Tf, se puede insertar el péptido seleccionado en un emplazamiento análogo en la Tf de longitud completa para proporcionar un derivado de la Tf de longitud completa con propiedades de unión conferidas por el péptido insertado.

La presente invención proporciona constructos de Tf y mTf para generar diversas bibliotecas de péptidos de Tf o mTf. Los constructos de Tf y mTf contienen varios emplazamientos de restricción para la adición, inserción, o sustitución de los péptidos aleatorios. Está dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica generar constructos de péptidos aleatorios que podrían añadirse a o insertarse en la Tf y los constructos de mTf en la orientación apropiada.

A continuación se puede cribar la biblioteca de los péptidos con la afinidad deseada para una molécula específica. Una vez que se identifica el clon que codifica el péptido, se hace crecer a gran escala y se purifica para estudios in vivo y/o in vitro.

Vectores

La presente invención emplea preferiblemente un vector de expresión capaz de producir elevados niveles -del péptido o el fragmento de proteína presentado en una estructura de Tf. La elección del promotor usado para impulsar la expresión de la estructura de Tf depende del ensayo usado para el cribado. En general se prefieren los promotores fuertes, debido a que facilitarán mayores niveles de expresión de las secuencias de la biblioteca en las células huésped escogidas. Se pueden derivar dichos promotores de los genes domésticos que se expresan a elevados niveles en la mayor parte o en todos los tipos celulares en el organismo o procedente de virus. Se conocen en la técnica numerosas de dichas secuencia cis reguladoras, adecuadas para impulsar la expresión en células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, hongos o bacterias (Ausubel y col., 1996). Por ejemplo, en eucariotas, es útil el promotor de la beta actina (Qin Z., Kruger-Krasagakes S. y col., J. Exp. Med. 178: 355-360); en plantas el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Goddijn O. J., Pennings E. J., y col., Transgenic Res. 1995 4: 315-323). En células de mamíferos se usa comúnmente el promotor del citomegalovirus; y en general, se puede identificar un promotor que impulse elevados niveles de expresión de, por ejemplo, un gen doméstico o vírico con relativa facilidad usando procedimientos corrientes de genética molecular.

En una biblioteca de péptidos, se construyen los vectores recombinantes de tal manera que el péptido aleatorio se expresa como un producto de fusión; el péptido se fusiona con una proteína estructural. Se puede insertar también el péptido en la estructura de Tf.

Se pueden insertar de diversos modos las secuencias de ADN generadas como oligonucleótidos sintéticos o como ADNc o ADN genómico en vectores de expresión apropiados. Se conocen en la técnica dichos procedimientos para la preparación e inserción, la ligadura y la transformación del vector (Ausebel y col, más arriba). En general, es necesario producir un vector que tenga un emplazamiento de restricción apropiado para insertar el ADN extraño en el gen estructural, con el fin de producir un vector lineal de manera que el emplazamiento esté disponible para ligadura, para mezclar los ADN del vector y del inserto de la biblioteca en condiciones adecuadas de reacción, para permitir proceder a la ligadura durante el tiempo suficiente, y para introducir el material ligado en un huésped adecuado tal como, por ejemplo, E. coli de tal manera que se puedan seleccionar clones individuales (preferiblemente unos pocos millones) para los experimentos adicionales.

Se puede conectar la proteína de fusión con el péptido aleatorio de Tf en una biblioteca de péptidos mediante un separador o un enlazante, El separador o el enlazante sirven para colocar las dos moléculas de la proteína de fusión en una configuración preferida. Los restos del separador o el enlazante pueden ser algo flexibles, comprendiendo poliglicina, por ejemplo, para proporcionar diversidad a las regiones de la biblioteca con la capacidad de interactuar con los emplazamientos en un emplazamiento de unión grande relativamente no restringido por la unión a la estructura de Tf. Se pueden insertar también separadores rígidos tales como, por ejemplo, poliprolina, libremente o en combinación con otros separadores, que incluyen restos de glicina. Las regiones variables pueden estar próximas entre sí, sirviendo para orientar una región variable con respecto a la otra, tal como empleando un giro entre las dos secuencias como proporcionaría un separador de la secuencia Gly-Pro-Gly, por ejemplo. Para añadir estabilidad a dicho giro, puede ser deseable o necesario añadir restos de cisteína a cualquiera o a ambos extremos de cada región variable. A continuación, los restos Cys formarían puentes disulfuro para mantener las regiones variables juntas en un bucle, y de esta manera pueden servir también para imitar un péptido cíclico. Por supuesto, las personas expertas en la técnica apreciarán que se pueden realizar varios tipos diferentes de enlaces covalentes para la ciclación.

Los restos del separador descritos anteriormente también se pueden codificar en cualquiera o en ambos extremos de la región de nucleótidos variables. Por ejemplo, se puede fabricar la secuencia de codificación del péptido aleatorio sin que intervenga un separador teniendo un codón Cys en ambos extremos de la secuencia de codificación del péptido aleatorio con las dianas seleccionadas. Alternativamente, los separadores rígidos pueden permitir presentar al péptido como si estuviera en el extremo de un brazo rígido, en el que el número de restos, por ejemplo, Pro, determina no sólo la longitud del brazo sino también la dirección del brazo en el que el péptido se orienta. Se pueden usar separadores hidrófilos, fabricados de aminoácidos hidrófilos cargados y/o no cargados (por ejemplo, Thr, His, Asn, Gln, Arg, Glu, Asp, Met, Lys, etc.), o separadores hidrófobos fabricados de aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Gly, Val, Ala, etc.) para presentar los péptidos a los emplazamientos de unión con una variedad de ambientes locales.

Por ejemplo, se puede construir una biblioteca de péptidos aleatorios que codifique una proteína de unión al ADN, de tal manera que el represor lac o un represor lac sin cisteína, un péptido aleatorio de fórmula NNK_{5} (se podrían usar también secuencias hasta y que incluyan NNK_{10} o NNK_{5}) fusionado a Tf, y un ligando de péptido de especificidad conocida. Se cribaría a continuación la biblioteca para mejorar la unión del ligando del péptido con el receptor específico del ligando usando el procedimiento de la presente invención; se aislarían las proteínas de expresión que presenten especificidad mejorada junto con el vector que las codifica, y se secuenciaría el vector para determinar la estructura del separador responsable de la mejora de la unión.

Cribado de la biblioteca de péptidos

El número de posibles moléculas diana para las que se pueden identificar ligandos peptídicos mediante cribado de bibliotecas de péptidos es virtualmente ilimitado. Por ejemplo, la molécula diana puede ser un anticuerpo (o una porción de unión del mismo) El antígeno al cual se une el anticuerpo puede ser conocido y quizá incluso secuenciado, en cuyo caso, se puede usar la invención para mapear los epitopos del antígeno, lo que estimula la respuesta inmune. Si el antígeno es desconocido, tal como con algunas enfermedades autoinmunes, se puede usar, por ejemplo, el suero, los fluidos, el tejido, o las células de los pacientes en el presente procedimiento de cribado para identificar los péptidos y, en consecuencia, el antígeno, que estimula la respuesta inmune. Una vez se ha identificado un péptido, este péptido puede servir como, o proporcionar la base para, el desarrollo de una vacuna, un agente terapéutico, un reactivo para diagnóstico, etc.

El cribado se puede llevar a cabo usando uno de los procedimientos bien conocidos por el especialista en la técnica, tal como presentación de fago, fago selectivamente infectivo, cribado por unión, sistemas de ensayo de la actividad enzimática o la estabilidad de la proteína. Se pueden identificar los polipéptidos y los péptidos que tienen la propiedad deseada mediante secuenciación de la secuencia correspondiente de ácidos nucleicos o mediante la secuenciación de los aminoácidos o la espectrometría de masas. En el caso de optimización posterior, se pueden usar opcionalmente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y los péptidos inicialmente seleccionados sin secuenciación. Se lleva a cabo la optimización repitiendo la sustitución de las subsecuencias por secuencias diferentes, preferiblemente por secuencias aleatorias, y la etapa de cribado una o más veces.

Una biblioteca de péptidos de Tf es especialmente útil en el cribado de los péptidos que se unen a una molécula diana de interés. Como ejemplo, un procedimiento de cribado puede comprender las etapas de (a) lisar las células transformadas con la biblioteca de péptidos de Tf bajo condiciones tales que la proteína de fusión permanezca unida al vector que codifica la proteína de fusión; (b) poner en contacto las proteínas de fusión de la Tf de la biblioteca de péptidos con un receptor bajo condiciones que conduzcan a la unión específica péptido-receptor; y (c) aislar el vector que codifica el péptido que se une a dicho receptor. Mediante la repetición del procedimiento de selección por afinidad una o más veces, se pueden enriquecer los vectores que codifican los péptidos de interés. Con el aumento en la restricción de la selección, se pueden identificar los péptidos con afinidad creciente. Si la presencia de proteínas citoplásmicas o periplásmicas interfiere con la unión de la proteína de fusión a la molécula diana, entonces, se puede usar la purificación parcial de los complejos de proteína de fusión-plásmido mediante filtración en gel, afinidad, u otros procedimientos de purificación para evitar dicha interferencia.

Una vez construida la biblioteca de péptidos de Tf, las células huésped se transforman, con los vectores de la biblioteca. Se seleccionan normalmente los transformantes satisfactorios por crecimiento en un medio selectivo o bajo condiciones selectivas, por ejemplo, un antibiótico apropiado, tal como ampicilina u otros dependiendo del vector usado. Se puede llevar a cabo esta selección en un medio de crecimiento sólido o líquido. Para el crecimiento de las células bacterianas en medio sólido, las células se hacen crecer a una densidad elevada (aproximadamente 10^{8} a 10^{9} transformantes por m^{2}) sobre una superficie grande de, por ejemplo, L-agar conteniendo el antibiótico selectivo para formar esencialmente un pasto confluente. Para el crecimiento en cultivo líquido, las células se pueden hacer crecer en caldo L (con selección del antibiótico) con aproximadamente 10 o más duplicaciones. Puede ser más conveniente el crecimiento en cultivo líquido debido al tamaño de las bibliotecas, mientras que el crecimiento en medios sólidos proporciona probablemente menos posibilidades de desviación durante el procedimiento de amplificación.

En algún momento durante el crecimiento de los transformantes, se expresará la proteína de fusión. Las células que contienen una biblioteca se lisan, y los complejos se purifican parcialmente de los residuos celulares. Tras la lisis celular, se debe evitar la reacción cruzada entre las proteínas de fusión no unidas de una célula con las moléculas de ADN heterólogo de otra célula.

Tras la lisis celular, en un procedimiento denominado inmunoadsorción, los complejos plásmido-péptido que se unen específicamente a los receptores inmovilizados se separan de los complejos no unidos, que se eliminan por lavado. Se puede incluir ADN en masa durante las etapas de lisis e inmunoadsorción para competir con los emplazamientos de unión no específica y disminuir el fondo de unión no específica al receptor para el receptor inmovilizado. Se pueden usar diferentes procedimientos de lavado para enriquecer la retención de moléculas con intervalos de afinidad deseados. Por enriquecimiento por afinidad de los clones deseados, entre 10^{2} y 10^{6} equivalentes de biblioteca (un equivalente de biblioteca es uno de cada recombinante; 10^{4} equivalentes de una biblioteca de 10^{9} miembros corresponde a 1013 vectores), pero típicamente de 10^{3} a 10^{4} equivalentes de una biblioteca se incuban con un receptor (o porción del mismo) para el que se desea un ligando peptídico. El receptor está en una de varias formas adecuada para los esquemas de enriquecimiento por afinidad. En un ejemplo, el receptor se inmoviliza sobre la superficie de una partícula, y a continuación la biblioteca se inmunoadsorbe sobre el receptor inmovilizado generalmente según el procedimiento descrito a continuación.

El procedimiento de cribado implica la reacción de la biblioteca de péptidos de la Tf con la diana de interés para establecer un nivel inicial de enlace frente al que comparar las actividades de enlace de las posteriores bibliotecas de péptidos. La unión se puede determinar mediante una variedad de procedimientos de ensayo bien conocidos, por ejemplo, mediante ELISA, ensayos de unión competitiva cuando el compañero de enlace del péptido natural es conocido, ensayos en sándwich, ensayos de radiorreceptores usando un ligando radiactivo cuyo enlace está bloqueado por la biblioteca de péptidos, etc. La naturaleza del ensayo no es crítica, siempre que sea lo suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de unión del péptido o para competir por unión con la diana. Las condiciones de ensayo pueden variarse para tomar en consideración las condiciones óptimas de enlace para diferentes uniones con sustancias de interés u otras actividades biológicas. Así, el pH, temperatura, concentración de sales, volumen y duración de la unión, etc. Pueden variarse para conseguir la unión del péptido a la diana en condiciones que se parezcan a las del entorno de interés.

Una vez que se ha determinado que la biblioteca de péptidos de la Tf posee un péptido o péptidos que se unen con la diana de interés, se pueden usar los procedimientos iterativos de la invención para identificar la secuencia del(de los) péptido(s) en la mezcla. Los aminoácidos se dividen en grupos, convenientemente en tres grupos con un tamaño aproximadamente igual. Por ejemplo, la proporción del primer grupo (designado como "\alpha") está disminuida, la proporción del segundo grupo (designado como "\beta") está aumentada, y la proporción del tercer grupo (designado como "\gamma") permanece inalterada. Cuando la concentración de un grupo varía, debe disminuirse hasta el punto en que se omita completamente, o puede incrementarse en dos o tres veces la concentración molar del(de los) otro(s)
grupo(s). Se determina a continuación el efecto de cambiar la concentración de los aminoácidos en un grupo particular para cada posición del péptido, así como la contribución de dichos aminoácidos en dicho grupo determinada para esa posición en el péptido. Basándose en estas determinaciones, el procedimiento se repite usando subconjuntos de los grupos contribuyentes en cada posición, hasta que finalmente se determina la secuencia de los uno o más péptidos en la mezcla que se unen al ligando.

Diversificación de un péptido aleatorio seleccionado

Una vez identificado un péptido como ligando de interés, se pueden usar diferentes técnicas para diferenciar una biblioteca del péptido Tf para construir ligandos con propiedades mejoradas. En una solución, los vectores positivos (los identificados en un ciclo temprano de inmunoadsorción) se secuenciaron para determinar la identidad de los péptidos activos. A continuación, se sintetizaron oligonucleótidos basados en estas secuencias de péptido, empleando todas las bases en cada etapa a concentraciones diseñadas para producir ligeras variaciones en las secuencias primarias de los oligonucleótidos. Esta mezcla de oligonucleótidos (ligeramente) degenerada se clonó seguidamente en el vector de expresión de la biblioteca de péptidos. Este procedimiento produce variaciones sistemáticas y controladas de las secuencias del péptido inicial pero requiere, sin embargo, la secuenciación de los vectores individuales positivos antes de la mutagénesis. Este procedimiento es útil para expandir la diversidad de pequeñas cantidades de vectores recuperados.

