ES2355488T3

ES2355488T3 - Proteína de fusión de tranferrina modificadas.

Info

Publication number: ES2355488T3
Application number: ES02757486T
Authority: ES
Inventors: Christopher P. Prior
Original assignee: Biorexis Technology Inc
Current assignee: Biorexis Technology Inc
Priority date: 2001-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2011-03-28
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: CN101177455A; CN101519449A; CN101177456A

Abstract

Una proteína de fusión purificada que comprende a proteína de transferrina (Tf) que muestra glicosilación reducida fusionada a al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que la semivida en suero o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico se incrementa respecto de la semivida en suero o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico en un estado no fusionado y en el que dicha proteína de Tf comprende al menos una mutación que reduces o evita la glicosilación.

Description

Proteína de fusión de transferrina modificadas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas o péptidos terapéuticos con estabilidad en suero o semivida en suero ampliada, en particular a proteínas o péptidos terapéuticos fusionados o insertados en una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la glicosilación, unión a hierro y/o unión al receptor de transferrina.

Antecedentes de la invención

Proteínas o péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de manera recombinante son típicamente moléculas lábiles que muestran períodos cortos de estabilidad en suero o semivida en suero. Además, estas moléculas son a menudo extremadamente lábiles cuando se formulan, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas para propósito diagnóstico o terapéutico.

Existen pocas soluciones prácticas para ampliar o promover la estabilidad in vivo o in vitro de moléculas terapéuticas proteináceas. Polietilen glicol (PEG) es una sustancia que puede unirse a una proteína, que da como resultado actividad de actuación más prolongada, sostenida de la proteína. Si la actividad de una proteína se prolonga mediante la unión a PEG, disminuye la frecuencia con la que la proteína se debe administrar. Sin embargo, la unión a PEG, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de la proteína.

Proteínas o péptidos terapéuticos también se han estabilizado mediante fusión a una proteína heteróloga capaz de ampliar la semivida en suero de la proteína terapéutica. Por ejemplo, proteínas terapéuticas fusionadas a albúmina y fragmentos de anticuerpos pueden mostrar semivida en suero ampliada cuando se compara con la proteína terapéutica en estado no fusionado. Véanse las Patentes de Estados Unidos 5.876.969 y 5.766.88.

Otra proteína de suero, transferrina (Tf) humana glicosilada también se ha usado para hacer fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir la administración intracelular o para llevar agentes heterólogos a través de la barrera sangre-cerebro. Estas proteínas de fusión que comprenden Tf humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de crecimiento nervioso (NGF) o factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera sangre-cerebro mediante la fusión de longitud completa Tf a cualquier agente. Véanse las Patentes de Estados Unidos 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la parte de Tf de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro, que se requiere para la unión de Tf a su receptor en una célula y, de acuerdo con los inventores de estas patentes, para dirigir la administración del NGF o resto de CNTF a través de la barrera sangre-cerebro. Proteínas de fusión de transferrina también se han producido mediante la inserción de una secuencia de proteasa de VIH-1 en bucles expuestos en la superficie de transferrina glicosilada para investigar la capacidad de producir otra forma de fusión de Tf para la administración dirigida al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (34): 24066-24073).

La transferrina de suero (Tf) es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 daltons que se une a hierro en la circulación y se transporta a los diversos tejidos mediante el receptor de transferrina (TfR) (Aisen et al. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray et al. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de Estados Unidos 5.026.651). Tf es una de las moléculas de suero más comunes, que comprende hasta aproximadamente 5-10% de proteínas totales en suero. La transferrina deficiente en carbohidratos se produce a niveles elevados en la sangre de alcohólicos y muestra una mayor semivida (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glicosilada (aproximadamente 7-10 días). Véase van Eijk et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Amdt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler et al. in "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353-357).

La estructura de Tf se ha caracterizado bien y el mecanismo de unión al receptor, unión a hierro y se ha explicado la liberación de la unión al ion carbonato (Patentes de Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray et al. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).

La transferrina y anticuerpos que se unen al receptor de transferrina también se han usado para distribuir o llevar agentes tóxicos a las células tumorales como terapia de cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y transferrina se ha usado como un vector de terapia génica no viral como vehículo para distribuir ADN a las células (Frank et al., 1994; Wagner et al, 1992). La capacidad de distribuir proteínas al sistema nervioso central (CNS) usando el receptor de transferrina como el punto de entrada se ha demostrado con varias proteínas y péptidos incluyendo CD4 (Walus et al., 1996), factor neurotrófico derivado del cerebro (Pardridge et al., 1994), factor neurotrófico derivado glial (Albeck et al.), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel et al., 1993), un péptido betaamiloide (Saito et al., 1995), y un oligonucleótido no codificante (Pardridge et al., 1995).

Hoefkens et al ((1997) Glicoconj J. J. 14, 289-295) reseña la influencia del estado de glicosilación de transferrina sobre la unión al receptor y donación de hierro. Documento US-A-6027921 desvela la preparación de una proteína de fusión transferrina/LDLR expresada de manera recombinante. Newton et al ((1999) J. Inmunol. Meth. 231, 159-167) describe una proteína de fusión anticuerpo del receptor de antitransferrina-ARNasa expresado en la glándula mamaria de ratones transgénicos. Park et al. ((1998) J. Drug 55 Tar. 6, 53-64) describe una proteína de fusión que comprende transferrina y factor de crecimiento nervioso. Prince et al. ((1999) J. Biol. Chem. 274, 3602-3609) describe moléculas quiméricas que consisten en las regiones de cola amino-terminal y carboxilo-terminal de CFTR, cada una fusionada a los dominios transmembrana y extracelulares del receptor de transferrina. Shin et al. ((1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 2820-2824) describe proteínas de fusión de anticuerpo de transferrina eficaces en la dirección del cerebro. El documento USA-5986067 describe la provisión de transferrina modificada genéticamente. El documento EP-0413622 describe proteínas de fusión que comprenden albúmina como vehículo y CD4 como la proteína terapéutica. EP0314317 describe proteínas conjugadas y quiméricas que comprenden CD4 y una proteína de plasma, tales como transferrina humana, albúmina y una lipoproteína.

Sin embargo proteínas de fusión de transferrina no se han modificado o modificado por ingeniería para ampliar la semivida en suero de una proteína terapéutica o péptido o para incrementar la biodisponibilidad mediante la reducción o inhibición de la glicosilación del resto de Tf o para reducir o prevenir la unión a hierro y/o receptor de Tf.

Sumario de la invención

Como se describe en más detalle más adelante, la presente invención incluye proteínas de fusión de Tf modificadas que comprenden al menos una entidad proteína, polipéptido o péptido terapéutico, en la que la parte Tf está modificada por ingeniería para ampliar la semivida o biodisponibilidad en suero de la molécula. La invención también incluye formulaciones y composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión, procedimientos de ampliación de la estabilidad en suero, semivida en suero y biodisponibilidad de una proteína terapéutica mediante la fusión a transferrina modificada, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de Tf modificadas, y similares. Otro aspecto de la presente invención se refiere a proteínas de fusión modificadas de Tf para uso en un procedimiento de tratamiento médico.

En una realización preferida, la presente invención proporciona una proteína de fusión purificada que comprende una proteína de transferrina (Tf) que muestra glicosilación reducida fusionada a al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que la semivida o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico aumenta por encima de la semivida en suero o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico en un estado no fusionado y en la que dicha proteína Tf comprende al menos una mutación que reduce o evita la glicosilación.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento de incremento de la semivida en suero o estabilidad en suero de una proteína o péptido terapéutico, que comprende la expresión de dicha proteína o péptido terapéutico como una proteína de fusión con una proteína de transferrina (Tf), en la que:

dicha proteína Tf comprende al menos una mutación que reduce o evita la glicosilación; de manera que la proteína de transferrina (Tf) muestra una glicosilación reducida.

En otra realización, la invención proporciona una proteína de fusión purificada que comprende una proteína Tf que comprende la mutación en un sitio de glicosilación N-X-S/T unido a N fusionado a al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que la proteína de transferrina muestra una glicosilación reducida comparada con una proteína Tf totalmente glicosilada y en la que la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico aumenta por encima de la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico en un estado no fusionado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra una alineación de los dominios N y C de transferrina (Tf) humana (Hu) con similitudes e identidades destacadas.

Figura 2A-2B muestra una alineación de secuencias de secuencias de transferrina de diferentes especies. Sombreado claro: Similitud; Sombreado oscuro: Identidad.

Figura 3 muestra la localización de un número de sitios de inserción expuestos en la superficie de Tf para proteínas, polipéptidos o péptidos terapéuticos.

Figura 4A-4B muestra las regiones VH y VL para un número de anticuerpos preferidos anti-TNF usados para producir proteínas de fusión modificadas de Tf.

Figura 5 muestra pREX0010.

Figura 6 muestra pREX0011.

Figura 7 muestra pREX0012.

Figura 8 muestra pREX0013.

Figura 9 muestra pREX0014.

Figura 10 muestra pREX0015.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada Descripción General

Se ha descubierto que una proteína terapéutica (por ejemplo, un polipéptido, anticuerpo, o péptido, o fragmentos y sus variantes) se pueden estabilizar para ampliar la semivida en suero y/o retener la actividad de las proteínas terapéuticas durante períodos amplios de tiempo in vivo by mediante fusión genética o conjugación química de la proteína, polipéptido o péptido terapéutico a toda o una parte de la transferrina modificada suficiente para ampliar la semivida en suero. Las proteínas de fusión de transferrina modificadas incluyen una proteína de transferrina o dominio unido de manera covalente a una proteína o péptido terapéutico, en la que la parte de transferrina está modificada para contener una o más sustituciones inserciones o supresiones de aminoácido, comparado con una secuencia de transferina de tipo salvaje. En una realización, proteínas de fusión de Tf se modifican por ingeniería para reducir o prevenir la glicosilación entre la Tf o un dominio de Tf. En otras realizaciones, la proteína Tf o dominio (s) Tf se modifica para que muestre unión reducida o ninguna a ion hierro o carbonato, o que tenga una afinidad reducida o no se una a un receptor de Tf (TfR).

La presente invención por lo tanto incluye proteínas de fusión de transferrina, composiciones terapéuticas que comprenden las proteínas de fusión, y procedimientos de tratamiento, prevención, o mejora de las enfermedades o trastornos mediante la administración de las proteínas de fusión. Una proteína de fusión de transferrina de la invención incluye al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de transferrina modificada, que están asociadas entre sí, preferiblemente mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de transferrina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en la que un polinucleótido que codifica toda o una parte de la proteína terapéutica está unida en marco con un polinucleótido que codifica toda o una parte de la transferrina modificada) o conjugación química a otra. La proteína terapéutica y proteína transferrina, una parte de la proteína de fusión de transferrina, se puede denominar "parte", "región" o "resto" de la proteína de fusión de transferrina (por ejemplo, una "parte de proteína terapéutica" o una "parte de proteína de transferrina").

En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión de transferrina que comprende, o de manera alternativa que consiste en una proteína terapéutica y una proteína de transferrina de suero modificada. En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de transferrina que comprende, o de manera alternativa que consiste en, un fragmento biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de una proteína terapéutica y una proteína de transferrina modificada. En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de transferrina que comprende, o de manera alternativa que consiste en, una variante biológicamente activa y/o terapéuticamente activa de una proteína terapéutica y proteína de transferrina modificada. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de transferencia que comprende una proteína terapéutica, y un fragmento biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de transferrina modificada. En otra realización, la parte de la proteína terapéutica de la proteína de fusión de transferrina es la forma activa de la proteína terapéutica.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos de manera común por los expertos en la técnica a la que esta invención pertenece. Aunque cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos.

\vskip1.000000\baselineskip

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "actividad biológica" se refiere a una función o conjunto de actividades realizadas por una molécula, proteína o péptido terapéutico en un contexto biológico (es decir, en un organismo o su facsímile in vitro). Las actividades biológicas pueden incluir pero no se limitan a las funciones de la parte de molécula terapéutica de las proteínas de fusión reivindicadas, tales como, pero sin limitación a, la inducción de la secreción de matriz extracelular de las líneas celulares sensibles, la inducción de secreción de hormonas, la inducción de quimiotaxis, la inducción de mitogénesis, la inducción de diferenciación, o la inhibición de la división de células de las células sensibles. Una proteína de fusión o péptido de la invención se considera que es biológicamente activa si muestra una o más actividades biológicas de su pareja nativa de proteína terapéutica.

Como se usa en el presente documento, un "aminoácido que corresponde a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de transferrina se identifica mediante la alineación para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de transferrina y al menos a una segunda secuencia de transferrina. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de transferrina se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la primera secuencia de transferrina. En ciertos casos, estas frases se pueden usar para describir los restos de aminoácido en transferrina humana comparados con ciertos restos en transferrina de suero de conejo.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "fragmento de una proteína Tf" o "proteína Tf", o "parte de una proteína Tf" se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de una proteína Tf de origen natural o su mutante.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado una función biológica. De este modo, los genes incluyen, pero no se limitan a, secuencias de codificación y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes también pueden incluir segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes se pueden obtener a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo clonación a partir de una fuente de interés o síntesis a partir de información de secuencia conocida o pronosticada, y pueden incluir secuencias diseñadas para que tengan los parámetros deseados.

Como se usa en el presente documento, un "polinucleótido heterólogo" o un "ácido nucleico heterólogo" o un "gen heterólogo" o una "secuencia heteróloga" o un "segmento de ADN exógeno" se refiere a un polinucleótido, ácido nucleico o segmento de ADN que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped particular, o, a partir de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. Un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno a la célula huésped particular, pero ha sido modificado. De este modo, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que el elemento no se encuentra de manera ordinaria. Como un ejemplo, una secuencia nativa de señal a una célula de levadura pero unida a una secuencia de Tf humana es heteróloga.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico "aislada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, más preferiblemente aproximadamente 60% pura, incluso más preferiblemente aproximadamente 80% pura, lo más preferiblemente aproximadamente 90% pura, e incluso lo más preferiblemente aproximadamente 95% pura, como se determina mediante electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico aislada se puede obtener mediante procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para relocalizar la secuencia de ácido nucleico a partir de su localización natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, inserción del fragmento en una molécula vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán copias o clones múltiples de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen, ADNc, ARN, semisintético, sintético, genómico o cualquiera de sus combinaciones.

Como se usa en el presente documento, dos o más secuencias de codificación de ADN se dice que están "unidas" o "fusionadas" cuando, como resultado de las fusiones en la estructura entre las secuencias que codifican ADN, las secuencias que codifican ADN se traducen en una fusión de polipéptido. El término "fusión" en referencia a las fusiones de Tf incluye, pero no se limita a, unión de al menos una proteína, polipéptido o péptido terapéutico al extremo N-terminal de Tf, unión al extremo C-terminal de Tf, y/o inserción entre cualesquiera dos aminoácidos entre Tf.

"Transferrina modificada" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de transferrina que muestra al menos una modificación de su secuencia de aminoácidos, comparada con la transferrina de tipo salvaje.

"Proteína de fusión de transferrina modificada" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína formada mediante la fusión de al menos una molécula de transferrina modificada (o su fragmento o variante) a al menos una molécula de una proteína terapéutica (o su fragmento o variante).

Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refieren a deoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma o bien de una sola o doble hebra. Salvo que se limite específicamente, los términos abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a la referencia a ácido nucleico y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. Salvo que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca de manera implícita sus variantes modificadas de manera conservadora (por ejemplo sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias así como la secuencia indicada de manera explícita. De manera específica, sustituciones de codón degenerado se pueden lograr mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida con una base mixta y/o restos de desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). El término ácido nucleico se usa de manera indistinta con gen, ADNc, y ARNm codificados por un gen.

Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN se refiere a "unido de manera operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, ADN para una secuencia de señal está unida de manera operativa a ADN que codifica una proteína de fusión de la invención si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de la proteína de fusión; un promotor o potenciador está unido de manera operativa a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. En general, las secuencias de ADN que están unidas de manera operativa son contiguas, y en el caso de una secuencia de señal o proteína de fusión ambas contiguas y en fase de lectura. sin embargo, los potenciadores no necesitan estar contiguos a las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. Unión, en este contexto, se lleva a cabo mediante ligación a sitios de restricción convenientes o a adaptadores o engarces insertados en su lugar.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una región de ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una célula, tejido u organismo que se ha sometido a transformación con ADN recombinante.

Como se usa en el presente documento, una entidad de dirección, proteína, polipéptido o péptido se refiere a tales moléculas que se unen de manera específica a un tipo de célula particular [normal (por ejemplo, linfocitos) o anormales por ejemplo, (células cancerosas)] y por lo tanto se pueden usar para dirigir una proteína de fusión de Tf o compuesto (fármaco, o agente citotóxico) a ese tipo de célula de manera específica.

Como se usa en el presente documento, "proteína terapéutica" se refiere a proteínas, polipéptidos, anticuerpos, péptidos o fragmentos o sus variantes, que tienen una o más actividades terapéuticas y/o biológicas. Proteínas terapéuticas abarcadas por la invención incluyen pero no se limitan a proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, y compuestos biológicos. Los términos péptidos, proteínas, y polipéptidos se usan de manera indistinta en este documento. De manera adicional, el término "proteína terapéutica" se puede referir a la correlación endógena o de origen natural de una proteína terapéutica. Por un polipéptido que muestra una "actividad terapéutica" o una proteína que es "terapéuticamente activa" significa un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas conocidas asociadas a una proteína terapéutica tales como una o más de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento o de otra manera conocidas en la técnica. Como un ejemplo no limitante, una "proteína terapéutica" es una proteína que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno. Tal enfermedad, afección o trastorno puede ser en seres humanos o en un animal no humano, por ejemplo, uso veterinario.

Como se usa en el presente documento, el término "transformación" se refiere a la transferencia de ácido nucleico (es decir, un polímero de nucleótido) en una célula. Como se usa en el presente documento, el término "transformación genética" se refiere a la transferencia e incorporación de ADN, especialmente ADN recombinante, en una célula.

Como se usa en el presente documento, el término "transformante" se refiere a una célula, tejido u organismo que se ha sometido a transformación.

Como se usa en el presente documento, el término "transgen" se refiere a un ácido nucleico que se inserta en un organismo, célula huésped o vector de manera que asegura su función.

Como se usa en el presente documento, el término "transgénico" se refiere a células, cultivos de células, organismos, bacterias, hongos, animales, plantas, y progenies de cualquiera de los precedentes, que han recibido un gen extraño o modificado y en particular un gen que codifica una proteína de fusión de Tf modificada por uno de los diversos procedimientos de transformación, en los que el gen extraño o modificado es de la misma o diferente especie de las especies del organismo que recibe el gen extraño o modificado.

"Variantes o variante" se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico diferente de un ácido nucleico o polipéptido de referencia, pero que mantiene sus propiedades de referencia. En general, variantes son estrechamente similares globalmente, y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia. Como se usa en el presente documento, "variante", se refiere a una parte de proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina de la invención, que es diferente de la secuencia de una proteína terapéutica nativa pero que mantiene al menos su propiedad funcional y/o terapéutica como se describe en otra parte en el presente documento o conocida de otra manera en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere de manera amplia a cualquier plásmido, fagémido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. El término también se construye para incluir compuestos no-plásmido, no-fagémido y no-viral que facilitan la transferencia de ácido nucleico en viriones o células, tales como, por por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector viral que es adecuado como un vehículo de administración para la administración del ácido nucleico, o su mutante, a una célula, o el vector puede ser un vector no-viral que es adecuado para el mismo propósito. Ejemplos de vectores virales y no virales para la administración de ADN a células y tejidos se conocen bien en la técnica ay se describen, por ejemplo, en Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 94: 12744-12746). Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, un virus de vaccinia recombinante, un adenovirus, recombinante un retrovirus recombinante, un virus asociado a adeno recombinante, un virus de viruela aviar recombinante, y similares (Cranage et al., 1986, EMBO J. 5:3057-3063; Solicitud de Patente Internacional No. WO94/17810, expedida el 18 de agosto de1994; Solicitud de Patente Internacional No. WO94/23744, expedida el 27 de octubre de1994). Ejemplos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, liposomas, derivados de poliamina de DNA, y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "tipo salvaje" se refiere a una secuencia de polinucleótido o polipéptido que es de origen natural.

\vskip1.000000\baselineskip

Transferrina y Modificaciones de transferrina

Se puede usar cualquier transferrina para preparar proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención. Tf (Tf) humana de tipo salvaje es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 kDa (no responsable de la glicosilación), con dos dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parece que se originan a partir de una duplicación de genes. Véanse los números de acceso del GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936 (www.ncbLnlm.nih.gov/), que se incorporan todas en el presente documento por referencia en su totalidad, así como las SEQ ID NOS 1, 2 y 3. Los dos dominios divergen con el tiempo pero retienen un alto grado de identidad/similitud (Fig. 1).

Cada uno de los dominios N y C se divide además en dos subdominios, N1 y N2, C1 y C2. La función de Tf es transportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está mediado por el receptor de Tf (TfR), que se expresa en todas las células, en particular células que crecen activamente. TfR reconoce la forma de unión a hierro de Tf (dos de las cuales están unidas por el receptor), endocitosis después se produce mediante la que el complejo TfR/Tf se transporta al endosoma, en el punto en el que el grupo localizado en pH da como resultado la liberación de hierro unido y el reciclado del complejo TfR/Tf a la superficie de la célula y liberación de Tf (conocida como apoTf en su forma no unida a hierro). La unión al receptor es a través del dominio C de Tf. Los dos sitios de glicosilación en el domino C no parece que estén implicados en la unión al receptor ya que la Tf unida a hierro no glicosilada se une al receptor.

Cada molécula de Tf puede llevar dos átomos de hierro. Éstos forman complejo en el espacio entre los subdominios N1 y N2, C1 y C2 que dan como resultado un cambio conformacional en la molécula. Tf cruza la barrera sangre cerebro (BBB) mediante el receptor de Tf.

En la transferrina humana, los sitios de unión a hierro comprenden al menos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82 de la SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia de señal nativa de Tf); Asp 392 (Asp 411 de la SEQ ID NO: 2); Tyr 95 (Tyr 114 de la SEQ ID NO: 2); Tyr 426 (Tyr 445 de la SEQ ID NO: 2); Tyr 188 (Tyr 207 de la SEQ ID NO: 2); Tyr 514 ó 517 (Tyr 533 ó Tyr 536 SEO ID NO:2); His 249 (His 268 de la SEQ ID NO: 2); His 585 (His 604 de la SEQ ID NO: 2), las regiones de articulación comprenden al menos restos de aminoácidos 94-96, 245-247 y/o 316-318 de dominio N así como restos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 del dominio C, los sitios de unión de carbonato comprenden al menos los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la SEQ ID NO: 2); Thr 452 (Thr 471 de la SEQ ID NO: 2); Arg 124 (Arg 143 de la SEQ ID NO: 2); Arg 456 (Arg 475 de la SEQ ID NO: 2); Ala 126 (Ala 145 de la SEQ ID NO: 2); Ala 458 (Ala 477 de la SEQ ID NO: 2); Gly 127 (Gly 146 de la SEQ ID NO: 2); Gly 459 (Gly 478 de la SEQ ID NO: 2).

En una realización de la invención, la proteína de fusión de transferrina modificada incluye una transferrina humana modificada, aunque cualquier molécula de Tf animal se puede usar para producir las proteínas de fusión de la invención, incluyendo variantes de Tf humana, vaca, cerdo, oveja, perro, conejo, rata, ratón, hámster, echnida, ornirorrinco, pollo, rana, gusano de cuerno, mono, así como otras especies bovinas, canina y aviares (véase la Figura 2 para un conjunto representativo de secuencias de Tf). Todas estas secuencias de Tf están fácilmente disponibles del GenBank y otras bases de datos públicas. La secuencia de nucleótidos de Tf humana está disponible (véase SEQ ID NOS 1, 2 y 3 y los números de acceso descritos anteriormente y disponibles en www.ncbi.nlin.nih.gov/) y se pueden usar para preparar fusiones genéticas entre Tf o un dominio de Tf y la molécula terapéutica de elección. Las fusiones también se pueden preparar a partir de moléculas relacionadas tal como lacto transferrina (Lactoferrina) GenBank Acc: NM_002343).

Lactoferrina (Lf), una proteína de unión a hierro de defensa natural, se ha encontrado que posee actividad antibacteriana, antimicótica, antiviral, antineoplásica y anti-inflamatoria. La proteína está presente en secreciones exocrinas que está expuesta de manera común a la flora normal: leche, lágrimas, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos gastrointestinales, moco cervico-vaginal y fluido seminal. De manera adicional, Lf es un constituyente principal de los gránulos específicos secundarios de neutrófilos polimorfonucleares circulantes (PMN). La apoproteína se libera en la desgranulación de los PMN en áreas sépticas. Una función principal de Lf es la de inactivar hierro libre en fluidos y áreas inflamadas de manera que se suprima el daño mediado por el radical libre y disminuya la disponibilidad del metal para invadir células microbianas y neoplásicas. En un estudio que examinaba la velocidad de recambio de ^{125}I Lf en adultos, se mostró que LF se recoge rápidamente por el hígado y bazo, y la radiactividad persistía durante varias semanas en el hígado y bazo (Bennett et al. (1979), Clin. ScL (Lond.) 57: 453-460).

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina de la invención incluye una variante de ayuste de transferrina. En un ejemplo, una variante de ayuste de transferrina puede ser una variante de ayuste de transferrina humana. En una realización específica, la variante de ayuste de transferrina humana puede ser la de Genbank Acceso AAA61140. En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina de la invención incluye una variante de ayuste de lactoferrina. En un ejemplo, una variante de ayuste de lactoferrina de suero humano puede ser una variante de ayuste novedosa de una lactoferrina de neutrófilos. En una realización específica, la variante de ayuste de lactoferrina de neutrófilos puede ser la de Genbank Acceso AAA59479. en otra realización específica, la variante de ayuste de lactoferrina de neutrófilos puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos EDCIALKGEADA (SEQ ID NO: 8), que incluye la región novedosa de la variante de ayuste.

