ES2337245T3 - Bibliotecas de proteinas de fucion de la transferrina. - Google Patents
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Abstract
Biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR).
Description
Bibliotecas de proteínas de fusión de la
transferrina.
La presente invención reivindica la prioridad de
la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/485.404,
presentada el 9 de julio de 2003, la Solicitud de Patente de los
Estados Unidos 10/384.060, presentada el 10 de marzo de 2003, y la
Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.997 presentada el
30 de agosto de 2002.
La presente invención se refiere a bibliotecas
de fagos que contienen proteínas o péptidos con estabilidad en
suero y/o semivida circulatoria in vivo ampliadas,
particularmente a proteínas o péptidos fusionados a o insertados en
una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la
unión al receptor de la transferrina.
Las proteínas o péptidos terapéuticos en su
estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son
moléculas típicamente lábiles que presentan cortos periodos de
estabilidad en suero o cortas semividas circulatorias in
vivo. Adicionalmente, estas moléculas son a menudo
extremadamente lábiles cuando están en una formulación,
particularmente cuando se formulan en disoluciones acuosas con
objetivos diagnósticos y terapéuticos.
Existen pocas soluciones prácticas para
prolongar o potenciar la estabilidad in vivo o in
vitro de las moléculas proteináceas terapéuticas.
Polietilenglicol (PEG) es una sustancia que se puede unir a una
proteína, dando como resultado una actividad sostenida, de mayor
duración, de la proteína. Si la actividad de la proteína se
prolonga mediante la unión a PEG, se puede disminuir la frecuencia
en la que se necesita administrar la proteína. La unión a PEG, sin
embargo, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de
la proteína. Aunque en algún caso la unión a PEG puede reducir la
inmunogenicidad de la proteína, en otros ejemplos puede aumentar la
inmunogenicidad.
Las proteínas o péptidos terapéuticos se han
estabilizado también mediante fusión a una proteína capaz de
prolongar la semivida circulatoria in vivo de la proteína
terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas a
albúmina o a fragmentos de anticuerpos pueden presentar semivida
circulatoria extendida in vivo en comparación con la
proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véanse las Patentes
de los Estados Unidos 5.876.969 y 5.766.883.
Otra proteína sérica, la transferrina humana
glicosilada (Tf), se ha usado para realizar fusiones con proteínas
terapéuticas para dirigir la administración hacia el interior de las
células o para trasportar agentes a través de la barrera
hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden la Tf
humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de
crecimiento nervioso (NGF) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF) a
través de la barrera hematoencefálica fusionando la Tf de longitud
completa con el agente. Véanse las Patentes de los Estados Unidos
5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la porción Tf
de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro,
que son necesarios para la unión de la Tf con su receptor en una
célula y, según los inventores de estas patentes, para dirigir la
administración del resto NGF o el CNTF a través de la barrera
hematoencefálica. Park y col (Journal of Drug Targeting Vol 6, Nº 1
pp 53-64) exploran la capacidad de usar fusiones
genéticas o transferrina como vehículo para la dirección y la
administración en el cerebro. Se han producido también proteínas de
fusión de la transferrina insertando una secuencia diana de la
proteasa de VIH-1 en los bucles expuestos a la
superficie de la transferrina glicosilada para investigar la
capacidad de producir otra forma de la Tf de fusión para la dirigir
la administración al interior de una célula mediante el receptor de
Tf (Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34):
24066-24073). Véase también Shin y col (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA Vol. 92, pp 2820-2824).
La transferrina sérica (Tf) es una glicoproteína
monomérica con un peso molecular de 80.000 dalton que se une al
hierro en la circulación y trasporta esto a diverso tejidos mediante
el receptor de la transferrina (TfR) (Aisen y col. (1980) Ann. Rev.
Biochem. 49: 357-393; MacGillivray y col. (1981) J.
Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de los Estados
Unidos 5.026.651). Tf es una de las moléculas séricas más comunes,
que comprende hasta aproximadamente un 5-10% de las
proteínas séricas totales. Se produce transferrina deficiente en
carbohidratos en grandes cantidades en la sangre de individuos
alcohólicos y presenta una semivida más larga (aproximadamente
14-17 días) que la de la transferrina glicosilada)
(aproximadamente 7-10 días) Véanse van Eijk y col.
(1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler
(1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Arndt
(2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler y
col. en "Carbohydrate-deficient consumption",
Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann y col.), Pergamon, 1988,
Vol. 71, páginas 353-357).
Se ha caracterizado bien la estructura de Tf y
el mecanismo de la unión al receptor, la unión y liberación de
hierro y se ha elucidado la unión al ión carbonato (Patentes de los
Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray y col. (1983) J.
Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).
Se han usado también transferrina y los
anticuerpos que se unen al receptor de la transferrina para
administrar o trasportar agentes tóxicos a células tumorales como
terapia para el cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y se ha usado
transferrina como un vector no vírico de terapia génica para
administrar ADN a las células (Frank y col, 1994; Wagner
y col, 1992). Se ha demostrado la capacidad de liberar
proteínas en el sistema nervioso central (SNC) usando el receptor
de la transferrina como punto de entrada con diversas proteínas y
péptidos entre los que se incluyen CD4 (Walus y col, 1996),
el factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge y col,
1994), factor neurotrófico derivado de la glia (Albeck y
col), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel y
col, 1993), un péptido beta-amiloide (Saito y
col, 1995), y un oligonucleótido de sentido contrario (Pardridge
y col, 1995).
Sin embargo, las proteínas de fusión de la
transferrina no se han modificado o construido mediante ingeniería
genética para prolongar la semivida circulatoria in vivo de
una proteína ni de un péptido terapéutico o para aumentar la
biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glicosilación del resto
de Tf ni para reducir o evitar la unión al receptor de Tf y/o el
hierro.
Según se describe con más detalle a
continuación, la presente invención incluye una biblioteca de fagos
que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo
cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado a al
menos un segundo polipéptido, en el que el péptido Tf tiene afinidad
reducida por un receptor de la transferrina (TfR).
En una realización preferida, las proteínas de
fusión Tf modificadas comprenden un resto Tf de transferrina humana
que se ha modificado para reducir o evitar la unión al hierro y al
receptor y opcionalmente la glicosilación.
Figura 1. Muestra una alineación de la Regiones
N y C de la transferrina (Tf) Humana (Hu) (aminoácidos
1-331 y 332-679 de la SEC DE ID Nº:
3, respectivamente) con las similitudes e identidades
resaltadas.
Figura 2A-2B. Muestra una
alineación de las secuencias de transferrina de diferentes especies
animales. Sombreo claro: Similitud; Sombreo oscuro: Identidad. Las
especies son como sigue: conejo (SEC DE ID Nº: 37), rata (SEC DE ID
Nº: 38); ratón (SEC DE ID nº: 39), caballo (SEC DE ID Nº: 40),
bovino (SEC DE ID Nº: 41), cerdo (SEC DE ID Nº: 42) y pollo (SEC DE
ID Nº: 43.
Figura 3. Muestra la localización de un número
de emplazamientos de inserción de Tf expuestos a la superficie en
proteínas, polipéptidos o péptidos terapéuticos.
Figuras 4A-4B. Muestran las
regiones V_{H} y V_{L} de numerosos anticuerpos
anti-TNF\alpha usados para producir proteínas de
fusión Tf modificadas. Las regiones V_{H} son como sigue: V_{H}
de ScFv sintético, Nº de Acceso al GenBank AAK83057 (SEC DE ID Nº:
44), V_{H} de la SEC DE ID Nº: 5 de la Patente de los Estados
Unidos Nº 5.698.195 (SEC DE ID Nº: 45), V_{H} de Nº de Acceso al
GenBank BAB 18250 (SEC DE ID Nº: 46), V_{H} de Nº de Acceso al
GenBank BAB 18252 (SEC DE ID Nº: 47), V_{H} de Nº de Acceso al
GenBank BAB 18254 (SEC DE ID Nº: 48); V_{H} de Nº de Acceso al
GenBank BAB 18256 (SEC DE ID Nº: 49); V_{L} de ScFv sintético, Nº
de Acceso al GenBank AAK83057 (SEC DE ID Nº: 70), V_{L} de la SEC
DE ID Nº: 3 de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.698.195 (SEC DE
ID Nº: 71), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18251 (SEC DE ID
Nº: 72), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18253 (SEC DE ID Nº:
73), V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18255 (SEC DE ID Nº: 74)
y V_{L} de Nº de Acceso al GenBank BAB 18257 (SEC DE ID Nº:
75).
Figura 5. Muestra la mutación de la secuencia
pUC18 para la inserción de un emplazamiento NcoI (SEC DE ID
N^{os}: 50 y 51, secuencias del ADN y de la proteína,
respectivamente). Se muestran también los cebadores de la
mutagénesis usados (P 180 y P 181, SEC DE ID N^{os}: 52 y 53,
respectivamente.
Figuras 6A-6B). Muestran la
secuencia de M13 pIII generada mediante la PCR para la inserción en
pUC18/NcoI (SEC DE ID N^{os}. 54 y 55, secuencias del ADN y
de la proteína, respectivamente). Se muestran también los cebadores
de clonación usados, P182 y P183 (SEC DE ID N^{os}: 56 y 57,
respectivamente).
Figura 7. Muestra el emplazamiento de inserción
en la región N de la transferrina (SEC DE ID N^{os}: 58 y 59,
secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran
también los cebadores usados para generar la secuencia de
reconocimiento SacII, P184 y P185 (SEC DE ID N^{os}: 60 y 61,
respectivamente).
Figuras 8A-8B. Muestran el
resultado de la mutagénesis mediante la PCR de la región N para la
inserción en pUC18pIIISacII (SEC DE ID N^{os}: 62 y 63, secuencias
del ADN y de la proteína, respectivamente). Se muestran también los
cebadores de clonación usados (P186 y P187, SEC DE ID N^{os}: 64 y
65, respectivamente).
Figura 9. Muestra la PCR mutagénica (dos
ciclos).
Figura 10. Muestra los cebadores mutagénicos
para la inserción de una región variable de ocho aminoácidos,
(X)_{8},
cebadores P0234 y P0235 (SEC DE ID N^{os}: 68 y 69, respectivamente). Se muestra también la región de los vectores M13-pUC18 generados mediante reacción con estos cebadores (SEC DE ID N^{os}: 66 y 67, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente).
cebadores P0234 y P0235 (SEC DE ID N^{os}: 68 y 69, respectivamente). Se muestra también la región de los vectores M13-pUC18 generados mediante reacción con estos cebadores (SEC DE ID N^{os}: 66 y 67, secuencias del ADN y de la proteína, respectivamente).
Se ha descubierto que se puede estabilizar una
proteína terapéutica (por ejemplo, un polipéptido,
anticuerpo, o péptido, o sus fragmentos y variantes) para prolongar
la semivida sérica y/o retener la actividad de la proteína
terapéutica durante largos periodos de tiempo in vivo
fusionando genéticamente o conjugando químicamente la proteína,
polipéptido o péptido terapéutico en toda o en una porción de la
transferrina modificada lo suficiente para prolongar su semivida en
el suero. Las proteínas de fusión de la transferrina modificada
incluyen una proteína o región de la transferrina unida
covalentemente a una proteína o péptido terapéutico, en la que la
porción de la transferrina se ha modificada para contener una o más
sustituciones, inserciones o delecciones de aminoácidos en
comparación con una secuencia de transferrina natural. Las proteínas
de fusión Tf se pueden construir mediante ingeniería genética para
reducir o evitar la glicosilación en el interior de Tf o una región
de Tf, o la proteína Tf o la(s) región(es) Tf se
pueden modificar para presentar una unión reducida o ninguna unión
al ión hierro o carbonato, o para tener una afinidad reducida o
ninguna unión al receptor de Tf (TfR).
La presente invención incluye una biblioteca de
fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión,
comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf)
fusionado a al menos un segundo polipéptido, en el que el péptido Tf
tiene una afinidad reducida por un receptor de transferrina (TfR).
La proteína de fusión de la transferrina puede incluir al menos un
fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un
fragmento o variante de la transferrina modificada, que están
asociadas entre sí, mediante fusión genética (es decir, la
proteína de fusión de la transferrina está generada por la
traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que
codifica toda o una porción de una proteína terapéutica se une en
marco con un polinucleótido que codifica toda o una porción de la
transferrina modificada). La proteína terapéutica y la proteína
transferrina, una parte de la proteína de fusión de la
transferrina, puede denominarse como una "porción",
"región" o "resto" de la proteína de fusión de la
transferrina (por ejemplo, una "porción de proteína
terapéutica" o una "porción de la proteína
transferrina").
A no ser que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que una persona normalmente experta en
la técnica entiende comúnmente a la que esta invención pertenece.
Aunque se puede usar cualquier procedimiento y material similar o
equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica
o ensayo de la presente invención, se describen los procedimientos y
materiales preferidos.
Según se usa en el presente documento, el
término "actividad biológica" se refiere a una función o
conjunto de actividades llevadas a cabo por una molécula, proteína o
péptido terapéutico en un contexto biológico (es decir, en
un organismo o un organismo facsímil in vitro del anterior).
Las actividades biológicas pueden incluir, pero no se limitan a,
las funciones de la porción de molécula terapéutica de las proteínas
de fusión reivindicadas, tales como, pero sin limitarse a, la
inducción de la secreción de la matriz extracelular procedente de
las líneas celulares sensibles, la inducción de la secreción de la
hormona, la inducción de la quimiotaxis, la inducción de la
mitogénesis, la inducción de la diferenciación, o la inhibición de
la división celular de las células sensibles. Se considera que una
proteína o péptido de fusión de la invención es biológicamente
activa si presenta una o más actividades biológicas de su
contraparte natural de la proteína terapéutica.
Según se usa en el presente documento "un
aminoácido que corresponde a" o un "aminoácido equivalente"
en una secuencia de la transferrina se identifica mediante
alineamiento para maximizar la identidad o similitud entre una
primera secuencia de la transferrina y al menos una segunda
secuencia de la transferrina. El número usado para identificar un
aminoácido equivalente en una segunda secuencia de la transferrina
se basa en el número usado para identificar el aminoácido
correspondiente en la primera secuencia de la transferrina. En
algunos casos, se pueden usar estas frases para describir los restos
de aminoácidos en la transferrina humana en comparación con algunos
restos en la transferrina del suero de conejo.
Según se usa en el presente documento, los
términos "fragmento de una proteína Tf" o "proteína Tf",
o "porción de una proteína Tf" se refieren a una secuencia de
aminoácidos que comprende al menos aproximadamente un 5%, 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% o 100% de
una proteína Tf que se produce naturalmente o mutante de la
misma.
Según se usa en el presente documento, el
término "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado
con una función biológica. De esta manera, los genes incluyen, pero
no se limitan a, las secuencias de codificación y/o las secuencias
reguladoras requeridas para su expresión. Los genes pueden incluir
también segmentos de ADN no expresado que, por ejemplo, forman las
secuencias de reconocimiento de otras proteínas. Se pueden obtener
genes de una variedad de fuentes, entre las que incluyen la
clonación de una fuente de interés o sintetizarlos a partir de
información de una secuencia predicha o conocida y pueden incluir
secuencias diseñadas para que tengan los parámetros deseados.
Según se usa en el presente documento, un
"polinucleótido heterólogo" o un "ácido nucleico
heterólogo" o un "gen heterólogo" o una "secuencia
heteróloga" o un "segmento de ADN exógeno" se refiere a un
polinucleótido, ácido nucleico o segmento de ADN que se origina a
partir de una fuente extraña a la célula huésped concreta, o, si
procede de la misma fuente, está modificada a partir de su forma
original. Un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen
que es endógeno para la célula huésped concreta, pero que se ha
modificado. De esta manera, los términos se refieren a un segmento
de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la
célula pero en una posición en el interior del ácido nucleico en la
célula huésped en la que el elemento no se encuentra
ordinariamente. Como ejemplo, es heteróloga una secuencia señal
natural en una célula de levadura pero unida a la secuencia Tf
humana.
Según se usa en el presente documento, una
secuencia de ácido nucleico "aislado" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que está esencialmente libre de otras
secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente
un 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% pura,
más preferiblemente aproximadamente un 60% pura, incluso más
preferible aproximadamente un 80% pura, lo más preferible
aproximadamente un 90% pura, e incluso lo más preferible
aproximadamente un 95% pura, según se determinó mediante
electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, se puede obtener,
mediante procedimientos de clonación normalizados una secuencia de
ácido nucleico aislado, usada en ingeniería genética para reubicar
la secuencia de ácido nucleico desde su localización natural a un
emplazamiento diferente en el que se reproducirá. Los procedimientos
de clonación pueden implicar la excisión y el aislamiento de un
fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de
ácido nucleico que codifica el polipéptido, la inserción del
fragmento en la molécula vector, y la incorporación del vector
recombinante a una célula huésped en la que se replicarán múltiples
copias o clones de la secuencia del ácido nucleico. La secuencia de
ácido
nucleico puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualquiera de sus combinaciones.
nucleico puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualquiera de sus combinaciones.
Según se usa en el presente documento, dos o más
secuencias que codifican ADN se dice que se "unen" o
"fusionan" cuando, como resultado de fusiones en marco entre
las secuencias que codifican el ADN, las secuencias que codifican el
ADN se traducen en un polipéptido de fusión.
Según se usa en el presente documento, el
término "fusión" en referencia a las fusiones de Tf incluye,
pero no se limita a, la unión de al menos una proteína, polipéptido
o péptido terapéutico, preferiblemente la región variable de un
anticuerpo, al extremo N terminal de Tf, la unión al extremo C
terminal de Tf, la inserción entre dos aminoácidos cualquiera en el
interior de Tf, y/o la sustitución de una porción de la secuencia de
Tf tal como el bucle de Tf.
"Transferrina modificada", según se usa en
el presente documento, se refiere a una molécula de transferrina
que presenta al menos una modificación de su secuencia de
aminoácidos, en comparación con la transferrina natural.
"Proteína de fusión de la transferrina modificada", según se
usa en el presente documento, se refiere a una proteína formada por
la fusión de al menos una molécula de transferrina modificada (o uno
de sus fragmentos o variantes) en al menos una molécula de una
proteína terapéutica (o uno de sus fragmentos o variantes).
Según se usa en el presente documento, los
términos "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refieren
a dexosirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros tanto en
forma única como en doble cadena. A no ser que se limite de manera
específica, los términos abarcan los ácidos nucleicos que contienen
análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión
similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan de
una manera similar a los nucleótidos que se producen naturalmente. A
no ser que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico
concreto abarca también implícitamente sus variantes modificadas
conservativamente (por ejemplo, sustituciones de codones
degenerados) y las secuencias complementarias así como la secuencia
explícitamente indicada. Específicamente, se pueden conseguir
sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las
que está sustituida la tercera posición de uno o más codones
seleccionados (o todos) con restos de base mixta y/o dexosiinosina
(Batzer y col. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka y col.
(1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Cassol y col.
(1992); Rossolini y col. (1994) Mol. Cell. Probes 8:
91-98). El término ácido nucleico se usa de manera
intercambiable con gen, ADNc, y ARNm codificado por un gen.
Según se usa en el presente documento, un
segmento de ADN se denomina como "unido de manera operable"
cuando se sitúa en una relación funcional con otro segmento de ADN.
Por ejemplo, el ADN de la secuencia señal se une de manera operable
al ADN que codifica una proteína de fusión de la invención si se
expresa como una preproteína que participa en la secreción de la
proteína de fusión; un promotor o un potenciador se une de manera
operable a una secuencia de codificación si estimula la
transcripción de la secuencia. Generalmente, las secuencias de ADN
que se unen de manera operable son contiguas, y en el caso de una
secuencia señal o de la proteína de fusión, ambas son contiguas y
en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser
contiguos con las secuencias de codificación cuya transcripción
controlan. La unión, en este contexto, se lleva a cabo mediante
ligadura en emplazamientos de restricción convenientes o en
adaptadores o enlazantes insertados en su lugar.
Según se usa en el presente documento, el
término "promotor" se refiere a una región de ADN implicada en
la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.
Según se usa en el presente documento, el
término "recombinante" se refiere a una célula, tejido u
organismo que ha experimentado transformación con una nueva
combinación de genes o ADN.
Según se usa en el presente documento, una
entidad, proteína, polipéptido o péptido diana se refiere a una
molécula que se une específicamente a un tipo de célula concreto
[normal (por ejemplo, linfocitos) o anormal (por
ejemplo, célula cancerosa)] y por tanto se puede usar para
dirigir una proteína o compuesto de fusión de Tf (fármaco, o agente
citotóxico) específicamente hacia este tipo celular.
Según se usa en el presente documento
"proteína terapéutica" se refiere a proteínas, polipéptidos,
péptidos o sus variantes, que tienen una o más actividades
terapéutica(s) y/o biológica(s). Las proteínas
terapéuticas abarcadas por la invención incluyen, pero no se limitan
a proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, y compuestos
biológicos. Los términos péptidos, proteínas, y polipéptidos se usan
de manera intercambiable en el presente documento. Adicionalmente,
el término "proteína terapéutica" puede referirse a la
correlación que se produce de manera endógena o natural de una
proteína terapéutica. Por un polipéptido que muestra una
"actividad terapéutica" o una proteína que es
"terapéuticamente activa" se entiende un polipéptido que posee
una o más actividades biológicas y/o terapéuticas asociadas con una
proteína terapéutica tal como una o más de las proteínas
terapéuticas descritas en el presente documento o conocidas de otra
manera en la técnica. Como ejemplo no limitante, una "proteína
terapéutica" es una proteína que es útil para tratar, evitar o
mejorar una enfermedad, dolencia o trastorno, Dicha enfermedad,
dolencia o trastorno puede ser en seres humanos o en animales no
humanos, por ejemplo, de uso veterinario.
Según se usa en el presente documento, el
término "transformación" se refiere a la transferencia de
ácido nucleico (es decir, un polímero de nucleótidos) en el
interior de una célula. Según se usa en el presente documento, el
término "transformación genética" se refiere a la transferencia
y a la incorporación de ADN, especialmente ADN recombinante, en el
interior de una célula.
Según se usa en el presente documento, el
término "transformante" se refiere a una célula, tejido u
organismo que ha experimentado transformación.
Según se usa en el presente documento, el
término "transgén" se refiere a un ácido nucleico que se
inserta en un organismo, célula huésped o vector de manera que
asegura su función.
Según se usa en el presente documento, el
término "transgénico" se refiere a células, cultivos celulares,
organismos, bacterias, hongos, animales, plantas, y la progenie de
cualquiera de los anteriores, que ha recibido un gen extraño o
modificado y en concreto un gen que codifica una proteína de fusión
de Tf modificada mediante uno de los diversos procedimientos de
transformación, en el que el gen extraño o modificado es de la misma
o diferentes especies que las especies del organismo que recibe el
gen extraño o modificado.
"Variantes o variante" se refiere a un
polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o
polipéptido de referencia, pero reteniendo sus propiedades
esenciales. Generalmente, las variantes son globalmente muy
similares, y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o
polipéptido de referencia. Según se usa en el presente documento,
"variante" se refiere a una porción de proteína terapéutica de
una proteína de fusión de la transferrina de la invención, que
difiere en la secuencia de una proteína terapéutica natural pero que
retiene al menos una de sus propiedades funcional y/o terapéutica
según se describe en otra parte en el presente documento o se conoce
de otra manera en la técnica.
Según se usa en el presente documento, el
término "vector" se refiere ampliamente a cualquier plásmido,
fagómido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. El término
se construye también para incluir compuestos no plásmidos, no
fagómidos y no víricos que facilitan la transferencia del ácido
nucleico en viriones o células, tales como, por ejemplo, compuestos
de polilisina y similares. El vector puede ser un vector vírico que
sea adecuado como vehículo de administración para la administración
del ácido nucleico, o uno de sus mutantes, a una célula, o el
vector puede ser un vector no vírico que sea adecuado para el mismo
objetivo. Se conocen bien en la técnica los ejemplos de vectores
víricos y no víricos para la liberación de ADN en las células y
tejidos y se describen, por ejemplo en Ma y col. (1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746). Los ejemplos de
vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, un virus vaccinia
recombinante, un adenovirus recombinante, un virus adenoasociado
recombinante, un virus de la viruela aviar recombinante, y similares
(Cranage y col., 1986, EMBO J. 5: 3057-3063;
Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/17810, publicada el 18
de agosto de 1994; Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/23744,
publicada el 27 de Octubre de 1994). Los ejemplos de vectores no
víricos incluyen, pero no se limitan a, liposomas, poliaminas
derivadas de ADN, y similares.
Según se usa en el presente documento, el
término de "tipo natural" se refiere a una secuencia de
polinucleótidos o polipéptidos que se produce naturalmente.
Según se usa en el presente documento,
"proteína adaptadora", "polipéptido adaptador", o
"adaptadora" se refiere a una proteína a la cual se pueden
fusionar las secuencias de aminoácidos tales como péptidos
aleatorios. Estos péptidos son exógenos a la adaptadora.
Según se usa en el presente documento
"secuencia de péptido aleatorio" se refiere a una secuencia de
aminoácidos compuesta por dos o más monómeros de aminoácidos y
construida mediante un procedimiento estocástico o aleatorio. Un
péptido aleatorio puede incluir el marco de trabajo de motivos
adaptadores, que puede comprender secuencias invariantes.
Según se usa en el presente documentos
"biblioteca de péptidos aleatorios" se refiere a un conjunto
de secuencias de polinucleótidos que codifica un conjunto de
péptidos aleatorio, y al conjunto de péptidos aleatorios
codificados por aquellas secuencias de polinucleótidos, así como a
las proteínas de fusión que contienen los péptidos aleatorios.
\newpage
Según se usa en el presente documento, el
término "pseudoaleatorio" se refiere a un conjunto de
secuencias que tienen una variabilidad limitada, de tal manera que
por ejemplo, el grado de variabilidad del resto en una posición es
diferente del grado de variabilidad del resto en otra posición, pero
se permite algún grado de variación del resto en cualquier posición
pseudoaleatoria, sin embargo restringida.
Según se usa en el presente documento, el
término "marco de trabajo de la secuencia definida" se refiere
a un conjunto de secuencias definidas que se seleccionan sobre una
base no aleatoria, generalmente sobre la base de datos
experimentales o datos estructurales, por ejemplo, un marco
de trabajo de la secuencia definida puede comprender un conjunto de
secuencias de aminoácidos que se predice que forman una estructura
de lámina \beta, un motivo de repetición heptad en cremallera de
leucina, una región con dedos de cinc, entre otras variaciones. Un
"kemal de secuencia definida" es un conjunto de secuencias que
abarca un alcance limitado de variabilidad. Mientras que (1) una
secuencia de 10-mer completamente aleatoria de los
20 aminoácidos convencionales puede ser cualquier de
(20)^{10} secuencias, y (2) una secuencia de
10-mer pseudoaleatoria de los 20 aminoácidos
convencionales puede ser cualquiera de (20)^{10}
secuencias pero presentará un sesgo para algunos restos en algunas posiciones y/o globalmente, (3) un kemal de secuencia definida es un subconjunto de secuencias que es menor del número máximo de secuencias potenciales si se permitió a cada posición del resto ser cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales permisibles (y/o los amino/iminoácidos no convencionales permisibles). Un kemal de secuencia definida comprende generalmente posiciones variantes e invariantes del resto y/ comprende posiciones variantes del resto que pueden comprender un resto seleccionado procedente de un subconjunto defmed de restos de aminoácidos, y del mismo tipo, tanto segmentariamente como sobre la longitud completa de la secuencia de miembros de la biblioteca seleccionados individualmente. Los kemales de secuencias definidas pueden referirse tanto a secuencias de aminoácidos como a secuencias de polinucleótidos. Para ilustración y sin limitación las secuencias (NNK)10 (SEC DE ID Nº : 31) y (NNM)10 (SEC DE ID Nº: 32), en las que N representa A, T, G, u C; K representa G o T; y M representa A o C, son los kemales de secuencias definidas.
secuencias pero presentará un sesgo para algunos restos en algunas posiciones y/o globalmente, (3) un kemal de secuencia definida es un subconjunto de secuencias que es menor del número máximo de secuencias potenciales si se permitió a cada posición del resto ser cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales permisibles (y/o los amino/iminoácidos no convencionales permisibles). Un kemal de secuencia definida comprende generalmente posiciones variantes e invariantes del resto y/ comprende posiciones variantes del resto que pueden comprender un resto seleccionado procedente de un subconjunto defmed de restos de aminoácidos, y del mismo tipo, tanto segmentariamente como sobre la longitud completa de la secuencia de miembros de la biblioteca seleccionados individualmente. Los kemales de secuencias definidas pueden referirse tanto a secuencias de aminoácidos como a secuencias de polinucleótidos. Para ilustración y sin limitación las secuencias (NNK)10 (SEC DE ID Nº : 31) y (NNM)10 (SEC DE ID Nº: 32), en las que N representa A, T, G, u C; K representa G o T; y M representa A o C, son los kemales de secuencias definidas.
Según se usa en el presente documento,
"enlazante" o "separador" se refiere a una molécula o
grupo de moléculas que conecta dos moléculas tales como una
proteína de unión al ADN y un péptido aleatorio, y sirve para
colocar las dos moléculas en una configuración preferida, por
ejemplo, de tal manera que el péptido aleatorio pueda unirse a un
receptor con impedimento estérico mínimo procedente de la proteína
de unión al ADN.
Según se usa en el presente documento, el
término "segmento variable" se refiere a una porción de un
péptido nascente que comprende una secuencia kemal aleatoria,
pseudoaleatoria, o definida. Un segmento variable puede comprender
las posiciones de los restos variantes e invariantes, y el grado de
variación del resto en la posición del resto variante puede ser
limitada; ambas opciones se seleccionan a discreción por el
especialista. Normalmente, los segmentos variables son
aproximadamente de 5 a 20 restos de aminoácidos de longitud (por
ejemplo, 8 a 10), aunque los segmentos variables pueden ser más
largos y pueden comprender porciones de anticuerpos o proteínas
receptoras, tales como un fragmento de anticuerpo, una proteína de
unión al ácido nucleico, una proteína receptora, y similares.
Según se usa en el presente documento, el
término "epitopo" se refiere a la porción de un antígeno u
otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión que
interactúa con el bolsillo de unión de la región variable de un
anticuerpo. Normalmente, dicha interacción de unión se manifiesta
como un contacto intermolecular con uno o más restos de aminoácidos
de una CDR.
Según se usa en el presente documento, el
término "receptor" se refiere a una molécula que tiene una
afinidad por un ligando dado. Los receptores se pueden producir
naturalmente o como moléculas sintéticas. Se pueden emplear
receptores en un estado inalterado o en forma de agregados con otras
especies. Los receptores Se pueden unir, covalente o no
covalentemente, a un miembro de unión, tanto en forma directa como
mediante una sustancia específica de la unión. Los ejemplos de
receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, incluyendo
anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes
antigénicos específicos (tales como en virus, células, u otros
materiales), receptores de membranas celulares, carbohidratos y
glicoproteínas complejos, enzimas, y receptores de hormonas.
Según se usa en el presente documento, el
término "ligando" se refiere a una molécula, tal como un
péptido aleatorio o secuencia de segmento variable, que está
reconocida por un receptor concreto. Como una persona experta en la
técnica reconocerá, una molécula (o complejo macromolecular) puede
ser un receptor y un ligando. En general, el compañero de unión que
tiene un peso molecular más pequeño se denomina ligando y el
compañero de unión que tiene un peso molecular mayor se denomina
receptor. Según se usa en el presente documento, "fusionado" o
"unido de manera operable" se entiende que el péptido aleatorio
y la proteína adaptadora se unen conjuntamente, de tal manera que
minimizan la perturbación de la estabilidad de la estructura
adaptadora.
Según se usa en el presente documento, el
término "anticuerpo de cadena única" se refiere a un
polipéptido que comprende una región V_{H} y una región V_{L}
unidas entre sí con un enlace peptídico, unidas generalmente
mediante un péptido separador (por ejemplo,
[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{x})
(SEC DE ID Nº: 33), y que puede comprender secuencias adicionales
de aminoácidos en los términos amino y/o carboxilo. Por ejemplo, un
anticuerpo de cadena única puede comprender un segmento de cuerda
para la unión con el polipéptido codificante. Como ejemplo, un scFv
es un anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos de cadena única
son generalmente proteínas constituidas por uno o más segmentos de
polipéptidos de al menos 10 aminoácidos contiguos codificados
sustancialmente por genes de la superfamilia de la inmunoglobulina
(por ejemplo, véase The Immunoglobulin Gene Superfamily, A.
F. Williams y A. N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F.
W. Alt, y T. H. Rabbitts, eds., (1989) Academic Press: San Diego,
Calif., pp. 361-387, que se incorpora por referencia
en el presente documento, lo más frecuentemente, codificado por un
roedor, primate no humano, aves, porcino, bovino ovino, cabra, la
secuencia del gen de la cadena ligera o de la cadena pesada humana.
Un anticuerpo de cadena única general contiene una porción
suficiente de un producto génico de la superfamilia de la
inmunoglobulina de tal manera que retiene la propiedad de unión a
una molécula diana específica, normalmente un receptor o antígeno
(epitopo).
Según se usa en el presente documento, el
término "región determinante de la complementaridad" y
"CDR" se refieren al término reconocido en la técnica como
ejemplificado por las definiciones de CDR de Kabat y Chothia
conocidas generalmente también como regiones hipervariables o bucles
hipervariables (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901;
Chothia y col. (1989) Nature 342: 877; E. A. Kabat y col., Sequences
of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of
Health, Bethesda, Md.) (1987); y Tramontano y col. (1990) J. Mol.
Biol. 215: 175). Los dominios de las regiones variables comprenden
normalmente los 105-115 aminoácidos aproximadamente
aminoterminales de la cadena de inmunoglobulina que se produce de
manera natural (por ejemplo, los aminoácidos
1-110), aunque
regiones variables algo más cortas o más largas son también adecuadas para formar anticuerpos de cadena única.
regiones variables algo más cortas o más largas son también adecuadas para formar anticuerpos de cadena única.
Una región variable de la cadena ligera o pesada
de la inmunoglobulina está constituida por una región "FW"
interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas también
CDR. Se ha definido con precisión la extensión de la región FW y de
las CDR (véase, "Sequences of Proteins of Immunological
Interest," E. Kabat y col., 4^{a} Ed., U.S. Department of
Health and Human Services, Bethesda, Md. (1987)). Las secuencias de
las regiones FW de las diferentes cadenas ligeras o pesadas se
conservan relativamente dentro de una especie. Según se usa en el
presente documento, "una región FW humana" es una región FW que
es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más, normalmente
90-95% o más) a la región FW de la inmunoglobulina
humana que se produce naturalmente. La región FW de un anticuerpo,
esto es, las regiones FW combinadas de las cadenas ligeras y
pesadas constituyentes sirven para situar y alinear las CDR. Las CDR
son principalmente responsables de la unión a un epitopo de un
antígeno.
Se puede usar cualquier transferrina para
realizar las proteínas de fusión de la Tf modificada. Como ejemplo,
la Tf humana natural (Tf es una proteína de 679 aminoácidos, de
aproximadamente 75 KDa (no se tuvo en cuenta la glicosilación), con
dos regiones principales, la N (aproximadamente 330 aminoácidos) y
la C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecen originarse a
partir de la duplicación de un gen. Véanse los números de acceso al
GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936
(www.ncbi.nlm.nih.gov/) así como las SEC DE ID N^{os}: 1, 2 y 3.
Las dos regiones han divergido en el tiempo pero retienen un elevado
grado de identidad/similitud (Fig. 1).
Cada una de las regiones N y C se divide
adicionalmente en dos subregiones, N1 y N2, C1 y C2, La función de
Tf es trasportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está
mediado por el receptor de Tf (TfR), que se expresa en todas las
células, de manera particularmente activa en las células en
crecimiento. TfR reconoce la forma unida al hierro de Tf (se unen
dos moléculas de cada por receptor), a continuación se produce la
endocitosis, de esta manera, el complejo TfR/Tf se trasporta al
endosoma, en ese momento la disminución localizada del pH da como
resultado la liberación del hierro unido y la recirculación del
complejo TfR/Tf a la superficie celular y la liberación de Tf
(conocida como apoTf en su forma no unida al hierro). La unión al
receptor se produce a través de la región C de Tf. Los dos
emplazamientos de glicosilación en la región C no parecen estar
implicados en la unión al receptor, ya que la Tf no glicosilada
unida al hierro se une al receptor.
Cada molécula de Tf puede trasportar dos iones
hierro (Fe^{3+}). Estos se complejan en el espacio entre las
subregiones N1 y N2, C1 y C2 dando como resultado un cambio
conformacional en la molécula. Tf cruza la barrera hematoencefálica
(BBB) mediante el receptor Tf.
En la transferrina humana, los emplazamientos de
unión al hierro comprenden al menos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82
de la SEC DE ID Nº: 2 que incluye la secuencia señal de la Tf
natural), Asp 392 (Asp 411 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 95 (Tyr 114
de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 426 (Tyr 445 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr
188 (Tyr 207 de la SEC DE ID Nº: 2), Tyr 514 o 517 (Tyr 533 o Tyr
536 de la SEC DE ID Nº:2), His 249 (His 268 de la SEC DE ID Nº: 2),
e His 585 (His 604 de la SEC DE ID Nº: 2) de la SEC DE ID Nº: 3. Las
regiones bisagra comprenden al menos los restos de aminoácidos
94-94-96, 245-247
y/o 316-318 de la región así como la región C los
restos de aminoácidos 425-427,
581-582 y/o 652-658 de la SEC DE ID
Nº: 3. Los emplazamientos de unión al carbonato comprenden al menos
los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la SEC DE ID Nº: 2), Thr 452
(Thr 471 de la SEC DE ID Nº: 2), Arg 124 (Arg 143 de la SEC DE ID
Nº: 2), Arg 456 (Arg 475 de la SEC DE ID Nº: 2), Ala 126 (Ala 145
de la SEC DE ID Nº: 2), Ala 458 (Ala 477 de la SEC DE ID Nº: 2), Gly
127 (Gly 146 de la SEC DE ID Nº: 2), y Gly 459 (Gly 478 de la SEC DE
ID Nº: 2) de la SEC DE ID Nº: 3.
En una realización de la invención, la proteína
de fusión de la transferrina modificada incluye una transferrina
humana modificada, aunque se puede usar cualquier molécula de Tf
animal para producir las proteínas de fusión de la invención,
incluyendo las variantes de la Tf humana, de vaca, cerdo, oveja,
perro, conejo, rata, ratón, hámster, echnida, platypus, pollo,
rana, gusano del tabaco, mono, así como otras especies de bovinos,
caninos y aves (véase la Fig. 2 de un conjunto representativo de
secuencias de Tf). Todas estas secuencias de la TF están fácilmente
disponibles en el GenBank y otras bases de datos públicas. Las
secuencia de nucleótidos de la Tf humana está disponible (véanse
las SEC DE ID N^{os}: 1, 2 y 3 y los números de acceso descritos
anteriormente y disponibles en (www.ncbi.nlm.nih.gov) y se pueden
usar para llevar a cabo fusiones genéticas entre Tf o una región de
Tf y la molécula terapéutica de elección. Se pueden llevar a cabo
también fusiones a partir de moléculas relacionadas tales como
lacto transferrina (lactoferrina) Acceso
al GenBank: NM_002343) o melanotransferrina (Acceso al GenBank NM_013900, melanotransferrina de murino).
al GenBank: NM_002343) o melanotransferrina (Acceso al GenBank NM_013900, melanotransferrina de murino).
Melanotransferrina es una proteína glicosilada
que se encuentra en grandes cantidades en las células de melanoma
maligno y se denominó originalmente antígeno p97 de melanoma humano
(Brown y col., 1982, Nature, 296: 171-173). Posee
una elevada homología de la secuencia con la transferrina sérica
humana, la lactoferrina humana, y la transferrina de pollo (Brown y
col., 1982, Nature, 296: 171-173; Rose y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 1261-1265). Sin
embargo, a diferencia de estos receptores, no se ha identificado
receptor celular para la melanotransferrina. Melanotransferrina se
une reversiblemente al hierro y existe en dos formas, una de las
cuales se une a las membranas celulares mediante un anclaje de
glicosil fosfatidilinositol mientras que la otra forma es soluble y
se segrega activamente (Baker y col., 1992, FEBS Lett, 298:
215-218; Alemany y col., 1993, J. Cell Sci., 104:
1155-1162; Food y col., 1994, J. Biol. Chem. 274:
7011-7017).
Lactoferrina (Lf), una proteína defensiva
natural de unión al hierro, se ha encontrado que posee actividad
antibacteriana, antimicótica, antivírica, antineoplásica y
antiinflamatoria. La proteína está presente en secreciones
exocrinas que están expuestas comúnmente a la flora normal: leche,
desgarros, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos
gastrointestinales, moco cervicovaginal y fluido seminal.
Adicionalmente, Lf es un constituyente principal de los gránulos
específicos secundarios de los neutrófilos polimorfonucleares
circulantes (PMN). La apoproteína se libera en la desgranulación de
los PMN en áreas sépticas. Una función principal de Lf es la de
secuestrar el hierro libre en fluidos y zonas inflamadas de tal
manera que suprime el daño mediado por radicales libres y disminuye
la disponibilidad del metal para invadir las células microbianas y
neoplásicas. En un estudio que examinó la velocidad de renovación
de ^{125}I Lf en adultos, se demostró que Lf se capturaba
rápidamente por el hígado y el bazo, y la radioactividad persistió
durante algunas semanas en el hígado y el bazo (Bennett y col.
(1979), Clin. Sci. (Lond.) 57: 453-460).
En una realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la
invención incluye una variante de corte y empalme de la
transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la
transferrina puede ser una variante de corte y empalme de la
transferrina humana. En una realización específica, la variante de
corte y empalme de la transferrina humana puede ser la del Acceso al
Genbank AAA61140.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la
invención incluye una variante de corte y empalme de la
lactoferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la
lactoferrina sérica humana puede ser una novedosa variante de corte
y empalme de una lactoferrina neutrófila. En una realización
específica, la variante de corte y empalme de la lactoferrina
neutrófila puede ser la del Acceso al Genbank AAA59479. En otra
realización específica, la variante de corte y empalme de la
lactoferrina neutrófila puede comprender la siguiente secuencia de
aminoácidos EDCIALKGEADA (SEC DE ID Nº: 8), que incluye la novedosa
región de varianza de corte y empalme.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina en la biblioteca de la
invención incluye una variante de la melanotransferrina.
Se pueden realizar fusiones de la Tf modificada
con cualquier proteína, fragmento, región, o región construida
mediante ingeniería genética de la Tf. Por ejemplo, se pueden
producir proteínas de fusión usando la secuencia de la Tf de
longitud completa, con o sin la secuencia señal de la Tf natural. Se
pueden preparar las proteínas de fusión de la Tf usando una región
de Tf única, tal como la región N o C individual o una forma
modificada de la Tf que comprende las regiones 2N o 2C (véase la
solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.977, presentada
el 30 de agosto de 2002). En algunas realizaciones, se pueden
producir las fusiones de una proteína terapéutica con una región C
única, en la que la región C está alterada para reducir, inhibir o
evitar la glicosilación. En otras realizaciones, es ventajoso el uso
de una región N única ya que los emplazamientos de glicosilación de
Tf residen en la región C y en la región N, por sí mismos. Una
realización preferida es la proteína de fusión de la Tf que tiene
una región N única que se expresa a un elevado nivel.
Según se usa en el presente documento, una
región o lóbulo C terminal modificado para funcionar como una
región de tipo N está modificada para presentar modelos de
glicosilación o propiedades de unión al hierro sustancialmente
similares a las de una región o lóbulo N nativa o natural. En una
realización preferida, la región o lóbulo C está modificada de tal
manera que no está glicosilada y no se une al hierro mediante
sustitución de las regiones o aminoácidos relevantes del dominio C
por las presentes, en las correspondientes regiones o emplazamientos
de una región N nativa o natural.
Según se usa en el presente documento, un resto
Tf que comprende "dos regiones o lóbulos N" incluye una
molécula Tf que está modificada para sustituir la región o lóbulo C
natural con una segunda región o lóbulo N nativa o natural o una
región o lóbulo N modificada o que contiene una región C que se ha
modificado para funcionar sustancialmente de manera similar a una
región N natural o modificada. Véase la Solicitud Provisional de
los Estados Unidos 60/406.977. El análisis de dos regiones mediante
la superposición de la estructura tridimensional de las dos
regiones (Swiss PDB Viewer 3.7b2, Iterative Magic Fit) y mediante la
alineación directa de los aminoácidos (alineación múltiple
ClustalW) desvela que las regiones han divergido con el tiempo. La
alineación de los aminoácidos muestra una identidad del 42% y una
similitud del 59% entre las dos regiones. Sin embargo,
aproximadamente el 80% de la región N tiene una equivalencia
estructural correspondiente con la de la región C. La región C
tiene también algunos enlaces disulfuro extra en comparación con la
región N.
La alineación de los modelos moleculares de las
regiones N y C desvela los siguientes equivalentes
estructurales:
Los enlaces disulfuro de las dos regiones se
alinean como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la Tf incluye al menos dos lóbulos n
terminales de la transferrina. En las realizaciones adicionales, la
porción de la transferrina de la proteína de fusión de la Tf
incluye al menos dos lóbulos terminales de la transferrina derivados
de la transferrina sérica humana.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión incluye, comprende, o está constituida por
al menos dos lóbulos N terminales de transferrina que tienen una
mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el
grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, e His249 de la
SEC DE ID Nº: 3.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión modificada incluye un lóbulo N terminal de
la transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en
la Lys206 o la His207 de la SEC DE ID Nº: 3.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión incluye, comprende o está constituida por
dos lóbulos C terminales de transferrina. En las realizaciones
adicionales, la porción de transferrina de la proteína de fusión
incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina derivados
de la transferrina sérica humana.
En una realización adicional, el lóbulo C
terminal mutante incluye además una mutación de al menos uno de
Asn413 y Asn611 de la SEC DE ID Nº: 3, que no permite la
glicosilación. En otra realización, la porción de transferrina de
la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de
transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de
aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp392,
Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el
mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una
realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína
de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina
que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido
seleccionado entre el grupo constituido por Tyr426, Tyr514, Tyr517 e
His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una
capacidad reducida de unirse a iones metálicos. En otra realización,
la porción de transferrina de la proteína de fusión incluye al
menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una
mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el
grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr517 e His585 de la SEC DE
ID Nº: 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a
iones metálicos y funciona de manera sustancialmente similar a una
región N.
En algunas realizaciones, Tf o la porción de Tf
tendrán longitud suficiente para aumentar la semivida circulatoria
in vivo, estabilidad en suero, estabilidad en disolución
in vitro o biodisponibilidad de la región variable del
anticuerpo en comparación con la semivida circulatoria in
vivo, estabilidad en suero (semivida), estabilidad in
vitro o biodisponibilidad de la región variable del anticuerpo
en un estado no fusionado. Dicho aumento de la estabilidad,
semivida circulatoria in vivo o biodisponibilidad puede ser
de aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90% o más aumento
respecto de la región variable del anticuerpo no fusionado. En
algunos casos, los trans-cuerpos que comprenden la
transferrina modificada presentan una semivida en suero de
aproximadamente 10-20 o más días, aproximadamente
12-18 días o aproximadamente 14-17
días.
Cuando la región C de Tf es parte de la proteína
de fusión los dos emplazamientos de glicosilación unidos a N,
restos de aminoácidos que corresponden a N413 y N611 de la SEC DE ID
Nº: 3, pueden mutarse para expresión en un sistema de levaduras
para evitar la glicosilación o hipermanosilación y prolongar la
semivida circulatoria in vivo de la proteína de fusión y/o
de la proteína terapéutica (para producir asialo-, o en algunos
ejemplos monosialo-Tf o disialo-Tf).
Adicionalmente, en los aminoácidos de Tf que corresponden a N413 y
n611, las mutaciones pueden ser restos adyacentes dentro del
emplazamiento de glicosilación
N-X-S/T para evitar o reducir
sustancialmente la glicosilación. Véase la Patente de los Estados
Unidos 5.986.067 de Funk y col. Se ha informado también de que la
región N de la Tf expresada en Pichia pastoris se vuelve
glicosilada unida a O con una única hexosa en S32 que se puede mutar
o modificar también para evitar dicha glicosilación. Es más, se
puede reducir o eliminar la glicosilación unida a O en una célula
huésped de levadura con mutaciones en los genes PMT.
Según esto, en una realización de la invención,
la proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de
transferrina modificada que presenta glicosilación reducida,
incluyendo pero sin limitarse a formas asialo, monosialo y disialo
de Tf. En otra realización, la porción de transferrina de la
proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina recombinante que está mutado para evitar la
glicosilación. En otra realización, la porción de transferrina de
la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina recombinante que está completamente glicosilado. En una
realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de
fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica
recombinante humana que está mutado para evitar la glicosilación,
en el que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC DE ID Nº: 3
están mutados en un aminoácido que no permite la glicosilación. En
otra realización, la porción de transferrina de la proteína de
fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica
humana recombinante que está mutado para evitar o reducir
sustancialmente la glicosilación, en la que las mutaciones pueden
ser en los restos adyacentes dentro del emplazamiento de
glicosilación N-X-S/T. Es más, se
puede reducir o evitar la glicosilación mutando el resto de serina
o treonina. Además, se conoce el cambio de X por prolina para
inhibir la glicosilación.
Tal como se discute a continuación con más
detalle, se pueden construir también mediante ingeniería genética
las proteínas de fusión de la Tf para que no se una al hierro y no
se una al receptor de Tf. Cuando la unión al hierro está retenida,
se puede usar la capacidad de Tf de dos manera, una, para
administrar una proteína o péptido(s)
terapéutico(s)
en el interior de una célula y/o a través de la BBB. Estas realizaciones con unión al hierro y/o al receptor de Tf, se construirán a menudo mediante ingeniería genética para reducir o evitar la glicosilación para prolongar la semivida en suero de la proteína terapéutica. La región N sola no se unirá al TfR cuando se cargue con el hierro, y la región C unida a hierro se unirá al TfR pero sin la misma afinidad que la molécula completa.
en el interior de una célula y/o a través de la BBB. Estas realizaciones con unión al hierro y/o al receptor de Tf, se construirán a menudo mediante ingeniería genética para reducir o evitar la glicosilación para prolongar la semivida en suero de la proteína terapéutica. La región N sola no se unirá al TfR cuando se cargue con el hierro, y la región C unida a hierro se unirá al TfR pero sin la misma afinidad que la molécula completa.
En las bibliotecas de la invención, el péptido
Tf tiene una afinidad reducida por un receptor de la
transferrina.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el
mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una
realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína
de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina
recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una
avidez de unión más débil por los iones metálicos que la de la
transferrina sérica natural. En una realización alternativa, la
porción de transferrina da la proteína de fusión de la transferrina
incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una
mutación en la
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural.