Otra técnica para diversificar un péptido seleccionado implica una sutil incorporación incorrecta de cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación del péptido mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en condiciones de baja fidelidad. Un protocolo descrito en Leung y col., 1989, Technique 1:11-15, utiliza relaciones de nucleótidos alteradas y la adición de iones manganeso para producir una frecuencia de mutaciones del 2%.

Otra solución adicional para diversificar un vector péptido aleatorio seleccionado implica la mutagénesis de una combinación, o subconjunto, de vectores recuperados. Células huésped recombinantes transformadas con vectores recuperados por inmunoadsorción se combinan y aíslan. Al ADN del vector se mutageniza por tratamiento de las células con, por ejemplo, ácido nitroso, ácido fórmico, hidracina, o mediante el uso de una cepa mutante. Estos tratamientos producen una variedad de mutaciones en el ADN del vector. El segmento que contiene la secuencia que codifica el péptido variable puede aislarse opcionalmente cortando con endonucleasa(s) de restricción específicas de los emplazamientos que flanquean la región variable y posteriormente se vuelve a clonar en el ADN del vector no dañado. Alternativamente, los vectores mutagenizados se pueden usar sin reclonar la secuencia que codifica el péptido aleatorio mutagenizado.

En la segunda solución general para diversificar un conjunto de péptidos ligando, el de añadir aminoácidos adicionales a un péptido o péptidos activo(s) están disponibles diferentes procedimientos. En uno, se determinan individualmente las secuencias de los péptidos seleccionados en una inmunoadsorción temprana, y se sintetizan oligonucleótidos nuevos que incorporan todo o parte de la secuencia determinada y una secuencia degenerada adjunta. Estos se clonan continuación para producir una biblioteca de Tf secundaria.

En otra solución que añade una segunda región variable a una combinación de vectores de expresión de péptido aleatorio, se instala un emplazamiento de restricción al lado de la primera región variable. Preferiblemente, la enzima se debería cortar por el exterior de su secuencia de reconocimiento, tal como BspMI, que se corta dejando un saliente 5' de cuatro bases, cuatro bases 3' desde el emplazamiento de reconocimiento. De esta forma, el emplazamiento de reconocimiento puede ubicarse a cuatro bases desde la primera región degenerada. Para insertar una segunda región variable, se liga a continuación un oligonucleótido sintetizado degenerativamente en este emplazamiento para producir una segunda región variable yuxtapuesta a la primera región variable. Esta biblioteca secundaria seguidamente se amplifica y se criba como anteriormente.

Aunque en algunos casos puede ser apropiado sintetizar péptidos que tengan regiones variables contiguas para enlazarse a ciertos receptores, en otros casos puede ser deseable proporcionar péptidos que tengan dos o más regiones de diversidad separadas por restos separadores. Por ejemplo, las regiones variables pueden estar separadas por separadores que permiten que diversas regiones de los péptidos se presenten al receptor de diferentes maneras. La distancia entre regiones variables puede ser tan corta como un resto o tan larga como de cinco a diez hasta aproximadamente 100 restos. Por ejemplo, para sondear un emplazamiento de enlace grande, se pueden construir regiones variables separadas por un separador que contiene de 20 a 30 aminoácidos. El número de restos separadores, cuando están presentes, será de al menos de dos a tres o más pero usualmente será inferior a de ocho a diez. Una biblioteca de oligonucleótidos que tiene regiones variables separadas por separadores se puede representar por la fórmula: (NNK)_{y}- -(abc)_{n}- -(NNK)_{z},
en la que N y K son como se ha definido anteriormente (resaltar que S como se ha definido anteriormente se puede sustituir por K); y+z es igual a aproximadamente 5, 6, 7, 8, o más; a, b y c representan nucleótidos iguales o diferentes que comprenden un codón que codifican aminoácidos separadores; y n es hasta aproximadamente de 20 a 30 codones o más. Alternativamente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf. Adicionalmente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf. Se pueden insertar otras regiones variables adicionales en el bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf o en el bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf.

Salvo que se modifique durante o tras la síntesis por la maquinaria de traducción, las bibliotecas de péptido de Tf recombinante están constituidas por secuencias de los 20 L-aminoácidos normales. Aunque la diversidad estructural disponible para una biblioteca de ese tipo es grande, se puede introducir diversidad adicional por diferentes medios, tales como modificaciones químicas de los aminoácidos. Por ejemplo, una fuente para añadir diversidad a una biblioteca C-terminal del péptido Tf de la invención puede ser someterla a amidación del carboxilo terminal. La amidación del carboxilo terminal es necesaria para la actividad de muchos péptidos bioactivos de origen natural. Esta modificación se produce in vivo por rotura del enlace N-C del carboxilo terminal de un resto Gly en una reacción en dos etapas catalizada por las enzimas peptidiglicina alfa-amidación monooxigenasa (PAM) e hidroxiglicina aminotransferasa (HGAT). Véase, Eipper y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:7827-7833; Mizuno y col., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137(3): 984-991; Murthy y col., 1986, J. Biol. Chem. 261(4): 1815-1822; Katopodis y col., 1990, Biochemistry 29: 6115-6120; y Young y Tamburini, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1933-1934, cada una de las cuales se incorpora por referencia al presente documento.

La amidación se puede realizar por tratamiento con enzimas, tales como PAM y HGAT, in vivo o in vitro, y en condiciones que conduzcan al mantenimiento de la integridad estructural de la proteína de fusión. En una biblioteca aleatoria C-terminal del péptido Tf de la presente invención, la amidación se producirá en un subconjunto de la biblioteca, es decir, aquellos péptidos que tengan un carboxilo terminal de Gly. Se puede construir una biblioteca de péptidos diseñada para amidación introduciendo un codón de Gly en el extremo de la región variable de la biblioteca. Tras la amidación, una biblioteca enriquecida sirve como fuente particularmente eficaz de ligandos para receptores que preferiblemente se unen a péptidos amidados. Muchos de los péptidos bioactivos con el término C amidado se procesan en prohormonas de mayor tamaño, en las que el péptido amidado se flanquea en su término en C por la secuencia
-Gly-Lys-Arg-X ... (SEC. DE ID Nº: 35) (en la que X es cualquier aminoácido). Se pueden ubicar oligonucleótidos que codifiquen la secuencia -Gly-Lys-Arg-X-Stop en el extremo 3' de la región oligonucleótida variable. Cuando se expresa, la Gly-Lys-Arg-X (SEC. DE ID Nº: 35) se elimina por tratamiento enzimático in vivo o in vitro, y la biblioteca de péptidos queda amidada en su extremo carboxilo.

Se pueden introducir otras modificaciones encontradas en los péptidos y proteínas de origen natural en las bibliotecas de Tf para proporcionar diversidad adicional y para contribuir a la actividad biológica deseada. Por ejemplo, la biblioteca de regiones variables puede estar provista de codones que codifican restos de aminoácido implicados en la fosforilación, glicosilación, sulfatación, isoprenilación (o la adición de otros lípidos), etc. Se pueden introducir modificaciones no catalizadas por enzimas de origen natural por medios químicos (en condiciones relativamente suaves) o por la acción de, por ejemplo, anticuerpos catalíticos y similares. En la mayor parte de los casos, una estrategia eficaz para la construcción de bibliotecas implica la especificación del emplazamiento de reconocimiento del sustrato enzimático (o químico) en o adyacente a la región nucleotídica variable de la biblioteca de manera que la mayor parte de los miembros de la biblioteca queden modificados. El emplazamiento de reconocimiento del sustrato añadido puede ser un único resto (por ejemplo, serina para la fosforilación) o una secuencia de consenso compleja, según se desee.

Se pueden introducir también restricciones conformacionales, o estructurales, en la estructura de las bibliotecas de péptidos. Se pueden adaptar con este fin numerosos motivos procedentes de estructuras conocidas de proteínas y péptidos. El procedimiento implica introducir secuencias de nucleótidos que codifiquen restos estructurales conservados en o adyacentes a la región nucleotídica variable para contribuir a la estructura deseada del péptido. Se deja que las posiciones no esenciales para la estructura varíen.

Como ejemplo, la Patente de los Estados Unidos nº 5.824.483 da a conocer bibliotecas combinatorias de péptidos de diferente secuencia. Las bibliotecas están formadas por polipéptidos estabilizados alfahelicoidales con una estructura terciaria similar pero diferentes restos de aminoácido en posiciones "variables" específicas de la secuencia. Los polipéptidos se estabilizan mediante interacciones superenrolladas con otros polipéptidos con \alpha-hélice y/o por puentes lactama intrahelicoidales. También se dan a conocer procedimientos para usar dichas bibliotecas para cribar ligandos macromoleculares seleccionados.

Bibliotecas de presentación de fago

Una "biblioteca de presentación de fago" es una biblioteca para expresión de proteínas, por ejemplo construida en un vector derivado de M13, que expresa una colección de secuencias de proteínas clonadas. En este caso, una biblioteca del péptido Tf en forma de fusiones con una proteína de recubrimiento de fago. Así, en la presente invención, las proteínas de fusión de transferrina que comprenden péptidos se expresan en la parte exterior de una partícula de fago. Esto permite, por ejemplo, el contacto y enlace entre el péptido de la proteína de fusión y la molécula diana inmovilizada. Las personas normalmente expertas en la técnica reconocerán que los clones de fago que expresan proteínas de enlace a péptido específicas de un ligando o receptor se pueden enriquecer sustancialmente mediante ciclos en serie de enlace del fago al ligando inmovilizado, disociación del ligando inmovilizado y amplificación por crecimiento en células huésped bacterianas.

En los últimos años, muchas publicaciones han informado del uso de la tecnología de presentación de fago para producir y cribar bibliotecas de polipéptidos para enlace con una diana seleccionada. Véase, por ejemplo, Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382; (1990); Devlin y col., Science 249, 404-406 (1990), Scott & Smith, Science 249, 386-388 (1990); Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.571.698. Un concepto básico de los procedimientos de presentación de fago es el establecimiento de una asociación física entre el ADN que codifica un polipéptido a cribar y el polipéptido. Esta asociación física se consigue mediante la partícula de fago, que presenta un polipéptido como parte de la cápsida que encierra el genoma del fago que codifica el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre los polipéptidos y su material genético permite el cribado simultáneo masivo de grandes cantidades de fagos que soportan diferentes polipéptidos. Los fagos que presentan un polipéptido con afinidad por una diana se unen a la diana. Estos fagos se enriquecen mediante cribado por afinidad a la diana. La identidad de los polipéptidos presentados desde estos fagos se puede determinar a partir de sus respectivos genomas. Usando estos procedimientos, un polipéptido identificado por tener una afinidad de enlace por una diana deseada puede sintetizarse masivamente a continuación por medios convencionales.

Existen numerosos tipos de biblioteca de presentación de fago, incluyendo la presentación de fago no lítico y la presentación de fago lítico. La presentación de fago no lítico se deriva del fago bacteriano filamentoso M13 y emplea las proteínas pIII, pVIII, o pVI del fago, y preferiblemente se fusiona con péptidos aleatorios, péptidos o proteínas diseñados a medida, y anticuerpos (Fv de fusión cadena de única a pIII). La presentación de fago lítico está basada en el fago \lambda, T7 o T4.

Como se ha indicado, la aplicación de técnicas eficaces de cribado a péptidos requiere el establecimiento de una conexión física o lógica entre cada péptido Tf y el ácido nucleico que codifica el péptido de la Tf de fusión. Tras ciclos de enriquecimiento por afinidad, una conexión de este tipo permite la identificación, normalmente mediante amplificación y secuenciación, del material genético que codifica los péptidos de interés. Se puede usar el enfoque de fusión de fago de Parmley y Smith, 1988, Gene 73:305-318, para cribar proteínas. Otros autores han descrito sistemas basados en fagos en los que el péptido se fusiona a la proteína de recubrimiento pIII del fago filamentoso (véase Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin y col., 1990, Science 249:404-406; y Cwirla y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382).

En estas últimas publicaciones, los autores describen la expresión de un péptido en el término amino o en el interior de la proteína pIII. La conexión entre el péptido y el material genético que codifica el péptido se establece debido a que la proteína de fusión forma parte de la cápsida que encierra el ADN genómico del fago. El fago que codifica los ligandos peptídicos para los receptores de interés se puede aislar a partir de bibliotecas de más de 10^{8} péptidos tras varios ciclos de enriquecimiento por afinidad seguido por crecimiento del fago.

Por lo general, la presentación de una secuencia de péptido, anticuerpo, u otra proteína se realiza en la superficie de una partícula de bacteriófago o célula. Cada partícula de bacteriófago o célula sirve como un miembro individual de la biblioteca presentando una especie única del péptido presentado además de las secuencias de proteínas del bacteriófago o célula natural. Cada bacteriófago o célula contiene información acerca de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del péptido concreto presentado; de esta forma, la secuencia del péptido presentado se puede comprobar mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de un miembros aislado de la biblioteca.

Los procedimientos de presentación del péptido Tf incluyen la presentación de una estructura de Tf fusionada con una secuencia de péptido sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso, típicamente como una fusión con una proteína de recubrimiento de bacteriófago. La biblioteca de bacteriófagos puede incubarse con una molécula diana inmovilizada predeterminada (por ejemplo, un receptor o molécula pequeña) de manera que las partículas de bacteriófago que presentan una secuencia de péptido que se une a la macromolécula inmovilizada se pueden diferenciar de las que no presentan la secuencia de péptidos que se une a la macromolécula predeterminada. Las partículas de bacteriófago (es decir, los integrantes de la biblioteca) que se enlazan con la macromolécula inmovilizada se recuperan a continuación y se replican para amplificar la subpoblación de bacteriófago seleccionada para un ciclo posterior de enriquecimiento por afinidad y replicación de fago. Tras varios ciclos de enriquecimiento por afinidad y replicación de fago, los integrantes de la biblioteca de bacteriófagos se seleccionan y aíslan de esta manera, y se determina la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del péptido mostrado, identificando de esta manera la secuencia o secuencias de péptidos que se unen a la macromolécula predeterminada (por ejemplo, receptor). Dichos procedimientos se describen adicionalmente en las publicaciones de patentes PCT con números 91/17271, 91/18980, y 91/19818 y 93/08278.