Las fusiones de Tf modificadas se pueden preparar con cualquier proteína, fragmento, dominio, o dominio modificado por ingeniería de Tf. Por ejemplo, proteínas de fusión se pueden producir usando la secuencia de Tf de longitud completa, con o sin la secuencia de señal de Tf. Las proteínas de fusión de Tf también se pueden preparar usando un único dominio de Tf, tal como un dominio individual N o C. En algunas realizaciones, el uso de un único dominio N es ventajoso ya que los sitios de glicosilación de Tf residen en el dominio C y el dominio N, sobre el suyo, no se une a hierro o el receptor de Tf. En otras realizaciones, se pueden producir fusiones de una proteína terapéutica a un único dominio C, en las que el dominio C se altera para reducir, inhibir o prevenir glicosilación, unión a hierro y/o unión al receptor de Tf.

En algunas realizaciones, la Tf o parte de Tf será de suficiente longitud para para incrementar la estabilidad o biodisponibilidad de la solución en suero, in vitro de la proteína terapéutica comparada con la estabilidad en suero (semivida), estabilidad o biodisponibilidad in vitro de la proteína terapéutica en un estado no fusionado. Tal incremento en estabilidad, semivida en suero o biodisponibilidad puede ser aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90% o más incremento sobre la proteína terapéutica no fusionada. En algunos casos, las proteínas de fusión de transferrina modificadas muestran una semivida en suero de aproximadamente 10-20 o más días, aproximadamente 12-18 días o aproximadamente 14-17 días.

Cuando el dominio C de Tf es parte de la proteína de fusión, los dos sitios de glicosilación unidos a N, restos de aminoácido correspondientes a N413 y N611 de la SEQ ID NO:3 se puede mutar para la expresión en un sistema de levadura para prevenir la glicosilación o hipermanosilación y ampliar la semivida en suero de la proteína de fusión y/o proteína terapéutica (para producir asialo-, o en algunos casos, monosialo-Tf o disialo-Tf). Además de los aminoácidos Tf correspondientes a N413 y N611, las mutaciones pueden ser para los restos adyacentes dentro del sitio de glicosilación N-X-S/T para prevenir o sustancialmente reducir la glicosilación. Véase la Patente de Estados Unidos 5.986.067 de Funk et al. Se ha reseñado que el dominio N de Tf expresado en Pichia pastoris llega a estar glicosilado unido a O con una única hexosa en S32 que también puede a estar mutado o modificado para prevenir tal
glicosilación.

De acuerdo con lo anterior, en una realización de la invención, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina muestra glicosilación reducida, que incluye pero no se limita a formas asialo-monosialo- y disialo- de Tf. En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que está mutada para prevenir la glicosilación. En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que está completamente glicosilada. En una realización adicional, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante de suero humano que está mutada para prevenir la glicosilación, en la que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEQ ID NO:3 están mutados a un aminoácido que no permite la glicosilación. En otra realización, la parte de parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humano recombinante que está mutada para prevenir o sustancialmente reducir glicosilación, en la que las mutaciones pueden estar en los restos adyacentes al sitio de glicosilación N-X-S/T.

Como se describe en más detalle más adelante, proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención también se pueden modificar por ingeniería para que no se una a hierro y/o no se una al receptor de Tf. En otras realizaciones de la invención, la unión a hierro se mantiene y la capacidad de unión a hierro de Tf se puede usar de dos formas, una para distribuir una proteína o péptido terapéutico (s) al interior de una célula y/o a través de la BBB. estas realizaciones que unen hierro y/o el receptor de Tf a menudo se modifican por ingeniería para reducir o prevenir la glicosilación para ampliar la semivida en suero de la proteína terapéutica. El dominio N solo no se unirá a TfR cuando está cargado con hierro, y el hierro unido al dominio C se unirá a TfR pero no con la misma afinidad que la molécula entera.

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse al metal. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para el metal que la transferrina de suero de tipo salvaje. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte para el metal que la transferrina de suero de tipo salvaje.

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse al receptor de transferrina. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para el receptor de transferrina que la transferrina de suero de tipo salvaje. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte para el receptor de transferrina que la transferrina de suero de tipo salvaje.

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse a carbonate. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para carbonato que la transferrina de suero de tipo salvaje. En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte para carbonato que la transferrina de suero de tipo salvaje.

\newpage

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEQ ID No:3, en la que el mutante mantiene la capacidad de unirse a metal. En una realización alternativa, un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, 25 Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEQ ID NO:3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a metal. En otra realización, un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr517 y His585 de la SEQ ID No:3, en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse a metal.

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEQ ID No:3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte para metal que la transferrina de suero humano de tipo salvaje (véase la Patente de Estados Unidos 5.986.067). En una realización alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEQ ID No: 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para metal que la transferrina de suero humano de tipo salvaje. En una realización adicional, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humano recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEQ ID No:3, en la que el mutante no se une a metal.

Se puede usar cualquier técnica disponible para preparar proteínas de fusión de la invención, que incluye, pero no se limita a técnicas moleculares comúnmente disponibles, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótidos usando las técnicas para llevar a cabo mutagénesis específica del sitio que se conocen bien en la técnica los cambios de aminoácidos codificados preferiblemente de una naturaleza menor, esto es, sustituciones de aminoácido conservadoras, aunque también se contemplan otras sustituciones no conservadoras, en particular cuando se produce una parte de transferrina modificada de la proteína de fusión de Tf, por ejemplo, una proteína de Tf de fusión modificada que muestra glicosilación reducida, unión a hierro reducida y similares. De manera específica se contemplan sustituciones, pequeñas supresiones o inserciones de aminoácidos, típicamente de una a aproximadamente 30 aminoácidos; inserciones entre dominios de transferrina; pequeñas extensiones de amino- o carboxilo-terminal, tal como un resto de metionina amino-terminal, o pequeños péptidos de engarce de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 restos entre dominios de transferrina o unión de una proteína de transferrina y una proteína o péptido terapéutico; o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un espacio de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras son sustituciones hechas dentro del mismo grupo tales como dentro del grupo de aminoácidos básicos (tal como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tal como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina and asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).

Las sustituciones no conservadoras abarcan sustituciones de aminoácidos en un grupo por aminoácidos en otro grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservadora incluiría la sustitución de un aminoácido polar por un aminoácido hidrófobo. Para una descripción general de nucleótido sustitución, véase por ejemplo, Ford et al. (1991), Prot. Exp. Pur. 2: 95-107. Las sustituciones no conservadoras, supresiones e inserciones son en particular útiles para producir proteínas de fusión de Tf de la invención que muestran ninguna o reducida unión de hierro, ninguna o reducida unión de la proteína de fusión al receptor de Tf y/o ninguna o reducida glicosilación.

En el polipéptido y proteínas de la invención, se sigue el siguiente sistema para la designación de aminoácidos de acuerdo con la siguiente lista convencional:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA DE AMINOÁCIDOS

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

La unión a hierro y/o unión al receptor se puede reducir o romper mediante mutación, incluyendo supresión, sustitución o inserción en, restos de aminoácido correspondientes a uno o más de los restos del dominio N de Tf Asp63, Tyr95, Tyr188, His249 y/o restos del dominio C Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o His 585. La unión de hierro también se puede afectar mediante mutación a aminoácidos Lys206, Hys207 o Arg632. La unión a carbonato se puede reducir o romper mediante mutación, incluyendo supresión, sustitución o inserción en, restos de aminoácido correspondientes a uno o más restos del dominio N de Tf Thr120, Arg124, Ala126, Gly 127 y/o restos del dominio C Thr 452, Arg 456, Ala 458 y/o Gly 459. Una reducción o ruptura de la unión a carbonato puede afectar de manera adversa a la unión a hierro y/o receptor.

La unión al receptor de Tf se puede reducir o romper mediante mutación, incluyendo supresión, sustitución o inserción en, restos de aminoácido que corresponden a uno o más restos del dominio N de Tf descritos anteriormente para la unión a hierro.

Como se ha descrito anteriormente, glicosilación se puede reducir o prevenir mediante mutación, incluyendo supresión, sustitución o inserción en, restos de aminoácido correspondiente a uno o más restos de dominio C de Tf alrededor de los sitios N-X-S/T correspondientes a los restos del dominio C N413 y/o N611 (Véase la Patente de Estados Unidos No. 5.986.067). Por ejemplo, el N413 y/o N611 se puede mutar a restos Glu.

En los casos donde las proteínas de fusión de Tf de la invención no se modifican para prevenir la glicosilación, unión a hierro, unión a carbonato y/o unión al receptor, glicosilación, los iones hierro y/o carbonato se pueden eliminar de o escindirse de la proteína de fusión. Por ejemplo, se pueden usar de-glicosilasas disponibles para escindir los restos de glicosilación de la proteína de fusión, en particular los restos de azúcar unidos a la parte de Tf, levadura deficiente en enzimas de glicosilación se pueden usar para prevenir la glicosilación y/o células recombinantes se pueden desarrollar en la presencia de un agente que previene la glicosilación, por ejemplo, tunicamicina.

Las mutaciones adicionales se pueden preparar con Tf para alterar la estructura tridimensional de TF, tal como las modificaciones de la región de articulación para prevenir en plegamiento de Tf necesarios para la unión a hierro y reconocimiento de receptor de Tf. Por ejemplo, mutaciones se pueden preparar en o alrededor de los restos del dominio N de aminoácidos 94-96, 245-247 y/o 316-318 así como los restos del dominio C de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658. Además, se pueden hacer mutaciones en o alrededor de las regiones flanqueantes de estos sitios para alterar la estructura y función de Tf.

\newpage

En un aspecto de la invención, la proteína de fusión de transferrina puede funcionar como una proteína vehículo para ampliar la semivida o biodisponibilidad de la proteína terapéutica así como en algunos casos, administración de la proteína terapéutica dentro de una célula y/o a través de la barrera sangre cerebro. En una realización alternativa, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina no mantiene la capacidad de cruzar la barrera sangre cerebro.

En otra realización, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina mantiene la capacidad de unirse al receptor de transferrina y transportar el péptido terapéutico dentro de las células. En una realización alternativa, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina no mantiene la capacidad de unirse al receptor de transferrina y transportar el péptido terapéutico dentro de las células.

En realizaciones adicionales, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina mantiene la capacidad de unirse al receptor de transferrina y transportar el péptido terapéutico dentro de las células, pero no mantiene la capacidad de cruzar la barrera sangre cerebro. En una realización alternativa, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina mantiene la capacidad de cruzar la barrera sangre cerebro, pero no mantiene la capacidad de unirse al receptor de transferrina y transportar el péptido terapéutico dentro de las células.

\vskip1.000000\baselineskip

Proteínas de fusión de transferrina modificadas

La fusión of proteínas de la invención puede contener una o más copias de la proteína terapéutica unida al extremo N y/o el extremo C de la proteína de Tf. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica está unida a tanto el extremo N- como C de la proteína de Tf y la proteína de fusión puede contener uno o más equivalentes de la proteína terapéutica o en cualquiera o ambos extremos de Tf. En otras realizaciones, la proteína terapéutica o polipéptido se inserta en dominios conocidos de la proteína de Tf, por ejemplo, en uno o más bucles de Tf (véase Ali et al. (1999) J. Biolog. Chem. 274 (34): 24066-24073). En otras realizaciones, la proteína terapéutica o péptido terapéutico se inserta entre los dominios N y C de Tf.

En general, la proteína de fusión de transferrina de la invención puede tener una región derivada de transferrina modificada y una región derivada de proteína terapéutica. Sin embargo se pueden usar regiones múltiples de cada proteína, para preparar una proteína de fusión de transferrina de la invención. De manera similar, se puede usar más de una proteína terapéutica para preparar una proteína de fusión de transferrina de la invención de la invención, produciendo por lo tanto proteína de fusión de Tf modificada multifuncional.

En una realización, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica o parte de la misma fusionada a una molécula de transferrina o parte de la misma. En otra realización, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica fusionada al extremo N de una molécula de transferrina. En una realización alternativa, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica fusionada al extremo C de una molécula de transferrina. En una realización adicional, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una molécula de transferrina fusionada al extremo N de una proteína terapéutica. En una realización alternativa, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una molécula de transferrina fusionada al extremo C de una proteína terapéutica.

En realizaciones adicionales, la molécula de transferrina modificada contiene el extremo N de una molécula de transferrina fusionada al que sería el extremo N de un péptido terapéutico. En una realización alternativa, la molécula de transferrina modificada contiene el extremo N de una molécula de transferrina fusionada al extremo C de un péptido terapéutico. En una realización alternativa adicional, la molécula de transferrina modificada contiene el extremo C de una molécula de transferrina fusionada al que sería el extremo C de un péptido terapéutico. En una realización alternativa, la molécula de transferrina modificada contiene el extremo C de una molécula de transferrina fusionada al extremo N de un péptido terapéutico.

En otras realizaciones, la proteína de fusión de transferrina de la invención contiene una proteína terapéutica fusionada a tanto el extremo N como el extremo C de transferrina modificada. En otra realización, las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N- y C- son las mismas proteínas terapéuticas. En una realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas en los extremos N- y C- son proteínas terapéuticas diferentes. En otra realización alternativa, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N- y C- son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para tratar, prevenir la misma enfermedad, trastorno o afección. En otra realización, las proteínas terapéuticas fusionadas a los extremos N- y C- son proteínas terapéuticas diferentes que se pueden usar para prevenir o tratar enfermedades o trastornos que se conocen en la técnica que se producen de manera común en pacientes de manera simultánea.

Además de la proteína de fusión de transferrina modificada de la invención en las que la parte de transferrina modificada está fusionada a N terminal y/o C terminal de la parte de proteína terapéutica, la proteína de fusión de transferrina de la invención también se puede producir mediante la inserción de la proteína o péptido terapéutico de interés (por ejemplo, una proteína o péptido terapéutico como se describe en el presente documento, o, por ejemplo, un anticuerpo de cadena única que se une a una proteína terapéutica o su fragmento o variante) en una región interna de la transferrina modificada. Las regiones internas de transferrina modificada incluyen, pero no se limitan a, los sitios de unión a hierro, las regiones de articulación, los sitios de unión a bicarbonato, o el dominio de unión al
receptor.

Dentro de la secuencia de proteína de la molécula de transferrina modificada existen un número de bucles o giros, que se estabilizan mediante enlaces bisulfuro. Estos bucles son útiles para la inserción, o fusión interna, o péptidos terapéuticamente activos, en particular los que requieren una estructura secundaria para que sean funcionales, o proteínas terapéuticas, que esencialmente generan una molécula de transferrina modificada con actividad biológica específica.

Cuando las proteínas o péptidos terapéuticos se insertan o reemplazan en al menos un bucle de una molécula de Tf, se pueden hacer inserciones dentro de cualquier superficie expuesta a la regiones de bucle, además de otros áreas de Tf. Por ejemplo, se pueden hacer inserciones dentro de los bucles que comprende aminoácidos 32-33, 74-75, 256-257, 279-280 y 288-289 de TF (Ali et al., supra) (Véase la Figura 3). Como se ha descrito previamente, se pueden hacer inserciones dentro de otras regiones de Tf tales como los sitios para unión a hierro y bicarbonato, regiones de articulación, y la unión del dominio de receptor como se describe en más detalle más adelante. Los bucles en la proteína de la secuencia de Tf que son susceptibles de modificación/reemplazo para la inserción de proteínas o péptidos también se pueden usar para el desarrollo de una genoteca que se puede seleccionar de inserciones de péptido al azar. Se pueden usar cualesquiera procedimientos para producir inserciones de ácido nucleico para la generación de genotecas de péptido, incluyendo sistemas disponibles de despliegue en fago y bacteria, prior antes de la clonación en un dominio de Tf y/o fusión a los extremos de Tf.

El extremo N de Tf está libre y está lejos del cuerpo de la molécula. Fusiones de proteínas o péptidos en el extremo N puede por lo tanto ser una realización preferida. Tales fusiones pueden incluir una región de engarce, tal como pero sin limitación un tramo de poli-glicina, para separar la proteína o péptido terapéutico de Tf. Atención a la conexión entre la secuencia guía, la elección de la secuencia guía, y la estructure del ARNm mediante manipulación/optimización de codón (sin bucles de tronco grande que inhiba el progreso de ribosoma) incrementará la secreción y se puede llevar a cabo fácilmente usando técnicas de proteína recombinante convencionales.

El extremo C de Tf parece que esté más oculto y seguro mediante un puente disulfuro de 6 aminoácidos del extremo C. En Tf humana, el aminoácido C-terminal es una prolina que, dependiendo de la forma que está orientada, estará o bien lejos de una fusión en el cuerpo de la molécula. Un engarce o resto espaciador en el extremo C se puede usar en algunas realizaciones de la invención.

En todavía otras realizaciones, se pueden formar complejos agentes terapéuticos de pequeña molécula con hierro y cargarse en una proteína de fusión de Tf modificada para la administración al interior de las células y atravesar la BBB. La adición de un péptido de dirección o, por ejemplo, un SCA dirigirá la carga neta a un tipo de célula particular, por ejemplo, una célula cancerosa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ácidos nucleicos

Las moléculas de ácido nucleico también se proporcionan en la presente invención. Éstas también codifican una proteína de fusión de Tf modificada que comprende una proteína de transferrina o una parte de una proteína de transferrina unida de manera covalente o unida a una proteína terapéutica. Como se describe en más detalle más adelante, se puede usar cualquier proteína terapéutica. La proteína de fusión puede además comprender una región de engarce, por ejemplo un engarce de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácido. el engarce puede estar unido de manera covalente a y entre la proteína de transferrina o su parte y la proteína terapéutica. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar purificadas o no.

También se proporcionan células huésped y vectores para replicar las moléculas de ácido nucleico y para expresar las proteínas de fusión codificadas. Se pueden usar cualesquiera vectores o células huésped, tanto procarióticas como eucarióticas, pero se pueden preferir sistemas de expresión eucarióticos, en particular sistemas de iones de expresión de levadura. Muchos vectores y células huésped se conocen en la técnica para tales propósitos. Está dentro de la experiencia en la técnica seleccionar un conjunto apropiado para la aplicación deseada.

Las secuencias de ADN que codifican transferrina, partes de transferrina y proteínas terapéuticas de interés se pueden clonar a partir de una diversidad de de genotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN que usan procedimientos basados en sonda son técnicas convencionales y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Las sondas para aislar tales secuencias de ADN se pueden basar en secuencias de ADN o proteína expedidas (véase, por ejemplo, Baldwin, G.S. (1993) Comparison of Transferrin Sequences from Different Species. Comp. Biochem. Physiol. 106B/1: 203-21 S y todas las referencias citadas en ella). De manera alternativa, se puede usar el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Mullis et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195) y Mullis (Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202). la elección de la genoteca y selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN está dentro del nivel de los expertos en la técnica.

Como se conoce en la técnica "similitud" entre dos polinucleótidos o polipéptidos se determina mediante comparación de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y sus sustitutos conservados de nucleótido o aminoácido de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. También se conoce en la técnica "identidad" que significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias de polipéptido o polinucleótido como se determina por la identidad de coincidencia entre dos cordones de tales secuencias. Tanto identidad como similitud se puede modificar fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Secuencia Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad y similitud entre dos secuencias de polinucleótido o polipéptido, los términos "identidad" y "similitud" son bien conocidos por los expertos en la técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M 5 Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos empleados de manera común para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988).

Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la coincidencia mayor entre las dos secuencias ensayadas. Procedimientos para determinar identidad y similitud se codifican en programas de ordenador. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programa GCG (Devereux, et al, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, PASTY (Atschul, et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o identidad mencionado anteriormente se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias indicando una derivación de la primera secuencia de la segunda. El grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se puede determinar mediante programas de ordenador conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Needleman y Wunsch (1970) Journal of Molecular Biology 45: 443-453). Para los propósitos de determinación del grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico para la presente invención, se usa GAP con los siguientes establecimientos: penalización de creación GAP de 5,0 y penalización de extensión GAP de 0,3.

\vskip1.000000\baselineskip

Optimización de Codón

La degeneración del código genético permite variaciones de la secuencia de nucleótidos de una proteína de transferrina y/o proteína terapéutica de interés, mientras todavía produce un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido codificado por la secuencia de ADN nativa. El procedimiento, conocido como "optimización de codón" (descrito en la Patente de Estados Unidos 5.547.871) proporciona uno con un medio de diseño tal como secuencia de DNA alterada. El diseño de genes de codón optimizado deben tener en cuenta una diversidad de factores, incluyendo la frecuencia de uso de codón en un organismo, frecuencias próximas más cercanas, estabilidad de ARN, el potencial para la formación de estructura secundaria, la vía de síntesis y las manipulaciones de ADN propuestas futuras de ese gen. En particular, procedimientos disponibles se pueden usar para alterar los codones que codifican una proteína de fusión dada con los reconocidos más fácilmente por levadura cuando se usan los sistemas de expresión de levadura.

La degeneración del código genético permite que la misma secuencia de aminoácidos se codifique y se traduzca de muchas formas diferentes. Por ejemplo, leucina, serina y arginina están cada una de ellas codificada por seis codones diferentes, mientras valina, prolina, treonina, alanina y glicina están cada una de ellos codificado por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de tales codones sinónimos varía de genoma a genoma entre eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los patrones de elección de codón sinónimo entre mamíferos son muy similares, mientras que los organismos distantes evolutivamente tales como levadura (S. cerevisiae), bacterias (tal como E. coli) e insectos (tal como D. melanogaster) revelan un patrón claramente diferente de frecuencias de uso de codón genómico (Grantham, R., et al., Nucl. Acids Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R., et al., Nucl. Acids Res., 9, 43-74 (1981); Maroyama, T, et al., Nucl. Acids Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., et al., Nucl. Acids Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., et al., Nucl. Acids Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Letters, 285,165-169 (1991 )). Estas diferencias en los patrones de elección de codón parece que contribuyen a los niveles de expresión global de genes individuales mediante la modulación de de las tasas de elongación de péptido. (Kurland, C. G., FEBS Letters, 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); Randall, L. L., et al., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol.,
43, 211-225 (1974); Ikemura, T, J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); Ikemura, T, J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).

Las frecuencias de uso de codón preferidas para un gen sintético debe reflejar los usos de codón de genes nucleares derivados del genoma exacto (o relacionado tan estrechamente como sea posible) de la célula/organismo que se propone para usar para la expresión de proteína recombinante, en particular de especies de levadura. Como se ha descrito anteriormente, en una realización preferida la secuencia de Tf preferida es de codón optimizada, antes o después de la modificación como se describe en el presente documento para la expresión de levadura como puede ser la (s) secuencia (s) de nucleótidos de la proteína terapéutica.

\vskip1.000000\baselineskip

Vectores

La unidades de expresión para uso en la presente invención en general comprenderán los siguientes elementos, ligados de manera operativa en una orientación 5' a 3': un promotor de transcripción, una secuencia de señal secretora, una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de Tf que comprende proteína de transferrina o una parte de una proteína de transferrina junto a una secuencia de ADN que codifica una proteína o péptido terapéutico de interés y un terminador de transcripción. Como se ha descrito anteriormente, cualquier disposición de la proteína o péptido terapéutico fusionado a o dentro de la parte de Tf se puede usar en los vectores de la invención. La selección de promotores adecuados, secuencias de señal y terminadores se determinarán por la célula huésped seleccionada y será evidente para los expertos en la técnica y se describen específicamente más adelante.

Los vectores de levadura adecuados para uso en la presente invención se describen en la Patente de Estados Unidos 6.291.212 e incluyen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores de plásmido de levadura útiles también incluyen pRS403-406, pRS413-416 y los vectores Pichia disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, Estados Unidos. Plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración de levadura (Ylps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, 7RPI, LEU2 y URA3. Plásmidos pRS413-41.6 son plásmidos de centróemro de Levadura (Ycps).

Tales vectores en general incluirán un marcador seleccionable, que puede ser uno de cualquier número de genes que muestran un fenotipo dominante para el que existe un ensayo fenotípico para permitir que se seleccionen los transformanrtes. Los marcadores seleccionables preferidos son los que complementan la auxotrofia de la célula huésped, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten que una célula utilice fuentes de carbono específicas, e incluyen LEU2 (Broach et al. ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl et al., ibid.) o POT1 (Kawasaki y Bell, EP 171,142). Otros marcadores adecuados seleccionables incluyen el gen CAT, que confiere resistencia a chloramfenicol en células de levadura. Los promotores preferidos para uso en levadura incluyen promotores de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de Estados Unidos Nº 4.599.311) o genes de la alcohol deshidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., (eds.), p. 355, Plenum, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201,1983). A este respecto, en particular los promotores preferidos son el promotor TPI1 (Kawasaki, Patente de Estados Unidos Nº 4.599.311) y el promotor ADH2-4.sup.C [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] (Russell et al., Nature 304: 652-654, 1983). Las unidades de expresión también pueden incluir un terminador de transcripción. Un terminador de transcripción preferido es el terminador TPI1 (Alber y Kawasaki, ibid.).

Además de levadura, proteínas de fusión modificadas la presente invención se pueden expresar en hongos filamentosos, por ejemplo, cepas de hongos Aspergillus. Ejemplos de promotores útiles incluyen los derivados de genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor ADH3 (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) y el promotor tpiA 25. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminador ADH3 (McKnight et al., ibid.). Las unidades de expresión que utilizan tales componentes se pueden clonar en vectores que son capaces de inserción en el ADN cromosómico de Aspergillus, por ejemplo.