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la transferrina sérica natural.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el
mutante no retiene la capacidad de unirse al receptor de la
transferrina. En una realización alternativa, la porción de
transferrina de la proteína de fusión de la transferrina incluye un
mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la
que el mutante tiene una avidez de unión más débil por el receptor
de la transferrina que la de la transferrina sérica natural.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el
mutante no retiene la capacidad de unirse a iones carbonato. En una
realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína
de fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina
recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una
avidez de unión más débil por los iones carbonato que la de la
transferrina sérica natural. En una realización alternativa, la
porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina
incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una
mutación en la
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural.
que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte por los iones carbonato que la de la transferrina sérica natural.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina sérica recombinante humana que tiene una mutación en al
menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo
constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426,
Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante
retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una
realización alternativa, un mutante de transferrina sérica humana
recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de
aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65,
Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de
la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una capacidad
reducida de unirse a iones metálicos. En otra realización, un
mutante de transferrina sérica humana recombinante que tiene una
mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionados entre el
grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392,
Tyr426, Tyr517 y His585 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante
no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos.
En otra realización, la porción de transferrina
de la proteína de fusión de la transferrina incluye un mutante de
transferrina sérica humana recombinante que tiene una mutación en
Lys206 o His207 de la SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante tiene
una avidez de unión más fuerte por los iones metálicos que la de la
transferrina sérica humana natural (véase la Patente de los Estados
Unidos 5.986.067, que se incorpora por referencia en el presente
documento en su totalidad). En una realización alternativa, la
porción de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina
incluye un mutante de transferrina sérica humana recombinante que
tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC DE ID Nº: 3, en la
que el mutante tiene una avidez de unión más débil por los iones
metálicos que la de la transferrina sérica humana natural. En una
realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de
fusión de la transferrina incluye un mutante de transferrina sérica
humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la
SEC DE ID Nº: 3, en la que el mutante no se une a iones
metálicos.
Se puede usar cualquier técnica disponible para
preparar las proteínas de fusión de la invención, incluyendo, pero
sin limitarse a las técnicas moleculares comúnmente disponibles, por
ejemplo, las descritas en Sambrook y col. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989. Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótidos usando
técnicas para realizar mutagénesis específica del emplazamiento que
se conocen bien en la técnica, los cambios en los aminoácidos
modificados son preferiblemente de naturaleza menor, esto es,
sustituciones conservativas de aminoácidos, aunque se contemplan
también otras sustituciones no conservativas, particularmente
cuando producen una porción de transferrina modificada de una
proteína de fusión de la Tf, por ejemplo, una proteína de
fusión de la Tf modificada que presenta glicosilación reducida,
unión al hierro reducida y similares. Se contemplan específicamente
sustituciones de aminoácidos, pequeñas delecciones o inserciones,
normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos, inserciones
entre las regiones de la transferrina; pequeñas extensiones amino o
carboxil terminales, tales como un resto de metionina amino
terminal, o pequeños péptidos enlazantes de menos de 50, 40, 30, 20
o 10 restos o la unión a una proteína transferrina y a una proteína
o péptido terapéutico; o una pequeña extensión que facilita la
purificación, tal como un tramo de poli-histidina,
un epitopo antigénico o una región de unión.
Los ejemplos de sustituciones conservativas de
aminoácidos son sustituciones hechas en el interior del mismo grupo
tales como en el interior del grupo de aminoácidos básicos (tales
como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como
ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tal como
glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como
leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como
fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (tales
como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).
Las sustituciones no conservativas abarcan las
sustituciones de aminoácidos en un grupo por aminoácidos del otro
grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservativa incluiría la
sustitución de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo.
Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos,
véase, por ejemplo, Ford y col. (1991), Prot. Exp. Pur. 2:
95-107. Las sustituciones, delecciones e inserciones
no conservativas son particularmente útiles para producir las
proteínas de fusión de Tf de la invención que presentan ninguna o
reducida unión del hierro, ninguna o reducida unión de la proteína
de fusión al receptor de Tf.
En el polipéptido y las proteínas de la
invención, se sigue el siguiente sistema para designar los
aminoácidos según la siguiente lista convencional.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede reducir o perturbar la unión al hierro
y/o la unión al receptor mediante mutación, que incluye delección,
sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que
corresponden a uno o más de los restos Asp63, Tyr95, Tyr188, His249
de la región N de Tf y/o los restos Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o
His 585 de la SEC DE ID Nº: 3 de la región C. Puede estar también
afectada la unión al hierro mediante mutación en los aminoácidos
Lys206, His207 o Arg632 de la SEC DE ID Nº: 3. Se puede reducir o
perturbar la unión al carbonato, mediante mutación, que incluye
delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que
corresponden a uno o más restos de los aminoácidos Thr120, Arg124,
Ala126, Gly 127 de la región N de Tf y/o los restos Thr 452, Arg
456, Ala 458 y/o Gly 459 de la SEC DE ID Nº: 3 de la región C. una
reducción o perturbación de la unión al carbonato puede afectar
adversamente la unión al hierro y/o al receptor.
La unión al receptor de Tf puede estar reducida
o perturbada mediante mutación, que incluye delección, sustitución o
inserción en, los restos de aminoácidos que corresponde a uno o más
de los restos de la región N de Tf descritos anteriormente para la
unión al hierro.
Tal como se ha discutido anteriormente, se puede
reducir o evitar la glicosilación mediante mutación, que incluye
delección, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que
corresponde a uno o más de los restos de la región C de Tf
alrededor de los emplazamientos
N-X-S/T que corresponden a los
restos N413 y/o N611 de la región C (Véase la Patente de los
Estados Unidos Nº 5.986.067. Por ejemplo, el N413 y/o el N611 pueden
estar mutados en los restos Glu.
En ejemplos en los que las proteínas de fusión
de Tf no están modificadas para evitar la glicosilación, la unión
al hierro, la unión al carbonato y/o la unión al receptor, la
glicosilación, los iones de hierro y/o carbonato pueden estar
eliminados o escindidos de la proteína de fusión, en particular los
restos de azúcar unidos a la porción de Tf, se pueden usar enzimas
de levaduras deficientes en la glicosilación para evitar la
glicosilación y/o se pueden hacer crecer células recombinantes en
presencia de un agente que evite la glicosilación, por
ejemplo, tunicamicina.
Los carbohidratos de la proteína de fusión
pueden también reducirse o eliminarse enzimáticamente de manera
completa tratando la proteína de fusión con deglicosilasas. Las
deglicosilasas se conocen bien en la técnica. Los ejemplos de
deglicosilasas incluyen, pero no se limitan a galactosidasa, PNGasa
F, glucosidasa, mannosidasa, fucosidasa, y Endo H deglicosilasa.
Se pueden realizar mutaciones adicionales con Tf
para alterar la estructura tridimensional de Tf, dichas
modificaciones en la región bisagra evitan el cambio conformacional
necesario para la unión al hierro y el reconocimiento del receptor
de Tf. Por ejemplo, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de
los restos de los aminoácidos 94-96,
245-247 y/ 316-318 de la región N
así como los restos de aminoácidos 425-427,
581-582 y/o 652-658 de la región C.
Adicionalmente, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de las
regiones que flanquean estos emplazamientos para alterar la
estructura y función de Tf.
En un aspecto de la invención, la proteína de
fusión de la transferrina puede funcionar como una proteína
vehículo para prolongar la semivida o la biodisponibilidad de la
proteína terapéutica así como, en algunos ejemplos, administrar la
proteína terapéutica al interior de una célula y/o a través de la
barrera hematoencefálica. En una realización alternativa, la
proteína de fusión de la transferrina incluye una molécula de
transferrina modificada en la que la transferrina no retiene la
capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica.
En otra realización, la proteína de fusión de la
transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la
que la molécula de transferrina retiene la capacidad de unirse al
receptor de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al
interior de las células. En una realización alternativa, la proteína
de fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina
modificada en la que la molécula de transferrina no retiene la
capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el
péptido terapéutico al interior de las células.
En realizaciones adicionales, la proteína de
fusión de la transferrina incluye una molécula de transferrina
modificada en la que la molécula de transferrina retiene la
capacidad de unirse al receptor de la transferrina y trasportar el
péptido terapéutico al interior de las células y retiene la
capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica. En una realización
alternativa, la proteína de fusión de la transferrina incluye una
molécula de transferrina modificada en la que la molécula de
transferrina retiene la capacidad de cruzar la barrera
hematoencefálica, pero no retiene la capacidad de unirse al receptor
de la transferrina y trasportar el péptido terapéutico al interior
de las células.
Las proteínas de fusión en las bibliotecas de la
invención pueden contener una o más copias de la proteína o
polipéptido terapéutico unido al término N y/o al término C de la
proteína Tf. En algunas realizaciones, la proteína o el péptido
terapéutico se unen a los términos N y C de la proteína Tf y la
proteína de fusión puede contener uno o más equivalentes de la
proteína o el polipéptido terapéutico en cualquiera de ambos
extremos de Tf. En otras realizaciones, la proteína o el
polipéptido terapéutico se inserta en regiones conocidas de la
proteína Tf, por ejemplo, en uno o más de los bucles de Tf (véase
Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34):
24066-24073). En otras realizaciones, la proteína
terapéutica o el péptido terapéutico se insertan entre las regiones
N y C de Tf.
Generalmente, la proteína de fusión de la
transferrina puede tener una región derivada de la transferrina
modificada y una región derivada de la proteína terapéutica. Se
pueden usar, sin embargo, múltiples regiones de cada proteína para
preparar una proteína de fusión de la transferrina. De manera
similar, se puede usar más de una proteína terapéutica para
preparar una proteína de fusión de la transferrina produciendo de
esta manera una proteína de fusión de la Tf modificada
multifuncional.
La presente invención proporciona bibliotecas de
fagos que contienen una proteína de fusión de la transferrina que
contiene una proteína o polipéptido o porción del mismo fusionada a
una molécula de transferrina o porción de la misma, que tiene
afinidad reducida por un receptor de la transferrina. En una
realización, la proteína de fusión de la invención contiene una
proteína o polipéptido terapéutico fusionado al término N de una
molécula de transferrina. En una realización alternativa, la
proteína de fusión de la transferrina contiene una proteína
terapéutica fusionada al término C de una molécula de transferrina.
En otras realizaciones, la proteína de fusión de la transferrina
puede contener una proteína o polipéptido o porción terapéutica del
mismo fusionada a una molécula de transferrina modificada o porción
de la misma.
En otras realizaciones, la proteína de fusión de
la transferrina contiene una proteína terapéutica fusionada al
término N y al término C de la transferrina modificada. En otra
realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N
y C son las mismas proteínas terapéuticas. En una realización
alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N
y C son proteínas terapéuticas diferentes. En otra realización
alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N
y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para
tratar o evitar la misma enfermedad, trastorno, o dolencia. En otra
realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los términos N
y C son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para
tratar o evitar enfermedades o trastornos que se sabe en la técnica
que se producen comúnmente en pacientes de manera simultánea.
Adicionalmente a la proteína de fusión de la
transferrina modificada en la que la porción de la transferrina
modificada se fusiona con el N terminal y/o el C terminal de la
porción de proteína terapéutica, se puede producir también la
proteína de fusión de la transferrina insertando la proteína o el
péptido terapéutico de interés (por ejemplo, una proteína o
péptido terapéutico como se da a conocer en el presente documento,
o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única que se une a una
proteína terapéutica o a un fragmento o variante de la misma) en
una región interna de la transferrina modificada. Las regiones
internas de la transferrina modificada incluyen, pero no se limitan
a, los emplazamientos de unión al hierro, las regiones bisagra, los
emplazamientos de unión al bicarbonato, o la región de unión al
receptor.
Dentro de la secuencia de la proteína de la
molécula de la transferrina modificada, existen numerosos bucles o
vueltas, que se estabilizan mediante enlaces disulfuro. Estos bucles
son útiles para la inserción, o la fusión interna, de péptidos
terapéuticamente activos, particularmente los que requieren una
estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas
terapéuticas para generar una molécula de transferrina modificada
con actividad biológica específica.
Cuando se insertan las proteínas o péptidos
terapéuticos en o se sustituye al menos un bucle de una molécula de
Tf, se pueden realizar inserciones en el interior de cualquiera de
las regiones bucle expuestas superficialmente, adicionalmente a
otras áreas de la Tf. Por ejemplo, se pueden realizar inserciones en
el interior de los bucles que comprenden los aminoácidos
32-33, 74-75,
256-257, 279-280 y
288-289 de Tf (Ali y col, más arriba) (véase
la Fig. 3). Según se ha descrito anteriormente, se pueden realizar
también inserciones en el interior de otras regiones de Tf tales
como los emplazamientos para la unión del hierro y el bicarbonato,
las regiones bisagra, y la región de unión al receptor según se
describe con más detalle a continuación. Se pueden usar también los
bucles en la secuencia de la proteína Tf que son adecuados para la
modificación/sustitución para la inserción de proteínas o péptidos
para el desarrollo de una librería rastreable de insertos de
péptidos aleatorio. Se puede usar cualquier procedimiento para
producir insertos de ácido nucleico para la generación de
bibliotecas de péptidos, incluyendo los sistemas de fagos
disponibles y de presentación de bacterias, antes de la clonación
en una región de Tf y/o la fusión con los extremos de Tf. En otras
realizaciones, la biblioteca se prepara directamente en o sobre los
extremos de un péptido Tf según se describe a continuación.
El término N de Tf está libre y apunta hacia
fuera del cuerpo de la molécula. Las fusiones de las proteínas o
los péptidos en el término N pueden por tanto ser una realización
preferida. Dichas fusiones pueden incluir una región enlazante, tal
como, pero sin limitarse a un tramo de poliglicina, para separar la
proteína o el péptido terapéutico de Tf. Debe prestarse atención a
la unión entre la secuencia líder, la elección de la secuencia
líder, y la estructura del ARNm mediante la
manipulación/optimización del codón (sin bucles en los tallos
principales para inhibir el progreso del ribosoma) aumentará la
secreción y se puede llevar a cabo fácilmente usando técnicas
estandarizadas de proteínas recombinantes.
El término C de Tf parece estar más hundido y
asegurado mediante un enlace disulfuro en 6 aminoácidos del término
C. En la Tf humana, el aminoácido c terminal es una prolina que,
dependiendo de la manera en que está orientada, apuntará una fusión
tanto fuera de cómo en el interior del cuerpo de la molécula. Se
puede usar un resto enlazante o separador en el término C en
algunas realizaciones de la invención. Existe también una prolina
próxima al término N. En un aspecto de la invención, se puede
cambiar la prolina en los términos N y/o C. En otro aspecto de la
invención, se puede eliminar el enlace disulfuro C terminal para
desligar el término C.
En otras realizaciones adicionales, se pueden
complejar pequeñas moléculas terapéuticas con hierro y cargarse en
una proteína de fusión de la Tf modificada para liberarse en el
interior de las células y a través de la BBB. Se puede usar la
adición de un péptido director o, por ejemplo, un anticuerpo de
cadena única (SCA) para dirigir la carga útil hacia un tipo celular
concreto, por ejemplo, una célula cancerosa.
La presente invención proporciona también
bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos. Estas codifican un
proteína de fusión de la Tf que comprende una proteína transferrina
o una porción de una proteína transferrina que tiene afinidad
reducida por un receptor de la transferrina enlazado o unido
covalentemente a al menos un segundo péptido. Tal como se discute
con más detalle a continuación, se puede usar cualquier proteína
terapéutica. La proteína de fusión puede comprender además una
región enlazante, por ejemplo, una enlazante menor de
aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácidos. Las
moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden estar
purificadas o no.
Se proporcionan también las células y vectores
huéspedes para la replicación de las moléculas de ácido nucleico y
para expresar las proteínas de fusión codificadas. Se puede usar
cualquier vector o célula huésped, tanto procariota como eucariota,
pero se pueden preferir los sistemas de expresión eucariotas, en
concreto, los sistemas de expresión de levaduras. Se conocen en la
técnica muchos vectores y células huésped para dichos objetivos.
Está bien comprendido dentro del conocimiento de la persona experta
en la técnica seleccionar un conjunto apropiado para la aplicación
deseada.
Se pueden clonar las secuencias de ADN que
codifican la transferrina, porciones de la transferrina y las
proteínas terapéuticas de interés a partir de una variedad de
bibliotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica. Las
técnicas para aislar dichas secuencias de ADN usando procedimientos
basados en sondas son técnicas convencionales y bien conocidas de
las personas expertas en la técnica. Las sondas para aislar dichas
secuencias de ADN pueden basarse en secuencias publicadas de ADN o
proteínas (véase, por ejemplo, Baldwin, G.S. (1993) Comparison of
Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem.
Physiol. 106B/1: 203-218 y todas las referencias
citadas en el presente documento) Alternativamente, se puede usar la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), procedimiento que dieron
a conocer Mullis y col. (Patente de los Estados Unidos. Nº.
4.683.195) y Mullis (Patente de los Estados Unidos. Nº. 4.683.202).
La elección de la biblioteca y la selección de las sondas para el
aislamiento de dichas secuen-
cias de ADN están comprendidas dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.
cias de ADN están comprendidas dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.
Según se conoce en la técnica, la
"similitud" entre dos polinucleótidos o polipéptidos se
determina comparando la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y
sus sustitutos de nucleótidos o de aminoácidos conservados de un
polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo
polinucleótido o polipéptido. Se conoce también en la técnica la
"identidad", que significa el grado de relación de la secuencia
entre dos secuencias de polipéptidos o dos polinucleótidos según se
determina mediante la identidad de la secuencia entre dos cadenas
de dichas secuencias. se pueden calcular fácilmente la identidad y
la similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed.,
Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics
and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York,
1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.,
and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence
Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,
1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds.,
M Stockton Press, Nueva York, 1991).
Aunque existen numerosos procedimientos para
medir la identidad y la similitud entre dos secuencias de
polinucleótidos o de polipéptidos, los términos "identidad" y
"similitud" son bien conocidos de los técnicos expertos
(Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic
Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J.,
eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman,
D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos
comúnmente empleados para determinar la identidad o la similitud
entre dos secuencia incluyen, pero no se limitan a los que se dan a
conocer en la Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed.,
Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM
J. Applied Math. 48: 1073 (1988).
Los procedimientos preferidos para determinar la
identidad están diseñados para proporcionar la mayor
correspondencia entre las dos secuencias ensayadas. Los
procedimientos para determinar la identidad y la similitud están
codificados en programas informáticos. Los procedimientos de
programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la
similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al
paquete del programa CGC (Devereux, y col., Nucl. Acid Res.
12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, y col.,
J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o de
identidad referidas a lo anterior se determina como el grado de
identidad entre las dos secuencias, que a menudo indica una
derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. Se puede
determinar el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos
nucleicos por medio de un programa informático conocido en la
técnica como GAP facilitado en el paquete del programa GCG
(Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443-453
(1970)). Con el objeto de determinar el grado de identidad entre
dos secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, se usa
GAP con las siguientes configuraciones: penalización por creación
de huecos de 0,5 y penalización por extensión de huecos de 0,3.
La degeneración del código genético permite
variaciones en la secuencia de nucleótidos de una proteína
transferrina y/o la proteína terapéutica de interés, produciendo
adicionalmente a la vez un polipéptido que tiene idéntica secuencia
de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN
natural. El procedimiento, conocido como "optimización del
codón" (descrito en la Patente de los Estados Unidos 5.547.871)
proporciona un medio de diseñar dicha secuencia de ADN alterada. El
diseño de los genes optimizados del codón debería tener en cuenta
una variedad de factores, incluyendo la frecuencia de uso del codón
en un organismo, las frecuencias semejantes más próximas, la
estabilidad del ARN, el potencial de formación de la estructura
secundaria, la ruta de síntesis y las manipulaciones futuras
previstas del ADN de este gen. En concretos, se pueden usar los
procedimientos disponibles para alterar los codones que codifican
una proteína de fusión dada con los más fácilmente reconocidos por
la levadura cuando se usan sistemas de expresión de levaduras.
La degeneración del código genético permite
codificar y traducir la misma secuencia de aminoácidos de muchas
maneras diferentes. Por ejemplo, leucina, serina y arginina está
codificados cada uno por seis codones diferentes, mientras que
valina, prolina, treonina, alanina y glicina están codificados cada
uno por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de
uso de dichos codones sinónimos varía de genoma a genoma entre
eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los modelos de elección de
codones sinónimos entre mamíferos son muy similares, mientras que
organismos evolutivamente distantes tales como levaduras (tal como
S. cerevisiae), bacterias (tal como E. coli) e
insectos (tal como D. melanogaster) desvelan un modelo
claramente diferente de frecuencias de uso del codón genómico
(Grantham, R, y col., Nucl. Acid Res., 8, 49-62
(1980); Grantham, R., y col., Nucl. Acid Res., 9,
43-74 (1981); Maroyarna, T., y col., Nucl. Acid
Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., y col., Nucl.
Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., y col.,
Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991);
Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)).
Estas diferencias en los modelos de elección del codón parecen
contribuir a los niveles de expresión global de los genes
individuales modulando las velocidades de elongación de los
péptidos (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169
(1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984);
Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989);
Randall, L. L., y col., Eur. J. Biochem., 107,
375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J.
Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., y col.,
J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., y
col., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel,
J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974);
Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981);
Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409
(1981)).
Las frecuencias de uso preferido del codón de un
gen sintético deberían reflejar los usos del codón de los genes
nucleares derivados del genoma exacto (o tan estrechamente
relacionado como sea posible) de la célula/organismo que se prevé
que se va a usar para la expresión de la proteína recombinante,
particularmente de las especies de levaduras. Según se ha discutido
anteriormente, en una realización preferida de la secuencia de la
Tf humana se optimiza el codón, antes o después de la modificación
como se describe en el presente documento para la expresión de la
levadura como puede ser la(s) secuencia(s)
del(os) nucleótido(s) de la proteína terapéutica.
Las unidades de expresión para uso en la
presente invención comprenderán generalmente los siguientes
elementos, unidos de manera operable en una orientación 5' a 3'; un
promotor transcripcional, una secuencia señal secretora, una
secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la Tf
modificada que comprende la proteína transferrina o una porción de
una proteína transferrina unida a una secuencia de ADN que codifica
una proteína o péptido terapéutico de interés y un terminador
transcripcional. Según se ha discutido anteriormente, se puede usar
cualquier disposición de la proteína o péptido terapéutico fusionado
a o en el interior de la porción de Tf en los vectores de la
invención. La célula huésped seleccionada determinará la selección
de los promotores adecuados, las secuencias señal y los
terminadores y será evidente para una persona experta en la técnica
y se discute más específicamente a
continuación.
continuación.
Los vectores de levaduras adecuados para uso en
la presente invención se describen en la Patente de los Estados
Unidos 6.291.212 e incluyen YRp7 (Struhl y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach y
col., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219
(Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), pPPC0005,
pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores de plásmidos de
levaduras útiles incluyen también pRS403-406,
pRS413-416 y los vectores de Pichia disponibles de
Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los
plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos Integrantes
de Levaduras (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de
levaduras HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos
pRS413-41.6 son plásmidos Centrómeros de Levaduras
(YCps).
Dichos vectores incluirán generalmente un
marcador seleccionable, que puede ser uno de cualquier número de
genes que presente un fenotipo dominante para el cual exista un
ensayo fenotípico que permita seleccionar los transformantes. Los
marcadores seleccionables preferidos son los que complementan la
auxotrofia de la célula huésped, proporcionan resistencia a
antibióticos o permiten a una célula utilizar fuentes específicas
de carbono, e incluyen LEU2 (Broach y col. ibid.),
URA3 (Botstein y col., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl
y col., ibid.) o POT1 (Kawasaki y Bell, documento EP
171,142). Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen
CAT, que confiere resistencia al cloranfenicol en células de
levaduras. Los promotores preferidos para uso en levaduras incluyen
los promotores de los genes glicolíticos de las levaduras (Hitzeman
y col., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; Alber
y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982;
Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311) o los genes
de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering
of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y col., (eds.), p. 355,
Plenum, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101:
192-201, 1983) a este respecto, los promotores
particularmente preferidos son el promotor TPI1 (Kawasaki, Patente
de los Estados Unidos. Nº 4.599.311) y el
ADH2-4^{C} (véase el promotor de la Patente de
los Estados Unidos 6.291212 (Russell y col., Nature 304:
652-654, 1983). Las unidades de expresión pueden
incluir también un terminador transcripcional. Un terminador
transcripcional preferido es el terminador TPI1 (Alber y
Kawasaki, ibid.) otros vectores preferidos y componentes
preferidos tales como los promotores y terminadores de un sistema
de expresión de levadura se dan a conocer en las Patentes Europeas
EP 0258067, EP 0286424, EP0317254, EP 0387319, EP 0386222, EP
0424117, EP 0431880, y EP 1002095; Publicaciones de Patentes
Europeas EP 0828759, EP 0764209, EP 0749478, y EP
0889949;publicación PCT WO 00/44772 y WO 94/04687; y las Patentes
de los Estados Unidos 5.739.007; 5.637.504; 5.302.697; 5.260.202;
5.667.986; 5.728.553; 5.783.423; 5.965.386; 6150.133; 6.379.924; y
5.714.377.
Adicionalmente a las levaduras, se pueden
expresar las proteínas de fusión modificadas en hongos filamentosos,
por ejemplo, cepas de los hongos Aspergillus, Los ejemplos
de promotores útiles incluyen los derivados de los genes
glicolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor
adh3 (McKnight y col., EMBO J. 4: 2093-2099,
1985) y el promotor tpiA, Un ejemplo de un terminador adecuados es
el terminador adh3 (McKnight y col., ibid.). Las
unidades de expresión que utilizan dichos componentes se pueden
clonar en el interior de vectores que sean capaces de la inserción
en el ADN cromosómico de Aspergillus, por ejemplo.
Los vectores de expresión en mamíferos incluirán
un promotor capaz de dirigir la transcripción de la proteína de
fusión de la Tf modificada. Los promotores preferidos incluyen
promotores víricos y promotores celulares, los promotores víricos
preferidos incluyen el promotor tardío mayor de adenovirus 2
(Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199,
1982) y el promotor de SV40 (Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1:
854-864, 1981). Los promotores celulares preferidos
incluyen el promotor de la metalotioneina 1 de ratón (Palmiter y
col., Science 222: 809-814, 1983) y el promotor
V_{\kappa} de ratón (véase la patente de los Estados Unidos
6.291.212) (Grant y col., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987). Un
promotor particularmente preferido es un promotor V_{H} de ratón
(véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Loh y col,
ibid). Dichos vectores de expresión pueden contener también un
conjunto de emplazamientos de corte y empalme del ARN localizados en
la dirección 3' del promotor y en la dirección 5' de la secuencia
de ADN que codifica la proteína de fusión de la transferrina. Los
emplazamientos de corte y empalme del ARN preferidos se pueden
obtener de los genes de adenovirus y/o de la inmunoglobulina.
Contenida también en los vectores de expresión
está una señal de poliadenilación localizada en la dirección 3' de
la secuencia de codificación de interés. Las señales de
poliadenilación incluyen las señales de poliadenilación temprana o
tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de
poliadenilación procedente de la región E1B de adenovirus 5 y el
terminador del gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto y
col., Nucl. Acid Res. 9: 3719-3730, 1981). Una
señal de poliadenilación particularmente preferida es el terminador
del gen V_{H} (véase la Patente de los Estados Unidos 6.291.212)
(Loh y col, ibid.). Los vectores de expresión pueden incluir
una secuencia líder vírica no codificante, tal como la líder
tripartita de adenovirus 2, localizada entre el promotor y los
emplazamientos de corte y empalme del ARN. Los vectores preferidos
pueden incluir también secuencias potenciadoras, tales como el
potenciador de SV40 y el potenciador \mu de ratón (véase la
Patente de los Estados Unidos 6.291.212) (Gillies, Cell 33:
717-728, 1983). Los vectores de expresión pueden
incluir también secuencias que codifican los ARN de adenovirus
VA.
Son bien conocidas en la bibliografía las
técnicas para transformar hongos, y se han descrito, por ejemplo,
por Beggs (ibid.), Hinnen y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75: 1929-1933, 1978), Yelton y col., (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), y Russell
(Nature 301: 167-169, 1983). Se pueden usar otras
técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células
fúngicas, tales como la electroporación (Becker y Guarente, Methods
in Enzymol. 194: 182-187, 1991). El genotipo de la
célula huésped contendrá generalmente un defecto genético que está
complementado por el marcador seleccionable presente en el vector de
expresión. La elección de un huésped y el marcador seleccionable
concretos está bien comprendida dentro del nivel de conocimiento de
una persona normalmente experta en la técnica.
Se pueden introducir las secuencias de ADN
clonado que comprenden las proteínas de fusión de la Tf modificada
en células de mamífero cultivadas mediante, por ejemplo,
transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y col., Cell 14:
725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981;
Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973. Se pueden usar también
otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células
de mamíferos, tales como la electroporación (Neumann y col., EMBO J.
1: 841-845, 1982), o la lipofección. Con el fin de
identificar las células que tienen integrado el ADN, se introduce
generalmente un marcador seleccionable en las células junto con el
gen del ADNc de interés. Los marcadores seleccionables preferidos
para uso en células de mamífero cultivadas incluyen los genes que
confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina,
higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un
marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable
amplificable preferido es el gen DHFR. Un marcador amplificable
particularmente preferido es el ADNc de DHFR' (véase la Patente de
los Estados Unidos 6.291.212) (Simonsen y Levinson, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly revisó
los marcadores seleccionables (Mammalian Cell Technology,
Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.) y la elección de los
marcadores seleccionables está bien comprendida dentro del nivel de
conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica.
La presente solicitud describe también una
célula, preferiblemente una célula de levadura transformada para
expresar una proteína de fusión de la transferrina modificada.
Adicionalmente a las propias células huésped transformadas, la
solicitud describe también un cultivo de dichas células,
preferiblemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un
cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si
se segrega el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con
las células, o sin las células si se han separado por filtración o
centrifugación.
Las células huésped par uso en la práctica de la
presente invención incluyen células eucariotas, y en algunos casos
células procariotas, capaces de transformarse o transfectarse con
ADN exógeno y crecer en cultivo, tal como células de mamífero,
insecto, hongo, planta y bacteria.
Las células fúngicas, incluyendo las especies de
levaduras (por ejemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces
spp., Pichia spp.) se pueden usar como células huésped dentro de
la presente invención. Los ejemplos de hongos que incluyen
levaduras como huéspedes para expresar la proteína de fusión de la
transferrina son Pichia (algunas especies de las cuales se
clasificaban anteriormente como Hansenula), Saccharomyces,
Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora,
Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces,
Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor,
Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium,
Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y
similares. Los ejemplos de Saccharomyces spp. son S.
cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Los ejemplos de
Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K.
marxianus. Una especie de Torulaspora adecuada es T.
delbrueckii. Los ejemplos de Pichia spp. son P.
angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anomala
(anteriormente H. anomala) y P. pastoris.
Las células huésped particularmente útiles para
producir las proteínas de fusión de la Tf son la Pichia
pastoris metilotrófica (Steinlein y col. (1995) Protein Express.
Purif. 6: 619-624). Se ha desarrollado Pichia
pastoris para que sea un huésped destacado para la producción de
proteínas extrañas debido a que su promotor de la alcohol oxidasa
ha sido aislado y clonado; se informó por primera vez de su
transformación en 1985. P. pastoris utiliza metanol como
fuente de carbono en ausencia de glucosa. El sistema de expresión de
P. pastoris puede usar el promotor de la alcohol oxidasa
inducida por metanol (AOX1), que controla el gen que codifica la
expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera
etapa en el metabolismo del metanol. Este promotor se ha
caracterizado e incorporado a una serie de vectores de expresión de
P. pastoris. Debido a que las proteínas producidas en P.
pastoris se pliegan normalmente de manera correcta y se segregan
en el medio, la fermentación de P. pastoris construida
mediante ingeniería genética proporciona una excelente alternativa
a los sistemas de expresión en E. coli. Se han producido
numerosas proteínas usando este sistema, incluyendo el fragmento de
la toxina del tétanos, la pertactina de Bordetella pertussis,
la albúmina y la lisozima del suero humano.
Las cepas de Saccharomyces cerevisiae son
otro huésped preferido. En una realización preferida, se usa una
célula de levadura, o más específicamente, una célula huésped de
Saccharomyces cerevisiae que contiene una deficiencia
genética en un gen requerido para la glicosilación ligada a
asparagina de las glicoproteínas. Se pueden preparar las células
huésped de S. cerevisiae que tienen dichos defectos usando
las técnicas estandarizadas de mutación y selección, aunque se han
modificado muchas cepas de levadura disponibles para evitar o
reducir la glicosilación o la hipermanosilación. Ballou y col. (J.
Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) han descrito el
aislamiento de los mutantes de la biosíntesis de la mannoproteína
que son defectivos en los genes que afectan a la glicosilación
ligada a asparagina. Gentzsch y Tanner (Glycobiology
7:481-486, 1997) han descrito una familia de al
menos seis genes (PMT1-6) que codifican las enzimas
responsables de la primera etapa en la
O-glicosilación de las proteínas en levadura. Los
mutantes defectivos en uno o más de estos genes muestran una
reducida glicosilación ligada a O y/o una alteración en la
especificidad de la O-glicosilación.
Para optimizar la producción de las proteínas
heterólogas, se prefiere también que la cepa huésped trasporte una
mutación, tal como la mutación pep4 en S. cerevisiae (Jones,
Genetics 85: 23-33, 1977), que da como resultado
una actividad proteolítica reducida. Las cepas huésped que contienen
mutaciones en otras regiones que codifican la proteasa son
particularmente útiles para producir grandes cantidades de las
proteínas de fusión de la Tf.
Las células huésped que contienen constructos de
ADN se hacen crecer en un medio de crecimiento apropiado. Según se
usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento
apropiado" significa un medio que contiene los nutrientes
requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes
requeridos para el crecimiento celular puede incluir una fuente de
carbono, una fuente de nitrógeno, los aminoácidos esenciales,
vitaminas, minerales y factores de crecimiento. El medio de
crecimiento será generalmente selectivo para las células que
contienen el constructo de ADN mediante, por ejemplo, selección
mediante fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que se
complementará por el marcador seleccionable en el constructo de ADN
o transfectarse simultáneamente con el constructo de ADN. Las
células de levadura, por ejemplo, se hacen crecer preferiblemente en
un medio definido químicamente, que comprende una fuente de
carbono, por ejemplo, sacarosa, una fuente de nitrógeno no
de aminoácidos, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de
aminoácidos esenciales. El pH del medio se mantiene preferiblemente
a un pH mayor de 2 y menor de 8, preferiblemente a pH
5,5-6,5. Los procedimientos para mantener un pH
estable incluyen controlar el tamponamiento y el pH constante. Los
agentes tamponantes preferidos incluyen ácido succínico y
Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). las
células de levadura que tienen un defecto en un gen requerido para
la glicosilación ligada a asparagina se hacen crecer preferiblemente
en un medio que contiene un estabilizante osmótico. Un
estabilizante osmótico preferido es sorbitol suplementado en el
medio a una concentración entre 0,1 M y 1,5 M, preferiblemente a 0,5
M o 1,0 M.
Se hacen crecer las células de mamífero
cultivadas en medios libres de suero o que contienen suero
comercialmente disponible. La selección de un medio apropiado para
la línea celular concreta usada está comprendida dentro del nivel
de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica. Se
dejaron crecer las células de mamífero transfectadas durante un
periodo de tiempo, normalmente 1-2 días, hasta el
comienzo de la expresión de la(s) secuencia(s)
de
ADN de interés. A continuación se aplicó la selección mediante fármaco para seleccionar el crecimiento de las células que expresaban el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador seleccionable amplificable, se puede aumentar la concentración del fármaco en una manera por etapas para seleccionar el aumento del número de copias de las secuencias clonadas, aumentando por tanto los niveles de expresión.
ADN de interés. A continuación se aplicó la selección mediante fármaco para seleccionar el crecimiento de las células que expresaban el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador seleccionable amplificable, se puede aumentar la concentración del fármaco en una manera por etapas para seleccionar el aumento del número de copias de las secuencias clonadas, aumentando por tanto los niveles de expresión.
El Sistema de Expresión de Baculovirus
BacPAK^{TM} (BD Biosciences (Clontech)) expresa las proteínas
recombinantes en grandes cantidades en células huésped de insectos.
Se insertó el gen diana en un vector de transferencia, que se
transfectó simultáneamente en células huésped de insectos con el ADN
vírico de BacPAK6 linealizado. El ADN de BacPAK6 carece de una
porción esencial del genoma de baculovirus. Cuando el ADN se
recombina con el vector, se restaura el elemento esencial y el gen
diana se transfiere al genoma de baculovirus. Tras la
recombinación, se repican y purifican unas pocas placas víricas, y
se verifica el fenotipo recombinante. A continuación se pueden
amplificar los virus recombinantes aislados recientemente y usarse
para infectar cultivos de células de insectos para producir grandes
cantidades de la proteína deseada.
Se pueden producir también las proteínas de
fusión de la Tf usando plantas y animales transgénicos. Por
ejemplo, ovejas y cabras pueden fabricar la proteína terapéutica en
su leche. O las plantas de tabaco pueden incluir la proteína en sus
hojas. La producción de proteínas en plantas y animales transgénicos
comprende añadir un nuevo gen que codifica la proteína de fusión en
el genoma del organismo. No sólo puede el organismo transgénico
producir una nueva proteína, sino que también puede pasar esta
capacidad en su progenie.
Los términos "secuencia señal secretora" o
"secuencia señal" o "secuencia líder de secreción" se usan
de manera intercambiable y se describen, por ejemplo, en la Patente
de los Estados Unidos 6.291.212 y la Patente de los estados Unidos
5.547.871. las secuencias señal secretoras o secuencias señal o
secuencias líder de secreción codifican péptidos secretores. Un
péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para
dirigir la secreción de un polipéptido o proteína madura procedente
de una célula. Los péptidos secretores se caracterizan generalmente
por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran normalmente
(pero no exclusivamente) en los términos amino de las proteínas
recientemente sintetizadas. Muy a menudo los péptidos secretores se
escinden de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos
secretores pueden contener emplazamientos de procesamiento que
permiten romper el péptido señal a partir de la proteína madura a
medida que ésta pasa a través de la ruta secretora. Los
emplazamientos de procesamiento pueden estar codificados en el
interior del péptido señal o se pueden añadir al péptido señal,
mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro.
Se pueden usar los péptidos secretores para
dirigir la secreción de las proteínas de fusión de la Tf
modificada. Uno de dichos péptidos secretores que se puede usar en
combinación con otros péptidos secretores es la secuencia líder del
factor de apareamiento alfa. Se requieren secuencias señal
secretoras o secuencias señal o secuencias líder de secreción en
una serie compleja de etapas de procesamiento
post-traduccionales que dan como resultado la
secreción de una proteína. Si está presente una secuencia señal
intacta, la proteína que se está expresando entra en la luz del
retículo endoplásmico rugoso y a continuación se trasporta a través
del aparato de Golgi hasta las vesículas secretoras y finalmente se
trasporta fuera de la célula. Generalmente, la secuencia señal
sigue inmediatamente al codón de inicio y codifica un péptido señal
en el extremo amino terminal de la proteína que se va a secretar.
En la mayor parte de los casos, la secuencia señal se rompe
mediante una proteasa específica, denominada una peptidasa señal.
Las secuencias señal preferidas mejoran el procesamiento y exportan
la eficacia de la expresión de la proteína recombinante mediante
vectores de expresión víricos, de mamíferos o de levaduras. En
algunos casos, se puede usar la secuencia señal de la Tf natural
para expresar y segregar las proteínas de fusión.
El resto Tf y el(los) resto(s) de
la proteína terapéutica se pueden fusionar directamente o usando un
péptido enlazante de diversas longitudes par proporcionar mayor
separación física y permitir más movilidad espacial entre las
proteínas fusionadas y de esta manera, maximizar la accesibilidad de
la porción de proteína terapéutica, por ejemplo, para la unión de
su receptor análogo. El péptido enlazante puede estar constituido
por aminoácidos que sean flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un
enlazante tal como pero sin limitarse a un tramo de poliglicina. El
enlazante puede ser menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20, ó 10
restos de aminoácidos. El enlazante se puede unir covalentemente a
y entre la proteína transferrina o su porción y la proteína
terapéutica.
Los ensayos para la detección de proteínas de
fusión terapéuticas de la transferrina modificada biológicamente
activas pueden incluir la transferencia Western, la transferencia de
proteínas o el filtro de colonias así como ensayos basados en la
actividad que detectan la proteína terapéutica fusionada. Se puede
preparar un filtro de transferencia Western usando el procedimiento
descrito por Towbin y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:
4350-4354, 1979). De manera breve, las muestras se
sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio. Las proteínas en el gel se transfirieron
electroforéticamente a papel de nitrocelulosa. Se pueden preparar
filtros de transferencia de proteínas filtrando las muestras o
concentrados de sobrenadante a través de filtros de nitrocelulosa
usando, por ejemplo, un Minifold (Schleicher & Schuell, Keene,
N.H.). Se pueden preparar filtros de colonias haciendo crecer las
colonias sobre un filtro de nitrocelulosa que se ha extendido a
través de un medio de crecimiento apropiado. En este procedimiento,
se prefiere un medio sólido: Se dejan crecer las células sobre los
filtros durante al menos 12 horas. Las células se retiran de los
filtros lavándolos con un tampón apropiado que no elimina las
proteínas unidas a los filtros. Un tampón preferido comprende
Tris-base 25 mM, glicina 19 mM, pH 8,3, metanol al
20%.
Se pueden detectar también las proteínas de
fusión evaluando la actividad del resto de proteína terapéutica.
Dichos ensayos están fácilmente disponibles, incluyendo, pero sin
limitarse a, los ensayos descritos en la Tabla 1 de la Publicación
Internacional PCT Nº WO 03/020746. Específicamente, se pueden
evaluar las proteínas de fusión para la actividad funcional (por
ejemplo, la actividad biológica o la actividad terapéutica)
usando el ensayo que e referencia en la columna "Ensayo de
Actividad a modo de Ejemplo" de la Tabla 1. Adicionalmente, una
persona experta en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los
fragmentos de una proteína terapéutica que corresponde a una
porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión, usando
para la actividad los ensayos que se referencian en su
correspondiente fila de la Tabla 1. Adicionalmente, una persona
experta en la técnica puede evaluar de manera rutinaria los
fragmentos de una proteína de la transferrina modificada par la
actividad usando los ensayos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, en una realización en la que se
está evaluando la capacidad de una proteína de fusión de la
transferrina de unirse o competir con una proteína terapéutica para
la unión a un anticuerpo del polipéptido antiterapéutico y/o el
anticuerpo de la antitransferrina, se pueden usar diversos ensayos
conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas
de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales
como los radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunosorbente unido a
enzima), inmunoensayos de tipo sándwich, ensayos
inmunoradiométricos, reacciones de precipitación mediante difusión
en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ
(usando oro coloidal, marcas de enzimas o radioisótopos, por
ejemplo), transferencias western, reacciones de precipitación,
ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación
en gel), ensayos de fijación del complemento, ensayos de
inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de
inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detectó la unión
con el anticuerpo detectando una marca en el anticuerpo primario.
En otra realización, se detectó el anticuerpo primario detectando la
unión de un anticuerpo o reactivo secundario con el anticuerpo
primario. En una realización adicional, se marcó el anticuerpo
secundario. Se sabe de muchos medios en la técnica para detectar la
unión en un inmunoensayo.
En una realización adicional, en la que se
identificó un compañero de unión (por ejemplo, un receptor o
un ligando), se puede evaluar la unión a este compañero de unión
mediante una proteína de fusión de la transferrina que contiene la
proteína terapéutica como la porción de la proteína terapéutica de
la fusión, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica,
tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductor y no
reductor, cromatografía de afinidad de proteínas, y transferencia
por afinidad. El técnico experto conocerá otros procedimientos.
Se pueden aislar las proteínas de fusión de la
transferrina modificada segregadas biológicamente activas a partir
del medio de crecimiento de las células huésped en condiciones que
permitan la secreción de las proteínas de fusión biológicamente
activas. El material celular se retira del medio de cultivo, y las
proteínas de fusión biológicamente activas se aíslan usando las
técnicas de aislamiento conocidas en la técnica. Las técnicas de
aislamiento adecuadas incluyen la precipitación y el fraccionamiento
mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, que
incluyen la filtración en gel, la cromatografía de intercambio
iónico y la cromatografía de afinidad.
Un procedimiento de purificación particularmente
preferido es la cromatografía de afinidad en una columna enlazante
de hierro o quelante de metales o una cromatografía de
inmunoafinidad usando un anticuerpo dirigido contra la transferrina
o proteína terapéutica o la porción del péptido del polipéptido de
fusión. El anticuerpo se inmoviliza o se une preferiblemente a un
soporte o sustrato sólido. Un sustrato particularmente preferido es
Sepharose activada por CNBr (Pharmacia LKB Technologies, Inc.,
Piscataway, N.J.). mediante este procedimiento, el medio se combina
con el anticuerpo/sustrato en condiciones que permitan que se
produzca la unión. Se puede lavar el complejo para eliminar el
material no unido, y la proteína de fusión de la transferrina se
libera o eluye mediante el uso de condiciones desfavorables para la
formación del complejo. Los procedimientos de elución
particularmente útiles incluyen cambios en el pH, en el que el
anticuerpo inmovilizado tiene una elevada afinidad por el ligando a
un primer pH y una afinidad reducida a un segundo pH (mayor o
menor); cambios en la concentración de algunos agentes caótropos; o
mediante el uso de detergentes.
Las proteínas de fusión de la transferrina
también se pueden marcar con un radioisótopo u otro agente de
formación de imagen y usarse con objetivos diagnósticos in
vivo. Los agentes radioisótopos para formación de imágenes
preferidos incluyen yodo-125 y
tecnecio-99, siendo particularmente preferido
tecnecio-99. Se conocen bien en la técnica los
procedimientos para producir conjugados de
proteína-isótopo, y se describen en, por ejemplo,
Eckelman y coll. (Patente de los Estados Unidos Nº 4.652.440),
Parker y col. (documento WO 87/05030) y Wilber y col. (documento EP
203,764). Alternativamente, las proteínas de fusión de la
transferrina se pueden unir a potenciadores de marca de espin y
usarse para formación de imagen mediante resonancia magnética (RM).
Los potenciadores de marca de espin adecuados incluyen, compuestos
de radicales libres, estables, estéticamente impedidos, tales como
nitróxidos. Los procedimientos para marcar ligandos para la
formación de imágenes mediante RM se dan a conocer, por ejemplo, en
Coffman y col. (Patente de los Estados Unidos Nº 4.656.026). Para la
administración, las proteínas de fusión de la transferrina marcada
se combinan con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable, tal como disolución salina estéril o agua estéril. La
administración es preferiblemente mediante inyección de bolo,
preferiblemente por vía intravenosa.
La presente solicitud describe además los
procedimientos para producir una proteína de fusión modificada
usando las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente
documento, la producción de una forma recombinante de una proteína
implica normalmente las siguientes etapas.
Se obtiene en primer lugar una molécula de ácido
nucleico que codifica una proteína de fusión de la transferrina de
la invención. A continuación la molécula de ácido nucleico se coloca
preferiblemente de manera operable con las secuencias de control
adecuadas, según se ha descrito anteriormente, para formar una
unidad de expresión que contenga el marco de lectura abierto de la
proteína, las unidades de expresión se usan para transformar un
huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva en condiciones
que permitan la producción de la proteína recombinante. La proteína
recombinante se aísla opcionalmente a partir del medio o a partir
de las células; puede no ser necesaria la recuperación y la
purificación de la proteína en algunos casos en los que se pueden
tolerar algunas impurezas.
Se puede llevar a cabo cada una de las
anteriores etapas en una variedad de maneras. Por ejemplo, la
construcción de vectores de expresión que son operables en una
variedad de huéspedes se lleva a cabo usando replicones y
secuencias de control apropiados, como se muestra anteriormente. Las
secuencias de control, los vectores de expresión, y los
procedimientos de transformación son dependientes del tipo de
células huésped usada para expresar el gen y se han discutido en
detalle anteriormente y las personas expertas en la técnica los
conocen. Los emplazamientos de restricción adecuados pueden, si no
están normalmente disponibles, añadirse a los extremos de la
secuencia de codificación de tal manera que proporcionen un gen
escindible para insertar en estos vectores. Un técnico experto
puede adaptar fácilmente cualquier sistema de huésped/expresión
conocido en la técnica para uso con las moléculas de ácido nucleico
de la invención para producir una proteína recombinante deseada.
Según se ha discutido anteriormente, se puede
usar cualquier sistema de expresión, incluyendo sistemas de
levaduras, bacterias, animales, plantas eucariotas y procariotas. En
algunas realizaciones, se prefieren los sistemas de levaduras,
cultivo de células de mamíferos, y producción de animales o plantas
transgénicos. En otras realizaciones, se puede usar sistemas de
levaduras que se han modificado para reducir la glicosilación, la
hiperglicosilación o la actividad proteolítica de las levaduras
naturales.
Se puede usar cualquier molécula terapéutica
como compañero de fusión de Tf según los procedimientos y las
composiciones de la presente invención. Según se usa en el presente
documento, una molécula terapéutica es normalmente una proteína o
péptido capaz de ejercer un efecto biológico beneficioso in
vitro o in vivo e incluye las proteínas o los péptidos
que ejercen un efecto beneficioso en relación con la homeostasis, la
fisiología o un estado de enfermedad normal. Las moléculas
terapéuticas no incluyen los compañeros de fusión comúnmente usados
como marcadores o auxiliares de la purificación de proteínas, tales
como las galactosidasas bacterianas (véase por ejemplo, la Patente
de los Estados Unidos 5, 986, 067 y Aldred y col. (1984) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 122: 960-965). Por ejemplo, un
efecto beneficioso que se relaciona con un estado de enfermedad
incluye cualquier efecto que sea ventajoso para el sujeto tratado,
incluyendo la prevención de la enfermedad, la estabilización de la
enfermedad, la disminución o el alivio de los síntomas de la
enfermedad o una modulación, alivio o cura del defecto subyacente
que produce un efecto beneficioso en el sujeto tratado.
Una proteína de fusión de la transferrina
modificada incluye al menos un fragmento o variante de una proteína
terapéutica y al menos un fragmento o variante de la transferrina
sérica modificada, que se asocian entre sí, preferiblemente mediante
fusión genética.
En una realización, la proteína de fusión de la
transferrina incluye una molécula de transferrina modificada unida
a un agente neurofarmacéutico. En otra realización, la proteína de
fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el
término carboxilolo unida a un agente neurofarmacéutico en el
término amino. En una realización alternativa, la proteína de
fusión de la transferrina modificada incluye transferrina en el
término amino unida a un agente neurofarmacéutico en el término
carboxilo. En realizaciones específicas el agente neurofarmacéutico
es tanto el factor de crecimiento nervioso como el factor neutrófico
ciliar.
En realizaciones adicionales, una proteína de
fusión de la transferrina modificada puede contener al menos un
fragmento o variante de una proteína terapéutica, y/o al menos un
fragmento o variante de un anticuerpo. En una realización
adicional, las proteínas de fusión de la transferrina pueden
contener fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de
proteínas o anticuerpos en los que la variante o fragmento retiene
al menos una actividad biológica o terapéutica. Las proteínas de
fusión de la transferrina pueden contener proteínas terapéuticas
que pueden ser fragmentos de péptido o variantes de péptidos de al
menos aproximadamente 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al
menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos
13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos
30, al menos 35, o al menos aproximadamente 40, al menos
aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos
aproximadamente 60, o al menos aproximadamente 70 o más aminoácidos
de longitud fusionados a los términos N y/o C, insertados en el
interior, o insertados en un bucle de una transferrina
modificada.