La tecnología de presentación de fago se ha usado también para producir y cribar bibliotecas de proteínas heterodiméricas tales como fragmentos Fab y sistemas de ese tipo que se pueden usar para producir y cribar las bibliotecas de péptidos Tf de la invención. Véase por ejemplo, Garrard y col., Bio/Tech 9, 1373-1377 (1991). Las bibliotecas de presentación de fago de fragmentos Fab se producen expresando una de las cadenas componentes en forma de una fusión con una proteína de recubrimiento, igual que para la presentación de polipéptidos monocatenarios. La cadena del anticuerpo compañero se expresa en la misma célula procedente del mismo replicón o de uno diferente al de la primera cadena, y el ensamblaje se produce en el interior de la célula. De esta forma, un fragmento fago-Fab tiene una cadena de anticuerpo fusionada a una proteína de recubrimiento de fago de manera que se presenta desde la superficie externa del fago y la otra cadena de anticuerpo está complejada con la con la primera cadena. La presente invención también proporciona bibliotecas de presentación de fago del péptido Tf que comprenden una estructura de Tf fusionada con fragmentos de anticuerpo tales como las CDR.

La Patente de los Estados Unidos Nº 6.555.310 da a conocer dos mejoras relacionadas pero autosuficientes de los procedimientos de presentación convencionales. La primera mejora proporciona procedimientos para enriquecer bibliotecas de presentación convencionales para los miembros que presentan más de una copia de un polipéptido antes del cribado por afinidad de dichas bibliotecas con una diana de interés. Estos procedimientos pueden conseguir poblaciones diversas en la que la gran mayoría de los miembros retienen secuencias de codificación de longitud completa que codifican polipéptidos con afinidad específica por la diana. En un segundo aspecto, la invención proporciona procedimientos para subclonar ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos presentados de bibliotecas enriquecidas procedentes de un vector de presentación hasta un vector de expresión sin necesidad de aislamiento clonal de los miembros individuales. Estos procedimientos dan como resultado bibliotecas de anticuerpos policlonales y otros polipéptidos para uso, por ejemplo, como reactivos para diagnóstico o terapia.

Las bibliotecas de la invención para la expresión en la superficie de Tf se pueden cribar para péptidos específicos que se unen a moléculas diana mediante procedimientos estandarizados de aislamiento por afinidad. Entre dichos procedimientos se incluyen, por ejemplo, inmunoadsorción, cromatografía de afinidad y procedimientos de inmunotransferencia en fase sólida. Se prefiere la inmunoadsorción según se describe en Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1988), que se incorpora por referencia al presente documento, debido a que se pueden cribar grandes títulos de fagos fácil y rápidamente y en pequeños volúmenes. Adicionalmente, este procedimiento puede seleccionar especies peptídicas menores incluidas en la población, que de otra forma serían indetectables, y amplificarlas para tener poblaciones sustancialmente homogéneas. La secuencia de péptidos seleccionada se puede determinar secuenciando los ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos tras amplificación de la población de fagos.

Los oligonucleótidos aleatorios sintetizados mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos se pueden expresar también sobre la superficie de una Tf de fusión de bacteriófago filamentoso, tal como M13, por ejemplo, sin juntar con los oligonucleótidos del precursor. Se puede usar un vector como M13IX30. Este vector muestra todos los rasgos funcionales del vector combinado para la expresión en superficie de las proteínas de fusión gVIII-péptido. La secuencia de nucleótidos completa para M13IX30 se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.258.350 que se incorpora por referencia en su totalidad.

M13IX30 contiene un gVIII de tipo natural para la viabilidad del fago una secuencia pseudo gVIII para fusiones del péptido. El vector contiene también emplazamientos de restricción en marco para clonar péptidos aleatorios. Los emplazamientos de clonación en este vector son Xho I, Stu I y Spe I. Por tanto, los oligonucleótidos deberían sintetizarse con los extremos complementarios adecuados para hibridación y ligadura o mutagénesis insercional. Alternativamente, se pueden generar los términos apropiados mediante tecnología de la PCR. Entre los emplazamientos de restricción y la secuencia pseudo gVIII se encuentra un codón de detención ámbar en el marco, de nuevo, asegurando la completa viabilidad del fago durante la construcción y manipulación de la biblioteca. La expresión y el cribado se realizan como se ha descrito anteriormente para la expresión en superficie de la biblioteca of oligonucleótidos generada a partir de porciones de precursor.

ScFv Libraries

La presente invención proporciona bibliotecas de presentación de fago que comprenden regiones variables de cadena única fusionadas a Tf, mTf, y regiones, subregiones y porciones de las mismas. Recientemente, sistemas en los que diferentes secuencias de péptidos se presentan sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos (Scott y Smith (1990) Science 249:386) han demostrado ser atractivos para formar varias combinaciones de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de anticuerpos (y las secuencias de polinucleótidos que las codifican) para selección in vitro y enriquecimiento por enlace a un antígeno específico. Las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada se enlazan a fragmentos génicos que codifican señales que los dirigen al espacio periplásmico de E. coli y los "anticuerpos" resultantes se presentan sobre la superficie del bacteriófago, típicamente en forma de fusiones con proteínas de recubrimiento del bacteriófago (por ejemplo, pIII o pVIII). Los fragmentos de la región variable de las inmunoglobulinas (tanto Fv como Fab) se pueden presentar externamente sobre las cápsidas de fago (cuerpos del fago) y los fagos recombinantes se seleccionan para unión a los antígenos inmovilizados.

Se han descrito varias realizaciones de bibliotecas de presentación de anticuerpos en bacteriófago y de bibliotecas de expresión en fagos lambda (Kang y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4363; Clackson y col. (1991) Nature 352: 624; McCafferty y col. (1990) Nature 348: 552; Burton y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 10134; Hoogenboom y col. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang y col. (1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitling y col. (1991) Gene 104: 147; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marks y col. (1992) Biotechnology 10: 779; Marks y col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30: 10832; Lerner y col. (1992) Science 258: 1313).

Un enfoque particularmente ventajoso ha sido el uso de las denominadas bibliotecas de fragmento variable de cadena única (ScFv) (Marks y col. (1992) Biotechnology 10: 779; Winter G y Milstein C (1991) Nature 349: 293; Clackson y col. (1991) obra citada; Harks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Chaudhary y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1066; Chiswell y col. (1992) TIBTECH 10: 80; McCafferty y col. (1990) obra citada; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879). Se han descrito varias realizaciones de bibliotecas de scFv presentadas sobre proteínas de recubrimiento del bacteriófago.

Desde 1988, se han generado de manera fiable análogos de fragmentos Fv y sus proteínas de fusión mediante procedimientos de diseño genético de anticuerpos. La primera etapa implica generalmente la obtención de genes que codifican las regiones V_{H} y V_{L} con las propiedades de enlace deseadas. Estos genes V se pueden aislar a partir de una línea celular de hibridoma específica, seleccionarse de una biblioteca combinatoria del gen V, o fabricarse mediante síntesis del gen V. El Fv de cadena única se forma conectando los genes del componente V con un oligonucleótido que codifica un péptido enlazante adecuadamente diseñado tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3} (SEC. DE ID Nº: 36) o péptido(s) enlazante(s) equivalente(s). El enlazante hace un puente entre el término C de la primera región V y el término N de la segunda, ordenado en forma V_{H}-enlazante-V_{L} o V_{L}-enlazante-V_{H}. En principio, el emplazamiento de enlace de ScFv puede replicar sin problemas tanto la afinidad como la especificidad del emplazamiento combinante de su anticuerpo pariente.

El componente procedente de SCA se puede fusionar con los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina o de la transferrina modificada (V_{L}, V_{H} y/o una o más regiones CDR). Estas fusiones también se pueden realizar usando diferentes partes o regiones de la transferrina tal como la región N o la región C. Las proteínas podrían fusionarse directamente o usar un péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible fusionar todo o parte de la SCA activa dentro de la estructura de la transferrina. En estos casos, la proteína de fusión se prepara insertando el ADNc de SCA dentro del ADNc de la transferrina para la producción de la proteína en células.

En una realización, dos regiones V_{H} o dos regiones V_{L} se pueden unir a los dos extremos o insertarse en la transferrina o en la transferrina modificada. En otra realización, una V_{H} y una V_{L} se podrían unir o insertar en la transferrina o en la transferrina modificada. Las regiones variables se podrían conectar entre sí mediante un enlazante (L) y a continuación fusionarse o insertarse en la transferrina. El enlazante es una molécula enlazada covalentemente a las regiones variables para facilitar la conexión o para inserción en la Tf. Juntos, enlazante y Tf, proporcionan especio y flexibilidad suficiente entre dos regiones de manera que son capaces de alcanzar una conformación en la que sean capaces de unir específicamente el epitopo al cual las dos regiones, V_{H} y V_{L}, están dirigidas. Adicionalmente, la transferrina se puede modificar de manera que las regiones variables conectadas a los dos términos puedan quedar próximas. Los ejemplos de dicha modificación incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de la prolina C terminal y/o del bucle de cistina cercano al término C de la Tf para proporcionar más flexibilidad.

La presente invención contempla también proteínas de fusión Tf/scFv multivalentes. Las regiones variables del anticuerpo con el orden V_{H}-L-V_{H} se podrían fusionar con un extremo de la transferrina y las regiones variables con el orden V_{L}-L-V_{L} se podrían fusionar con la propia transferrina en el otro extremo. También se contemplan en la presente invención otras secuencias de regiones variables que formen SCA multivalentes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a V_{H}-L-V_{L} y V_{L}-L-V_{H} y los que tienen más regiones variables enlazados entre sí. Las regiones variables y los enlazantes también se podrían insertar en la molécula de transferrina.

Alternativamente, las regiones variables multivalentes del anticuerpo se pueden formar insertando regiones variables en la molécula de transferrina o transferrina modificada sin usar ningún péptido enlazante no natural. De esta manera, las porciones de la molécula de transferrina actúan como enlazantes para proporcionar separación y flexibilidad entre las regiones variables.

Tal como se usa en el presente documento, el término "trans-cuerpos" se refiere a una transferrina con actividad de anticuerpo. Un trans-cuerpo comprende al menos una región variable de anticuerpo y una molécula de transferrina, molécula de transferrina modificada, o un fragmento de la misma. Los transcuerpos pueden comprender adicionalmente uno o más péptidos antigénicos que son capaces de inducir una respuesta inmune en un huésped. En un aspecto de la invención, las regiones variables que enlazan el mismo antígeno se pueden fusionar a términos diferentes de la misma molécula de transferrina o transferrina modificada. En otro aspecto de la invención, las regiones variables que enlazan antígenos enlazantes se pueden fusionar a términos diferentes de la misma molécula de transferrina o transferrina modificada. Dichos trans-cuerpos pueden enlazar dos antígenos diferentes, o unirse y/o activar dos células diferentes. De esta manera, la presente invención proporciona regiones variables de un anticuerpo quimérico fusionadas a transferrina o transferrina modificada. Más aún, las regiones variables se pueden insertar en una molécula de transferrina o transferrina modificada.

Así, los fragmentos scFv que comprenden las regiones V_{H} y V_{L} se enlazan en una única cadena de polipéptido mediante un péptido enlazante flexible. Posteriormente, los genes scFv se ensamblan, se clonan en un fagómido y se expresan en la punta del fago M13 (o bacteriófago filamentoso similar) en forma de proteínas de fusión con por ejemplo, la proteína de revestimiento pIII de bacteriófago (gen 3). El enriquecimiento mediante expresión en fago de un anticuerpo de interés se realiza mediante inmunoadsorción del fago recombinante que presenta una población de scFv para enlace con un epitopo determinado (por ejemplo, antígeno diana, receptor). Como ejemplo, in la presente invención, los fragmentos ScFv se pueden fusionar a Tf y expresarse en la punta del fago M13.

Se ha informado de varios procedimiento para aumentar la diversidad combinatoria de una biblioteca de scFv para ampliar el repertorio de especies enlazantes (espectro de idiotipo). El uso de la PCR ha permitido que las regiones variables se puedan clonar rápidamente desde una fuente de hibridoma específica o como biblioteca génica procedente de células no inmunizadas, dando como resultado una diversidad combinatoria en el surtido de casetes de V_{H} y V_{L} que se pueden combinar. Adicionalmente, los propios casetes de V_{H} y V_{L} se pueden diversificar, tal como mediante mutagénesis aleatoria, seudoleatoria, o dirigida. Típicamente, los casetes de V_{H} y V_{L} se diversifican en o cerca de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), a menudo en la tercera CDR, CDR3. La mutagénesis mediante PCR enzimática inversa se ha mostrado como un procedimiento simple y fiable para construir bibliotecas relativamente grandes de mutantes scFv por mutagénesis dirigida al emplazamiento (Stemmer y col. (1993) Biotechniques 14: 256), debido a la tendencia al error de la PCR y de la mutagénesis química (Deng y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9533). Riechmann y col. (1993) Biochemistry 32:8848 demostraron el diseño semirracional de un fragmento scFv de anticuerpo usando PCR con aleatorización dirigida al emplazamiento con oligonucleótidos degenerados y la posterior presentación de fago de los mutantes scFv resultantes. Barbas y col. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4457) intentaron evitar el problema de los tamaños limitados del repertorio resultante usando desviaciones en las secuencias de región variable aleatorizando la secuencia en una región CDR sintética del Fab enlazante con el toxoide tetánico humano.

La Patente de los Estados Unidos Nº 5922545 da a conocer procedimientos mejorados y composiciones novedosas para identificar péptidos y anticuerpos de cadena única que se unen a receptores o epitopos predeterminados. Dichos péptidos y anticuerpos se identifican mediante procedimientos mejorados y novedosos por cribado por afinidad de polisomas que presentan péptidos nascentes.

El documento U.S. 6300064 se refiere a secuencias de ADN sintético que codifican una o más colecciones de proteínas/(poli)péptidos homólogos, y los procedimientos para generar y aplicar bibliotecas de estas secuencias de ADN. En particular, la invención se refiere a la preparación de una biblioteca de genes de anticuerpo derivados de ser humano mediante el uso de una secuencia de consenso sintética que cubre el repertorio estructural de los anticuerpos codificados por el genoma humano. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de un único gen consenso de anticuerpo como marco universal de bibliotecas de anticuerpos muy diversos.