Los vectores de expresión de mamíferos para uso llevando a cabo la presente invención incluirán un a promotor capaz de dirigir la transcripción de la proteína de fusión de Tf modificada. Los promotores preferidos incluyen promotores virales y promotores celulares. Los promotores virales preferidos incluyen el promotor tardío principal de adenovirus 2 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199, 1982) y el promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981). Los promotores celulares preferidos incluyen el promotor de metalotioneína 1 de ratón (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983) y un promotor V.sub.kappa de ratón [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] (Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987). Un promotor preferido en particular es un promotor V.sub.H de ratón [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] promotor (Loh et al., ibid.). Tales vectores de expresión también pueden contener un conjunto de sitios de ayuste de ARN localizados cadena abajo del promotor y cadena arriba de la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de transferrina. Los sitios de ayuste de ARN preferidos se pueden obtener a partir de genes de adenovirus y/o inmunoglobulina.

También contenida en los vectores es expresión es una señal de poliadenilación localizada cadena abajo de la secuencia de codificación de interés. Las señales de poliadenilación incluyen las señales de poliadenilación tempranas o tardías de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región de adenovirus 5 EIB y el terminador del gen de hormona de crecimiento humano (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981). Una señal de poliadenilación particularmente preferida es el terminador del gen V.sub.H [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] (Loh et al., ibid.). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia guía viral no codificante, tal como la guía tripartita de adenovirus 2, localizada en el promotor y los sitios de ayuste de ARN. Los vectores preferidos también pueden incluir secuencias potenciadoras, tal como el potenciador SV40 y el potenciador de ratón .mu. [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] (Gillies, Cell 33: 717-728, 1983). Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias que codifican los ARN de adenovirus VA.

\vskip1.000000\baselineskip

Transformación

Las técnicas para transformar hongos se conocen bien en la bibliografía, y se han descrito, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), y Russell (Nature 301: 167-169, 1983). El genotipo de la célula huésped en general contendrá un defecto genético que se complementa por el marcador seleccionable presente en el vector de expresión. La elección de un huésped particular y marcador seleccionable está dentro de del nivel de práctica en la técnica.

Las secuencias de ADN clonadas que comprende proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención se pueden introducir en células de mamíferos cultivadas mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973.) otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonadas en células de mamífero, tal como electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), o lipofección también se pueden usar. Con el fin de identificar células que tengan integradas el ADN clonado, en general se introduce un marcador seleccionable en las células junto con el gen o ADNc de interés. Los marcadores seleccionables para uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcados seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es el gen DHFR gene. Un marcador seleccionable amplificable particularmente preferido es el ADNc de DHFR.sup.r [véase la Patente de Estados Unidos 6.291.212] ADNc (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Adac. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Los marcadores seleccionables están revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.) y la elección de marcadores seleccionables está dentro del nivel de la práctica ordinaria en la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

Células huésped

La presente invención también incluye una célula, preferiblemente una célula de levadura transformada para expresar una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención. Además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también incluye un cultivo de esas células, preferiblemente un cultivo monoclonal (homogéneo clonalmente), o un cultivo derivados de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si el polipéptido está secretado, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células si se han separado por filtración o centrifugación.

Células huésped para uso en la práctica de la presente invención incluyen células eucarióticas, y en algunos casos células procarióticas, capaces de transformarse o transfectarse con ADN exógeno y desarrollarse en cultivo, tales como células cultivadas de mamífero, insecto, hongo, planta y bacteria.

Células de hongo, incluyendo especies of levadura (por ejemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp.) se pueden usar como células huésped en la presente invención. Los géneros ejemplares de levadura contemplados que son útiles en la práctica, de la presente invención como huéspedes para expresar la, proteína de fusión de transferrina de la invención son Pichia (clasificada anteriormente como Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metsehunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopyis, y similares. Ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisae, S. italicus and S. rouxii. Ejemplos of Kluyveromyces spp. son K. ftagilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Tórulasppra adecuada es T. delbrueckii. Ejemplos de Pichia (Hansenula) spp. son P. angusta (formerly H. polymorpha), P. anomala (anteriormente H. anomala) y P. pastoris.

En particular las células huésped útiles para producir las proteínas de fusión de Tf de la invención son la Pichia pastoris metanoltrófica (Steinlein et al. (1995) Protein Express. Purif. 6: 619-624). Pichia pastoris se ha desarrollado para que sea un huésped relevante para la producción de proteínas extrañas ya que su promotor de la alcohol oxidasa se aisló y se clonó; su transformación primero se reseñó en 1985. P. pastoris puede utilizar metanol como fuente de carbono en la ausencia de glucosa. El sistema de expresión de P. pastoris puede usar el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) inducida por metanol, que controla el gen que codifica la expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo de metanol. Este promotor se ha caracterizado e incorporado en una serie de vectores de expresión de P. pastoris. Ya que las proteínas producidas en P. pastoris están típicamente plegadas correctamente y secretadas en el medio, la fermentación de P. pastoris modificada por ingeniería genética proporciona una excelente alternativa a los sistemas de expresión de E. coli. Un número de proteínas se ha producido usando este sistema, incluyendo fragmento de toxina de tétanos, pertactina de Bordatella pertussis, albúmina sérica humana y lisozima.

La transformación de F. oxisporum puede, por ejemplo, llevarse a cabo como se describe por Malardier et al. (1989) Gene 78:147-156.

Cepas de la levadura Saccharomyces cerevisae son otros huéspedes preferidos. En una realización preferida, se usa una célula de levadura, o más específicamente, una célula huésped de Saccharomyces cerevisae que contiene una deficiencia genética en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina de glicoproteínas. Células huésped de S. cerevisae que tienen tales defectos se pueden preparar usando técnicas convencionales de mutación y selección, aunque pueden muchas cepas de levadura disponibles se han modificado para prevenir o reducir la glicosilación o hipermanosilaciónn. Ballou et al. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) han descrito el aislamiento de los mutantes de biosíntesis de manoproteína que son defectuosas en genes que afectan a la glicosilación ligada a asparagina.

Para optimizar producción de las proteínas heterólogas, también se prefiere que la cepa huésped lleve una mutación, tal como la mutación pep4 de S. cerevisae mutación (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), que da como resultado actividad proteolítica reducida. Cepas huésped que contienen mutaciones en otras regiones que codifican proteasa son en particular útiles para producir grandes cantidades de las proteínas de fusión de Tf de la invención.

Células huésped que contienen construcciones de ADN de la presente invención se desarrollan en un medio de crecimiento apropiado. Como se usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Nutrientes requeridos para el crecimiento de las células pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. El medio de crecimiento se seleccionará en general células que contienen la construcción de ADN mediante, por ejemplo, selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial que están complementadas con el marcador seleccionable sobre la construcción de ADN o cotransfectadas con la construcción de ADN. Células levadura, por ejemplo, se desarrollan preferiblemente en un medio definido químicamente, que comprende una fuente de nitrógeno no aminoácido, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de aminoácidos esenciales. El pH del medio es preferiblemente mantenido a un pH mayor que 2 y menor que 8, preferiblemente a pH 6,5. Procedimientos para mantener un pH estable incluyen tamponación y control de pH constante, preferiblemente mediante la adición de hidróxido de sodio. Los agentes de tamponación incluyen ácido succínico y Bis-Tris (Sigma Chemical Co., S1. Louis, Mo.). Células de levadura que tienen un defecto en un gen requerido para la glicosilación ligada a asparagina se desarrollan preferiblemente en un medio que contiene un estabilizador osmótico. Un estabilizador osmótico preferido es sorbitol suplementado en el medio a una concentración entre 0,1 M y 1,5 M., preferiblemente a 0,5 M o 1,0 M.

Células de mamífero cultivadas se desarrollan en general en medios que contienen suero o sin suero comercialmente disponibles. Selección de un medio apropiado para la línea celular apropiada usada está dentro del nivel ordinario de experiencia en la técnica. Células de mamífero transfectadas se dejan crecer durante un período de tiempo, típicamente 1-2 días, para que comiencen a expresar la(s) secuencias(s) de ADN de interés, La selección de fármacos se aplica después para seleccionar crecimiento de células que expresan el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador seleccionable ampliable la concentración de fármaco se puede aumentar de una manera por etapas para seleccionar un número creciente de copias de las secuencias clonadas, incrementando por lo tanto los niveles de expresión.

Los sistemas de expresión de Baculovirus/célula de insecto también se pueden usar para producir las proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención. El Sistema de Expresión de Baculovirus BacPAKTM (BD Biosciences (Clontech) expresa proteínas recombinantes a altos niveles en células huésped de insecto. El gen diana se inserta en un vector de transferencia, que se cotransfecta en células huésped de insecto con el ADN viral de BacPAK6 linealizado. El ADN de BacPAK6 pierde una parte esencial del genoma de baculovirus. Cuando el ADN se recombine con el vector, el elemento esencial se restablece y el gen diana se transfiere al genoma de baculovirus. Después de la recombinación, se recogen una pocas placas virales y se purifican, y el fenotipo recombinante se verifica. El virus recombinante aislado recientemente se puede después ampliar y usar para infectar cultivos de célula de insecto para producir grandes cantidades de la proteína deseada.

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias de Señal Secretoras

Las expresiones "secuencia de señal secretada" o "secuencia de señal" o "secuencia guía de secreción" se usa de manera indistinta y se describen, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos. 6.291.212 y la Patente de Estados Unidos. 5.547.871, las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Las secuencias de señal secretadas o secuencias de señal o secuencias guía de secreción codifican péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína maduro de una célula. Los péptidos secretores se caracterizan en general por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y típicamente (pero no exclusivamente) se encuentran en los extremos amino de las proteínas recientemente sintetizadas. Muy a menudo el péptido secretor se escinde de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permiten la escisión del péptido de señal de la proteína madura a medida que pasa a través de la ruta secretora. Los sitios de procesamiento pueden estar codificados dentro del péptido de señal o se pueden añadir al péptido de señal mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro.

Los péptidos secretores se pueden usar para dirigir la secreción de proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención. Uno de tales péptidos secretores que se pueden usar en combinación con otros péptidos secretores es el tercer dominio de la proteína de la barrera de levadura. Las secuencias de señal secretoras o secuencias de señal o secuencias de guía de secreción se requieren para una serie compleja de etapas de procesamiento después de la traducción que da como resultado la secreción de una proteína. Si está presente una secuencia de señal intacta, la proteína que se expresa entra en el lumen del retículo endoplásmico rugoso y después se transporta a través del aparato de Golgi a las vesículas secretoras y finalmente se transporta fuera de la célula. En general, la secuencia de señal inmediatamente sigue al codón de inicio y codifica un péptido de señal en el extremo amino-terminal de la proteína a secretar. En la mayoría de los casos, la secuencia de señal se retira por escisión mediante una proteasa específica, llamada peptidasa de señal. Las secuencias de señal preferidas mejoran el procesamiento y exportan la eficacia de la expresión de la proteína de expresión usando vectores de expresión viral, de mamífero o de levadura. En algunos casos, la secuencia de señal de Tf nativas se pueden usar para expresar y secretar proteínas de fusión de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Engarces

El resto de Tf y resto (s) de proteína terapéutica de las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención se pueden fusionar directamente o usando un péptido de engarce de diversas longitudes para proporcionar mayor separación física y permitir más movilidad espacial entre las proteínas fusionadas y de este modo maximizar la accesibilidad de la parte de proteína terapéutica, por ejemplo, para unión a su receptor afín. El péptido de engarce puede consistir en aminoácidos que son flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un engarce tal como pero no limitado a un tramo de a poli-glicina. El engarce puede ser menor que aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácidos. El engarce puede estar ligado covalentemente a y entre la proteína de transferrina su parte y la proteína terapéutica.

\vskip1.000000\baselineskip

Detección de proteínas de fusión de Tf

Los ensayos para la detección de fusiones de transferrina modificada-proteína terapéutica biológicamente activas pueden incluir transferencia de Western, transferencia de proteína o filtro de colonias así como ensayos basados en actividad que detectan la proteína terapéutica fusionada. Un filtro de transferencia de Western se puede preparar usando los procedimiento descritos por Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). En resumen, las muestras se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Las proteínas en el gel se transfieren de manera electroforética a papel de nitrocelulosa. Los filtros de transferencia de proteína se pueden preparar filtrando muestras o concentrados de sobrenadante a través de filtros de nitrocelulosa usando, por ejemplo, un Minifold (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.). Los filtros de colonias se pueden preparar mediante desarrollo de las colonias sobre un filtro de nitrocelulosa que se ha colocado a través de un medio de crecimiento adecuado. En este procedimiento, se prefiere un medio sólido. Las células se dejan crecer sobre los filtros durante al menos 12 horas. Las células se retiran de los filtros mediante lavado con un tampón apropiado que no retira las proteínas unidas a los filtros. Un tampón preferido comprende 25 mM Tris-base, 19 mM glicina, pH 8,3, 20% de metanol.

Proteínas de fusión de la invención también se pueden detectar mediante el ensayo para determinar la actividad del resto de la proteína terapéutica. Tales ensayos están fácilmente disponibles, que incluyen pero no se limitan a, los ensayos descritos en la Tabla 1. Específicamente, proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden ensayar para determinar la actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica o actividad terapéutica) usando el ensayo mencionado en la columna "Ensayo de Actividad Ejemplar" de la Tabla 1. De manera adicional, los expertos en la técnica pueden de manera rutinaria ensayar fragmentos de una proteína terapéutica correspondiente a una parte de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de la invención, para la actividad que usa los ensayos mencionados en su fila correspondiente de la Tabla 1. Además, los expertos en la técnica pueden de manera rutinaria ensayar fragmentos de una proteína de transferrina modificada para determinar actividad usando los ensayos conocidos en
la técnica.

Por ejemplo, en una realización donde se ensaya la capacidad de una proteína de fusión de transferrina de la invención de unirse o competir con una proteína terapéutica para unirse a un anticuerpo de polipéptido anti-terapéutico y/o anticuerpo anti-transferrina, se pueden usar diversos inmunoensayos conocidos en la técnica que incluyen pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos sándwich, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación de disfusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, etiquetas de enzima o radioisótopo, por ejemplo), transferencias de Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión a anticuerpo se detecta mediante la detección de una etiqueta sobre anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección de la unión de un anticuerpo secundario o reactivo para el anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo v se etiqueta. Se conocen en la técnica muchos medios para detector la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.

En una realización adicional, donde un agente de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando) de una proteína terapéutica se identifica, la unión a ese agente de unión mediante una proteína de fusión de transferrina que contiene esa proteína terapéutica como la parte de la proteína terapéutica de la fusión se puede ensayar, por ejemplo, mediante medios bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora y no reductora gel, cromatografía de afinidad de proteína, y transferencia de afinidad. Otros procedimientos serán bien conocidos por los expertos en la técnica y están dentro del alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Aislamiento/Purificación de Proteínas de fusión de transferrina Modificadas

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas secretadas, biológicamente activas, se pueden aislar a partir de células huésped crecidas en condiciones que permiten la secreción de las proteínas de fusión biológicamente activas. El material celular se retira del medio de cultivo, y las proteínas de fusión biológicamente activas se aíslan usando técnicas de aislamiento conocidas en la técnica. Las técnicas de aislamiento adecuadas incluyen precipitación y fraccionamiento mediante una diversidad de procedimientos cromatogáficos, incluyendo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Un procedimiento de purificación particularmente preferido es cromatografía de afinidad sobre una columna de unión a hierro o de quelación de metal o una cromatografía de inmunoafinidad usando un anticuerpo dirigida contra la transferrina o parte de proteína o péptido terapéutico de la fusión de polipéptido. El anticuerpo preferiblemente se inmoviliza o se une a un soporte o sustrato sólido. Un sustrato particularmente preferido es sefarosa activada por CNBr (Pharmacia LKB Technologies, Inc., Piscataway, N.J.). Mediante este procedimiento, el medio se combina con el anticuerpo/sustrato en condiciones que permitirán que se produzca la unión. El complejo se puede lavar para retirar el material no unido, y la proteína de fusión de transferrina se libera o eluye mediante el uso de condiciones no favorables para la formación de complejo. En particular los procedimientos de elución útiles incluyen cambios de pH, en los que el anticuerpo inmovilizado tiene una alta afinidad para el ligando a un primer pH y una afinidad reducida a un segundo (mayor o menor) pH; cambios en concentración de ciertos agentes caotrópicos; o mediante el uso de detergentes.

\vskip1.000000\baselineskip

Proteínas de fusión de transferrina modificadas etiquetadas

Proteínas de fusión de transferrina de la presente invención también se pueden etiquetar con un radioisótopo u otro agente de formación de imágenes y usarse para propósitos de diagnóstico in vivo. Los agentes de formación de imágenes de radioisótopo preferidos incluyen yodo-125 y tecnecio-99, siendo tecnecio-99 particularmente preferido. Procedimientos para producir conjugados proteína-isótopo se conocen bien en la técnica, y se describen en, por ejemplo, Eckelman et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.652.440), Parker et al. (documento WO 87/05030) y Wilber et al. (documento EP 203.764). De manera alternativa, las proteínas de fusión de transferrina se pueden unir a potenciadores de etiqueta de giro y usarse para formación de imágenes de resonancia magnética (MR). Los potenciadores de etiqueta de giro adecuados incluyen compuestos estables, articulados de manera estérica, sin radicales tales como nitróxidos. Procedimientos para etiquetar ligandos para la formación de imágenes de MR se describen en, por ejemplo, Coffman et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.656.026). para la administración, las proteínas de fusión de transferrina etiquetadas se combinan con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, tales como solución salina estéril o agua estéril. Administración es preferiblemente mediante inyección de bolo, preferiblemente por vía intravenosa.

\vskip1.000000\baselineskip

Producción de Proteínas de fusión

La presente invención además proporciona procedimientos para producir una proteína de fusión modificada de la invención usando moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. En términos generales, la producción de una forma recombinante de una proteína típicamente implica las siguientes etapas.

Una molécula de ácido nucleico se obtiene primero que codifica una proteína de fusión de transferrina de la invención. La molécula de ácido nucleico preferiblemente después se coloca en unión que puede emplearse con secuencias de control adecuadas, como se ha descrito anteriormente, para formar una unidad de expresión que contiene el marco abierto de lectura de la proteína. La unidad de expresión se usa para transformar un huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva en condiciones que permiten la producción de la proteína recombinante. Opcionalmente la proteína recombinante se aísla a partir del medio o de las células; la recuperación y purificación de la proteína puede no ser necesaria en algunos casos en los que se pueden tolerar algunas impurezas.

Cada una de las etapas anteriores se puede llevar a cabo mediante una diversidad de formas. Por ejemplo, la construcción de los vectores expresión que se pueden emplear en una diversidad de huéspedes se lleva a cabo usando replicones apropiados y secuencias de control, como se ha establecido anteriormente. Las secuencias de control, expresan vectores de hierro, y procedimientos de transformación dependen del tipo de célula huésped usado para expresar el gen y se han descrito en detalle antes y son de otra manera conocidas por los expertos en la técnica. Los sitios de restricción adecuados pueden, si no están normalmente disponibles, añadirse a los extremos de la secuencia codificante de manera que proporcione un gen escindible para insertarse en estos vectores. Los expertos en la técnica pueden fácilmente adaptarse a cualquier sistema de expresión de huésped conocido en la técnica para uso con las moléculas de ácido nucleico de la invención para producir una proteína recombinante deseada.

Como se ha descrito anteriormente, se puede usar cualquier sistema de expresión, incluyendo sistemas de levadura, bacteria, animal, planta, eucarióticos y procarióticos. En algunas realizaciones, se prefieren sistemas de cultivo de células de levadura, mamífero y producción de animales o plantas transgénicos. En otras realizaciones, se pueden usar sistemas de levadura que se han modificado para reducir la glicosilación de levadura nativa, hiper-glicosilación o actividad proteolítica.

\vskip1.000000\baselineskip

Moléculas terapéuticas

Cualquier molécula terapéutica se puede usar como el agente de fusión a Tf de acuerdo con los procedimientos y composiciones de la presente invención. Como se usa en el presente documento, una molécula terapéutica es típicamente una proteína o péptido capaz de ampliar un efecto biológico beneficioso in vitro o in vivo e incluye proteínas o péptidos que ejercen un efecto beneficioso en relación a la homeostasis normal, fisiología o estado patológico. Las moléculas terapéuticas no incluyen, agentes de fusión usados de manera común como marcadores o adyuvantes de purificación de proteína, tales como galactosidasas (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5. 986. 067 y Aldred et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122: 960-965). Por ejemplo, un efecto beneficioso relacionado con un estado patológico incluye cualquier efecto que es ventajoso para el sujeto tratado, incluyendo prevención de enfermedad, estabilización de enfermedad, la reducción o alivio de los síntomas de enfermedad o una modulación, alivio o cura del defecto subyacente que produzca un efecto beneficioso para el sujeto tratado.

Una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención incluye al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica y al menos un fragmento o variante de transferrina de suero modificada, que están asociados entre sí, preferiblemente mediante fusión genética o conjugación química.

En una realización, la proteína de fusión de transferrina incluye una molécula de transferrina modificada unida a un agente neurofarmacéutico. En otra realización, la proteína de fusión de transferrina modificada incluye transferrina en el extremo carboxilo unido a un agente neurofarmacéutico en el extremo amino. En una realización alternativa, la proteína de transferrina de fusión modificada incluye transferrina en el extremo amino ligado a un agente neurofarmacéutico en el extremo carboxi. En realizaciones específicas, el agente neurofarmacéutico es o bien el factor de crecimiento nervioso o factor neurotrófico ciliar.

En realizaciones adicionales, una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención puede contener al menos a fragmento o variante de una proteína terapéutica, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. En una realización adicional, las proteínas de fusión de transferrina pueden contener fragmentos de péptido o variantes de péptido de proteínas o anticuerpos en los que la variante o fragmento mantiene al menos una actividad terapéutica o biológica. Las proteínas de fusión de transferrina pueden contener proteínas terapéuticas que pueden ser fragmentos de péptido o variantes de péptido de al menos aproximadamente 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60 o al menos aproximadamente 70 o más aminoácidos de longitud fusionadas a los extremos N y/o C, insertadas dentro, o insertadas dentro de un bucle de una transferrina modificada.

En otra realización, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen una parte de proteína terapéutica que pueden ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más restos suprimidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos.

En otra realización, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen una parte de proteína terapéutica que puede ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más restos suprimidos del extremo carboxi de las secuencia de aminoácidos.

En otra realización, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen una parte de proteína terapéutica que puede tener uno o más aminoácidos suprimidos de tanto el extremo amino como el extremo carboxi.

En otra realización, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen una parte de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una proteína terapéutica de referencia establecida en el presente documento, o sus fragmentos. En realizaciones adicionales, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen una parte de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a los polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos de supresiones N- y C-terminal como se ha descrito anteriormente.

En otra realización, las moléculas de fusión de transferrina modificadas contienen la parte de proteína terapéutica que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos nativa o de tipo salvaje de una proteína terapéutica. Fragmentos, de estos polipéptidos también se proporcionan.

Las proteínas terapéuticas que corresponden a una parte de proteína terapéutica de una proteína de transferrina de fusión modificada de la invención, tal como la superficie de la célula y proteínas secretoras, se pueden modificar mediante la unión, de uno o más grupos de oligosacárido. La modificación denominada glicosilación, puede afectar de manera significativa a las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción, y localización de la proteína. Glicosilación se produce en localizaciones específicas junto a la estructura central del polipéptido. Existen usualmente dos tipos principales de glicosilación: glicosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a O, que se unen a restos de serina o treonina; y glicosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N, que se unen a restos de asparagina en una secuencia Asn-X-SerIThr, donde X puede ser un aminoácido excepto prolina. Variables tales como estructura de proteína y tipo de célula influyen en el número y naturaleza de de las unidades de carbohidrato dentro de las cadenas en diferentes sitios de glicosilación. Los isómeros de glicosilación son también comunes en el mismo sitio dentro de un tipo de célula dado. Por ejemplo, varios tipos de interferón humano están glicosilados.

Proteínas terapéuticas que corresponden a una parte de proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina de la invención, así como análogos y sus variantes, se pueden modificar de manera que la glicosilación en uno o más sitios está alterada como resultado de la (s) manipulación (manipulaciones) de su secuencia de ácido nucleico por la célula huésped en las que se expresan, o debido a otras condiciones de expresión. Por ejemplo, isómeros de glicosilación se pueden producir mediante la eliminación o introducción de sitios de glicosilación, por ejemplo, mediante sustitución o supresión de restos de aminoácido, tal como sustitución de glutamina por asparagina, o proteínas recombinantes no glicosiladas se pueden producir mediante la expresión de las proteínas en células huésped que no las glicolizan, por ejemplo, en levadura deficiente en glicosilación. Estos planteamientos se conocen en la técnica

Proteínas terapéuticas y sus secuencias de ácido nucleico se conocen bien en la técnica y están disponibles en las bases de datos públicas tales como Bases de datos de los Servición de Chemical Abstracts (por ejemplo, el registro CAS), GenBank, y GenSeq.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión de transferrina de la invención son capaces de una actividad terapéutica y/o actividad biológica, que corresponde a la actividad terapéutica y/o actividad biológica de la proteína terapéutica enumerada en la fila correspondiente de la Tabla 1 y en otra parte de esta solicitud. (Véase, por ejemplo, las columnas "Actividad biológica" y "Proteína terapéutica X" de la Tabla 1.) En realizaciones adicionales, las partes de proteína terapéuticamente activas de las proteínas de fusión de transferrina de la invención son fragmentos o variantes de las secuencias de referencia citadas en el presente documento.