En otra realización, las moléculas de fusión de
la transferrina modificada contienen una porción de proteína
terapéutica que pueden ser fragmentos de una proteína terapéutica
que incluyen la proteína de longitud completa así como los
polipéptidos que tienen uno o más restos borrados del término amino
de la secuencia de aminoácidos.
En otra realización, las moléculas de fusión de
la transferrina modificada contienen una porción de proteína
terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos borrados del
término carboxilo de la secuencia de aminoácidos.
En otra realización, las moléculas de fusión de
la transferrina modificada contienen una porción de proteína
terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos borrados de los
términos amino y carboxilo.
En otra realización, las moléculas de fusión de
la transferrina modificada contienen una porción de proteína
terapéutica que es al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o
99% idéntica a la proteína terapéutica de referencia que se muestra
en el presente documento, o sus fragmentos. En realizaciones
adicionales, las moléculas de fusión de la transferrina contienen
una porción de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente
un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a los
polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos de
las delecciones N y C terminales según se describe
anteriormente.
En otra realización, las moléculas de la
transferrina modificada contienen la porción de la proteína
terapéutica que es al menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de
aminoácidos nativa o natural de una proteína terapéutica. Se
proporcionan también fragmentos de estos polipéptidos.
Las proteínas terapéuticas que corresponden a
una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la
transferrina modificada, tal como proteínas superficiales celulares
y secretoras, s pueden modificar mediante la unión de uno o más
grupos de oligosacáridos. La modificación denominada como
glicosilación puede afectar significativamente las propiedades
físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad,
secreción, y localización de la proteína. La glicosilación se
produce en localizaciones específicas a lo largo del esqueleto del
polipéptido. Existen normalmente dos tipos principales de
glicosilación: la glicosilación caracterizada por oligosacáridos
unidos a N, que se unes a restos de asparagina en una secuencia
Asn-X-Ser/Thr, en la que X puede
ser un aminoácido excepto prolina. Variables tales como la
estructura de la proteína y el tipo celular influencian el número y
la naturaleza de las unidades de carbohidrato en el interior de las
cadenas en diferentes emplazamientos de glicosilación. Son comunes
también las glicosilaciones de los isómeros en el mismo
emplazamiento en el interior de un tipo de célula dado, Por ejemplo,
se glicosilan diversos tipos de interferón humano.
Se pueden modificar las proteínas terapéuticas
que corresponden a un porción de proteína terapéutica de una
proteína de fusión de la transferrina de la invención, así como sus
análogos y variantes, de tal manera que se altere la glicosilación
en uno o más sitios como resultado de la(s)
manipulación(es) de su secuencia de ácido nucleico por la
célula huésped en la que se expresan, o debido a otras condiciones
de su expresión. Por ejemplo, se puede producir la glicosilación de
los isómeros eliminando o introduciendo los emplazamientos de
glicosilación, por ejemplo, mediante sustitución o delección
de restos de aminoácidos, tales como la sustitución de glutamina
por asparagina, o se pueden producir proteínas recombinantes no
glicosiladas expresando las proteínas en células huésped que no las
glicosilarán, por ejemplo, en levaduras deficientes en
glicosilación. Se conocen en la técnica estas soluciones.
Se conocen bien en la técnica las proteínas
terapéuticas y su ácido nucleico y están disponibles en bases de
datos públicas tales como las Chemical Abstracts Services Databases
(por ejemplo, el Registro CAS), GenBank, y GenSeq.
En otras realizaciones, las proteínas de fusión
de la transferrina son capaces de una actividad terapéutica y/o
actividad biológica, que corresponde a la actividad terapéutica y/o
la actividad biológica de la proteína relacionada en la
correspondiente fila de la Tabla 1 de la Publicación Internacional
PCT Nº WO 03/020746, y en otra parte en esta solicitud (Véanse,
por ejemplo, las columnas de la Tabla 1 "Actividad
Biológica" y "proteína Terapéutica X"). En realizaciones
adicionales, las porciones de proteína terapéuticamente activa de
las proteínas de fusión de la transferrina son fragmentos o
variantes de las secuencias de referencia citadas en el presente
documento.
Incluso si la delección de uno o más aminoácidos
del término N de una proteína da como resultado la modificación o
pérdida de una o más funciones biológicas de la porción de proteína
terapéutica, se pueden retener adicionalmente otras actividades
terapéuticas y/o actividades funcionales (por ejemplo, actividades
biológicas, capacidad de multimerizar, capacidad de unirse a un
ligando). Por ejemplo, la capacidad de los polipéptidos con
delecciones N terminales de inducir y/o unirse a anticuerpos que
reconocen las formas completa o madura de los polipéptidos se
retendrán generalmente con menos de la mayoría de los restos del
polipéptido completo eliminado del término N. Si un polipéptido
concreto carece de los restos N terminales de un polipéptido
completo, retiene dichas actividades inmunológicas que se puede
evaluar mediante los procedimientos de rutina descritos en el
presente documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es
improbable que un mutante con un gran número de restos de
aminoácido N terminales borrados pueda retener alguna actividad
biológica o inmunógena. De hecho, péptidos compuestos por tan poco
como seis restos de aminoácidos pueden evocar a menudo una respuesta
inmune.
Igual como se ha mencionado anteriormente,
incluso si la delección de uno o más aminoácidos da como resultado
la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la
proteína, se pueden retener adicionalmente otras actividades
funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad
de multimerizar, capacidad de unirse a un ligando) y/o actividades
terapéuticas. Por ejemplo, se retendrá generalmente la capacidad de
los polipéptidos con delecciones C-terminales de
inducir y/o unirse a anticuerpos que reconoces las formas completa
o madura del polipéptido, cuando menos de la mayoría de los restos
del polipéptido completo o maduro se eliminan del término C. Si un
polipéptido concreto carece de los restos N terminal y/o se pueden
determinar fácilmente los restos C terminales de un polipéptido de
referencia que retienen la actividad terapéutica, mediante los
procedimientos rutinarios que se describen en el presente documento
y/o de otra manera conocida en la técnica.
Los fragmentos de péptidos de las proteínas
terapéuticas pueden ser fragmentos que comprendan, o
alternativamente, estén constituidos por, una secuencia de
aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/ una actividad
funcional (por ejemplo, actividad biológica) de la secuencia
de polipéptidos de la proteína terapéutica de la cual la secuencia
de aminoácidos es un fragmento.
Los fragmentos de péptidos de la proteína
terapéutica pueden comprender sólo los términos N y C de la
proteína, es decir, la porción central de la proteína
terapéutica que se ha borrado. Alternativamente, los fragmentos de
péptidos pueden comprender porciones no adyacentes y/o adyacentes de
la parte central de la proteína terapéutica.
Otros fragmentos de polipéptido son fragmentos
biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos son los
que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a
una actividad de una proteína terapéutica usada en la presente
invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir
una mejora de la actividad deseada, o una disminución de la
actividad indeseada.
\newpage
Generalmente, las variantes de las proteínas son
globalmente muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a la
secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica que corresponde
a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de
la transferrina de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican
estas variantes están también abarcados por la invención.
Los polipéptidos terapéuticos adicionales que se
pueden usar en la invención son polipéptidos codificados por
polinucleótidos que se hibridan con el complemento de un molécula de
ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una
proteína terapéutica en condiciones de hibridación restrictivas que
las personas expertas en la técnica conocen (véase, por ejemplo,
Ausubel, F.M. y col., eds., 1989 Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley &
Sons Inc., nueva. York).. los polinucleótidos que codifican estos
polipéptidos están también abarcados por la invención.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a la
secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se
entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es
idéntica a la secuencia problema excepto en que la secuencia de
polipéptidos sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de
aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga
una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a la
secuencia de aminoácidos problema, se puede insertar, borrar, o
sustituir por otros aminoácidos hasta un 5% de los restos de
aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la
secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino
o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia
o en cualquier lugar entre las posiciones terminales, intercaladas
tanto individualmente entre los restos en la secuencia de
referencia, como en uno o más grupos contiguos en el interior de la
secuencia de referencia.
En la práctica, se puede determinar
convencionalmente si cualquier polipéptido particular es al menos
aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico
a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de
fusión de la transferrina o la porción de transferrina de proteína
de fusión de la transferrina (tal como una porción de la proteína
terapéutica de la proteína de fusión de la transferrina o la porción
de transferrina de la proteína de fusión de la transferrina) usando
programas informáticos conocidos. Un procedimiento preferido para
determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia
problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia
sujeto, denominada también como alineación global de la secuencia,
se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en
el algoritmo de Brufiag y col. (Comp. App. Biosci 245 (1990)).
Las variantes de polinucleótidos pueden contener
alteraciones en las regiones de codificación, las regiones no
codificantes, o ambas. Se pueden usar las variantes de
polinucleótidos que contienen alteraciones que producen
sustituciones, adiciones, o delecciones silenciosas, pero que no
alteran las propiedades o las actividades del polipéptido
codificado para producir proteínas de fusión de la Tf modificada. Se
pueden utilizar variantes de nucleótidos producidas mediante
sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código
genético. Más aún, se pueden utilizar también variantes de
polipéptidos en las que están sustituidos, borrados, o añadidos
menos de aproximadamente 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20,
menos de 10, 0 5-50, 5-25,
5-10, 1-5 0 1-2
aminoácidos. se pueden producir variantes de polinucleótidos por
diferentes razones, por ejemplo, para optimizar la expresión
del codón de un huésped concreto (cambio de los codones en el ARNm
humano por los preferidos por un huésped, tal como, una levadura o
E. coli según se describe anteriormente).
En otras realizaciones, el resto de proteína
terapéutica tiene sustituciones conservativas en comparación con la
secuencia de tipo natural. Por "sustituciones conservativas" se
entiende intercambios en el interior de grupos tales como la
sustitución de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val; Leu
e Ile; la sustitución de los restos hidroxilo de Ser y Thr; la
sustitución de los restos ácidos de Asp y Glu; la sustitución de
los restos amida de ASn y Gln, la sustitución de los restos básicos
de Lys, Arg, e His; la sustitución de los restos aromáticos de Phe,
Tyr, y Trp, y la sustitución de los aminoácidos de pequeño tamaño
Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. Se proporcionan las directrices con
respecto a como realizar sustituciones de aminoácidos
fenotípicamente silenciosas, por ejemplo, en Bowie et al.,
"Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino
Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310
(1990). Los polipéptidos de fusión pueden comprender, o
alternativamente estar constituidos por, fragmentos o variantes de
la secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica descrita en
el presente documento y/o la proteína transferrina sérica, y/o la
transferrina modificada, en la que los fragmentos o variantes
tienen 1-5, 5-10,
5-25, 5-50, 10-50 o
50-150 adiciones, sustituciones, y/o delecciones de
restos de aminoácidos cuando se las compara con la secuencia de
aminoácidos de referencia. En las realizaciones adicionales, las
sustituciones de aminoácidos son conservativas. Se describen también
en el presente documento los ácido nucleicos que codifican estos
polipéptidos.
Las proteínas de fusión modificadas pueden estar
compuestas por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces
peptídicos o enlaces peptídicos modificados y pueden contener
aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes.
Se pueden modificar los polipéptidos tanto por procesos naturales,
tales como el procesamiento post-traduccional, como
por técnicas de modificación químicas que se conocen bien en la
técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en los textos
básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa
bibliografía de investigación.
Se pueden producir modificaciones en cualquier
parte en un polipéptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las
cadenas secundarias de aminoácidos y los términos amino o carboxilo.
Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación
en el mismo grado o en grados variables en diverso momentos en un
polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener
muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser
ramificados, como resultado, por ejemplo, de ubiquitinación, y
pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos
cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden ser el
resultados de procesos naturales después de la traducción o se
pueden preparar mediante procedimientos sintéticos. Las
modificaciones incluyen la acetilación, acilación,
ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de
flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un
nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o
derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol,
reticulación, ciclación, formación de enlace disulfuro,
desmetilación, formación de reticulado covalente, formación de
cisteína, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación,
yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación,
procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia
de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y
ubiquitinación (Véanse, por ejemplo
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2^{a}
Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y Colaboradores, Nueva
York(1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT
MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva
York, págs. 1-12 (1983); Seifter y col. (1990)
Meth. Enzymol. 182: 626-646; Rattan y col., Ann.
N.Y. Acad. Sci. 663:48-62.
Las moléculas terapéuticas que se pueden
fusionar a o insertarse en Tf incluyen, pero no se limitan a,
hormonas, proteínas de la matriz, inmunosupresores,
broncodilatadores, agentes cardiovasculares, enzimas, agentes del
SNC, neurotransmisores, proteínas o péptidos del receptor, hormonas
del crecimiento, factores de crecimiento, péptidos antivíricos,
péptidos inhibidores fusogénicos, citocinas, linfocinas, monocinas,
interleucinas, factores estimulantes de las colonias, factores de
diferenciación, factores angiogénicos, ligandos del receptor,
proteínas asociadas a cáncer, antineoplásicos, péptidos víricos,
péptidos antibióticos, proteínas de la sangre, proteínas
antagonistas, factores de transcripción, factores antiangiogénicos,
proteínas o péptidos antagonistas, antagonistas del receptor,
anticuerpos, anticuerpos de cadena única y moléculas de adhesión
celular. Se pueden combinar diferentes moléculas terapéuticas en una
proteína de fusión única para producir una molécula terapéutica bi
o multifuncional. Se pueden usar también diferentes
mo-
léculas en combinación para producir una proteína de fusión con una entidad terapéutica y una entidad directora.
léculas en combinación para producir una proteína de fusión con una entidad terapéutica y una entidad directora.
Las citocinas son proteínas solubles liberadas
por las células del sistema inmune, que actúan no enzimáticamente a
través de receptores específicos para regular las respuestas
inmunes. Las citocinas semejan hormonas en las que actúan a bajas
concentraciones de unión con elevada afinidad hacia un receptor
específico. El término "citocina" se usa en el presente
documento para describir proteínas recombinantes o que se producen
naturalmente, sus análogos, y sus fragmentos, que estimulan una
respuesta biológica específica en una célula que tiene un receptor
para esta citocina. Las citocinas incluyen preferiblemente
interleucinas tales como interleucina-2
(IL-2) (Nº de Acceso al GenBank S77834),
IL-3 (Nº de Acceso al GenBank M14743),
IL-4 (Nº de Acceso al GenBank M23442),
IL-5 (Nº de Acceso al GenBank J03478),
IL-6 (Nº de Acceso al GenBank M14584),
IL-7 (Nº de Acceso al GenBank NM_000880),
IL-10 (Nº de Acceso al GenBank NM_000572),
IL-12 (Nº de Acceso al GenBank AF180562 y Nº de
Acceso al GenBank AF180563), IL-13 (Nº de Acceso al
GenBank U10307), IL-14 (Nº de Acceso al GenBank
XM_170924), IL-15 (Nº de Acceso al GenBank X91233),
IL-16 (Nº de Acceso al GenBank NM_004513),
IL-17 (Nº de Acceso al GenBank NM_002190) e
IL-18 (Nº de Acceso al GenBank NM_001562), factores
hematopoyéticos tales como factor de estimulación de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
(Nº de Acceso al GenBank X03021), factor de estimulación de colonias
de granulocitos (G-CSF) (Nº de Acceso al GenBank
X03656), factor de activación de plaquetas (Nº de Acceso al GenBank
NM_000437) y eritropoyetina (Nº de Acceso al GenBank X02158),
factores de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF\alpha (Nº de
Acceso al GenBank X02910), linfocinas tales como linfotoxina
\alpha (Nº de Acceso al GenBank X02911),
linfotoxina-\beta (Nº de Acceso al GenBank
L11016), leucoregulina, factor inhibidor de la migración de
macrófagos (Nº de Acceso al GenBank M25639), y neuroleucina (Nº de
Acceso al GenBank K03515), reguladores de los procesos metabólicos
tales como leptina (Nº de Acceso al GenBank U43415), interferones
tales como interferón \alpha (IFN\alpha) (Nº de Acceso al
GenBank M54886), IFN\beta (Nº de Acceso al GenBank V00534),
IFN\gamma (Nº de Acceso al GenBank J00219), IFNo (Nº de Acceso al
GenBank NM_002177), trombospondina 1 (THBS1) (Nº de Acceso al
GenBank NM_003246), THBS2 (Nº de Acceso al GenBank L12350), THBS3
(Nº de Acceso al GenBank L38969), THBS4 (Nº de Acceso al GenBank
NM_003248), y quimiocinas. Preferiblemente, la proteína de fusión de
la transferrina-citocina modificada de la presente
invención muestra actividad biológica de la citocina.
El término "hormona" se usa en el presente
documento para describir una cualquiera de las numerosas sustancias
biológicamente activas que están producidas por algunas células o
tejidos y que producen cambios o actividades biológicas específicas
que se producen en otra célula o tejido localizados en cualquier
parte del cuerpo. Las hormonas incluyen preferiblemente proinsulina
(Nº de Acceso al GenBank V00565), insulina (Nº de Acceso al GenBank
NM_000207), hormona 1 del crecimiento (Nº de Acceso al GenBank
V00520), hormona 2 del crecimiento (Nº de Acceso al GenBank
F006060), factor de liberación de la hormona del crecimiento (Nº de
Acceso al GenBank NM_021081), factor I de crecimiento de tipo
insulina (Nº de Acceso al GenBank M27544), factor II de crecimiento
de tipo insulina (Nº de Acceso al GenBank NM_000612), proteína 1 de
unión al factor de crecimiento de tipo insulina
(IGFBP-1) (Nº de Acceso al GenBank M59316),
IGFBP-2 (Nº de Acceso al GenBank X16302),
IGFBP-3 (Nº de Acceso al GenBank NM_ 000598),
IGFBP-4 (Nº de Acceso al GenBank Y12508),
IGFBP-5 (Nº de Acceso al GenBank M65062),
IGFBP-6 (Nº de Acceso al GenBank NM_002178),
IGFBP-7 (Nº de Acceso al GenBank NM_001553), cadena
\beta de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso al GenBank NM_
033142), cadena \alpha de la gonadotropina coriónica (Nº de Acceso
al GenBank NM_000735), hormona \beta luteneizante (Nº de Acceso
al GenBank X00264), hormona \beta estimuladora del folículo (Nº
de Acceso al GenBank NM_000510), hormona \beta estimuladora del
tiroides (Nº de Acceso al GenBank NM_000549), prolactina (Nº de
Acceso al GenBank NM_000948), pro-opiomelanocortina
(Nº de Acceso al GenBank V01510), corticotropina (ACTH),
\beta-lipotropina, hormona estimuladora de los
\alpha-melanocitos (\alpha-MSH),
\gamma-lipotropina, \beta-MSH,
\beta-endorfina, y péptido del lóbulo intermedio
de tipo corticotropina (CLIP).
El término "hormona" incluye también el
Péptido 1 de tipo Glucagón (GLP-1) que es una
hormona gastrointestinal que regula la secreción de insulina que
pertenece al así denominado eje enteroinsular. La secuencia de
aminoácidos de GLP-1(7-36) y
GLP-1(7-37) es la (SEC DE ID
Nº: 34)
- \quad
- His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X
en la que X es NH_{2} para
GLP-1(7-36) y X es Gly para
GLP-1(7-37).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "factor de crecimiento" se usa
en el presente documento para describir cualquier proteína o
péptido que se une a un receptor para estimular la proliferación
celular. Los factores de crecimiento preferibles incluyen factor
\alpha de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF-\alpha) (Nº de Acceso al GenBank X03795),
PDGF-\beta (Nº de Acceso al GenBank X02811),
hormonas, factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Nº de Acceso al
GenBank NM_ 001963), factores de crecimiento de los fibroblastos
tales como factor 1 de crecimiento de los fibroblastos (FGF1) (Nº
de Acceso al GenBank NM_000800), FGF2 (Nº de Acceso al GenBank
NM_002006), FGF3 (Nº de Acceso al GenBank NM_005247), FGF4 (Nº de
Acceso al GenBank NM_002007), FGF5 (Nº de Acceso al GenBank
M37825), FGF6 (Nº de Acceso al GenBank X57075), FGF7 (Nº de Acceso
al GenBank NM_002009), FGF8 (Nº de Acceso al GenBank AH006649),
FGF9 (Nº de Acceso al GenBank NM_002010), FGF10 (Nº de Acceso al
GenBank AB002097), FGF11 (Nº de Acceso al GenBank NM_004112), FGF12
(Nº de Acceso al GenBank NM_021032), FGF13 (Nº de Acceso al GenBank
NM_004114), FGF14 (Nº de Acceso al GenBank NM_004115), FGF16 (Nº de
Acceso al GenBank AB009391), FGF17 (Nº de Acceso al GenBank
NM_003867), FGF18 (Nº de Acceso al GenBank AF075292), FGF19 (Nº de
Acceso al GenBank NM_005117), FGF20 (Nº de Acceso al GenBank
NM_019851), FGF21 (Nº de Acceso al GenBank NM_019113), FGF22 (Nº de
Acceso al GenBank NM_020637), y FGF23 (Nº de Acceso al GenBank
NM_020638), angiogenina (Nº de Acceso al GenBank M11567), factor
neurotrófico derivado de cerebro (Nº de Acceso al GenBank M61176),
factor de crecimiento neurotrófico ciliar (Nº de Acceso al GenBank
X60542), factor-\alpha de crecimiento
transformante (TGF-\alpha) (Nº de Acceso al
GenBank X70340), TGF\beta (Nº de Acceso al GenBank X02812),
factor-\alpha de crecimiento nervioso
(NGF-\alpha) (Nº de Acceso al GenBank NM_010915),
NGF-\beta (Nº de Acceso al GenBank X52599),
inhibidor de tejido de la metaloproteinasa 1 (TIMP1) (Nº de Acceso
al GenBank NM_003254), TIMP2 (Nº de Acceso al GenBank NM_003255),
TIMP3 (Nº de Acceso al GenBank U02571), TIMP4 (Nº de Acceso al
GenBank U76456) y estimulador 1 de macrófagos (Nº de Acceso al
GenBank L11924).
El término "proteína de la matriz" se usa
en el presente documento para describir las proteínas o péptidos
que se encuentran normalmente en la matriz extracelular. Estas
proteínas pueden ser funcionalmente importantes para la
resistencia, la filtración, o la adhesión. Las proteínas de la
matriz incluyen preferiblemente colágenos tales como colágeno I (Nº
de Acceso al GenBank Z74615), colágeno II (Nº de Acceso al GenBank
X16711), colágeno III (Nº de Acceso al GenBank X14420), colágeno IV
(Nº de Acceso al GenBank NM_001845), colágeno V (Nº de Acceso al
GenBank NM_000393), colágeno VI (Nº de Acceso al GenBank NM_058175),
colágeno VII (Nº de Acceso al GenBank L02870), colágeno VIII (Nº de
Acceso al GenBank NM_001850), colágeno IX (Nº de Acceso al GenBank
X54412), colágeno X (Nº de Acceso al GenBank X60382), colágeno XI
(nº de Acceso al GenBank. J04177), and colágeno XII (Nº de Acceso
al GenBank U73778), proteínas laminina tales como LAMA2 (Nº de
Acceso al GenBank NM_000426), LAMA3 (Nº de Acceso al GenBank
L34155), LAMA4 (Nº de Acceso al GenBank NM_002290), LAMB1 (Nº de
Acceso al GenBank NM_002291), LAMB3 (Nº de Acceso al GenBank
L25541), LAMC1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002293), nidogen (Nº de
Acceso al GenBank NM_002508), \alpha-tectorina (Nº
de Acceso al GenBank NM_005422), \beta-tectorina
(Nº de Acceso al GenBank NM_058222), y fibronectina (Nº de Acceso al
GenBank X02761).
El término "proteínas de la sangre" se
define tradicionalmente como aquellas que se originan en el plasma,
producidas muchas ahora comúnmente por medios recombinantes, e
incluyen, pero no se limitan a proteínas séricas naturales,
derivados, fragmentos y mutantes o sus variantes, factores de
coagulación de la sangre, derivados, mutantes, variantes y
fragmentos (que incluyen los factores VII, VIII, IX, X), inhibidores
de la proteasa (antitrombina, antitripsina alfa-1),
activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, inmunoglobulinas,
factor de von Willebrand y mutantes de von Willebrand, fibronectina,
fibrinógeno, trombina y hemoglobina.
El término "enzima" se usa en el presente
documentos para describir cualquier proteína o sustancia proteínica
que cataliza una reacción específica sin que ella misma quede
permanentemente alterada o destruida. Las enzimas incluyen
preferiblemente factores de coagulación tales como F2 (Nº de Acceso
al GenBank XM_170688), F7 (Nº de Acceso al GenBank XM_027508), F8
(Nº de Acceso al GenBank XM_013124), F9 (Nº de Acceso al GenBank
NM_000133), F10 (Nº de Acceso al GenBank AF503510) y otros,
metaloproteinasas de la matriz tales como la metaloproteinasa I de
la matriz I (Nº de Acceso al GenBank MMP1) (Nº de Acceso al GenBank
NM_002421), MMP2 (Nº de Acceso al GenBank NM_004530), MMP3 (Nº de
Acceso al GenBank NM_002422), MMP7 (Nº de Acceso al GenBank
NM_002423), MMP8 (Nº de Acceso al GenBank NM_002424), MMP9 (Nº de
Acceso al GenBank NM_004994), MMP10 (Nº de Acceso al GenBank
NM_002425), MMP12 (Nº de Acceso al GenBank NM_002426), MMP13 (Nº de
Acceso al GenBank X75308), MMP20 (Nº de Acceso al GenBank
NM_004771), adenosina desaminasa (Nº de Acceso al GenBank
NM_000022), proteína activadas por mitógeno tales como MAPK3 (Nº de
Acceso al GenBank XM_055766), MAP2K2 (Nº de Acceso al GenBank
N_030662), MAP2K1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002755), MAP2K4 (Nº
de Acceso al GenBank NM_003010), MAP2K7 (AF013588), y MAPK12
(NM_002969), quinasas tales como JNKK1 (Nº de Acceso al GenBank
U17743), JNKK2 (Nº de Acceso al GenBank AF014401), JAK1 (M64174),
JAK2 (NM_004972), y JAK3 (NM_000215), y fosfatasas tales como PPM1A
(Nº de Acceso al GenBank NM_021003) and PPM1D (Nº de Acceso al
GenBank NM_003620).
El término "factores de transcripción" se
usa en el presente documento para describir cualquier proteína o
péptido implicado en la transcripción de los genes que codifican la
proteína. Los factores de transcripción pueden incluir Sp1, Sp2 (Nº
de Acceso al GenBank NM_003110), Sp3 (Nº de Acceso al GenBank
AY070137), Sp4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003112) NFYB (Nº de
Acceso al GenBank NM_006166), Hap2 (Nº de Acceso al GenBank M59079),
GATA-1 (Nº de Acceso al GenBank NM_002049),
GATA-2 (Nº de Acceso al GenBank NM_002050),
GATA-3 (Nº de Acceso al GenBank X55122),
GATA-4 (Nº de Acceso al GenBank L34357),
GATA-5, GATA-6 (Nº de Acceso al
GenBank NM_005257), FOG2 (NM_012082), Eryfl (Nº de Acceso al
GenBank X17254), TRPS1 (Nº de Acceso al GenBank NM_014112),
NF-E2 (Nº de Acceso al GenBank NM_006163),
NF-E3, NF-E4, TFCP2 (Nº de Acceso al
GenBank NM_005653), Oct-1 (Nº de Acceso al GenBank
X13403), proteínas homeobox tales como HOXB2 (Nº de Acceso al
GenBank NM_002145), HOX2H (Nº de Acceso al GenBank X16665),
homólogo sin pelo (Nº de Acceso al GenBank NM_005144), proteínas
madre frente a decapentaplégicas tales como MADH1 (Nº de Acceso al
GenBank NM_005900), MADH2 (Nº de Acceso al GenBank NM_005901),
MADH3 (Nº de Acceso al GenBank NM_005902), MADH4 (Nº de Acceso al
GenBank NM_005359), MADH5 (Nº de Acceso al GenBank AF009678), MADH6
(Nº de Acceso al GenBank NM_005585), MADH7 (Nº de Acceso al GenBank
NM_005904), MADH9 (Nº de Acceso al GenBank NM_005905), y
transductor de la señal y activador de las proteínas de la
transcripción tales como STAT1 (Nº de Acceso al GenBank XM_010893),
STAT2 (Nº de Acceso al GenBank NM_005419), STAT3 (Nº de Acceso al
GenBank AJ012463), STAT4 (Nº de Acceso al GenBank NM_003151), STAT5
(Nº de Acceso al GenBank L41142), y STAT6 (Nº de Acceso al GenBank
NM_003153).
En otra realización adicional de la invención,
la molécula terapéutica es una proteína no humana o no de mamífero.
Por ejemplo, gp120 de VIH, Tat de VIH, se prefieren las proteínas
superficiales de otros virus tales como hepatitis, herpes, gripe,
adenovirus y RSV, otros componentes de VIH, proteínas superficiales
parasíticas tales como antígenos de la malaria, y proteínas
superficiales bacterianas. Se pueden usar estas proteínas no
humanas, por ejemplo, como antígenos, o debido a que tienen
actividades útiles. Por ejemplo, la molécula terapéutica puede ser
estreptoquinasa, estafiloquinasa, asparaginasa, u otras proteínas
con actividades enzimáticas útiles.
En una realización alternativa, la molécula
terapéutica es una proteína de unión a ligando con actividad
biológica. Tales proteínas de unión a ligando pueden, por ejemplo,
(1) bloquear las interacciones receptor-ligando en
la superficie celular; o (2) neutralizar la actividad biológica de
una molécula en la fase fluida de la sangre, evitando por tanto que
ésta no alcance a su diana celular. En algunas realizaciones, las
proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una
molécula de transferrina modificada fusionada a una región de unión
a ligando de un receptor seleccionado entre el grupo constituido
por, pero sin limitarse a, el receptor de una lipoproteína de baja
densidad (LDL), un receptor de LDL acetilado, un receptor del factor
\alpha de necrosis tumoral, un receptor del factor \beta de
crecimiento transformante, un receptor de la citocina, un receptor
de la inmunoglobulina Fc, un receptor de hormona, un receptor de
glucosa, un receptor de glicolípido, y un receptor de
glicosaminoglicano. En otras realizaciones, las proteínas de unión a
ligando incluyen CD2 (M14362), CD3G (NM_000073), CD3D (NM_000732),
CD3E (NM_000733), CD3Z (J04132), CD28 (NM_006139), CD4 (Nº de
Acceso al GenBank NM_000616), CD1A (Nº de Acceso al GenBank M28825),
CD1B (Nº de Acceso al GenBank NM_001764), CD1C (Nº de Acceso al
GenBank NM_001765), CD1D (Nº de Acceso al GenBank NM_001766), CD80
(Nº de Acceso al GenBank NM_005191), GNB3 (Nº de Acceso al GenBank
AF501884), CTLA-4 (Nº de Acceso al GenBank
NM_005214), moléculas de adhesión intercelular tales como
ICAM-1 (NM_ 000201), ICAM-2
(NM_000873), e ICAM-3 (NM_002162), receptores del
factor de necrosis tumoral tales como TNFRSF1A (Nº de Acceso al
GenBank X55313), TNFR1SFB (Nº de Acceso al GenBank NM_001066),
TNFRSF9 (Nº de Acceso al GenBank NM_001561), TNFRSF10B (Nº de Acceso
al GenBank NM_003842), TNFRSF11B (Nº de Acceso al GenBank
NM_002546), and TNFRSF13B (Nº de Acceso al GenBank NM_006573), y
receptores de interleucina tales como IL2RA (Nº de Acceso al
GenBank NM_000417), IL2RG (Nº de Acceso al GenBank NM_000206), IL4R
(Nº de Acceso al GenBank AF421855), IL7R (GenBank. Acc. No.
NM_002185), IL9R (Nº de Acceso al GenBank XM_015989), e IL13R (Nº
de Acceso al GenBank X95302). La proteína de fusión de unión al
ligando de la Tf de la presente invención muestra la actividad
biológica de la proteína de unión al ligando.
El término "proteínas asociadas a cáncer"
se usa en el presente documento para describir proteínas o
polipéptidos cuya expresión está asociada con cáncer o el
mantenimiento de crecimiento celular controlado, tal como las
proteínas codificadas por genes supresores del tumor u oncogenes.
Las proteínas asociadas a cáncer puede incluir p16 (Nº de Acceso al
GenBank AH005371), p53 (Nº de Acceso al GenBank NM_000546), p63 (Nº
de Acceso al GenBank NM_003722), p73 (Nº de Acceso al GenBank
NM_005427), BRCA1 (Nº de Acceso al GenBank U14680), BRCA2 (Nº de
Acceso al GenBank NM_000059), proteína interactuante CTBP (Nº de
Acceso al GenBank U72066), DMBT1 (Nº de Acceso al GenBank
NM_004406), HRAS (Nº de Acceso al GenBank NM_005343), NCYM (Nº de
Acceso al GenBank NM_006316), FGR (Nº de Acceso al GenBank
NM_005248), myb (Nº de Acceso al GenBank AF104863), rafl (Nº de
Acceso al GenBank NM_002880), erbB2 (Nº de Acceso al GenBank
NM_004448), VAV (Nº de Acceso al GenBank X16316),
c-fos (V Nº de Acceso al GenBank 01512),
c-fes (Nº de Acceso al GenBank X52192),
c-jun (Nº de Acceso al GenBank NM_002228), MAS1 (Nº
de Acceso al GenBank M13150), pim-1 (Nº de Acceso
al GenBank M16750), TIF1 (Nº de Acceso al GenBank NM_003852),
c-fms (Nº de Acceso al GenBank X03663), EGFR (Nº de
Acceso al GenBank NM_005228), erbA (Nº de Acceso al GenBank X04707),
tirosina quinasa c-src (Nº de Acceso al GenBank
XM_044659), c-abl (Nº de Acceso al GenBank M14752),
N-ras (Nº de Acceso al GenBank X02751),
K-ras (Nº de Acceso al GenBank M54968),
jun-B (Nº de Acceso al GenBank M29039),
c-myc (Nº de Acceso al GenBank AH001511), RB1 (Nº de
Acceso al GenBank M28419), DCC (Nº de Acceso al GenBank X76132),
APC (Nº de Acceso al GenBank NM_000038), NF1 (Nº de Acceso al
GenBank M89914), NF2 (Nº de Acceso al GenBank Y18000), and
bcl-2 (Nº de Acceso al GenBank M13994).
"Péptidos inhibidores fusogénicos" se usa
en el presente documento par describir los péptidos que muestran
actividad antivírica, competencia de función antimembrana, y/o una
capacidad para modular los procesos intracelulares, por ejemplo,
aquellos que implican estructuras superenrolladas de péptidos. La
actividad antivírica incluye, pero no se limita a, la inhibición de
VIH-1, VIH-2, VSR, SIV, VEB, virus
del sarampión, virus de la gripe, o la transmisión del CMV a
células no infectadas. Adicionalmente, la capacidad antifusogénica,
la actividad antivírica o la actividad moduladora intracelular de
los péptidos requiere meramente la presencia de los péptidos y no
requiere específicamente la estimulación de una respuesta inmune del
huésped dirigida contra dichos péptidos. Antifusogénico se refiere
a la capacidad del péptido para inhibir o reducir el nivel de los
episodios de fusión de la membrana entre dos o más restos en
relación con el nivel de fusión de la membrana que se produce entre
dichos restos en ausencia del péptido. Los restos pueden ser, por
ejemplo, membranas celulares o estructuras víricas, tales como
envolturas o pili víricos. El término "péptido antivírico",
como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del
péptido para inhibir la infección vírica de células o alguna
actividad vírica requerida para una infección vírica productiva y/o
la patogénesis vírica mediante, por ejemplo, fusión
célula-célula o infección de virus libre. Dicha
infección puede implicar la fusión de la membrana, como se produce
en el caso de los virus con envoltura, o algún otro episodio de
fusión que implique una estructura vírica y una estructura celular.
Los péptidos inhibidores fusogénicos y los péptidos antivíricos
tienen a menudo secuencias de aminoácidos que se derivan de más de
una proteína vírica (por ejemplo, un polipéptido derivado de
VIH-1, VIH-2, VSR, y SIV).
Se pueden encontrar ejemplos de péptidos
inhibidores fusogénicos y péptidos antivíricos en los documentos WO
94/2820, WO 96/19495, WO 96/40191, WO 01/64013 y en las patentes de
los Estados Unidos 6.333.395, 6.258.782, 6.228.983, 6.133.418,
6.093.794, 6.068.973, 6.060.065, 6.054.265, 6.020.459, 6.017.536,
6.013.263, 5.464.933,
5.346.989, 5.603.933, 5.656.480, 5.759.517, 6.245.737; 6.326.004, y 6.348.568; todas las cuales se incorporan por referencia en el presente documento. En una realización preferida, los péptidos antifusogénicos se seleccionan entre el grupo constituido por T-20 de VIH (FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY, SEC DE ID NO: 4), T-1249 de VIH, T786 de VSR (VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV, SEC DE ID Nº: 5), T1584 de VSR AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL, SEC DE ID Nº: 6) y T112 de VSR (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEC DE ID Nº: 7).
5.346.989, 5.603.933, 5.656.480, 5.759.517, 6.245.737; 6.326.004, y 6.348.568; todas las cuales se incorporan por referencia en el presente documento. En una realización preferida, los péptidos antifusogénicos se seleccionan entre el grupo constituido por T-20 de VIH (FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY, SEC DE ID NO: 4), T-1249 de VIH, T786 de VSR (VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV, SEC DE ID Nº: 5), T1584 de VSR AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL, SEC DE ID Nº: 6) y T112 de VSR (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEC DE ID Nº: 7).
Los ejemplos de otros tipos de péptidos,
incluyen fragmentos de proteínas terapéuticas como se describe en
el presente documento, en particular, los fragmentos de proteínas
humanas que retienen al menos una actividad de la molécula
parental. Los péptidos que se pueden usar para producir las
proteínas de fusión de la Tf modificada de la invención, incluye
también péptidos miméticos y péptidos que presentan una actividad
biológica de una proteína terapéutica pero difieren en la secuencia
o en la estructura tridimensional de una proteína terapéutica de
longitud completa. Como un ejemplo no limitado, los péptidos
incluyen los péptidos miméticos de eritropoyetina que se dan a
conocer en Johnson y col. (2000) Nephrol. Dial. Transplant
15(9): 1274-7, Kuai y col. (2000) J. Pept.
Res. 56(2): 59-62, Barbone y col. (1999)
Nephrol. Dial. Transplant. 14 Supp 2: 80-4,
Middleton y col. (1999) J. Biol. Chem. 274 (20):
14163-9, Johnson y col. (1998) Biochemistry 37 (11):
3699-710, Johnson y col. (1997) Chem. Biol. 12:
939-50, Wrighton y col. (1997) Nat. Biotechnol. 15
(12): 1261-5, Livnah y col. (1996) Science 273:
464-71, y Wrighton y col., (1996) Science 273:
458-64.
Las moléculas terapéuticas incluyen también
proteínas alérgenas y sus fragmentos digeridos. Éstas incluyen
alérgenos del polen de ambrosía, centeno, koeleria, dáctilo,
cerrillo, agróstide blanca, festuca roja, lengua de vaca, trigo,
maíz, artemisa, pasto azul, poa anual de California, bledo, grada
americana, caramillo, cedro de montaña, encina, arce negundo,
sicómoro, arce, olmo, etc., ácaros del polvo, veneno de abeja,
alérgenos alimentarios, ácaros del pelo de los animales, y otros
venenos de insectos.
Otras moléculas terapéuticas incluyen vacunas
microbianas, bacterianas y protozoarias y sus diversos componentes
tales como los antígenos superficiales. Estos incluyen vacunas que
contienen glicoproteínas, proteínas o péptidos derivados de estas
proteínas. Dichas vacunas se preparan a partir de Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus neumoniae, Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella spp., Shigella
spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Vibrio
cholera, Campylobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus
influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis,
Legionella neumophila, Tieponema pallidum, clamidia, toxoide
del tétanos, toxoide de la difteria, virus de la gripe, adenovirus,
paramixovirus (paperas, sarampión), virus de la rubeola, virus de
la polio, virus de la hepatitis, virus del herpes, virus de la
rabia, VIH-1, VIH-2, VSR, y virus
del papiloma.
Las moléculas de fusión preferidas pueden
contener péptidos víricos anti-VIH, péptidos
anti-VSR, hormona del crecimiento humana,
interferones \alpha y/o \beta, eritropoyetina (EPO), péptidos de
tipo EPO, factor de estimulación de las colonias de granulocitos
(GCSF), factor de estimulación de las colonias de
granulocitos-macrófagos (GMCSF), insulina, factor de
crecimiento de tipo insulina (IGF), trombopoyetina, péptidos que
corresponden a la CDR de un anticuerpo, Proteína Asociada a la
Neogénesis de los Islotes (INGAP), calcitonina, angiostatina,
endostatina, interleucina-2, factor de liberación de
la hormona del crecimiento, hormona paratiroidea humana, péptidos
del factor de necrosis antitumoral (TNF), receptor de la
interleucina-1 (IL-1) y/o
anticuerpos de cadena única.
Se pueden preparar también las proteínas de
fusión usadas en las bibliotecas de la invención que incluyen los
péptidos o polipéptidos derivados de las bibliotecas de péptidos
para rastrear moléculas con funciones nuevas o novedosas: Dichas
bibliotecas de péptidos pueden incluir los disponibles
comercialmente o públicamente, por ejemplo, American Peptide
Co. Inc., Cell Sciences Inc., Invitrogen Corporation, Phoenix
Pharmaceuticals Inc., United States Biological, así como los
producidos mediante las tecnologías disponibles, por ejemplo,
bibliotecas de presentación de bacteriófagos y bacterias preparadas
usando los procedimientos estandarizados.
En otras realizaciones adicionales de la
invención, se pueden preparar proteínas de fusión de la Tf usando
restos de proteínas terapéuticas conocidos en la técnica y
ejemplificados mediante los péptidos y proteínas actualmente
aprobados por la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos (Food
and Drug Administration)
(www.fda.gov/cber/
efoi/approve.htm) así como las Publicaciones de Patente PCT N^{os}. WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480.
efoi/approve.htm) así como las Publicaciones de Patente PCT N^{os}. WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480.
La Tabla 1 de la Publicación Internacional PCT
Nº WO 03/02746 proporciona una lista no exhaustiva de las proteínas
terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica
de una proteína de fusión de la transferrina modificada de la
invención. La columna "Proteína Terapéutica X" da a conocer las
moléculas de proteínas terapéuticas seguidas por paréntesis que
contienen los nombres científicos y comerciales que comprenden o
están constituidos alternativamente por esta molécula de proteína
terapéutica o uno de sus fragmentos o variantes. "Proteína
Terapéutica X" como se usa en el presente documento puede
referirse tanto a una molécula de proteína terapéutica individual
(como se define mediante la secuencia de aminoácidos obtenible de
los números de acceso del CAS y el GenBank), o al grupo completo de
proteínas terapéuticas asociadas con una molécula de proteína
terapéutica dada que se da a conocer en esta columna. La columna del
"Identificador a modo de Ejemplo" proporciona los números del
registro del Chemical Abstracts Services (CAS) (publicados por la
American Chemical Society) y/o los Números de Acceso al Genbank
(por ejemplo, ID del Locus, NP-XXXXX
(Secuencia de Referencia de la Proteína), y los identificadores
XP-XXXXX (Proteína Modelo) disponibles de la página
web del National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(www.ncbi.nlm.nih.gov), que corresponde a las entradas en el
Registro CAS o la base de datos del Genbank que contienen una
secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína o un fragmento
o variante de la molécula de la proteína terapéutica.
Adicionalmente, se proporcionan los números de Acceso del GenSeq y
el índice de citas bibliográficas de publicaciones para identificar
la secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de algunos
polipéptidos.
polipéptidos.
Están disponibles las páginas resumen asociadas
con cada uno de estos Números de Acceso a CAS y a Genbank y a
GenSeq así como el índice de citas bibliográficas de publicaciones
(por ejemplo, el número de ID de PubMed (PMID)). La columna
PCT/Referencia de Patente proporciona los números de Patente de los
Estados Unidos o los Números de las Publicaciones Internacionales
PCT que corresponden a las patentes y/o las solicitudes de patente
publicadas que describen la molécula de proteína terapéutica. La
columna de Actividad Biológica describe las actividades biológicas
asociadas con la molécula de proteína terapéutica. La columna de
Ensayo de Actividad a modo de Ejemplo proporciona las referencias
que describen los ensayos que se pueden usar para ensayar la
actividad terapéutica y/o biológica de una proteína terapéutica o
una proteína de fusión de la transferrina de la invención que
comprende una porción X de la proteína terapéutica. Estas
referencias se incorporan también por referencia en el presente
documento en su totalidad, La columna "Indicación Preferida Y"
describe las enfermedades, trastornos, y/o dolencias que se pueden
tratar, evitar, diagnosticar, o mejorar mediante la proteína
terapéutica X o una proteína de fusión de la transferrina de la
invención que comprende una porción de la proteína X
terapéutica.
Se pueden usar las proteínas de fusión de la
transferrina modificada como un vehículo para liberar una molécula
o molécula pequeña terapéutica complejada con el ión férrico de la
transferrina en el interior de una célula o a través de la barrera
hematoencefálica u otras barreras que incluyen el paso a través de
la membrana celular de cualquier tipo de célula que exprese un
receptor de Tf de forma natural o mediante construcción por
ingeniería genética. En estas realizaciones, la proteína de fusión
de la Tf se construirá normalmente mediante ingeniería genética o
se modificará para inhibir, evitar o eliminar la glicosilación para
prolongar la semivida en suero de la proteína de fusión y/o la
porción de la proteína terapéutica. Se contempla específicamente la
adición de un péptido director o, por ejemplo, un anticuerpo de
cadena única para dirigir adicionalmente la proteína de fusión de
la Tf hacia un tipo de célula concreto, por ejemplo, una
célula cancerosa.
En una realización, se introduce el complejo
férrico-sorbitol-citrato, fármaco
antianémico que contiene hierro en una proteína de fusión de la Tf
modificada de la invención. El complejo
férrico-sorbitol-citrato (FSC) ha
demostrado inhibir la proliferación de células cancerosas de murino
in vitro y produce la regresión del tumor in vivo, a
la vez que no tiene ningún efecto sobre la proliferación de células
no malignas (Poljak-Blazi y col. (Junio de 2000)
Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals (Estados Unidos), 15/3:
285-293).
En otra realización, el fármaco antineoplásico
Adriamycin® (Doxorubicina) y/o el fármaco quimioterapéutico
bleomicina, ambos conocidos por formar complejos con el ión férrico,
se introducen en una proteína de fusión de la Tf de la invención.
En otras realizaciones, se puede preparar y complejar una sal de un
fármaco, por ejemplo, un sal de citrato o carbonato, con el ión
férrico que se une a continuación a la Tf. Como las células
tumorales muestran a menudo una mayor velocidad de renovación del
hierro; la transferrina modificada para transportar al menos un
agente antitumoral, puede proporcionar un medio de aumentar la
exposición al agente o de introducirlo en las células tumorales.
(Demant, E.J, (1983) Eur. J. Biochem. 137/(1-2):
113-118; Padbury y col. (1985) J. Biol. Chem.
260/13: 7820-7823).
Se pueden administrar las proteínas de fusión
modificadas a un paciente necesitado de las mismas usando
protocolos de administración normalizados. Por ejemplo, se pueden
proporcionar las proteínas de fusión de la Tf modificada solas, o
en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes que
modulan un proceso patológico particular. Según se usa en el
presente documento, se dice que dos agentes se administran en
combinación cuando los dos agentes se administran simultáneamente o
se administran independientemente de una manera tal que los agentes
actuarán al mismo o casi al mismo tiempo.
Se pueden administrar los agentes mediante rutas
parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal, transdérmica y bucal. Por ejemplo, se puede
administrar un agente localmente en un lugar de la lesión mediante
microinfusión. Alternativa, o concurrentemente, la administración
puede ser no invasiva mediante cualquier ruta oral, por inhalación,
nasal, o pulmonar. La dosificación administrada será dependiente de
la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento
concurrente, si acaso, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza
del efecto deseado.
La presente solicitud describe también
composiciones que contienen uno o más trans-cuerpos
de la invención. Aunque las necesidades varían, la determinación de
los intervalos óptimos de las cantidades eficazs de cada componente
está comprendida dentro del conocimiento de la persona experta en la
técnica. Las dosificaciones usuales comprenden aproximadamente 1
pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las
dosificaciones preferidas para la administración sistémica
comprenden aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg de
peso corporal. Las dosificaciones preferidas para la administración
directa en un emplazamiento diana mediante microinfusión comprenden
aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal.
Cuando se administran mediante inyección directa o microinfusión,
se pueden construir mediante ingeniería genética las proteínas de
fusión modificadas para presentar unión reducida o ninguna del
hierro para evitar, en parte, la toxicidad localizada del
hierro.
Adicionalmente a la proteína de fusión
farmacológicamente activa, las composiciones pueden contener
vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden
excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los
compuestos activos en preparaciones que se pueden usar
farmacéuticamente para liberar en el lugar de la acción. Las
formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen
disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en
agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Adicionalmente, se
pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como
inyecciones de suspensiones oleosas apropiadas. Los disolventes o
vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo,
aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por
ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las inyecciones de
suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo,
carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente,
la suspensión puede contener también estabilizantes. Se pueden usar
también liposomas para encapsular el agente para la liberación en la
célula.
La formulación farmacéutica para administración
sistémica se puede formular para administración entérica,
parenteral o tópica. Por tanto, se pueden usar los tres tipos de
formulaciones simultáneamente para conseguir la administración
sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para
administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda,
píldoras, comprimidos, que incluyen comprimidos recubiertos,
elíxires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y sus formas de
liberación controlada.
En la práctica de los procedimientos de
tratamiento los agentes solos se pueden usar o en combinación, o en
combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En
algunas realizaciones preferidas, se pueden administrar
simultáneamente los compuestos descritos en el presente documento
junto con otros compuestos normalmente prescritos para estas
dolencias según la práctica médica generalmente aceptada. Se pueden
utilizar los compuestos in vivo, ordinariamente en
mamíferos, tales como seres humanos, ovejas, caballos, ganado,
cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, ex vivo o in
vitro.
Se pueden usar las proteínas de fusión
modificadas en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o
tratamiento de las enfermedades y/o trastornos relacionados con las
enfermedades y trastornos del sistema endocrino, el sistema
nervioso, el sistema inmune, el sistema respiratorio, el sistema
cardiovascular, el sistema reproductor, el sistema digestivo, las
enfermedades y/o trastornos relacionados con la proliferación
celular, y/o las enfermedades o trastornos relacionados con la
sangre.