En la presente invención, los péptidos de unión a antígeno o CDR se fusionan con la Tf y la mTf para generar una biblioteca de anticuerpos mejorados. En particular, se puede usar la tecnología de presentación de fago para generar grandes bibliotecas de CDR explotando la capacidad del bacteriófago para expresar y presentar moléculas de proteína de fusión de Tf que comprenden CDR funcionales sobre la superficie del bacteriófago. En otras realizaciones, la biblioteca de CDR se puede preparar directamente en una Tf modificada para crear una biblioteca. Se han generado bibliotecas combinatorias de péptidos de unión a antígeno en sistemas de expresión en bacteriófago lambda que se pueden cribar como placas de bacteriófago o como colonias de lisógenos (Huse y col. (1989) Science 246:1275; Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:6450; Mullinax y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 8095; Persson y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 2432). Se han descrito bibliotecas de presentación en bacteriófago de péptidos de unión a antígeno y bibliotecas de expresión en fago lambda (Kang y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 4363; Clackson y col. (1991) Nature 352: 624; McCafferty y col. (1990) Nature 348: 552; Burton y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 10134; Hoogenboom y col. (1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133; Chang y col. (1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitling y col. (1991) Gene 104: 147; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marks y col. (1992) Biotechnology 10: 779; Marks y col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30: 10832; Lerner y col. (1992) Science 258: 1313). También véase la revisión de Rader, C. y Barbas, C. F. (1997) "Fago display of combinatorial antibody libraries" Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508.

Como parte de esta invención, la transferrina o parte de la transferrina que contiene péptidos aleatorios se puede insertar en el gen 3 del fago en lugar de los fragmentos V_{L} o V_{H}. De esta manera, la biblioteca se puede cribar para una proteína transferrina que contiene un péptido con una función deseada.

De manera similar, una biblioteca puede expresar una transferrina que contiene varios péptidos insertados en lugar de los fragmentos de anticuerpo. A continuación, esta biblioteca se criba para el péptido con la mejor actividad de enlace para una diana particular.

La diversidad de la biblioteca de anticuerpos o péptidos está preferiblemente entre aproximadamente 10^{6}-10^{16}, más preferiblemente entre aproximadamente 10^{8}-10^{16}, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 10^{10}-10^{16}.

Ejemplos de bibliotecas de péptidos

Se han generado diferentes bibliotecas de péptidos para cribar péptidos. Algunas están comercialmente disponibles. Usando Tf como proteína estructural, se podrían generar bibliotecas de péptidos Tf similares usando el presente procedimiento.

En general, dos tipos de bibliotecas de péptidos pueden servir como fuente de epitopos de péptido: bibliotecas de péptidos aleatorios (RPL) y bibliotecas de péptidos naturales (NPL). En las RPL, los péptidos presentados en fago se codifican mediante insertos de oligonucleótidos degenerados aleatorios sintéticos cortados y empalmados en los genes de la proteína de recubrimiento. En las NPL, las partículas de fago presentan fragmentos de proteínas naturales codificadas mediante fragmentos cortos de ADN del genoma de un organismo de interés, por ejemplo un patógeno o un organismo conocido por producir proteínas o péptidos con propiedades deseables incluyendo propiedades terapéuticas.

Se han construido bibliotecas de fagos basadas en estructuras de proteínas bien caracterizadas. En estas bibliotecas, se selecciona una única proteína fuertemente estructurada y se varían los aminoácidos de una parte de esta proteína pariente. Únicamente se varían las regiones de la proteína que son accesibles desde la superficie, ya que son estas regiones las que están disponibles para enlazar una diana, mientras que las regiones de la proteína que están implicadas en el mantenimiento de la estructura no se varían.

También se han construido bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos. Contienen genes que codifican las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de las células productos de anticuerpos procedentes de donantes humanos que se presentan en la biblioteca de fagos en forma de fragmentos de anticuerpo (Fabs). El diseño de la biblioteca incluye la capacidad de producir y purificar rápidamente Fabs solubles.

Bibliotecas de fagos con péptidos lineales en las que todos los aminoácidos, excepto cisteína, en cada posición de un péptido de 20-mer se varían para crear bibliotecas grandes. Estas bibliotecas se han usado para identificar péptidos lineales novedosos que se pueden usar como compuestos terapéuticos o como ligandos por afinidad para la purificación de compuestos terapéuticos diana.

Las bibliotecas de fagos con sustrato peptídico contienen variaciones en la secuencia del péptido que sirven como emplazamiento de reconocimiento para enzimas específicas. Estas bibliotecas se han usado para identificar péptidos novedosos que son mejores sustratos para enzimas específicas.

Se han construido bibliotecas de enzimas que se pueden usar para identificar enzimas con especificidades y enantioselectividades de sustratos hechas a mediada. Se usan enzimas con relevancia industrial como proteína parental, y los aminoácidos de las partes relevantes se varían para obtener variantes enzimáticos con la función deseada. Por ejemplo, estas bibliotecas de presentación de fago se pueden usar para crear catalizadores que realicen el mismo tipo de reacción, pero con sustratos y estereoselectividades diferentes.

La Patente de los Estados Unidos Nº 6.573.098 da a conocer un procedimiento para el reensamblaje del ADN tras fragmentación aleatoria, y su aplicación a la mutagénesis de secuencias de ácidos nucleicos por recombinación in vitro o in vivo. En particular, se describe un procedimiento para la producción de fragmentos de ácidos nucleicos o polinucleótidos que codifican proteínas mutantes. La invención también se refiere a un procedimiento para repetir ciclos de mutagénesis, barajado y selección que permite dirigir la evolución molecular in vitro o in vivo de las proteínas.

Breve resumen de las etapas para generar Bibliotecas de péptido Tf en bacteriófagos

La presentación de péptidos está basada principalmente en el cribado de péptidos o proteínas, tal como anticuerpos de cadena única (SCA), para actividad de enlace frente a una diana elegida en el que el péptido o proteína se inserta y presenta sobre la superficie de un bacteriófago, por ejemplo en el término N de la proteína de recubrimiento pIII del bacteriófago M13.

En el caso de los péptidos, se puede generar una biblioteca del fago M13 cortando y empalmando una secuencia de ADN aleatorizada, que codifica un conjunto aleatorizado de aminoácidos, 3' del término N de Tf que está fusionada con la proteína del bacteriófago pIII e inmediatamente después del emplazamiento de rotura de la secuencia señal. Esta secuencia de péptidos está típicamente en el intervalo de 6, 8, 12, 15 ó 20 aminoácidos de longitud. Sin embargo, a medida que el tamaño del inserto de péptido aumenta, la complejidad potencial de la biblioteca también lo hace. Por ejemplo, una biblioteca de 6 mer que usa los 20 aminoácidos genera 10^{8} posibles combinaciones; una biblioteca de 20 mer biblioteca genera 10^{26} posibles combinaciones. Con el fin de que la biblioteca sea representativa para la etapa de cribado, la biblioteca inicial se amplifica para dar lugar a una duplicación cinco veces o superior de todas las posibles secuencias contenidas en la biblioteca.

Los péptidos pueden ser lineales o estar restringidos, se consigue una biblioteca restringida mediante la adición de dos restos cisteína dentro de la secuencia de péptido de manera que se forme un enlace disulfuro dentro del péptido. Los péptidos pueden también estar conservados en determinados restos, particularmente si la biblioteca está basada en una secuencia existente en las que ya se han determinado algunos restos clave.

Los medios de generar y cribar bibliotecas de fagos están bien documentados (Véase http://www.biosci.nussouri.
edu/smithgp/FagoDisplayWebsite/PetrenkoSmithChemReviews.PDF). En breve, una cepa huésped de E. coli adecuada se infecta con la biblioteca para generar partículas de fago. En la punta de las partículas de fago se presenta el producto del gen III, pIII, junto con el péptido insertado. A continuación, estas partículas se criban contra una diana y, como el ADN y el péptido que codifica están inexorablemente unidos en la partícula de fago, se puede determinar la secuencia del aminoácido del péptido(s) a partir de la secuencia del ADN.

El mismo principio de cribar grandes cantidades de secuencias aleatorias se aplica tanto a péptidos como a SCA, siendo la diferencia que, con SCA, los péptidos son las secuencias hipervariables de las CDR en las cadenas ligera y pesada del anticuerpo.

Para la presentación de fago usando una proteína como Tf, la metodología se vuelve un poquito más compleja que para un péptido sencillo, puesto que el tamaño del ADN del bacteriófago excede el que se puede empaquetar eficazmente en la partícula de fago. Esto requiere el uso de un sistema de dos vectores. La fusión proteína Tf-pIII se transporta en un vector, o fagómido, que es esencialmente un plásmido que contiene el ADN de la fusión proteína Tf-pIII junto con una secuencia funcional de empaquetamiento de fago. Este vector no puede generar partículas de fago viables. Para generar partículas de fago, la cepa huésped E. coli se infecta con un segundo vector, o fago auxiliar, que es un bacteriófago M13 de tipo natural que transporta una señal de empaquetado no funcional. El fago auxiliar proporciona todos los genes necesarios para fabricar y ensamblar las proteínas de una partícula de fago pero es incapaz de empaquetar su ADN en la partícula de fago. Únicamente el ADN del fagómido transporta una señal de empaquetado funcional, y así, es únicamente el ADN del fagómido el que se empaqueta en las partículas de fago.

En una única partícula de fago se encuentran cinco copias de la proteína pIII. En un sistema de presentación de péptido las cinco copias normalmente transportan el péptido Tf. Esto puede dar como resultado la selección de péptidos con una afinidad inferior a la que se hubiera inicialmente indicado debido a los efectos de la avidez. El sistema de presentación de proteínas, debido a que el fago auxiliar transporta el gen para fabricar copias nativas de la proteína del gen III, permite la incorporación de normalmente una o dos copias de la fusión proteína-pIII. Esto tiene dos efectos, el primero es una mejor infectividad cuando el fago aislado requiere propagación y el segundo, más importante, es la selección de péptidos con afinidad superior.

Se pueden generar oligonucleótidos que contienen los mismos emplazamientos de restricción a cada extremo por separado mediante un conjunto aleatorio de nucleótidos que codifican los péptidos aleatorios. Los emplazamientos de restricción son los mismos que los del término N de Tf. El tamaño del péptido depende de la longitud de la región aleatoria de nucleótidos en estos oligonucleótidos.

El vector de expresión que contiene Tf se corta con las enzimas de restricción adecuadas, y los oligonucleótidos se insertan en dicho emplazamiento. Tras la ligadura y transformación, la levadura puede producir Tf con los péptidos aleatorios añadidos en su término N.

Se podría usar un protocolo similar para unir los péptidos al término C o en el interior de Tf excepto en que se deberían usar emplazamientos de restricción adecuados en los extremos 3' y 5' de los oligonucleótidos para permitir una inserción correcta.

A continuación, la biblioteca se criba para péptidos que tengan afinidad por una molécula de interés específica. El cribado se puede realizar mediante el procedimiento de dilución limitante similar al de selección de anticuerpos monoclonales o mediante el uso de transferencia replicada de las placas de cultivo que se sondean con la molécula de interés marcada.

Tras la selección, los clones seleccionados se hacen crecer y el péptido Tf expresado se purifica usando cromatografía de afinidad o de intercambio iónico. El material purificado se puede usar para estudios in vitro e in vivo.

Maduración por afinidad

La maduración por afinidad se refiere al incremento de la afinidad por el antígeno específico de los anticuerpos producidos en el transcurso de una respuesta inmune humoral. Es particularmente elevada en la inmunización secundaria e inmunizaciones posteriores.

La Patente de los Estados Unidos Nº 6.573.098 da a conocer un procedimiento para generar bibliotecas de polipéptidos presentados o anticuerpos presentados adecuados para cribado mediante interacción por afinidad o cribado fenotípico. El procedimiento comprende (1) obtener una primera pluralidad de miembros seleccionados de una biblioteca que comprenden un polipéptido presentado o anticuerpo presentados y un polinucleótido asociado que codifica dichos polipéptido presentado o anticuerpo presentado, y obtener dichos polinucleótidos asociados o copias de los mismos en los que dichos polinucleótidos asociados comprenden una región de secuencia esencialmente idéntica, introduciendo opcionalmente mutaciones en dichos polinucleótidos o copias, y (2) combinar y fragmentar, mediante digestión con nucleasa, amplificación mediante la PCR con extensión parcial, PCR con barajado, u otro procedimiento de fragmentación adecuado, produciendo típicamente fragmentos aleatorios o fragmentos equivalentes, dichos polinucleótidos asociados o copias para formar fragmentos de los mismos en condiciones adecuadas para amplificación mediante la PCR y opcionalmente mediante mutagénesis, y de esta manera recombinando homólogamente fragmentos para formar una combinación barajada de polinucleótidos recombinados, en la que una fracción sustancial (por ejemplo, más del 10 por ciento) de los polinucleótidos recombinados de dicha combinación barajada no están presentes en la primera pluralidad de miembros seleccionados de la biblioteca, comprendiendo dicha combinación barajada una biblioteca de polipéptidos presentados o de anticuerpos presentados adecuados para cribado mediante interacción por afinidad. Opcionalmente, el procedimiento comprende la etapa adicional de cribar los miembros de la biblioteca de la combinación barajada para identificar miembros individuales de la biblioteca barajada que tengan la capacidad de unirse o de interactuar de cualquier otra manera (por ejemplo, tal como anticuerpos catalíticos) con una macromolécula predeterminada, tal como por ejemplo un receptor proteínico, péptido, oligosacárido, virión, u otro compuesto o estructura predeterminados. Los polipéptidos, anticuerpos, anticuerpos peptidomiméticos y secuencias de región variable presentados que se identifican a partir de dichas bibliotecas que se pueden usar en terapia, diagnóstico, investigación y fines relacionados (por ejemplo, catalizadores, solutos para incrementar la osmolaridad de una disolución acuosa y similares), y/o puede someterse a uno o más ciclos adicionales de barajado y/o selección por afinidad. El procedimiento se puede modificar para que la etapa de selección sea para una característica fenotípica diferente a la afinidad de enlace con una molécula predeterminada (por ejemplo, para actividad catalítica, estabilidad, resistencia a la oxidación, resistencia a fármacos, o un fenotipo detectable conferido a una célula
huésped).

Un procedimiento preferido para la selección de un fago que presenta una molécula de proteína con una especificidad o afinidad deseada a menudo procederá de la elución de una matriz de afinidad con un ligando. La elución con concentraciones crecientes de ligando debería eluir el fago que presenta moléculas enlazantes de afinidad
creciente.

Otro procedimiento preferido para selección por afinidad sería el enlace a una matriz de afinidad que contiene bajas cantidades de ligando. Como estrategia prefería, una población de fagos se enlaza a una matriz de afinidad que contiene una baja cantidad de ligando. Los fagos que presentan afinidad elevada y las proteínas de baja afinidad compiten para enlazarse con el ligando de la matriz. Los fagos que presentan una proteína de afinidad elevada quedan preferentemente unidos, y la proteína de baja afinidad se elimina con el lavado. La proteína de alta afinidad se recupera posteriormente por elución con el ligando o mediante otros procedimientos que eluyan el fago de la matriz de afinidad.