La presente invención se refiere además a proteínas de fusión modificadas de Tf que comprende fragmentos de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento. Incluso si la supresión de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la parte de proteína terapéutica, otras actividades terapéuticas y/o actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizarse, capacidad de unirse a ligando) todavía se puede mantener. Por ejemplo, la capacidad de polipéptidos con supresiones N-terminal de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras de los polipéptidos en general se mantendrán con menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo eliminado del extremo N. Si un polipéptido particular que carece de los restos N-terminal de un polipéptido completo mantiene tales actividades inmunológicas se pueden ensayar mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y de otra manera conocidos en la técnica No es probable que un mutante con un gran número de restos de aminoácido suprimidos N-terminal pueden retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, péptidos compuestos de como mucho seis restos de aminoácido pueden a menudo provocar una respuesta inmune.

También como se ha mencionado anteriormente, incluso si la supresión de uno o más aminoácidos del extremo N o extremo C de una proteína terapéutica da como resultado modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizarse, capacidad de unirse a ligando) y/o actividades terapéuticas todavía se pueden mantener. Por ejemplo la capacidad de polipéptidos con supresiones C-terminal de inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras del polipéptido en general se mantendrán cuando menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo o maduro se eliminan del extremo C. Si un polipéptido particular que carece de los restos N-terminal y/o, C-terminal de un polipéptido de referencia mantiene actividad terapéutica se puede determinar fácilmente mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y/o de otra manera conocidos en la técnica.

Fragmentos de péptido de las proteínas terapéuticas pueden ser fragmentos que comprenden, o de manera alternativa, que consiste en, una secuencia de aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica) de la secuencia de polipéptido de la proteína terapéutica de la que la secuencia de aminoácidos es un fragmento.

Otros fragmentos de polipéptido son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son los que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de una proteína terapéutica usada en la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos pueden incluir una actividad deseada mejorada, o una actividad no deseable disminuida.

En general, variantes de proteínas son en conjunto muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a las secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica que corresponden a una parte de proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes también están abarcadas por la invención.

Los polipéptidos terapéuticos adicionales que se pueden usar en la invención son polipéptidos codificados por polinucleótidos que se hibridan al complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons Inc., New. York). Polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están abarcados por la presente invención.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos duda de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia duda excepto que la secuencia de polipéptidos sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos duda. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos duda, hasta 5% de los restos de aminoácido en la secuencia sujeto de puede insertar, suprimir o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino- o carboxi-terminal de la secuencia de referencia de aminoácidos o en cualquier parte entre las posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre restos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como una materia práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de transferrina de la invención o su fragmento (tal, como la parte de proteína terapéutica de la proteína de fusión de transferrina o la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina), se puede determinar de manera convencional usando programas de ordenador conocidos. Un procedimiento preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia duda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominada alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brufiag-et al. (Comp. App. Biosci 245-(1990)).

Las variantes de polinucleótido de la invención pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. Las variantes de polinucleótido que contienen alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones, o supresiones, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado se puede usar para producir proteínas de fusión modificadas de Tf. Se pueden utilizar las variantes de nucleótido producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Además, variantes de polipéptido en las que menos de aproximadamente 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, o 5-50, 5-25, 5-10, 1-5, o 1-2 aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos en cualquier combinación también se puede utilizar. Variantes de polinucleótido se pueden producir por una diversidad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codón para un huésped particular (codones de cambio en el ARNm humano para los preferidos por un huésped, tal como, levadura o E. coli como se ha descrito anteriormente).

En otras realizaciones, es resto de proteína terapéutica tiene sustituciones conservadoras comparado con la secuencia de tipo salvaje. Por "sustituciones conservadoras" se pretende intercambiar dentro de grupos tal como reemplazo de aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e Ile; reemplazo de los restos hidroxilo Ser y Thr; reemplazo de los restos ácidos Asp y Glu; reemplazo de los restos amida Asn y Gln, reemplazo de los restos básicos Lys, Arg, y His; reemplazo de los restos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, y reemplazo de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. La guía concerniente a cómo preparar sustituciones de aminoácido fenotípicamente silenciosas de proporciona, por ejemplo, en Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990). En realizaciones específicas, los polipéptidos de la invención comprenden, o de manera alternativa, constan de, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica descrita en el presente documento y/o transferrina de suero, y/ proteína de transferrina modificada de la invención, en las que los fragmentos o variantes tienen 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ó 50-150 adiciones, sustituciones, y/o supresiones de restos de aminoácido, cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia. En realizaciones adicionales, las sustituciones de aminoácido son ácidos nucleicos conservadores que codifican estos polipéptidos están también abarcadas por la invención.

Las proteínas de fusión modificadas de la presente invención pueden estar compuestas de aminoácidos unidos entre sí por las uniones de péptido o uniones de péptido modificadas y puede contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos se pueden codificar mediante cualquier procedimiento natural, tal como procesamiento después de la traducción, o mediante técnicas de modificación química se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una bibliografía de investigación voluminosa.

Modificaciones se pueden producir en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la estructura central del péptido, las cadenas laterales de aminoácido y los extremos amino o carboxi. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos o grados variables en los diferentes sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados se pueden producir a partir de procesos naturales después de la traducción o se pueden preparar mediante procedimientos sintéticos. Modificaciones incluyen acetilación, acilación, AOP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, sulfonación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS-estructura AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., 1. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New' York, páginas. 1-12 (1983); Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-646; Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62.

Las moléculas terapéuticas que se pueden fusionar o insertar en Tf incluyen, pero no se limitan a, hormonas, proteínas de matriz, inmunosupresores, broncodilatadores, agentes cardiovasculares, enzimas, agentes del CNS, neurotransmisores, proteínas o péptidos receptores, hormonas, hormonas de crecimiento, péptidos antivirales, péptidos inhibidores fusogénicos, citoquina, linfoquinas, monoquinas, interleuquinas, factores estimuladores de colonias, factores de diferenciación, factores angiogénicos, ligandos receptores, proteínas asociadas a cáncer, antineoplásicos, péptidos virales, péptidos antibióticos, proteínas de sangre, proteínas antagonistas, factores de transcripción, factores antiangiogénicos, proteínas o péptidos antagonistas, antagonistas receptores, anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena y moléculas de adhesión a células. Se pueden combinar diferentes moléculas terapéuticas en una sola proteína de fusión para producir una molécula bi o multi-funcional. También se pueden usar diferentes moléculas en combinación para producir una proteína de fusión con una entidad terapéutica y una entidad de dirección.

Las citoquinas son proteínas solubles liberadas por células del sistema inmune, que actúa de manera no enzimática mediante receptores específicos para regular las respuestas inmunes. Citoquinas se parecen a las hormonas porque actúan a bajas concentraciones unidas con alta afinidad a un receptor específico. El término "citoquina" se usa en el presente documento para describir proteínas de origen natural o recombinantes, sus análogos, y sus fragmentos que inducen una respuesta biológica específica en una célula que tiene un receptor para esa citoquina. Citoquinas preferiblemente incluyen interleuquinas tales como interleuquina-2 (IL-2) (Nº de Acceso del GenBank S77834), IL-3 (Nº de Acceso del GenBank M14743), IL-4 (Nº de Acceso del GenBank M23442), IL-5 (Nº de Acceso del GenBank J03478), IL-6 (Nº de Acceso del GenBank M14584), IL-7 (Nº de Acceso del GenBank NM_000880), IL-10 (Nº de Acceso del GenBank NM_000572), IL-12 (Nº de Acceso del GenBank AF180562 y Nº de Acceso del GenBank AF180563), IL-13 (Nº de Acceso del GenBank U10307), IL-14 (Nº de Acceso del GenBank XM_170924), IL-15 (Nº de Acceso del GenBank X91233), IL-16 (Nº de Acceso del GenBank NM_004513), IL-17 (GenBank Acc. 35 No. NM_002190) and IL-18 (Nº de Acceso del GenBank NM_001562), factores hematopoyéticos tales como factor estimulante de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Nº de Acceso del GenBank X03021), factor estimulante de la colonia de granulocito (G-CSF) (Nº de Acceso del GenBank X03656), factor activador de plaquetas (Nº de Acceso del GenBank NM_000437) y eritropoyetina (Nº de Acceso del GenBank X02158), factores de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF\alpha (Nº de Acceso del GenBank X0291O), linfoquinas tales como Ilinfotoxina (Nº de Acceso del GenBank X02911), linfotoxina-B (Nº de Acceso del GenBank L11016), leukorregulina, factor de inhibición de la migración de macrófagos (Nº de Acceso del GenBank M25639), y neuroleuquina (Nº de Acceso del GenBank K03515), reguladores del proceso metabólico tal como leptina (Nº de Acceso del GenBank U43415), interferones tal como interferón \alpha (IFN\alpha) (Nº de Acceso del GenBank M54886), IFN\beta (Nº de Acceso del GenBank V00534), IFN\gamma (Nº de Acceso del GenBank J00219), IFNo (Nº de Acceso del GenBank NM_002177), trombospondina 1 (THBS1) (Nº de Acceso del GenBank NM_003246), THBS2 (Nº de Acceso del GenBank L12350), THBS3 (Nº de Acceso del GenBank L38969), THBS4 (Nº de Acceso del GenBank NM_003248), y quimioquinas. Preferiblemente, la proteína de fusión transferrina modificada-citoquinuna de la presente invención muestra actividad biológica de citoquina.

El término "hormona" se usa en el presente documento para describir cualquiera de un número de sustancias biológicamente activas que se producen mediante ciertas células o tejidos y que pueden provocar cambios o actividades biológicos específicos que se producen en otra célula o tejido localizado en cualquier parte en el cuerpo. Las hormonas preferiblemente incluyen proinsulina (Nº de Acceso del GenBank V00565), insulina (Nº de Acceso del GenBank NM_000207), hormona de crecimiento 1 (Nº de Acceso del GenBank V00520), hormona de crecimiento 2 (Nº de Acceso del GenBank F006060), factor de liberación de la hormona de crecimiento (Nº de Acceso del GenBank NM_021081), factor de crecimiento I de tipo insulina (Nº de Acceso del GenBank M27544), factor de crecimiento II de tipo insulina (Nº de Acceso del GenBank NM_000612), factor de crecimiento I de tipo insulina que se une a proteína (IGFBP-1) (Nº de Acceso del GenBank M59316), IGFBP-2 (Nº de Acceso del GenBank X16302), IGFBP-3 (Nº de Acceso del GenBank NM_ 000598), IGFBP-4 (Nº de Acceso del GenBank Y12508), IGFBP-5 (Nº de Acceso del GenBank M65062), IGFBP-6 (Nº de Acceso del GenBank NM_002178), IGFBP-7 (Nº de Acceso del GenBank NM_001553), cadena \beta de gonadotropina coriónica (Nº de Acceso del GenBank NM_ 55 033142), cadena \alpha de gonadotropina coriónica (Nº de Acceso del GenBank NM_000735), hormona \beta luteinizante (Nº de Acceso del GenBank X00264), hormona \beta estimuladora de folículo (Nº de Acceso del GenBank NM_00051 O), hormona \beta estimuladora de tiroides (Nº de Acceso del GenBank NM_000549), prolactina (Nº de Acceso del GenBank NM_000948), pro-opiomelanocortina (Nº de Acceso del GenBank V0151 O), corticotropina (ACTH), lipotropina \beta, hormona estimuladora de melanocitos \alpha (\alpha-MSH), \gamma-lipotropin, \beta-MSH, \beta-endorfina, y péptido del lóbulo intermedio de tipo corticotropina (CLIP).

El término "factor de crecimiento" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido que se une a un receptor para estimular la proliferación de células. Los factores de crecimiento preferiblemente incluyen factor de crecimiento-\alpha derivado de plaquetas (PDGF-a) (Nº de Acceso del GenBank X03795), PDGF-\beta (Nº de Acceso del GenBank X02811), hormonas esteroides, factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Nº de Acceso del GenBank 5 NM_001963), factor de crecimiento de fibroblastos tal como factor de crecimiento 1 de fibroblastos (FGF1) (Nº de Acceso del GenBank NM_000800), FGF2 (Nº de Acceso del GenBank NM_002006), FGF3 (Nº de Acceso del GenBank NM_005247), FGF4 (Nº de Acceso del GenBank NM_002007), FGF5 (Nº de Acceso del GenBank M37825), FGF6 (Nº de Acceso del GenBank X57075), FGF7 (Nº de Acceso del GenBank NM_002009), FGF8 (Nº de Acceso del GenBank AH006649), FGF9 (Nº de Acceso del GenBank NM_002010), FGF10 (Nº de Acceso del GenBank AB002097), FGF11 (Nº de Acceso del GenBank NM_004112), FGF12 (Nº de Acceso del GenBank NM_021 032), FGF13 (Nº de Acceso del GenBank NM_004114), FGF14 (Nº de Acceso del GenBank NM_004115), FGF16 (Nº de Acceso del GenBank AB009391), FGF17 (Nº de Acceso del GenBank NM_ 003867), FGF18 (Nº de Acceso del GenBank AF075292), FGF19 (Nº de Acceso del GenBank NM_005117), FGF20 (Nº de Acceso del GenBank NM_019851), FGF21 (Nº de Acceso del GenBank NM_019113), FGF22 (Nº de Acceso del GenBank NM_020637), y FGF23 (Nº de Acceso del GenBank NM_020638), angiogenina (Nº de Acceso del GenBank M11567), factor neurotrófico derivado del cerebro (Nº de Acceso del GenBank M61176), factor de crecimiento neurotrófico ciliar (Nº de Acceso del GenBank X60542), factor de crecimiento-\alpha de transformación (TGF-\alpha) (Nº de Acceso del GenBank X70340), TGF-\beta (Nº de Acceso del GenBank X02812), factor de crecimiento-\alpha nervioso (NGF-a) (Nº de Acceso del GenBank NM_010915), NGF-\beta (Nº de Acceso del GenBank X52599), inhibidor de tejido de metalloproteinasa 1 (TIMP1) (Nº de Acceso del GenBank NM_003254), TIMP2 (Nº de Acceso del GenBank NM_003255), TIMP3 (Nº de Acceso del GenBank U02571), TIMP4 (Nº de Acceso del GenBank U76456) y estimulador 1 de macrófagos (Nº de Acceso del GenBank L11924).

El término "proteína de matriz" se usa en el presente documento para describir proteínas o péptidos que se encuentran normalmente en la matriz extracelular. Estas proteínas pueden ser funcionalmente funcionales para resistencia, filtración, o adhesión. Las proteínas de matriz preferiblemente incluyen colágenos tal como colágeno I (Nº de Acceso del GenBank Z74615), colágeno II (Nº de Acceso del GenBank X16711), colágeno III (Nº de Acceso del GenBank X14420), colágeno IV (Nº de Acceso del GenBank NM_001845), colágeno V (Nº de Acceso del GenBank NM_000393), colágeno VI (Nº de Acceso del GenBank NM_058175), colágeno VII (Nº de Acceso del GenBank L02870), colágeno VIII (Nº de Acceso del GenBank NM_001850), colágeno IX (Nº de Acceso del GenBank X54412), colágeno X (Nº de Acceso del GenBank X60382), colágeno XI (Nº de Acceso del GenBank J04177), y colágeno XII (Nº de Acceso del GenBank U73778), proteínas de laminina tales como LAMA2 (Nº de Acceso del GenBank NM_000426), LAMA3 (Nº de Acceso del GenBank L34155), LAMA4 (Nº de Acceso del GenBank NM_002290), LAMB (Nº de Acceso del GenBank NM_002291), LAMB3 (Nº de Acceso del GenBank L25541), LAMC1 (Nº de Acceso del GenBank NM_002293), nidógeno (Nº de Acceso del GenBank NM_002508), \alpha-tectorina (Nº de Acceso del GenBank NM_005422), \beta-tectorina (Nº de Acceso del GenBank NM_058222), y fibronectina (Nº de Acceso del GenBank X02761).

La expresión "proteínas de sangre" se definen de manera tradicional como aquellas con origen en plasma, muchas ahora producidas comúnmente por medios recombinantes, e incluyen, pero no se limitan a proteínas de suero nativas, derivados, fragmentos y mutantes o sus variantes, factores de coagulación de sangre, derivados, mutantes, variantes y fragmentos (incluyendo factores VII, VIII, IX, X), inhibidores de proteasa (antitrombina 3, antitripsina alfa-1), activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, inmunoglobulinas, factor de von Willebrand y mutantes de von Willebrand, fibronectina, fibrinógeno, trombina y hemoglobina.

El término "enzima" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o sustancia proteinácea que cataliza una reacción específica sin estar ella misma permanentemente alterada o destruida. Las enzimas preferiblemente incluyen factores de coagulación tales como F2 (Nº de Acceso del GenBank XM_170688), F7 (Nº de Acceso del GenBank XM_027508), F8 (Nº de Acceso del GenBank XM_013124), F9 (Nº de Acceso del GenBank NM_000133), F10 (Nº de Acceso del GenBank AF503510) y otros, metaloproteinasas de matriz tales como metaloproteinasa de matriz 1 (Nº de Acceso del GenBank MMP1) (Nº de Acceso del GenBank NM_002421), MMP2 (Nº de Acceso del GenBank NM_004530), MMP3 (Nº de Acceso del GenBank NM_002422),MMP7 (Nº de Acceso del GenBank NM_002423), MMP8 (Nº de Acceso del GenBank NM_002424), MMP9 (Nº de Acceso del GenBank NM_004994), MMP10 (Nº de Acceso del GenBank NM_002425), MMP12 (Nº de Acceso del GenBank NM_002426), MMP13 (Nº de Acceso del GenBank X75308), MMP20 (Nº de Acceso del GenBank NM_004771), adenosina desaminasa (Nº de Acceso del GenBank NM_000022), proteína quinasas activada por mitógeno tales como MAPK3 (Nº de Acceso del GenBank XM_055766), MAP2K2 (Nº de Acceso del GenBank NM_030662), MAP2K1 (Nº de Acceso del GenBank NM_002755), MAP2K4 (Nº de Acceso del GenBank N_003010), MAP2K7 (AF013588), y MAPK12 (NM_002969), quinasas tales como JNKK1 (Nº de Acceso del GenBank U17743), JNKK2 (Nº de Acceso del GenBank AF014401), JAK1 (M64174), JAK2 (NM_004972), y JAK3 (N_000215), y fosfatasas tales como PPM1A (Nº de Acceso del GenBank NM_021 003) y PPM1D (Nº de Acceso del GenBank NM_003620).

La expresión "factores de transcripción" se usa en el presente documento para describir cualquier proteína o péptido implicado en la transcripción de genes que codifican proteína. Los factores de transcripción pueden incluir Sp1, Sp2 (Nº de Acceso del GenBank NM_003110), Sp3 (Nº de Acceso del GenBank AY070137), Sp4 (Nº de Acceso del GenBank NM_003112) NFYB (Nº de Acceso del GenBank NM_006166), Hap2 (Nº de Acceso del GenBank M59079), GATA-1 (Nº de Acceso del GenBank NM_002049), GATA-2 (Nº de Acceso del GenBank NM_002050), GATA-3 (Nº de Acceso del GenBank X55122), GATA-4 (Nº de Acceso del GenBank L34357), GATA-5, GATA-6 (Nº de Acceso del GenBank NM_005257), FOG2 (NM_012082), Eryf1 (Nº de Acceso del GenBank X17254), TRPS1 (Nº de Acceso del GenBank NM_014112), NF-E2 (Nº de Acceso del GenBank NM_006163), NF-E3, NF-E4, TFCP2 (Nº de Acceso del GenBank NM_005653), Oct-1 (Nº de Acceso del GenBank X13403), proteínas caja homeo tales como HOXB2 (Nº de Acceso del GenBank NM_002145), HOX2H (Nº de Acceso del GenBank X16665), homólogo sin pelo (Nº de Acceso del GenBank NM_005144), madres contra proteínas decapentaplégicas tales como MADH1 (Nº de Acceso del GenBank NM_005900), MADH2 (Nº de Acceso del GenBank NM_005901), MADH3 (Nº de Acceso del GenBank NM_005902), MADH4 (Nº de Acceso del GenBank NM_005359), MADH5 (Nº de Acceso del GenBank AF009678), MADH6 (Nº de Acceso del GenBank NM_005585), MADH7 (Nº de Acceso del GenBank NM_005904), MADH9 (Nº de Acceso del GenBank NM_005905), y traductor de señal y activador de proteínas de transcripción tales como STAT1 (Nº de Acceso del GenBank XM_010893), STAT2 (Nº de Acceso del GenBank NM_005419), STAT3 (Nº de Acceso del GenBank AJ012463), STAT4 (Nº de Acceso del GenBank NM_003151), STAT5 (Nº de Acceso del GenBank L41142), y STAT6 (Nº de Acceso del GenBank NM_003153).

En otra realización más de la invención, molécula terapéutica es una proteína no humana o no mamífero. Por ejemplo, VIH gp120, VIH Tat, proteínas de superficie de otros virus tales como hepatitis, herpes, gripe, adenovirus y RSV, otros componentes de VIH, proteínas de superficie de parásitos tales como antígenos de malaria, y proteínas de superficie de bacterias son las preferidas. Estas proteínas no humanas se pueden usar, por ejemplo, como antígenos, o porque tienen actividades útiles. Por ejemplo, la molécula terapéutica puede ser estreptoquinasa, estafiloquinasa, uroquinasa, u otras proteínas con actividades enzimáticas útiles.

En una realización alternativa, la molécula terapéutica es una proteína de unión a ligando con actividad biológica. Tales proteínas de unión a ligando pueden, por ejemplo, (1) bloquear interacciones receptor-ligando en la superficie de la célula; o (2) neutralizar la actividad biológica de una molécula en la fase fluida de la sangre, previniendo por lo tanto que alcance su diana celular. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de transferrina modificadas incluyen una molécula de transferrina modificada fusionadas a un dominio de unión a ligando de un receptor seleccionado entre el grupo que consiste en, pero sin limitación a, un receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), un receptor acetilado de LDL, un receptor del factor \alpha de necrosis tumoral, un receptor del factor \beta de crecimiento de transformación, un receptor de citoquina, un receptor de inmunoglobulina Fc, un receptor del hormona, un receptor de glucosa, un receptor de glicolípido, y un receptor de glicosaminoglicano. En otras realizaciones, las proteínas de unión a ligando incluyen CD2 (M14362), CD3G (NM_ 000073), CD3D (NM_000732), CD3E (NM_000733), CD3Z (J04132), CD28 (NM_006139), CD4 (Nº de Acceso del GenBank NM_000616), CD1A (Nº de Acceso del GenBank M28825), CD1B (Nº de Acceso del GenBank NM_001764), CD1C (Nº de Acceso del GenBank NM_001765), CD1D (Nº de Acceso del GenBank NM_001766), CD80 (Nº de Acceso del GenBank NM_005191), GNB3 (Nº de Acceso del GenBank AF501884), CTLA-4 (Nº de Acceso del GenBank NM_005214), moléculas de adhesión intercelular tales como ICAM-1 (NM_000201), ICAM-2 (NM_000873), and ICAM-3 (NM_002162), receptores del factor de necrosis tumoral tales como TNFRSF1 A (Nº de Acceso del GenBank X55313), TNFR1SFB (Nº de Acceso del GenBank NM_001066), TNFRSF9 (Nº de Acceso del GenBank NM_001561), TNFRSF10B (Nº de Acceso del GenBank NM_003842), TNFRSF11 B (Nº de Acceso del GenBank NM_002546), y TNFRSF13B (Nº de Acceso del GenBank No_006573), y receptores de interleuquina tales como IL2RA (Nº de Acceso del GenBank NM_000417), IL2RG (Nº de Acceso del GenBank NM_000206), IL4R (Nº de Acceso del GenBank AF421855), IL7R (Nº de Acceso del GenBank NM_002185), IL9R (Nº de Acceso del GenBank XM_015989), e IL13R (Nº de Acceso del GenBank X95302). Preferiblemente, la proteína de fusión de unión a ligando-Tf de la presente invención muestra la actividad biológica de la proteína de unión a ligando.

La expresión "proteínas asociadas a cáncer" se usa en el presente documento para describir proteínas o polipéptidos cuya expresión está asociada a cáncer o el mantenimiento de crecimiento de célula controlado, tales como proteínas codificadas por genes supresores de tumor u oncogenes. Proteínas asociadas a cáncer pueden ser p16 (Nº de Acceso del GenBank AH005371), p53 (Nº de Acceso del GenBank NM_000546), p63 (Nº de Acceso del GenBank NM_003722), p73 (Nº de Acceso del GenBank NM_005427), BRCA1 (Nº de Acceso del GenBank U14680), BRCA2 (Nº de Acceso del GenBank NM_000059), proteína de interacción CTBP (Nº de Acceso del GenBank U72066), DMBT1 (Nº de Acceso del GenBank NM_004406), HRAS (Nº de Acceso del GenBankNM_005343), NCYM (Nº de Acceso del GenBank NM_006316), FGR (Nº de Acceso del GenBank NM_005248), myb (Nº de Acceso del GenBank AF104863), rafl (Nº de Acceso del GenBank NM_002880), erbB2 (Nº de Acceso del GenBank NM_004448), VAV (Nº de Acceso del GenBank X16316), e-tos (V Nº de Acceso del GenBank 01512), e-fes (Nº de Acceso del GenBank X52192), c-jun (Nº de Acceso del GenBank NM_002228), MAS1 (Nº de Acceso del GenBank M13150), pim-1 (Nº de Acceso del GenBank. M16750), TIF1 (Nº de Acceso del GenBank NM_003852), c-fms (Nº de Acceso del GenBank X03663), EGFR (Nº de Acceso del GenBank NM_005228), erbA (Nº de Acceso del GenBank X04707), c-src tirosina quinasa (Nº de Acceso del GenBank XM_044659), c-abl (Nº de Acceso del GenBank M14752), N-ras (Nº de Acceso del GenBank X02751), K-ras (Nº de Acceso del GenBank M54968), jun-B (Nº de Acceso del GenBank. M29039), c-myc (Nº de Acceso del GenBank AH001511), RB1 (Nº de Acceso del GenBank M28419), DCC (Nº de Acceso del GenBank X76132), APC (Nº de Acceso del GenBank NM_000038), NF1 (Nº de Acceso del GenBank M89914), NF2 (Nº de Acceso del GenBank Y18000), y bcl-2 (Nº de Acceso del GenBank M13994).