En otras realizaciones adicionales, se pueden
usar las proteínas de fusión de la Tf modificada en el diagnóstico,
pronóstico, prevención y/o tratamiento de las enfermedades y/o
trastornos relacionados con las enfermedades y trastornos conocidos
por asociarse con o poderse tratar con restos de la proteína
terapéutica como se sabe en la técnica y se ejemplifica en las
Publicaciones de Patentes PCT N^{os} WO 01/79258, WO 01/77137, WO
01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480. Según esto, la
presente solicitud describe un procedimiento para tratar una
enfermedad o trastorno relacionado en la columna "Indicación
Preferida Y" de la Tabla 1 del documento WO 03/020746 que
comprende la administración a un paciente en el que se desea dicho
tratamiento, prevención o mejora mediante una proteína de fusión de
la transferrina modificada que comprende una porción de proteína
terapéutica que corresponde a una proteína terapéutica que se da a
conocer en la columna "Proteína Terapéutica X" de la Tabla 1
en una cantidad eficaz para tratar, evitar, o mejorar la enfermedad
o el trastorno.
En algunas realizaciones, se puede usar una
proteína de fusión de la transferrina para diagnosticar y/o
pronosticar las enfermedades y/o trastornos.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento,
prevención, diagnóstico y/o pronóstico de las enfermedades,
trastornos, y/o dolencias del sistema inmune. Además, se pueden usar
las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina como un marcador o detector
de una enfermedad o trastorno concreto del sistema inmune.
En una realización preferida, las proteínas de
fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de la
transferrina modificada se usarían como un agente para estimular la
inmunosensibilidad entre individuos inmunodeficientes. En
realizaciones específicas, las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina se usarían como un agente para estimular la
inmunosensibilidad entre las células B y/o las células T de
individuos inmunodeficientes.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento,
prevención, diagnóstico, y/o pronóstico de las enfermedades
autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de un
reconocimiento inapropiado del material propio como extraño por las
células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado
una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido del
huésped. Por tanto, la administración de proteínas de fusión y/o
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina, que pueden inhibir una respuesta inmune,
particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de
las células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de los
trastornos autoinmunes.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento,
prevención, pronóstico, y/o diagnóstico de las enfermedades,
trastornos, y/o dolencias de las células hematopoyéticas. Las
proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían
para aumentar la diferenciación y la proliferación de las células
hematopoyéticas, que incluyen las células troncales pluripotentes,
en un esfuerzo de tratar o evitar las enfermedades, trastornos y/o
dolencias asociadas con una disminución en algunos (o muchos) tipos
de células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a,
leucopenia, neutropenia, anemia, y trombocitopenia.
Alternativamente, las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se usarían para aumentar la diferenciación
y la proliferación de las células hematopoyéticas, incluyendo las
células troncales pluripotentes, en un esfuerzo de tratar o evitar
las enfermedades, trastornos, y/o dolencias asociadas con un
aumento en algunos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas,
incluyendo, pero sin limitarse a, histiocitosis.
Se pueden tratar, evitar, diagnosticar y/o
pronosticar también las reacciones y dolencias alérgicas, tales
como asma (concretamente asma alérgico) u otros problemas
respiratorios y usar las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina. Además, se pueden usar estas moléculas para tratar,
evitar, pronosticar, y/o diagnosticar la anafilaxis,
hipersensibilidad a una molécula antigénica, o la incompatibilidad
del grupo sanguíneo.
Adicionalmente, se pueden usar Las proteínas de
fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina, para tratar, evitar,
diagnosticar y/o pronosticar las reacciones alérgicas mediadas por
IgE. Dichas reacciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a,
asma, rinitis, y eczema. En las realizaciones específicas, se
pueden usar las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina para modular
las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.
Además, las proteínas de fusión modificadas y/o
los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina tienen usos en el diagnóstico, pronóstico, prevención,
y/o tratamiento de las dolencias inflamatorias. Por ejemplo, debido
a que las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que codifican
las proteínas de fusión de la transferrina pueden inhibir la
activación, proliferación, y/o la diferenciación de las células
implicadas en una respuesta inflamatoria, se pueden usar estas
moléculas para evitar y/o tratar las dolencias inflamatorias
crónicas y agudas. Dichas dolencias inflamatorias incluyen, pero no
se limitan a, por ejemplo, la inflamación asociada con infección
(por ejemplo, choque sépticos, sepsis, o síndrome sistémico
de respuesta inflamatoria), lesión por reperfusión tras isquemia,
letalidad de la endotoxina, rechazo hiperagudo mediado por el
complemento, nefritis, lesión de pulmón inducida por citocina o
quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de
Crohn, sobreproducción de citocinas (por ejemplo, TNF o
IL-1), trastornos respiratorios (por
ejemplo, asma y alergia); trastornos gastrointestinales (por
ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino); cánceres
(por ejemplo, gástrico, de ovario, de pulmón, de vejiga, de
hígado, y de mama); trastornos del SNC (por ejemplo,
esclerosis múltiple, lesión isquémica de cerebro y/o apoplejía,
lesión traumática de cerebro); trastornos neurodegenerativos
(por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de
Alzheimer); (demencia relacionada con SIDA y enfermedad priónica);
trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis,
miocarditis, enfermedad cardiovascular, y complicaciones por
derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades,
dolencias, y trastornos adicionales que se caracterizan por
inflamación (por ejemplo, hepatitis, artritis reumatoide,
gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión de
reperfusión tras isquemia renal, enfermedad de Grave, lupus
sistémico eritematoso, diabetes mellitus, y rechazo alogénico al
trasplante).
Debido a que la inflamación es un mecanismo de
defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar
virtualmente cualquier tejido del cuerpo. Según esto, Las proteínas
de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina tienen usos en el tratamiento
de trastornos inflamatorios específicos de tejido, que incluyen,
pero no se limitan a, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis,
apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis,
celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, colitis,
conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis,
endocarditis, esofagitis, eustachitis, fibrositis, foliculitis,
gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatoesplenitis,
queratitis, laberintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis
media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miositis,
miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis,
pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis,
poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis,
salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis,
espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis,
tendonitis, tonsilitis, uretritis, y vaginitis.
En realizaciones específicas, las proteínas de
fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina son útiles para diagnosticar,
pronosticar, evitar, y/o tratar los rechazos al trasplante de
órganos y la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Se produce
el rechazo del órgano por la destrucción de las células inmunes del
huésped del tejido trasplantado a través de una respuesta inmune.
Similarmente, está también implicada una respuesta inmune en GVHD,
pero, en este caso, las células inmunes trasplantadas extrañas
destruyen los tejidos del huésped. Los polipéptidos, anticuerpos, o
polinucleótidos, y/o sus agonistas o antagonistas, que inhiben una
respuesta inmune, particularmente la activación, proliferación,
diferenciación, o quimiotaxis de las células T, pueden ser una
terapia eficaz en la prevención del rechazo al órgano o GVHD.
En otra realización específica, las proteínas de
fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usaron como
un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antivíricas: las
respuestas inmunes antivíricas que se pueden potenciar usando la
composiciones descritas en el presente documento como un adyuvante,
incluyen enfermedades o síntomas víricos y asociados a virus
descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la
técnica. En realizaciones específicas, se usaron la composiciones
como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus,
enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo constituido por
SIDA, meningitis, Dengue, VEB, y hepatitis (por ejemplo,
hepatitis B). En otra realización específica, se usaron las
composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune
a un virus, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo
constituido por: VIH/SIDA, virus respiratorio sincitial; Dengue,
rotavirus, encefalitis japonesa B, gripe A y B, virus paragripal,
sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chicungunya, Fiebre del
Valle del Rift, herpes simple, y fiebre amarilla.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina, pueden usarse también como un adyuvante
para potenciar respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas.
Las respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas que se pueden
potenciar usando la composiciones descritas en el presente
documento como un adyuvante incluyen las enfermedades o síntomas de
bacterias u hongos y las asociadas a bacterias u hongos descritas
en el presente documento o conocidas de otra manera en la técnica.
En realizaciones específicas, se usaron las composiciones como un
adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una enfermedad o
síntoma por bacteria u hongo seleccionada entre el grupo constituido
por tétanos, difteria, botulismo, meningitis tipo B, y
candidiasis.
En otra realización específica, se usaron la
composiciones como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune
a una enfermedad o síntoma por bacteria u hongo seleccionadas entre
el grupo constituido por Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae,
Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis,
Streptococcus neumoniae, Streptococcus Grupo B, Shigella
spp., Escherichia coli Enterotoxigénica, E. coli
Enterohemorrágica, Borrelia burgdorferi, y
Candida.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar también como un adyuvante
para potenciar respuestas inmunes antiparasíticas. Las respuestas
inmunes antiparasíticas que se pueden potenciar usando las
composiciones como un adyuvante incluyen las enfermedades o
síntomas por parásitos o asociados a parásitos descritos en el
presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. Se
pueden usar también las composiciones descritas en el presente
documento como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un
parásito. Se pueden usar también las composiciones descritas en el
presente documento como un adyuvante para potenciar una respuesta
inmune a Plasmodium (malaria) o
Leishmania.
Leishmania.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden emplear también para tratar
enfermedades infecciosas que incluyen silicosis, sarcoidosis, y
fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, evitando el reclutamiento
y activación de los fagocitos mononucleares.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar también como un antígeno
para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar
respuestas inmunomediadas contra los polipéptidos de la
invención.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden administrar a un animal (por
ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdos, micro
cerdos, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato,
primate no humano, y ser humano, lo más preferible ser humano) para
estimular el sistema inmune para producir cantidades crecientes de
uno o más anticuerpos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, e IgE),
para inducir la producción de anticuerpos con mayor afinidad y el
cambio del tipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA,
IgN, e IgE, y para aumentar una respuesta inmune.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar en una o más de las
aplicaciones descritas en el presente documento, ya que se pueden
aplicar a la medicina veterinaria.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar como medio para bloquear
algunos aspectos de las respuestas inmunes a agentes extraños o
propios. Los ejemplos de enfermedades o dolencias en las que se
puede desear el bloqueo de algunos aspectos de las respuestas
inmunes incluyen trastornos autoinmunes tales como lupus, y
artritis, así como inmunosensibilidad a las alergias de la piel,
inflamación, enfermedad del intestino, lesión, y
enfermedades/trastornos asociados con patógenos.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para
evitar la proliferación de células B y la secreción de Ig asociada
con enfermedades autoinmunes tales como púrpura trombocitopénico
idiopático, lupus sistémico eritematoso y esclerosis múltiple.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar como un inhibidor de la
activación de las células B y/o T en las células endoteliales. Esta
actividad perturba la arquitectura del tejido o las respuestas
análogas y es útil, por ejemplo en la perturbación de las respuestas
inmunes, y el bloqueo de la sepsis.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para la
hipergammaglobulinemia crónica evidente en dichas enfermedades
tales como la gammopatía monoclonal de significancia indeterminada
(MGUS), la enfermedad de Waldenstrom, gammopatías monoclonales
idiopáticas relacionadas, y plasmacitomas.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden emplear por ejemplo para inhibir
la quimiotaxis de los polipéptidos y la activación de los
macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos,
linfocitos B, y algunos subconjuntos de células T, por ejemplo,
células T activadas y citotóxicas CD8, y las linfocitos citolíticos
naturales, en algunas enfermedades autoinmunes e inflamatorias
crónicas e infectivas. Se describen en el presente documento
enfermedades autoinmunes e incluyen la esclerosis múltiple, y la
diabetes dependiente de insulina.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden emplear también para tratar la
aterosclerosis, por ejemplo, evitando la infiltración de monocitos
en la pared de la arteria.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden emplear para tratar el síndrome
de dolor respiratorio en adultos (ARDS).
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles para estimular la
reparación de heridas y tejidos, estimular la angiogénesis, y/o
estimular la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o
linfáticos. Adicionalmente, las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina se pueden usar para estimular la regeneración de
superficies mucosales.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para diagnosticar,
pronosticar, tratar, y/o evitar un trastorno caracterizado por
inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción de
inmunoglobulina en suero deficiente, infecciones recurrentes, y/o
disfunción del sistema inmune. Además Las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para tratar o evitar
infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glándulas
parótidas, infecciones transmitidas por sangre (por ejemplo,
sepsis, meningitis, artritis séptica, y/u osteomielitis),
enfermedades autoinmunes (por ejemplo, las que se dan a
conocer en el presente documento), trastornos inflamatorios, y
neoplasias malignas, y/o cualquier enfermedad o trastorno o
dolencia asociadas con estas infecciones, enfermedades, trastornos
y/o neoplasias malignas) incluyendo, pero sin limitarse a,
Inmunodeficiencia variable Común (CVID), otras inmunodeficiencias
primarias, enfermedad por VIH, Leucemia Linfocítica Crónica (CLL),
bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis,
neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zoster (por ejemplo,
herpes zoster grave), y/o neumocistis carinii. Otras enfermedades y
trastornos que se pueden evitar, diagnosticar, pronosticar, y/o
tratar con las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero
no se limitan a, infección por VIH, infección por
HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción
bactericida de los fagocitos, trombocitopenia, y hemoglobinuria.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para diagnosticar,
pronosticar, evitar, y/o tratar cánceres o neoplasmas que incluyen
cánceres o neoplasmas de células inmunes o relacionados con tejido
inmune. Los ejemplos de cánceres o neoplasmas que se pueden evitar,
diagnosticar, o tratar mediante las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena
aguda, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no
de Hodgkin, leucemia Linfocítica aguda (ALL), leucemia Linfocítica
crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt,
enfermedades transformadas por VEB, y/o las enfermedades y los
trastornos descritos en la sección titulada "Trastornos
Hiperproliferativos" en otra parte en el presente documento.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar como una terapia para
disminuir la proliferación celular de los Linfomas de células B
grandes.
Las composiciones descritas en el presente
documento se pueden usar como un agente para estimular la
inmunosensibilidad entre los individuos inmunodeficientes en células
B, tales como, por ejemplo, un individuo que experimenta una
esplenectomía parcial o completa.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para modular la actividad
hemostática (la detención del sangrado) o trombolítica (disolución
del coágulo). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o
trombolítica, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se usarían
para tratar o evitar las enfermedades, trastornos, y/o dolencias de
coagulación de la sangre (por ejemplo, afibrinogenemia,
deficiencias de factores, hemofilia), las enfermedades, trastornos,
y/o dolencias de las plaquetas de la sangre (por ejemplo,
trombocitopenia), o las heridas resultantes de trauma, cirugía, u
otras causas. Alternativamente, las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina, que pueden disminuir la actividad hemostática o
trombolítica se usarían para inhibir o disolver los coágulos. Estas
moléculas serían importantes en el tratamiento o prevención de los
ataques al corazón (infartos), las apoplejías, o la
cicatrización.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para evitar, diagnosticar,
pronosticar, y/o tratar la trombosis, trombosis arterial, trombosis
venosa, tromboembolismo, embolismo pulmonar, aterosclerosis, infarto
de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. Las
proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar
para la prevención de la oclusión de los injertos de la safena,
para reducir el riesgo de la trombosis periprocedural que puede
acompañar a los procedimientos de angioplastia, para reducir el
riesgo de apoplejía en pacientes con fibrilación atrial que incluye
fibrilación atrial no reumática, para reducir el riesgo de embolismo
asociado a válvulas cardíacas mecánicas y/o enfermedad de las
válvulas mitrales. Otros usos para las proteínas de fusión de la
transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina, incluyen, pero no se
limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos
extracorpóreos (por ejemplo, canales intravasculares, vías de
acceso en pacientes de hemodiálisis, equipos de hemodiálisis, y
equipos de derivación cardiopulmonar).
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para evitar, diagnosticar,
pronosticar, y/o tratar las enfermedades y trastornos de la sangre
y/o los órganos que forman la sangre asociados con el(los)
tejido(s) en los que el polipéptido se expresa.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para modular la actividad
hematopoyética (la formación de células de la sangre). Por ejemplo,
las proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos
que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden
usar para aumentar la cantidad de todas o los subconjuntos de
células de la sangre, tal como, por ejemplo, los eritrocitos,
linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo,
basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastocíticas,
macrófagos) y las plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad
de células de la sangre o de los subconjuntos de células de la
sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico, y/o
tratamiento de las anemias y las leucopenias descritas a
continuación. Alternativamente, las proteínas de fusión de la
transferrina modificada y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para disminuir
la cantidad de todas o de los subconjuntos de células de la sangre,
tales como, por ejemplo, los eritrocitos, linfocitos (células B o
T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos,
neutrófilos, células mastocíticas, macrófagos) y las plaquetas. La
capacidad para disminuir la cantidad de células de la sangre o de
los subconjuntos de células de la sangre puede ser útil en la
prevención, detección, diagnóstico, y/o tratamiento de la
leucocitosis, tal como, por ejemplo, la eosinofilia. Las proteínas
y/o los polinucleótidos de fusión modificados que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar para evitar,
tratar, o diagnosticar la discrasia de las células de la sangre.
Las anemias son dolencias en las que el número
de glóbulos rojos de la sangre o la cantidad de hemoglobina (la
proteína que transporta el oxígeno) en la misma está por debajo de
lo normal. Se puede producir la anemia por sangrado excesivo,
disminución de la producción de glóbulos rojos de la sangre, o
aumento en la destrucción de glóbulos rojos de la sangre
(hemolisis). Las proteínas de fusión de la transferrina modificada
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o
diagnóstico de las anemias. Las anemias que se pueden tratar, evitar
o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o
los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen anemia por deficiencia de hierro, anemia
hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica
hereditaria, anemia sideroblástica idiopática adquirida, aplasia de
glóbulos rojos, anemia megaloblástica (por ejemplo, anemia
perniciosa, (deficiencia de vitamina B12, y anemia por deficiencia
de ácido fólico), anemia aplásica, anemias hemolíticas (por
ejemplo, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica
microangiopática, y hemoglobinuria nocturna paroxística). Las
proteínas de fusión de la transferrina modificada y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o
diagnóstico de las anemias asociadas con las enfermedades que
incluyen, pero no se limitan a, anemias asociadas con lupus
sistémico eritematoso, cánceres, linfomas, enfermedad renal
crónica, y bazo aumentado. Las proteínas de fusión de la
transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina puede ser útiles en el tratamiento,
prevención, y/o diagnóstico de la anemia que se produce a partir de
tratamientos con fármacos tales como las anemias asociadas con
metildopa, dapsona, y/o sulfafármacos. Adicionalmente, las
proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden ser
útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de las
anemias asociadas con arquitectura anormal de los glóbulos rojos que
incluye, pero no se limita a, esferocitosis hereditaria,
eliptocitosis hereditaria, deficiencia de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
anemia de células falciformes.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles en el tratamiento,
prevención, y/o diagnóstico de anormalidades de la hemoglobina (por
ejemplo, las asociadas con anemia de células falciformes, enfermedad
de la hemoglobina C, enfermedad de la hemoglobina
S-C, y enfermedad de la hemoglobina E.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la transferrina y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina pueden ser útiles en el diagnóstico, prevención, y/o
pronóstico en el tratamiento de talasemias, que incluyen, pero no se
limitan a, formas mayores y menores de
alfa-talasemia y beta-talasemia.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles en el diagnóstico,
pronóstico, prevención, y/o tratamiento de los trastornos de
sangrado que incluyen, pero no se limitan a, trombocitopenia (por
ejemplo, púrpura trombocitopénico idiopático, y púrpura
trombocitopénico trombótico), enfermedad de Von Willebrand,
trastornos plaquetarios hereditarios (por ejemplo, la
enfermedad por defecto en el compartimento de depósito tal como los
síndromes de Chediak-Higashi y
Hermansky-Pudlak, disfunción del tromboxano A2,
tromboastenia, y síndrome de Bernard-Soulier),
síndrome hemoliticurémico, hemofilias tales como hemofilia A o
deficiencia del Factor V11 y enfermedad de Navidad o deficiencia
del Factor IX, Telangiectsia Hemorrágica hereditaria, conocida
también como Síndrome de
Rendu-Osler-Webe, púrpura alérgico
(púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular
diseminada.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles como un agente para
aumentar la producción de citocina.
Las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos
que codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden
usar para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, que
incluyen neoplasmas. Las proteínas de fusión de la transferrina y/o
los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina pueden ser útiles pueden inhibir la proliferación del
trastorno a través de interacciones directas o indirectas.
Alternativamente, las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos
que codifican las proteínas de fusión de la transferrina pueden
producir la proliferación de otras células que pueden inhibir el
trastorno hiperproliferativo.
Por ejemplo, se pueden tratar los trastornos
hiperproliferativos aumentando una respuesta inmune,
particularmente, aumentando las calidades antigénicas del trastorno
hiperproliferativo o proliferando, diferenciando, o movilizando las
células T. se puede aumentar esta respuesta inmune, tanto
potenciando una respuesta inmune existente, como iniciando una
nueva respuesta inmune. Alternativamente, disminuir una respuesta
inmune puede ser también un procedimiento para tratar trastornos
hiperproliferativos tales como un agente quimioterapéutico.
Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos
que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a neoplasma
localizado en el colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo,
hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal,
paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo,
cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema
linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax, y tracto
urogenital.
Similarmente, se pueden tratar o detectar otros
trastornos hiperproliferativos mediante las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina. Los ejemplos de dichos trastornos
hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a Leucemia
Linfoblástica Aguda Infantil; Leucemia Linfoblástica Aguda,
Leucemia Linfocítica Aguda, Leucemia Mieloide Aguda, Carcinoma
Adrenocortical; Cáncer Hepatocelular en Adultos (Primario), Cáncer
de Hígado en Adultos (Primario), Leucemia Linfocítica Aguda en
Adultos, Leucemia Mieloide Aguda en Adultos; Enfermedad de Hodgkin
en Adultos, Linfoma de Hodgkin en Adultos, Leucemia Linfocítica en
Adultos, Linfoma no de Hodgkin en Adultos, Cáncer Primario de Hígado
en Adultos, Sarcoma del Tejido Blando en Adultos, Linfoma
Relacionado con SIDA, Neoplasias Malignas relacionadas con SIDA,
Cáncer Anal, Astrocitoma, Cáncer de los Conductos biliares, Cáncer
de Vejiga, Cáncer de Hueso, Glioma de Tronco Cerebral, Tumores
Cerebrales, Cáncer de Mama, Cáncer de la Pelvis Renal y el Uréter,
Linfoma del Sistema Nervioso Central (Primario), Linfoma del
Sistema Nervioso Central, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma
Cerebral, Cáncer Cervical, Cáncer Hepatocelular Infantil
(Primario), Cáncer de Hígado Infantil (Primario), Leucemia
Linfoblástica Aguda Infantil, Leucemia Mieloide Aguda Infantil,
Glioma de Tronco Cerebral Infantil, Astrocitoma Cerebelar Infantil;
Astrocitoma Cerebral Infantil, Tumores Extracraneales de las Células
Germinales Infantiles, Enfermedad de Hodgkin Infantil, Linfoma de
Hodgkin Infantil, Glioma Hipotalámico y de la Ruta Visual Infantil,
Leucemia Linfoblástico Infantil, Meduloblastoma Infantil; Linfoma
No de Hodgkin Infantil, Tumores Neuroectodérmico Primitivo
Supratentorial y Pineal Infantiles, Cáncer Primario de Hígado
Infantil, Rabdomiosarcoma Infantil, Sarcoma del Tejido Blando
Infantil, Glioma Hipotalámico y de la Ruta Visual, Leucemia
Linfocítica Crónica, Leucemia Mielógena Crónica, Cáncer de Colon,
Linfoma Cutáneo de Células T, Carcinoma Endocrino de las Células de
los Islotes del Páncreas, Cáncer Endometrial, Ependimoma, Cáncer
Epitelial, Cáncer Esofágico, Sarcoma de Ewing y Tumores
Relacionados, Cáncer Pancreático Exocrino, Tumor Extracraneal de
Células Germinales, Tumor Extragonadal de Células Germinales,
Cáncer Extrahepático de los Conductos Biliares, Cáncer de ojo,
Cáncer de Mama Femenino, Enfermedad de Gaucher, Cáncer de Vesícula
Biliar, Cáncer gástrico, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumores
Gastrointestinales, Tumores de Células Germinales, Tumor
Trofoblástico gestacional, Leucemia de Células Pilosas, Cancer de
Cabeza y Cuello, Cáncer Hepatocelular, Enfermedad de Hodgkin,
Linfoma de Hodgkin, Hipergammaglobulinemia, Cáncer de Hipofaringe,
Cánceres Intestinales, Melanoma Intraocular, Carcinoma de las
Células de los Islotes, Cáncer pancreático de la Células de los
Islotes, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñón, cáncer de Laringe,
Cáncer de Labios y de la Cavidad Oral, Cáncer de Hígado, Cáncer de
Pulmón, Trastornos Linfoproliferativos, Macroglobulinemia, Cáncer
de Pecho masculino, Mesotelioma Maligno, Timoma Maligno,
Meduloblastomia, Melanoma, Mesotelioma, Cáncer Escamoso Metastásico
del Cuello con Tumor Primario Oculto, Cáncer Escamoso Metastásico
del Cuello con Tumor Primario, Cáncer Escamoso Metastásico del
Cuello, Mieloma Múltiple, Neoplasma de Células Plasmáticas/Mieloma
Múltiple, Síndrome Mielodisplásico, Leucemia Mielógena, Leucemia
Mieloide, Trastornos Mieloproliferativos, Cáncer de la Cavidad
Nasal y del Seno Paranasal, Cáncer de Nasofaringe, Neuroblastoma,
Linfoma No de Hodgkin Durante el Embarazo, Cáncer de Piel Sin
melanoma, Cáncer de Pulmón de Células No Pequeñas, Cáncer Escamoso
Metastásico del Cuello con Tumor Primario Oculto, Cáncer de
Orofaringe, Osteosarcoma Fibroso Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma
Fibroso Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno del
hueso, Cáncer Epitelial de Ovario, Tumor de Células germinales de
Ovario, Tumor de Ovario con Bajo Potencial Maligno, Cáncer de
Páncreas, Paraproteinemias, Púrpura, Cáncer de Paratiroides, Cáncer
de Pene, Feocromocitoma, Tumor de la Pituitaria, Neoplasma de
Células Plasmáticas/Mieloma Múltiple, Linfoma Primario del Sistema
nervioso Central; Cáncer Primario de hígado, Cáncer de Próstata,
Cancer Rectal, Cáncer de Células Renales, Cáncer de pelvis Renal y
Uréter, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de Glándulas
Salivares, Sarcomas, Sarcoidosis, Síndrome de Sezary, Cáncer de
piel, Cáncer de pulmón de Células Pequeñas, Cáncer de Intestino
delgado, Sarcoma del Tejido Blando, Cáncer Escamoso del Cuello,
Cáncer de Estómago, Tumores Neuroectodérmico Primitivo
Supratentorial y Pineal, Linfoma de Células T, Cáncer de testículos,
Timoma, Cáncer de Tiroides, Cáncer de Células de Transición de
Pelvis Renal y Uréter, Cáncer de Transición de Pelvis Renal y
Uréter, tumores Trofoblásticos, Cáncer de Células de Uréter y Pelvis
Renal, Cáncer de Uretra, Cáncer de Útero, Sarcoma de Útero, Cáncer
de vagina, Glioma de la Ruta Visual e Hipotalámico; Cáncer de Vulva;
Macroglobulinemia de Waldenstron; Tumor de Wilm, y cualquier otra
enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia localizada en u
sistema de órgano relacionado anteriormente.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina, se pueden usar para diagnosticar,
pronosticar, evitar, y/o tratar dolencias premalignas y para evitar
la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo, pero sin
limitarse a, los trastornos descritos anteriormente. Se indican
dichos usos en las dolencias conocidas o sospechosas de preceder a
la progresión de neoplasia o cáncer, en concreto, cuando el
crecimiento de células no neoplásicas está constituido por
hiperplasia, metaplasia, o más concretamente, se ha producido
displasia (para una revisión de dichas dolencias de crecimiento
anormal véase Robbins. y Angell, 1976, Basic Pathology, 2^{a} Ed.
W. B. Saunders Co., Filadelfia, pp. 68-79).
Hiperplasia es una forma de proliferación
celular controlada, que implica un aumento en el número de células
en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura
o función. Los trastornos hiperplásicos que se pueden diagnosticar,
pronosticar, evitar, y/o tratar con las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia del nódulo
linfático mediastinal angiofolicular, hiperplasia angiolinfoide con
eosinofilia, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de
células basales, hiperplasia aguda de nódulo linfático gigante,
hiperplasia del cemento, hiperplasia adrenal congénita, hiperplasia
sebácea congénita, hiperplasia cística, hiperplasia cística de la
mama, hiperplasia de la dentadura, hiperplasia ductal, hiperplasia
endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial
focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria,
hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar
intravascular, hiperplasia nodular de la próstata, hiperplasia
nodular regenerativa, hiperplasia psudoepiteliomatosa, hiperplasia
sebácea senil, e hiperplasia verrucosa.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina conjugados con una toxina o un isótopo
radioactivo, según se describe en el presente documento, se pueden
usar para tratar cánceres y neoplasmas, que incluyen, pero no se
limitan a, los descritos en el presente documento. Las proteínas de
fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina conjugados con una toxina o
un isótopo radioactivo, según se describe en el presente documento,
se pueden usar también para tratar la leucemia mielógena aguda.
Adicionalmente, las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden afectar la apoptosis, y por tanto,
serían útiles en el tratamiento de numerosas enfermedades asociadas
con un aumento en la supervivencia celular o la inhibición de la
apoptosis. Por ejemplo, las enfermedades asociadas con un aumento
en la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se
podrían diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar por los
polinucleótidos, polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas según
se describe en el presente documento, incluyen cánceres (tales como
linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, y tumores
dependientes de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer
de colon, tumores cardíacos, cáncer de páncreas, melanoma,
Retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de
intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago, neuroblastoma,
mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma,
Osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de
próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos
autoinmunes tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren,
tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet,
enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso y
glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide) e
infecciones víricas (tales como los virus del herpes, poxvirus y
adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped,
rechazo agudo al injerto, y rechazo crónico al injerto.
Las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina se pueden usar para inhibir el crecimiento, la
progresión, y/o la metástasis de los cánceres, en concreto, los
relacionados anteriormente.
Las enfermedades o dolencias adicionales
asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podrían
diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar mediante las proteínas
de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan
a progresión y/o metástasis de trastornos malignos y relacionados
tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo.,
leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye
mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y
eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia
mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica
crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de
Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple,
macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, y
tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y
carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, fiposarcoma,
condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma,
endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma,
sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma,
rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de
mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células
escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma
de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma
papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico,
carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células
renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares,
coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilm,
cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de
pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma
epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma,
ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico,
oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y
retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con un aumento de la
apoptosis que se podrían diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o
tratar mediante las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina, incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos (tal como
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis
lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebral,
tumor cerebral o enfermedad asociada a priones); trastornos
autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogre,
tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet,
enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso, y
glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis reumatoide),
síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad
de injerto contra huésped Y, lesión isquémica (tal como la
producida por infarto de miocardio, apoplejía y lesión por
reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, lesión de hígado
relacionada con hepatitis, lesión tras isquemia/reperfusión,
colestosis (lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado),
enfermedad del hígado inducida por toxina (tal como la producida por
alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.
Los polinucleótidos que codifican las proteínas
de fusión de la transferrina se pueden usar también para inhibir la
división celular aberrante, mediante terapia génica, y/o las
proteínas de fusión o sus fragmentos.
Los polinucleótidos descritos en el presente
documento se pueden liberar directamente en los emplazamientos de
la enfermedad proliferativa celular desordenada, en órganos
internos, cavidades corporales, y similares mediante el uso de
dispositivos de formación de imagen usados para guiar una aguja de
inyección directamente en el emplazamiento de la enfermedad, Se
pueden administrar también los polinucleótidos en el emplazamiento
de la enfermedad en el momento de la intervención quirúrgica.
Por enfermedad proliferativa celular se entiende
se entiende cualquier enfermedad o trastorno humano o animal, que
afecta uno cualquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades,
o partes corporales, que se caracteriza por proliferaciones
anormales locales únicas o múltiples de células, grupos de células,
o tejidos, tanto benignas como malignas.
Se puede administrar cualquier cantidad de
polinucleótidos siempre que tengan un efecto de inhibir
biológicamente la proliferación de las células tratadas.
Además, es posible administrar más de uno de los
polinucleótidos simultáneamente en el mismo sitio. Por "inhibir
biológicamente" se entiende la inhibición del crecimiento parcial
o total así como las disminuciones en la velocidad de proliferación
o el crecimiento de las células.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina son útiles en la inhibición de la
metástasis de las células o los tejidos proliferativos. Se puede
producir la inhibición como resultado directo de administrar estas
proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos, o
indirectamente, tal como activando la expresión de las proteínas
conocidas por inhibir la metástasis, por ejemplo, las alfa
integrinas (véase, por ejemplo, Curr. Top. Mirobiol. Immunol. 1998;
231: 1 41). Se pueden conseguir dichos efectos terapéuticos de la
presente invención tanto solo como en combinación con pequeñas
moléculas de fármacos o adyuvantes.
La presente solicitud describe también un
procedimiento para liberar las composiciones que contienen las
proteínas de fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina en células
diana que expresan un polipéptido unido por, que se une a, o
asociado con una proteína de fusión de la transferrina modificada.
Se pueden asociar las proteínas de fusión de la transferrina con
polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o
profármacos mediante interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas
y/o covalentes.
Las enfermedades del riñón que se pueden
diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o tratar con la composiciones
descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a,
insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica,
insuficiencia renal ateroembólica enfermedad renal terminal,
enfermedades inflamatorias del riñón (por ejemplo,
glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis post infecciosa,
glomerulonefritis rápidamente progresiva, síndrome nefrítico,
glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrítico familiar,
glomerulonefritis proliferativa de membrana y glomerulonefritis
mesangial proliferativa, glomerulonefritis crónica, nefritis aguda
túbulointersticial, nefritis tubulointersticial crónica,
glomerulonefritis aguda post estreptocócica (PSGN), pielonefritis,
nefritis por lupus, nefritis crónica, nefritis intersticial,
glomerulonefritis post estreptocócica), trastornos de los vasos
sanguíneos de los riñones (por ejemplo, infarto de riñón, enfermedad
ateroembólica de riñón, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna,
trombosis de la vena renal, perfusión renal, retinopatía renal,
reperfusión renal tras isquemia, embolismo de las arteria renal y
estenosis de la arteria renal), trastornos del riñón como resultado
de enfermedad del tracto urinario (por ejemplo., pielonefritis,
hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis),
nefropatía de reflujo, infecciones del tracto urinario, retención
urinaria, y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica).
Adicionalmente, las composiciones descritas en el presente
documento se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, evitar, y/o
tratar trastornos metabólicos y congénitos del riñón (por ejemplo,
uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular
renal, glicosuria renal, diabetes nefrogénica insípida, cistinuria,
síndrome de Fanconi, osteosis fibrocística renal (raquitismo
renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de
Liddle, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular,
riñón medular en esponja, síndrome de Alport, síndrome de
nail-patella, síndrome nefrítico congénito, síndrome
de aplastamiento, riñón en herradura, nefropatía diabética,
diabetes nefrogénica insípida, nefropatía analgésica, piedras en el
riñón, y nefropatía membranosa), y enfermedades autoinmunes del
riñón (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso (SLE), síndrome de
Goodpasture, nefropatía por IgA, y glomerulonefritis mesangial
proliferativa según la CIPM).
Se pueden usar también las composiciones
descritas en el presente documento para diagnosticar, pronosticar,
evitar, y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón
(por ejemplo, glomeruloesclerosis, nefropatía diabética,
glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSFyG), glomerulonefritis
narcotizante y necrosis papilar renal), cánceres del riñón (por
ejemplo, nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células
renales, cáncer de células transicionales, adenocarcinoma renal,
cáncer de células escamosas, y tumor de Wilm), y desequilibrio de
electrolitos (por ejemplo, nefrocalcinosis, piuria, edema,
hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipernatremia,
hipocalemia, hipercalemia, hipocalcemia, hipercalcemia,
hipofosfatemia, e hiperfosfatemia).
Se pueden administrar las composiciones
descritas en el presente documento usando cualquier procedimiento
conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección
de aguja directa en el emplazamiento de liberación, inyección
intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores
biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos tipo esponja de
espuma de gel, otros materiales de depósito comercialmente
disponibles, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas
orales o en forma de supositorio, aplicaciones para decantación o
tópicas durante la cirugía, administración en aerosol. Se conocen
dichos procedimientos en la técnica. Se pueden administrar las
composiciones descritas en el presente documento como parte de una
terapéutica, descrita con más detalle a continuación.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina, se pueden usar para tratar, evitar,
diagnosticar, y/o pronosticar trastornos cardiovasculares,
incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de las arterias
periféricas, tales como isquemia límbica.
Los trastornos cardiovasculares incluyen, pero
no se limitan a, anormalidades cardiovasculares, tales como fístula
arterio arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones
arteriovenosas cerebrales, defectos congénitos del corazón, atresia
pulmonar y Síndrome de la Cimitarra.
Los defectos congénitos del corazón incluyen,
pero no se limitan a, coartación aórtica, cor triatriatum,
anomalías de los vasos coronarios, corazón en criss cross,
dextrocardia, ductus arterioso permeable, anomalía de Ebstein,
complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo
hipoplástico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de
los grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia
tricuspídea, tronco arterioso persistente, defectos septales del
corazón, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de
almohadillas endocárdicas, síndrome de Lutembacher, trilogía de
Fallot, defectos septales ventriculares del corazón.
Los trastornos cardiovasculares incluyen
también, pero no se limitan a, cardiopatía, tal como, arritmias,
enfermedad carcinoide del corazón, gasto cardíaco elevado, gasto
cardiaco bajo, tamponada cardiaca, endocarditis (que incluye
bacterias), aneurisma de corazón, parada cardiaca, insuficiencia
congestiva cardíaca, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxística,
edema cardiaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva,
hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha,
ruptura cardiaca después de infarto, ruptura ventricular septal,
enfermedades de las válvulas cardiacas, enfermedades miocardiales,
isquemia de miocardio, efusión pericardial, pericarditis (que
incluye constrictiva y tuberculosa), mesotelioma primario del
pericardio, síndrome después de pericardiotomía, cardiopatía
pulmonar, cardiopatía reumática, disfunción ventricular, hiperemia,
complicaciones cardiovasculares del embarazo, Síndrome de la
Cimitarra, sífilis cardiovascular, y tuberculosis
cardiovascular.
Las arritmias incluyen, pero no se limitan a,
arritmia del seno, fibrilación atrial, flutter atrial, bradicardia,
extrasístole, Síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de
rama, síndrome de QT largo, parasístole, Síndrome de
Lown-Ganong-Levine, síndrome de
preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de
Wolff-Parkinson-White, síndrome de
seno enfermo, taquicardias, y fibrilación ventricular. Las
taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia
supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia por
reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica,
taquicardia ectópica de la unión, taquicardia por reentrada nodal
senoatrial, taquicardia del seno, taquicardia ventricular en
entorchado, y taquicardia ventricular.
Las enfermedades de las válvulas cardiacas
incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia de la válvula
aórtica, estenosis de la válvula aórtica, murmullos cardíacos,
prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral,
prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula
mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar,
insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula
pulmonar, atresia de tricúspide, insuficiencia de la válvula
tricúspide, y estenosis de la válvula tricúspide.
Las enfermedades miocardiales incluyen, pero no
se limitan a, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva,
cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica,
estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva,
cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis endocardial, fibrosis
endomiocardial, Síndrome de Kearns, lesión por reperfusión de
miocardio, y miocarditis.
Las isquemias miocardiales incluyen, pero no se
limitan a, enfermedad coronaria, tal como angina de pecho, aneurisma
coronario, arterioesclerosis coronaria, trombosis coronaria,
vasoespasmo coronario, infarto de miocardio, y miocardio
aturdido.
Las enfermedades cardiovasculares incluyen
también enfermedades vasculares tales como aneurismas,
angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, Enfermedad de
Hippel-Lindau, Síndrome de Klippel Trenaunay Weber,
Síndrome de Sturge Weber, edema angioneurótico, enfermedades
aórticas, Arteritis de Takayasu, aortitis, Síndrome de Leriche,
enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis,
poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías
diabéticas, retinopatía diabética, embolismos, trombosis,
eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno oclusiva hepática,
hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares
periféricas, flebitis, enfermedad veno oclusiva hepática,
enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena
retinal, síndrome de la Cimitarra, síndrome de la vena cava
superior, telangiectasia, ataxia telangiectasia, telangiectasia
hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, vasculitis, e
insuficiencia venosa.
Los trastornos cerebrovasculares incluyen, pero
no se limitan a, enfermedades cardioarteriales sino que incluye
trastornos respiratorios. Las proteínas de fusión de la transferrina
de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas
de fusión de la transferrina de la invención se pueden usar para
tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar las enfermedades y/o
trastornos del sistema respiratorio.
Las enfermedades y trastornos del sistema
respiratorio incluyen, pero no se limitan a, vestibulitis nasal,
rinitis no alérgica (por ejemplo, rinitis aguda, rinitis
crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotora), pólipos nasales, y
sinusitis, angiofibromas juveniles, cáncer de la nariz y papilomas
juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos, nódulos de los
cantantes, úlceras de contacto, parálisis de las cuerdas vocales,
laringoceles, faringitis (por ejemplo, vírica y bacteriana),
tonsilitis, celulitis tonsilar, acceso para faríngeo, laringitis,
laringoceles, y cánceres de garganta (por ejemplo, cáncer de
la nasofaringe, cáncer de amígdala, cáncer de laringe), cáncer de
pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas,
carcinoma de células pequeñas (célula pequeña), carcinoma de
células grandes, y adenocarcinoma, trastornos alérgicos (neumonía
eosinófila, neumonitis por hipersensibilidad (por ejemplo,
alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica,
neumoconiosis orgánica producida por polvo, aspergiliosis
broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener (vasculitis
granulomatosa), síndrome de Goodpasture), neumonía (por
ejemplo, neumonía bacteriana (por ejemplo, Streptococcus
pneumoniae (neumonía neumocócica), Staphylococcus aureus
(neumonía estafilocócica), neumonía por bacterias Gram negativas
(producidas por, por ejemplo, Klebsiella y
Pseudomonas spp.), neumonía por Mycoplasma pneumoniae,
neumonía por Hemophilus influenzae; Legionella pneumophila
(enfermedad del Legionario, y Chlamydia psittaci
(Psitacosis)), y neumonía vírica (por ejemplo, gripe,
varicela (varicela).
Las enfermedades y trastornos adicionales del
sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a bronquiolitis,
polio (poliomelitis), croup, infección vírica respiratoria
sincitial, paperas, eritema infecciosos (la quinta enfermedad),
roséola infantil, panencefalitis progresiva por rubeola, sarampión
alemán, panencefalitis esclerosante subaguda), neumonía fúngica
(por ejemplo, Histoplasmosis, Coccidiomicosis, Blastomicosis,
infecciones fúngicas en personas con sistemas inmunes gravemente
suprimidos (por ejemplo, criptococosis, producida por
Cryptococcus neoformans; aspergiliosis, producida por
Aspergillus spp.), candidiasis, producida por Candida; y
mucormicosis)), Pneumocystis acrinii (neumonía por
neumocistis), neumonías atípicas (por ejemplo,
Mycoplasma y Chlamydia spp.), neumonía por infección
oportunista, neumonía nosocomial, neumonitis química, y neumonía por
aspiración, trastornos pleurales (por ejemplo, pleuresía,
derrame pleural, y neumotórax, (por ejemplo, neumotórax
espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax por
tensión), enfermedades obstructivas de las vías aéreas (por
ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPID),
enfisema, bronquitis aguda o crónica), enfermedades laborales del
pulmón (por ejemplo, silicosis, pulmón negro (neumoconiosis
de los mineros del carbón, asbestosis, beriliosis, asma laboral y
bisiniosis), Enfermedad Infiltrativa Pulmonar (por ejemplo,
fibrosis pulmonar (por ejemplo, pneumonía intersticial
usual), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía interticial
descamativa, neumonía intersticial linfoide (por ejemplo,
enfermedad de Letterer-Siwe, enfermedad de
Hand-Schüller-Christian, granuloma
eosinófilo, hemosiderosis pulmonar idiopática sarcoidosis y
proteinosis alveolar pulmonar), síndrome de dolor respiratorio
agudo (denominado también, por ejemplo, síndrome de dolor
respiratorio en adultos), edema, embolismo pulmonar, bronquitis
(por ejemplo, vírica, bacteriana), bronquiectasis,
atelectasis, abscesos del pulmón (producidos por, por ejemplo,
Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila), y
fibrosis quística.
Los cánceres que se pueden tratar con las
proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan
tumores sólidos , que incluyen de próstata, pulmón, mama, ovario,
estómago, páncreas, laringe, esófago, hígado, parótida, tracto
biliar, colon, rectos, cerviz, útero, endometrio, riñón, vejiga,
cáncer de tiroides; tumores y metástasis; melanomas; glioblastoma;
sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no
pequeñas; cáncer colorrectal; neoplasias malignas avanzadas;
tumores hemáticos tales como leucemia. Por ejemplo, las proteínas de
fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden liberar tópicamente, con el fin
de tratar cánceres tales como el cáncer de piel, los tumores de
cabeza y cuello, y el sarcoma de Kaposi.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden ser útiles, en el tratamiento de
otros trastornos, además de cánceres, que implican la angiogénesis.
Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos,
por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas,
tracomas, y granulomas piógenos; placas ateroescleróticas;
enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía
diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo
al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental,
rubeosis, retinoblastoma, uveítis, y crecimiento anormal de los
vasos sanguíneos del ojo por Pterigio; artritis reumatoide;
soriasis, cicatrización retardada de la herida; endometriosis;
vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas
(queloides); fracturas sin unión; escleroderma; tracoma; adhesiones
vasculares; angiogénesis miocardial; coronarias secundarias;
cerebrales secundarias; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis
límbica isquémica; Síndrome de Osler-Webber;
neovascularización de la placa; telangiectasia, articulaciones en
hemofílicos; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de
la herida; enfermedad de Chron; y
aterosclerosis.
aterosclerosis.
Adicionalmente, los trastornos que se pueden
tratar con las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen, pero no se limitan a, hemangioma, artritis,
soriasis, angiofibroma, placas ateroescleróticas, cicatrización
retardada de la herida, granulaciones, articulaciones en
hemofílicos, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome
de Osler-Weber, granuloma piógeno, escleroderma,
tracoma; y adhesiones vasculares.
Además, los trastornos y/o estados que se pueden
tratar, evitar, diagnosticar, y/o pronosticar con las proteínas de
fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero
no se limitan a, tumores sólidos, tumores hemáticos tales como
leucemia, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos,
por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas,
tracomas, y granulomas piógenos, artritis reumatoide, soriasis,
enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía
diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo
al injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia
retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveítis, cicatrización
retardada de la herida, endometriosis, vasculogénesis,
granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides, fracturas sin
unión, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis
miocardial, coronarias secundarias, cerebrales secundarias,
malformaciones arteriovenosas, angiogénesis límbica isquémica,
Síndrome de Osler-Webber, neovascularización de la
placa, telangiectasia, articulaciones en hemofílicos, angiofibroma,
displasia fibromuscular, granulación de la herida, enfermedad de
Chron, ateroesclerosis, agente que controla el nacimiento evitando
la vascularización requerida por el embrión, implante de control de
la menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como
consecuencia patológica tal como enfermedad por arañazo de gato
(Rochele nunalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori),
Bartonelosis y angiomatosis bacular.
En un aspecto del procedimiento de control del
embarazo, se administra una cantidad del compuesto suficiente para
controlar el implante del embrión antes o después que se haya
producido el coito y la fertilización, proporcionando de esta
manera un procedimiento efectivo de control del embarazo,
posiblemente un procedimiento del "día después". Las proteínas
de fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar
también en el control de la menstruación o administrarse tanto como
fluido de lavado peritoneal o como implante peritoneal en el
tratamiento de la endometriosis.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden utilizar en una amplia variedad
de procedimientos quirúrgicos.
\newpage
Las enfermedades asociadas con un aumento de la
supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se
podrían tratar, evitar, diagnosticar, y/o inhibir usando las
proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen
cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con
mutaciones, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen, pero
no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer de
páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón,
cáncer de intestino, cáncer de testículos, cáncer de estómago,
neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma,
osteoclastoma, Osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama,
cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario);
trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, síndrome
de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de
Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus sistémico
eritematoso t glomerulonefritis inmunorelacionada y artritis
reumatoide) e infecciones víricas (tales como virus del herpes,
virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de
injerto contra huésped, rechazo agudo al injerto, y rechazo crónico
al injerto.
Las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina se pueden usar para inhibir el crecimiento, la
progresión, y/o la metástasis de los cánceres, en particular, los
relacionados anteriormente.
Las enfermedades o dolencias adicionales
asociadas con un aumento de la supervivencia celular que se podría
tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas y/los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen, pero no se limitan a la progresión y/o la
metástasis de las neoplasias malignas y los trastornos relacionados
tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo,
leucemia aguda linfocítica, leucemia aguda mielocítica (que incluye
mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y
eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia
mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica
crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de
Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple,
macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesad, y
tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y
carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma,
condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma,
endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, linfoangioendoteliosarcoma,
sinovioma, mesotelioma, tumores de Ewing, leiomiosarcoma,
rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de
mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células
escamosas, carcinoma de célula basales, adenocarcinoma, carcinoma
de glándula sudorípara, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma
papilar, adenocarcinomas papilares, adenocarcinoma quístico,
carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células
renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares,
coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilm,
cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de Jung, carcinoma de
pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma
epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma,
ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico,
oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y
retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con aumento de la
apoptosis que se podrían tratar, evitar, diagnosticar, y/o
pronosticar usando las proteínas de fusión modificadas y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina, incluyen, pero no se limitan a, SIDA; trastornos
neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad
de Parkinson, Esclerosis lateral amiotrófica, Retinitis pigmentosa,
Degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada a
priones); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple,
síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, quimosis biliar,
enfermedad de Behcet, enfermedad de Chron, polimiositis, lupus
sistémico eritematoso, y glomerulonefritis inmunorelacionada y
artritis reumatoide), Síndromes mielodisplásicos (tales como anemia
aplásica), enfermedad de injerto contra huésped, lesión isquémica
(tal como la producida por infarto de miocardio, apoplejía y lesión
por reperfusión), lesión de hígado (por ejemplo, de hígado
relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión,
colestosis/lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado);
enfermedad del hígado inducida por toxinas (tal como la producida
por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.