Cualquier procedimiento de maduración por afinidad como los descritos anteriormente se puede usar con las bibliotecas de estructura de Tf descritas en el presente documento. Según esto, la presente invención incluye procedimientos para usar técnicas de maduración por afinidad para seleccionar péptidos u otras moléculas por sus características deseadas comprendías en el contexto de las bibliotecas de estructura de Tf descritas en el presente documento.

Sin descripción adicional, se cree que una persona normalmente experta en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, realizar y utilizar la presente invención y poner en práctica los procedimientos reivindicados. Por ejemplo, una persona experta será rápidamente capaz de determinar la actividad biológica, tanto in vitro como in vivo, de los constructos de proteína de fusión de la presente invención en comparación con la actividad comparable del resto terapéutico en su estado no fusionado. De manera similar, una persona experta en la técnica será rápidamente capaz de determinar la semivida y la estabilidad en suero de los constructos según la presente invención. Los siguientes ejemplos de trabajo del documento apuntas específicamente a las realizaciones preferidas de la presente invención, y no se deben tomar en forma alguna como una limitación del resto de la memoria descriptiva.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1

Se preparó una proteína de fusión que comprendía Tf modificada y un péptido antifusogénico VIH-1 (T-20) fusionando una o más copias de la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido a la secuencia de nucleótidos de mTf para producir una proteína de fusión con un péptido fusionado a los términos N- o C- de Tf. Alternativamente, el péptido puede fusionarse internamente con mTf.

En una realización, la porción Tf de la proteína de fusión está diseñada para no permitir la glicosilación cuando se produce en lavaduras. Según se ha descrito anteriormente, la transferrina humana tiene dos emplazamientos de glicosilación N-unidos a N413 y N611; el emplazamiento de glicosilación N-unido comprende la secuencia N-X-S/T. En una realización, N (Asn) se cambia a Q (Gln); se aprecian otros cambios tales como Asn por Ala o Ser o cualquier otro aminoácido.

Específicamente, los codones N413 y N611 se convierten en GAT y GAC mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido usando el procedimiento dut/ung (dUTPasa/uracilo glicosidasa, por sus siglas en ingles). Véase Kunkel y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492). Los oligonucleótidos mutagénicos 5'-GCAGAAAACTACGATAA
GAGCGATAAT-3' (SEC. DE ID Nº: 9) y 5'-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3' (SEC. DE ID Nº: 10) se sintetizan y usan para producir mutagénesis en los codones N413 y N611 según los procedimiento de Funk y col. (Patente de los Estados Unidos 5.986.067).

De esta manera quedan perturbados la unión al receptor y/o la unión a hierro o carbonato produciendo la mutación en los siguientes restos de unión y/o restos de unión a hierro y/o carbonato:

\vskip1.000000\baselineskip

Unión a hierro

4

Unión a carbonato

5

\vskip1.000000\baselineskip

La producción de mutantes deficientes en unión al hierro se puede realizar mediante numerosas técnicas. Véase la Patente de los Estados Unidos 5.986.067. Se puede preparar una substitución D63S usando el procedimiento de Nelson, R. M. y Long, G. L. (1989) Anat. Biochem. 180:147-151. En breve, un fragmento HpaII/BamHI procedente del extremo 5' de la secuencia de codificación del hTF/2N (Tf humana con doble región N) se subclona en pUC 18 y a continuación se usa como plantilla para un procedimiento de mutagénesis en dos etapas basado en la PCR. A continuación, el fragmento se libera de la forma de doble cadena del vector de secuenciación mediante digestión con XbaI y BamHI y a continuación se liga a un fragmento BamHI/HindIII procedente del constructo original de la Tf humana para producir una secuencia de codificación de D63S longitud completa.

Para la expresión en Pichia pastoris, se puede usar el sistema procedente de RCT/Invitrogen. Están disponibles tres vectores para multicopia para expresión, pPIC9K, pPIC3.5K y pAO815. Para este ejemplo, se usa el vector pPIC9K, que permite la secreción en el medio de crecimiento.

La secuencia modificada de transferrina se clonó en el vector pPIC9K por alteración de los extremos del ADNc de transferencia mediante mutagénesis solapante con PCR, dando como resultado el vector pREX0010. Se eliminan o añaden numerosos emplazamientos de restricción en el vector y la secuencia de codificación para facilitar las últimas etapas de clonación.

La secuencia del péptido antifusogénico del VIH H DP-178 se conoce también como T-20. Este péptido está fusionado en los extremos N- o C- de la Transferrina, ya que el péptido necesita libertad de movimientos para cumplir su función.

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de DP-178:

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

(SEC. DE ID Nº: 4).

\vskip1.000000\baselineskip

Cuando se vuelve a traducir a ADN (usando codones optimizados para levadura), se obtuvo la siguiente secuencia (SEC. DE ID N^{ros}: 13 y 14):

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

Para insertar la secuencia anterior, se digirió el vector pREX0010 con el ADNc de la transferrina, con las enzimas de restricción XbaI/KpnI para la inserción en el extremo 5' y con SalI/HindIII para la inserción en el extremo 3'.

Para la inserción en 5', se sintetizaron dos oligos solapantes que forman un saliente XbaI en el extremo 5' y un saliente KpnI en el extremo 3' de la secuencia DP-178 anteriormente proporcionada. Estos oligos se fusionaron entre sí (véase más adelante) y se ligaron en el vector pREX0010 digerido con XbaI/KpnI.

7

La inserción de los oligos fusionados dio como resultado la pérdida del emplazamiento KpnI tras la inserción. Esto dio como resultado el vector pREX0011.

Para la inserción en el término C, se siguió un enfoque similar mediante la adición de un emplazamiento SalI en el extremo 5' y uno HindIII en el extremo 3'.

La transformación, selección y expresión se llevaron a cabo posteriormente como está descrito en el folleto del protocolo en kit de expresión Pichia Invitrogen.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Se prepararon fusiones INGAP usando una secuencia de aminoácidos INGAP humana traducida inversamente. La secuencia de proteína procedente de la anterior es como sigue: sp|Q92778|PBCG_HUMAN Human INGAP
(SwissProt):

MMLPMTLCRMSWMLLSCLMFLSWVEGEESQKKLPSSRITCPQGSVAYGSYCYSLILIPQTWSNAELSCQ {}\hskip0.45cm MHFSGHLAFLLSTGEITFVSSLVKNSLTAYQYIW[IGLHDPSHGTLPNG]GWKWSSSNVLTFYNWERNPSI {}\hskip0.45cmAADRGYCAVLSQKSGFQKWRDFNCENELPYICKFKV {}\hskip1cm (SEC. DE ID Nº: 17).

La traducción inversa a ADN (codones optimizados para levadura) produjo lo siguiente (SEC. DE ID N^{ros}: 18 y 19).

8

El punto más adecuado para la rotura de la secuencia líder es el C-terminal del KK en el extremo de la secuencia subrayada anterior.

Una metodología que se puede usar para generar constructos para la expresión de INGAP fusionado con los términos N- o C- de la transferrina es sintetizar una serie de oligos solapantes diseñados a partir de la secuencia anteriormente proporcionada (menos la secuencia líder anterior). La hibridación de estos cebadores generó el ADNc maduro de INGAP. Con diferentes oligos diseñados para los extremos 5' y 3', el ADNc híbrido se puede ligar en el pREX0010 en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación de la transferrina.

La secuencia que aparece entre paréntesis es el péptido usado para inducir la actividad de INGAP. De esta manera, la secuencia podría acortarse hasta cierto punto entre la secuencia completa y esta secuencia mínima.

\vskip1.000000\baselineskip

Fusión en el término N

Para el término N, el ácido nucleico codificante tendría un saliente que forma un emplazamiento XbaI en el extremo 5' y un saliente compatible con un emplazamiento KpnI en el extremo 3' pero que da como resultado la destrucción del emplazamiento KpnI tras la ligadura.

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

La digestión de pREX0010 con XbaI y KpnI y la ligadura con la secuencia anterior dio como resultado el vector pREX0013.

\newpage

Fusión en el término C

Para el término C, el extremo 5' formaría un emplazamiento SalI y en el extremo 3' un codón de detención y un emplazamiento HindIII.

10

\vskip1.000000\baselineskip

La digestión de pREX0010 con SalI y HindIII y la ligadura de la secuencia anterior dio como resultado el vector pREX0014.

La transformación, selección y expresión se llevaron a cabo posteriormente como está descrito en el folleto del protocolo en kit de expresión Pichia Invitrogen.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

El péptido dado a continuación ha demostrado imitar la actividad de la EPO produciendo la dimerización del receptor EPO. El péptido, que es cíclico, no tiene homología con EPO. Para su actividad, el péptido debe de actuar concertado con otro péptido, es decir, en forma de dímero, de manera que las moléculas del receptor se ponen lo suficientemente cerca para formar un complejo activo. Como en el caso de muchos péptidos, el dímero de péptidos tiene una semivida corta, y se beneficiaría de la longevidad que le proporcione la transferrina. En este ejemplo, se diseñaron dos péptidos en la estructura de la transferrina.

11

\vskip1.000000\baselineskip

Como se detalla en Ali y col., se puede insertar un péptido con éxito en la transferrina entre His289 y Gly290. La duplicación inherente a la molécula de transferrina, con los dos dominios enfrentados entre sí, sugiere que puede ser posible insertar un péptido en la región análoga del dominio C, entre Glu625 y Thr626.

12

\vskip1.000000\baselineskip

Para cada inserción, se sintetizaron dos cebadores mutagénicos solapantes (véase más adelante). Usando pREX0010 como plantilla, se llevaron a cabo reacciones con cada cebador mutagénico, y un cebador externo del 5' o 3' del de ADNc Tf. Los productos de estas dos reacciones se mezclaron a continuación, y se llevó a cabo una reacción adicional con los cebadores externos para unir los dos productos entre sí. El inserto His289-Gly290 producto de la PCR se digirió con XbaI y HpaI para ligadura en digerido con pREX0010XbaI/HpaI. El vector resultante se digirió a su vez con HpaI y SalI para ligadura del inserto Glu625-Thr626 producto de la PCR digerido con HpaI/SalI.

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

Esto proporcionó el plásmido pREX0015. La transformación, selección y expresión se llevaron a cabo posteriormente como está descrito en el folleto del protocolo en kit de expresión Pichia Invitrogen.

Los puntos alternativos para la inserción del péptido o péptido(s) miméticos de EPO o de cualquier otro péptido o péptido(s) son los dos emplazamientos de glicosilación en la región C de la Transferrina en N413 y N611. La ventaja de esto sería que la inserción se consigue y la glicosilación se evita, mediante perturbación de la secuencia N-X-S/T en un evento único y compartido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Las proteínas de fusión entre Tf y los péptidos fusogénicos inhibidores contra RSV se preparan fusionando las secuencias de péptido en los extremos N- o C- terminal de Tf o mediante la inserción de las secuencias en un bucle de Tf, en el que Tf está modificada para no unirse al hierro y/o está modificada para evitar la glicosilación. El péptido RSV puede incluir: T786: VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV (SEC. DE ID Nº: 5) y/o T1584: AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL (SEC. DE ID Nº: 6).

El péptido T786 tiene un dipéptido RK que podría actuar como un emplazamiento de rotura para la proteasa de levadura Kex2p. Esto daría como resultado un péptido truncado. Según esto, este péptido se modificaría de RK a RE. Otra versión del péptido T786, T112 (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEC. DE ID Nº: 7), que es más potente que T786 pero que tiene problemas de solubilidad en su forma no fusionada. Según esto, una versión de T112 modificado para de RK a RE también se prepara para producir una versión del péptido fusionado a Tf.

Para producir los constructos genéticos, las secuencias de péptidos se traducen inversamente a ADN usando una preferencia codónica de ser humano, levadura, o de cualquier otro organismo según sea apropiado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Se pueden fusionar citocinas a los extremos N-, C- o N- y C- de ofTf. Estas fusiones también se pueden construir usando diferentes partes o regiones de transferrina modificada tal como la región N o la región C. Las proteínas se podían fusionar directamente o usando un péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible funcionar todo o parte de la citocina activa en la estructura de la transferrina.

El ADNc de la citocina de interés, tal como la EPO, se puede aislar mediante una variedad de medios tales como RT-PCR de ARNm, a partir de bibliotecas de ADNc, construyendo sintéticamente el ADNc a partir de oligonucleótidos solapantes, mediante PCR o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica, usando todos ellos procedimientos estandarizados. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas son conocidas y están disponibles, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 4.703.008, 4.810.643 y 5.908.763 así como en bases de datos públicas como GenBank. El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de manera que los enlazantes oligonucleótidos se pueden usar para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la Transferrina. Esto puede ser en el extremo N- o en el C-, con o sin el uso de una secuencia separadora, o insertando el ADNc de la citocina dentro del ADNc de la Transferrina. La citocina, por EPO, y el ADNc de Tf se clonan en un vector cuyo casete de expresión completo se escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura (o cualquier otro sistema de expresión apropiado). La proteína de fusión secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio, y ensayarse para su actividad biológica.

Para expresión en líneas celulares de mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Se pueden fusionar varios interferones con los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina o la transferrina modificada. Estas fusiones se pueden construir usando diferentes partes o regiones de la transferrina tal como la región N o la región C. Las proteínas se pueden fusionar directamente o usando un péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible fusionar todo o parte del interferón en el armazón de la transferrina.

Un ejemplo específico de un interferón que se puede fusionar con Tf es interferón-\beta. El ADNc del interferón de interés tal como IFN \beta se puede aislar por una variedad de medios tal como RT-PCR a partir de ARNm o ADNc, a partir de bibliotecas de ADNc, construyendo sintéticamente el ADNc a partir de oligonucleótidos solapantes, mediante PCR u otros procedimientos conocidos en la técnica, todos usando procedimientos estandarizados. Las secuencias de nucleótidos de los interferones, tales como IFN\alpha, IFN\beta, y IFN\gamma son conocidas y están disponibles, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5.326.859 y 4.588.585, en el documento EP 32 134, así como en otras bases de datos públicas como GenBank. El ADNc puede adaptarse a los extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de manera que se pueden usar oligonucleótidos enlazantes para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la transferrina modificada. Esto se puede realizar en los términos N-, C- o N- y C- de la secuencia de la transferrina, con y sin el uso de una secuencia separadora. El ADNc de IFN \beta (u otro interferón) se clona en un vector, del cual a continuación se escinde el casete de expresión completo y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión de la levadura. La proteína de fusión secretada desde la levadura se pueden recoger y purificar desde el medio y ensayarse para su actividad biológica.