"Péptidos inhibidores fusogénicos" se usa en el presente documento para describir péptidos que muestran actividad antiviral, capacidad de fusión anti-membrana, y/o una capacidad para modular los procesos intracelulares, por ejemplo, los que implican estructuras de péptido enrolladas en espiral. Actividad antiviral incluye, pero no se limita a, la inhibición de VIH-1, VIH-2, RSV, SIV, EBV. virus de sarampión, virus de la gripe, o transmisión de CMV a células no infectadas. De manera adicional, la capacidad antifusogénica, actividad antiviral o actividad intracelular moduladora de los péptidos solamente requiere la presencia de los péptidos y específicamente no requiere la estimulación de una respuesta inmune huésped dirigida contra tales péptidos. Antifusogénico se refiere a una capacidad de péptido para inhibir o reducir el nivel de episodios de fusión de membrana entre dos o más restos con relación al nivel de fusión de membrana que se produce entre dichos restos en la ausencia del péptido. Los restos pueden ser, por ejemplo, membranas celulares o estructuras virales, tales como envueltas o pelos virales. El término "péptido antiviral", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del péptido para inhibir infección viral de células o alguna actividad viral requerida para infección viral y/o patogénesis viral productiva, mediante, por ejemplo, fusión célula-célula o infección sin virus. Tal infección puede implicar la fusión de membrana, como se produce en el caso de virus envueltos, o algún otro episodio de fusión que implica una estructura viral y una estructura celular. Los péptidos inhibidores fusogénicos y antipéptidos virales a menudo tienen secuencias de aminoácidos que se derivan de más una proteína viral (por ejemplo, un polipéptido derivado de VIH-1, VIH-2, RSV, y SIV).

Ejemplos de péptidos inhibidores fusogénicos y antipéptidos virales se pueden encontrar en los documentos WO 94/2820, WO 96/19495, WO 96/40191, WO 01/64013 y patentes de Estados Unidos 6.333.395, 6.258.782, 6.228.983, 6.133.418, 6.093.794. 6.068.973, 6.060.065, 6.054.265, 6.020.459, 6.017.536, 6.013.263, 5.464.933, 5.346.989,
5.603.933, 5.656.480, 5.759.517, 6.245.737; 6.326.004. y 6.348.568; todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. En una realización preferida, péptidos antifusogénicos se seleccionan entre el grupo que consiste en VIH T-20 (FWNWLSAWKDLELLEOENKEOONOVÉASEILSHILSTY, SEQ ID NO: 4), VIH T-1249, RSV T786 (VYPSDEYDASISOVNEEINOALAYIRKADELLENV, SEQ ID NO: 5),RSV T1584 (AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKOL, SEQ ID NO: 6) y RSV T112 (VFPSDEFDASISOVNEKINOSLAFIRESDELLHNV, SEQ ID NO: 7).

Ejemplos de otros tipos de péptidos, incluyen fragmentos de proteínas terapéuticas como se describe en el presente documento, en particular, fragmentos de proteínas humanas que retienen al menos una actividad de la molécula precursora. Péptidos que se pueden usar para producir proteínas de fusión modificadas de Tf de la invención también incluyen péptidos miméticos y péptidos que muestran una actividad biológica de una proteína terapéutica pero que se defieren en la secuencia o estructura tridimensional de una proteína terapéutica de longitud completa. Como un ejemplo no limitante, los péptidos incluyen péptidos miméticos de eritropoyetina descritos por Johnson et al. (2000) Nephrol. Dial. Transplant 15 (9): 1274-7, Kuai et al. (2000) J. Pept. Res. 56 (2): 59-62, Barbone et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14 Supp 2: 80-4, Middleton et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (20): 14163-9, Johnson et al. (1998) Biochemistry 37 (11): 3699-710, Johnson et al. (1997) Chem. Biol. 12: 939-50, Wrighton et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15 (12): 1261-5, Livnah et al. (1996) Science 273: 464-71, y Wrighton et al., (1996) Science 273: 458-64.

Las moléculas terapéuticas también incluyen proteínas alergénicas y sus fragmentos digeridos. Éstos incluyen alérgenos de polen de artemisa, centeno, grama de los prados, dáctilo, cerrillo, grama roja, fleo, lengua de vaca, trigo, maíz, artemisa, césped azul, césped anual de California, bledo, césped de Bermudas, cardo ruso, cedro de montaña, roble, hacer negundo, sicomoro, arce, olmo, etc., polvo y ácaros, veneno de abeja, alérgenos de alimentos, mudas de animal, y otros venenos de insectos.

Otras moléculas terapéuticas incluyen vacunas microbianas que incluyen vacunas virales, vacunas bacterianas y de protozoos y sus diversos componentes tales como antígenos de superficie. Éstos incluyen vacunas que contienen glicoproteínas, proteínas o péptidos derivados de estas proteínas. Tales vacunas se preparan a partir de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumonia, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonellae species, Shigellae species, Escherichia coli, Klebsiellae species, Proteus species, Vibrio cholera, Campylobacter pylori, Pseudomonas aeraginosa, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Treponema pallidum, chlamydia, toxoide de tétanos, toxoide de difteria, virus influenza, adenovirus, paramixovirus (paperas, sarampión), virus de rubéola, virus de polio, virus de hepatitis, virus de herpes, virus de rabia, VIH-1, VIH-2, RSV y virus de papiloma.

Las moléculas de fusión preferidas pueden contener péptidos virales anti-HIV, péptidos anti-RSV, hormona de crecimiento humana, \alpha y/o \beta interferones, eritropoyetina (EPO), péptidos de tipo EPO, factor estimulante de la colonia de granulocitos (GCSF), factor estimulante de la colonia de granulocitos-macrófagos (GMCSF), insulina, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), trombopoyeitina, péptidos que corresponden a CDR de un anticuerpo, Proteína asociada a neogénesis de islotes (INGAP), calcitonina, angiostatina, endostatina, interleuquina-2, factor de liberación de la hormona de crecimiento, hormona paratiroide humana, péptidos del factor de necrosis anti-tumoral (TNF), receptor de interleuquina-1 (1 L-1) y/o anticuerpos de una sola cadena.

Proteínas de fusión de la invención también se pueden preparar para que incluyan péptidos o polipéptidos derivados de genotecas de péptido para seleccionar moléculas con funciones nuevas o novedosas. Tales genotecas de péptido pueden incluir las disponibles comercialmente o públicamente, por ejemplo, American Peptide Co. Inc., Cell Sciences Inc., Invitrogen Corporation, Phoenix Pharmaceutical Inc., United States Biological, así como las producidas por tecnologías disponibles, por ejemplo, genotecas que se despliegan en bacteriófagos o bacterias hacen uso de de procedimientos convencionales.

En otras realizaciones más de la invención, proteínas de fusión de Tf se pueden preparar usando restos de proteína terapéutica como se conocen en la técnica y se ejemplifican por los péptidos y proteínas actualmente aprobados por Food and Drug Administración de Alimentos y Fármacos en (www.fda.gov/cber/efoi/approve.htm) así como Publicaciones de patentes números PCT WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480.

Tabla 1 (adaptada de la Publicación Internacional PCT No. WO 01/79444) proporciona una lista no exhaustiva de proteínas terapéuticas que corresponde a una parte de proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención. La columna "Proteína terapéutica X" describe moléculas de proteína terapéutica seguido de paréntesis que contiene nombres científicos y de marca comercial que comprenden o de manera alternativa constan de esa molécula de proteína terapéutica o su fragmento o su variante. "Proteína terapéutica X" como se usa en el presente documento se puede referir a o bien una molécula de proteína terapéutica individual (como se define por la secuencia de aminoácidos obtenible de CAS and números de acceso del Genbank), o el grupo entero de proteínas terapéuticas asociadas a una molécula de proteína terapéutica dada descrita en esta columna. La columna 'Identificador Ejemplar' proporciona Números de Registro de Servicios de Resúmenes Químicos (CAS) (publicados por la Sociedad Química Americana) y/o Números de Acceso del GenBank (por ejemplo, Locus ID, NP-XXXXX (Secuencia de referencia Proteína), e identificadores XPXXXXX (Proteína Modelo) disponibles a través de la página web nacional de Información del Centro para Biotecnología, (NCBI) en www.ncbLnlm.nih.gov) que corresponde a las entradas de registro CAS o base de datos del Genbank que contiene una secuencia de aminoácidos de la proteína molécula o de un fragmento o variante de la molécula de proteína terapéutica. Además números de acceso del GenSeq y/o citas en la publicación de revistas se proporcionan para identificar la secuencia de aminoácidos ejemplar para algunos polipéptidos

Las páginas de sumario asociadas a cada uno de estos CAS y números de acceso del Genbank y del GenSeq y así como las publicaciones de revistas citadas están disponibles (por ejemplo, PubMed ID número (PMID)). La columna PCT/referencia de patente proporciona Número de Patente de Estados Unidos, o Números de Publicación Internacional PCT que corresponde a las patentes y/o Solicitudes de Patente Expedidas que describen la molécula de proteína terapéutica todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. La columna Actividad biológica describe actividades biológicas asociadas a la molécula de proteína terapéutica. La columna Ensayo de Actividad Ejemplar proporciona referencias que describen ensayos que se pueden usar para ensayar la actividad terapéutica y/o biológica de una proteína terapéutica o una proteína de fusión de transferrina de la invención que comprende una parte de proteína terapéutica X. Estas referencias están también en el presente documento incorporadas por referencia en su totalidad. La columna "Indicación Preferida Y" describe enfermedad, trastornos, y/o afecciones que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar, o mejorar mediante la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de transferrina de la invención que comprende una parte de la proteína terapéutica X.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

221

222

223

224

225

226

227

228

229

230

231

232

233

234

235

236

237

238

239

240

241

242

243

244

245

246

247

248

249

250

251

252

253

254

255

256

257

258

Administración de un fármaco o proteína terapéutica al interior de una célula y/o a través de la Barrera sangre cerebro (BBB)

\global\parskip0.870000\baselineskip

Dentro del alcance de la invención, las proteínas de fusión de transferrina modificadas se pueden usar como un vehículo para administrar una molécula o molécula pequeña formando complejo con el ion férrico de transferrina al interior de una célula o a través de la barrera sangre cerebro. En estas realizaciones, la proteína de Tf de fusión se someterá o se modificará por ingeniería para, evitar o eliminar la glicosilación para extender la semivida en suero de la proteína de fusión y/o parte de proteína terapéutica. La adición de un péptido diana o, por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena se contempla específicamente para además dirigir la proteína de Tf de fusión a un tipo de célula particular, por ejemplo, una célula cancerosa.

En una realización, el fármaco que contiene hierro, anti-anémico, complejo férrico-sorbitol-citrato se carga en una proteína de Tf de fusión de la invención. Férrico-sorbitol-citrato (FSC) se ha mostrado que inhibe la proliferación de diversas células cancerosas murinas in vitro y pueden provocar la regresión del tumor in vivo, mientras no tiene efecto en la proliferación de células no malignas (Poljak-Blazi et al. (junio de 2000) Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals (Estados Unidos), 15/3: 285-293).

En otra realización, el fármaco antineoplásico adriamicina (Doxorubicina) y/o el fármaco quimioterapéutico bleomicina, que se conocen en la técnica que forman complejos con el ion férrico, se carga en una proteína Tf de fusión de la invención. En otras realizaciones, una sal de un fármaco, por ejemplo, una sal citrato o carbonato, se puede preparar y formar complejo con el hierro férrico que se une después a Tf. Ya que las células tumorales a menudo muestran una mayor tasa de recambio para hierro; transferrina modificada para llevar al menos un agente antitumoral, puede proporcionar un medio de incrementar la exposición del agente o cargado para las células tumorales. (Demant, E.J., (1983) Eur. J. of Biochem. 137/(1-2): 113-118; Padbury et al. (1985) J. Biol. Chem. 260/13: 7820-7823).

\vskip1.000000\baselineskip

Formulaciones farmacéuticas y Procedimientos de Tratamiento

Las proteínas de fusión de la invención modificadas se pueden administrar a un paciente en necesidad del mismo usando protocolos de administración estándar. Por ejemplo, las proteínas de fusión modificadas de Tf de la presente invención se pueden proporcionar solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Como se usa en el presente documento, dos agentes se dice que se administran en combinación cuando se administran los dos agentes simultáneamente o se administran independientemente de una manera tal que los agentes actuarán en el mismo o casi el mismo tiempo.

Los agentes de la presente invención se pueden administrar mediante vías parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica y bucal. Por ejemplo, cualquier agente cualquier agente se puede administrar localmente a un sitio de lesión mediante microinfusión. De manera alternativa, o simultánea, la administración puede ser no invasiva mediante cualquier vía oral, inhalación, nasal, o pulmonar. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento simultáneo, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.

La presente invención además proporciona composiciones que contienen una o más proteínas de fusión de la invención. Aunque las necesidades individuales pueden variar, determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está dentro de la práctica en la técnica Las dosificaciones típicas comprenden aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones preferidas para administración sistémica comprenden aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal aproximadamente 100-200 mg de proteína/dosis. Las dosificaciones preferidas para la administración directa a un sitio mediante microinfusión comprenden aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Cuando se administra por inyección directa o microinfusión, de proteínas de fusión de la invención modificadas se puede modificar por ingeniería para mostrar reducida o no unión a hierro para prevenir, en parte, la toxicidad de hierro localizada.

Además de la proteína de fusión farmacéuticamente activa, las composiciones de la presente invención pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente para la administración al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos liófilos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o estrés de ácido graso sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden liposomas usar para encapsular el agente para la administración del agente en la célula.

La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo con la invención se puede formular para administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, los tres tipos de formulaciones se pueden usar de manera simultánea para lograr la administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas de gelatina duras o blandas, píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos revestidos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y sus formas de liberación controlada.

\global\parskip1.000000\baselineskip

En la práctica de los procedimientos de esta invención, los agentes de esta invención se pueden usar solos o en combinación, o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. En ciertas realizaciones preferidas, los compuestos de esta invención se pueden administrar conjuntamente con otros compuestos típicamente prescritos para estas condiciones de acuerdo con la práctica médica aceptada generalmente. Los compuestos de esta invención se pueden utilizar in vivo, ordinariamente en mamíferos, tales como seres humanos, ovejas, caballos, ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro.

Las proteínas de fusión modificadas de la presente invención se pueden usar en la diagnosis, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos relativos a enfermedades y trastornos del sistema endocrino, el sistema nervioso, el sistema inmune, sistema respiratorio, sistema cardiovascular, sistema reproductor, sistema digestivo, enfermedades y/o trastornos relativos a la proliferación de células, y/o enfermedades o trastornos relativos a la sangre.

En otras realizaciones más de la invención, proteínas de fusión modificadas de Tf se pueden usar en la diagnosis, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos relativos a enfermedades y trastornos que se sabe que están asociados a o se pueden tratar por restos proteína terapéutica como se sabe en la técnica y se ejemplifican por las Publicaciones de Patente PCT números WO 01/79258, WO 01/77137, WO 01/79442, WO 01/79443, WO 01/79444 y WO 01/79480. De acuerdo con lo anterior, la presente invención abarca un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerado en la columna de "Indicación Preferida Y" de la Tabla 1 que comprende la administración a un paciente en el que tal tratamiento, prevención o mejora se desea de una transferrina de fusión modificada de la invención que comprende aparte de proteína terapéutica correspondiente a una proteína terapéutica descrita en la columna "Proteína terapéutica X" de la Tabla 1 en una cantidad eficaz para tratar, prevenir, o mejorar la enfermedad o trastorno.

En ciertas realizaciones, una proteína de fusión de transferrina de la presente invención se pueden usar para diagnosticar y/o pronosticar enfermedades y/o trastornos.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnosis y/o pronóstico de enfermedades, trastornos, y/o afecciones del sistema inmune. Además, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno del sistema inmune particular.

En una realización preferida proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención se pueden usar como un agente para reforzar la sensibilidad inmune entre individuos inmunodeficientes. En realizaciones específicas, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar como un agente para reforzar la sensibilidad inmune entre individuos inmunodeficientes de células B y/o células T.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnosis, y/o pronóstico de trastornos autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes se producen por reconocimiento inapropiado del propio como material extraño por las células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido huésped. Por lo tanto, la administración de proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, que pueden inhibir una respuesta inmune, en particular la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de trastornos autoinmunes.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, pronóstico, y/o diagnosis de enfermedades, trastornos, y/o afecciones de células hematopoyéticas. Proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican transferrina proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles para incrementar diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células de tronco pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir esas enfermedades, trastornos, y/o afecciones asociados a una disminución de ciertos (o muchos) tipos células hematopoyéticas, incluyendo pero sin limitación, leucopenia, neutropenia, anemia, y trombocitopenia.

De manera alternativa, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para incrementar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células de tronco pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir esas enfermedades, trastornos, y/o afecciones asociados a un incremento de ciertos (o muchos) tipos células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitación, histiocitosis.

Reacciones alérgicas tales como asma (en particular asma alérgica) u otros problemas respiratorios, también se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar y usando las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención. Además, estas moléculas se pueden usar para tratar, prevenir, pronosticar y/o diagnosticar, hipersensibilidad a a una molécula antigénica, o incompatibilidad de grupo sanguíneo.

De manera adicional, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar reacciones alérgicas mediadas por IgE. Tales reacciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis, y eczema. En realizaciones específicas, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para modulas las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.

Además, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención tienen usos en la diagnosis, prognosis, prevención, y/o tratamiento de afecciones inflamatorias. Por ejemplo, ya que las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden inhibir la activación, proliferación, y/o diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria, estas moléculas se pueden usar para prevenir y/o tratar afecciones crónicas e inflamatorias agudas. Tales afecciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inflamación asociada a infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis, o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), lesión de reperfusión por isquemia, letalidad por endotoxina, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citoquina o quimioquina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, sobre producción de citoquinas (por ejemplo, TNF o IL-1.), trastornos respiratorios (por ejemplo, asma y alergia); trastornos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino); cánceres (por ejemplo, gástrico, ovario, pulmón, vejiga, hígado, y mama); trastornos del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple; lesión cerebral isquémica y/o apoplejía, lesión cerebral traumática, trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheizmer); Demencia relacionada con SIDA; y enfermedad de priones); trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular, y complicaciones de desviación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades adicionales, afecciones, y trastornos que se caracterizan por inflamación (por ejemplo, hepatitis, artritis reumatoide, gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión de reperfusión por isquemia renal, enfermedad de Grave, lupus sistémico eritematoso, diabetes mellitus, y rechazo de transplante
alogénico).

Debido a que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, trastornos inflamatorios can se pueden producir virtualmente en cualquier tejido del cuerpo. De acuerdo con lo anterior, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, tienen usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejidos, que incluyen, pero no se limitan a, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, cocitis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustachitis, fibrositis, foliculitis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatoesplenitis, queratitis, labirinitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miosititis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, Pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis, tendonitis, tonsillitis, uretritis, y vaginitis.

En realizaciones específicas, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de transferrina de fusión de la invención, son útiles para diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar rechazos de transplante de órganos y enfermedad de huésped contra injerto. El rechazo de órganos se produce por la destrucción de células inmunes huésped del tejido transplantado mediante una respuesta inmune. De manera similar, una respuesta inmune también está implicada en GVHD, pero, en esta caso, las células inmunes transplantadas extrañas destruyen los tejidos del huésped. Polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la invención, y/o agonistas o sus antagonistas, que inhiben una respuesta inmune, en particular la activación, proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de rechazo de órganos o GVHD.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antivirales. Respuestas inmunes antivirales que se pueden potenciar usando las composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen virus y enfermedades asociadas a virus o síntomas descritos en el presente documento o de otra manera conocidos en la técnica En realizaciones específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo que consiste en SIDA, meningitis, Dengue, EBV, y hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En otra realización específica, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un virus, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo que consiste en: VIH/SIDA, virus sincitial respiratorio, Dengue, rotavirus, encefalitis japonesa B, gripe A y B, parainfluenza, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chikungunya, fiebre del valle del Rift, herpes simplex, y fiebre amarilla.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas. Las respuestas inmunes antibacterianas o antifúngicas que se pueden potenciar usando las composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen bacterias u hongos y bacteria enfermedades o síntomas asociados a bacterias u hongos descritos en el presente documento o de otra manera conocidos en la técnica En realizaciones específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una bacteria u hongo, enfermedad, o síntoma seleccionado entre el grupo que consiste en tétanos, Difteria, botulismo, y meningitis tipo B.

En otra realización específica, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionado entre el grupo que consiste en Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococoss del grupo B, Shigella spp., Escherichia coli enterotoxigénica, E. coli enterohemorrágica, y Borrelia burgdorferi.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como un adyuvante para potenciar respuestas inmunes antiparasitarias. Las respuestas inmunes antiparasitarias que se pueden potenciar usando composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen parásitos y enfermedades asociadas a parásitos o síntomas descritos en el presente documento o de otra manera conocidos en la técnica En realizaciones específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmune a un parásito. En otra realización específica, las composiciones de la invención se usan como un, adyuvante para potenciar una respuesta inmune a Plasmodium (malaria) o Leishmania.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención también se pueden emplear para tratar infecciones enfermedades incluyendo silicosis, sarcoidosis, y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, evitando el reclutamiento y activación de fagocitos mononucleares.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como un antígeno para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas mediadas inmunes contra los polipéptidos de la invención.

En una realización, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de transferrina de fusión de la invención se administran a un animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdos, micro-cerdo, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano, y ser humano, lo más preferiblemente ser humano) para reforzar el sistema inmune que produce cantidades aumentadas, de uno o más anticuerpos (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, e IaE), para inducir mayor producción de anticuerpo de afinidad y cambio de la clase inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, e IaE), y/o para incrementar una respuesta inmune.

En otra realización, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan en una o más de las aplicaciones descritas en el presente documento, como se aplican a la medicina veterinaria.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención, y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como un medio de bloquear diversos aspectos de respuestas inmunes a agentes extraños o propios. Ejemplos de enfermedades o afecciones en las que el bloqueo de ciertos aspectos de respuestas inmunes se pueden desear incluyen trastornos autoinmunes tales como lupus, y artritis, así como inmunosensibilidad a alergias cutáneas, inflamación, enfermedad del intestino, lesión, y enfermedades/trastornos asociados a patógenos.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como una terapia para prevenir la proliferación de células B y secreción de Ig asociada a enfermedades autoinmunes tales como púrpura idiopática trombocitopénica idiopática, lupus sistémico eritematoso y esclerosis múltiple.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas o polinucleótidos que codifican proteínas de transferrina de fusión de la invención se usan como un inhibidor de migración de células B y/o T en células endoteliales. Esta actividad rompe la arquitectura del tejido o respuestas afines y es útil, por ejemplo en la ruptura de las respuestas inmunes, y bloqueo de sepsis.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención, y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como una terapia para hipergammaglobulina crónica evidente en enfermedades tales como gammapatía monoclonal de significación incierto (MGUS), enfermedad de Waldenstrom, relacionadas con gammapatías monoclonales idiopáticas, y plasmacitomas.

Otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden emplear por ejemplo para inhibir la quimiotaxis de polipéptido y activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de células T, por ejemplo, células citotóxicas T activadas y C08 y células asesinas naturales, en ciertas enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas e infecciosas. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes se describen en el presente documento e incluyen esclerosis múltiple, y diabetes insulino dependiente.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteína de fusión de transferrina de la invención también se pueden emplear para tratar aterosclerosis, por ejemplo, evitando la infiltración de monocitos en la pared de la arteria.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención también se pueden emplear para tratar síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS).

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención también pueden ser útiles para estimulación de reparación de heridas y tejidos, estimulando angiogénesis, y/o estimulación de la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o linfáticos. De manera adicional, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para estimular la regeneración de superficies mucosales.

En una realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan para diagnosticar, pronosticar, tratar, y/o prevenir un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción de inmunoglobulina deficiente en suero, infecciones recurrentes, y/o disfunción del sistema inmune. Además, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir infecciones de las articulaciones, huesos, piel, y/o glándulas para tiroides, infecciones de origen sanguíneo (por ejemplo, sepsis, meningitis, artritis séptica, y/o osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, los descritos en el presente documento), trastornos inflamatorios, y malignidades, y/o cualquier enfermedad o trastorno o afección asociado a estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o malignidades) incluyendo pero sin limitación, CVID, otras deficiencias inmunes primarias, enfermedad de VIH, CLL, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zoster (por ejemplo, herpes zoster grave), y/o Pneumocistis carnii, Otras enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, diagnosticar, pronosticar, y/o tratar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, infección de VIH, infección HTLV-BlV, Ilinfopenia, anemia de disfunción bactericida de fagocitos, trombocitopenia, y hemoglobinuria.

En una realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar cánceres o neoplasmas incluyendo cánceres o neoplasmas relacionados con células inmunes o tejidos inmunes. Ejemplos de cánceres o neoplasmas que se pueden prevenir, diagnosticar o tratar mediante proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, Ilinfoma no Hodgkin, anemia linfocítica aguda (ALL) leucemia de linfocitos crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, Ilinfoma de Burkltt, enfermedades transformadas de ESV, y/o enfermedades y trastornos descritos en la sección titulada "Trastornos Hiperproliferativos" en otra parte en el presente documento.

En otra realización específica, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan como una terapia para disminuir la proliferación celular de Linfomas de células s grandes.