Adicionalmente, las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se podrían usar para tratar o evitar el
comienzo de la diabetes mellitus, En pacientes recientemente
diagnosticados con los tipos I y II de diabetes, en los que
permanece alguna función celular de los islotes, las proteínas de
fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión
de la transferrina, se podrían usar para mantener la función de los
islotes para de esta manera, aliviar, retrasar o evitar la
manifestación permanente de la enfermedad. También, las proteínas de
fusión y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se podrían usar como un auxiliar en el
trasplante de las células de islotes para mejorar o promover la
función celular de los islotes.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para el diagnóstico y/o el
tratamiento de las enfermedades, trastornos, daños o lesiones del
cerebro y/o el sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso
que se pueden tratar con la composiciones descritas en el presente
documento (por ejemplo, las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina, limitados al sistema nervioso incluyen, pero no se
limita a, las lesiones y enfermedades o los trastornos que dan como
resultado una desconexión de los axones, una disminución o
degeneración de las neuronas, como la desmielinización. Las lesiones
del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (que
incluyen pacientes mamíferos humanos y no humanos), incluyen, pero
no se limitan a, las siguientes lesiones tanto de los s nervioso
central (incluyendo la médula espinal, el cerebro) como del
periférico: (i) lesiones isquémicas, en las que una ausencia de
oxígeno en una porción del sistema nervioso da como resultado una
lesión o muerte neuronal, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o
infarto o isquemia de la médula espinal, (2) lesiones traumáticas,
que incluyen la lesiones producidas por lesión física o asociada
con cirugía, por ejemplo, lesiones que dañan una parte del sistema
nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las
que se destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por tejido
maligno que es tanto un carcinoma asociado al sistema nervioso como
un carcinoma derivado del tejido del sistema nervioso, (4) lesiones
infecciosas en las que se destruye o lesiona una parte del sistema
nervioso, como resultado de la infección, por ejemplo, mediante un
absceso o asociado con infección por el virus de la
inmunodeficiencia, herpes zoster o el virus del herpes simple, o con
la enfermedad de Lyme, tuberculosis, o sífilis, (5) lesiones
degenerativas, en las que se destruye o lesiona una parte del
sistema nervioso como resultado de un proceso degenerativo que
incluye, pero no se limita a, degeneración asociada con la
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de
Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ALS); (6) lesiones
asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales, en las que se
destruye o lesiona una parte del sistema nervioso por un trastorno
nutricional o trastorno del metabolismo que incluye, pero no se
limita a, deficiencia de vitamina B 12, deficiencia de ácido
fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía producida por
tabaco-alcohol, enfermedad de
Marchiafava-Blanami (degeneración primaria del
cuerpo calloso), y degeneración cerebral alcohólica; (7) lesiones
neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas que incluyen,
pero no se limitan a diabetes (neuropatía diabética, parálisis de
Bell), lupus sistémico eritematoso, carcinoma, o sarcoidoisis; (8)
lesiones producidas por sustancias tóxicas que incluyen, alcohol,
plomo, o en particular, neurotoxinas; y (9) lesiones
desmielinizadas en las que se destruye o lesiona una parte del
sistema nervioso por una enfermedad desmielinizante que incluye,
pero no se limita a, esclerosis múltiple, mielopatía asociada con
virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa o
diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva, y
mielinosis central pontina.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para proteger células
neurales de los efectos de daños de la hipoxia. Las proteínas de
fusión de la transferrina modificada y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar
también para proteger las células neurales de los efectos del daño
de la hipoxia cerebral.
Los trastornos de las neuronas motoras que se
pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, trastornos tales como
infarto, infección, exposición a toxinas, trauma, daño quirúrgico,
enfermedad degenerativa o neoplasia maligna que puede afectar a las
neuronas motoras así como a otros componentes del sistema nervioso,
así como trastornos que afectan selectivamente las neuronas tales
como esclerosis lateral amiotrófica, y que incluyen, pero no se
limitan a, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar
progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil
y juvenil, parálisis bulbar progresiva infantil (síndrome de
Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome de post
poli, y Neuropatía Sensora Motora Hereditaria (Enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth).
Adicionalmente, las proteínas de fusión
modificadas y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden jugar un papel en la supervivencia
neuronal; formación de la sinapsis; conductancia; diferenciación
neural, etc. De esta manera, las composiciones descritas en el
presente documento (que incluyen las proteínas de fusión y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina) se pueden usar para diagnosticar y/o tratar o evitar
las enfermedades o trastornos asociados con estos papeles,
incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos del aprendizaje y/o
cognitivos. Las composiciones pueden ser también útiles en el
tratamiento o la prevención de los estados de enfermedad
neurodegenerativos y/o los trastornos del comportamiento. Dichos
estados de enfermedad neurodegenerativos y/o los trastornos del
comportamiento incluyen, pero no se limitan a, Enfermedad de
Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Huntington,
síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia,
trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de pánico, discapacidades
del aprendizaje, ALS, sicosis, autismo, y comportamientos alterados,
que incluyen trastornos en la alimentación, modelos de sueño,
equilibrio, y percepción.
Los ejemplos de enfermedades neurológicas que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen, enfermedades cerebrales, tales como
enfermedades cerebrales metabólicas que incluyen fenilcetonuria, tal
como fenilcetonuria materna, deficiencia de piruvato carboxilasa,
deficiencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa,
Encefalopatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales
tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas
infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como
neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas hipotalámicos, neoplasmas
supratentoriales, enfermedad de Canavan, enfermedades cerebelares
tales como ataxia cerebelar que incluye degeneración
espinocerebelar tal como ataxia telangiectasia, disinergia
cerebelar, Ataxia de Friederich, Enfermedad de
Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar,
neoplasmos cerebelares tales como neoplasmos infratentoriales,
esclerosis cerebral difusa tal como encefalitis periaxialis,
leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y
panencefalitis esclerosante aguda.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como
enfermedades de la arteria carótida que incluyen trombosis de la
arteria carótida, estenosis de la carótida y Enfermedad de
Moyamoya), angiopatía cerebral amiloide, aneurisma cerebral, anoxia
cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas
cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolismo
cerebral y trombosis tal como trombosis de la arteria carótida,
trombosis del seno y Síndrome de Wallenger, hemorragia cerebral tal
como hematoma epidérmico, hematoma subdural, y hemorragia
subaracnoide, infarto cerebral, isquemia cerebral tal como isquemia
cerebral transitoria, síndrome de Robo de la Subclavia e
insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular tal como demencia
multi-infarto, leucomalacia periventricular, dolor
de cabeza vascular tal como dolor de cabeza en racimo y migraña.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican la proteínas de fusión de la
transferrina incluyen demencia tal como Demencia Compleja por SIDA,
demencia presenil, tal como Enfermedad de Alzheimer, y Síndrome de
Creutzfeldt-Jakob, demencia senil tal como
Enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear progresiva,
demencia vascular tal como demencia multi-infarto,
encefalitis que incluye encefalitis periaxial, encefalitis vírica,
encefalitis epidémica, Encefalitis Japonesa, Encefalitis de San
Luis, encefalitis transmitida por garrapatas y Fiebre Del Nilo
Occidental, encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis
tal como síndrome uveomeningoencefalítico, Enfermedad de Parkinson
Postencefálica, y panencefalitis esclerosante subaguda,
encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsia
tal como epilepsia generalizada, que incluye espasmos infantiles,
epilepsia por ausencia, epilepsia mioclónica que incluye Síndrome
de MERRF, epilepsia tónica-clónica, epilepsia
parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia de lóbulo
frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia
post-traumática, estado epiléptico tal como
Epilepsia Parcial Continua, y Síndrome de
Hallervorden-Spatz.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen hidrocéfalo tal como Síndrome de
Dandy-Walker e hidrocéfalo con presión normal,
enfermedades hipotalámicas tales como neoplasmas hipotalámicos,
malaria cerebral, narcolepsia que incluye catalexia, poliomelitis
bulbar, seudotumor cerebral, Síndrome de Rett, Síndrome de Reye,
enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma
intracraneal y Síndrome de Zellweger, infecciones del sistema
nervioso central tales como SIDA, Demencia compleja, Absceso
Cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tal como
Encefalomielitis Equina, Encefalomielitis Equina de Venezuela,
Encefalomielitis Hemorrágica Necrotizante, Visna, y malaria
cerebral.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen meningitis tal como aracnoiditis, meningitis
aséptica tal como meningitis vírica que incluye meningitis
linfocítica crónica, meningitis bacterianas, que incluyen
Meningitis por Haemophilus, Meningitis por Listera, Meningitis
Meningocócica tal como Síndrome de
Waterhouse-Friedericlisen, Meningitis Pneumocócica,
y tuberculosis meningeal, meningitis fúngica tal como meningitis
Criptocócica, derrame subdural, meningoencefalitis, mielitis tal
como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsal,
poliomelitis que incluye poliomielitis bulbar, y síndrome post
poliomielitis, enfermedades priónicas (tales como Síndrome de
Creutzfeldt-Jakob, Encefalitis Espongiforme Bovina,
Síndrome de Gertsmann-Straussler, Kuru, Scrapie), y
toxoplasmosis cerebral.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se
pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas
y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina incluyen neoplasmas del sistema nervioso central tales
como neoplasmas cerebrales que incluyen neoplasmas cerebelares tales
como neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo
cerebral tales como neoplasmas del plexo coroide, neoplasmas
hipotalámicos y neoplasmas supratentoriales, neoplasmas meningeales,
neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales,
enfermedades desmielinizantes tales como las Enfermedades de
Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye
adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxial, leucodistrofia de
células globoides, esclerosis cerebral difusa tal como
leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica,
encefalomielitis hemorrágica Necrotizante, leucoencefalopatía
multifocal progresiva, en esclerosis múltiple, mielinosis pontina
central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, Scrapie;
Swayback, Síndrome de Fatiga Crónica, Visna, Síndrome Nervioso de
Presión Elevada, Meningismo, enfermedades de la médula espinal tales
como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia
muscular espinal tal como Enfermedad de
Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal,
neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales,
siringomielia, Tabes Dorsal, Síndrome de Stiff-Man,
retraso mental tal como Síndrome de Angelman, Síndrome del Maullido
del Gato, Sindrome de De Lange, Síndrome de Down, Gangliósidos
tales como Gangliósidos G (MI), Enfermedad de Sandhoff, Enfermedad
de Tay-Sachs, Enfermedad de Hartnup, homocistunuria,
Síndrome de Laurence-Moon-Bied,
Síndrome de Lesch-Nylian, Enfermedad de la Orina
con Olor a Jarabe de Arce, mucolipidosis tal como fucosidosis,
lipofuscinosis ceroide neuronal, síndrome oculocerebrorenal,
fenilcetonuria tal como fenilcetonuria materna, Síndrome de
Prader-Willi, Síndrome de Rett, Síndrome de
Rubinstein-Taybi, esclerosis Tuberosa, Sindrome de
WAGR, amormalidades del sistema nervioso tales como
haloprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia
que incluye hidrangencefalia, deformidad de
Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele,
meningomielocele, disrafismo espinal tal como Espina bífida cística
y espina bífida oculta.
El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las
enfermedades por desequilibrio de hormonas abarcan trastornos de la
motilidad uterina que incluyen, pero no se limitan a complicaciones
con el embarazo y el trabajo (por ejemplo, trabajo
pre-término, embarazo pre-término,
aborto espontáneo, y trabajo lento o parado); y los trastornos y/o
enfermedades del ciclo menstrual (por ejemplo, dismenorrea y
endometriosis).
El sistema endocrino y/o los trastornos y/o las
enfermedades por desequilibrio de hormonas incluyen trastornos y/o
enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes
mellitus, diabetes insípida, agenesis pancreática congénita,
Feocromocitoma, síndrome tumoral de las células de los islotes;
trastornos y/o enfermedades de las glándulas adrenales tales como,
por ejemplo, Enfermedad de Addison, deficiencia de
corticoesteroides, enfermedad virilizante, hirsutismo, Síndrome de
Cushing, hiperaldosteronismo, Feocromocitoma; trastornos y/o
enfermedades de las glándulas pituitarias, tales como, por ejemplo,
hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanismo pituitario, adenoma
de la pituitaria, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo;
trastornos y/o enfermedades del tiroides, que incluyen, pero no se
limitan a, hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer,
Enfermedad de Graves (bocio tóxico difuso), bocio tóxico nodular,
tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa
subaguda y tiroiditis linfocítica silenciosa), síndrome de Pendred,
mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de la
hormona tiroidea, aplasia tímica, tumores de células de Hurthle del
tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides., Carcinoma
medular de tiroides; trastornos y/o enfermedades de la
paratiroides, tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo,
hipoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.
Adicionalmente, el sistema endocrino y/o los
trastornos y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas
pueden incluir los trastornos y/o las enfermedades de los testículos
o los ovarios, incluyendo cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades
de los testículos o los ovarios incluyen además, por ejemplo, cáncer
de ovario, síndrome de ovario poliquístico, síndrome de
Klinefelter, síndrome de testículos evanescentes, (anorquia
bilateral), ausencia congénita de células de Leydig,
criptorquidismo, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma
capilar testicular (benigno), neoplasias testiculares y
neotesticulares.
Además, el sistema endocrino y/o los trastornos
y/o las enfermedades por desequilibrio de hormonas pueden incluir
también trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo,
síndromes por deficiencia poliglandular, Feocromocitoma,
neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple, y trastornos y/o
cánceres de los tejidos endocrinos.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para el diagnóstico,
tratamiento, o prevención de las enfermedades y/o trastornos del
sistema reproductor. Los trastornos del sistema reproductor que se
pueden tratar mediante las composiciones de la invención incluyen,
pero no se limitan a, lesiones del sistema reproductor, infecciones,
trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y las enfermedades o
los trastornos infertilidad, complicaciones con el embarazo,
trabajo, o parto, y dificultades después del parto.
Los trastornos y/o las enfermedades del sistema
reproductor incluyen enfermedades y/o trastornos de los testículos,
que incluyen atrofia testicular, feminización testicular,
criptorquismo (unilateral y bilateral), anorquia, testículos
ectópicos, epididimitis y orquitis (resultado normalmente de
infecciones tales como, por ejemplo, gonorrea, paperas,
tuberculosis, y sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa,
tumores de las células germinales (por ejemplo, seminomas,
carcinomas de las células embrionales, teratocarcinomas,
coriocarcinomas, tumores del saco vitelino del testículo, y
teratomas), tumores estromales (por ejemplo, tumores de las
células de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele,
espermatocele, hernia inguinal, y trastornos de la producción
espermática (por ejemplo, síndrome de los cilios inmóviles,
espermia, astenozooespermia, azooespermia, oligoespermia, y
teratozooespermia).
Los trastornos del sistema reproductor incluyen
también trastornos de la glándula prostática, tales como
prostatitis no bacteriana aguda, prostatitis no bacteriana crónica,
prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica,
prostatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa,
malacoplakia, hipertrofia o hiperplasia prostática benigna, y
trastornos neoplásicos de la próstata, que incluyen adenocarcinomas,
carcinomas de células transicionales, carcinomas ductales, y
carcinomas de células escamosas.
Adicionalmente, las composiciones descritas en
el presente documento pueden ser útiles en el diagnóstico,
tratamiento y/o prevención de los trastornos o enfermedades del pene
y la uretra, que incluyen trastornos inflamatorios, tales como
balanopostitis, balanitis xerotica obliterans, fimosis, parafimosis,
sífilis, síndrome de Reites, condiloma acuminado, condiloma latum,
pápulas perladas del pene, anormalidades de la uretra, tales como
hipospadias, epispadias, y fimosis, lesiones premalignas, que
incluyen Eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, paplosis
Bowenoide, condiloma gigante inguinal de
Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrucoso, cánceres
de pene, que incluyen carcinomas de células escamosas, carcinoma
in situ, carcinoma verrucoso, y carcinoma diseminado del
pene; trastornos neoplásicos de la uretra, que incluyen carcinoma de
la uretra en el pene, carcinoma urotelial bulbomembranoso, y
carcinoma prostaticuretral; y trastornos eréctiles, tales como
priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunción eréctil, e
impotencia.
Además, las enfermedades y/o los trastornos de
los vasos deferentes incluyen vasculitis y CBAVD (ausencia
bilateral congénita de los vasos deferentes); adicionalmente, las
proteínas de fusión de la transferrina de la invención y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina de la invención, se pueden usar en el diagnóstico,
tratamiento, y/o prevención de enfermedades y trastornos de las
vesículas seminales, que incluyen enfermedad hidatídica,
cloridorrea congénita, y enfermedad del riñón poliquístico.
Otros trastornos y/o enfermedades del sistema
reproductor masculino incluyen, por ejemplo, síndrome de
Klinefelter, síndrome de Young, eyaculación prematura, diabetes
mellitus, fibrosis quística, síndrome de Kartagener, fiebre elevada,
esclerosis múltiple, y ginecomastia.
Adicionalmente, los polinucleótidos, las
proteínas de fusión modificadas y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina se pueden usar
en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las enfermedades
y/o trastornos de la vagina y la vulva, que incluyen vaginosis
bacteriana, vaginitis por candida, virus del herpes simple,
cancroide, granuloma inguinal, linfogranuloma venéreo, sarna, virus
del papiloma humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenosis,
vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas,
condiloma acuminado, sífilis, molluscum contagiosum, vaginitis
atrófica enfermedad de Paaet, liquen escleroso, liquen plano,
vulvodimia, síndrome del choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis,
vestibulitis vulvar, y trastornos neoplásicos, tales como
hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células claras,
carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de la glándula de
Bartolino, y neoplasia y neoplasia intraepitelial vulvar.
Los trastornos y/o las enfermedades del útero
incluyen dismenorrea, retrodesviación uterina, endometriosis,
fibroides, adenomiosis, sangrado anovulatorio, amenorrea, síndrome
de Cushiner, molas hidatídicas, síndrome de Asherman, menopausia
prematura, pubertad precoz, pólipos uterinos, sangrado uterino
disfuncional (por ejemplo, debido a señales hormonales
aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas,
keiomiosarcomas, y sarcomas. Adicionalmente, las proteínas de
fusión de la transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las
proteínas de fusión de la transferrina pueden ser útiles como un
marcador o detector de, así como, en el diagnóstico, tratamiento,
y/o prevención de las anormalidades uterinas congénitas, tales como
útero bicorne, útero septado, útero unicorne simple, útero unicorne
con cuerno rudimentario sin cavidad, útero unicorne con cuerno
rudimentario sin cavidad de comunicación, útero unicorne con cuerno
con cavidad de comunicación, útero arcuado, útero didelfo, y útero
con forma de T.
Las enfermedades y/o los trastornos de los
ovarios incluyen una ovulación, síndrome de ovarios poliquísticos
(síndrome de Stein-Leventhal), quistes ováricos,
hipofunción de los ovarios, insensibilidad de los ovarios a las
gonadotropinas, sobreproducción de andrógenos en los ovarios,
síndrome de la vena del ovario derecho, en amenorrea, hirutismo, y
cáncer de ovarios (que incluye, pero no se limita a crecimiento
canceroso primario y secundario, tumores de
Sertoli-Leydig, carcinoma endometrioide del ovario,
adenocarcinoma seroso papilar ovárico, adenocarcinoma mucinoso
ovárico, y tumores de Krukenberg de los Ovarios.
Las enfermedades y/o los trastornos cervicales
incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta,
y displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian,
erosión cervical; incompetencia cervical, y neoplasmas cervicales
(que incluyen, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa,
carcinoma de células escamosas, neoplasia de células
adenoescamosas, y neoplasia de células columnares.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para tratar o detectar
agentes infecciosos. Por ejemplo, aumentando la respuesta inmune,
concretamente, aumentando la proliferación y la diferenciación de
las células B y/o T, se pueden tratar las enfermedades infecciosas.
Se puede aumentar la respuesta inmune tanto potenciando una
respuesta inmune existente, como mediante las proteínas de fusión de
la invención y/o iniciando una nueva respuesta inmune.
Alternativamente, los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden inhibir también directamente el
agente infeccioso sin estimular necesariamente una respuesta
inmune.
Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso
que puede producir enfermedad o los síntomas que se pueden tratar o
detectar mediante las proteínas de fusión de la transferrina y/o los
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la
transferrina. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a
los siguientes virus y familias víricas de ADN y ARN: Arbovirus,
Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae,
Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, VEB, VIH,
Flaviviridae, Hepadnaviridae Hepatitis, Herpesviridae (tal como,
Cytomegalovirus, Herpes Simplex; Herpes Zoster), Mononegavirus
(por ejemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus,
Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, Gripe A, gripe
B, y virus paragripal), virus del Papilloma, Papovaviridae,
Parvoviridae, Picomaviridae, Poxviridae (tal como Seudoviruela o
Vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae
(HTLV-I, HTLV-11, -Lentivirus), y
Togaviridae (por ejemplo, Rubivirus).
Similarmente, los agentes bacterianos y fúngicos
que pueden producir enfermedades o los síntomas que se pueden
tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la
transferrina y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina incluyen, pero no se limitan a, las
siguientes bacterias Gram-negativas y
Gram-positivas, familias bacterianas, y hongos:
Actinomyces (por ejemplo., Norcardia), Acinetobacter,
Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (por
ejemplo., Bacillus anthrasis), Bacteroides (por ejemplo,
Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por
ejemplo, Borrelia burgdorferi), Brucella, Candida, Campylobacter,
Chlamydia, Clostridium (por ejemplo, Clostridium botulinum,
Clostridium dificile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani),
Coccidioides, Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium
diptheriae), Cryptococcus, Dermatomicosis, E. coli (por ejemplo, E.
coli Enterotoxigénico y E. coli Enterohemorrágico),
Enterobacter (por ejemplo Enterobacter aerogenes),
Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella
typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia,
Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (por ejemplo,
Haemophilus influenzae tipo B), Helicobacter, Legionella (por
ejemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por
ejemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por
ejemplo, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio
(por ejemplo, Vibrio cholerae), Neisseriaceae (por ejemplo,
Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurellaceae,
Proteus, Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa),
Rickettsiaceae, Espiroquetas (por ejemplo, Treponema. spp.,
Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (por
ejemplo, Staphylococcus aureus), Meningococcus, Pneumococcus and
Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y los Grupos A,
B, y C de Streptococcus), y Ureaplasmas.
Además, los agentes parasíticos que producen
enfermedades o que se pueden tratar, evitar, y/o diagnosticar
mediante las proteínas de fusión y/o los polinucleótidos que
codifican las proteínas de fusión de la transferrina incluyen, pero
no se limitan a, las siguientes familias o clases: Amebiasis,
Babesiosis, Coccidiosis, Criptosporidiosis, Dientamoebiasis,
Dourina, Ectoparasíticos, Giardias, Helmintiasis, Leishmaniasis,
Esquistisomas, Teileriasis, Toxoplasmosis, Tripanosomiasis, y
Tricomonas y Esporozoarios (por ejemplo, Plasmodium vivax,
Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale).
\newpage
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina que se pueden usar para diferenciar,
proliferar, y las células atractoras que aportando a la
regeneración de los tejidos (Véase, Science 276:
59-87 (1997)). Se podría usar la regeneración de
los tejidos para reparar, sustituir o proteger del daño en el tejido
por defectos congénitos, traumas (heridas, quemaduras, incisiones,
o úlceras), la edad, las enfermedades (por ejemplo, osteoporosis,
osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática),
cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por
reperfusión, o daño sistémico por citocinas).
Los tejidos que se podrían regenerar usando la
presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado,
intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético,
cardiaco, vasculatura (incluyendo la vascular y la linfática),
tejido nervioso, hematopoyético, y esquelético (hueso, cartílago,
tendón, y ligamento). Preferiblemente, se produce la regeneración
con poca o ninguna cicatrización. La regeneración puede incluir
también la angiogénesis.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina se pueden usar para tratar, evitar,
diagnosticar, y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, que
incluyen enfermedades y/o dolencias inflamatorias, infecciones,
cánceres (por ejemplo, neoplasmas intestinales (tumor carcinoide
del intestino delgado, linfoma no de Hodgkin del intestino delgado,
linfoma del intestino delgado), y úlceras, tales como úlceras
pépticas.
Los trastornos gastrointestinales incluyen
disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica,
reflujo gástrico, fibrosis y estructuración submucosal, lesiones de
Mallory-Weiss, lipomas, cánceres epidérmicos,
adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis,
atrofia gástrica, cánceres gástrico/de estómago, pólipos de
estómago, trastornos autoinmunes como anemia perniciosa, estenosis
pilórica, gastritis (bacteriana, vírica, eosinófila, inducida por
estrés, erosiva crónica, atrófica, de células plasmáticas, y de
Menetrier) y enfermedades peritoneales (por ejemplo, quiloperitoneo,
hemoperitoneo, quiste mesentérico, linfadenitis mesentérica,
oclusión vascular mesentérica, paniculitis, neoplasmas, peritonitis,
neumoperitoneo, absceso subfrénico.
Los trastornos gastrointestinales incluyen
también trastornos asociados con el intestino delgado, tales como
el síndrome de mala absorción, distensión, síndrome de intestino
irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras
duodenales, duodenitis, esprúe tropical, enfermedad de Whipple,
linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis,
obstrucciones del íleo, divertículo de Meckel, divertículos
múltiples, fracaso de la rotación completa del intestino delgado y
grueso, linfoma, y enfermedades bactrianas y parasíticas (tales
como diarrea del Viajero, tifoideas y paratifoideas, cólera,
infección por Áscaris (ascariasis lumbricoides),
Anquilostomas (Ancylostoma duodenale), Oxiuros (Enterobius
vermicularis), Acantocéfalos Taenia saginata, Echinococcus
granulosus, Diphyllobothrium spp. y T. solium).
Las enfermedades y/o los trastornos del hígado
incluyen colestasis intrahepática (síndrome de Alagille, cirrosis
hepático biliar), hígado graso (hígado graso alcohólico, síndrome de
Reye), vena hepática, trombosis de la vena hepática, degeneración
hepatolenticular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome
hepatorenal, hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas),
absceso hepático (absceso hepático amébico), cirrosis hepática
(alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas
alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis, parasítica
(equinococosis hepática, fascioliasis, absceso hepático amébico),
ictericia (hemolítica, hepatocelular, y colestática), colestasis,
hipertensión portal, alargamiento del hígado, ascites, hepatitis
(hepatitis alcohólica, hepatitis intrafamiliar, hepatitis crónica
(autoinmune, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por
fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis vírica humana (hepatitis A,
hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de
Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria,
encefalopatía hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatía
hepática, hemangiomas biliares primarios, cirrosis biliar,
colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, piedras,
insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia
hepática aguda), y neoplasmas hepáticos (ancriomiolipoma, metástasis
del hígado calcificado, metástasis del hígado quístico, tumores
epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia focal
nodular, adenoma hepático , adenoma quístico hepatobiliar,
hepatoblastoma, carcinoma Hepatocelular, hepatoma, cáncer de
hígado, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimal, tumores
mesenquimales del hígado, hiperplasia nodular regenerativa, tumores
benignos de hígado (quistes hepáticos, quistes simples, enfermedad
del hígado poliquístico, adenoma quístico hepatobiliar, quistes
coledocales, tumores mesenquimales, hamartoma mesenquimal,
hemangioendotelioma infantil, Hemangioma, Peliosis hepática,
lipomas, seudotumor inflamatorio, tumores epiteliales variados,
epitelio del conducto biliar (hamartoma del conducto biliar, adenoma
del conducto biliar), hepatocitos (adenoma, hiperplasia focal
nodular, hiperplasia nodular regenerativa), tumores malignos del
hígado (hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma Hepatocelular,
colangiocelular, colangiocarcinoma, adenocarcinoma quístico, tumores
de los vasos sangíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi,
hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embriónico,
fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma carcinoide,
carcinoma escamoso, linfoma primario)),peliosis hepática, porfiria
eritrohepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda,
porfiria cutánea tardía), síndrome de Zelli Neger.
Las enfermedades y/o los trastornos pancreáticos
incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis
aguda Necrotizante, pancreatitis alcohólica), neoplasmas
(adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma,
gastrinoma, y glucacronoma, neoplasmas quísticos, tumores de las
células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades
pancreáticas (por ejemplo, fibrosis quística, quiste
seudopancreático, fístula pancreática. Insuficiencia)).
\newpage
Las enfermedades de la vesícula biliar incluye
piedras en la vesícula (colelitiasis y coledocolitiasis, síndrome de
postcolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar,
colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores del conducto
biliar, y mucocele.
Las enfermedades y/o los trastornos del
intestino grueso incluyen colitis asociada a antibióticos,
diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos,
infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorectales (por
ejemplo, fisuras, hemorroides), enfermedades colónicas (colitis,
neoplasia colónica, cáncer de colon, pólipos colónicos adenomatosos
(por ejemplo, adenoma velloso), carcinoma de colon, cáncer
colorrectal, diverticulitis colónica, diverticulosis colónica,
megacolon, enfermedad de Hirchsprung, megacolon tóxico,
enfermedades de las sigmoideas, proctocolitis, neoplasmas
sigmoideos, estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea
infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias
duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis)
enteritis (enterocolitis) enteropatía por VIH, enfermedades letales
(neoplasias letales, ileitis), enfermedades inmunoproliferativas
del intestino delgado, enfermedad inflamatoria del intestino
(colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal,
enfermedades parasíticas (anisakiasis, balantidiasis, infecciones
blastocísticas, criptoesporidiosis, Dientamoebiasis, disentería
amebiana, giardiasis), fístula intestinal (fístula rectal),
neoplasmas intestinales (neoplasmas cecales, neoplasmas colónicos,
neoplasmas duodenales, neoplasmas letales, pólipos intestinales,
neoplasias yeyunales, neoplasmas rectal), obstrucción intestinal
(síndrome del bucle aferente, obstrucción duodenal, heces
impactadas, seudoobstrucción intestinal, vólvulo cecal,
intosuscepción, perforación intestinal, pólipos intestinales
(pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de
Peutz-Jeghers), enfermedades yeyunales (neoplasmas
yeyunales), síndromes de mala absorción (síndrome del bucle ciego,
enfermedad celíaca, intolerancia a la lactosa, síndrome del
intestino corto, esprúe tropical, enfermedad de Whipple), oclusión
vascular mesentérica, neumatosis cistoides intestinales,
enteropatías con pérdida de proteínas (linfagiectasis intestinal),
enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal,
hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele),
úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia,
perforación , ulcera de estómago, síndrome de
Zollinger-Ellison), síndromes de postgastrectomía,
(síndrome de dumping), enfermedades del estómago (por
ejemplo, aclorhidria, reflujo duedenogástrico (reflujo biliar),
ectasia vascular antral gástrica, fístula gástrica, obstrucción de
la salid gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica),
gastroparesis, dilatación del estómago, divertículos del estómagos,
neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos,
adenocarcinoma gástrico, pólipo gástrico hiperplásico), rotura del
estómago, úlcera de estómago, vólvulo de estómago), tuberculosis,
viesceroptosis, vómitos (por ejemplo, hematemesis hiperemesis
grávida, náuseas y vómitos después de operación) y colitis
hemorrágica.
Las enfermedades y/o los trastornos del sistema
gastrointestinal incluyen las enfermedades del tracto biliar, tales
como, gastroesquisis, fístula (por ejemplo, fístula biliar,
fístula esofágica, fístula gástrica, fístula pancreática),
neoplasmas (por ejemplo, neoplasmas del tracto biliar,
neoplasmas esofágicos, tales como adenocarcinoma del esófago,
carcinoma de células escamosas esofágicas, neoplasmas
gastrointestinales, neoplasmas pancreáticos, tales como
adenocarcinoma del páncreas, neoplasma quístico mucinoso del
páncreas, neoplasmas quísticos pancreáticos, pancreatoblastoma, y
neoplasmas peritoneales), enfermedad esofágica (por ejemplo,
enfermedades bullosas, candidiasis, acantosis glicogénica, úlcera,
varices esofágicas de Barrett, atresia, quistes, divertículos
(por ejemplo, divertículos de Zenker), fístula (por
ejemplo, fístula traqueoesofágica, trastornos de motilidad
(por ejemplo síndrome de CREST, trastornos de la deglución,
acalasia, espasmo, reflujo gastroesofágico), neoplasmas,
perforación (por ejemplo, síndrome de Boerhaave, síndrome de
Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia de
diafragma (por ejemplo, hernia de hiato); enfermedades
gastrointestinales, tales como gastroenteritis (por ejemplo,
cólera morboso, infección por virus de Norwalk), hemorragia (por
ejemplo, hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica),
neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos,
adenocarcinoma gástrico, cáncer de estómago)), hernia (por
ejemplo, hernia diafragmática congénita, hernia femoral, hernia
inguinal, hernia obturadora, hernia umbilical, hernia ventral), y
enfermedades intestinales (por ejemplo, enfermedades cecales
(apendicitis, neoplasmas cecales)).
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o os polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden tener actividad quimiotáxica. Una
molécula quimiotáxica atrae o moviliza células (por ejemplo,
monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células
mastocíticas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) en
un emplazamiento concreto en el cuerpo, tal como inflamación,
infección, o emplazamiento de hiperproliferación. Las células
movilizadas pueden a continuación rechazar y/o sanar el trauma o
anormalidad particular.
Las proteínas de fusión de la transferrina
modificada y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de
fusión de la transferrina pueden aumentar la actividad quimiotáxica
de las células concretas. Estas moléculas quimiotácticas se pueden
usar a continuación para tratar la inflamación, infección,
trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema
inmune aumentando el número de células dirigidas hacia una
localización concreta en el cuerpo.
Las proteínas de fusión de la Tf incluyen, pero
no se limitan a las proteínas de fusión Tf modificada. Los
procedimientos de preparación de la Tf y los procedimientos de
administración de las proteínas de fusión de la Tf se discuten en la
Solicitud de Patente PCT PCT/US03/________________, títulada,
"Oral Delivery of Modified Transferrin Fusion Proteins",
presentada el 28 de agosto de 2003.
En particular, algunas proteínas de fusión que
se usaron para tratar algunos tipos de enfermedades o dolencias
médicas pueden ser particularmente adecuadas para la formulación y
la administración oral. Dichos tipos de enfermedades o dolencias
incluyen, pero no se limitan a, enfermedades agudas, crónicas y
recurrentes. Las enfermedades crónicas y recurrentes incluyen, pero
no se limitan a enfermedades o infecciones víricas, cáncer,
enfermedades ametabólicas, obesidad, enfermedades autoinmunes,
enfermedades inflamatoria, alergia enfermedad de injerto contra
huésped, infección microbiana sistémica, anemia, enfermedad
cardiovascular, sicosis, enfermedades genéticas, enfermedades
neurodegenerativas, trastornos de las células hematopoyéticas del
sistema endocrino o los sistemas reproductores, enfermedades
gastrointestinales. Los ejemplos de estos tipos de enfermedades
incluyen diabetes, esclerosis múltiple, asma, infecciones por VHC o
VIH, hipertensión, hipercolesterolemia, esclerosis arterial,
artritis, y enfermedad de Alzheimer. En muchas enfermedades
crónicas, las formulaciones orales de las proteínas de fusión de la
Tf y los procedimientos de administración son particularmente útiles
debido a que permiten la atención sanitaria y la terapia a largo
plazo del paciente mediante la administración oral en su casa sin
dependencia de tratamiento inyectable o protocolos
farmacológicos.
Las formulaciones orales y los procedimientos de
administración que comprenden proteínas de fusión de la Tf se
aprovechan, en parte, de la transcitosis mediada por el receptor de
la transferrina a través del epitelio gastrointestinal (GI). El
receptor de la Tf se encuentra en una densidad muy elevada en el
epitelio GI humano, la transferrina es muy resistente a la
digestión tríptica y quimiotríptica y se han usado conjugados
químicos de la Tf satisfactoriamente para administrar las proteínas
y los péptidos a través del epitelio GI (Xia y col., (2000) J.
Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600; Xia y
col. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2):
191-195; y Shah y col. (1996) J. Pharmaceutical
Sci., 85(12): 1306-1311). Una vez
trasportadas a través del epitelio GI, las proteínas de fusión de
la Tf presentan una semivida prolongada en suero, esto es, la
proteína o el(los) péptidos unidos o insertados en Tf
presentan una semivida circulatoria in vivo prolongada, en
comparación con la proteína o el péptido en su estado no
fusionado.
Se pueden preparar formulaciones orales de las
proteínas de fusión de la Tf de tal manera que sean adecuadas para
el trasporte al epitelio GI y la protección del componente de la
proteína de fusión de la Tf y otros componentes activos en el
estómago. Dichas formulaciones pueden incluir los componentes del
vehículo y el dispersante y pueden estar en cualquier forma
adecuada, incluyendo aerosoles (para administración oral o
pulmonar), jarabes, comprimidos, que incluyen comprimidos
masticables, cápsulas, comprimidos gruesos, pastillas para chupar,
sellos o bolitas granuladas y polvos. Contempladas también para el
uso en el presente documento están otras formas de dosificación
sólida orales, que se describen generalmente en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18^{a} Ed. 1990 (Mack Publishing Co.
Easton Pa. 18042) en el Capítulo 89.
Muchas de las formulaciones orales pueden
contener también ingredientes inertes que permiten la protección
frente al ambiente del estómago, y la liberación del material
biológicamente activo en el intestino. Se conocen bien en la
técnica dichas formulaciones, o recubrimientos entéricos. En una
realización particularmente preferida, las composiciones
farmacéuticas orales de la invención se formulan en forma líquida
tamponada que se encapsula a continuación en cápsulas recubiertas
de gelatina blanda o dura que se reviste a continuación con un
revestimiento entérico apropiado. Para las composiciones de
administración oral de la invención, la ubicación de la liberación
puede ser cualquier parte del sistema GI, incluyendo el intestino
delgado (el duodeno, el yeyuno, o el íleo), o el intestino
grueso.
Los vehículos o dispersantes farmacéuticamente
aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones acuosos,
sacarosa, lactosa, almidón, aceites grasos, ésteres de ácidos
grasos, polisacáridos, monoglicéridos, triglicéridos,
emulsificantes de fosfolípidos, emulsificantes no iónicos y arcillas
coloidales refinadas. Se pueden formular también las composiciones
farmacéuticas para la administración oral usando microesferas de
poliéster, microesferas de zein, microesferas de proteinoides,
microesferas de policianoacrilato, y sistemas basados en lípidos
(véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, Oral Delivery of
Microencapsulated Proteins, ``in Protein Delivery: Physical
Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288
(Plenum Press 1997)). En otras realizaciones, las composiciones
orales se formulas para liberar lentamente los ingredientes activos,
incluyendo las proteínas de fusión de la Tf de la invención, en el
sistema GI usando formulaciones conocidas de liberación
retardada.
Las proteínas de fusión de la Tf de la invención
para la administración oral son capaces de unirse al receptor de Tf
que se encuentra en el epitelio GI. Para facilitar esta unión y el
trasporte mediado por el receptor, las proteínas de fusión de la Tf
de la invención se producen normalmente con hierro, y en algunos
ejemplos, carbonato, unido al resto de Tf. Se conocen en la técnica
las procesos y los procedimientos para introducir el resto de Tf de
las composiciones de las proteínas de fusión de la invención con
hierro y carbonato.
En algunas formulaciones farmacéuticas, el resto
de Tf de la proteína de fusión de Tf se puede modificar para
aumentar la afinidad o la avidez del resto de Tf por el hierro. Se
conocen dichos procedimientos en la técnica. Por ejemplo, se puede
usar la mutagénesis para producir restos de transferrina mutantes
que se unen al hierro con más avidez que la transferrina natural.
En la transferrina de suero humano, los aminoácidos que son
ligandos para la quelación del ión metálico incluyen, pero no se
limitan a los lóbulos N de los aminoácidos Asp63, Tyr 95, Tyr188,
Lys206, His207 e His249; y los lóbulos C de los aminoácidos Asp392,
Tyr426, Tyr517 e His584 (el número al lado del aminoácido indica la
posición del resto de aminoácido en la secuencia principal de
aminoácidos en el que la valina de la proteína madura se designa
como posición 1) Véase la Patente de los Estados Unidos 5.986.067.
En una realización, los restos de Lys206 e His207 en el interior del
lóbulo N están sustituidos con Gln y Glu; respectivamente.
En algunas formulaciones farmacéuticas, la
proteína de fusión de la Tf se construye mediante ingeniería
genética para que contenga un emplazamiento de rotura entre la
proteína o el péptido terapéutico y la del resto de Tf. Se conocen
en la técnica dichos emplazamientos de rotura o enlazantes.
Las composiciones y procedimientos farmacéuticos
pueden incluir la adición de un potenciador de la transcitosis para
facilitar la transferencia de la proteína de fusión a través del
epitelio GI. Se conocen dichos potenciadores en la técnica. Véase
Xia y col., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:
594-600; y Xia y col. (2001) Pharmaceutical Res.,
18(2): 191-195.
Las formulaciones farmacéuticas orales pueden
incluir proteínas de fusión de Tf que comprenden un resto de Tf
modificado que presenta una glicosilación reducida o ninguna
glicosilación fusionada al extremo N terminal de una proteína o
péptido de insulina o GLP-1 según se describe
anteriormente. Se pueden usar dichas composiciones farmacéuticas
para tratar trastornos de desequilibrio de glucosa tales como
diabetes, mediante administración oral de la composición
farmacéutica que comprende una dosis eficaz de la proteína de
fusión.
Se puede medir de numerosos modos la dosis
eficaz de la proteína de fusión, entre los que se incluyen las
dosificaciones calculadas para aliviar los síntomas asociados con un
estado específico de enfermedad en un paciente, síntomas como los
de diabetes. En otras formulaciones, las dosificaciones se calculan
para comprender una cantidad eficaz de la proteína de fusión para
inducir un cambio detectable en los niveles de glucosa en sangre de
entre aproximadamente un 1% y un 90%, o entre aproximadamente un 5%
y aproximadamente un 80%. Estas disminuciones en los niveles de
glucosa en sangre serán dependientes del estado de enfermedad que se
está tratando y las composiciones farmacéuticas o los
procedimientos de administración se pueden modificar para conseguir
el resultado deseado para cada paciente. En otros ejemplo, se
formulan las composiciones farmacéuticas y se modifican los
procedimientos de administración para detectar un aumento en el
nivel de actividad de la proteína o péptido terapéutico en el
paciente, por ejemplo, aumentos detectables en las actividades de la
insulina o GLP-1. Dichas formulaciones y
procedimientos pueden liberar entre aproximadamente 1 pg y
aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de la proteína de
fusión, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 \mug/kg de
peso corporal de la proteína de fusión, aproximadamente 100 \mug a
aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de la proteína de
fusión, aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1 g de la
proteína de fusión, aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 100
mg de la proteína de fusión o aproximadamente 10 mg a
aproximadamente 50 mg de la proteína de fusión. Se pueden calcular
también las formulaciones usando una medida unitaria de la
actividad de la proteína terapéutica, tal como de aproximadamente 5
a aproximadamente 500 unidades de insulina humana o de
aproximadamente 10 a aproximadamente 100 unidades de insulina
humana. Se pueden calcular las medidas ponderales o la actividad
usando patrones conocidos de cada proteína o péptido terapéutico
fusionado a Tf.
Se describen también en el presente documento
los procedimientos para administrar oralmente las composiciones
farmacéuticas. Dichos procedimientos pueden incluir, pero no se
limitan a, etapas de administración oral de las composiciones por
el paciente o un profesional sanitario. Dichas etapas de
administración pueden incluir la administración en intervalos tales
como una vez o dos veces por día dependiendo de la proteína de
fusión de la Tf, la enfermedad o dolencia del paciente o el
paciente individual. Dichos procedimientos incluyen también la
administración de varias dosificaciones de la proteína de fusión de
la Tf individual. Por ejemplo, la dosificación inicial de una
composición farmacéutica puede ser a un nivel mayor para inducir un
efecto deseado, tal como una reducción de los niveles de glucosa en
sangre. A continuación se pueden disminuir las dosificaciones
posteriores una vez se ha conseguido el efecto deseado. Se pueden
llevar a cabo estos cambios o modificaciones en los protocolos de
administración por el médico a cargo del paciente o el profesional
sanitario. En algunos ejemplos, se pueden llevar a cabo los cambios
en el protocolo de administración por el paciente individual, tal
como cuando un paciente se vigila los niveles de glucosa en sangre
y se administra una insulina-mTf o una composición
oral de mTf-GLP-1.
Se describen también en el presente documento
los procedimientos para producir composiciones orales o
composiciones de medicamento que comprender formular una proteína de
fusión de la Tf en una forma adecuada para administración oral. La
solicitud describe también los procedimientos para producir
composiciones o composiciones de medicamento que comprenden
formular una proteína de fusión de la Tf en una forma adecuada para
la administración oral.
Se contempla la producción de animales
transgénicos no humanos que contienen un constructo de fusión de la
transferrina modificada con semivida prolongada en suero,
estabilidad prolongada en suero o biodisponibilidad aumentada de la
presente invención. Se puede usar lactoferrina como la porción de Tf
de la proteína de fusión de tal manera que se produce y segrega la
proteína de fusión en leche.
Se ha descrito la producción satisfactoria de
animales transgénicos no humanos en numerosas patentes y
publicaciones, tales como, por ejemplo la Patente de los Estados
Unidos 6.291.740 (otorgada el 18 de septiembre de 2001); la patente
de los Estados Unidos 6.281.408 (otorgada el 28 de agosto de 2001);
y la Patente de los Estados Unidos 6.271.436 (otorgada el 7 de
agosto de 2001).
La capacidad de alterar el componente genético
de animales, tal como de mamíferos domesticados que incluyen vacas,
cerdos, cabras, caballos, ganado, y ovejas, permite numerosas
aplicaciones comerciales. Estas aplicaciones incluyen la producción
de animales que expresan grandes cantidades de proteínas exógenas en
una forma fácilmente cosechable (por ejemplo, expresión en leche o
sangre), la producción de animales con mayor ganancia de peso ,
eficiencia de la alimentación, composición de la carcasa, producción
o contenido de leche, resistencia a enfermedad y resistencia a la
infección por microorganismos específicos y la producción de
animales que tienen índices de crecimiento o comportamiento
reproductor potenciados. Los animales que contienen secuencias de
ADN exógeno en su genoma se denominan animales transgénicos.
El procedimiento más ampliamente usado para la
producción de animales transgénicos es la microinyección de ADN en
los pronúcleos de los animales fertilizados (Wall y col., J. Cell.
Biochem. 49:113 [1992]). Otros procedimientos para la producción de
animales transgénicos incluyen la infección de embriones con
retrovirus o con vectores retrovíricos. Se ha informado de la
infección de embriones de ratón antes y después del implante con
retrovirus de tipo natural o recombinante (Janenich, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 73: 1260 [1976]; Janenich y col., Cell 24: 519
[1981]; Stuhlmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7151
[1984]; Jahner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6927 [1985];
Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:
6148-6152; Stewart y col., EMBO J. 6:
383-388 [1987]).
Un medio alternativo para infectar embriones con
retrovirus es la inyección de virus o células que producen virus en
el blastocele de embriones de ratón (Jahner, D. y col., Nature 298:
623 [1982]). Se ha informado de la introducción de transgenes en la
línea germinal de ratones usando infección retrovírica intrauterina
de embriones de ratón parcialmente gestados (Jahner y col., más
arriba [1982]). Se ha informado de la infección de embriones de
bovino y ovino con retrovirus o vectores retrovíricos para crear
animales transgénicos. Estos protocolos implican la microinyección
de partículas retrovíricas o células con el crecimiento detenido
(es decir, tratadas con mitomicina C) que expiden partículas
retrovíricas al espacio perivitelino de los huevos fertilizados o
los embriones tempranos (La Solicitud Internacional PCT WO 90/08832
[1990]; y Haskell y Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]. La
Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 describe la inyección del
virus B de la leucemia de felinos de tipo natural en el espacio
perivitelino de embriones de oveja en las etapas celulares 2 a 8.
Los fetos derivados de los embriones inyectados mostraron contener
múltiples emplazamientos de integración.
La Patente de los Estados Unidos 6.291.740
(otorgada el 18 de septiembre de 2001) describe la producción de
animales transgénicos mediante la introducción de ADN exógeno en los
oocitos premaduros y maduros, los oocitos no fertilizados (es
decir, la prefertilización de los oocitos) usando vectores
retrovíricos que traducen las células en división (por ejemplo,
vectores derivados del virus de la leucemia de murino [VLM]). Esta
patente describe también los procedimientos y las composiciones
para el promotor que impulsa el citomegalovirus, así como la
expresión de diversas proteínas recombinantes de LTR en un tumor
mamario de ratón.
La Patente de los Estados Unidos 6.281.408
(otorgada el 28 de agosto de 2001) describe los procedimientos para
producir animales transgénicos usando células troncales embriónicas.
De manera breve, se usaron células troncales embriónicas en un
cultivo simultáneo de células mixtas con mórula para generar
animales transgénicos. Se introdujo el material genético extraño en
las células troncales embriónicas antes del cultivo simultáneo
mediante, por ejemplo, electroporación, microinyección o liberación
retrovírica. Se seleccionaron las células ES transfectadas de esta
manera para las integraciones en el gen mediante un marcador de
selección tal como neomicina.
La Patente de los Estado Unidos 6.271.436
(otorgada el 7 de agosto de 2001) describe la producción de
animales transgénicos usando procedimientos que incluyen el
aislamiento de células germinales primordiales, cultivando estas
células para producir líneas de células derivadas de células
germinales primordiales, transformando las células germinales
primordiales y las líneas celulares cultivadas, y usando estas
células transformadas y las líneas celulares para generar animales
transgénicos. Se aumentó mucho la eficiencia a la cual se generaron
los animales transgénicos, permitiendo por tanto el uso de la
recombinación homóloga en la producción de especies animales
transgénicas no roedores.
Se contempla el uso de los constructos de
transferrina modificada para la terapia génica en los que una
proteína de transferrina modificada o región de transferrina se une
a una proteína o péptido terapéutico. Los constructos de fusión de
la transferrina modificada con semivida en suero o estabilidad en
suero aumentadas son idealmente adecuados para los tratamientos de
terapia génica.
Se ha descrito el uso satisfactorio de la
terapia génica para expresar una proteína de fusión soluble. De
manera breve, se demostró recientemente la terapia génica mediante
inyección de un vector de adenovirus que contiene un gen que
codifica una proteína de fusión soluble constituida por el antígeno
4 de los linfocitos citotóxicos (CTL4) y la porción Fc de la
inmunoglobulina G1 humana en Ijima y col. (Human Gene Therapy
(Estados Unidos) 12/9: 1063-77,2001). En esta
aplicación de la terapia génica, se trató satisfactoriamente un
modelo de artritis inducida por colágeno de tipo II en murino,
mediante la inyección intraarticular del vector.
Se describe también la terapia génica en
numerosas patentes de los Estados Unidos que incluyen la patente de
los Estados Unidos 6.225.290 (otorgada el 1 de mayo de 2001); la
Patente de los Estados Unidos 6.187.305 (otorgada el 13 de febrero
de 2001); y la Patente de los Estados Unidos 6.140.111 (otorgada el
31 de octubre de 2000).