Para expresión en líneas celulares de mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero. Los IFN fusionados con la transferrina tienen una semivida mucho más larga, esto es, las dosis terapéuticas de las proteínas fusionadas son muy inferiores a los IFN. Por tanto, los interferones fusionados son más eficaces con mucho menos toxicidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Varios anticuerpos de cadena única (SCA) fueron originalmente inventados para simplificar la selección y producción de anticuerpos. Sin embargo, demostraron tener un valor terapéutico limitado o sin valor debido a su pequeño tamaño y corta semivida in vivo. La adición de transferrina a SCA incrementa significativamente la semivida in vivo de SCA.

SCA se puede fusionar a los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina o la transferrina modificada. Estas fusiones se pueden construir usando diferentes partes o regiones de la transferrina tal como la región N o la región C. Las proteínas se pueden fusionar directamente o usando un péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible fusionar todo o parte del interferón en el armazón de la transferrina. En estos casos, la proteína de fusión se prepara insertando el ADNc de SCA en el ADNc de la transferrina para la producción de la proteína en células. Un ejemplo específico de un SCA que se puede fusionar a la Transferrina es el anti-TNF (factor de necrosis tumoral; Figs. 4A-4B). El anti-TNF se ha usado para tratar varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes. TNF-SCA podría fusionarse a los términos N- o C- de la transferrina modificada de manera que el termino N codificante de TNF-SCA está directamente unido al aminoácido C-terminal de la Transferrina o el aminoácido C-terminal de TNF-SCA está directamente unido al aminoácido N-terminal de la Transferrina. Alternativamente, se puede insertar un péptido enlazante para proporcionar más separación entre la Transferrina y TNF-SCA y permitir más movilidad espacial a las dos proteínas fusionadas. Se muestran en las Figuras 4A-4B varios ejemplos de TNF-SCA.

Los anticuerpos de cadena única se producen mediante varios procedimientos que incluyen, pero no se limitan a: selección a partir de bibliotecas de fagos, clonación de la región variable de un anticuerpo específico por clonación del ADNc del anticuerpo y usando las regiones constantes flanqueantes como el cebador para clonar la región variable, o sintetizado un oligonucleótido correspondiente a la región variable de cualquier anticuerpo específico. El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de manera que se pueden usar oligonucleótidos enlazantes para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la transferrina. Esto puede ser en los términos N- o C- o en el término N- y C- con o sin el uso de una secuencia separadora. La molécula de ADNc de SCA se clona en un vector del que a continuación el casete de expresión completo se escinde e inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levaduras. La proteína de fusión secretada desde la levadura se puede recoger y purificar del medio y ensayar su actividad. Para expresión en líneas celulares de mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero. El anticuerpo producido de esta manera se puede purificar del medio y ensayarse para el enlace con su antígeno usando procedimientos estandarizados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Las CDR son las regiones variables de los anticuerpos que interactúan con antígenos. Estos consisten usualmente en tramos relativamente cortos de péptidos. Los anticuerpos tienen normalmente tres CDR en sus cadenas pesadas y tres en sus cadenas ligeras. Una o más CDR de un anticuerpo puede(n) interactuar con el antígeno que se puede fusionar a la transferrina modificada para conferir actividad de unión de antígeno a la molécula de transferrina. Las CDR se pueden fusionar a los términos N-, C-, N- y C- o insertarse en la estructura interna de la transferrina. Ejemplos de secuencias de CDR procedentes de los anticuerpos anti-TNF se muestran en las Figuras 4A-4B de TNF-SCA. Los ADNc correspondientes a una o más CDR se pueden fusionar con la transferrina modificada para conferir a TNF actividad de unión a la transferrina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

La tecnología de fusión con Transferrina se puede usar también para mejorar las propiedades terapéuticas de los péptidos descubiertos en diferentes sistemas como bibliotecas de presentación de gados y bibliotecas de péptidos. Muchos de estos péptidos tienen actividad biológica sin homología alguna con proteínas o péptidos naturales. Estos péptidos, debido a sus cortas semividas in vivo, son buenos candidatos para fusión con transferrina modificada. Por su pequeño tamaño se pueden fusionar en una variedad de regiones de la molécula de transferrina. Además de los términos N- y C-, se pueden insertar en diferentes regiones de la transferrina incluyendo pero sin limitarse a los bucle de cistina. De esta manera, la estructura tridimensional del péptido dentro de la transferrina se mantiene relativamente rígida. Se pueden fusionar más de una copia de cada péptido y más de un péptido con la transferrina modificada. Adicionalmente, la secuencia del péptido se puede usar para sustituir una parte de la transferrina para conferir actividad terapéutica a la transferrina. Como la mayor parte de estos péptidos es de pequeño tamaño, sus ADNc se pueden sintetizar con emplazamientos de restricción adecuados para inserción en el ADNc de la transferrina modificada. El ADNc podría insertarse a continuación en un vector que contenga el ADNc de la transferrina ADNc de manera que el péptido se exprese como parte de la transferrina o se fusione con la molécula de transferrina. Alternativamente, se podrían sintetizar cebadores para PCR que contengan el péptido de interés y una sección de transferrina adecuada. Usando estos cebadores, la amplificación de los ADNc de la transferrina daría como resultado la fusión del péptido en el emplazamiento elegido de la transferrina. Ejemplos de dichos péptidos son los péptidos miméticos de la EPO: GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEC. DE ID Nº: 11); DREGCRRGWVGQCKAWFN (SEC. DE ID Nº: 12); y QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY (SEC. DE ID Nº: 30), que no tienen homología con la EPO natural, pero que tienen una actividad biológica similar porque activan el receptor de la EPO actuando como antagonistas. Estos péptidos también necesitan tener una conformación específica para que su actividad sea óptima. Los péptidos miméticos de la EPO se pueden insertar en (o pueden sustituir) uno o más bucles de cistina en la transferrina. De esta manera puede adquirir actividad EPO. Otros péptidos que se pueden fusionar con la transferrina son péptidos con una actividad de enlace similar a la de los anticuerpos. Estos péptidos se pueden unir a proteínas con una afinidad relativamente elevada y proporcionar la misma función biológica que los anticuerpos excepto en que su semivida in vivo es muy corta. La fusión de estos péptidos con la transferrina podría conferir a estos péptidos una semivida mucho más larga sin destruir sus actividades de enlace. Estos péptidos se podrían fusionar a los términos N- o C- o a ambos en la molécula de transferrina. Los péptidos también pueden sustituir una parte de la transferrina. Además, se pueden fusionar más de una copia de un péptido o varios péptidos diferentes a una única molécula de transferrina. Un ejemplo de una molécula de este tipo es un péptido que se puede unir a TNF. La unión de este péptido a la transferrina proporcionaría a la transferrina la capacidad de unirse a TNF y actuar de manera similar a los anticuerpos anti-TNF. De esta manera, se podrían fabricar moléculas tipo anticuerpo con un protocolo de fabricación mucho más sencillo y económico.

Se incluyen también en la presente invención los péptidos inhibidores de enzimas fusionados a los términos N- o C- o ambos o en el interior de la molécula de transferrina. Los péptidos inhibidores de enzimas se podrían usar de cualquier manera, incluyendo terapia con fármacos o en procesos industriales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Las proteínas de fusión dirigidas a Tf tienen una combinación de dos o más proteínas o péptidos fusionados a Tf modificada para servir como molécula bifuncional. En este caso, la Tf modificada se fusiona con una proteína o péptido para tener una actividad biológica nueva ya otra proteína o péptido para la direccionamiento. Un ejemplo de este tipo de proteína es una Tf que contienen una proteína inhibidora tal como una endostatina y un péptido director tal como SCA o un péptido enlazante que puede reconocer tumores. De esta manera, la molécula inhibidora se dirige al tumor que lo necesita. El ADNc de esta proteína de interés se puede aislar de una biblioteca de ADNc o se puede fabricar sintéticamente usando varios cebadores oligonucleótidos solapantes usando procedimientos convencionales en biología molecular. Los nucleótidos adecuados se pueden insertar en el ADNc para que formen emplazamientos de restricción convenientes y permitan igualmente la unión del ADNc de la proteína al ADNc de la transferrina de manera similar al procedimiento descrito para otras fusiones. Igualmente, el ADNc de una proteína o péptido director tal como anticuerpos o péptidos de cadena sencilla, tales como señales de localización nuclear, que pueden dirigir proteínas al interior de las células se puede fusionar en el otro extremo de la transferrina o en su interior. La proteína de interés, y el péptido director, se clonan en vector, lo que permite la fusión con el ADNc de la transferrina. De esta forma ambas (ambos) proteínas/péptidos se fusionan con la transferrina modificada. A continuación, el ADNc fusionado se escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en la levadura.

Todos los procedimientos anteriores se pueden realizar usando procedimientos convencionales en biología molecular. La proteína de fusión secretada desde la levadura se puede recoger y purificar del medio y ensayarse para su actividad biológica y su actividad de dirección usando ensayos bioquímicos y biológicos adecuados. Estas proteínas se pueden también fabricar en otros sistemas tales como cultivo de tejidos celulares usando un vector y un protocolo de transfección adecuados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

El ADNc de una enzima de interés se puede aislar de diferentes maneras tal como RT-PCR procedente de mRNA, procedente de bibliotecas de ADNc, construyendo sintéticamente el ADNc a partir de oligonucleótidos solapantes, mediante PCR o con otros procedimientos conocidos en la técnica, usando todos procedimientos estandarizados. El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de manera que los enlazantes oligonucleótidos se pueden usar para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la Transferrina modificada. Esto puede ser en el extremo N- o en el C-, con o sin el uso de una secuencia separadora. El ADNc de la enzima se clona en un vector cuyo casete de expresión completo se escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura. La proteína de fusión secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio, y ensayarse para su actividad biológica. Para expresión en líneas celulares de mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Usando presentación de fago, los péptidos se aíslan específicamente para un marcador sobre la superficie de, por ejemplo, una célula tumoral. El péptido se fusiona a continuación con los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina modificada para dirigir la fusión a este tipo celular específico. A la proteína de fusión de transferrina se le introduce un ion metálico que se parece al hierro en sus propiedades de enlace a la transferrina, pero que es citotóxico, por ejemplo galio o iones radiactivos. Mediante este mecanismo, el galio o el ión radiactivo se dirige al tipo celular.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

En un ejemplo, un sistema de presentación de péptido para generar secuencias de péptidos de la presente invención utiliza la región N- de la transferrina incorporado a la proteína pIII y la inserción de péptidos dentro de la estructura de la transferrina (Tf). Debido a su naturaleza, estos péptidos quedan restringidos, y tienen la ventaja de ser seleccionados por el entorno, su posición en la molécula de transferrina, en la que se van a usar definitivamente.

La primera etapa es clonar el gen pIII de M13mp18 e introducir la región N- de la Transferrina en el término N de pIII. Los péptidos se insertan a continuación en bucles expuestos dentro de la molécula de transferrina.

\vskip1.000000\baselineskip

Construcción de la región N de la biblioteca de presentación de fago Clonación de pIII

La secuencia de ADN de pIII se amplificó mediante la PCR usando M13mp18 como plantilla para la inserción en pUC18 bajo el control del promotor LacZ. Como pIII requiere su propia secuencia líder para el procesado correcto, el producto de la PCR no se ubicó convenientemente en el emplazamiento de multiclonación (MCS) de pUC18. Se usó el emplazamiento HindIII del MCS para la ligadura en el extremo 3' de pIII y permitió la construcción de un codón de detención doble. Sin embargo, para ligadura en el extremo 5' se requiere insertar un emplazamiento de restricción, NcoI, alrededor del codón de inicio para el operón LacZ.

Usando el kit de Mutagénesis dirigida al emplazamiento Stratagene QuickChange XL (nº de catálogo 20051) se diseñaron cebadores para las mutaciones mostradas (fig. 5). El producto de esta mutagénesis, pUC18 NcoI, se digirió a continuación con NcoI/HindIII en preparación de la clonación de pIII.

Se diseñaron cebadores (fig. 6) para introducir un emplazamiento NcoI en el 5' de pIII y un doble codón de detención más emplazamiento HindIII en el 3' de pIII mediante mutagénesis por PCR usando M13mp18 como plantilla. Estos emplazamientos dieron como resultado una inserción en el marco de pIII con la metionina N terminal de LacZ y la rotura del transcripto LacZ normal tras la clonación en el en pUC18NcoI digerido cono NcoI/HindIII como un fragmento NcoI/HindIII. Esto produjo el plásmido pUC18pIII.

Se diseñaron cebadores (fig. 7) para introducir un emplazamiento SacII usando el kit de Mutagénesis dirigida al emplazamiento Stratagene QuickChange XL (nº de catálogo 20051) en la unión entre la secuencia señal de pIII y la pIII madura dando como resultado el plásmido pUC18pIIISacII.

Esto permitió que la región N de la Transferrina se modificara mediante PCR mutagénica, con pREX0056 como plantilla, para introducir un emplazamiento SacII 5' y un emplazamiento SfiI 3' (fig. 8) para clonación en
pUC18pIIISacII digerido mediante SacII/SfiI para dar pUC18pIII Ndom.

\vskip1.000000\baselineskip

Inserción de la secuencia de péptido aleatorio

Una ADN que codificaba una secuencia de péptido aleatorio de ocho aminoácidos se cortó y empalmó a la región N de la Transferrina entre los aminoácidos 288 y 289 con el objeto de generar una biblioteca de péptido aleatorio en la superficie de la región N de la Transferrina que se pueda cribar frente a potenciales dianas para aislar péptidos que, en el contexto de su presentación, se unan con afinidad elevada. La metodología descrita se pueden usar en el corte y empalme de un ADN que codifique una secuencia o secuencias de péptido aleatorio en otros puntos de la superficie de la región N de la Transferrina. Debido a la homología estructural entre las regiones N y C de la Transferrina, una vez se ha aislado un péptido desde la librería de región N, ésta se puede duplicar en la posición equivalente de la región C para dar multivalencia.

\vskip1.000000\baselineskip

Biblioteca de fagos

La secuencia de péptido aleatorio se generó mediante PCR mutagénica (Immunological Method Manual, Lefkovits, L. (Ed.) 1977 Academic Press) (fig. 9). Se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos mutagénicos (C (P0234) y D (P0235)) (Fig. 10). Usando pUC18pIIINdom como plantilla y dos cebadores externos (A y B) se sintetizó un fragmento de ADN con la secuencia aleatoria insertada. Este fragmento se digirió con EcoRI/SfiI y se ligó en pUC18pIIINdom digerido con EcoRI/SfiI. A continuación, el ADN unido se transformó en una biblioteca de DH5 \alpha o de otra cepa de E. coli. La biblioteca se comprobó mediante procedimientos estandarizados para determinar el tamaño de la biblioteca y la variabilidad de la secuencia insertada seguido por amplificación de la biblioteca para uso en el cribado.