En realizaciones específicas, las composiciones de la invención se usan como un agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos inmunodeficientes de células S, tales como, por ejemplo, un individuo que se ha sometido a esplenectomía parcial o completa.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para modular la actividad homeostática (detención de sangrado) o trombolítica (disolución de coágulos). Por ejemplo, incrementando la actividad homeostática o trombolítica, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades de coagulación de sangre, trastornos, y/o afecciones (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factor, hemofilia), enfermedades trastornos, y/o afecciones de plaquetas de sangre, (por ejemplo, trombocitopenia), oo heridas que se producen por trauma, cirugía, u otras causas. De manera alternativa, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención que pueden disminuir la actividad hemostática o trombolítica se pueden usar para inhibir o disolver la coagulación. Estas moléculas pueden ser importantes en el tratamiento o prevención de ataques cardíacos (infarto), apoplejías, o cicatrización.

En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para prevenir diagnosticar, pronosticar, y/o tratar trombosis, trombosis de arterias, trombosis venosa, tromboembolia, embolia pulmonar, aterosclerosis, infarto de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para la prevención de oclusión de injertos de safena, para reducir el riesgo de trombosis periprocedural ya que pudiera acompañar a procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de apoplejía en pacientes con fibrilación atrial incluyendo fibrilación atrial no reumática, para reducir el riesgo de embolia asociada a enfermedad de válvulas cardíacas y/o válvulas mitrales mecánicas. Otros uso para las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (por ejemplo, canales intravasculares, de derivaciones de acceso vascular en pacientes con hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis, y máquinas de desviación cardiopulmonar).

En otra realización, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, se pueden usar para prevenir diagnosticar, pronosticar, y/o tratar enfermedades y trastornos de la sangre y/u órganos asociados s la formación de sangre asociados al (a lo
s tejido(s) en lo(s) que el polipéptido de la invención se expresa.

Las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para modular actividad hematopoyética (la formación de células sanguíneas). Por ejemplo, las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para incrementar la cantidad de todos los subconjuntos de células sanguíneas, tales como, por ejemplo, eritrocitos, Ilinfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, macrófagos) y plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células sanguíneas o subconjunto de células sanguíneas puede ser útil en la prevención, detección, diagnosis, y/o tratamiento de anemias y leucopenias descritas más adelante. De manera alternativa, las proteínas de fusión modificadas de transferrina, de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para disminuir la cantidad de todos los subconjuntos de células sanguíneas, tales como, por ejemplo, eritrocitos, Ilinfocitos (células S o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, macrófagos) y plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células sanguíneas o subconjuntos de células sanguíneas pueden ser útiles en la prevención, detección, diagnosis, y/o tratamiento de leucocitosis, tal como, por ejemplo eosinofilia. Las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para prevenir, tratar o diagnosticar discrasia de sangre.

Anemias son afecciones en las que el número de glóbulos rojos o cantidad de hemoglobina (la proteína que lleva oxígeno) en ellos está por debajo de lo normal. Anemia se puede provocar por un excesivo sangrado, disminución de producción de glóbulos rojos, o incremento en la destrucción de glóbulos rojos (hemolisis). Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en tratamiento, prevención, y/o diagnosis de anemias. Anemias que se pueden tratar prevenir o diagnosticar por las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen anemia por deficiencia en hierro, anemia hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica idiomática adquirida, aplasia de glóbulos rojos, anemia megaloblastia (por ejemplo, anemia pemiciovis, (deficiencia en vitamina B12) y anemia por deficiencia de ácido fólico), anemia aplástica, anemias hemolítica (por ejemplo, anemia hemolítica autoinunune, anemia hemolítica microarigiopática, y hemoglobinunía nocturna paroxismal). Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en tratamiento, prevención, y/o diagnosis de anemias asociadas a enfermedades que incluyen pero no se limitan a, anemias asociadas a lupus sistémico eritematoso, cánceres, Linfomas, enfermedad renal crónica, y bazos engrosados. Las proteínas de fusión de transferrina y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en tratamiento, prevención, y/o diagnosis de anemia que surgen de tratamientos por fármaco tales como anemias asociadas a fármacos metildopa, dapsona, y/o sulfa. De manera adicional, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, y/o diagnosis de anemias asociadas a arquitectura de glóbulos rojos anormal que incluyen pero no se limitan a, esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria, deficiencia en la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y anemias de células falciformes.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en tratamiento, prevención, y/o diagnosis de anormalidades de hemoglobina, (por ejemplo, las asociadas a anemia de células falciformes, enfermedad de hemoglobina C, enfermedad de hemoglobina S-C, y enfermedad de hemoglobina E). De manera adicional, las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en diagnosis, prevención, y/o pronóstico en el tratamiento de talasemias, que incluyen pero no se limitan a, formas principales o secundarias de alfa-talasemia y beta-talasemia.

En otra realización, las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles en diagnosis, pronóstico, prevención, y/o tratamiento de trastornos de sangrado que incluyen pero no se limitan a, trombocitopenia (por ejemplo, púrpura tromocitopénica idiopática, y púrpura tromocitopénica trombocítica), enfermedad de Von Willebrand, trastornos de plaquetas hereditarios (por ejemplo, enfermedad de tales como enfermedad por defecto de almacenamiento tales como síndromes Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción de tromboxano A2, tromboastenia, y síndrome Bernard-Soulier), síndrome hemolticurémico, hemofilias tales como hemofilia A o deficiencia en el Factor V-11 y enfermedad de Christmas o deficiencia en el Factor IX, Telangiectsia Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome Rendu-Osler-Webe, púrpura alérgica (púrpura Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles como un agente para incrementar la producción de citoquina.

Trastornos hiperproliferativos en ciertas realizaciones, proteínas de fusión de la invención, y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluyendo neoplasmas. Proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden inhibir la proliferación del trastorno mediante interacciones directas o indirectas. De manera alternativa, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden proliferar otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.

Por ejemplo, incrementando una respuesta inmune, en particular incrementando las calidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o mediante la proliferación, diferenciación, o movilización, de células T, se pueden tratar trastornos hiperproliferativos. Esta respuesta inmune se puede aumentar mediante o bien potenciando la respuesta inmune existente, o mediante el inicio de una nueva respuesta inmune. De manera alternativa, disminución de una respuesta inmune también puede ser un procedimiento of tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como un agente quimioterapéutico.

Ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a neoplasmas localizados en el: colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroide, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax, y tracto
urogenital.

De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos también se pueden tratar o detectar mediante proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención. Ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a Leucemia Linfoblástica de la Infancia Aguda; Leucemia Linfoblástica Aguda, Leucemia Linfoblástica de la Infancia Aguda, Leucemia Mieloide Aguda, Carcinoma Adrenocortical, Cáncer Hepatocelular de adultos (primario), Cáncer Hepático de adultos (primario), Leucemia Linfocítica Aguda de Adultos, Leucemia Mieloide Aguda de Adultos, Enfermedad de Hodgkin de Adultos, Linfoma de Hodgkin de Adultos, Leucemia Linfocítica de Adultos, Linfoma No-Hodgkin de Adultos, Cáncer de hígado Primario de Adultos, Sarcoma de tejido Blando de Adultos Linfoma relacionado con SIDA, Malignidades relacionadas con SIDA, Cáncer Anal, Astrocitoma, Cáncer del conducto Biliar, Cáncer de Vejiga, Cáncer de Hueso, Glioma de tronco cerebral, Tumores de cerebro, Cáncer de mama, Cáncer de la Pelvis Renal y Uréter, Linfoma del Sistema Nervioso Central (Primario), Linfoma del Sistema Nervioso, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral, Cáncer de cuello, Cáncer Hepatocelular de la infancia (Primario), Cáncer de Hígado de la Infancia (Primario), Leucemia Linfoblástica Aguda de la Infancia, Leucemia Mieloide Aguda de la Infancia, Glioma del tronco cerebral de la Infancia, Astrocitoma Cerebelar de la Infancia, Astrocitoma Cerebral de la Infancia, Tumores de las células germinales Extracraneales de la Infancia, Enfermedad de Hodgkin de la Infancia, Linfoma de Hodgkin de la Infancia, Glioma Hipotalámico y de la ruta Visual de la Infancia, Leucemia Linfoblástica de la Infancia, Medulloblastoma de la Infancia, Linfoma de No Hodgkin de la Infancia, Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Pineales y Supratentoriales, Cáncer de Hígado Primario, Rabdomiosarcoma de la Infancia, Sarcoma de tejido Blando de la Infancia, Glioma de la Ruta Visual e Hipotalámica de la Infancia, Leucemia linfocítica Crónica, Leucemia Mielógena Crónica, Cáncer de Colon, Linfoma de Células T cutáneo, Carcinoma de Células de Islotes de Páncreas Endocrino, Cáncer Endometrial, Ependimoma, Cáncer epitelial, Cáncer de Esófago, Sarcoma de Ewing y Tumores relacionados, Cáncer de Páncreas Exocrino, Tumor de las Células germinales Extracraneales Tumor de las Células germinales Extragonadales, Cáncer del conducto biliar Extrahepático, Cáncer de Ojo, Cáncer de Mama de Mujeres, Enfermedad de Gaucher, Cáncer de Vesícula Biliar, Cáncer Gástrico, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumores Gastrointestinales Tumores de las Células germinales, Tumor Trfoblástico Gestacional, Leucemia de Células Velludas, cáncer de cabeza y cuello, Cáncer Hepatocelular, Enfemedad de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, Hipergammaglobulinemia, Cáncer Hipofaríngeo, Cánceres Intestinales, Melanoma Intraocular, Carcinoma de células de Islotes, Cáncer pancreáticos de Células de islotes, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñón, Cáncer de laringe, Cáncer de Labio y de la cavidad Oral, Cáncer de Hígado, Cáncer de Pulmón, Trastornos linfoproliferativos, Macroglobulinemia, Cáncer de mama en hombres, Mesotelioma maligno, Timoma maligno, Meduloblastomia, Melanoma, Mesotelioma, Cáncer de cuello escamoso Primario Oculto Metastático, Cáncer de cuello escamoso Primario Metastático, Cáncer de cuello escamoso Metastático, Mieloma Múltiple, Mieloma Múltiple/Neoplasma de Células de plasma, Síndrome Mielodiplástico, Leucemia Mielógeno, Leucemia Mieloide, Trastornos Mieloproliferativos, Cáncer de la cavidad Nasal y seno paranasal, cáncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma, Linfoma de No Hodgkin durante el embarazo, Cáncer de piel no melanoma, Cáncer de Pulmón de células no pequeñas, Cáncer de cuello escamoso metastático Primario Oculto, Cáncer Orofaríngeo, sarcoma Fibroso Osteo/maligno, Histiocitoma fibroso osteosarcoma/Maligno, Histiocitoma fibroso osteosarcoma/Maligno de hueso, Cáncer de epitelio de ovarios, Tumor de las células germinales de ovario, Tumor Potencial de baja malignidad de ovarios, Cáncer de Páncreas, Paraproteinaemias, Púrpura, Cáncer de paratiroide, Cáncer de Pene, Feocromocitoma, Tumor Pituitario, Plasma célula Neoplasma de células de Plasma/Mieloma múltiple, Linfoma Primario del Sistema Nervioso Central, Cáncer de Hígado Primario, Cáncer de próstata, Cáncer de Recto, Cáncer de Células renales, Cáncer de pelvis renal y uréter, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de Glándulas salivares, Sarcomas Sarcoidosis, Síndrome Sezary, Cáncer de Piel, Cáncer de Pulmón de células pequeñas, Cáncer de intestino delgado, Sarcoma de tejido blando, Cáncer de cuello escamoso, Cáncer de estómago, Tumores Supratentoriales Primitivos Neuroectodérmicos y Pineales, Linfoma de células T, Cáncer de Testículos, Timoma, Cáncer de tiroides, Cáncer de células de transición de la pelvis renal y Uréter, Cáncer de transición de la pelvis renal, Tumores trofoblásticos, Cáncer de células de uréter y pelvis renal, Cáncer de uretra, Cáncer de útero, Sarcoma de útero, Cáncer Vaginal, Glioma de la ruta visual e hipotalámica, Cáncer de Vulva, Macroglobulinemia de Waldenstroin, Tumor de Wilm, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además neoplasia, localizada en un sistema de órganos enumerado anteriormente.

En otra realización preferida, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan para, diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar afecciones premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, que incluye pero no se limita a los trastornos descritos anteriormente. Tales uso están indicados en afecciones conocidas o que se sospecha que preceden a la progresión a neoplasia o cáncer, en particular, cuando el crecimiento de células no neoplásicas consta de hiperplasia, metaplasia, o más en particular, se ha producido displasia (para revisión de tales afecciones de creci-
miento anormal, véase Robbins. y Angell, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed. W. B. Saunders Co., Filadelfia, p. 68-79).

Hiperplasia es una forma de proliferación de células controlada, que implica un incremento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa de la estructura o función. Los trastornos hiperplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar prevenir, y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia angiofolicular mediastinal de ganglio linfático, Hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, Hiperplasia melanocítica atípica, Hiperplasia de células basales, Hiperplasia de ganglio linfático gigante benigno, Hiperplasia del cementum, Hiperplasia adrenal congénita, Hiperplasia sebácea congénita, Hiperplasia quística, Hiperplasia quística de la mama, Hiperplasia de la dentadura, Hiperplasia ductal, Hiperplasia endometrial, Hiperplasia fibromuscular, Hiperplasia epitelial focal, Hiperplasia gingival, Hiperplasia fibrosa inflamatoria, Hiperplasia papilar inflamatoria, Hiperplasia endotelial papilar intravascular, Hiperplasia nodular de próstata, Hiperplasia regenerativa nodular, Hiperplasia seudoepiteliomatosa, Hiperplasia sebácea senil, e Hiperplasia verrugosa.

En otra realización, proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención conjugados a una toxina o isótopo radiactivo, como se describe en el presente documento, se pueden usar para tratar cánceres y neoplasmas, que incluyen pero no se limitan a, los descritos en el presente documento. En una realización adicional preferida, proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención conjugados a una toxina o isótopo radiactivo, como se describe en el presente documento, se pueden usar para tratar leucemia mielógena.

De manera adicional, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden afectar a la apoptosis, y por lo tanto, serían útiles en el tratamiento de un número de enfermedades asociadas a un incremento de supervivencia de células o la inhibición de apoptosis. Por ejemplo, enfermedades asociadas a incremento de la supervivencia de células o la inhibición de apoptosis que se podría diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar por polinucleótidos, polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas de la invención, incluyen cánceres (tales como Linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen pero no se limitan a, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, inioma, Ilinfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes tales como, esclerosis múltiple, Síndrome Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiosifis, lupus sistémico eritematoso y glomeruionefritis relacionada inmune y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus herpes, virus pox y adenovirus), inflamación, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de injerto agudo, y rechazo de injerto crónico.

En realizaciones preferidas, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan para inhibir el crecimiento, progresión, y/o metástasis de cánceres, en particular los enumerados anteriormente.

Enfermedades o afecciones adicionales asociadas a incremento de supervivencia de células que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar por proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, incluyen pero no se limitan a, progresión, y/o metástasis de malignidades y trastornos relacionados tales como leucemia (que incluye leucemia aguda (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye mieloblástica, promielocítica, milomonocítica, monocítica, y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, Linfomas (por ejemplo, Enfermedad de Hodgkin y Enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada y tumores sólidos que incluyen pero no se limitan a, Sarcomas y, carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, fiposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, anglosarcoma, endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, linfoangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, epitelial carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendrogliomia, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Enfermedades asociadas a un incremento de apoptosis que se puede diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar mediante proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, incluyen SIDA; trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebral y tumor cerebral o enfermedad asociada anterior); trastornos autoinmunes (tal como, esclerosis múltiple, Síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso y glomerulonefritis relacionada inmune y artritis reumatoide) Síndromes mielodisplásicos (tales como una anemia aplásica), enfermedad de injerto frente a huésped, lesión isquémica (tales como la provocada por infarto de miocardio, apoplejía y lesión por referfusión), lesión de hígado (por ejemplo, lesión de hígado relacionada con hepatitis, isquemia/lesión de perfusión, colestosis (lesión de conducto biliar) y cáncer de hígado); enfermedad de hígado inducida por toxina (tal como la provocada por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Otra realización preferida utiliza polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención para inhibir la división celular aberrante, por terapia génica usando la presente invención, y/o proteínas fusión o sus fragmentos.

De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar trastornos de células proliferativas en una célula de proliferación anormal un polinucleótido que codifica proteína de fusión de transferrina modificada de la presente invención, en la que dicho polinucleótido reprime dicha expresión.

Otra realización de la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento trastornos de células proliferativas en individuos que comprende administración de una o más copias de genes activos de la presente invención a una célula o células proliferativas de manera anormal.

Los polinucleótidos de la presente invención se pueden administrar directamente a sitios patológicos desordenados proliferativos de células en órganos internos, cavidades corporales, y similares mediante el uso de dispositivos de formación de imágenes usados para guiar una aguja de inyección directamente al sitio patológico. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden administrar a sitios patológicos en el momento de la intervención quirúrgica.

Por enfermedad proliferativa de células se entiende cualquier enfermedad o trastorno humano o animal, que afecta a una cualquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades, o partes del cuerpo, que se caracteriza por proliferaciones anormales locales únicas o múltiples de células, grupos de células, o tejidos, tanto benignos como malignos.

Cualquier cantidad de los polinucleótidos de la presente invención se pueden administrar mientras tenga un efecto inhibidor biológicamente sobre la proliferación de las células tratadas.

Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos de la presente invención de manera simultánea al mismo sitio. Por "inhibidor biológicamente" se entiende inhibición de crecimiento parcial o total al igual que disminuye la tasa de proliferación o crecimiento de las células.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención son útiles en la inhibición de metástasis de células o tejidos proliferativos. La inhibición se puede producir como resultado directo, o indirecto de la administración de estas proteínas de fusión de transferrina y/o polinucleótidos, tales como activación de la expresión de proteínas que se sabe que inhiben metástasis, por ejemplo alfa, integrinas, (Véase, por ejemplo, Curr Top Microbiol Immunol 1998; 231: 141, que se incorpora por el presente documento por referencia). Tales efectos terapéuticos de la presente invención se pueden lograr bien solos, o en combinación con fármacos o adyuvantes de molécula pequeña.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de administración de composiciones que contienen las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención a células dirigidas que expresan un polipéptido unido por, que se une a, o se asocia a una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención. Proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden estar asociadas a polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o profármacos mediante interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes.

Las enfermedades de riñón que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar con composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica, enfermedad renal de fase final, enfermedades inflamatorias del riñón (por ejemplo, glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis después de infección, glomerulonefritis progresiva rápidamente, Síndrome nefrítico, glomeruionefritis membranosa, Síndrome nefrítico familiar, glomerulonefritis proliferativa de membrana y glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis crónica, nefritis intestinal tubular aguda, nefritis túbulointersticial crónica, glomeruionefritis post-estrectocócica aguda (PSGN), pielonefritis, nefritis por lupus, nefritis crónica, nefritis intersticial, y glomerulonefritis post-estreptocócica), trastornos de los vasos sanguíneos de las riñones (por ejemplo, infarto de riñón, enfermedad del riñón ateroembólica, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis venosa renal, perfusión inferior renal, retinopatía renal, reperfusión isquémica renal, embolia de arteria renal y estenosis de arteria renal), y trastornos de riñón que se producen por enfermedad del tracto urinario (por ejemplo, pielonefritis, hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolithiasis), nefropatía de reflujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria, y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica). Además, composiciones de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar los trastornos metabólicos y congénitos del riñón (por ejemplo, uremia, renalamiloidosis, osteodistrofía renal, acidosis tubular renal, glicosuria renal, diabetes insípida nefrógena, cistinuria, Síndrome de Fanconi, osteosis fibroquística renal (raquitismo renal), enfermedad de Hartnup, Síndrome de Bartter, Síndrome de Liddle, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular, riñón esponjoso medular, Síndrome de Alport, Síndrome de uña-patela, Síndrome nefrítico congénito, Síndrome de CRUSH, riñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes insípida nefrógena, nefropatía analgésica, piedras en el riñón, y neuropatía membranosa), y trastornos autoinmunes del riñón (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso (SLE), Síndrome de Goodpasture, neuropatía de IgA, e ICFM glomerulonefritis proliferativa mesangial).

\global\parskip1.000000\baselineskip

Las composiciones de la invención también se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir, y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón (por ejemplo, glomeruloesclerosis, diabeticnefropatía, esclerosis glomerular segmental focal (FSGS), glomerulonefritis narcotizante, y necrosis papilar renal), cánceres del riñón (por ejemplo, nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células renales, cáncer de células de transición, adenocarcinoma renal, cáncer de células escamosas, y tumor de Wilm), y desequilibrios de electrolitos (por ejemplo, nefrocalcinosis, piuria, edema, hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipematremia, hipocalemia, Hipercalemia, hipocalcemia, Hipercalcemia. hipofosfatemia, e Hiperfosfatemia).

Composiciones de la invención se pueden administrar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluyen pero no se limitan a, inyección de aguja directa en el sitio de distribución, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partícula, depósitos de esponja de espuma de gel, otros materiales de depósito comercialmente disponibles, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o por supositorio, aplicaciones de decantación o tópicas durante la cirugía, distribución por aerosol. Tales procedimientos se conocen en la técnica Composiciones de la invención se pueden administrar como una parte de un compuesto terapéutico, descrito en más detalle más adelante.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar, y/o pronosticar trastornos cardiovasculares, que incluyen pero no se limitan a, enfermedad arterial periférica, tales como isquemia de un miembro.

Los trastornos cardiovasculares, incluyen, pero no se limitan a, anormalidades cardiovasculares, tales como fístula arterio arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar, y Síndrome de Scimitar.

Los defectos cardíacos congénitos incluyen, pero no se limitan a, constricción aórtica, cortriatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón en criss cross, dextrocardia, ductus arterioso permeable, anomalía de Ebstein, complejo Eisenmenger, Síndrome de corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de los vasos grandes, ventrículo derecho con doble salida, tricuspidatresia, tronco arterioso persistente, y defectos septales coronarios, tales como defectos septales aortopulmonares, defectos de cojines endocárdicos, Síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales cardíacos ventriculares.

Trastornos cardiovasculares también incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cardíaca, tales como arritmias, enfermedad cardíaca carcinoide, alta rendimiento cardíaco, bajo rendimiento cardíaco, taponamiento cardíaco, endocarditis (incluyendo bacterias), aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxismal, edema cardíaco, Hipertrofia cardíaca, cardiomiopatía congestiva, Hipertrofia de ventrículo izquierdo, Hipertrofia de ventrículo derecho, ruptura cardíaca después de infarto, ruptura septal ventricular, enfermedades de la válvula cardíaca, enfermedades de miocardio, isquemia de miocardio, efusión pericardial, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), primo pericardio, síndrome después de pericardiotomia, enfermedad cardíaca pulmonar, enfermedad cardíaca reumática, disfunción ventricular, Hiperemia, complicaciones de embarazo cardiovasculares, Síndrome de Scimitar, sífilis cardiovascular, y tuberculosis cardiovascular.

Arritmias incluyen, pero no se limitan a, arritmia de seno, fibrilación atrial, palpitación atrial, bradicardia, extrasístole, Síndrome de Adams-Stokes, bloqueo haz-rama, bloqueo sinoatrial, Síndrome de QT largo, parasístole, Síndrome de Lown-Ganong-Levine, Síndrome de pre-excitación de tipo Mahaim, Síndrome de Wolff-Parkinson-White, Síndrome de seno enfermo, taquicardias, y fibrilación ventricular. Taquicardias incluyen taquicardia paroxismal, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia de empalme ectópica, taquicardia de reentrada nodal sinoatrial, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes, y taquicardia ventricular.

Las enfermedades de válvula de corazón incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide, y estenosis de la válvula tricúspide.

Las enfermedades de miocardio incluyen, pero no se limitan a, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis endocardial, fibrosis endomiocardial, Síndrome de Kearns, lesión por reperfusión miocardial, y miocarditis.

Las isquemias miocardiales incluyen, pero no se limitan a, enfermedades coronarias, tales como angina de pecho, aneurisma coronario, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio, y atrofia miocardial.

Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, arigiomiatosis, enfermedad de Hippel-Lindau por bacilos, Síndrome de Klippel Trenaunay Weber, Síndrome de Sturge Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, Artritis de Takayasu, aortitis, Síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, artritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, Hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva hepática pulmonar, enfermedad de Raynaud, Síndrome de CREST, oclusión de la vena retinal, Síndrome de Scimitar, Síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, ataciatelangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlceras varicosas, vasculitis, e insuficiencia venosa.

Los trastornos cerebrovasculares incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardioarteriales, Trastornos respiratorios, Las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar, y/o pronosticar enfermedades y/o trastornos del sistema respiratorio.

Enfermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a, vestibulitis nasal, rinitis no alérgica (por ejemplo, rinitis aguda, rinitis crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotor), pólipos nasales, y sinusitis, angiofibromas juvenil, cáncer de la nariz y papilomas juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos (nódulos de los cantantes), ulceras de contacto, parálisis de las cuerdas vocales, laringoceles, faringitis (por ejemplo, viral y bacteriana), tonsilitis, celulitis tonsilar, abscesos parafaríngeos, laringitis, laringoceles, y cánceres de garganta (por ejemplo, cáncer de la nasofaringe, cáncer de tonsila, cáncer de laringe), cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, (célula en avena) carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células grandes, y adenocarcinoma), trastornos alérgicos (neumonía eosinófila, neumonitis de hipersensibilidad (por ejemplo, alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica, neumoconiosis por polvo orgánico, aspergillosis broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener (granulomatousvasculitis), Síndrome de Goodpasture), neumonía (por ejemplo, bacteriana neumonía bacteriana (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae (neumonía neumocócica), Staphylococcus aureus (neumonía estafilocócica), neumonía por bacterias Gram negativas (causada mediante, por ejemplo, Klebsiella y Pseudomas spp.), neumonía por Mycoplasma pneumoniae, neumonía por Hemophilus influenza, Legionella pneumophila (enfermedad de los legionarios), y Chlamydapsittaci (Psittacosis)), y neumonía viral (por ejemplo, gripe, varicela (varicella).