La Patente de los Estados Unidos 6.225.290
proporciona los procedimientos y constructos en los que células
epiteliales intestinales de un sujeto mamífero se alteran
genéticamente para incorporar operativamente un gen que expresa una
proteína que tiene un efecto terapéutico deseado. Se llevó a cabo la
transformación celular intestinal mediante la administración de una
formulación compuesta principalmente por ADN desnudo, y el ADN se
puede administrar oralmente. Las rutas de administración oral y
otras rutas gastrointestinales proporcionan un procedimiento
sencillo de administración, mientras que el uso de ácido nucleico
desnudo evita las complicaciones asociadas con el uso de vectores
víricos para llevar a cabo la terapia génica. La proteína expresada
se segregó directamente en el tracto gastrointestinal y/o el
torrente sanguíneo para obtener niveles terapéuticos en sangre de
la proteína tratando al paciente necesitado de la proteína. Las
células epiteliales intestinales transformadas proporcionan curas
terapéuticas a corto o largo plazo de las enfermedades asociadas
con una deficiencia en una proteína concreta o que son adecuadas
para el tratamiento mediante la sobreexpresión de una proteína.
La Patente 6.187.305 proporciona los
procedimientos para dirigir un gen o ADN en células de vertebrados,
particularmente de origen mamífero. Se introdujo el ADN en las
células primarias o secundarias de origen vertebrado mediante la
recombinación homóloga o dirigiendo el ADN, que se introdujo en el
ADN genómico de las células primarias o secundarias en un
emplazamiento preseleccionado.
La Patente de los Estados Unidos 6.140.111
(otorgada el 31 de octubre de 2000) describe vectores retrovíricos
de terapia génica. Los vectores retrovíricos que se dan a conocer
incluyen un emplazamiento de inserción para los genes de interés y
son capaces de expresar elevados niveles de la proteína derivada de
los genes de interés en una amplia variedad de tipos celulares
transfectados. Se dan a conocer también los vectores retrovíricos
que carecen de un marcador seleccionable, volviéndolos de esta
manera adecuados para la terapia génica humana en el tratamiento de
una variedad de estados de enfermedad sin la expresión simultánea de
un producto marcador, tal como un antibiótico. Estos vectores
retrovíricos son especialmente adecuados para el uso en algunas
líneas celulares de empaquetamiento. La capacidad de los vectores
retrovíricos para insertarse en el genoma de las células de
mamífero les hace ser candidatos particularmente prometedores para
uso en la terapia génica de las enfermedades genéticas en seres
humanos y animales. La terapia génica implica normalmente (1) añadir
nuevo material genético a las células del paciente in vivo,
o (2) eliminar células del paciente del cuerpo, añadir nuevo
material genético a las células y reintroduciéndolo en el cuerpo,
es decir, terapia génica in vitro. Se pueden
encontrar discusiones sobre cómo llevar a cabo la terapia génica en
una variedad de células usando vectores retrovíricos, por ejemplo,
en las Patentes de los Estados Unidos 4.868.116, otorgada el 19 de
septiembre de 1989, y 4.980.286, otorgada el 25 de diciembre de
1990 (células epiteliales), los documentos WO89/07136 publicado el
10 de agosto de 1989 (células hepatocitos), EP 378.576 publicado el
25 de julio de 1990 (células fibroblastos), y WO89/05345 publicado
el 15 de Junio de 1989 y WO/90/06997, publicado el 28 de junio de
1990 (células endoteliales).
Un aspecto cada vez más importante en el
desarrollo biofarmacéutico de fármacos y de la biología molecular
es la identificación de las estructuras de los péptidos, incluyendo
las secuencias primarias de los aminoácidos de los péptidos o los
peptidomiméticos que interactúan con las macromoléculas biológicas.
Un procedimiento para identificar los péptidos que poseen una
estructura o propiedad funcional deseada, tal como la unión a una
macromolécula biológica predeterminada (por ejemplo, un
receptor) implica el cribado de una gran biblioteca de péptidos de
los miembros individuales de la biblioteca que poseen la estructura
o la propiedad funcional deseada conferida por la secuencia de
aminoácidos del péptido.
El cribado de las bibliotecas combinatorias para
fármacos potenciales o antígenos diana terapéuticamente relevantes
es un campo importante y en rápido desarrollo. Las bibliotecas de
péptidos son un importante subconjunto de estas bibliotecas. Sin
embargo, con el fin de expresar y posteriormente cribar los péptidos
funcionales en las células, los péptidos necesitan expresarse en
cantidad suficiente para superar mecanismos catabólicos tales como
la proteólisis. Los péptidos pueden estabilizarse también
conformacionalmente en relación con los péptidos lineales para
permitir una mayor afinidad de unión por sus dianas celulares.
Adicionalmente, la medida del nivel de expresión de estos péptidos
puede ser difícil, puede ser generalmente difícil seguir la
expresión de los péptidos en células específicas para discernir si
cualquier célula concreta está expresando un miembro de la
biblioteca.
Para superar estos problemas, la patente de los
Estados Unidos 6.562.617 da a conocer proteínas de fusión que
comprenden proteínas estructurales, incluyendo las variantes, y
péptidos aleatorios que se fusionan de tal manera que la
organización de la proteína estructural no se perturba
significativamente y el péptido se estabiliza metabólica y
conformacionalmente. Esto permite la creación de una biblioteca de
péptidos que se controla fácilmente, tanto en lo que concierne a su
presencia en el interior de las células como a su cantidad. De esta
manera, los péptidos en el interior o fusionados a una proteína
estructural se muestran sobre o en la superficie de la estructura,
siendo por tanto accesibles para la interacción con dianas
funcionales potenciales.
La presente invención se dirige a fusiones de
las proteínas transferrina (Tf), incluyendo variantes, y a los
péptidos aleatorios que se fusionan de tal manera que la estructura
del péptido se estabiliza metabólica y conformacionalmente. La
presente invención proporciona Tf como una proteína estructural para
generar bibliotecas de péptidos.
La presente invención proporciona bibliotecas de
fagos con péptido que contienen proteínas de fusión de la
transferrina que comprenden Tf y uno o más péptidos fusionados a
ésta en la que el péptido de Tf tiene una afinidad reducida por un
receptor de la transferrina (TfR). Tf actúa como proteína
estructural para estabilizar y aumentar la semivida de los
péptidos.
Por "proteína estructural", "polipéptido
estructural", "estructura" o sus equivalentes gramaticales
en el presente documento se entiende una proteína a la cual se
pueden fusionar secuencias de aminoácidos, tales como péptidos
aleatorios. Los péptidos son exógenos respecto de la estructura,
esto es, no se presentan normalmente en la proteína. Tras la
fusión, la proteína estructural permite usualmente la presentación
de péptidos aleatorios de tal manera que sean accesibles a otras
moléculas. Las proteínas estructurales se clasifican en diversos
tipos, incluyendo, proteínas indicadoras (que incluyen proteínas
detectables, proteínas de supervivencia e, indirectamente,
proteínas detectables), y las proteínas estructurales.
Por "proteína indicadora" o sus
equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende una
proteína que por su presencia en o sobre una célula o cuando se
segrega en el medio permite que se pueda distinguir la célula de
una célula que no contiene la proteína indicadora. La célula
comprende normalmente un gen indicador que codifica la proteína
indicadora. Los genes indicadores se clasifican en diversos tipos,
según se ha reseñado anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse
a, genes de detección, genes indirectamente detectables, y genes de
supervivencia.
La proteína estructural podría ser una proteína
detectable. Una "proteína detectable" o "proteína de
detección" (codificada por un gen detectable o de detección) es
una proteína que se puede usar como una marca directa, esto es, la
proteína es detectable (y preferiblemente, una célula que comprende
la proteína detectable es detectable) sin manipulaciones o
constructos adicionales. Una realización del cribado utiliza la
clasificación celular (por ejemplo mediante FACS) para detectar la
expresión de la estructura (y de esta manera la biblioteca de
péptidos). De esta manera, el producto de la proteína del propio gen
indicador puede servir para distinguir las células que expresan el
gen detectable.
Las proteínas indicadoras son aquellas que
permiten que las células que contienen proteínas indicadoras se
distinguan de las que no las contienen. Las proteínas estructurales
permiten que los péptidos tengan diferentes desviaciones
estructurales y son a menudo deseables debido a que diferentes
proteínas u otras dianas funcionales pueden requerir péptidos de
diferentes estructuras específicas para interactuar estrechamente
con su superficie o los emplazamientos de unión en hendidura. De
esta manera, se pueden utilizar diferentes bibliotecas, cada una
con diferente desviación estructural, para maximizar las
posibilidades de tener miembros con elevada afinidad para una
variedad de dianas diferentes. De esta manera, por ejemplo, se
pueden preparar bibliotecas de péptidos aleatorios con una
desviación helicoidal o la desviación de la estructura extendida
mediante fusión con el término N y/o el término C de las proteínas
Tf estructurales. Similarmente, se pueden preparar bibliotecas de
péptidos aleatorios con una desviación superenrollada mediante
fusión con el término N y/o el término C de las proteínas Tf
estructurales. Se pueden preparar conformaciones extendidas de la
biblioteca aleatoria usando inserciones entre proteínas Tf
estructurales dimerizantes. Otras conformaciones de la biblioteca
aleatoria utilizan formaciones en bucle mediante la inserción en
bucles en las proteínas Tf estructurales; se pueden sustituir los
restos de aminoácidos en el interior de la estructuras en bucle
respectivas por la biblioteca de péptidos aleatorios o se puede
insertar la biblioteca de péptidos aleatorios entre dos restos de
aminoácidos localizados en el interior de una estructura en
bucle.
Según esto, se pueden escoger los armazones de
Tf con la estructura deseada para generar una biblioteca. Por
ejemplo, la estructura podría contener únicamente la región N de
Tf. También, la presente invención incluye Tf fusionada a una
proteína indicadora o a una proteína detectable. Alternativamente,
se podría etiquetar Tf para la detección.
Una proteína estructural tal como Tf o el gen
que codifica ésta puede ser de tipo natural o variantes de la
misma. Estas variantes se clasifican en uno o más de tres tipos:
variante sustitucional, insercional o deleccional. Estas variantes
se preparan ordinariamente mediante mutagénesis específica del
emplazamiento de los nucleótidos en el ADN que codifica la proteína
estructural, usando mutagénesis de casete o mediante la PCR u otras
técnicas bien conocidas en la técnica, para producir un ADN que
codifica la variante, y expresar a continuación el ADN en el
cultivo celular recombinante tal como se ha reseñado en el presente
documento. Sin embargo, se pueden preparar fragmentos variantes de
la proteína que tienen hasta aproximadamente 100-150
restos mediante síntesis in vitro usando las técnicas
establecidas. Las variantes de la secuencia de aminoácidos se
caracterizan por la naturaleza predeterminada de la variación, una
característica que las separa de la variación alélica o
interespecie que se produce naturalmente de la secuencia de
aminoácidos de la proteína natural. Las variantes presentan
normalmente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo
que se produce naturalmente, aunque se pueden seleccionar también
variantes que tienen características modificadas que se reseñarán
más completamente a continuación.
Como se discutió al principio, para generar
proteínas de fusión de la Tf, el péptido se puede fusionar con el
término N o el término C, o se puede insertar en la estructura de
Tf. Se puede añadir el péptido a la estructura de la Tf o se puede
sustituir o reemplazar una porción, tal como un bucle o parte de un
bucle de la estructura de Tf.
En un aspecto de la invención se fusiona un
péptido aleatorio a una estructura de Tf, para formar una proteína
de fusión. La proteína de fusión podría incluir también elementos
adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, compañeros y
enlazantes de fusión.
El aislamiento de ligandos que se unen a dianas
biológicas es fundamental para descubrir nuevas terapéuticas. La
capacidad para Sintetizar ADN químicamente ha hecho posible la
construcción de colecciones extremadamente grandes de ácido
nucleico y secuencias de péptidos como potenciales ligandos.
Procedimientos recientemente desarrollados permiten un eficiente
cribado de las bibliotecas para las actividades de unión deseadas
(véase Pluckthun y Ge, 1991, Angew. Chem. Int Ed. Engl.
30:296-298).
En general, se podrían generar bibliotecas de
péptidos aleatorios para identificar tanto péptidos que se unen a
moléculas diana de interés como productos génicos que modifican los
péptidos o el ARN de una manera deseada. Los péptidos se producen a
partir de bibliotecas de vectores de expresión de péptidos
aleatorios que codifican los péptidos unidos a una proteína
estructural. Un procedimiento de enriquecimiento por afinidad
permite cribar una biblioteca muy grande de péptidos y seleccionar
el vector que trasporta el(los) péptido(s)
deseado(s). A continuación se puede aislar el ácido nucleico
a partir del vector y secuenciarse para deducir la secuencia de
aminoácidos del péptido deseado. Usando estos procedimientos se
puede identificar un péptido que tenga una afinidad de unión
deseada por una molécula. A continuación se puede sintetizar el
péptido masivamente mediante medios convencionales.
Se pueden usar bibliotecas de péptidos
aleatorios para identificar péptidos con afinidad por una amplia
variedad de moléculas diana, tales como receptores, pequeñas
moléculas, macromoléculas y similares. Los ejemplos de péptidos
incluyen, pero no se limitan a factores de crecimiento, hormonas,
sustratos de enzimas, interferones, interleucinas, mensajeros
intracelulares e intercelulares, lectinas, moléculas de adhesión
celular, y similares. La presente invención usa también bibliotecas
de péptidos aleatorios para identificar análogos y miméticos de
estos péptidos.
El documento US. 5.270.170 da a conocer una
biblioteca de péptidos aleatorios construida transformando células
huésped con una colección de vectores recombinantes que codifican
una proteína de fusión comprendida por una proteína de unión al ADN
y un péptido aleatorio y que codifica también un emplazamiento de
unión para la proteína de unión al ADN que se va a usar para cribar
los ligandos novedosos.
Se han propuesto en la técnica diversas
soluciones para generar y cribar grandes bibliotecas de secuencias
de péptidos aleatorios y seudoaleatorios adecuados para el cribado,
selección e identificación de los miembros individuales de la
biblioteca deseados.
En general, el camino más sencillo para crear un
gran número de secuencias diversas implica la síntesis de
oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido aleatorio de
longitud 24 codifica todos los péptidos posibles de longitud 8, un
número que excede a diez billones. La biblioteca normalmente varía
de tamaño desde al menos algunos cientos a aproximadamente cien
millones de especies individuales. Dichas bibliotecas pueden
implicar todos los péptidos posibles de longitud 6, o pueden
implicar subconjuntos de bibliotecas compuestos de secuencias más
largas.
También se pueden generar bibliotecas a partir
de secuencias de ADN natural tales como ARNm o ADN genómico.
Normalmente dichas bibliotecas se desviarían hacia las proteínas
naturales y los fragmentos de proteínas. De esta manera, estas
bibliotecas pueden contener una fracción significativa de las
secuencias que codifican polipéptidos que interactúan con las
proteínas naturales en la célula. Cuando dichos fragmentos se
insertan en la estructura, pueden plegarse en una conformación que
asemeja una región que procede de la proteína análoga natural de la
cual se derivan (Bartel P. L., Roecklein J. A., y col. Nat Genet
January 1996; 12(1): 72-77).
Usando técnicas conocidas de ADN recombinante
(véase generalmente, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., 1989, incorporadas por referencia en el
presente documento) se puede sintetizar un oligonucleótido que,
entre otros, elimina emplazamientos de restricción no deseados y
añade otros deseados, que reconstruyen las porciones correctas de
cualquier secuencia que se ha eliminado, insertan los restos
separadores, conservados, o del marco, si acaso, y corrige el marco
de traducción (si es necesario) para producir una proteína de fusión
activa constituida por una proteína estructural y un péptido
aleatorio. La porción central del oligonucleótido contendrá
generalmente una o más secuencias de codificación del péptido
aleatorio (dominio de la región variable)y un separador o
los restos del marco. Las secuencias se expresan de manera última
como péptidos (con o sin separador o los restos del marco)
fusionados a o en la proteína estructural.
El dominio de la región variable del
oligonucleótido codifica una característica clave de la biblioteca:
el péptido aleatorio. El tamaño de la biblioteca variará según el
número de codones variables, y por tanto del tamaño de los
péptidos, que se desean. Generalmente la biblioteca tendrá al menos
10^{6} a 10^{8} o más miembros, aunque en algunas
circunstancias pueden ser bastante útiles bibliotecas más pequeñas.
Para generar la colección de oligonucleótidos que forma una serie
de codones que codifica una colección aleatoria de aminoácidos y
que se clona finalmente en el vector, se usa un motivo de codón, tal
como (NNK)_{x}, en el que N puede ser A, C, G, o T
(nominalmente equimolar), K es G o T (nominalmente equimolar (y x es
normalmente hasta aproximadamente 5, 6, 7 u 8 o más, produciéndose
por tanto bibliotecas de penta, hexa, hepta, y octapéptidos o más.
La tercera posición puede ser también G o C, designados "S". De
esta manera, NNK o NNS (i) codifica todos los aminoácidos, (ii)
codifica únicamente un codón de detención, y (iii) reduce el
intervalo de desviación del codón desde 6: 1 a 3:1. Existen 32
posibles codones resultantes del motivo NNK. 1 para cada uno de 12
aminoácidos, 2 para cada uno de 5 aminoácidos, 3 para cada uno de 3
aminoácidos, y únicamente uno de los tres codones de detención. Con
péptidos más largos, el tamaño de la biblioteca que se genera puede
convertirse en una restricción en el procedimiento de clonación,
pero se pueden muestrear bibliotecas más grandes.
Un motivo de codón (NNK)_{x} a modo de
ejemplo produce 32 codones, uno para cada uno de 12 aminoácidos,
dos para cada uno de cinco aminoácidos, tres para cada uno de tres
aminoácidos y un codón de detención (ámbar). Aunque este motivo
produce una distribución de codones tan igualitaria como es posible
con los procedimientos estandarizados de síntesis de
oligonucleótidos, da como resultado una desviación contra los
péptidos que contienen restos con un de codón. Por ejemplo, una
colección completa de hexacodones contiene una secuencia que
codifica cada péptido compuesta por un único codón de aminoácidos,
pero contiene 729 (3^{6}) secuencias que codifican cada péptido
con tres codones de aminoácidos.
Una solución alternativa que minimiza la
desviación frente a un resto de codón implica la síntesis de 20
trinucleótidos activados, representando cada uno el codón de uno de
los 20 aminoácidos codificados genéticamente. Estos trinucleótidos
se sintetizan por medios convencionales, se retiran del soporte con
la base y los grupos protectores 5-OH intactos, y
se activan mediante la adición de
3'-O-fosforoamidita (y protección
del fosfato con grupos beta-cianoetilo) mediante el
procedimiento usado para la activación de mononucleósidos descrito
en McBride y Caruthers, 1983, Tetr. Letters 22: 245, que se
incorpora por referencia en el presente documento.
Se prepararon "oligocodones" degenerados
usando estos trímeros como bloques de construcción. Se mezclaron
los trímeros a las relaciones molares deseadas y se instalaron en el
sintetizador. Las relaciones serán usualmente equimolares, pero
puede ser una relación desigual controlada para obtener desde la
sobre-hasta la infrarrepresentación de algunos
aminoácidos codificados por la colección de oligonucleótidos
degenerados. Se llevó a cabo la condensación de los trímeros para
formar los oligocodones esencialmente según se ha descrito para la
síntesis convencional empleando mononucleósidos activados como
bloques de construcción. Véase generalmente, Atkinson y Smith, 1984,
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.), pp.
35-82. Este procedimiento genera una población de
oligonucleótidos para clonación que es capaz de codificar una
distribución equitativa (o una distribución desigual controlada) de
las posibles secuencias de péptidos. Esta solución puede ser
especialmente útil en la generación de secuencias de péptidos más
largas, debido a que aumenta el intervalo de desviación producido
por el motivo (NNK)_{X} en tres veces con cada resto de
aminoácido adicional.
Cuando el motivo del codón es
(NNK)_{X}, según se ha definido anteriormente, y cuando X
es igual a 8, existen 2,6 x 10^{10} octapéptidos posibles. Se
puede producir una biblioteca que contenga la mayor parte de los
octapéptidos, pero se puede construir más convenientemente un
muestreo de los octapéptidos preparando únicamente un subconjunto
de la biblioteca usando aproximadamente un 0,1% y hasta tanto como
un 1%, 5%, o 10% de las posibles secuencias, cuyo subconjunto de
vectores recombinantes se criba a continuación. A medida que el
tamaño de la biblioteca aumenta, son aceptables porcentajes más
pequeños. Si se desea, para extender la diversidad de un
subconjunto de biblioteca se puede someter el subconjunto de
vectores recuperado a mutagénesis y a continuación someterlos a
posteriores ciclos de cribado. Esta etapa de mutagénesis puede
llevarse a cabo de dos formas generales: se puede mutagenizar la
región variable del fago recuperado o se pueden añadir aminoácidos
variables adicionales a las regiones adjuntando las secuencias
variables iniciales.
Los ejemplos de otros tipos de bibliotecas de
péptidos aleatorios que se han construido incluyen los siguientes:
(NNK)_{10}, TGT(NNK)_{n}TGT,
(NNK)_{2}TGT(NNK)_{14}TGT
(NNK)_{2}, TGT(NNK)_{9},
(NNK)_{2}TGT(NNK)_{18}.
La presente invención proporciona bibliotecas de
fagos con péptidos de transferrina (Tf) que contienen una
pluralidad de proteínas de fusión comprendiendo cada una de ellas
una proteína transferrina o un polipéptido fusionado a un péptido,
en el que el péptido de Tf tiene una reducida afinidad por un
receptor de la transferrina (TfR). La proteína transferrina o el
polipéptido actúa como estructura en la biblioteca de péptidos. La
estructura de la transferrina podría ser una proteína transferrina
natural o una proteína transferrina modificada (mTf) o polipéptido.
Por ejemplo, la estructura de Tf podría ser una lactoferrina o la
proteína Tf podría presentar una glicosilación reducida. La
estructura de Tf comprendería al menos una sustitución, delección o
adición de aminoácidos en cualquier región tal como un
emplazamiento de glicosilación, región de unión al receptor o al
hierro, u otras áreas tales como la región bisagra.
En una realización, la presente invención
proporciona un sistema que utiliza la región N de la Transferrina,
M13 y pIII. Otras combinaciones posibles son la secuencia completa
de la transferrina o sus derivados, la región doble N (NN) de Tf,
los vectores de fago alternativos, por ejemplo, T7 o las proteínas
recubiertas, por ejemplo pVIII en M13.
Según se ha descrito anteriormente respecto a la
generación de las proteínas de fusión de la Tf, se podrían unir
diversas porciones de Tf y mTf con los péptidos terapéuticos. Por
ejemplo, la estructura de Tf comprendería una porción de la región
N de una proteína Tf, un péptido puente y una porción de la región C
de un péptido Tf. Preferiblemente, la estructura de la transferrina
comprende o está constituida por la región N de una proteína Tf. La
estructura de la transferrina podría comprender también una porción
o subdominio de la región N de una proteína Tf. Alternativamente,
la estructura de Tf comprende o está constituida por la región C de
una proteína Tf; la estructura de la transferrina podría comprender
también una porción de la región C de una proteína Tf.
Los péptidos de la biblioteca podrían tener
diferentes tamaños y secuencias. por ejemplo, los péptidos podrían
contener 6 o más aminoácidos, aproximadamente 4 a 30 aminoácidos,
aproximadamente 6 a 25 aminoácidos, aproximadamente 8 a 20
aminoácidos, aproximadamente 10 a 18 aminoácidos, y aproximadamente
12 a 16 aminoácidos. Adicionalmente, los péptidos podrían
comprender aproximadamente 6, 9, 12, 16, o 19 aminoácidos. En
algunas realizaciones, los péptidos tienen aproximadamente 6
aminoácidos, el tamaño de un epitopo.
Los péptidos se podrían fusionar al extremo C
terminal de la estructura de Tf o al extremo N terminal de la
estructura de Tf. Se podrían insertar también los péptidos en un
bucle de un péptido de Tf. Los péptidos podrían también sustituir
una porción del péptido de Tf. Los péptidos podrían también
sustituirse o insertarse en uno o más de los bucles de la
estructura de Tf. La presente memoria descriptiva proporciona las
descripciones para preparar proteína de fusión de la Tf deseables.
Por ejemplo, se podrían fusionar los péptidos a la estructura de Tf
de la misma manera anteriormente descrita para las proteínas de
fusión de la Tf.
Los péptidos se podrían fusionar a la estructura
de Tf directamente o a través de uno o más ligantes o separadores.
El objetivo del ligante o separador es permitir que el péptido
retenga su conformación activa para enlazarse a su diana. El
ligante o separador puede comprender restos de poliglicina para la
flexibilidad o restos de poliprolina para la rigidez o una
combinación de ambas. El ligante o el separador puede incluir
también restos de Cy para añadir estabilidad mediante la formación
de puentes disulfuro. El ligante o el separador pueden incluir
también restos hidrófilos tales como Thr, His, Asn, Gln, Arg, Glu,
Asp, Met, Lys, etc. El ligante o el separador puede
comprender también restos hidrófobos tales como Phe, Leu, Ile, Gly,
Val, Ala, etc. El número de restos en el ligante o el separador
variará dependiendo de la proteína de fusión, y/o los péptidos
aleatorios.
Existen muchas ventajas en el uso de la Tf como
proteína estructural en una biblioteca de péptidos. En primer
lugar, Tf es una proteína endógena y se puede usar directamente con
objetivos terapéuticos en comparación con otros sistemas tales como
la presentación de fago normalizada que utiliza una proteína
completamente extraña que no se puede usar terapéuticamente debido
a que producirá una reacción inmunógena. En una biblioteca de
presentación de fago, la proteína Tf se puede insertar en la
proteína del fago con un componente péptido, y, en algunos
ejemplos, una proteína Tf puede sustituir la estructura de la
proteína del fago. Segundo, los péptidos tienen una semivida corta
in vivo y no son terapéuticamente útiles. Debido a que Tf y
mTf tienen semividas prolongadas en circulación, los péptidos
fusionados a Tf tienen una semivida prolongada. Los péptidos de las
bibliotecas de péptidos de Tf pueden tener una semivida
significativa in vivo debido a la presencia del esqueleto de
Tf. Tercero, los péptidos son a menudo insolubles en disolución
acuosa, mientras que la Tf es muy soluble, incluso a
concentraciones elevadas. Los péptidos de las bibliotecas de
péptidos de Tf son solubles por lo que pueden contribuir poco a las
propiedades físicas globales de la proteína de fusión. De esta
manera Tf es una estructura perfecta para los péptidos insolubles en
disolución acuosa. Cuarto, se puede preparar Tf en sistemas
microbianos tales como levaduras, lo que permite la producción a
gran escala y el cribado de grandes bibliotecas de péptidos.
Quinto, las bibliotecas de péptidos se preparan generalmente con
los péptidos localizados en configuraciones tridimensionales
específicas, a diferencia de las bibliotecas de péptidos de la
presente invención. Puesto que se pueden usar diversas regiones de
Tf para localizar las bibliotecas de péptidos tales como los
términos N y C y los bucles expuestos en el interior de la proteína,
se pueden construir bibliotecas con péptidos de movimiento libre en
el término N o el C y restringirse estructuralmente los péptidos
insertados en el interior de la transferrina. Sexto, la estructura
de la transferrina permite múltiples copias de secuencias de
péptidos únicos o múltiples péptidos diferentes para insertarse en
la misma molécula de la Tf. De hecho, la estructura de Tf podría
contener otros restos de péptidos que faciliten el cribado, la
identificación, o la producción del péptido.
Existen numerosas bibliotecas para producir y
cribar péptidos. Se han identificados numerosos péptidos con
afinidad de unión a ligandos específicos usando estas bibliotecas.
Sin embargo, el producto final identificado a partir de estas
bibliotecas es normalmente un péptido corto con uso terapéutico
limitado. También, en algunas bibliotecas, tal como una biblioteca
de presentación de fago normalizada, el péptido funciona en el
contexto de la proteína del fago, pero el péptido puede quedar
inactivo cuando se escinde, o incluso cuando se vuelve a insertar
en una nueva proteína estructural. Por otra parte, usando la
biblioteca de péptidos de Tf de la presente invención, se puede
identificar un péptido en la Tf o la MTf que se une a las moléculas
deseadas o que tiene la propiedad deseada, en la que el resto de
péptido está ya contenido en la proteína terapéutica final, es
decir, la proteína de fusión de la Tf. Adicionalmente, se puede
escalar la producción del péptido identificado con objetivos
terapéuticos. Si la estructura de Tf es una porción de Tf, tal como
la región N de Tf, se puede insertar el péptido seleccionado en un
emplazamiento análogo en la Tf de longitud completa para
proporcionar un derivado de la Tf de longitud completa con
propiedades de unión conferidas por el péptido insertado.
La presente invención proporciona constructos de
Tf y mTf para generar diversas bibliotecas de péptidos de Tf o mTf.
Los constructos de Tf y mTf contienen varios emplazamientos de
restricción para la adición, inserción, o sustitución de los
péptidos aleatorios. Está dentro del conocimiento de la persona
experta en la técnica generar constructos de péptidos aleatorios
que podrían añadirse a o insertarse en la Tf y los constructos de
mTf en la orientación apropiada.
A continuación se puede cribar la biblioteca de
los péptidos con la afinidad deseada para una molécula específica.
Una vez que se identifica el clon que codifica el péptido, se hace
crecer a gran escala y se purifica para estudios in vivo y/o
in vitro.
La presente invención emplea preferiblemente un
vector de expresión capaz de producir elevados niveles -del péptido
o el fragmento de proteína presentado en una estructura de Tf. La
elección del promotor usado para impulsar la expresión de la
estructura de Tf depende del ensayo usado para el cribado. En
general se prefieren los promotores fuertes, debido a que
facilitarán mayores niveles de expresión de las secuencias de la
biblioteca en las células huésped escogidas. Se pueden derivar
dichos promotores de los genes domésticos que se expresan a
elevados niveles en la mayor parte o en todos los tipos celulares en
el organismo o procedente de virus. Se conocen en la técnica
numerosas de dichas secuencia cis reguladoras, adecuadas para
impulsar la expresión en células de mamíferos, células de insectos,
células de plantas, hongos o bacterias (Ausubel y col., 1996). Por
ejemplo, en eucariotas, es útil el promotor de la beta actina (Qin
Z., Kruger-Krasagakes S. y col., J. Exp. Med. 178:
355-360); en plantas el promotor 35S del Virus del
Mosaico de la Coliflor (Goddijn O. J., Pennings E. J., y col.,
Transgenic Res. 1995 4: 315-323). En células de
mamíferos se usa comúnmente el promotor del citomegalovirus; y en
general, se puede identificar un promotor que impulse elevados
niveles de expresión de, por ejemplo, un gen doméstico o vírico con
relativa facilidad usando procedimientos corrientes de genética
molecular.
En una biblioteca de péptidos, se construyen los
vectores recombinantes de tal manera que el péptido aleatorio se
expresa como un producto de fusión; el péptido se fusiona con una
proteína estructural. Se puede insertar también el péptido en la
estructura de Tf.
Se pueden insertar de diversos modos las
secuencias de ADN generadas como oligonucleótidos sintéticos o como
ADNc o ADN genómico en vectores de expresión apropiados. Se conocen
en la técnica dichos procedimientos para la preparación e
inserción, la ligadura y la transformación del vector (Ausebel y
col, más arriba). En general, es necesario producir un vector
que tenga un emplazamiento de restricción apropiado para insertar
el ADN extraño en el gen estructural, con el fin de producir un
vector lineal de manera que el emplazamiento esté disponible para
ligadura, para mezclar los ADN del vector y del inserto de la
biblioteca en condiciones adecuadas de reacción, para permitir
proceder a la ligadura durante el tiempo suficiente, y para
introducir el material ligado en un huésped adecuado tal como, por
ejemplo, E. coli de tal manera que se puedan seleccionar
clones individuales (preferiblemente unos pocos millones) para los
experimentos adicionales.
Se puede conectar la proteína de fusión con el
péptido aleatorio de Tf en una biblioteca de péptidos mediante un
separador o un enlazante, El separador o el enlazante sirven para
colocar las dos moléculas de la proteína de fusión en una
configuración preferida. Los restos del separador o el enlazante
pueden ser algo flexibles, comprendiendo poliglicina, por ejemplo,
para proporcionar diversidad a las regiones de la biblioteca con la
capacidad de interactuar con los emplazamientos en un emplazamiento
de unión grande relativamente no restringido por la unión a la
estructura de Tf. Se pueden insertar también separadores rígidos
tales como, por ejemplo, poliprolina, libremente o en combinación
con otros separadores, que incluyen restos de glicina. Las regiones
variables pueden estar próximas entre sí, sirviendo para orientar
una región variable con respecto a la otra, tal como empleando un
giro entre las dos secuencias como proporcionaría un separador de la
secuencia Gly-Pro-Gly, por ejemplo.
Para añadir estabilidad a dicho giro, puede ser deseable o necesario
añadir restos de cisteína a cualquiera o a ambos extremos de cada
región variable. A continuación, los restos Cys formarían puentes
disulfuro para mantener las regiones variables juntas en un bucle, y
de esta manera pueden servir también para imitar un péptido
cíclico. Por supuesto, las personas expertas en la técnica
apreciarán que se pueden realizar varios tipos diferentes de
enlaces covalentes para la ciclación.
Los restos del separador descritos anteriormente
también se pueden codificar en cualquiera o en ambos extremos de la
región de nucleótidos variables. Por ejemplo, se puede fabricar la
secuencia de codificación del péptido aleatorio sin que intervenga
un separador teniendo un codón Cys en ambos extremos de la secuencia
de codificación del péptido aleatorio con las dianas seleccionadas.
Alternativamente, los separadores rígidos pueden permitir presentar
al péptido como si estuviera en el extremo de un brazo rígido, en el
que el número de restos, por ejemplo, Pro, determina no sólo
la longitud del brazo sino también la dirección del brazo en el que
el péptido se orienta. Se pueden usar separadores hidrófilos,
fabricados de aminoácidos hidrófilos cargados y/o no cargados
(por ejemplo, Thr, His, Asn, Gln, Arg, Glu, Asp, Met, Lys,
etc.), o separadores hidrófobos fabricados de aminoácidos
hidrófobos (por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Gly, Val, Ala, etc.)
para presentar los péptidos a los emplazamientos de unión con una
variedad de ambientes locales.
Por ejemplo, se puede construir una biblioteca
de péptidos aleatorios que codifique una proteína de unión al ADN,
de tal manera que el represor lac o un represor lac sin cisteína, un
péptido aleatorio de fórmula NNK_{5} (se podrían usar también
secuencias hasta y que incluyan NNK_{10} o NNK_{5}) fusionado a
Tf, y un ligando de péptido de especificidad conocida. Se cribaría
a continuación la biblioteca para mejorar la unión del ligando del
péptido con el receptor específico del ligando usando el
procedimiento de la presente invención; se aislarían las proteínas
de expresión que presenten especificidad mejorada junto con el
vector que las codifica, y se secuenciaría el vector para
determinar la estructura del separador responsable de la mejora de
la unión.
El número de posibles moléculas diana para las
que se pueden identificar ligandos peptídicos mediante cribado de
bibliotecas de péptidos es virtualmente ilimitado. Por ejemplo, la
molécula diana puede ser un anticuerpo (o una porción de unión del
mismo) El antígeno al cual se une el anticuerpo puede ser conocido
y quizá incluso secuenciado, en cuyo caso, se puede usar la
invención para mapear los epitopos del antígeno, lo que estimula la
respuesta inmune. Si el antígeno es desconocido, tal como con
algunas enfermedades autoinmunes, se puede usar, por ejemplo, el
suero, los fluidos, el tejido, o las células de los pacientes en el
presente procedimiento de cribado para identificar los péptidos y,
en consecuencia, el antígeno, que estimula la respuesta inmune. Una
vez se ha identificado un péptido, este péptido puede servir como, o
proporcionar la base para, el desarrollo de una vacuna, un agente
terapéutico, un reactivo para diagnóstico, etc.
El cribado se puede llevar a cabo usando uno de
los procedimientos bien conocidos por el especialista en la
técnica, tal como presentación de fago, fago selectivamente
infectivo, cribado por unión, sistemas de ensayo de la actividad
enzimática o la estabilidad de la proteína. Se pueden identificar
los polipéptidos y los péptidos que tienen la propiedad deseada
mediante secuenciación de la secuencia correspondiente de ácidos
nucleicos o mediante la secuenciación de los aminoácidos o la
espectrometría de masas. En el caso de optimización posterior, se
pueden usar opcionalmente las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican los polipéptidos y los péptidos inicialmente
seleccionados sin secuenciación. Se lleva a cabo la optimización
repitiendo la sustitución de las subsecuencias por secuencias
diferentes, preferiblemente por secuencias aleatorias, y la etapa de
cribado una o más veces.
Una biblioteca de péptidos de Tf es
especialmente útil en el cribado de los péptidos que se unen a una
molécula diana de interés. Como ejemplo, un procedimiento de cribado
puede comprender las etapas de (a) lisar las células transformadas
con la biblioteca de péptidos de Tf bajo condiciones tales que la
proteína de fusión permanezca unida al vector que codifica la
proteína de fusión; (b) poner en contacto las proteínas de fusión
de la Tf de la biblioteca de péptidos con un receptor bajo
condiciones que conduzcan a la unión específica
péptido-receptor; y (c) aislar el vector que
codifica el péptido que se une a dicho receptor. Mediante la
repetición del procedimiento de selección por afinidad una o más
veces, se pueden enriquecer los vectores que codifican los péptidos
de interés. Con el aumento en la restricción de la selección, se
pueden identificar los péptidos con afinidad creciente. Si la
presencia de proteínas citoplásmicas o periplásmicas interfiere con
la unión de la proteína de fusión a la molécula diana, entonces, se
puede usar la purificación parcial de los complejos de proteína de
fusión-plásmido mediante filtración en gel,
afinidad, u otros procedimientos de purificación para evitar dicha
interferencia.
Una vez construida la biblioteca de péptidos de
Tf, las células huésped se transforman, con los vectores de la
biblioteca. Se seleccionan normalmente los transformantes
satisfactorios por crecimiento en un medio selectivo o bajo
condiciones selectivas, por ejemplo, un antibiótico
apropiado, tal como ampicilina u otros dependiendo del vector
usado. Se puede llevar a cabo esta selección en un medio de
crecimiento sólido o líquido. Para el crecimiento de las células
bacterianas en medio sólido, las células se hacen crecer a una
densidad elevada (aproximadamente 10^{8} a 10^{9}
transformantes por m^{2}) sobre una superficie grande de, por
ejemplo, L-agar conteniendo el antibiótico selectivo
para formar esencialmente un pasto confluente. Para el crecimiento
en cultivo líquido, las células se pueden hacer crecer en caldo L
(con selección del antibiótico) con aproximadamente 10 o más
duplicaciones. Puede ser más conveniente el crecimiento en cultivo
líquido debido al tamaño de las bibliotecas, mientras que el
crecimiento en medios sólidos proporciona probablemente menos
posibilidades de desviación durante el procedimiento de
amplificación.
En algún momento durante el crecimiento de los
transformantes, se expresará la proteína de fusión. Las células que
contienen una biblioteca se lisan, y los complejos se purifican
parcialmente de los residuos celulares. Tras la lisis celular, se
debe evitar la reacción cruzada entre las proteínas de fusión no
unidas de una célula con las moléculas de ADN heterólogo de otra
célula.
Tras la lisis celular, en un procedimiento
denominado inmunoadsorción, los complejos
plásmido-péptido que se unen específicamente a los
receptores inmovilizados se separan de los complejos no unidos, que
se eliminan por lavado. Se puede incluir ADN en masa durante las
etapas de lisis e inmunoadsorción para competir con los
emplazamientos de unión no específica y disminuir el fondo de unión
no específica al receptor para el receptor inmovilizado. Se pueden
usar diferentes procedimientos de lavado para enriquecer la
retención de moléculas con intervalos de afinidad deseados. Por
enriquecimiento por afinidad de los clones deseados, entre 10^{2}
y 10^{6} equivalentes de biblioteca (un equivalente de biblioteca
es uno de cada recombinante; 10^{4} equivalentes de una
biblioteca de 10^{9} miembros corresponde a 1013 vectores), pero
típicamente de 10^{3} a 10^{4} equivalentes de una biblioteca
se incuban con un receptor (o porción del mismo) para el que se
desea un ligando peptídico. El receptor está en una de varias formas
adecuada para los esquemas de enriquecimiento por afinidad. En un
ejemplo, el receptor se inmoviliza sobre la superficie de una
partícula, y a continuación la biblioteca se inmunoadsorbe sobre el
receptor inmovilizado generalmente según el procedimiento descrito a
continuación.
El procedimiento de cribado implica la reacción
de la biblioteca de péptidos de la Tf con la diana de interés para
establecer un nivel inicial de enlace frente al que comparar las
actividades de enlace de las posteriores bibliotecas de péptidos.
La unión se puede determinar mediante una variedad de procedimientos
de ensayo bien conocidos, por ejemplo, mediante ELISA,
ensayos de unión competitiva cuando el compañero de enlace del
péptido natural es conocido, ensayos en sándwich, ensayos de
radiorreceptores usando un ligando radiactivo cuyo enlace está
bloqueado por la biblioteca de péptidos, etc. La naturaleza del
ensayo no es crítica, siempre que sea lo suficientemente sensible
para detectar pequeñas cantidades de unión del péptido o para
competir por unión con la diana. Las condiciones de ensayo pueden
variarse para tomar en consideración las condiciones óptimas de
enlace para diferentes uniones con sustancias de interés u otras
actividades biológicas. Así, el pH, temperatura, concentración de
sales, volumen y duración de la unión, etc. Pueden variarse para
conseguir la unión del péptido a la diana en condiciones que se
parezcan a las del entorno de interés.
Una vez que se ha determinado que la biblioteca
de péptidos de la Tf posee un péptido o péptidos que se unen con la
diana de interés, se pueden usar los procedimientos iterativos de la
invención para identificar la secuencia del(de los)
péptido(s) en la mezcla. Los aminoácidos se dividen en
grupos, convenientemente en tres grupos con un tamaño
aproximadamente igual. Por ejemplo, la proporción del primer grupo
(designado como "\alpha") está disminuida, la proporción del
segundo grupo (designado como "\beta") está aumentada, y la
proporción del tercer grupo (designado como "\gamma")
permanece inalterada. Cuando la concentración de un grupo varía,
debe disminuirse hasta el punto en que se omita completamente, o
puede incrementarse en dos o tres veces la concentración molar
del(de los) otro(s)
grupo(s). Se determina a continuación el efecto de cambiar la concentración de los aminoácidos en un grupo particular para cada posición del péptido, así como la contribución de dichos aminoácidos en dicho grupo determinada para esa posición en el péptido. Basándose en estas determinaciones, el procedimiento se repite usando subconjuntos de los grupos contribuyentes en cada posición, hasta que finalmente se determina la secuencia de los uno o más péptidos en la mezcla que se unen al ligando.
grupo(s). Se determina a continuación el efecto de cambiar la concentración de los aminoácidos en un grupo particular para cada posición del péptido, así como la contribución de dichos aminoácidos en dicho grupo determinada para esa posición en el péptido. Basándose en estas determinaciones, el procedimiento se repite usando subconjuntos de los grupos contribuyentes en cada posición, hasta que finalmente se determina la secuencia de los uno o más péptidos en la mezcla que se unen al ligando.
Una vez identificado un péptido como ligando de
interés, se pueden usar diferentes técnicas para diferenciar una
biblioteca del péptido Tf para construir ligandos con propiedades
mejoradas. En una solución, los vectores positivos (los
identificados en un ciclo temprano de inmunoadsorción) se
secuenciaron para determinar la identidad de los péptidos activos.
A continuación, se sintetizaron oligonucleótidos basados en estas
secuencias de péptido, empleando todas las bases en cada etapa a
concentraciones diseñadas para producir ligeras variaciones en las
secuencias primarias de los oligonucleótidos. Esta mezcla de
oligonucleótidos (ligeramente) degenerada se clonó seguidamente en
el vector de expresión de la biblioteca de péptidos. Este
procedimiento produce variaciones sistemáticas y controladas de las
secuencias del péptido inicial pero requiere, sin embargo, la
secuenciación de los vectores individuales positivos antes de la
mutagénesis. Este procedimiento es útil para expandir la diversidad
de pequeñas cantidades de vectores recuperados.
Otra técnica para diversificar un péptido
seleccionado implica una sutil incorporación incorrecta de cambios
de nucleótidos en la secuencia de codificación del péptido mediante
el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en
condiciones de baja fidelidad. Un protocolo descrito en Leung y
col., 1989, Technique 1:11-15, utiliza relaciones
de nucleótidos alteradas y la adición de iones manganeso para
producir una frecuencia de mutaciones del 2%.
Otra solución adicional para diversificar un
vector péptido aleatorio seleccionado implica la mutagénesis de una
combinación, o subconjunto, de vectores recuperados. Células huésped
recombinantes transformadas con vectores recuperados por
inmunoadsorción se combinan y aíslan. Al ADN del vector se
mutageniza por tratamiento de las células con, por ejemplo,
ácido nitroso, ácido fórmico, hidracina, o mediante el uso de una
cepa mutante. Estos tratamientos producen una variedad de
mutaciones en el ADN del vector. El segmento que contiene la
secuencia que codifica el péptido variable puede aislarse
opcionalmente cortando con endonucleasa(s) de restricción
específicas de los emplazamientos que flanquean la región variable y
posteriormente se vuelve a clonar en el ADN del vector no dañado.
Alternativamente, los vectores mutagenizados se pueden usar sin
reclonar la secuencia que codifica el péptido aleatorio
mutagenizado.
En la segunda solución general para diversificar
un conjunto de péptidos ligando, el de añadir aminoácidos
adicionales a un péptido o péptidos activo(s) están
disponibles diferentes procedimientos. En uno, se determinan
individualmente las secuencias de los péptidos seleccionados en una
inmunoadsorción temprana, y se sintetizan oligonucleótidos nuevos
que incorporan todo o parte de la secuencia determinada y una
secuencia degenerada adjunta. Estos se clonan continuación para
producir una biblioteca de Tf secundaria.
En otra solución que añade una segunda región
variable a una combinación de vectores de expresión de péptido
aleatorio, se instala un emplazamiento de restricción al lado de la
primera región variable. Preferiblemente, la enzima se debería
cortar por el exterior de su secuencia de reconocimiento, tal como
BspMI, que se corta dejando un saliente 5' de cuatro bases,
cuatro bases 3' desde el emplazamiento de reconocimiento. De esta
forma, el emplazamiento de reconocimiento puede ubicarse a cuatro
bases desde la primera región degenerada. Para insertar una segunda
región variable, se liga a continuación un oligonucleótido
sintetizado degenerativamente en este emplazamiento para producir
una segunda región variable yuxtapuesta a la primera región
variable. Esta biblioteca secundaria seguidamente se amplifica y se
criba como anteriormente.
Aunque en algunos casos puede ser apropiado
sintetizar péptidos que tengan regiones variables contiguas para
enlazarse a ciertos receptores, en otros casos puede ser deseable
proporcionar péptidos que tengan dos o más regiones de diversidad
separadas por restos separadores. Por ejemplo, las regiones
variables pueden estar separadas por separadores que permiten que
diversas regiones de los péptidos se presenten al receptor de
diferentes maneras. La distancia entre regiones variables puede ser
tan corta como un resto o tan larga como de cinco a diez hasta
aproximadamente 100 restos. Por ejemplo, para sondear un
emplazamiento de enlace grande, se pueden construir regiones
variables separadas por un separador que contiene de 20 a 30
aminoácidos. El número de restos separadores, cuando están
presentes, será de al menos de dos a tres o más pero usualmente
será inferior a de ocho a diez. Una biblioteca de oligonucleótidos
que tiene regiones variables separadas por separadores se puede
representar por la fórmula:
(NNK)_{y}- -(abc)_{n}- -(NNK)_{z},
en la que N y K son como se ha definido anteriormente (resaltar que S como se ha definido anteriormente se puede sustituir por K); y+z es igual a aproximadamente 5, 6, 7, 8, o más; a, b y c representan nucleótidos iguales o diferentes que comprenden un codón que codifican aminoácidos separadores; y n es hasta aproximadamente de 20 a 30 codones o más. Alternativamente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf. Adicionalmente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf. Se pueden insertar otras regiones variables adicionales en el bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf o en el bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf.
en la que N y K son como se ha definido anteriormente (resaltar que S como se ha definido anteriormente se puede sustituir por K); y+z es igual a aproximadamente 5, 6, 7, 8, o más; a, b y c representan nucleótidos iguales o diferentes que comprenden un codón que codifican aminoácidos separadores; y n es hasta aproximadamente de 20 a 30 codones o más. Alternativamente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf. Adicionalmente, se puede insertar una segunda región variable en un bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf. Se pueden insertar otras regiones variables adicionales en el bucle expuesto adyacente en la estructura de la Tf o en el bucle no adyacente no expuesto a la superficie en la estructura de la Tf.
Salvo que se modifique durante o tras la
síntesis por la maquinaria de traducción, las bibliotecas de
péptido de Tf recombinante están constituidas por secuencias de los
20 L-aminoácidos normales. Aunque la diversidad
estructural disponible para una biblioteca de ese tipo es grande, se
puede introducir diversidad adicional por diferentes medios, tales
como modificaciones químicas de los aminoácidos. Por ejemplo,
una fuente para añadir diversidad a una biblioteca
C-terminal del péptido Tf de la invención puede ser
someterla a amidación del carboxilo terminal. La amidación del
carboxilo terminal es necesaria para la actividad de muchos péptidos
bioactivos de origen natural. Esta modificación se produce in
vivo por rotura del enlace N-C del carboxilo
terminal de un resto Gly en una reacción en dos etapas catalizada
por las enzimas peptidiglicina alfa-amidación
monooxigenasa (PAM) e hidroxiglicina aminotransferasa (HGAT). Véase,
Eipper y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:7827-7833;
Mizuno y col., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137(3):
984-991; Murthy y col., 1986, J. Biol. Chem.
261(4): 1815-1822; Katopodis y col., 1990,
Biochemistry 29: 6115-6120; y Young y Tamburini,
1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1933-1934, cada una de
las cuales se incorpora por referencia al presente documento.
La amidación se puede realizar por tratamiento
con enzimas, tales como PAM y HGAT, in vivo o in
vitro, y en condiciones que conduzcan al mantenimiento de la
integridad estructural de la proteína de fusión. En una biblioteca
aleatoria C-terminal del péptido Tf de la presente
invención, la amidación se producirá en un subconjunto de la
biblioteca, es decir, aquellos péptidos que tengan un
carboxilo terminal de Gly. Se puede construir una biblioteca de
péptidos diseñada para amidación introduciendo un codón de Gly en el
extremo de la región variable de la biblioteca. Tras la amidación,
una biblioteca enriquecida sirve como fuente particularmente eficaz
de ligandos para receptores que preferiblemente se unen a péptidos
amidados. Muchos de los péptidos bioactivos con el término C
amidado se procesan en prohormonas de mayor tamaño, en las que el
péptido amidado se flanquea en su término en C por la
secuencia
-Gly-Lys-Arg-X ... (SEC. DE ID Nº: 35) (en la que X es cualquier aminoácido). Se pueden ubicar oligonucleótidos que codifiquen la secuencia -Gly-Lys-Arg-X-Stop en el extremo 3' de la región oligonucleótida variable. Cuando se expresa, la Gly-Lys-Arg-X (SEC. DE ID Nº: 35) se elimina por tratamiento enzimático in vivo o in vitro, y la biblioteca de péptidos queda amidada en su extremo carboxilo.