La biblioteca construida de esta manera se puede usar de dos maneras. Como tal, la fusión región N-pIII se localiza en la membrana celular, con la región N orientada hacia el espacio periplásmico. Por rotura suave de la membrana externa, se pueden cribar células completas frente al antígeno diana. La bacteria que contiene la biblioteca de presentación de fago se puede plaquear en medio agar y dejarse crecer y expresar la proteína pIII. A continuación, un papel de filtro réplica procedente de la placa se sondea con el antígeno diana. La colonia bacteriana que muestra enlace con el antígeno se puede recoger de la plana original y subclonarse adicionalmente. La secuencia del péptido active se puede identificar aislando de la bacteria el plásmido que contiene pIII. Se pueden usar protocolos similares para usar levaduras que contienen péptidos frente a un antígeno específico. Como las colonias de levaduras y bacterias están localizadas, el protocolo se puede usar para células unidas o bibliotecas secretadas.

Con la adición de una secuencia de empaquetado funcional en el vector pUC18pIIINdom, la biblioteca se puede usar en el sistema de dos vectores anteriormente descrito para generar partículas de fago que se pueden cribar de diferentes formas como se describe en la bibliografía.

\vskip1.000000\baselineskip

Biblioteca de levaduras

Usando el mismo conjunto de cebadores mutagénicos (P0234 y P0235) pero un conjunto diferente de cebadores externos y pREX0056 como plantilla, se sintetiza un fragmento PCR con la secuencia aleatoria para construcción de una biblioteca de presentación de la región N de levaduras. Esto es, una biblioteca secretada o un constructo anclado a la pared celular de una célula individual usando un ancla GPI específica de la pared celular (Hamada y col., 1998, J. Biol. Chem. 273:26946-53) en un vector con bajo número de copia.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a los ejemplos anteriores, se entiende que se pueden realizar distintas modificaciones sin separarse del espíritu de la invención. Según esto, la invención queda limitada únicamente por las siguientes reivindicaciones.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 48540403 P [0001]

\bullet US 38406003 A [0001]

\bullet US 40699702 P [0001]

\bullet US 5876969 A [0005]

\bullet US 5766883 A [0005]

\bullet US 5672683 A [0006]

\bullet US 5977307 A [0006]

\bullet US 5026651 A [0007] [0008]

\bullet US 5986067 A [0008] [0072] [0080] [0087] [0144] [0333] [0473] [0474]

\bullet US 5698195 A [0013] [0530]

\bullet WO 9417810 A [0037]

\bullet WO 9423744 A [0037]

\bullet US 40697702 P [0062]

\bullet US 406977 P [0064]

\bullet US 4683195 A, Mullis [0106]

\bullet US 4683202 A, Mullis [0106]

\bullet US 5547871 A [0110] [0130]

\bullet US 6291212 B [0114] [0115] [0117] [0118] [0120] [0130]

\bullet EP 171142 A, Kawasaki and Bell [0115]

\bullet US 4599311 A, Kawasaki [0115]

\bullet EP 0258067 A [0115]

\bullet EP 0286424 A [0115]

\bulletEP 0317254 A [0115]

\bulletEP 0387319 A [0115]

\bullet EP 0386222 A [0115]

\bullet EP 0424117 A [0115]

\bullet EP 0431880 A [0115]

\bullet EP 1002095 A [0115]

\bullet EP 0828759 A [0115]

\bullet EP 0764209 A [0115]

\bullet EP 0749478 A [0115]

\bullet EP 0889949 A [0115]

\bullet WO 0044772 A [0115]

\bullet WO 9404687 A [0115]

\bullet US 5739007 A [0115]

\bullet US 5637504 A [0115]

\bullet US 5302697 A [0115]

\bullet US 5260202 A [0115]

\bullet US 5667986 A [0115]

\bullet US 5728553 A [0115]

\bullet US 5783423 A [0115]

\bullet US 5965386 A [0115]

\bullet US 6150133 A [0115]

\bullet US 6379924 A [0115]

\bullet US 5714377 A [0115]

\bullet WO 03020746 A [0134] [0156] [0190] [0202]

\bullet US 4652440 A, Eckelman [0139]

\bullet WO 8705030 A, Parker [0139]

\bullet EP 203764 A, Wilber [0139]

\bullet US 4656026 A, Coffman [0139]

\bullet WO 942820 A [0183]

\bullet WO 9619495 A [0183]

\bullet WO 9640191 A [0183]

\bullet WO 0164013 A [0183]

\bullet US 6333395 B [0183]

\bullet US 6258782 B [0183]

\bullet US 6228983 B [0183]

\bullet US 6133418 A [0183]

\bullet US 6093794 A [0183]

\bullet US 6068973 A [0183]

\bullet US 6060065 A [0183]

\bullet US 6054265 A [0183]

\bullet US 6020459 A [0183]

\bullet US 6017536 A [0183]

\bullet US 6013263 A [0183]

\bullet US 5464933 A [0183]

\bullet US 5346989 A [0183]

\bullet US 5603933 A [0183]

\bullet US 5656480 A [0183]

\bullet US 5759517 A [0183]

\bullet US 6245737 B [0183]

\bullet US 6326004 B [0183]

\bullet US 6348568 B [0183]

\bullet WO 0179258 A [0189] [0202]

\bullet WO 0177137 A [0189] [0202]

\bullet WO 0179442 A [0189] [0202]

\bullet WO 0179443 A [0189] [0202]

\bullet WO 0179444 A [0189] [0202]

\bullet WO 0179480 A [0189] [0202]

\bullet US 6291740 B [0341] [0345]

\bullet US 6281408 B [0341] [0346]

\bullet US 6271436 B [0341] [0347]

\bullet WO 9008832 A [0344]

\bullet US 6225290 B [0350] [0351]

\bullet US 6187305 B [0350] [0352]

\bullet US 6140111 A [0350] [0353]

\bullet US 4868116 A [0353]

\bullet US 4980286 A [0353]

\bullet WO 8907136 A [0353]

\bullet EP 378576 A [0353]

\bullet WO 8905345 A [0353]

\bullet WO 9006997 A [0353]

\bullet US 6562617 B [0356]

\bullet US 5270170 A [0370]

\bullet US 5824483 A [0415]

\bullet US 5571698 A, Ladner [0417]

\bullet US 9117271 W [0422]

\bullet US 9118980 W [0422]

\bullet US 9119818 W [0422]

\bullet US 9308278 W [0422]

\bullet US 6555310 B [0424]

\bullet US 6258350 B [0426]

\bullet US 5922545 A [0439]

\bullet US 6300064 B [0440]

\bullet US 6573098 B [0452] [0466]

\bullet US 4703008 A [0502]

\bullet US 4810643 A [0502]

\bullet US 5908763 A [0502]

\bullet US 5326859 A [0505]

\bullet US 4588585 A [0505]

\bullet EP 32134 A [0505]

\bullet US 60406977 B [0530]

\bullet US 10384060 B [0530]

\bullet US 60485404 B [0530]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletPark et al. Journal of Drug Targeting, vol. 6 (1), 53-64 [0006]

\bulletAli et al. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274 (34), 24066-24073 [0006] [0094]

\bulletShin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, 2820-2824 [0006]

\bulletAisen et al. Ann. Rev. Biochem., 1980, vol. 49, 357-393 [0007]

\bulletMacGillivray et al. J. Biol. Chem., 1981, vol. 258, 3543-3553 [0007]

\bullet van Eijk et al. Clin. Chim. Acta, 1983, vol. 132, 167-171 [0007]

\bulletStibler. Clin. Chem., 1991, vol. 37, 2029-2037 [0007]

\bulletArndt. Clin. Chem., 2001, vol. 47 (1), 13-27 [0007]

\bullet Carbohydrate-deficient consumption. Stibler et al. Advances in the Biosciences. Pergamon, 1988, vol. 71, 353-357 [0007]

\bulletMacGillivray et al. J. Biol. Chem., 1983, vol. 258 (6), 3543-3546 [0008]

\bulletBatzer et al. Nucleic Acid Res., 1991, vol. 19, 5081 [0026]

\bulletOhtsuka et al. J. Biol. Chem., 1985, vol. 260, 2605-2608 [0026]

\bulletRossolini et al. Mol. Cell. Probes, 1994, vol. 8, 91-98 [0026]

\bulletMa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, vol. 94, 12744-12746 [0037]

\bulletCranage et al. EMBO J., 1986, vol. 5, 3057-3063 [0037]

\bullet The Immunoglobulin Gene Superfamily. A. F. Williams; A. N. Barclay. Immunoglobulin Genes. Academic Press, 1989, 361-387 [0049]

\bulletChothia; Lesk. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901 [0050]

\bulletChothia et al. Nature, 1989, vol. 342, 877 [0050]

\bullet E. A. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1987 [0050]

\bulletTramontano et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 175 [0050]

\bullet E. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of Health and Human Services, 1987 [0051]

\bulletBrown et al. Nature, 1982, vol. 296, 171-173 [0057]

\bulletRose et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 1261-1265 [0057]

\bulletBaker et al. FEBS Lett, 1992, vol. 298, 215-218 [0057]

\bulletAlemany et al. J. Cell Sci., 1993, vol. 104, 1155-1162 [0057]

\bulletFood et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 274, 7011-7017 [0057]

\bulletBennett et al. Clin. Sci. (Lond.), 1979, vol. 57, 453-460 [0058]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0081]

\bulletFord et al. Prot. Exp. Pur., 1991, vol. 2, 95-107 [0083]

\bulletBaldwin, G.S. Comparison of Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem. Physiol., 1993, vol. 106B (1), 203-218 [0106]

\bullet Computational Molecular Biology. Oxford University Press, 1988 [0107]

\bullet Biocomputing: Informatics and Genome Projects. Academic Press, 1993 [0107]

\bullet Computer Analysis of Sequence Data, Part I. Humana Press, 1994 [0107]

\bulletHeinje, G. Sequence Analysis in Molecular Biology. Academic Press, 1987 [0107] [0108]

\bullet Sequence Analysis Primer. M Stockton Press, 1991 [0107] [0108]

\bulletCarillo, H.; Lipman, D. SIAM J. Applied Math., 1988, vol. 48, 1073 [0108]

\bullet Guide to Huge Computers. Academic Press, 1994 [0108]

\bulletDevereux et al. Nucl. Acid Res., 1984, vol. 12 (1), 387 [0109]

\bulletAtschul et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403 [0109]

\bulletNeedleman; Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443-453 [0109]

\bulletGrantham, R et al. Nucl. Acid Res., 1980, vol. 8, 49-62 [0111]

\bulletGrantham, R. et al. Nucl. Acid Res., 1981, vol. 9, 43-74 [0111]

\bulletMaroyarna, T. et al. Nucl. Acid Res., 1986, vol. 14, 151-197 [0111]

\bulletAota, S. et al. Nucl. Acid Res., 1988, vol. 16, 315-402 [0111]

\bulletWada, K. et al. Nucl. Acid Res., 1991, vol. 19, 1981-1985 [0111]

\bulletKurland, C. G. FEBS Lett., 1991, vol. 285, 165-169 [0111]

\bulletPedersen, S. EMBO J., 1984, vol. 3, 2895-2898 [0111]

\bulletSorensen, M. A. J. Mol. Biol., 1989, vol. 207, 365-377 [0111]

\bulletRandall, L. L. et al. Eur. J. Biochem., 1980, vol. 107, 375-379 [0111]

\bulletCurran, J. F.; Yarus, M. J. Mol. Biol., 1989, vol. 209, 65-77 [0111]

\bulletVarenne, S. et al. J. Mol. Biol., 1984, vol. 180, 549-576 [0111]

\bulletVarenne, S. et al. J. Mol, Biol., 1984, vol. 180, 549-576 [0111]

\bulletGarel, J.-P. J. Theor. Biol., 1974, vol. 43, 211-225 [0111]

\bulletIkemura, T. J. Mol. Biol., 1981, vol. 146, 1-21 [0111]

\bulletIkemura, T. J. Mol. Biol., 1981, vol. 151, 389-409 [0111]

\bulletStruhl et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 76, 1035-1039 [0114]

\bulletBroach et al. Gene, 1979, vol. 8, 121-133 [0114]

\bulletBeggs. Nature, 1978, vol. 275, 104-108 [0114]

\bulletBotstein et al. Gene, 1979, vol. 8, 17 [0115]

\bulletHitzeman et al. J Biol. Chem., 1980, vol. 225, 12073-12080 [0115]

\bulletAlber; Kawasaki. J. Mol. Appl. Genet., 1982, vol. 1, 419-434 [0115]

\bulletYoung et al. Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals. Plenum, 1982, 355 [0115]

\bulletAmmerer. Meth. Enzymol., 1983, vol. 101, 192-201 [0115]

\bulletRussell et al. Nature, 1983, vol. 304, 652-654 [0115]

\bulletMcKnight et al. EMBO J., 1985, vol. 4, 2093-2099 [0116]

\bulletKaufman; Sharp. Mol. Cell. Biol., 1982, vol. 2, 1304-13199 [0117]

\bulletSubramani et al. Mol. Cell. Biol., 1981, vol. 1, 854-864 [0117]

\bulletPalmiter et al. Science, 1983, vol. 222, 809-814 [0117]

\bulletGrant et al. Nuc. Acids Res., 1987, vol. 15, 5496 [0117]

\bulletDeNoto et al. Nucl. Acid Res., 1981, vol. 9, 3719-3730 [0118]

\bulletGillies. Cell, 1983, vol. 33, 717-728 [0118]

\bulletHinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 1929-1933 [0119]

\bulletYelton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 1740-1747 [0119]

\bulletRussell. Nature, 1983, vol. 301, 167-169 [0119]

\bulletBecker; Guarente. Methods in Enzymol., 1991, vol. 194, 182-187 [0119]

\bulletWigler et al. Cell, 1978, vol. 14, 725 [0120]

\bulletCorsaro; Pearson. Somatic Cell Genetics, 1981, vol. 7, 603 [0120]

\bulletGraham; Van der Eb. Virology, 1973, vol. 52, 456 [0120]

\bulletNeumann et al. EMBO J., 1982, vol. 1, 841-845 [0120]

\bulletSimonsen; Levinson. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 2495-2499 [0120]

\bulletThilly. Mammalian Cell Technology. Butterworth Publishers [0120]