Las enfermedades y trastornos adicionales del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a bronquiolitis, polio (poliomielitis), Crup, infección por virus sincitial respiratorio, paperas, eritema infeccioso (quinta enfermedad), roseola infantum, panencefalitis por rubéola progresiva, sarampión alemán, y panencefalitis esclerosante subaguda), neumonía fúngica (por ejemplo, Histoplasmosis, Coccidioidomicosis, Blastomycosis, infecciones fúngicas en personas con los sistemas inmunes suprimidos de manera severa (por ejemplo, criptococosis, provocada por Cryptococcus neoformans; aspergillosis, provocada por Aspergillus spp.) candidiasis, provocada por Candida; y mucormicosis)), Pneumocystis carinu (neumonía por neumocistis), neumonías atípicas (por ejemplo, Mycoplasma y Chlamyda spp.), neumonía por infección oportunista, neumonía nosocomial, neumonitis química, y neumonía por aspiración, trastornos pleurales (por ejemplo, pleuresia, efusión pleural, y neumotórax (por ejemplo, simple neumotórax espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax de tensión)), enfermedades de las vías respiratorias obstructivas (por ejemplo, asma,. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPID), enfisema, bronquitis aguda o crónica), enfermedades pulmonares ocupacionales (por ejemplo, silicosis, antracosis (neumoconiosis de los trabajadores del carbón, asbestosis, beriliosis, asma ocupacional, bisinosis, y pritumoconiosis benigna), Enfermedad pulmonar infiltrativa (por ejemplo, fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis en alvéolos, neumonía intersticial usual), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial descamativa, neumonía intersticial linfoide, histiocitosis (por ejemplo, enfermedad de Letterer-Siwe, enfermedad de Hand-Schuller-Christian, granuloma eosinófilo), hemosiderosis pulmonar idiopática, sarcoidosis y pulmonar, proteinosis alveolar), síndrome de insuficiencia aguda respiratoria aguda (también llamada, por ejemplo, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos), edema, embolia pulmonar, bronquitis (por ejemplo, viral, bacteriana), bronquiectasis, atelectasis, absceso pulmonar (provocado por ejemplo, Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila), y fibrosis quística.

Cánceres que se pueden tratar con proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a tumores sólidos, incluyendo próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, lesteg, hígado, parotides, tracto biliar, colon, recto, cuello, útero, endometrio, riñón, vejiga, cáncer de titoides; primario tumores primarios y metástasis; melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorrectal; malignidades avanzadas; y tumores de origen sanguíneo tales como leucemia. Por ejemplo, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden distribuir de manera tópica, con el fin de tratar cánceres tales como cáncer de piel, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama, y sarcoma de Kaposi.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles, en el tratamiento de otros trastornos, además de cánceres, que implican angiogénesis. estos trastornos incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos, por ejemplo hemanglomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos; placas arteroesclerósicas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uvietis y crecimiento de vaso sanguíneo normal de Pterygiaab) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; retraso de la cicatrización de heridas; endometriosis; vasculogenesis; grantilaciones; cicatrices Hipertróficas (queloides); fractura de no unión; escleroderma; tracoma; adhesiones vasculares; angiogénesis miocardial; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de miembro isquémica; Síndrome de Osler-Webber; neovascularización de placa; telangiectasia; hemophiliac articulaciones hemofílicas; angiofíbroima; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis.

De este modo, dentro de un aspecto de la presente invención se proporcionan procedimientos para tratar enfermedades neovasculares del ojo.

De manera adicional, trastornos que se pueden tratar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemangioma, artritis, psoriasis, angiofibroma, placas ateroscleróticas, retraso en la cicatrización de heridas, granulaciones articulaciones hemofílicas; cicatrices hipertróficas, fracturas de no unión, Síndrome de Osler-Webber, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma; y adhesiones vasculares.

Además, trastornos y/o estados, que se pueden tratar, prevenir, tratar, y/o pronosticar con las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo tales como leucemia, metástasis de tumor, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, refinoblastoma, y uvietis, retraso en la cicatrización de heridas w, endometriosis, vascluogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides], fracturas no unión, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocardial, colaterales coronarios, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de miembro isquémico, Síndrome de Osler-Webber, neovascularización de placa, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma displasia fibromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, agente de control de nacimiento mediante la prevención de la vascularización requerida para embrión, implante que controla la menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como una consecuencia patológica tales como enfermedad de arañazo de gato (Rochele nunalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonellosis y angiomatosis por bacilos.

En un aspecto del procedimiento de control de natalidad, una cantidad del compuesto suficiente para bloquear el implante de embrión se administra antes o después del coito y que se haya producido la fertilización, proporcionando de esta manera un procedimiento eficaz del control de natalidad, posiblemente un procedimiento "la mañana siguiente". Proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención también se pueden usar en el control de la menstruación o administrarse o bien como un fluido de lavado peritoneal o para implante peritoneal en el tratamiento de endometriosis.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden utilizar en una amplia diversidad de procedimientos quirúrgicos.

Enfermedades asociadas a un incremento en la supervivencia de células o la inhibición de apoptosis que se podría tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones, y tumores dependientes de hormonas, que incluyen pero no se limitan a cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, Síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso y glomerulonefritis relacionada inmune y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto agudo, y rechazo de injerto crónico.

Las enfermedades o afecciones adicionales asociadas a un incremento en la supervivencia de célula que se puede tratar o detectar mediante las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican, proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, progresión, y/o metástasis de trastornos malignos y relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemia aguda (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluyendo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y eritroleucemia)) y leucemia crónica (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia crónica linfocítica)), policitemia vera, Linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad de no n-Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, y tumores sólidos, que incluyen, pero no se limitan a, Sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, sarcoma Iinfoangioendotelial, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma e colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de Jung, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, medulloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.

Las enfermedades asociadas a un incremento de apoptosis que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar, y/o pronosticar usando las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, AIDS; trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, Retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o asociado antes a enfermedad); trastornos autoinmunes (tales como, esclerosis múltiple, Síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus sistémico eritematoso y glomerulonefritis relacionada inmune y artritis reumatoide) Síndromes Mielodisplásicos (tales como aplasiic anemia aplásica), enfermedad de injerto frente a huésped, lesión isquémica (tales como las provocadas por, infarto de miocardio, apoplejía y lesión de reperfusión), lesión hepática (por ejemplo, hepatitis relacionada con lesión hepática, isquemia/lesión de reperfusión, colestosis (lesión de conducto biliar) y cáncer de hígado); enfermedad hepática inducida por toxina(tal como la provocada por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Además, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir la aparición de diabetes mellitus. En pacientes con diabetes de Tipos I y II diagnosticados recientemente, cuando alguna función de las células de islotes permanece, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, se pueden usar para mantener la función de los islotes de manera que alivie, retrase o evite la manifestación permanente de la enfermedad. También, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar como un auxiliar en el transplante de células de islotes para mejorar o promover la función de las células de islotes.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para la diagnosis y/o tratamiento de enfermedades, trastornos, daño o lesión del cerebro y/o sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que se pueden tratar con las composiciones de la invención (por ejemplo, proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención), que se limitan al sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a lesiones, y enfermedades o trastornos que dan como resultado o bien una desconexión de axones, una disminución o degeneración de neuronas, o desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyen pacientes mamíferos humanos y no humanos) de acuerdo con los procedimientos de la invención, incluyen pero no se limitan a, las siguientes lesiones de o bien los sistemas nerviosos central (incluyendo médula espinal, cerebro) o periférico:

(1) las lesiones isquémicas, en las que una carencia de oxígeno es una parte del sistema nervioso dan como resultado lesión neuronal o muerte, incluyendo infarto cerebral o isquemia, o infarto de la médula espinal o isquemia; (2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones provocadas por lesión física o asociada a cirugía, por ejemplo, lesiones que afectan a una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona mediante tejido maligno que es o bien una malignidad asociada al sistema nervioso o una malignidad derivada del tejido del sistema nervioso; (4) lesiones infecciosas en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de infección, por ejemplo, por un absceso o asociado a infección por el virus de inmunodeficiencia humana, herpes zoster, o virus herpes simplex o con enfermedad de Lyme, tuberculosis, o sífilis; (5) lesiones degenerativas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de un proceso degenerativo incluyendo pero no limitado a, degeneración asociada a enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotróficas (ALS); (6) lesiones asociadas a enfermedades o trastornos nutricionales, en los que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona por un trastorno nutricional o trastorno de metabolismo que incluyen pero no se limitan a deficiencia en vitamina B 12, deficiencia en ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Blanami (degeneración primaria del corpus callosum), y degeneración cerebral alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas a enfermedades sistémicas, que incluyen, pero no se limitan a diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell'), lupus sistémico eritematoso, carcinoma, o sarcoidoisis; (8) lesiones provocadas por sustancias tóxicas que incluyen alcohol, plomo, o particular, neurotoxinas; y (9) lesiones desmielinizantes en las que una parte sistema nervioso se destruye o lesiona por una enfermadas desmielinizante que incluyen pero no se limitan a, esclerosis múltiple, mielopatía asociada al virus de inmunodeficiencia humano, mielopatía transversa o diversas etilogías, leucoencefalopatía multifocal progresiva, y mielinólisis central pontina.

En una realización, las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan para proteger células neurales de los efectos dañinos de hipoxia. En una realización adicional preferida, las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se usan para proteger células neurales de los efectos dañinos de hipoxia cerebral.

En realizaciones específicas, trastornos de neuronas motoras que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxina, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o malignidad que puede afectar a las neuronas motoras así como otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan de manera selectiva a neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica, y que incluyen pero no se limitan a, atrofia muscular espinal, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la Infancia (Síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el Síndrome después de polio, y Neuropatía sensorial motora hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).

Además, las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden jugar un papel en la supervivencias de neuronas; formación de sinapsis; conductancia; diferenciación neural, etc. De este modo, las composiciones de la invención (que incluyen proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención) se pueden usar para diagnosis y/o tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociadas a estos papeles, que incluyen pero no se limitan a, trastornos de aprendizaje y/o cognición. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de estados patológicos neurodegenerativos y/o trastornos conductuales. Tales estados patológicos neurodegenerativos y/o trastornos conductuales incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, Síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de pánico, discapacidades de aprendizaje, ALS, psicosis, autismo, y conductas alteradas, incluyendo trastornos de alimentación, patrones del sueño, equilibrio, y percepción.

Los ejemplos de enfermedades neurológicos que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, enfermedades cerebrales, tales como enfermedades cerebrales metabólicas que incluye fenilcetonuria tales como fenilcetonuria maternal, deficiencia en piruvato carboxilasa, deficiencia en complejo piruvato deshidrogenasa, encelofatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas infratentoriales, neoplasmas ventriculares cerebrales tales como neoplasmas del plexo cordial, necoplasmas hipotalámicos, neoplasmas supratentoriales, enfermedad de canavan, enfermedades cerebelares tales como ataxia cerebelar que incluyen degeneración espinocerebelar tales como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelar, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas intratentoriales, esclerosis cerebral difuso tales como encefalitis periaxialis, leucodistrofía de células globoides, leucodistrofía metacromática y panencefalitis esclerosante subaguda.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de arterias carótidas que incluyen trombosis de arterias carótidas, estenosis de carótida y enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, cerebral arteriosclerosis, malformaciones arterio venosas cerebrales, enfermedades de la arteria cerebral, embolia cerebral y trombosis tales como trombosis de arteria carótida, trombosis sinusal y Síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral tales como hematoma epidérmico, hematoma subdural y hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral tales como isquemia cerebral transitoria, Síndrome de Subclavian Steal e insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular tales como demencia multiinfarto, leucomalacia periventricular, cefalea vascular tal como cefalea en racimos y migraña.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen demencia tales como Complejo de demencia por SIDA, demencia presenil tales como enfermedad de Alzheimer y Síndrome de Creutzféldt-Jakob, senil tales como enfermedad de Alzheimer y y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tales como demencia multi-infarto, encefalitis que incluyen encefalitis periaxialis, encefalitis viral tales como encefalitis epidérmica, encefalitis japonesa, encefalitis St. Louis, encefalitis transmitida por garrapatas y fiebre del Nilo Oeste, acute disseminated encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como Síndrome uveomeningoencefalitico, enfermedad de Parkinson postencefalítica y panencefalitis escrelosizante subaguda, encefalomalacia tal como lieucomalacia periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada, que incluye espasmos infantiles, epilepsia de ausencia, epilepsia mioclónica que incluye Síndrome MERRF, epilepsia tónica-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia post-traumática, estado epiléptico tal como Epilepsia Parcial Continua, y Síndrome de Hallervorden-Spatz.

Las enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen hidrocefalia tal como Síndrome de Dandy-Walker e hidrocefalia de presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasmas hipotalámicos, malaria cerebral, narcolepsia que incluye catalepsia, poliomioelitis bulbar, seudotumor cerebral, Síndrome de Rett, Síndrome de Reye Síndrome, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y Síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central tales como SIDA, Complejo de demencia, Absceso de cerebro, empiema subdural, encefalomielitis tal como Encefalomielitis equina, Encefalomielitis equina de Venezuela, Encefalomielitis hemorrágica neconizante, Visna, y malaria cerebral.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen meningitis tales como araclinoiditis, meningitis aséptica tal como meningitis viral que incluye meningitis crónica linfocítica, meningitis bacteriana que incluye Meningitis hemofílica, Meningitis por Listeria, Meningitis menigocócica tales como Síndrome de Waterhouse-Fridericlisen, Meningitis neumocócica y tuberculosis meningeal, meningitis fúngica tal como Meningitis criptocócica, efusión subdural, meniapencefalitis tales como Síndrome uvemenineroencefálitica, mielitis tales como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsalis, poliomielitis que incluye poliomielitis bulbar y Síndrome después de poliomielitis, enfermedades de priones (tales como Síndrome de Creutzfeldt-Jakob, Encefalopatía Espongiforme Bovina, Síndrome de Gerstinann-Straussler, Kuru, Scrapie), y toxoplasmosis cerebral.

Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen neoplasmas del Sistema Nervioso Central tales como neoplasmas cerebrales incluyen neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, neoplasmas ventriculares cerebrales tales como neoplasmas coroidplexus, neoplasmas hipotalámicos y neoplasmas supratentoriales, neoplasmas de meninge, neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales, enfermedades desmielinizantes tales como Enfermedades Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluyen sadreno leucodistrofia, encefalifis periaxialis, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tal como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis necronizante hemorrágica, progressive leucoencefalopatía multifocal progresiva, en esclerosis múltiple, irinolinólisis central pontina, mielitis transversa, neuroimielitiss óptica, Scrapie, Swayback, Síndrome de fatiga crónica, Visna, Síndrome nervioso de alta presión, Meningismo, enfermedades de la médula espinal tales como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales, siringomielia., Tabes Dorsalis, Síndrome de Stiff-Man, retraso mental tal como Síndrome de Angelman, Síndrome de Cri-duChat, Síndrome de De Lange, Síndrome de Down, Gangliósídos tales como Gangliósídos G(MI), enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon-Bied, síndrome de Lesch-Nylian, enfermedad de la orina de jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, fipofuscinosis ceroide neuronal, Síndrome oculocerebrorrenal, fenilcetonuria tales como fenilcetonuria maternal, síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Rett, Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, Síndrome de WAGR, anormalidades del sistema nervioso tales como holoprosencefalía, defectos del tubo neural tales como anencefalia que incluye hidrogcefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrrafismo espinal tales como Espina bifida quística y espina bífida oculta.

Desequilibrio y/o enfermedades sistema endocrino y/u hormonal abarcan trastornos de motilidad uterina que incluyen pero no se limitan a complicaciones con el embarazo y parto (por ejemplo, parto prematuro, embarazo después del plazo, aborto espontáneo, y parto lento o detenido); y trastornos y/o enfermedades del ciclo menstrual, (por ejemplo, dismenorrea y endometriosis).

Trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal incluyen trastornos y/o enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agénesis pancreática congénita, Síndrome de tumor de células de islotes feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de las glándulas adrenales tales como, por ejemplo, enfermedad de Addison, deficiencia corticosteroide, enfermedad virilizante, hirsutismo, Síndrome de Cushing, Hiperaldosterlonismo, feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de la glándula pituitaria, tales como, por ejemplo, Hiperpituitarismo, hipopituitarismo, dwarfismo de pituitaria, adenoma de pituitaria, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; trastornos y/o enfermedades del tiroides, que incluyen pero no se limitan a, Hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plurnrner, enfermedad de Graves (bocio difuso tóxico), bocio nodular tóxico, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silenciosa), Síndrome de PendreWs, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de la hormona tiroidea, aplasia tímica, tumores de células de Hurthle del tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides, carcinoma de tiroides medular; trastornos y/o enfermedades del paratiroides, tales como, por ejemplo, Hiperparatiroidismo, hopoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.

Además, trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal también pueden incluir trastornos y/o enfermedades de los testículos u ovarios, incluyendo cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades de los testículos u ovarios además incluyen, por ejemplo, cáncer de ovario, Síndrome de ovario poliquístico, Síndrome de Klinefelter, síndrome de desaparición de testículos (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidismo, Síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar de los testículos (benigno), neoplasias de los testículos y neotesticular.

Además trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o desequilibrio hormonal también puede incluir trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo, Síndromes de deficiencia poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrino múltiple, y trastornos y/o cánceres de tejidos endocrinos.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para la diagnosis, tratamiento, o prevención de enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor. Los trastornos del sistema reproductor que se pueden tratar mediante las composiciones de la invención, incluyen, pero no se limitan a, lesiones del sistema reproductor, infecciones, trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y enfermedades o trastornos darán como resultado infertilidad, complicaciones con el embarazo, parto, o alumbramiento, y dificultades después del parto.

Los trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor incluyen enfermedades y/o trastornos, de los testículos, incluyen atrofia testicular, feminización testicular, criptorquismo (unilateral y bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimitis y orquitis (típicamente que se produce por infecciones tales como, por ejemplo, gonorrea, paperas, tuberculosis, y sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa, tumores de las células germinales (por ejemplo, seminomas, carcinomas de células embrionarias, teratocarcinomas, coriocarcinomas, tumores del saco vitelino, y teratomas), tumores de estroma (por ejemplo, célula tumorales de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hernia inguinal, y trastornos de la producción de esperma (por ejemplo, Síndrome de cilios inmóviles, espermia, astenozoospermia, azoospermia, oligospermia, y teratozoospermia).

Los trastornos del sistema reproductor también incluyen trastornos de la glándula prostática, tales como prostatitis no bacteriana aguda, prostatitis no bacteriana crónica, prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica, postatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa, malacoplaquia, Hipertrofia o Hiperplasia prostática benigna, y trastornos neoplásicos de la próstata, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas de células de transición, carcinomas ductales, y carcinoma de células escamosas.

De manera adicional, las composiciones de la invención pueden ser útiles en la diagnosis, tratamiento, y/o prevención de trastornos o enfermedades del pene y uretra, incluyendo trastornos inflamatorios, tales como balanopostitis, balanitis xerótica obliterante, fimosis, parafimosis, sífilis, virus herpes simplex, gonorrea, uretritas no gonocócica, clamidia, micoplasma, tricomonas, VIH, SIDA, Síndrome de Reiter, condiloma acuminatum, condiloma latum, y pápulas perladas de pene, anormalidades uretrales, tales como hipospadias, epispadias, y fimosis, lesiones premalignas, incluyendo Eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, papulosis Bowenoid, condiloma criant, enfermedad de Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrugoso; cánceres de pene, incluyendo carcinoma de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrugoso, y carcinoma de pene diseminado; trastornos neoplásicos de la uretra, incluyendo carcinoma uretial de pene, carcinoma uretial bulbomembranotis, y carcinoma próstata uretral; y trastornos de erección, tales como priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunción eréctil, e impotencia.

Además, enfermedades y/o trastornos de los vasos deferentes incluyen vasculititis y CBAVD (ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes); de manera adicional, las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar en la diagnosis, tratamiento, y/o prevención de enfermedades y/o trastornos de las vesículas seminales, incluyendo enfermedad hidatídica, diarrea de cloruro congénita, y enfermedad del riñón poliquístico.

Otros trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, Síndrome de Klinefelters, Síndrome de Young, eyaculación precoz, diabetes mellitus, fibrosis quística, Síndrome de Kartagener, fiebre alta, esclerosis múltiple, y ginecomastia.

Además, los polinucleótidos, proteínas de fusión modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar en la diagnosis tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o trastornos de la vagina y vulva, incluyendo vaginosis bacteriana, vaginitis por cándida, virus herpes simplex, chancroide, granuloma inguinal, Ilinfogranuloma venéreo, sarna, papilomavirus humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenosis, vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas, condiloma acuminatum, sífilis, Molusco contagiosos, vaginitis atrófica, enfermedad de Paaet, liquen escleroso, liquen plano, vulvodinia, Síndrome de choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis, vestibulitis vulvar, y trastornos neoplásicos, tales como Hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células transparentes, carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de glándulas de Bartholin, y neoplasia vulvar intraepitelial.

Trastornos y/o enfermedades del útero incluyen dismenorrea, útero retrovertido, endometriosis, fibroides, adenomiosis, sangrado anovulatorio, amenorrea, Síndrome de Cushiner, mola hidatidiforme, Síndrome de Asherman, menopausia prematura, pubertad precoz, pólipos uterinos, sangrado uterino disfuncional (por ejemplo, debido a señales hormonales aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas, leiomiosarcomas, y sarcomas. De manera adicional, las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden ser útiles como un marcador o detector de, así como, en la diagnosis, tratamiento, y/o prevención de anormalidades uterinas congénitas, tales como útero bicorne, útero septado, útero unicorne simple, útero unicorne con un asta rudimentaria no cavitaria, útero unicorne con un asta rudimentaria cavitaria que no se comunica, útero unicorne con un asta rudimentaria cavitaria que se comunica, útero arcuato, didelfus uterino, y útero en forma de T.

Las enfermedades y/o trastornos de ovarios incluyen una ovulación, Síndrome de ovario poliquístico (Síndrome Stein-Leventhal), quistes de ovarios, hipofunción ovárica, insensibilidad de ovarios a gonadotropinas, sobre producción de andrógenos de ovarios, Síndrome venoso del ovario derecho, en, amenorrea, hirutismo y cáncer de ovario (que incluyen pero no se limitan a, crecimiento canceroso primario y secundario, tumores Sertoli-Leydig, carcinoma endometrial del ovario, adenocarcinoma seroso papilar de ovario, adenocarcinoma mucinoso de ovario y tumores de Krukenberg de ovario).

Las enfermedades y/o trastornos cervicales incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta, y displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian, erosión cervical, incompetencia cervical, y neoplasmas cervicales (incluyendo, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasma escamosa, carcinoma de células escamosas, célula neoplasia de células adenoescamosas, y neoplasia de células columnares).

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, mediante incremento de la respuesta inmune, en particular incrementando la proliferación y diferenciación de células B y/o T, se pueden tratar enfermedades infecciosas. La respuesta inmune se puede incrementar mediante o bien potenciando una respuesta inmune existente, o mediante proteínas de fusión de la invención y/o iniciando una nueva respuesta inmune. De manera alternativa, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la inven-
ción también pueden inhibir directamente un agente infeccioso, sin necesariamente provocar una respuesta inmune.

Virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede provocar enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención. Los ejemplos de virus, incluyen, pero no se limitan a los siguientes virus de ADN y ARN y familias virales:

Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, EBV, HIV, Flaviviridae, Hepadnaviridae Hepatitis, Herpesviridae (tales como, Citomegalovirus, Herpes Simplex, Herpes Zoster), Mononegavirus (por ejemplo, Paramixoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, Influenza A, Influenza B, y parainfluenza), Papiloma virus, Papovaviridae, Parvoviridae, Picomaviridae, Poxviridae (tales como Smallpox o Vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-11, -Lentivirus), y Togaviridae (por ejemplo, Rubivirus).

De manera similar, agentes bacterianos y fúngicos que pueden provocar enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de transferrina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, familias bacterianas, y hongos: Actinomyces (por ejemplo, Norcardia), Acinetobacter, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (por ejemplo, Bacillus anthracis), Bacteroides (por ejemplo, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por ejemplo, Borrelia burgdorferi), Brucella, Candidia, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium (por ejemplo, Clostridium botulinum, Clostridium dificile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Coccidioides, Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium diptheriae), Cryptococcus, Dermatocycoses, E. coli (por ejemplo, E. coli enterocoxigénica y E. coli enterohemorrágica), Enterobacter (por ejemplo, Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus influenza tipo B), Helicobacter, Legionella (por ejemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (por ejemplo, Vibrio cholerae), Neisseriaceae (por ejemplo, Neisseriagonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurellacea., Proteus, Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomionas aeruginosa), Rickettsiaceae, Spirochetes (por ejemplo, Treponema. spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus), Meningiococcus, Pneumococcus y Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y los grupos A, B, y C Streptococci), y Ureaplasmas.

Además, los agentes parásitos que provocan enfermedad o que se pueden tratar, prevenir, y/o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias o clases: Amebiasis, Babesiosis, Coccidiosis, Cryptosporidiosis, Dientamoebiasis, Dourine, Ectoparasitic, Giardias, Helminthiasis, Leishmaniasis, Schistisoma, Theileriasis, Toxoplasmosis, Trypanosomiasis, y Trichomonas y Sporozoans (por ejemplo, Plasmodiumvirax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale).