-Gly-Lys-Arg-X ... (SEC. DE ID Nº: 35) (en la que X es cualquier aminoácido). Se pueden ubicar oligonucleótidos que codifiquen la secuencia -Gly-Lys-Arg-X-Stop en el extremo 3' de la región oligonucleótida variable. Cuando se expresa, la Gly-Lys-Arg-X (SEC. DE ID Nº: 35) se elimina por tratamiento enzimático in vivo o in vitro, y la biblioteca de péptidos queda amidada en su extremo carboxilo.
Se pueden introducir otras modificaciones
encontradas en los péptidos y proteínas de origen natural en las
bibliotecas de Tf para proporcionar diversidad adicional y para
contribuir a la actividad biológica deseada. Por ejemplo, la
biblioteca de regiones variables puede estar provista de codones que
codifican restos de aminoácido implicados en la fosforilación,
glicosilación, sulfatación, isoprenilación (o la adición de otros
lípidos), etc. Se pueden introducir modificaciones no catalizadas
por enzimas de origen natural por medios químicos (en condiciones
relativamente suaves) o por la acción de, por ejemplo,
anticuerpos catalíticos y similares. En la mayor parte de los
casos, una estrategia eficaz para la construcción de bibliotecas
implica la especificación del emplazamiento de reconocimiento del
sustrato enzimático (o químico) en o adyacente a la región
nucleotídica variable de la biblioteca de manera que la mayor parte
de los miembros de la biblioteca queden modificados. El
emplazamiento de reconocimiento del sustrato añadido puede ser un
único resto (por ejemplo, serina para la fosforilación) o
una secuencia de consenso compleja, según se desee.
Se pueden introducir también restricciones
conformacionales, o estructurales, en la estructura de las
bibliotecas de péptidos. Se pueden adaptar con este fin numerosos
motivos procedentes de estructuras conocidas de proteínas y
péptidos. El procedimiento implica introducir secuencias de
nucleótidos que codifiquen restos estructurales conservados en o
adyacentes a la región nucleotídica variable para contribuir a la
estructura deseada del péptido. Se deja que las posiciones no
esenciales para la estructura varíen.
Como ejemplo, la Patente de los Estados Unidos
nº 5.824.483 da a conocer bibliotecas combinatorias de péptidos de
diferente secuencia. Las bibliotecas están formadas por polipéptidos
estabilizados alfahelicoidales con una estructura terciaria similar
pero diferentes restos de aminoácido en posiciones "variables"
específicas de la secuencia. Los polipéptidos se estabilizan
mediante interacciones superenrolladas con otros polipéptidos con
\alpha-hélice y/o por puentes lactama
intrahelicoidales. También se dan a conocer procedimientos para usar
dichas bibliotecas para cribar ligandos macromoleculares
seleccionados.
Una "biblioteca de presentación de fago" es
una biblioteca para expresión de proteínas, por ejemplo
construida en un vector derivado de M13, que expresa una colección
de secuencias de proteínas clonadas. En este caso, una biblioteca
del péptido Tf en forma de fusiones con una proteína de
recubrimiento de fago. Así, en la presente invención, las proteínas
de fusión de transferrina que comprenden péptidos se expresan en la
parte exterior de una partícula de fago. Esto permite, por
ejemplo, el contacto y enlace entre el péptido de la proteína
de fusión y la molécula diana inmovilizada. Las personas normalmente
expertas en la técnica reconocerán que los clones de fago que
expresan proteínas de enlace a péptido específicas de un ligando o
receptor se pueden enriquecer sustancialmente mediante ciclos en
serie de enlace del fago al ligando inmovilizado, disociación del
ligando inmovilizado y amplificación por crecimiento en células
huésped bacterianas.
En los últimos años, muchas publicaciones han
informado del uso de la tecnología de presentación de fago para
producir y cribar bibliotecas de polipéptidos para enlace con una
diana seleccionada. Véase, por ejemplo, Cwirla y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382; (1990); Devlin y
col., Science 249, 404-406 (1990), Scott &
Smith, Science 249, 386-388 (1990); Ladner y col.,
Patente de los Estados Unidos Nº 5.571.698. Un concepto básico de
los procedimientos de presentación de fago es el establecimiento de
una asociación física entre el ADN que codifica un polipéptido a
cribar y el polipéptido. Esta asociación física se consigue mediante
la partícula de fago, que presenta un polipéptido como parte de la
cápsida que encierra el genoma del fago que codifica el
polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre los
polipéptidos y su material genético permite el cribado simultáneo
masivo de grandes cantidades de fagos que soportan diferentes
polipéptidos. Los fagos que presentan un polipéptido con afinidad
por una diana se unen a la diana. Estos fagos se enriquecen
mediante cribado por afinidad a la diana. La identidad de los
polipéptidos presentados desde estos fagos se puede determinar a
partir de sus respectivos genomas. Usando estos procedimientos, un
polipéptido identificado por tener una afinidad de enlace por una
diana deseada puede sintetizarse masivamente a continuación por
medios convencionales.
Existen numerosos tipos de biblioteca de
presentación de fago, incluyendo la presentación de fago no lítico
y la presentación de fago lítico. La presentación de fago no lítico
se deriva del fago bacteriano filamentoso M13 y emplea las
proteínas pIII, pVIII, o pVI del fago, y preferiblemente se fusiona
con péptidos aleatorios, péptidos o proteínas diseñados a medida, y
anticuerpos (Fv de fusión cadena de única a pIII). La presentación
de fago lítico está basada en el fago \lambda, T7 o T4.
Como se ha indicado, la aplicación de técnicas
eficaces de cribado a péptidos requiere el establecimiento de una
conexión física o lógica entre cada péptido Tf y el ácido nucleico
que codifica el péptido de la Tf de fusión. Tras ciclos de
enriquecimiento por afinidad, una conexión de este tipo permite la
identificación, normalmente mediante amplificación y secuenciación,
del material genético que codifica los péptidos de interés. Se
puede usar el enfoque de fusión de fago de Parmley y Smith, 1988,
Gene 73:305-318, para cribar proteínas. Otros
autores han descrito sistemas basados en fagos en los que el péptido
se fusiona a la proteína de recubrimiento pIII del fago filamentoso
(véase Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390;
Devlin y col., 1990, Science 249:404-406; y Cwirla y
col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:6378-6382).
En estas últimas publicaciones, los autores
describen la expresión de un péptido en el término amino o en el
interior de la proteína pIII. La conexión entre el péptido y el
material genético que codifica el péptido se establece debido a que
la proteína de fusión forma parte de la cápsida que encierra el ADN
genómico del fago. El fago que codifica los ligandos peptídicos
para los receptores de interés se puede aislar a partir de
bibliotecas de más de 10^{8} péptidos tras varios ciclos de
enriquecimiento por afinidad seguido por crecimiento del fago.
Por lo general, la presentación de una secuencia
de péptido, anticuerpo, u otra proteína se realiza en la superficie
de una partícula de bacteriófago o célula. Cada partícula de
bacteriófago o célula sirve como un miembro individual de la
biblioteca presentando una especie única del péptido presentado
además de las secuencias de proteínas del bacteriófago o célula
natural. Cada bacteriófago o célula contiene información acerca de
la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del péptido
concreto presentado; de esta forma, la secuencia del péptido
presentado se puede comprobar mediante la determinación de la
secuencia de nucleótidos de un miembros aislado de la
biblioteca.
Los procedimientos de presentación del péptido
Tf incluyen la presentación de una estructura de Tf fusionada con
una secuencia de péptido sobre la superficie de un bacteriófago
filamentoso, típicamente como una fusión con una proteína de
recubrimiento de bacteriófago. La biblioteca de bacteriófagos puede
incubarse con una molécula diana inmovilizada predeterminada
(por ejemplo, un receptor o molécula pequeña) de manera que
las partículas de bacteriófago que presentan una secuencia de
péptido que se une a la macromolécula inmovilizada se pueden
diferenciar de las que no presentan la secuencia de péptidos que se
une a la macromolécula predeterminada. Las partículas de
bacteriófago (es decir, los integrantes de la biblioteca) que
se enlazan con la macromolécula inmovilizada se recuperan a
continuación y se replican para amplificar la subpoblación de
bacteriófago seleccionada para un ciclo posterior de
enriquecimiento por afinidad y replicación de fago. Tras varios
ciclos de enriquecimiento por afinidad y replicación de fago, los
integrantes de la biblioteca de bacteriófagos se seleccionan y
aíslan de esta manera, y se determina la secuencia de nucleótidos
que codifica la secuencia del péptido mostrado, identificando de
esta manera la secuencia o secuencias de péptidos que se unen a la
macromolécula predeterminada (por ejemplo, receptor). Dichos
procedimientos se describen adicionalmente en las publicaciones de
patentes PCT con números 91/17271, 91/18980, y 91/19818 y
93/08278.
La tecnología de presentación de fago se ha
usado también para producir y cribar bibliotecas de proteínas
heterodiméricas tales como fragmentos Fab y sistemas de ese tipo que
se pueden usar para producir y cribar las bibliotecas de péptidos
Tf de la invención. Véase por ejemplo, Garrard y col.,
Bio/Tech 9, 1373-1377 (1991). Las bibliotecas de
presentación de fago de fragmentos Fab se producen expresando una de
las cadenas componentes en forma de una fusión con una proteína de
recubrimiento, igual que para la presentación de polipéptidos
monocatenarios. La cadena del anticuerpo compañero se expresa en la
misma célula procedente del mismo replicón o de uno diferente al de
la primera cadena, y el ensamblaje se produce en el interior de la
célula. De esta forma, un fragmento fago-Fab tiene
una cadena de anticuerpo fusionada a una proteína de recubrimiento
de fago de manera que se presenta desde la superficie externa del
fago y la otra cadena de anticuerpo está complejada con la con la
primera cadena. La presente invención también proporciona
bibliotecas de presentación de fago del péptido Tf que comprenden
una estructura de Tf fusionada con fragmentos de anticuerpo tales
como las CDR.
La Patente de los Estados Unidos Nº 6.555.310 da
a conocer dos mejoras relacionadas pero autosuficientes de los
procedimientos de presentación convencionales. La primera mejora
proporciona procedimientos para enriquecer bibliotecas de
presentación convencionales para los miembros que presentan más de
una copia de un polipéptido antes del cribado por afinidad de
dichas bibliotecas con una diana de interés. Estos procedimientos
pueden conseguir poblaciones diversas en la que la gran mayoría de
los miembros retienen secuencias de codificación de longitud
completa que codifican polipéptidos con afinidad específica por la
diana. En un segundo aspecto, la invención proporciona
procedimientos para subclonar ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos presentados de bibliotecas enriquecidas procedentes de
un vector de presentación hasta un vector de expresión sin necesidad
de aislamiento clonal de los miembros individuales. Estos
procedimientos dan como resultado bibliotecas de anticuerpos
policlonales y otros polipéptidos para uso, por ejemplo, como
reactivos para diagnóstico o terapia.
Las bibliotecas de la invención para la
expresión en la superficie de Tf se pueden cribar para péptidos
específicos que se unen a moléculas diana mediante procedimientos
estandarizados de aislamiento por afinidad. Entre dichos
procedimientos se incluyen, por ejemplo, inmunoadsorción,
cromatografía de afinidad y procedimientos de inmunotransferencia
en fase sólida. Se prefiere la inmunoadsorción según se describe en
Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1988), que se
incorpora por referencia al presente documento, debido a que se
pueden cribar grandes títulos de fagos fácil y rápidamente y en
pequeños volúmenes. Adicionalmente, este procedimiento puede
seleccionar especies peptídicas menores incluidas en la población,
que de otra forma serían indetectables, y amplificarlas para tener
poblaciones sustancialmente homogéneas. La secuencia de péptidos
seleccionada se puede determinar secuenciando los ácidos nucleicos
que codifican dichos péptidos tras amplificación de la población de
fagos.
Los oligonucleótidos aleatorios sintetizados
mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos
se pueden expresar también sobre la superficie de una Tf de fusión
de bacteriófago filamentoso, tal como M13, por ejemplo, sin
juntar con los oligonucleótidos del precursor. Se puede usar un
vector como M13IX30. Este vector muestra todos los rasgos
funcionales del vector combinado para la expresión en superficie de
las proteínas de fusión gVIII-péptido. La secuencia
de nucleótidos completa para M13IX30 se da a conocer en la Patente
de los Estados Unidos Nº 6.258.350 que se incorpora por referencia
en su totalidad.
M13IX30 contiene un gVIII de tipo natural para
la viabilidad del fago una secuencia pseudo gVIII para fusiones del
péptido. El vector contiene también emplazamientos de restricción en
marco para clonar péptidos aleatorios. Los emplazamientos de
clonación en este vector son Xho I, Stu I y Spe I. Por tanto, los
oligonucleótidos deberían sintetizarse con los extremos
complementarios adecuados para hibridación y ligadura o mutagénesis
insercional. Alternativamente, se pueden generar los términos
apropiados mediante tecnología de la PCR. Entre los emplazamientos
de restricción y la secuencia pseudo gVIII se encuentra un codón de
detención ámbar en el marco, de nuevo, asegurando la completa
viabilidad del fago durante la construcción y manipulación de la
biblioteca. La expresión y el cribado se realizan como se ha
descrito anteriormente para la expresión en superficie de la
biblioteca of oligonucleótidos generada a partir de porciones de
precursor.
La presente invención proporciona bibliotecas de
presentación de fago que comprenden regiones variables de cadena
única fusionadas a Tf, mTf, y regiones, subregiones y porciones de
las mismas. Recientemente, sistemas en los que diferentes
secuencias de péptidos se presentan sobre la superficie de
bacteriófagos filamentosos (Scott y Smith (1990) Science 249:386)
han demostrado ser atractivos para formar varias combinaciones de
regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena
ligera de anticuerpos (y las secuencias de polinucleótidos que las
codifican) para selección in vitro y enriquecimiento por
enlace a un antígeno específico. Las secuencias de polinucleótidos
que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada se
enlazan a fragmentos génicos que codifican señales que los dirigen
al espacio periplásmico de E. coli y los "anticuerpos"
resultantes se presentan sobre la superficie del bacteriófago,
típicamente en forma de fusiones con proteínas de recubrimiento del
bacteriófago (por ejemplo, pIII o pVIII). Los fragmentos de
la región variable de las inmunoglobulinas (tanto Fv como Fab) se
pueden presentar externamente sobre las cápsidas de fago (cuerpos
del fago) y los fagos recombinantes se seleccionan para unión a los
antígenos inmovilizados.
Se han descrito varias realizaciones de
bibliotecas de presentación de anticuerpos en bacteriófago y de
bibliotecas de expresión en fagos lambda (Kang y col. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4363; Clackson y col. (1991) Nature
352: 624; McCafferty y col. (1990) Nature 348: 552; Burton y col.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 10134; Hoogenboom y col.
(1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang y col. (1991) J. Immunol.
147: 3610; Breitling y col. (1991) Gene 104: 147; Marks y col.
(1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas y col. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol.
22: 867; Marks y col. (1992) Biotechnology 10: 779; Marks y col.
(1992) J. Biol. Chem. 267: 16007; Lowman y col. (1991) Biochemistry
30: 10832; Lerner y col. (1992) Science 258: 1313).
Un enfoque particularmente ventajoso ha sido el
uso de las denominadas bibliotecas de fragmento variable de cadena
única (ScFv) (Marks y col. (1992) Biotechnology 10: 779; Winter G y
Milstein C (1991) Nature 349: 293; Clackson y col. (1991) obra
citada; Harks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Chaudhary y col.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1066; Chiswell y col.
(1992) TIBTECH 10: 80; McCafferty y col. (1990) obra citada; y
Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879). Se han
descrito varias realizaciones de bibliotecas de scFv presentadas
sobre proteínas de recubrimiento del bacteriófago.
Desde 1988, se han generado de manera fiable
análogos de fragmentos Fv y sus proteínas de fusión mediante
procedimientos de diseño genético de anticuerpos. La primera etapa
implica generalmente la obtención de genes que codifican las
regiones V_{H} y V_{L} con las propiedades de enlace deseadas.
Estos genes V se pueden aislar a partir de una línea celular de
hibridoma específica, seleccionarse de una biblioteca combinatoria
del gen V, o fabricarse mediante síntesis del gen V. El Fv de
cadena única se forma conectando los genes del componente V con un
oligonucleótido que codifica un péptido enlazante adecuadamente
diseñado tal como
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3}
(SEC. DE ID Nº: 36) o péptido(s) enlazante(s)
equivalente(s). El enlazante hace un puente entre el término
C de la primera región V y el término N de la segunda, ordenado en
forma V_{H}-enlazante-V_{L} o
V_{L}-enlazante-V_{H}. En
principio, el emplazamiento de enlace de ScFv puede replicar sin
problemas tanto la afinidad como la especificidad del emplazamiento
combinante de su anticuerpo pariente.
El componente procedente de SCA se puede
fusionar con los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina o de
la transferrina modificada (V_{L}, V_{H} y/o una o más regiones
CDR). Estas fusiones también se pueden realizar usando diferentes
partes o regiones de la transferrina tal como la región N o la
región C. Las proteínas podrían fusionarse directamente o usar un
péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible
fusionar todo o parte de la SCA activa dentro de la estructura de la
transferrina. En estos casos, la proteína de fusión se prepara
insertando el ADNc de SCA dentro del ADNc de la transferrina para la
producción de la proteína en células.
En una realización, dos regiones V_{H} o dos
regiones V_{L} se pueden unir a los dos extremos o insertarse en
la transferrina o en la transferrina modificada. En otra
realización, una V_{H} y una V_{L} se podrían unir o insertar
en la transferrina o en la transferrina modificada. Las regiones
variables se podrían conectar entre sí mediante un enlazante (L) y
a continuación fusionarse o insertarse en la transferrina. El
enlazante es una molécula enlazada covalentemente a las regiones
variables para facilitar la conexión o para inserción en la Tf.
Juntos, enlazante y Tf, proporcionan especio y flexibilidad
suficiente entre dos regiones de manera que son capaces de alcanzar
una conformación en la que sean capaces de unir específicamente el
epitopo al cual las dos regiones, V_{H} y V_{L}, están
dirigidas. Adicionalmente, la transferrina se puede modificar de
manera que las regiones variables conectadas a los dos términos
puedan quedar próximas. Los ejemplos de dicha modificación
incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de la prolina C
terminal y/o del bucle de cistina cercano al término C de la Tf para
proporcionar más flexibilidad.
La presente invención contempla también
proteínas de fusión Tf/scFv multivalentes. Las regiones variables
del anticuerpo con el orden
V_{H}-L-V_{H} se podrían
fusionar con un extremo de la transferrina y las regiones variables
con el orden V_{L}-L-V_{L} se
podrían fusionar con la propia transferrina en el otro extremo.
También se contemplan en la presente invención otras secuencias de
regiones variables que formen SCA multivalentes. Los ejemplos
incluyen, pero no se limitan a
V_{H}-L-V_{L} y
V_{L}-L-V_{H} y los que tienen
más regiones variables enlazados entre sí. Las regiones variables y
los enlazantes también se podrían insertar en la molécula de
transferrina.
Alternativamente, las regiones variables
multivalentes del anticuerpo se pueden formar insertando regiones
variables en la molécula de transferrina o transferrina modificada
sin usar ningún péptido enlazante no natural. De esta manera, las
porciones de la molécula de transferrina actúan como enlazantes para
proporcionar separación y flexibilidad entre las regiones
variables.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "trans-cuerpos" se refiere a una
transferrina con actividad de anticuerpo. Un
trans-cuerpo comprende al menos una región variable
de anticuerpo y una molécula de transferrina, molécula de
transferrina modificada, o un fragmento de la misma. Los
transcuerpos pueden comprender adicionalmente uno o más péptidos
antigénicos que son capaces de inducir una respuesta inmune en un
huésped. En un aspecto de la invención, las regiones variables que
enlazan el mismo antígeno se pueden fusionar a términos diferentes
de la misma molécula de transferrina o transferrina modificada. En
otro aspecto de la invención, las regiones variables que enlazan
antígenos enlazantes se pueden fusionar a términos diferentes de la
misma molécula de transferrina o transferrina modificada. Dichos
trans-cuerpos pueden enlazar dos antígenos
diferentes, o unirse y/o activar dos células diferentes. De esta
manera, la presente invención proporciona regiones variables de un
anticuerpo quimérico fusionadas a transferrina o transferrina
modificada. Más aún, las regiones variables se pueden insertar en
una molécula de transferrina o transferrina modificada.
Así, los fragmentos scFv que comprenden las
regiones V_{H} y V_{L} se enlazan en una única cadena de
polipéptido mediante un péptido enlazante flexible. Posteriormente,
los genes scFv se ensamblan, se clonan en un fagómido y se expresan
en la punta del fago M13 (o bacteriófago filamentoso similar) en
forma de proteínas de fusión con por ejemplo, la proteína de
revestimiento pIII de bacteriófago (gen 3). El enriquecimiento
mediante expresión en fago de un anticuerpo de interés se realiza
mediante inmunoadsorción del fago recombinante que presenta una
población de scFv para enlace con un epitopo determinado (por
ejemplo, antígeno diana, receptor). Como ejemplo, in la
presente invención, los fragmentos ScFv se pueden fusionar a Tf y
expresarse en la punta del fago M13.
Se ha informado de varios procedimiento para
aumentar la diversidad combinatoria de una biblioteca de scFv para
ampliar el repertorio de especies enlazantes (espectro de idiotipo).
El uso de la PCR ha permitido que las regiones variables se puedan
clonar rápidamente desde una fuente de hibridoma específica o como
biblioteca génica procedente de células no inmunizadas, dando como
resultado una diversidad combinatoria en el surtido de casetes de
V_{H} y V_{L} que se pueden combinar. Adicionalmente, los
propios casetes de V_{H} y V_{L} se pueden diversificar, tal
como mediante mutagénesis aleatoria, seudoleatoria, o dirigida.
Típicamente, los casetes de V_{H} y V_{L} se diversifican en o
cerca de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR),
a menudo en la tercera CDR, CDR3. La mutagénesis mediante PCR
enzimática inversa se ha mostrado como un procedimiento simple y
fiable para construir bibliotecas relativamente grandes de mutantes
scFv por mutagénesis dirigida al emplazamiento (Stemmer y col.
(1993) Biotechniques 14: 256), debido a la tendencia al error de la
PCR y de la mutagénesis química (Deng y col. (1994) J. Biol. Chem.
269: 9533). Riechmann y col. (1993) Biochemistry 32:8848
demostraron el diseño semirracional de un fragmento scFv de
anticuerpo usando PCR con aleatorización dirigida al emplazamiento
con oligonucleótidos degenerados y la posterior presentación de fago
de los mutantes scFv resultantes. Barbas y col. (1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89: 4457) intentaron evitar el problema de los
tamaños limitados del repertorio resultante usando desviaciones en
las secuencias de región variable aleatorizando la secuencia en una
región CDR sintética del Fab enlazante con el toxoide tetánico
humano.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5922545 da a
conocer procedimientos mejorados y composiciones novedosas para
identificar péptidos y anticuerpos de cadena única que se unen a
receptores o epitopos predeterminados. Dichos péptidos y
anticuerpos se identifican mediante procedimientos mejorados y
novedosos por cribado por afinidad de polisomas que presentan
péptidos nascentes.
El documento U.S. 6300064 se refiere a
secuencias de ADN sintético que codifican una o más colecciones de
proteínas/(poli)péptidos homólogos, y los procedimientos para
generar y aplicar bibliotecas de estas secuencias de ADN. En
particular, la invención se refiere a la preparación de una
biblioteca de genes de anticuerpo derivados de ser humano mediante
el uso de una secuencia de consenso sintética que cubre el
repertorio estructural de los anticuerpos codificados por el genoma
humano. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de un único
gen consenso de anticuerpo como marco universal de bibliotecas de
anticuerpos muy diversos.
En la presente invención, los péptidos de unión
a antígeno o CDR se fusionan con la Tf y la mTf para generar una
biblioteca de anticuerpos mejorados. En particular, se puede usar la
tecnología de presentación de fago para generar grandes bibliotecas
de CDR explotando la capacidad del bacteriófago para expresar y
presentar moléculas de proteína de fusión de Tf que comprenden CDR
funcionales sobre la superficie del bacteriófago. En otras
realizaciones, la biblioteca de CDR se puede preparar directamente
en una Tf modificada para crear una biblioteca. Se han generado
bibliotecas combinatorias de péptidos de unión a antígeno en
sistemas de expresión en bacteriófago lambda que se pueden cribar
como placas de bacteriófago o como colonias de lisógenos (Huse y
col. (1989) Science 246:1275; Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 87:6450; Mullinax y col. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 87: 8095; Persson y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88: 2432). Se han descrito bibliotecas de presentación en
bacteriófago de péptidos de unión a antígeno y bibliotecas de
expresión en fago lambda (Kang y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88: 4363; Clackson y col. (1991) Nature 352: 624; McCafferty y
col. (1990) Nature 348: 552; Burton y col. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 88: 10134; Hoogenboom y col. (1991) Nucl. Acid Res. 19:
4133; Chang y col. (1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitling y col.
(1991) Gene 104: 147; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581;
Barbas y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4457; Hawkins
and Winter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marks y col. (1992)
Biotechnology 10: 779; Marks y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:
16007; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30: 10832; Lerner y col.
(1992) Science 258: 1313). También véase la revisión de Rader, C. y
Barbas, C. F. (1997) "Fago display of combinatorial antibody
libraries" Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508.
Como parte de esta invención, la transferrina o
parte de la transferrina que contiene péptidos aleatorios se puede
insertar en el gen 3 del fago en lugar de los fragmentos V_{L} o
V_{H}. De esta manera, la biblioteca se puede cribar para una
proteína transferrina que contiene un péptido con una función
deseada.
De manera similar, una biblioteca puede expresar
una transferrina que contiene varios péptidos insertados en lugar de
los fragmentos de anticuerpo. A continuación, esta biblioteca se
criba para el péptido con la mejor actividad de enlace para una
diana particular.
La diversidad de la biblioteca de anticuerpos o
péptidos está preferiblemente entre aproximadamente
10^{6}-10^{16}, más preferiblemente entre
aproximadamente 10^{8}-10^{16}, y lo más
preferiblemente entre aproximadamente
10^{10}-10^{16}.
Se han generado diferentes bibliotecas de
péptidos para cribar péptidos. Algunas están comercialmente
disponibles. Usando Tf como proteína estructural, se podrían generar
bibliotecas de péptidos Tf similares usando el presente
procedimiento.
En general, dos tipos de bibliotecas de péptidos
pueden servir como fuente de epitopos de péptido: bibliotecas de
péptidos aleatorios (RPL) y bibliotecas de péptidos naturales (NPL).
En las RPL, los péptidos presentados en fago se codifican mediante
insertos de oligonucleótidos degenerados aleatorios sintéticos
cortados y empalmados en los genes de la proteína de recubrimiento.
En las NPL, las partículas de fago presentan fragmentos de
proteínas naturales codificadas mediante fragmentos cortos de ADN
del genoma de un organismo de interés, por ejemplo un
patógeno o un organismo conocido por producir proteínas o péptidos
con propiedades deseables incluyendo propiedades terapéuticas.
Se han construido bibliotecas de fagos basadas
en estructuras de proteínas bien caracterizadas. En estas
bibliotecas, se selecciona una única proteína fuertemente
estructurada y se varían los aminoácidos de una parte de esta
proteína pariente. Únicamente se varían las regiones de la proteína
que son accesibles desde la superficie, ya que son estas regiones
las que están disponibles para enlazar una diana, mientras que las
regiones de la proteína que están implicadas en el mantenimiento de
la estructura no se varían.
También se han construido bibliotecas de fagos
de anticuerpos humanos. Contienen genes que codifican las regiones
variables de cadena ligera y cadena pesada de las células productos
de anticuerpos procedentes de donantes humanos que se presentan en
la biblioteca de fagos en forma de fragmentos de anticuerpo (Fabs).
El diseño de la biblioteca incluye la capacidad de producir y
purificar rápidamente Fabs solubles.
Bibliotecas de fagos con péptidos lineales en
las que todos los aminoácidos, excepto cisteína, en cada posición
de un péptido de 20-mer se varían para crear
bibliotecas grandes. Estas bibliotecas se han usado para
identificar péptidos lineales novedosos que se pueden usar como
compuestos terapéuticos o como ligandos por afinidad para la
purificación de compuestos terapéuticos diana.
Las bibliotecas de fagos con sustrato peptídico
contienen variaciones en la secuencia del péptido que sirven como
emplazamiento de reconocimiento para enzimas específicas. Estas
bibliotecas se han usado para identificar péptidos novedosos que son
mejores sustratos para enzimas específicas.
Se han construido bibliotecas de enzimas que se
pueden usar para identificar enzimas con especificidades y
enantioselectividades de sustratos hechas a mediada. Se usan enzimas
con relevancia industrial como proteína parental, y los aminoácidos
de las partes relevantes se varían para obtener variantes
enzimáticos con la función deseada. Por ejemplo, estas
bibliotecas de presentación de fago se pueden usar para crear
catalizadores que realicen el mismo tipo de reacción, pero con
sustratos y estereoselectividades diferentes.
La Patente de los Estados Unidos Nº 6.573.098 da
a conocer un procedimiento para el reensamblaje del ADN tras
fragmentación aleatoria, y su aplicación a la mutagénesis de
secuencias de ácidos nucleicos por recombinación in vitro o
in vivo. En particular, se describe un procedimiento para la
producción de fragmentos de ácidos nucleicos o polinucleótidos que
codifican proteínas mutantes. La invención también se refiere a un
procedimiento para repetir ciclos de mutagénesis, barajado y
selección que permite dirigir la evolución molecular in vitro
o in vivo de las proteínas.
La presentación de péptidos está basada
principalmente en el cribado de péptidos o proteínas, tal como
anticuerpos de cadena única (SCA), para actividad de enlace frente a
una diana elegida en el que el péptido o proteína se inserta y
presenta sobre la superficie de un bacteriófago, por ejemplo en el
término N de la proteína de recubrimiento pIII del bacteriófago
M13.
En el caso de los péptidos, se puede generar una
biblioteca del fago M13 cortando y empalmando una secuencia de ADN
aleatorizada, que codifica un conjunto aleatorizado de aminoácidos,
3' del término N de Tf que está fusionada con la proteína del
bacteriófago pIII e inmediatamente después del emplazamiento de
rotura de la secuencia señal. Esta secuencia de péptidos está
típicamente en el intervalo de 6, 8, 12, 15 ó 20 aminoácidos de
longitud. Sin embargo, a medida que el tamaño del inserto de péptido
aumenta, la complejidad potencial de la biblioteca también lo hace.
Por ejemplo, una biblioteca de 6 mer que usa los 20
aminoácidos genera 10^{8} posibles combinaciones; una biblioteca
de 20 mer biblioteca genera 10^{26} posibles combinaciones. Con el
fin de que la biblioteca sea representativa para la etapa de
cribado, la biblioteca inicial se amplifica para dar lugar a una
duplicación cinco veces o superior de todas las posibles secuencias
contenidas en la biblioteca.
Los péptidos pueden ser lineales o estar
restringidos, se consigue una biblioteca restringida mediante la
adición de dos restos cisteína dentro de la secuencia de péptido de
manera que se forme un enlace disulfuro dentro del péptido. Los
péptidos pueden también estar conservados en determinados restos,
particularmente si la biblioteca está basada en una secuencia
existente en las que ya se han determinado algunos restos clave.
Los medios de generar y cribar bibliotecas de
fagos están bien documentados (Véase
http://www.biosci.nussouri.
edu/smithgp/FagoDisplayWebsite/PetrenkoSmithChemReviews.PDF). En breve, una cepa huésped de E. coli adecuada se infecta con la biblioteca para generar partículas de fago. En la punta de las partículas de fago se presenta el producto del gen III, pIII, junto con el péptido insertado. A continuación, estas partículas se criban contra una diana y, como el ADN y el péptido que codifica están inexorablemente unidos en la partícula de fago, se puede determinar la secuencia del aminoácido del péptido(s) a partir de la secuencia del ADN.
edu/smithgp/FagoDisplayWebsite/PetrenkoSmithChemReviews.PDF). En breve, una cepa huésped de E. coli adecuada se infecta con la biblioteca para generar partículas de fago. En la punta de las partículas de fago se presenta el producto del gen III, pIII, junto con el péptido insertado. A continuación, estas partículas se criban contra una diana y, como el ADN y el péptido que codifica están inexorablemente unidos en la partícula de fago, se puede determinar la secuencia del aminoácido del péptido(s) a partir de la secuencia del ADN.
El mismo principio de cribar grandes cantidades
de secuencias aleatorias se aplica tanto a péptidos como a SCA,
siendo la diferencia que, con SCA, los péptidos son las secuencias
hipervariables de las CDR en las cadenas ligera y pesada del
anticuerpo.
Para la presentación de fago usando una proteína
como Tf, la metodología se vuelve un poquito más compleja que para
un péptido sencillo, puesto que el tamaño del ADN del bacteriófago
excede el que se puede empaquetar eficazmente en la partícula de
fago. Esto requiere el uso de un sistema de dos vectores. La fusión
proteína Tf-pIII se transporta en un vector, o
fagómido, que es esencialmente un plásmido que contiene el ADN de la
fusión proteína Tf-pIII junto con una secuencia
funcional de empaquetamiento de fago. Este vector no puede generar
partículas de fago viables. Para generar partículas de fago, la cepa
huésped E. coli se infecta con un segundo vector, o fago
auxiliar, que es un bacteriófago M13 de tipo natural que transporta
una señal de empaquetado no funcional. El fago auxiliar proporciona
todos los genes necesarios para fabricar y ensamblar las proteínas
de una partícula de fago pero es incapaz de empaquetar su ADN en la
partícula de fago. Únicamente el ADN del fagómido transporta una
señal de empaquetado funcional, y así, es únicamente el ADN del
fagómido el que se empaqueta en las partículas de fago.
En una única partícula de fago se encuentran
cinco copias de la proteína pIII. En un sistema de presentación de
péptido las cinco copias normalmente transportan el péptido Tf. Esto
puede dar como resultado la selección de péptidos con una afinidad
inferior a la que se hubiera inicialmente indicado debido a los
efectos de la avidez. El sistema de presentación de proteínas,
debido a que el fago auxiliar transporta el gen para fabricar
copias nativas de la proteína del gen III, permite la incorporación
de normalmente una o dos copias de la fusión
proteína-pIII. Esto tiene dos efectos, el primero es
una mejor infectividad cuando el fago aislado requiere propagación y
el segundo, más importante, es la selección de péptidos con afinidad
superior.
Se pueden generar oligonucleótidos que contienen
los mismos emplazamientos de restricción a cada extremo por
separado mediante un conjunto aleatorio de nucleótidos que codifican
los péptidos aleatorios. Los emplazamientos de restricción son los
mismos que los del término N de Tf. El tamaño del péptido depende de
la longitud de la región aleatoria de nucleótidos en estos
oligonucleótidos.
El vector de expresión que contiene Tf se corta
con las enzimas de restricción adecuadas, y los oligonucleótidos se
insertan en dicho emplazamiento. Tras la ligadura y transformación,
la levadura puede producir Tf con los péptidos aleatorios añadidos
en su término N.
Se podría usar un protocolo similar para unir
los péptidos al término C o en el interior de Tf excepto en que se
deberían usar emplazamientos de restricción adecuados en los
extremos 3' y 5' de los oligonucleótidos para permitir una inserción
correcta.
A continuación, la biblioteca se criba para
péptidos que tengan afinidad por una molécula de interés
específica. El cribado se puede realizar mediante el procedimiento
de dilución limitante similar al de selección de anticuerpos
monoclonales o mediante el uso de transferencia replicada de las
placas de cultivo que se sondean con la molécula de interés
marcada.
Tras la selección, los clones seleccionados se
hacen crecer y el péptido Tf expresado se purifica usando
cromatografía de afinidad o de intercambio iónico. El material
purificado se puede usar para estudios in vitro e in
vivo.
La maduración por afinidad se refiere al
incremento de la afinidad por el antígeno específico de los
anticuerpos producidos en el transcurso de una respuesta inmune
humoral. Es particularmente elevada en la inmunización secundaria e
inmunizaciones posteriores.
La Patente de los Estados Unidos Nº 6.573.098 da
a conocer un procedimiento para generar bibliotecas de polipéptidos
presentados o anticuerpos presentados adecuados para cribado
mediante interacción por afinidad o cribado fenotípico. El
procedimiento comprende (1) obtener una primera pluralidad de
miembros seleccionados de una biblioteca que comprenden un
polipéptido presentado o anticuerpo presentados y un polinucleótido
asociado que codifica dichos polipéptido presentado o anticuerpo
presentado, y obtener dichos polinucleótidos asociados o copias de
los mismos en los que dichos polinucleótidos asociados comprenden
una región de secuencia esencialmente idéntica, introduciendo
opcionalmente mutaciones en dichos polinucleótidos o copias, y (2)
combinar y fragmentar, mediante digestión con nucleasa,
amplificación mediante la PCR con extensión parcial, PCR con
barajado, u otro procedimiento de fragmentación adecuado,
produciendo típicamente fragmentos aleatorios o fragmentos
equivalentes, dichos polinucleótidos asociados o copias para formar
fragmentos de los mismos en condiciones adecuadas para
amplificación mediante la PCR y opcionalmente mediante mutagénesis,
y de esta manera recombinando homólogamente fragmentos para formar
una combinación barajada de polinucleótidos recombinados, en la que
una fracción sustancial (por ejemplo, más del 10 por ciento)
de los polinucleótidos recombinados de dicha combinación barajada
no están presentes en la primera pluralidad de miembros
seleccionados de la biblioteca, comprendiendo dicha combinación
barajada una biblioteca de polipéptidos presentados o de
anticuerpos presentados adecuados para cribado mediante interacción
por afinidad. Opcionalmente, el procedimiento comprende la etapa
adicional de cribar los miembros de la biblioteca de la combinación
barajada para identificar miembros individuales de la biblioteca
barajada que tengan la capacidad de unirse o de interactuar de
cualquier otra manera (por ejemplo, tal como anticuerpos
catalíticos) con una macromolécula predeterminada, tal como por
ejemplo un receptor proteínico, péptido, oligosacárido, virión,
u otro compuesto o estructura predeterminados. Los polipéptidos,
anticuerpos, anticuerpos peptidomiméticos y secuencias de región
variable presentados que se identifican a partir de dichas
bibliotecas que se pueden usar en terapia, diagnóstico,
investigación y fines relacionados (por ejemplo,
catalizadores, solutos para incrementar la osmolaridad de una
disolución acuosa y similares), y/o puede someterse a uno o más
ciclos adicionales de barajado y/o selección por afinidad. El
procedimiento se puede modificar para que la etapa de selección sea
para una característica fenotípica diferente a la afinidad de
enlace con una molécula predeterminada (por ejemplo, para
actividad catalítica, estabilidad, resistencia a la oxidación,
resistencia a fármacos, o un fenotipo detectable conferido a una
célula
huésped).
huésped).
Un procedimiento preferido para la selección de
un fago que presenta una molécula de proteína con una especificidad
o afinidad deseada a menudo procederá de la elución de una matriz de
afinidad con un ligando. La elución con concentraciones crecientes
de ligando debería eluir el fago que presenta moléculas enlazantes
de afinidad
creciente.
creciente.
Otro procedimiento preferido para selección por
afinidad sería el enlace a una matriz de afinidad que contiene
bajas cantidades de ligando. Como estrategia prefería, una población
de fagos se enlaza a una matriz de afinidad que contiene una baja
cantidad de ligando. Los fagos que presentan afinidad elevada y las
proteínas de baja afinidad compiten para enlazarse con el ligando
de la matriz. Los fagos que presentan una proteína de afinidad
elevada quedan preferentemente unidos, y la proteína de baja
afinidad se elimina con el lavado. La proteína de alta afinidad se
recupera posteriormente por elución con el ligando o mediante otros
procedimientos que eluyan el fago de la matriz de afinidad.
Cualquier procedimiento de maduración por
afinidad como los descritos anteriormente se puede usar con las
bibliotecas de estructura de Tf descritas en el presente documento.
Según esto, la presente invención incluye procedimientos para usar
técnicas de maduración por afinidad para seleccionar péptidos u
otras moléculas por sus características deseadas comprendías en el
contexto de las bibliotecas de estructura de Tf descritas en el
presente documento.
Sin descripción adicional, se cree que una
persona normalmente experta en la técnica puede, usando la
descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos,
realizar y utilizar la presente invención y poner en práctica los
procedimientos reivindicados. Por ejemplo, una persona
experta será rápidamente capaz de determinar la actividad
biológica, tanto in vitro como in vivo, de los
constructos de proteína de fusión de la presente invención en
comparación con la actividad comparable del resto terapéutico en su
estado no fusionado. De manera similar, una persona experta en la
técnica será rápidamente capaz de determinar la semivida y la
estabilidad en suero de los constructos según la presente invención.
Los siguientes ejemplos de trabajo del documento apuntas
específicamente a las realizaciones preferidas de la presente
invención, y no se deben tomar en forma alguna como una limitación
del resto de la memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una proteína de fusión que comprendía
Tf modificada y un péptido antifusogénico VIH-1
(T-20) fusionando una o más copias de la secuencia
de nucleótidos que codifica el péptido a la secuencia de nucleótidos
de mTf para producir una proteína de fusión con un péptido
fusionado a los términos N- o C- de Tf. Alternativamente, el péptido
puede fusionarse internamente con mTf.
En una realización, la porción Tf de la proteína
de fusión está diseñada para no permitir la glicosilación cuando se
produce en lavaduras. Según se ha descrito anteriormente, la
transferrina humana tiene dos emplazamientos de glicosilación
N-unidos a N413 y N611; el emplazamiento de
glicosilación N-unido comprende la secuencia
N-X-S/T. En una realización, N (Asn)
se cambia a Q (Gln); se aprecian otros cambios tales como Asn por
Ala o Ser o cualquier otro aminoácido.
Específicamente, los codones N413 y N611 se
convierten en GAT y GAC mediante mutagénesis dirigida al
oligonucleótido usando el procedimiento dut/ung (dUTPasa/uracilo
glicosidasa, por sus siglas en ingles). Véase Kunkel y col.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492). Los
oligonucleótidos mutagénicos
5'-GCAGAAAACTACGATAA
GAGCGATAAT-3' (SEC. DE ID Nº: 9) y 5'-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3' (SEC. DE ID Nº: 10) se sintetizan y usan para producir mutagénesis en los codones N413 y N611 según los procedimiento de Funk y col. (Patente de los Estados Unidos 5.986.067).
GAGCGATAAT-3' (SEC. DE ID Nº: 9) y 5'-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3' (SEC. DE ID Nº: 10) se sintetizan y usan para producir mutagénesis en los codones N413 y N611 según los procedimiento de Funk y col. (Patente de los Estados Unidos 5.986.067).
De esta manera quedan perturbados la unión al
receptor y/o la unión a hierro o carbonato produciendo la mutación
en los siguientes restos de unión y/o restos de unión a hierro y/o
carbonato:
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\vskip1.000000\baselineskip
La producción de mutantes deficientes en unión
al hierro se puede realizar mediante numerosas técnicas. Véase la
Patente de los Estados Unidos 5.986.067. Se puede preparar una
substitución D63S usando el procedimiento de Nelson, R. M. y Long,
G. L. (1989) Anat. Biochem. 180:147-151. En breve,
un fragmento HpaII/BamHI procedente del extremo 5' de la
secuencia de codificación del hTF/2N (Tf humana con doble región N)
se subclona en pUC 18 y a continuación se usa como plantilla para
un procedimiento de mutagénesis en dos etapas basado en la PCR. A
continuación, el fragmento se libera de la forma de doble cadena
del vector de secuenciación mediante digestión con XbaI y
BamHI y a continuación se liga a un fragmento
BamHI/HindIII procedente del constructo original de la Tf
humana para producir una secuencia de codificación de D63S longitud
completa.
Para la expresión en Pichia pastoris, se
puede usar el sistema procedente de RCT/Invitrogen. Están
disponibles tres vectores para multicopia para expresión, pPIC9K,
pPIC3.5K y pAO815. Para este ejemplo, se usa el vector pPIC9K, que
permite la secreción en el medio de crecimiento.
La secuencia modificada de transferrina se clonó
en el vector pPIC9K por alteración de los extremos del ADNc de
transferencia mediante mutagénesis solapante con PCR, dando como
resultado el vector pREX0010. Se eliminan o añaden numerosos
emplazamientos de restricción en el vector y la secuencia de
codificación para facilitar las últimas etapas de clonación.
La secuencia del péptido antifusogénico del VIH
H DP-178 se conoce también como
T-20. Este péptido está fusionado en los extremos
N- o C- de la Transferrina, ya que el péptido necesita libertad de
movimientos para cumplir su función.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de DP-178: | YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEC. DE ID Nº: 4). |
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se vuelve a traducir a ADN (usando
codones optimizados para levadura), se obtuvo la siguiente secuencia
(SEC. DE ID N^{ros}: 13 y 14):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para insertar la secuencia anterior, se digirió
el vector pREX0010 con el ADNc de la transferrina, con las enzimas
de restricción XbaI/KpnI para la inserción en el extremo 5' y
con SalI/HindIII para la inserción en el extremo 3'.
Para la inserción en 5', se sintetizaron dos
oligos solapantes que forman un saliente XbaI en el extremo
5' y un saliente KpnI en el extremo 3' de la secuencia
DP-178 anteriormente proporcionada. Estos oligos se
fusionaron entre sí (véase más adelante) y se ligaron en el vector
pREX0010 digerido con XbaI/KpnI.
La inserción de los oligos fusionados dio como
resultado la pérdida del emplazamiento KpnI tras la
inserción. Esto dio como resultado el vector pREX0011.
Para la inserción en el término C, se siguió un
enfoque similar mediante la adición de un emplazamiento SalI
en el extremo 5' y uno HindIII en el extremo 3'.
La transformación, selección y expresión se
llevaron a cabo posteriormente como está descrito en el folleto del
protocolo en kit de expresión Pichia Invitrogen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon fusiones INGAP usando una
secuencia de aminoácidos INGAP humana traducida inversamente. La
secuencia de proteína procedente de la anterior es como sigue:
sp|Q92778|PBCG_HUMAN Human INGAP
(SwissProt):
(SwissProt):
MMLPMTLCRMSWMLLSCLMFLSWVEGEESQKKLPSSRITCPQGSVAYGSYCYSLILIPQTWSNAELSCQ
{}\hskip0.45cm
MHFSGHLAFLLSTGEITFVSSLVKNSLTAYQYIW[IGLHDPSHGTLPNG]GWKWSSSNVLTFYNWERNPSI
{}\hskip0.45cmAADRGYCAVLSQKSGFQKWRDFNCENELPYICKFKV {}\hskip1cm
(SEC. DE ID Nº: 17).
La traducción inversa a ADN (codones optimizados
para levadura) produjo lo siguiente (SEC. DE ID N^{ros}: 18 y
19).
El punto más adecuado para la rotura de la
secuencia líder es el C-terminal del KK en el
extremo de la secuencia subrayada anterior.
Una metodología que se puede usar para generar
constructos para la expresión de INGAP fusionado con los términos N-
o C- de la transferrina es sintetizar una serie de oligos solapantes
diseñados a partir de la secuencia anteriormente proporcionada
(menos la secuencia líder anterior). La hibridación de estos
cebadores generó el ADNc maduro de INGAP. Con diferentes oligos
diseñados para los extremos 5' y 3', el ADNc híbrido se puede ligar
en el pREX0010 en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación
de la transferrina.
La secuencia que aparece entre paréntesis es el
péptido usado para inducir la actividad de INGAP. De esta manera, la
secuencia podría acortarse hasta cierto punto entre la secuencia
completa y esta secuencia mínima.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el término N, el ácido nucleico codificante
tendría un saliente que forma un emplazamiento XbaI en el
extremo 5' y un saliente compatible con un emplazamiento KpnI
en el extremo 3' pero que da como resultado la destrucción del
emplazamiento KpnI tras la ligadura.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La digestión de pREX0010 con XbaI y
KpnI y la ligadura con la secuencia anterior dio como
resultado el vector pREX0013.
\newpage
Para el término C, el extremo 5' formaría un
emplazamiento SalI y en el extremo 3' un codón de detención y
un emplazamiento HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
La digestión de pREX0010 con SalI y
HindIII y la ligadura de la secuencia anterior dio como
resultado el vector pREX0014.
La transformación, selección y expresión se
llevaron a cabo posteriormente como está descrito en el folleto del
protocolo en kit de expresión Pichia Invitrogen.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido dado a continuación ha demostrado
imitar la actividad de la EPO produciendo la dimerización del
receptor EPO. El péptido, que es cíclico, no tiene homología con
EPO. Para su actividad, el péptido debe de actuar concertado con
otro péptido, es decir, en forma de dímero, de manera que las
moléculas del receptor se ponen lo suficientemente cerca para formar
un complejo activo. Como en el caso de muchos péptidos, el dímero de
péptidos tiene una semivida corta, y se beneficiaría de la
longevidad que le proporcione la transferrina. En este ejemplo, se
diseñaron dos péptidos en la estructura de la transferrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se detalla en Ali y col., se puede insertar
un péptido con éxito en la transferrina entre His289 y Gly290. La
duplicación inherente a la molécula de transferrina, con los dos
dominios enfrentados entre sí, sugiere que puede ser posible
insertar un péptido en la región análoga del dominio C, entre Glu625
y Thr626.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada inserción, se sintetizaron dos
cebadores mutagénicos solapantes (véase más adelante). Usando
pREX0010 como plantilla, se llevaron a cabo reacciones con cada
cebador mutagénico, y un cebador externo del 5' o 3' del de ADNc Tf.
Los productos de estas dos reacciones se mezclaron a continuación, y
se llevó a cabo una reacción adicional con los cebadores externos
para unir los dos productos entre sí. El inserto
His289-Gly290 producto de la PCR se digirió con
XbaI y HpaI para ligadura en digerido con
pREX0010XbaI/HpaI. El vector resultante se digirió a su vez
con HpaI y SalI para ligadura del inserto
Glu625-Thr626 producto de la PCR digerido con
HpaI/SalI.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esto proporcionó el plásmido pREX0015. La
transformación, selección y expresión se llevaron a cabo
posteriormente como está descrito en el folleto del protocolo en kit
de expresión Pichia Invitrogen.
Los puntos alternativos para la inserción del
péptido o péptido(s) miméticos de EPO o de cualquier otro
péptido o péptido(s) son los dos emplazamientos de
glicosilación en la región C de la Transferrina en N413 y N611. La
ventaja de esto sería que la inserción se consigue y la
glicosilación se evita, mediante perturbación de la secuencia
N-X-S/T en un evento único y
compartido.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de fusión entre Tf y los péptidos
fusogénicos inhibidores contra RSV se preparan fusionando las
secuencias de péptido en los extremos N- o C- terminal de Tf o
mediante la inserción de las secuencias en un bucle de Tf, en el que
Tf está modificada para no unirse al hierro y/o está modificada para
evitar la glicosilación. El péptido RSV puede incluir: T786:
VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV (SEC. DE ID Nº: 5) y/o T1584:
AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL (SEC. DE ID Nº:
6).