\bulletSteinlein et al. Protein Express. Purif., 1995, vol. 6, 619-624 [0123]

\bulletBallou et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 5986-5991 [0124]

\bulletGentzsch; Tanner. Glycobiology, 1997, vol. 7, 481-486 [0124]

\bulletJones. Genetics, 1977, vol. 85, 23-33 [0125]

\bulletTowbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 4350-4354 [0133]

\bulletAldred et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, vol. 122, 960-965 [0144]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc, 1989 [0163]

\bulletBrufiag et al. Comp. App. Biosci, 1990, 245 [0165]

\bulletBowie et al. Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions. Science, 1990, vol. 247, 1306-1310 [0167]

\bullet T. E. Creighton. PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES. W. H. Freeman and Company, 1993 [0169]

\bullet POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS. Academic Press, 1983, 1-12 [0169]

\bulletSeifter et al. Meth. Enzymol., 1990, vol. 182, 626-646 [0169]

\bulletRattan et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., vol. 663, 48-62 [0169]

\bulletJohnson et al. Nephrol. Dial. Transplant, 2000, vol. 15 (9), 1274-7 [0184]

\bulletKuai et al. J. Pept. Res., 2000, vol. 56 (2), 59-62 [0184]

\bulletBarbone et al. Nephrol. Dial. Transplant., 1999, vol. 14 (2), 80-4 [0184]

\bulletMiddleton et al. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274 (20), 14163-9 [0184]

\bulletJohnson et al. Biochemistry, 1998, vol. 37 (11), 3699-710 [0184]

\bulletJohnson et al. Chem. Biol., 1997, vol. 12, 939-50 [0184]

\bulletWrighton et al. Nat. Biotechnol., 1997, vol. 15 (12), 1261-5 [0184]

\bulletLivnah et al. Science, 1996, vol. 273, 464-71 [0184]

\bulletWrighton et al. Science, 1996, vol. 273, 458-64 [0184]

\bulletPoljak-Blazi et al. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals (United States), June 2000, vol. 15/3, 285-293 [0193]

\bulletDemant, E.J. Eur. J. Biochem., 1983, vol. 137 (1-2), 113-118 [0194]

\bulletPadbury et al. J. Biol. Chem., 1985, vol. 260 (13), 7820-7823 [0194]

\bulletRobbins; Angell. Basic Pathology. W. B. Saunders Co, 1976, 68-79 [0246]

\bulletCurr. Top. Microbiol. Immunol., 1998, vol. 231 (1), 41 [0258]

\bulletScience, 1997, vol. 276, 59-87 [0314]

\bulletXia et al. J. Pharmacol. Experiment. Therap., 2000, vol. 295, 594-600 [0328] [0335]

\bulletXia et al. Pharmaceutical Res., 2001, vol. 18 (2), 191-195 [0328] [0335]

\bulletShah et al. J. Pharmaceutical Sci., 1996, vol. 85 (12), 1306-1311 [0328]

\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1990 [0329]

\bullet Oral Delivery of Microencapsulated Proteins. DiBase; Morrel. Protein Delivery:Physical Systems. Plenum Press, 1997, 255-288 [0331]

\bulletWall et al. J. Cell. Biochem., 1992, vol. 49, 113 [0343]

\bulletJanenich. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, vol. 73, 1260 [0343]

\bulletJanenich et al. Cell, 1981, vol. 24, 519 [0343]

\bulletStuhlmann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 7151 [0343]

\bulletJahner et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1985, vol. 82, 6927 [0343]

\bullet Van der Putten et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1985, vol. 82, 6148-6152 [0343]

\bulletStewart et al. EMBO J., 1987, vol. 6, 383-388 [0343]

\bulletJahner, D. et al. Nature, 1982, vol. 298, 623 [0344]

\bulletHaskell; Bowen. Mol. Reprod. Dev., 1995, vol. 40, 386 [0344]

\bulletIjima et al. Human Gene Therapy (United States), 2001, vol. 12 (9), 1063-77 [0349]

\bulletPluckthun; Ge. Angew. Chem. Int Ed. Engl., 1991, vol. 30, 296-298 [0367]

\bulletBartel P. L.; Roecklein J. A. et al. Nat Genet, January 1996, vol. 12 (1), 72-77 [0373]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0374]

\bulletMcBride; Caruthers. Tetr. Letters, 1983, vol. 22, 245 [0377]

\bulletAtkinson; Smith. Oligonucleotide Synthesis. 1984, 35-82 [0378]

\bulletQin Z.; Kruger-Krasagakes S. et al. J. Exp. Med., vol. 178, 355-360 [0391]

\bulletGoddijn O. J.; Pennings E. J. et al. Transgenic Res., 1995, vol. 4, 315-323 [0391]

\bulletLeung et al. Technique, 1989, vol. 1, 11-15 [0406]

\bulletEipper et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 7827-7833 [0411]

\bulletMizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1986, vol. 137 (3), 984-991 [0411]

\bulletMurthy et al. J. Biol. Chem., 1986, vol. 261 (4), 1815-1822 [0411]

\bulletKatopodis et al. Biochemistry, 1990, vol. 29, 6115-6120 [0411]

\bulletYoung; Tamburini. J. Am. Chem. Soc., 1989, vol. 111, 1933-1934 [0411]

\bulletCwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6378-6382 [0417] [0419]

\bulletDevlin et al. Science, 1990, vol. 249, 404-406 [0417] [0419]

\bulletScott; Smith. Science, 1990, vol. 249, 386-388 [0417]

\bulletParmley; Smith. Gene, 1988, vol. 73, 305-318 [0419] [0425]

\bulletScott; Smith. Science, 1990, vol. 249, 386-390 [0419]

\bulletGarrard et al. Bio/Tech, 1991, vol. 9, 1373-1377 [0423]

\bulletScott; Smith. Science, 1990, vol. 249, 386 [0428]

\bulletKang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1991, vol. 88, 4363 [0429]

\bulletClackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624 [0429] [0441]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552 [0429] [0441]

\bulletBurton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1991, vol. 88, 10134 [0429]

\bulletHoogenboom et al. Nucleic Acids Res., 1991, vol. 19, 4133 [0429]

\bulletChang et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 3610 [0429] [0441]

\bulletBreitling et al. Gene, 1991, vol. 104, 147 [0429] [0441]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0429] [0441]

\bulletBarbas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1992, vol. 89, 4457 [0429]

\bulletHawkins; Winter. J. Immunol., 1992, vol. 22, 867 [0429] [0441]

\bulletMarks et al. Biotechnology, 1992, vol. 10, 779 [0429] [0430] [0441]

\bulletMarks et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 16007 [0429] [0441]

\bulletLowman et al. Biochemistry, 1991, vol. 30, 10832 [0429] [0441]

\bulletLerner et al. Science, 1992, vol. 258, 1313 [0429] [0441]

\bulletWinter G; Milstein C. Nature, 1991, vol. 349, 293 [0430]

\bulletHarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0430]

\bulletChaudhary et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 1066 [0430]

\bulletChiswell et al. TIBTECH, 1992, vol. 10, 80 [0430]

\bulletHuston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988, vol. 85, 5879 [0430]

\bulletStemmer et al. Biotechniques, 1993, vol. 14, 256 [0438]

\bulletDeng et al. J. Biol. Chem., 1994 vol. 269, 9533 [0438]

\bulletRiechmann et al. Biochemistry, 1993, vol. 32, 8848 [0438]

\bulletBarbas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4457 [0438]

\bulletHuse et al. Science, 1989, vol. 246, 1275 [0441]

\bulletCaton; Koprowski. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 6450 [0441]

\bulletMullinax et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 8095 [0441]

\bulletPersson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 2432 [0441]

\bulletKang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 4363 [0441]

\bulletBurton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 10134 [0441]

\bulletHoogenboom et al. Nucl. Acid Res., 1991, vol. 19, 4133 [0441]

\bulletBarbas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1992, vol. 89, 4457 [0441]

\bulletRader, C.; Barbas, C. F. Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr. Opin. Biotechnol., 1997, vol. 8, 503-508 [0441]

\bulletKunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, 488-492 [0473]

\bulletNelson, R. M.; Long, G. L. Anat. Biochem., 1989, vol. 180, 147-151 [0474]

\bullet Immunological Method Manual. Academic Press, 1977 [0525]

\bulletHamada et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 26946-53 [0528]

<110> Prior, Christopher P. Turner, Andrew J. Sadeghi, Homayoun

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Bibliotecas de Proteínas de Fusión de la Transferrina

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 054710-5007-WO

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/406.977

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-08-2002

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 10/384.060

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 10-03-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/485.404

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 09-07-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (51)..(2147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GenBank Nº NM_001063, gen y proteína de la transferrina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (51)..(107)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 698

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 679

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína transferrina madura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

22

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia variante de corte y empalme de lactoferrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido para la mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaaaact acgataagag cgataat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido para la mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatttggaa gcgacgtaac tgactgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidomimético de EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidomimético de EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(108)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH para proteínas de fusión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(123)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH para proteínas de fusión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína INGAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

36

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(525)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(444)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(436)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de miméticos EPO

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(60)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencias de miméticos EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

440

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Región de inserción en el péptido de transferrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Región de inserción en el péptido de transferrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de ADN transferrina en la región de inserción en el péptido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de ADN transferrina en la región de inserción en el péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptidomimético EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plantilla para general la biblioteca de péptidos

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó c ó g ó t; k = g ó t.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nnknnknnkn nknnknnknn knnknnknnk

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plantilla para general la biblioteca de péptidos

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1). .(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó c ó g ó t; m = a ó c.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nnmnnmnnmn nmnnmnnmnn mnnmnnmnnm

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plantilla para la región de separación de un anticuerpo de cadena única

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

480

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Gly ó -NH2, aminoácidos 7-36/37 de GLP-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plantilla C-terminal para amidación

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de enlace para fragmentos Fv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 676

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 676

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

55

57

\newpage

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 677

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

59

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Equus caballus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

62

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 685

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

65

66

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 696

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (308)..(308)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

68

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 686

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

71

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa/ScFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV, SEC. DE ID Nº 5 del documento US 5.698.195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18254

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature, Nº de acceso Gen Bank BAB18256

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18256

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región del emplazamiento NcoI de pUC18

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(140)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región del emplazamiento NcoI de pUC18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ccatggccat gattacg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtaatcatg gccatggctg tttcctg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de recubrimiento M13 pIII para inserción en los vectores pUC18

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(1349)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de recubrimiento M13 pIII para inserción en los vectores pUC18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

86

87

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagcc atggtgaaaa aattattatt cgcaattcct ttag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacggccag tgccaagctt attaagactc cttattacgc agtatgttag c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región de inserción de transferrina en los vectores M13-pUC18

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(140)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región de inserción de transferrina en los vectores M13-pUC18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctattctcac tccgcggacg gggctgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagccccgt ccgcggagtg agaatag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región N de la transferrina modificada para clonación en los vectores M13-pUC18 vectors

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(1118)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

90

91

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región N de la transferrina modificada para clonación en los vectores M13-pUC18 vectors

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

93

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcactccgc ggacggggcg gtacctgata aaactgtgag atgg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttcaacag tttcggcccc agcggcccct tcatctgttg gggcttctg

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región variable para generar una biblioteca en los vectores M13-pUC18

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(282)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó c ó g ó t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(282)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 11 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 12 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 13 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 14 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 15 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 16 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 17 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" en la localización 18 define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región variable para generar una biblioteca en los vectores M13-pUC18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó c ó g ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de clonación

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a ó c ó g ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa/ScFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV, SEC. DE ID Nº5 del documento US 5.698.195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región HV de un anticuerpo anti-TNF-alfa/ScFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región V_{L} de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18253

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región V_{L} de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18255

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región V_{L} de un anticuerpo anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank BAB18257

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

104

Claims (34)

1. Biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR).

2. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende la región N de una proteína Tf.

3. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf está constituido por la región N de una proteína Tf.

4. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende una porción de la región N de una proteína Tf.

5. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf muestra una glicosilación reducida.

6. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido está fusionado con el extremo C-terminal del péptido Tf.

7. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido está fusionado con el extremo N-terminal del péptido Tf.

8. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido se inserta en el péptido Tf.

9. Biblioteca de la reivindicación 8, en la que el segundo péptido está insertado en un bucle expuesto a la superficie del péptido Tf.

10. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que las proteínas de fusión comprenden adicionalmente un enlazante flexible entre el péptido transferrina y el péptido aleatorio.

11. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que cada uno de los segundos péptidos de la biblioteca es diferente.

12. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR).

13. Biblioteca de la reivindicación 12, en la que el segundo péptido comprende tres CDR de anticuerpo diferentes.

14. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende aproximadamente 6 o más aminoácidos.

15. Biblioteca de la reivindicación 14, en la que el segundo péptido comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos.

16. Biblioteca de la reivindicación 15, en la que el segundo péptido comprende aproximadamente 6, 9, 12, 16, 19, 20, 25, o 30 aminoácidos.

17. Biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifican una biblioteca de la reivindicación 1.

18. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de presentación de fagos no líticos.

19. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de péptidos aleatorios o una biblioteca de péptidos naturales.

20. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de péptidos estructurados, una biblioteca de proteínas, una biblioteca de anticuerpos humanos, una biblioteca de péptidos lineales, o una biblioteca de enzimas.

21. Procedimiento para cribar una proteína de fusión de transferrina que tiene una actividad particular que comprende:

a) proporcionar una biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer péptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido en el que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR); y

b) cribar la biblioteca para identificar las proteínas de fusión de transferrina que tienen la actividad particular.

\newpage

22. Procedimiento de la reivindicación 21, que comprende además aislar al menos una proteína de fusión identificada en la etapa (b).

23. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende una proteína pIII de fago.

24. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección o adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de la SEC. DE ID. Nº: 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.

25. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une a TfR.

26. Biblioteca de la reivindicación 25, en la que el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección o adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de la SEC. DE ID. Nº 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.

27. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el hierro.

28. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une al hierro.

29. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la proteína Tf comprende al menos una mutación que evita la glicosilación.

30. Biblioteca de la reivindicación 29, en la que la mutación corresponde a una mutación en el aminoácido N413 o en el aminoácido N611.

31. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el bicarbonato.

32. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une al bicarbonato.

33. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf está modificado en uno o más de los emplazamientos internos seleccionado entre el grupo que comprende el emplazamiento de unión al hierro, el emplazamiento de la bisagra, el emplazamiento de unión al bicarbonato, y el emplazamiento de unión al receptor.

34. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende una única región N de una proteína Tf.