El péptido T786 tiene un dipéptido RK que podría
actuar como un emplazamiento de rotura para la proteasa de levadura
Kex2p. Esto daría como resultado un péptido truncado. Según esto,
este péptido se modificaría de RK a RE. Otra versión del péptido
T786, T112 (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEC. DE ID Nº: 7),
que es más potente que T786 pero que tiene problemas de solubilidad
en su forma no fusionada. Según esto, una versión de T112
modificado para de RK a RE también se prepara para producir una
versión del péptido fusionado a Tf.
Para producir los constructos genéticos, las
secuencias de péptidos se traducen inversamente a ADN usando una
preferencia codónica de ser humano, levadura, o de cualquier otro
organismo según sea apropiado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden fusionar citocinas a los extremos N-,
C- o N- y C- de ofTf. Estas fusiones también se pueden construir
usando diferentes partes o regiones de transferrina modificada tal
como la región N o la región C. Las proteínas se podían fusionar
directamente o usando un péptido enlazante de diferentes longitudes.
Es también posible funcionar todo o parte de la citocina activa en
la estructura de la transferrina.
El ADNc de la citocina de interés, tal como la
EPO, se puede aislar mediante una variedad de medios tales como
RT-PCR de ARNm, a partir de bibliotecas de ADNc,
construyendo sintéticamente el ADNc a partir de oligonucleótidos
solapantes, mediante PCR o mediante otros procedimientos conocidos
en la técnica, usando todos ellos procedimientos estandarizados.
Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas son
conocidas y están disponibles, por ejemplo, en las Patentes de los
Estados Unidos 4.703.008, 4.810.643 y 5.908.763 así como en bases
de datos públicas como GenBank. El ADNc se puede adaptar a los
extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de
manera que los enlazantes oligonucleótidos se pueden usar para
clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la
Transferrina. Esto puede ser en el extremo N- o en el C-, con o sin
el uso de una secuencia separadora, o insertando el ADNc de la
citocina dentro del ADNc de la Transferrina. La citocina, por EPO,
y el ADNc de Tf se clonan en un vector cuyo casete de expresión
completo se escinde y se inserta en un vector de expresión para
permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura (o
cualquier otro sistema de expresión apropiado). La proteína de
fusión secretada de la levadura se puede recoger y purificar del
medio, y ensayarse para su actividad biológica.
Para expresión en líneas celulares de mamífero,
se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de
expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación
de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y
se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas
celulares de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden fusionar varios interferones con los
términos N-, C- o N- y C- de la transferrina o la transferrina
modificada. Estas fusiones se pueden construir usando diferentes
partes o regiones de la transferrina tal como la región N o la
región C. Las proteínas se pueden fusionar directamente o usando un
péptido enlazante de diferentes longitudes. Es también posible
fusionar todo o parte del interferón en el armazón de la
transferrina.
Un ejemplo específico de un interferón que se
puede fusionar con Tf es interferón-\beta. El ADNc
del interferón de interés tal como IFN \beta se puede aislar por
una variedad de medios tal como RT-PCR a partir de
ARNm o ADNc, a partir de bibliotecas de ADNc, construyendo
sintéticamente el ADNc a partir de oligonucleótidos solapantes,
mediante PCR u otros procedimientos conocidos en la técnica, todos
usando procedimientos estandarizados. Las secuencias de nucleótidos
de los interferones, tales como IFN\alpha, IFN\beta, y
IFN\gamma son conocidas y están disponibles, por ejemplo, en las
Patentes de los Estados Unidos 5.326.859 y 4.588.585, en el
documento EP 32 134, así como en otras bases de datos públicas como
GenBank. El ADNc puede adaptarse a los extremos 5' y 3' para generar
emplazamientos de restricción, de manera que se pueden usar
oligonucleótidos enlazantes para clonar el ADNc en un vector que
contiene el ADNc de la transferrina modificada. Esto se puede
realizar en los términos N-, C- o N- y C- de la secuencia de la
transferrina, con y sin el uso de una secuencia separadora. El ADNc
de IFN \beta (u otro interferón) se clona en un vector, del cual
a continuación se escinde el casete de expresión completo y se
inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la
proteína de fusión de la levadura. La proteína de fusión secretada
desde la levadura se pueden recoger y purificar desde el medio y
ensayarse para su actividad biológica.
Para expresión en líneas celulares de mamífero,
se adopta un procedimiento similar excepto en que el casete de
expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de terminación
de mamífero. Este casete de expresión se escinde a continuación y
se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas
celulares de mamífero. Los IFN fusionados con la transferrina
tienen una semivida mucho más larga, esto es, las dosis
terapéuticas de las proteínas fusionadas son muy inferiores a los
IFN. Por tanto, los interferones fusionados son más eficaces con
mucho menos toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios anticuerpos de cadena única (SCA) fueron
originalmente inventados para simplificar la selección y producción
de anticuerpos. Sin embargo, demostraron tener un valor terapéutico
limitado o sin valor debido a su pequeño tamaño y corta semivida
in vivo. La adición de transferrina a SCA incrementa
significativamente la semivida in vivo de SCA.
SCA se puede fusionar a los términos N-, C- o N-
y C- de la transferrina o la transferrina modificada. Estas
fusiones se pueden construir usando diferentes partes o regiones de
la transferrina tal como la región N o la región C. Las proteínas
se pueden fusionar directamente o usando un péptido enlazante de
diferentes longitudes. Es también posible fusionar todo o parte del
interferón en el armazón de la transferrina. En estos casos, la
proteína de fusión se prepara insertando el ADNc de SCA en el ADNc
de la transferrina para la producción de la proteína en células. Un
ejemplo específico de un SCA que se puede fusionar a la Transferrina
es el anti-TNF (factor de necrosis tumoral; Figs.
4A-4B). El anti-TNF se ha usado para
tratar varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
TNF-SCA podría fusionarse a los términos N- o C- de
la transferrina modificada de manera que el termino N codificante
de TNF-SCA está directamente unido al aminoácido
C-terminal de la Transferrina o el aminoácido
C-terminal de TNF-SCA está
directamente unido al aminoácido N-terminal de la
Transferrina. Alternativamente, se puede insertar un péptido
enlazante para proporcionar más separación entre la Transferrina y
TNF-SCA y permitir más movilidad espacial a las dos
proteínas fusionadas. Se muestran en las Figuras
4A-4B varios ejemplos de
TNF-SCA.
Los anticuerpos de cadena única se producen
mediante varios procedimientos que incluyen, pero no se limitan a:
selección a partir de bibliotecas de fagos, clonación de la región
variable de un anticuerpo específico por clonación del ADNc del
anticuerpo y usando las regiones constantes flanqueantes como el
cebador para clonar la región variable, o sintetizado un
oligonucleótido correspondiente a la región variable de cualquier
anticuerpo específico. El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y
3' para generar emplazamientos de restricción, de manera que se
pueden usar oligonucleótidos enlazantes para clonar el ADNc en un
vector que contiene el ADNc de la transferrina. Esto puede ser en
los términos N- o C- o en el término N- y C- con o sin el uso de una
secuencia separadora. La molécula de ADNc de SCA se clona en un
vector del que a continuación el casete de expresión completo se
escinde e inserta en un vector de expresión para permitir la
expresión de la proteína de fusión en levaduras. La proteína de
fusión secretada desde la levadura se puede recoger y purificar del
medio y ensayar su actividad. Para expresión en líneas celulares de
mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el
casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de
terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a
continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la
transfección de líneas celulares de mamífero. El anticuerpo
producido de esta manera se puede purificar del medio y ensayarse
para el enlace con su antígeno usando procedimientos
estandarizados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las CDR son las regiones variables de los
anticuerpos que interactúan con antígenos. Estos consisten
usualmente en tramos relativamente cortos de péptidos. Los
anticuerpos tienen normalmente tres CDR en sus cadenas pesadas y
tres en sus cadenas ligeras. Una o más CDR de un anticuerpo
puede(n) interactuar con el antígeno que se puede fusionar a
la transferrina modificada para conferir actividad de unión de
antígeno a la molécula de transferrina. Las CDR se pueden fusionar
a los términos N-, C-, N- y C- o insertarse en la estructura
interna de la transferrina. Ejemplos de secuencias de CDR
procedentes de los anticuerpos anti-TNF se muestran
en las Figuras 4A-4B de TNF-SCA. Los
ADNc correspondientes a una o más CDR se pueden fusionar con la
transferrina modificada para conferir a TNF actividad de unión a la
transferrina.
\vskip1.000000\baselineskip
La tecnología de fusión con Transferrina se
puede usar también para mejorar las propiedades terapéuticas de los
péptidos descubiertos en diferentes sistemas como bibliotecas de
presentación de gados y bibliotecas de péptidos. Muchos de estos
péptidos tienen actividad biológica sin homología alguna con
proteínas o péptidos naturales. Estos péptidos, debido a sus cortas
semividas in vivo, son buenos candidatos para fusión con
transferrina modificada. Por su pequeño tamaño se pueden fusionar
en una variedad de regiones de la molécula de transferrina. Además
de los términos N- y C-, se pueden insertar en diferentes regiones
de la transferrina incluyendo pero sin limitarse a los bucle de
cistina. De esta manera, la estructura tridimensional del péptido
dentro de la transferrina se mantiene relativamente rígida. Se
pueden fusionar más de una copia de cada péptido y más de un
péptido con la transferrina modificada. Adicionalmente, la secuencia
del péptido se puede usar para sustituir una parte de la
transferrina para conferir actividad terapéutica a la transferrina.
Como la mayor parte de estos péptidos es de pequeño tamaño, sus
ADNc se pueden sintetizar con emplazamientos de restricción
adecuados para inserción en el ADNc de la transferrina modificada.
El ADNc podría insertarse a continuación en un vector que contenga
el ADNc de la transferrina ADNc de manera que el péptido se exprese
como parte de la transferrina o se fusione con la molécula de
transferrina. Alternativamente, se podrían sintetizar cebadores para
PCR que contengan el péptido de interés y una sección de
transferrina adecuada. Usando estos cebadores, la amplificación de
los ADNc de la transferrina daría como resultado la fusión del
péptido en el emplazamiento elegido de la transferrina. Ejemplos de
dichos péptidos son los péptidos miméticos de la EPO:
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEC. DE ID Nº: 11); DREGCRRGWVGQCKAWFN (SEC.
DE ID Nº: 12); y QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY (SEC. DE ID Nº: 30), que
no tienen homología con la EPO natural, pero que tienen una
actividad biológica similar porque activan el receptor de la EPO
actuando como antagonistas. Estos péptidos también necesitan tener
una conformación específica para que su actividad sea óptima. Los
péptidos miméticos de la EPO se pueden insertar en (o pueden
sustituir) uno o más bucles de cistina en la transferrina. De esta
manera puede adquirir actividad EPO. Otros péptidos que se pueden
fusionar con la transferrina son péptidos con una actividad de
enlace similar a la de los anticuerpos. Estos péptidos se pueden
unir a proteínas con una afinidad relativamente elevada y
proporcionar la misma función biológica que los anticuerpos excepto
en que su semivida in vivo es muy corta. La fusión de estos
péptidos con la transferrina podría conferir a estos péptidos una
semivida mucho más larga sin destruir sus actividades de enlace.
Estos péptidos se podrían fusionar a los términos N- o C- o a ambos
en la molécula de transferrina. Los péptidos también pueden
sustituir una parte de la transferrina. Además, se pueden fusionar
más de una copia de un péptido o varios péptidos diferentes a una
única molécula de transferrina. Un ejemplo de una molécula de este
tipo es un péptido que se puede unir a TNF. La unión de este péptido
a la transferrina proporcionaría a la transferrina la capacidad de
unirse a TNF y actuar de manera similar a los anticuerpos
anti-TNF. De esta manera, se podrían fabricar
moléculas tipo anticuerpo con un protocolo de fabricación mucho más
sencillo y económico.
Se incluyen también en la presente invención los
péptidos inhibidores de enzimas fusionados a los términos N- o C- o
ambos o en el interior de la molécula de transferrina. Los péptidos
inhibidores de enzimas se podrían usar de cualquier manera,
incluyendo terapia con fármacos o en procesos industriales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de fusión dirigidas a Tf tienen
una combinación de dos o más proteínas o péptidos fusionados a Tf
modificada para servir como molécula bifuncional. En este caso, la
Tf modificada se fusiona con una proteína o péptido para tener una
actividad biológica nueva ya otra proteína o péptido para la
direccionamiento. Un ejemplo de este tipo de proteína es una Tf que
contienen una proteína inhibidora tal como una endostatina y un
péptido director tal como SCA o un péptido enlazante que puede
reconocer tumores. De esta manera, la molécula inhibidora se dirige
al tumor que lo necesita. El ADNc de esta proteína de interés se
puede aislar de una biblioteca de ADNc o se puede fabricar
sintéticamente usando varios cebadores oligonucleótidos solapantes
usando procedimientos convencionales en biología molecular. Los
nucleótidos adecuados se pueden insertar en el ADNc para que formen
emplazamientos de restricción convenientes y permitan igualmente la
unión del ADNc de la proteína al ADNc de la transferrina de manera
similar al procedimiento descrito para otras fusiones. Igualmente,
el ADNc de una proteína o péptido director tal como anticuerpos o
péptidos de cadena sencilla, tales como señales de localización
nuclear, que pueden dirigir proteínas al interior de las células se
puede fusionar en el otro extremo de la transferrina o en su
interior. La proteína de interés, y el péptido director, se clonan
en vector, lo que permite la fusión con el ADNc de la transferrina.
De esta forma ambas (ambos) proteínas/péptidos se fusionan con la
transferrina modificada. A continuación, el ADNc fusionado se
escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la
expresión de la proteína de fusión en la levadura.
Todos los procedimientos anteriores se pueden
realizar usando procedimientos convencionales en biología
molecular. La proteína de fusión secretada desde la levadura se
puede recoger y purificar del medio y ensayarse para su actividad
biológica y su actividad de dirección usando ensayos bioquímicos y
biológicos adecuados. Estas proteínas se pueden también fabricar en
otros sistemas tales como cultivo de tejidos celulares usando un
vector y un protocolo de transfección adecuados.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc de una enzima de interés se puede aislar
de diferentes maneras tal como RT-PCR procedente de
mRNA, procedente de bibliotecas de ADNc, construyendo sintéticamente
el ADNc a partir de oligonucleótidos solapantes, mediante PCR o con
otros procedimientos conocidos en la técnica, usando todos
procedimientos estandarizados. El ADNc se puede adaptar a los
extremos 5' y 3' para generar emplazamientos de restricción, de
manera que los enlazantes oligonucleótidos se pueden usar para
clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc de la Transferrina
modificada. Esto puede ser en el extremo N- o en el C-, con o sin el
uso de una secuencia separadora. El ADNc de la enzima se clona en
un vector cuyo casete de expresión completo se escinde y se inserta
en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína
de fusión en levadura. La proteína de fusión secretada de la
levadura se puede recoger y purificar del medio, y ensayarse para su
actividad biológica. Para expresión en líneas celulares de
mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto en que el
casete de expresión usado emplea un promotor, secuencia líder y de
terminación de mamífero. Este casete de expresión se escinde a
continuación y se inserta en un plásmido adecuado para la
transfección de líneas celulares de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando presentación de fago, los péptidos se
aíslan específicamente para un marcador sobre la superficie de, por
ejemplo, una célula tumoral. El péptido se fusiona a continuación
con los términos N-, C- o N- y C- de la transferrina modificada
para dirigir la fusión a este tipo celular específico. A la proteína
de fusión de transferrina se le introduce un ion metálico que se
parece al hierro en sus propiedades de enlace a la transferrina,
pero que es citotóxico, por ejemplo galio o iones radiactivos.
Mediante este mecanismo, el galio o el ión radiactivo se dirige al
tipo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo, un sistema de presentación de
péptido para generar secuencias de péptidos de la presente
invención utiliza la región N- de la transferrina incorporado a la
proteína pIII y la inserción de péptidos dentro de la estructura de
la transferrina (Tf). Debido a su naturaleza, estos péptidos quedan
restringidos, y tienen la ventaja de ser seleccionados por el
entorno, su posición en la molécula de transferrina, en la que se
van a usar definitivamente.
La primera etapa es clonar el gen pIII de
M13mp18 e introducir la región N- de la Transferrina en el término N
de pIII. Los péptidos se insertan a continuación en bucles expuestos
dentro de la molécula de transferrina.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN de pIII se amplificó
mediante la PCR usando M13mp18 como plantilla para la inserción en
pUC18 bajo el control del promotor LacZ. Como pIII requiere su
propia secuencia líder para el procesado correcto, el producto de
la PCR no se ubicó convenientemente en el emplazamiento de
multiclonación (MCS) de pUC18. Se usó el emplazamiento
HindIII del MCS para la ligadura en el extremo 3' de pIII y
permitió la construcción de un codón de detención doble. Sin
embargo, para ligadura en el extremo 5' se requiere insertar un
emplazamiento de restricción, NcoI, alrededor del codón de
inicio para el operón LacZ.
Usando el kit de Mutagénesis dirigida al
emplazamiento Stratagene QuickChange XL (nº de catálogo 20051) se
diseñaron cebadores para las mutaciones mostradas (fig. 5). El
producto de esta mutagénesis, pUC18 NcoI, se digirió a
continuación con NcoI/HindIII en preparación de la clonación
de pIII.
Se diseñaron cebadores (fig. 6) para introducir
un emplazamiento NcoI en el 5' de pIII y un doble codón de
detención más emplazamiento HindIII en el 3' de pIII mediante
mutagénesis por PCR usando M13mp18 como plantilla. Estos
emplazamientos dieron como resultado una inserción en el marco de
pIII con la metionina N terminal de LacZ y la rotura del
transcripto LacZ normal tras la clonación en el en pUC18NcoI
digerido cono NcoI/HindIII como un fragmento
NcoI/HindIII. Esto produjo el plásmido pUC18pIII.
Se diseñaron cebadores (fig. 7) para introducir
un emplazamiento SacII usando el kit de Mutagénesis dirigida
al emplazamiento Stratagene QuickChange XL (nº de catálogo 20051) en
la unión entre la secuencia señal de pIII y la pIII madura dando
como resultado el plásmido pUC18pIIISacII.
Esto permitió que la región N de la Transferrina
se modificara mediante PCR mutagénica, con pREX0056 como plantilla,
para introducir un emplazamiento SacII 5' y un emplazamiento
SfiI 3' (fig. 8) para clonación en
pUC18pIIISacII digerido mediante SacII/SfiI para dar pUC18pIII Ndom.
pUC18pIIISacII digerido mediante SacII/SfiI para dar pUC18pIII Ndom.
\vskip1.000000\baselineskip
Una ADN que codificaba una secuencia de péptido
aleatorio de ocho aminoácidos se cortó y empalmó a la región N de
la Transferrina entre los aminoácidos 288 y 289 con el objeto de
generar una biblioteca de péptido aleatorio en la superficie de la
región N de la Transferrina que se pueda cribar frente a potenciales
dianas para aislar péptidos que, en el contexto de su presentación,
se unan con afinidad elevada. La metodología descrita se pueden
usar en el corte y empalme de un ADN que codifique una secuencia o
secuencias de péptido aleatorio en otros puntos de la superficie de
la región N de la Transferrina. Debido a la homología estructural
entre las regiones N y C de la Transferrina, una vez se ha aislado
un péptido desde la librería de región N, ésta se puede duplicar en
la posición equivalente de la región C para dar multivalencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de péptido aleatorio se generó
mediante PCR mutagénica (Immunological Method Manual, Lefkovits, L.
(Ed.) 1977 Academic Press) (fig. 9). Se sintetizaron dos cebadores
oligonucleótidos mutagénicos (C (P0234) y D (P0235)) (Fig. 10).
Usando pUC18pIIINdom como plantilla y dos cebadores externos (A y B)
se sintetizó un fragmento de ADN con la secuencia aleatoria
insertada. Este fragmento se digirió con EcoRI/SfiI y se ligó
en pUC18pIIINdom digerido con EcoRI/SfiI. A continuación, el
ADN unido se transformó en una biblioteca de DH5 \alpha o de otra
cepa de E. coli. La biblioteca se comprobó mediante
procedimientos estandarizados para determinar el tamaño de la
biblioteca y la variabilidad de la secuencia insertada seguido por
amplificación de la biblioteca para uso en el cribado.
La biblioteca construida de esta manera se puede
usar de dos maneras. Como tal, la fusión región
N-pIII se localiza en la membrana celular, con la
región N orientada hacia el espacio periplásmico. Por rotura suave
de la membrana externa, se pueden cribar células completas frente al
antígeno diana. La bacteria que contiene la biblioteca de
presentación de fago se puede plaquear en medio agar y dejarse
crecer y expresar la proteína pIII. A continuación, un papel de
filtro réplica procedente de la placa se sondea con el antígeno
diana. La colonia bacteriana que muestra enlace con el antígeno se
puede recoger de la plana original y subclonarse adicionalmente. La
secuencia del péptido active se puede identificar aislando de la
bacteria el plásmido que contiene pIII. Se pueden usar protocolos
similares para usar levaduras que contienen péptidos frente a un
antígeno específico. Como las colonias de levaduras y bacterias
están localizadas, el protocolo se puede usar para células unidas o
bibliotecas secretadas.
Con la adición de una secuencia de empaquetado
funcional en el vector pUC18pIIINdom, la biblioteca se puede usar
en el sistema de dos vectores anteriormente descrito para generar
partículas de fago que se pueden cribar de diferentes formas como se
describe en la bibliografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el mismo conjunto de cebadores
mutagénicos (P0234 y P0235) pero un conjunto diferente de cebadores
externos y pREX0056 como plantilla, se sintetiza un fragmento PCR
con la secuencia aleatoria para construcción de una biblioteca de
presentación de la región N de levaduras. Esto es, una biblioteca
secretada o un constructo anclado a la pared celular de una célula
individual usando un ancla GPI específica de la pared celular
(Hamada y col., 1998, J. Biol. Chem. 273:26946-53)
en un vector con bajo número de copia.
Aunque la presente invención se ha descrito en
detalle con referencia a los ejemplos anteriores, se entiende que se
pueden realizar distintas modificaciones sin separarse del espíritu
de la invención. Según esto, la invención queda limitada únicamente
por las siguientes reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
\bullet US 48540403 P [0001]
\bullet US 38406003 A [0001]
\bullet US 40699702 P [0001]
\bullet US 5876969 A [0005]
\bullet US 5766883 A [0005]
\bullet US 5672683 A [0006]
\bullet US 5977307 A [0006]
\bullet US 5026651 A [0007] [0008]
\bullet US 5986067 A [0008] [0072] [0080]
[0087] [0144] [0333] [0473] [0474]
\bullet US 5698195 A [0013] [0530]
\bullet WO 9417810 A [0037]
\bullet WO 9423744 A [0037]
\bullet US 40697702 P [0062]
\bullet US 406977 P [0064]
\bullet US 4683195 A, Mullis [0106]
\bullet US 4683202 A, Mullis [0106]
\bullet US 5547871 A [0110] [0130]
\bullet US 6291212 B [0114] [0115] [0117]
[0118] [0120] [0130]
\bullet EP 171142 A, Kawasaki and Bell
[0115]
\bullet US 4599311 A, Kawasaki [0115]
\bullet EP 0258067 A [0115]
\bullet EP 0286424 A [0115]
\bulletEP 0317254 A [0115]
\bulletEP 0387319 A [0115]
\bullet EP 0386222 A [0115]
\bullet EP 0424117 A [0115]
\bullet EP 0431880 A [0115]
\bullet EP 1002095 A [0115]
\bullet EP 0828759 A [0115]
\bullet EP 0764209 A [0115]
\bullet EP 0749478 A [0115]
\bullet EP 0889949 A [0115]
\bullet WO 0044772 A [0115]
\bullet WO 9404687 A [0115]
\bullet US 5739007 A [0115]
\bullet US 5637504 A [0115]
\bullet US 5302697 A [0115]
\bullet US 5260202 A [0115]
\bullet US 5667986 A [0115]
\bullet US 5728553 A [0115]
\bullet US 5783423 A [0115]
\bullet US 5965386 A [0115]
\bullet US 6150133 A [0115]
\bullet US 6379924 A [0115]
\bullet US 5714377 A [0115]
\bullet WO 03020746 A [0134] [0156] [0190]
[0202]
\bullet US 4652440 A, Eckelman [0139]
\bullet WO 8705030 A, Parker [0139]
\bullet EP 203764 A, Wilber [0139]
\bullet US 4656026 A, Coffman [0139]
\bullet WO 942820 A [0183]
\bullet WO 9619495 A [0183]
\bullet WO 9640191 A [0183]
\bullet WO 0164013 A [0183]
\bullet US 6333395 B [0183]
\bullet US 6258782 B [0183]
\bullet US 6228983 B [0183]
\bullet US 6133418 A [0183]
\bullet US 6093794 A [0183]
\bullet US 6068973 A [0183]
\bullet US 6060065 A [0183]
\bullet US 6054265 A [0183]
\bullet US 6020459 A [0183]
\bullet US 6017536 A [0183]
\bullet US 6013263 A [0183]
\bullet US 5464933 A [0183]
\bullet US 5346989 A [0183]
\bullet US 5603933 A [0183]
\bullet US 5656480 A [0183]
\bullet US 5759517 A [0183]
\bullet US 6245737 B [0183]
\bullet US 6326004 B [0183]
\bullet US 6348568 B [0183]
\bullet WO 0179258 A [0189] [0202]
\bullet WO 0177137 A [0189] [0202]
\bullet WO 0179442 A [0189] [0202]
\bullet WO 0179443 A [0189] [0202]
\bullet WO 0179444 A [0189] [0202]
\bullet WO 0179480 A [0189] [0202]
\bullet US 6291740 B [0341] [0345]
\bullet US 6281408 B [0341] [0346]
\bullet US 6271436 B [0341] [0347]
\bullet WO 9008832 A [0344]
\bullet US 6225290 B [0350] [0351]
\bullet US 6187305 B [0350] [0352]
\bullet US 6140111 A [0350] [0353]
\bullet US 4868116 A [0353]
\bullet US 4980286 A [0353]
\bullet WO 8907136 A [0353]
\bullet EP 378576 A [0353]
\bullet WO 8905345 A [0353]
\bullet WO 9006997 A [0353]
\bullet US 6562617 B [0356]
\bullet US 5270170 A [0370]
\bullet US 5824483 A [0415]
\bullet US 5571698 A, Ladner [0417]
\bullet US 9117271 W [0422]
\bullet US 9118980 W [0422]
\bullet US 9119818 W [0422]
\bullet US 9308278 W [0422]
\bullet US 6555310 B [0424]
\bullet US 6258350 B [0426]
\bullet US 5922545 A [0439]
\bullet US 6300064 B [0440]
\bullet US 6573098 B [0452] [0466]
\bullet US 4703008 A [0502]
\bullet US 4810643 A [0502]
\bullet US 5908763 A [0502]
\bullet US 5326859 A [0505]
\bullet US 4588585 A [0505]
\bullet EP 32134 A [0505]
\bullet US 60406977 B [0530]
\bullet US 10384060 B [0530]
\bullet US 60485404 B [0530]
\bulletPark et al. Journal of Drug
Targeting, vol. 6 (1), 53-64 [0006]
\bulletAli et al. J. Biol.
Chem., 1999, vol. 274 (34), 24066-24073
[0006] [0094]
\bulletShin et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol. 92, 2820-2824 [0006]
\bulletAisen et al. Ann. Rev.
Biochem., 1980, vol. 49, 357-393
[0007]
\bulletMacGillivray et al. J. Biol.
Chem., 1981, vol. 258, 3543-3553
[0007]
\bullet van Eijk et al. Clin. Chim.
Acta, 1983, vol. 132, 167-171 [0007]
\bulletStibler. Clin. Chem.,
1991, vol. 37, 2029-2037 [0007]
\bulletArndt. Clin. Chem.,
2001, vol. 47 (1), 13-27 [0007]
\bullet Carbohydrate-deficient
consumption. Stibler et al. Advances in the Biosciences.
Pergamon, 1988, vol. 71, 353-357
[0007]
\bulletMacGillivray et al. J. Biol.
Chem., 1983, vol. 258 (6), 3543-3546
[0008]
\bulletBatzer et al. Nucleic Acid
Res., 1991, vol. 19, 5081 [0026]
\bulletOhtsuka et al. J. Biol.
Chem., 1985, vol. 260, 2605-2608
[0026]
\bulletRossolini et al. Mol. Cell.
Probes, 1994, vol. 8, 91-98 [0026]
\bulletMa et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 1997, vol. 94, 12744-12746
[0037]
\bulletCranage et al. EMBO J.,
1986, vol. 5, 3057-3063 [0037]
\bullet The Immunoglobulin Gene Superfamily.
A. F. Williams; A. N. Barclay. Immunoglobulin Genes. Academic
Press, 1989, 361-387 [0049]
\bulletChothia; Lesk. J. Mol.
Biol., 1987, vol. 196, 901 [0050]
\bulletChothia et al. Nature,
1989, vol. 342, 877 [0050]
\bullet E. A. Kabat et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes
of Health, 1987 [0050]
\bulletTramontano et al. J. Mol.
Biol., 1990, vol. 215, 175 [0050]
\bullet E. Kabat et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of
Health and Human Services, 1987 [0051]
\bulletBrown et al. Nature,
1982, vol. 296, 171-173 [0057]
\bulletRose et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 1261-1265
[0057]
\bulletBaker et al. FEBS Lett,
1992, vol. 298, 215-218 [0057]
\bulletAlemany et al. J. Cell
Sci., 1993, vol. 104, 1155-1162
[0057]
\bulletFood et al. J. Biol.
Chem., 1994, vol. 274, 7011-7017
[0057]
\bulletBennett et al. Clin.
Sci. (Lond.), 1979, vol. 57, 453-460
[0058]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 [0081]
\bulletFord et al. Prot. Exp.
Pur., 1991, vol. 2, 95-107 [0083]
\bulletBaldwin, G.S. Comparison of
Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem.
Physiol., 1993, vol. 106B (1), 203-218
[0106]
\bullet Computational Molecular Biology.
Oxford University Press, 1988 [0107]
\bullet Biocomputing: Informatics and Genome
Projects. Academic Press, 1993 [0107]
\bullet Computer Analysis of Sequence Data,
Part I. Humana Press, 1994 [0107]
\bulletHeinje, G. Sequence Analysis in
Molecular Biology. Academic Press, 1987 [0107]
[0108]
\bullet Sequence Analysis Primer. M
Stockton Press, 1991 [0107] [0108]
\bulletCarillo, H.; Lipman, D.
SIAM J. Applied Math., 1988, vol. 48, 1073 [0108]
\bullet Guide to Huge Computers. Academic
Press, 1994 [0108]
\bulletDevereux et al. Nucl. Acid
Res., 1984, vol. 12 (1), 387 [0109]
\bulletAtschul et al. J. Mol.
Biol., 1990, vol. 215, 403 [0109]
\bulletNeedleman; Wunsch. J. Mol.
Biol., 1970, vol. 48, 443-453 [0109]
\bulletGrantham, R et al. Nucl.
Acid Res., 1980, vol. 8, 49-62 [0111]
\bulletGrantham, R. et al. Nucl.
Acid Res., 1981, vol. 9, 43-74 [0111]
\bulletMaroyarna, T. et al. Nucl.
Acid Res., 1986, vol. 14, 151-197
[0111]
\bulletAota, S. et al. Nucl. Acid
Res., 1988, vol. 16, 315-402 [0111]
\bulletWada, K. et al. Nucl. Acid
Res., 1991, vol. 19, 1981-1985 [0111]
\bulletKurland, C. G. FEBS
Lett., 1991, vol. 285, 165-169 [0111]
\bulletPedersen, S. EMBO J.,
1984, vol. 3, 2895-2898 [0111]
\bulletSorensen, M. A. J. Mol.
Biol., 1989, vol. 207, 365-377 [0111]
\bulletRandall, L. L. et al. Eur.
J. Biochem., 1980, vol. 107, 375-379
[0111]
\bulletCurran, J. F.; Yarus, M.
J. Mol. Biol., 1989, vol. 209, 65-77
[0111]
\bulletVarenne, S. et al. J. Mol.
Biol., 1984, vol. 180, 549-576 [0111]
\bulletVarenne, S. et al. J. Mol,
Biol., 1984, vol. 180, 549-576 [0111]
\bulletGarel, J.-P. J. Theor.
Biol., 1974, vol. 43, 211-225 [0111]
\bulletIkemura, T. J. Mol.
Biol., 1981, vol. 146, 1-21 [0111]
\bulletIkemura, T. J. Mol.
Biol., 1981, vol. 151, 389-409 [0111]
\bulletStruhl et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1978, vol. 76, 1035-1039
[0114]
\bulletBroach et al. Gene,
1979, vol. 8, 121-133 [0114]
\bulletBeggs. Nature,
1978, vol. 275, 104-108 [0114]
\bulletBotstein et al. Gene,
1979, vol. 8, 17 [0115]
\bulletHitzeman et al. J Biol.
Chem., 1980, vol. 225, 12073-12080
[0115]
\bulletAlber; Kawasaki. J. Mol.
Appl. Genet., 1982, vol. 1, 419-434
[0115]
\bulletYoung et al. Genetic
Engineering of Microorganisms for Chemicals. Plenum,
1982, 355 [0115]
\bulletAmmerer. Meth. Enzymol.,
1983, vol. 101, 192-201 [0115]
\bulletRussell et al. Nature,
1983, vol. 304, 652-654 [0115]
\bulletMcKnight et al. EMBO J.,
1985, vol. 4, 2093-2099 [0116]
\bulletKaufman; Sharp. Mol. Cell.
Biol., 1982, vol. 2, 1304-13199
[0117]
\bulletSubramani et al. Mol. Cell.
Biol., 1981, vol. 1, 854-864 [0117]
\bulletPalmiter et al. Science,
1983, vol. 222, 809-814 [0117]
\bulletGrant et al. Nuc. Acids
Res., 1987, vol. 15, 5496 [0117]
\bulletDeNoto et al. Nucl. Acid
Res., 1981, vol. 9, 3719-3730 [0118]
\bulletGillies. Cell,
1983, vol. 33, 717-728 [0118]
\bulletHinnen et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 1929-1933
[0119]
\bulletYelton et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 1740-1747
[0119]
\bulletRussell. Nature,
1983, vol. 301, 167-169 [0119]
\bulletBecker; Guarente. Methods in
Enzymol., 1991, vol. 194, 182-187
[0119]
\bulletWigler et al. Cell,
1978, vol. 14, 725 [0120]
\bulletCorsaro; Pearson. Somatic
Cell Genetics, 1981, vol. 7, 603 [0120]
\bulletGraham; Van der Eb.
Virology, 1973, vol. 52, 456 [0120]
\bulletNeumann et al. EMBO J.,
1982, vol. 1, 841-845 [0120]
\bulletSimonsen; Levinson. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80,
2495-2499 [0120]
\bulletThilly. Mammalian Cell
Technology. Butterworth Publishers [0120]
\bulletSteinlein et al. Protein
Express. Purif., 1995, vol. 6, 619-624
[0123]
\bulletBallou et al. J. Biol.
Chem., 1980, vol. 255, 5986-5991
[0124]
\bulletGentzsch; Tanner.
Glycobiology, 1997, vol. 7, 481-486
[0124]
\bulletJones. Genetics,
1977, vol. 85, 23-33 [0125]
\bulletTowbin et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 4350-4354
[0133]
\bulletAldred et al. Biochem.
Biophys. Res. Commun., 1984, vol. 122,
960-965 [0144]
\bullet Current Protocols in Molecular
Biology. Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley &
Sons Inc, 1989 [0163]
\bulletBrufiag et al. Comp. App.
Biosci, 1990, 245 [0165]
\bulletBowie et al. Deciphering
the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid
Substitutions. Science, 1990, vol. 247,
1306-1310 [0167]
\bullet T. E. Creighton.
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES. W. H.
Freeman and Company, 1993 [0169]
\bullet POST-TRANSLATIONAL
COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS. Academic Press,
1983, 1-12 [0169]
\bulletSeifter et al. Meth.
Enzymol., 1990, vol. 182, 626-646
[0169]
\bulletRattan et al. Ann. N.Y.
Acad. Sci., vol. 663, 48-62 [0169]
\bulletJohnson et al. Nephrol.
Dial. Transplant, 2000, vol. 15 (9),
1274-7 [0184]
\bulletKuai et al. J. Pept.
Res., 2000, vol. 56 (2), 59-62 [0184]
\bulletBarbone et al. Nephrol.
Dial. Transplant., 1999, vol. 14 (2),
80-4 [0184]
\bulletMiddleton et al. J. Biol.
Chem., 1999, vol. 274 (20), 14163-9
[0184]
\bulletJohnson et al.
Biochemistry, 1998, vol. 37 (11),
3699-710 [0184]
\bulletJohnson et al. Chem.
Biol., 1997, vol. 12, 939-50 [0184]
\bulletWrighton et al. Nat.
Biotechnol., 1997, vol. 15 (12), 1261-5
[0184]
\bulletLivnah et al. Science,
1996, vol. 273, 464-71 [0184]
\bulletWrighton et al. Science,
1996, vol. 273, 458-64 [0184]
\bulletPoljak-Blazi et al. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals (United
States), June 2000, vol. 15/3, 285-293 [0193]
\bulletDemant, E.J. Eur. J.
Biochem., 1983, vol. 137 (1-2),
113-118 [0194]
\bulletPadbury et al. J. Biol.
Chem., 1985, vol. 260 (13), 7820-7823
[0194]
\bulletRobbins; Angell. Basic
Pathology. W. B. Saunders Co, 1976,
68-79 [0246]
\bulletCurr. Top. Microbiol. Immunol.,
1998, vol. 231 (1), 41 [0258]
\bulletScience, 1997, vol. 276,
59-87 [0314]
\bulletXia et al. J. Pharmacol.
Experiment. Therap., 2000, vol. 295,
594-600 [0328] [0335]
\bulletXia et al. Pharmaceutical
Res., 2001, vol. 18 (2), 191-195 [0328]
[0335]
\bulletShah et al. J.
Pharmaceutical Sci., 1996, vol. 85 (12),
1306-1311 [0328]
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences.
Mack Publishing Co, 1990 [0329]
\bullet Oral Delivery of Microencapsulated
Proteins. DiBase; Morrel. Protein Delivery:Physical Systems.
Plenum Press, 1997, 255-288 [0331]
\bulletWall et al. J. Cell.
Biochem., 1992, vol. 49, 113 [0343]
\bulletJanenich. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1976, vol. 73, 1260 [0343]
\bulletJanenich et al. Cell,
1981, vol. 24, 519 [0343]
\bulletStuhlmann et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 7151 [0343]
\bulletJahner et al. Proc. Natl.
Acad Sci. USA, 1985, vol. 82, 6927 [0343]
\bullet Van der Putten et al. Proc.
Natl. Acad Sci. USA, 1985, vol. 82,
6148-6152 [0343]
\bulletStewart et al. EMBO J.,
1987, vol. 6, 383-388 [0343]
\bulletJahner, D. et al.
Nature, 1982, vol. 298, 623 [0344]
\bulletHaskell; Bowen. Mol. Reprod.
Dev., 1995, vol. 40, 386 [0344]
\bulletIjima et al. Human Gene
Therapy (United States), 2001, vol. 12 (9),
1063-77 [0349]
\bulletPluckthun; Ge. Angew. Chem.
Int Ed. Engl., 1991, vol. 30, 296-298
[0367]
\bulletBartel P. L.; Roecklein
J. A. et al. Nat Genet, January 1996, vol. 12 (1),
72-77 [0373]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 [0374]
\bulletMcBride; Caruthers. Tetr.
Letters, 1983, vol. 22, 245 [0377]
\bulletAtkinson; Smith.
Oligonucleotide Synthesis. 1984, 35-82
[0378]
\bulletQin Z.;
Kruger-Krasagakes S. et al. J. Exp.
Med., vol. 178, 355-360 [0391]
\bulletGoddijn O. J.; Pennings
E. J. et al. Transgenic Res., 1995, vol. 4,
315-323 [0391]
\bulletLeung et al. Technique,
1989, vol. 1, 11-15 [0406]
\bulletEipper et al. J. Biol.
Chem., 1991, vol. 266, 7827-7833
[0411]
\bulletMizuno et al. Biochem.
Biophys. Res. Comm., 1986, vol. 137 (3),
984-991 [0411]
\bulletMurthy et al. J. Biol.
Chem., 1986, vol. 261 (4), 1815-1822
[0411]
\bulletKatopodis et al.
Biochemistry, 1990, vol. 29, 6115-6120
[0411]
\bulletYoung; Tamburini. J. Am.
Chem. Soc., 1989, vol. 111, 1933-1934
[0411]
\bulletCwirla et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6378-6382
[0417] [0419]
\bulletDevlin et al. Science,
1990, vol. 249, 404-406 [0417] [0419]
\bulletScott; Smith. Science,
1990, vol. 249, 386-388 [0417]
\bulletParmley; Smith. Gene,
1988, vol. 73, 305-318 [0419] [0425]
\bulletScott; Smith. Science,
1990, vol. 249, 386-390 [0419]
\bulletGarrard et al. Bio/Tech,
1991, vol. 9, 1373-1377 [0423]
\bulletScott; Smith. Science,
1990, vol. 249, 386 [0428]
\bulletKang et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.), 1991, vol. 88, 4363 [0429]
\bulletClackson et al. Nature,
1991, vol. 352, 624 [0429] [0441]
\bulletMcCafferty et al.
Nature, 1990, vol. 348, 552 [0429] [0441]
\bulletBurton et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.), 1991, vol. 88, 10134 [0429]
\bulletHoogenboom et al. Nucleic
Acids Res., 1991, vol. 19, 4133 [0429]
\bulletChang et al. J.
Immunol., 1991, vol. 147, 3610 [0429] [0441]
\bulletBreitling et al. Gene,
1991, vol. 104, 147 [0429] [0441]
\bulletMarks et al. J. Mol.
Biol., 1991, vol. 222, 581 [0429] [0441]
\bulletBarbas et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.), 1992, vol. 89, 4457 [0429]
\bulletHawkins; Winter. J.
Immunol., 1992, vol. 22, 867 [0429] [0441]
\bulletMarks et al.
Biotechnology, 1992, vol. 10, 779 [0429] [0430]
[0441]
\bulletMarks et al. J. Biol.
Chem., 1992, vol. 267, 16007 [0429] [0441]
\bulletLowman et al.
Biochemistry, 1991, vol. 30, 10832 [0429] [0441]
\bulletLerner et al. Science,
1992, vol. 258, 1313 [0429] [0441]
\bulletWinter G; Milstein C.
Nature, 1991, vol. 349, 293 [0430]
\bulletHarks et al. J. Mol.
Biol., 1991, vol. 222, 581 [0430]
\bulletChaudhary et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 1066 [0430]
\bulletChiswell et al. TIBTECH,
1992, vol. 10, 80 [0430]
\bulletHuston et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1988, vol. 85, 5879 [0430]
\bulletStemmer et al.
Biotechniques, 1993, vol. 14, 256 [0438]
\bulletDeng et al. J. Biol.
Chem., 1994 vol. 269, 9533 [0438]
\bulletRiechmann et al.
Biochemistry, 1993, vol. 32, 8848 [0438]
\bulletBarbas et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4457 [0438]
\bulletHuse et al. Science,
1989, vol. 246, 1275 [0441]
\bulletCaton; Koprowski. Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 6450 [0441]
\bulletMullinax et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1990, vol. 87, 8095 [0441]
\bulletPersson et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 2432 [0441]
\bulletKang et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 4363 [0441]
\bulletBurton et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1991, vol. 88, 10134 [0441]
\bulletHoogenboom et al. Nucl. Acid
Res., 1991, vol. 19, 4133 [0441]
\bulletBarbas et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 1992, vol. 89, 4457 [0441]
\bulletRader, C.; Barbas, C. F.
Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr. Opin.
Biotechnol., 1997, vol. 8, 503-508
[0441]
\bulletKunkel et al. Proc. Natl.
Acad. Sci., 1985, vol. 82, 488-492
[0473]
\bulletNelson, R. M.; Long, G.
L. Anat. Biochem., 1989, vol. 180,
147-151 [0474]
\bullet Immunological Method Manual.
Academic Press, 1977 [0525]
\bulletHamada et al. J. Biol.
Chem., 1998, vol. 273, 26946-53
[0528]
<110> Prior, Christopher P. Turner, Andrew
J. Sadeghi, Homayoun
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bibliotecas de Proteínas de Fusión
de la Transferrina
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
054710-5007-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/406.977
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-08-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/384.060
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-03-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/485.404
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-07-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(2147)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GenBank Nº NM_001063, gen y proteína
de la transferrina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(107)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 698
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína transferrina madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido antifusogénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio
humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido antifusogénico
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio
humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido antifusogénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus sincitial respiratorio
humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido antifusogénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia variante de corte y
empalme de lactoferrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido para la mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaaact acgataagag cgataat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido para la mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatttggaa gcgacgtaac tgactgc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptidomimético de EPO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptidomimético de EPO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(108)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH para proteínas de
fusión
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(123)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de antifusogénico de VIH para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína INGAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(525)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(444)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(436)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias INGAP para proteínas de fusión
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de miméticos EPO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencias de miméticos EPO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Región de inserción en el péptido de transferrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Región de inserción en el péptido de transferrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de ADN transferrina en la región de inserción
en el péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de ADN transferrina en la región de inserción
en el péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptidomimético EPO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plantilla para general la biblioteca
de péptidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a ó c ó g ó t; k = g ó t.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnknnknnkn nknnknnknn knnknnknnk
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plantilla para general la biblioteca
de péptidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1). .(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a ó c ó g ó t; m = a ó c.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnmnnmnnmn nmnnmnnmnn mnnmnnmnnm
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plantilla para la región de
separación de un anticuerpo de cadena única
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly ó -NH2, aminoácidos
7-36/37 de GLP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plantilla C-terminal
para amidación
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido de enlace para fragmentos
Fv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryctolagus cuniculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 677
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 688
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Equus caballus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (308)..(308)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa/ScFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV, SEC. DE ID Nº 5 del
documento US 5.698.195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18250
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18254
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature, Nº de acceso Gen Bank
BAB18256
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18256
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región del emplazamiento NcoI de
pUC18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(140)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región del emplazamiento NcoI de
pUC18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ccatggccat gattacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaatcatg gccatggctg tttcctg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de recubrimiento M13 pIII
para inserción en los vectores pUC18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(1349)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de recubrimiento M13 pIII
para inserción en los vectores pUC18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaacagcc atggtgaaaa aattattatt cgcaattcct ttag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacggccag tgccaagctt attaagactc cttattacgc agtatgttag c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de inserción de transferrina
en los vectores M13-pUC18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(140)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de inserción de transferrina
en los vectores M13-pUC18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattctcac tccgcggacg gggctgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagccccgt ccgcggagtg agaatag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región N de la transferrina
modificada para clonación en los vectores M13-pUC18
vectors
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(1118)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región N de la transferrina
modificada para clonación en los vectores M13-pUC18
vectors
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcactccgc ggacggggcg gtacctgata aaactgtgag atgg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttcaacag tttcggcccc agcggcccct tcatctgttg gggcttctg
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable para generar una
biblioteca en los vectores M13-pUC18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(282)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a ó c ó g ó t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(282)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 11
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 12
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 13
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 14
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 15
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 16
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 17
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en la localización 18
define Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val,
Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, o Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable para generar una
biblioteca en los vectores M13-pUC18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a ó c ó g ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de clonación
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a ó c ó g ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa/ScFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV, SEC. DE ID Nº5 del
documento US 5.698.195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región HV de un anticuerpo
anti-TNF-alfa/ScFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V_{L} de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18253
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V_{L} de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18255
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región V_{L} de un anticuerpo
anti-TNF-alfa, Nº de acceso Gen Bank
BAB18257
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Biblioteca de fagos que contiene una
pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer
polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo
péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el
receptor transferrina (TfR).
2. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf comprende la región N de una proteína Tf.
3. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf está constituido por la región N de una proteína
Tf.
4. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf comprende una porción de la región N de una proteína
Tf.
5. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf muestra una glicosilación reducida.
6. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido está fusionado con el extremo
C-terminal del péptido Tf.
7. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido está fusionado con el extremo
N-terminal del péptido Tf.
8. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido se inserta en el péptido Tf.
9. Biblioteca de la reivindicación 8, en la que
el segundo péptido está insertado en un bucle expuesto a la
superficie del péptido Tf.
10. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
las proteínas de fusión comprenden adicionalmente un enlazante
flexible entre el péptido transferrina y el péptido aleatorio.
11. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
cada uno de los segundos péptidos de la biblioteca es diferente.
12. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido comprende al menos una región determinante de la
complementariedad (CDR).
13. Biblioteca de la reivindicación 12, en la
que el segundo péptido comprende tres CDR de anticuerpo
diferentes.
14. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido comprende aproximadamente 6 o más
aminoácidos.
15. Biblioteca de la reivindicación 14, en la
que el segundo péptido comprende de aproximadamente 6 a
aproximadamente 30 aminoácidos.
16. Biblioteca de la reivindicación 15, en la
que el segundo péptido comprende aproximadamente 6, 9, 12, 16, 19,
20, 25, o 30 aminoácidos.
17. Biblioteca de moléculas de ácido nucleico
que codifican una biblioteca de la reivindicación 1.
18. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
la biblioteca es una biblioteca de presentación de fagos no
líticos.
19. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
la biblioteca es una biblioteca de péptidos aleatorios o una
biblioteca de péptidos naturales.
20. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
la biblioteca es una biblioteca de péptidos estructurados, una
biblioteca de proteínas, una biblioteca de anticuerpos humanos, una
biblioteca de péptidos lineales, o una biblioteca de enzimas.
21. Procedimiento para cribar una proteína de
fusión de transferrina que tiene una actividad particular que
comprende:
a) proporcionar una biblioteca de fagos que
contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada
una un primer péptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un
segundo péptido en el que el péptido Tf tiene una afinidad reducida
por el receptor transferrina (TfR); y
b) cribar la biblioteca para identificar las
proteínas de fusión de transferrina que tienen la actividad
particular.
\newpage
22. Procedimiento de la reivindicación 21, que
comprende además aislar al menos una proteína de fusión identificada
en la etapa (b).
23. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
la proteína de fusión comprende una proteína pIII de fago.
24. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección o
adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de la
SEC. DE ID. Nº: 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp
63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr
426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127,
Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.
25. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf no se une a TfR.
26. Biblioteca de la reivindicación 25, en la
que el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección
o adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de
la SEC. DE ID. Nº 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp
63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr
426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127,
Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.
27. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el hierro.
28. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf no se une al hierro.
29. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
la proteína Tf comprende al menos una mutación que evita la
glicosilación.
30. Biblioteca de la reivindicación 29, en la
que la mutación corresponde a una mutación en el aminoácido N413 o
en el aminoácido N611.
31. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el bicarbonato.
32. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf no se une al bicarbonato.
33. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf está modificado en uno o más de los emplazamientos
internos seleccionado entre el grupo que comprende el emplazamiento
de unión al hierro, el emplazamiento de la bisagra, el emplazamiento
de unión al bicarbonato, y el emplazamiento de unión al
receptor.
34. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que
el péptido Tf comprende una única región N de una proteína Tf.
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