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención se pueden usar para diferenciar, proliferar, y atraer células, en defensa a la regeneración de tejidos. (Véase, Science 276: 59-87 (1997)). La regeneración de tejidos se puede usar para reparar, sustituir, o proteger tejido dañado por defectos congénitos, trauma (heridas, quemaduras, incisiones, o ulceras), edad, enfermedad (por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión de reperfusión, o daños por citoquina sistémico.

Los tejidos que se pueden regenerar usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculos (liso, esquelético o cardíaco), vasculatura (incluyendo vascular y linfática), nervioso, hematopoyético, y tejido esquelético (hueso, cartílago, tendón, y ligamento). Preferiblemente, regeneración se produce sin o disminución de scarrina. La regeneración también puede incluir angiogénesis.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención, se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar, y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, incluyendo enfermedades y/o afecciones inflamatorias, infecciones, cánceres (por ejemplo, neoplasmas intestinal (tumor carcinoide del intestino delgado intestino, Ilinfoma no Hodgkin del intestino delgado, linfoma de lazo), y úlceras, tales como úlceras peptídicas.

Trastornos gastrointestinales incluyen disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis submucosal y de estructuración, lesiones Mallory-Weiss, leioiniomas, lipomas, cánceres epidérmicos adeoncarcinomas, retención gástrica trastornos, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástricos/de estómago, pólipos del estómago, trastornos autoinmunes tales como anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, viral, eosinófila, inducida por estrés, erosiva crónica, atrófica, células del plasma, y de Menetrier), y enfermedades peritoneales (por ejemplo, peritoneo quiloso, hemoperitoneo, quiste mesentérico, linfadenitis de mesenterio, oclusión vascular mesentérica, paniculitis, neoplasias, peritonitis, neumoperitoneo, absceso subfrénico.

Trastornos gastrointestinales también incluyen trastornos asociados a intestino delgado, tales como Síndrome de mala absorción, distensión, Síndrome de intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprue tópico, enfermedad de Whipple, linfaangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del íleo, divertículo de Meckel, divertículo múltiple, fallo de la rotación completa del intestino delgado y grueso, Ilinfoma, y enfermedades bacterianas y parásitas (tales como diarrea de Traveler, cólera tifoide y para tifoide, cólera, infección por Gusanos redondos (Ascariasis Iumbricoides), anquilostomas (Anclostoma duodenale), Triquinas (Enterobius vermicularis), Tenias Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp. y 1. SOHUM).

Las enfermedades y/o trastornos del hígado incluyen colestasis intrahepática (Síndrome de alagille, cirrosis de hígado biliar), hígado graso, (hígado graso alcohólico, reye Síndrome de reye), veiri hepático, trombosis, degeneración hepatolenticular, hepatomegalias, Síndrome hepatopulmonar, Síndrome hepatorenal, Hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas), absceso de hígado (absceso de hígado amébico), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis), parásitas (equinocoecosis hepática, fascioliasis, absceso de hígado amébico), ictericia (hemolítica, hepatocelular, y colestática), colestasis, Hipertensión portal, engrosamiento del hígado, ascites, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis aniffial, hepatitis crónica (autoinmune, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis viral humana (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria, encefalopatía hepática, Hipertensión portal, varices, encefalopatía hepática, hemangiomas biliares primarios, cirrosis bílica, colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, piedras, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda), y neoplasia del hígado (ancriomiolipoma, metástasis del hígado calcificado, metástasis del hígado quístico, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, Hiperplasia nodular focal, adenoma hepático, cistadenoma hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer de hígado, hemangioendotelioma de hígado, hematoma mesenquimal, tumores mesenquimales del hígado, Hiperplasia regenerativa nodular, tumores de hígado benignos (quistes hepáticos, quistes simples, enfermedad del hígado poliquística, cistoadenoma hepatobiliar, quistes Coledocales, tumores mesenquimales, hematoma mesenquimal, hemangioendotelioma infantil, Hemangioma, hepatis Peliosis, Lipomas, pseudo tumor inflamatorio, tumores epiteliales misceláneos, epitelio del conducto biliar (hematoma del conducto biliar, adenoma del conducto biliar), Hepatocitp (Adenoma, Hiperplasia nodular focal, Hiperplasia nodular regenerativa), tumores de hígado malignos (hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumores los vasos sanguíneos, angiosarcoma, sarcoma de Karposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma, carcinoide, carcinoma escamoso, linfoma primario)), peliosis hepatis, porfiria eritropoyética, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutánea tarda), Síndrome de Zelli Neger).

Las enfermedades y/o trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis necronizante aguda, pancreatitis alcohólica), neoplasias (adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma, gastrinoma, y glucacronoma, neoplasmas quísticos, tumores de las células de islotes, pancreoblastoma), y otras enfermedades pancreáticas (por ejemplo, fibrosis quística, quiste (pancreático, seudoquiste, fístula pancreático, insuficiencia)).

Las enfermedades de la vesicular biliar incluyen piedras en la vejiga (colelitiasis y coledocolitiasis), Síndrome postcolecistectomía diverticulosis de la vesícula biliar, coleocistitis aguda, coleocistitis crónica, tumores del conducto biliar, y mucocele.

Las enfermedades y/o trastornos del intestino grueso incluyen colitis asociada a antibióticos, diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorrectales (por ejemplo, fisuras, hemorroides), enfermedades del colon (colitis, neoplasia del colon, cáncer de colon, pólipos de colon adenomatoso (por ejemplo, adenoma velloso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal, diverticulitis de colon, diverticulitis de colon, megacolon, enfermedad de Hirschsprung, megacolon tóxico, enfermedades sigmoides, proctocolitis, sigmo meoplasmosis, estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplastia duodenal, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis), enteritis (enterocolitis), enteropatía de VIH, enfermedades duodenales (neoplastia duodenal, ileitis), enfermedad del intestino delgado inmunoproliferativa, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parásitas (anisakis, balantidiasis, infecciones blastocistis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, disentería amébica, giardiasis), fístula intestinal (fístula rectal), neoplasmas intestinales (neoplasmas cecales, neoplasmas de colon, neoplasmas duodenales, neoplasmas del duodeno, pólipos intestinales, neoplasmas del yeyuno, rectal neoplasmas), obstrucción intestinal (Síndrome de bucle aferente, obstrucción duodenal, heces impactadas, pseudo obstrucción intestinal cecal volvulus, intususcepción), perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos de colon, Síndrome de jardinero, Síndrome de peutz-jeghers), enfermedades del yeyuno, neoplasmas del yeyuno), Síndromes de mal absorción (Síndrome del bucle ciego, enfermedad celíaca, intolerancia a lactosa, Síndrome del intestino corto, esprue del trópico, enfermedad de whipple), oclusión vascular mesentérica, neumatosis cistoides intestinalis, enteropatías de pérdida de proteína (linfaagiectasis intestinal), enfermedades rectales (anus enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia perforación, úlcera de estómago, Síndrome de Zollinger-Ellison), Síndromes de postgastrectomía (Síndrome de inundación), enfermedades del estómago (por ejemplo, acloridria, reflujo duodenogástrico (reflujo de bilis), vascular ectasia antral gástrica, fístula gástrica, obstrucción de la salida gástrica, gastritis (atrófica o Hipertrófica), gastroparesis, dilatación de estómago, divertículo de estómago, neoplasmas de estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, póplipo gástrico hiperplásico), ruptura de estómago, úlcera de estómago, vólvulo de estómago), tuberculosis, visceroptosis, vómito (por ejemplo, hematemesis, Hiperemesis gravidarum, nauseas post operativas y vómitos) y colitis hemorrágica.

Las enfermedades y/o trastornos adicionales del sistema gastrointestinal incluyen enfermedades del trato biliar, tales como, gastrosquisis, fístula (por ejemplo, fístula biliar, fístula esofágica, fístula gástrica, fístula intestinal, fístula pancreática), neoplasmas (por ejemplo, neoplasmas del tracto biliar, neoplasmas esofágicos, tales como adenocarcinoma del esófago, carcinoma de células escamosas del esófago, neoplasmas gastrointestinales, neoplasmas pancreáticos, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasma quístico mucinoso del páncreas, neoplasma quístico pancreático, pancreatoblastoma, y neoplasmas peritoneales), enfermedad esofágica (por ejemplo, enfermedades bulosas, candidiasis, acantona glicoaenía, ulceración, varices de esófago de barret, atresia, quiste, divertículos. (por ejemplo, divertículos de Zenker), fístula (por ejemplo, fístula traqueoesofágica), trastornos de motilidad (por ejemplo, Síndrome CREST, trastornos de deglución, acalasia, espasmo, reflujo gastroesofágica, neoplasmas, perforación (por ejemplo, Síndrome de Boerhaave, Síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia diafragmática (por ejemplo, hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como, gastroenteritis (por ejemplo, cólera morbus, infección de virus de Norwalk), hemorragia (por ejemplo, hematemesis, melena, hemorragia de úlcera péptica), neoplasmas de estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, cáncer de estómago)), hernia (por ejemplo, hernia de diafragma congénita, hernia femoral, hernia inguinal, hernia obturadora, hernia umbilical, hernia ventral), y enfermedades intestinales (por ejemplo, enfermedades cecales (apendicitis, neoplasmas cecales)).

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden tener actividad de quimiotaxis. Una molécula qumiotáctica atrae o mobiliza las células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastocitos, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio particular en el cuerpo, tales como inflamación, infección, o sitio de Hiperproliferación. Las células modificadas pueden por lo tanto rechazar y/o curar el trauma o anormalidad particular.

Las proteínas de fusión de transferrina modificadas de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de transferrina de la invención pueden incrementar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas molécula quimiotácticas después se pueden usar para tratar inflamación, trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmune incrementando el número de células dirigidas a una localización particular en el cuerpo.

\vskip1.000000\baselineskip

Animales transgénicos

La producción de animales no humanos transgénicos que contienen una una construcción de fusión de transferrina modificada con incremento de la semivida en suero incremento de estabilidad en suero o incremento en la biodisponibilidad de la presente invención se contempla en una realización de la presente invención. En algunas realizaciones, lactoferrina se puede usar como la parte de Tf de la proteína de fusión de manera que la proteína de fusión se produce y se secreta en leche.

La producción exitosa de animales transgénicos, no humanos se ha descrito en numerosas patentes y publicaciones, tales como, por ejemplo Patente de Estados Unidos 6.291.740 (expedida el 18 de septiembre de 2001); Patente de Estados Unidos 6.281.408 (expedida el 28 de agosto de 2001); y Patente de Estados Unidos 6,271,436 (expedida el 7 de agosto de 2001).

La capacidad de alterar la composición genética de animales, tales como mamíferos domésticos incluyendo vacas, cerdos, cabras, caballos, ganado, y ovejas, permite un número de aplicaciones comerciales. Estas aplicaciones incluyen la producción de animales que expresan grandes cantidades de proteínas exógenas en una forma recogida fácilmente (por ejemplo, expresión en la leche o sangre), la producción de animales con un incremento de ganancia de peso, eficacia de alimentación, composición de armazón, producción o contenido de leche, resistencia a enfermedad y resistencia a infección mediante microorganismos específicos y la producción de animales que tienen tasas de crecimiento o comportamiento reproductor potenciados. Animales que contienen secuencias de ADN exógenas en su genoma se denominan animales transgénicos.

El procedimiento más ampliamente usado para la producción de animales transgénicos es la microinyección de ADN en los pronúcleos de embriones fertilizados (Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113 [1992]). Otros procedimientos para la producción de animales transgénicos incluyen la infección de embriones con retrovirus o con vectores retrovirales. Infección de embriones de ratón tanto antes como después de implante con o bien retrovirus de tipo salvaje o recombinantes se ha reseñado (Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]; Janenich et al., Cell 24: 519 [1951]; Stuhlmann et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81: 50 7151 [1984]; Jahner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6927 [1985]; Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6148-6152; Stewart et al., EMBO J. 6:383-388 [1987]).

Un medio alternativo para infectar embriones con retrovirus es la inyección de virus o células que producen virus en el blastocele de embriones de ratón (Jahner, D. et al., Nature 298:623 [1982]). La introducción de transgenes en la línea germinal de ratones se ha reseñado usando infección retroviral intrauterina del ratón en la embriones en mitad de la gestación (Jahner et al., supra [1982]). Se ha reseñado la infección de embriones ovinos y bovinos con retrovirus o vectores retrovirales para crear animales transgénicos. Estos protocolos implican la microinyección de partículas retrovirales o células de crecimiento detenido (es decir, tratadas con mitomicina C) que están liberadas de partículas retrovirales en el espacio perivitelino de huevos fertilizados o embriones tempranos (Solicitud Internacional PCT WO 90/08832 [1990]; y Haskell y Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40: 386 [1995]. Solicitud internacional PCT WO 90/08832 describe la inyección de virus B de leucemia felino de tipo salvaje en el espacio perivitelino de embriones de oveja en la fase de 2 a 8 células. Fetos derivados de embriones inyectados se mostró que contenía sitios de integración múltiples.

Patente de Estados Unidos 6.291.740 (expedida el 18 de septiembre de 2001) describe la producción de animales transgénicos mediante la introducción de ADN exógeno en los oocitos antes de la maduración y maduros, oocitos no fertilizados (es decir, oocitos antes de la fertilización) usando vectores retrovirales que translucen la división de células (por ejemplo, vectores derivados de virus de leucemia de tipo murino [MLV]). Esta patente también describe procedimientos y composiciones para citomegalovirus conducidos por promotor, así como la expresión de tumor mamario de ratón LTR de diversas proteínas recombinantes.

Patente de Estados Unidos 6.281.408 (expedida el 28 de agosto de 2001) describe procedimientos para producir animales transgénicos usando células de tronco embrionarias. En resumen, las células de tronco embrionarias usadas en el co-cultivo de células mixtas con una mórula para generar animales transgénicos. Se introduce material genético extraño se introduce en las células de tronco embrionarias antes de co-cultivo mediante, por ejemplo, electroporación, microinyección distribución de retrovirales. Las células ES transfectadas de esta manera se seleccionan para integraciones del gen mediante un marcador de selección tales como neomicina.

Patente de Estados Unidos 6.271.436 (expedida el 7 de agosto de 2001) describe la producción de animales transgénicos usando procedimientos que incluyen aislamiento de células germinales primordiales, el cultivo de estas células primordiales para producir líneas celulares derivadas de células germinales primordiales, transformación de tanto las células germinales primordiales como las líneas celulares cultivadas, y uso de estas células transformadas y líneas celulares para generar animales transgénicos. La eficacia a la que los animales transgénicos se generar se incrementa en gran medida, permitiendo por lo tanto el uso de recombinación homóloga en la producción d especies animales no roedores transgénicos.

\vskip1.000000\baselineskip

Terapia génica

El uso de construcciones de fusión de transferrina modificada para terapia génica en el que una proteína de transferrina modificada o dominio de transferrina se une a una proteína o péptido terapéutico se contempla en una realización de esta invención. Las construcciones de fusión de transferrina modificada con incremento de la semivida en suero o estabilidad en suero de la presente invención son idealmente adecuadas para tratamientos de terapia génica.

El uso exitoso de terapia génica para expresar una proteína de fusión soluble se ha descrito. En resumen, terapia génica mediante inyección de un vector de adenovirus que contiene un gen que codifica una proteína de fusión soluble que consiste en antígeno 4 de linfocitos citotóxico (CTLA4) y la parte de Fc de inmunoglobulina IG humana se mostró recientemente en Ijima et al. (10 de junio de 2001) Human Gene Therapy (Estados Unidos) 12/9:1063-77. En esta solicitud de terapia génica, un modelo murino de artritis inducida por colágeno de tipo II se trató de manera exitosa mediante inyección intraarticular del vector.

Terapia génica también se describe en un número de Patentes de Estados Unidos incluyendo la Patente de Estados Unidos 6.225.290 (expedida el 1 de mayo de 2001); Patente de Estados Unidos 6.187.305 (expedida el 13 de febrero de 2001); y la Patente de Estados Unidos 6.140.111 (expedida el 31 de octubre de 2000).

La Patente de Estados Unidos 6.225.290 proporciona procedimientos y construcciones mediante los cuales células intestinales epiteliales de un sujeto mamífero están genéticamente alteradas para incorporar de manera operativa un gen que expresa una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado. Las transformaciones de células intestinales se lleva a cabo mediante la administración de una formulación compuesta principalmente de ADN desnudo, y el ADN se puede administrar por vía oral. Las rutas de administración oral u otra intragastrointestinal proporciona un procedimiento sencillo de administración, mientras que el ácido nucleido desnudo evita las complicaciones asociadas al uso use vectores virales para llevar a cabo terapia génica. La proteína expresada se secreta directamente en el tracto gastrointestinal y/o corriente sanguínea para obtener niveles en sangre terapéuticos de la proteína de la proteína tratando por lo tanto el paciente en necesidad de la proteína. Las células intestinales epiteliales transformadas proporcionan curas terapéuticas a corto o largo plazo para las enfermedades asociadas a una deficiencia en una proteína particular o que son susceptibles de tratamiento mediante la sobre expresión de una proteína.

Patente de Estados Unidos 6.187.305 proporciona procedimientos dirección de gen o ADN en células de vertebrados, en particular de origen mamífero. En resumen, el ADN se introduce en células primarias o secundarias de origen vertebrado mediante recombinación homóloga o dirección del ADN, que se introduce en el ADN genómico de las células primarias o secundarias en el sitio preseleccionado.

Patente de Estados Unidos 6.140.111 (expedida el 31 de octubre de 2000) describe vectores retrovirales de terapia génica. Los vectores retrovirales descritos incluyen un sitio de inserción para los genes de interés y son capaces de expresar altos niveles de la proteína derivada de los genes de interés en una amplia variedad de tipos de célula transfectada. También se describen vectores retrovirales que carecen de un marcador seleccionable, haciéndolos de este modo adecuados para terapia génica humana en el tratamiento de una variedad de estados patológicos sin la co-expresión de un producto marcador, tales como un antibiótico. Estos vectores retrovirales son especialmente adecuados para uso en ciertas líneas celulares empaquetadoras. La capacidad de vectores retrovirales de insertarse en el genoma de células de mamíferos les han hecho en particular candidatos prometedores para uso en la terapia genética de enfermedades en seres humanos y animales. La terapia genética típicamente implica (1) la adición de un material genético a células de paciente in vivo, o (2) eliminación de células de paciente del cuerpo, añadiendo nuevo material genético a las células y reintroduciéndolos en el cuerpo, es decir, terapia génica in vitro. Las discusiones de cómo realizar la terapia génica en una diversidad de células usando vectores retrovirales se puede encontrar, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Números. 6.868.116, expedida el 19 de septiembre de 1989, y 4.980.286, expedida el 25 de diciembre de 1990 (células epiteliales), WO89/07136 publicada el 10 de agosto de 1989 (células de hepatocito), EP 378,576 publicada el 25 de julio de 1990 (células de fibroblastos), y WO89/05345 publicada el 15 de junio de 1989 y WO/90/06997, publicada el 28 de junio de 1990 (células endoteliales).

Sin descripción adicional, se cree que los expertos en la técnica ordinaria, usando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, probar, realizar y utilizar la presente invención y practicar los procedimientos reivindicados. Por ejemplo, los expertos en la técnica serían fácilmente capaces de determinar la actividad biológica, tanto in vitro como in vivo, para las construcciones de proteína de fusión de la presente invención cuando se compara con la actividad comparable del resto terapéutico en su estado sin fusionar. De manera similar, los expertos en la técnica pueden fácilmente determinar la semivida en suero y estabilidad en suero de construcciones de acuerdo con la presente invención. Los siguientes ejemplos operativos, específicamente se refieren a las realizaciones de la presente invención preferidas, y no se consideran limitantes de ninguna manera el resto de la descripción.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1

Una proteína de fusión entre Tf modificada y péptido de VIH-1 antifusogénico (T-20) que comprende la secuencia se prepara fusionando una o más copias de la secuencia de nucleótidos que codifican el péptido a la secuencia de nucleótidos de TF para producir una proteína de fusión con un péptido fusionado al extremo N- o extremo C de Tf.

En una realización, la parte de Tf de la proteína de fusión se modifica por ingeniería para permitir la glicosilación cuando se produce en levadura. Como se ha descrito anteriormente, transferrina humana tiene dos sitios de glicosilación ligados a N en aproximadamente N413 y aproximadamente N611. El sitio de glicosilación ligado a N comprende la secuencia N-X-S/T. En una realización, N (Asn) se cambia a Q (Gln); otros cambios se contemplan tales como Asn a Ala o Ser o cualquier otro aminoácido.

Específicamente, los codones N413 y N611 se convierten en GAT y GAC mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido usando el procedimiento dut- y ung-. Véase Kunkel et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 488-492). Los oligonucleótidos mutagénicos 5'-GCAGAAAACTACGATAAGAGCGATAAT-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3' (SEQ ID NO: 10) se sintetizan y usan para mutagenizar los codones N413 y N611 de acuerdo con los procedimientos de Funk et al. (Patente de Estados Unidos 5.986.067).

Unión al receptor y/o a hierro o unión a carbonato se interrumpe después mediante mutación de los siguientes restos de unión a los iones hierro y/o carbonato:

\vskip1.000000\baselineskip

Unión a hierro

259

Unión a ion carbonato

260

\vskip1.000000\baselineskip

La producción de mutantes deficientes en la unión a hierro se puede llevar a cabo mediante numerosas técnicas. Véase la Patente de Estados Unidos 5.986.067. Una sustitución D63S se puede preparar usando el procedimiento de Nelson, R. M. y Long, G. L. (1989) Analyt. Biochem. 180:147-151. En resumen, un fragmento de HpaII/BamHI del extremo 5' de la secuencia de codificación hTF/2N se subclona en pUC18 y después se usa como un molde para un procedimiento de mutagénesis de dos etapas basado en PCR. El fragmento se libera después de la forma de doble hebra del vector de secuenciación mediante digestión con XbaI y BamHI y después se liga a un fragmento BamHI/HindIII de la construcción de Tf original humana para producir una secuencia de codificación de D63S de longitud completa, la fidelidad de este ayuste se se confirma mediante análisis de digestión de restricción.

Para la expresión en Pichia se puede usar el sistema de RCT/Invitrogen. Están disponibles tres vectores para la expresión de multicopias, pPIC9K, pPIC3.5K y pA0815. Para este ejemplo se usa el vector pPIC9K, que permite la secreción en el medio de crecimiento.

La secuencia de transferrina modificada se clonó en el vector pPIC9K mediante alteración de los extremos del ADNc de transferrina mediante mutagénesis de PCR de superposición esto produjo el vector pREX0010. Un número de sitios de restricción del vector y secuencia de codificación se eliminaron o añadieron para ayudar a las etapas de clonación posteriores (Figura 5).

La secuencia para el péptido VIH antifusogénico DP-178 también se muestra como T-20. Este péptido se presta él mismo a fusión en los extremos N- o C- de transferrina, ya que el péptido puede necesitar libertad de movimiento para cumplir su función. La secuencia DP-178: YTSLlHSLlEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 4).

Cuando se vuelve a traducir en un ADN (usando codones optimizados para levadura) se obtuvieron las siguientes secuencias (SEQ ID NOS: 13 y 14):

\vskip1.000000\baselineskip

261

\vskip1.000000\baselineskip

Para insertar la secuencia anterior el vector pREX0010 con el ADNc de transferrina modificada, se digirió con las enzimas de restricción XbaI/KpnI para inserción en el extremo 5' y SalI/HindIII para inserción en el extremo 3'.

Para la inserción 5' se sintetizaron dos oligos de superposición que forman un saliente XbaI en el extremo 5' y un saliente KpnI en el extremo 3' de la secuencia de DP-178 proporcionada anteriormente. Estos oligos después se hibridaron conjuntamente (véase más adelante) y se ligaron en el vector pREX0010 digerido con XbaI/KpnI.

262

Inserción de los oligos hibridados dio como resultado la pérdida del sitio KpnI tras la inserción. Esto dio como resultado el vector pREX0011 (Figura 6).

Para inserción en el extremo C se llevó un planteamiento similar mediante la adición de un sitio SalI en el extremo 5' y un HindIII en el extremo 3' (Figura 7).

Transformación, selección y expresión se realizan después como se describe en folleto del protocolo del kit de expresión de Pichia de Invitrogen.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Las fusiones INGAP se preparan usando una secuencia de aminoácidos INGAP humana traducida inversa. La secuencia de proteína es como sigue: spIQ92778IPBCG_HUMANA Humana INGAP

263

La traducción inversa en un ADN (codones optimizados para levadura proporcionó lo siguiente (SEQ ID NO: 18 y 19).

264

El punto más probable usado para escisión de la secuencia guía está en el KK en el extremo de la secuencia subrayada arriba.

Una metodología que se puede usar para generar construcciones para la expresión de INGAP fusionado al extremo N- o C de transferrina es para sintetizar una serie de oligos de superposición diseñados a partir de la secuencia proporcionada anteriormente (menos la secuencia guía subrayada). La hibridación de estos cebadores genera el ADNc de INGAP. Con diferentes oligos diseñados para los extremos 5' y 3' el ADNc hibridado se puede ligar en pREX0010 en el extremo 5' o 3' de transferrina.

La secuencia entre paréntesis es el péptido usado para inducir actividad de INGAP. Por lo tanto la secuencia se puede aparear abajo de algún punto entre la secuencia entera y mínima.

\vskip1.000000\baselineskip

Fusión N-terminal

Para el extremo N éstos tendrían un saliente que forma un sitio a XbaI en el extremo 5' y un saliente compatible con un sitio KpnI en el extremo 3' pero que da como resultado la destrucción del sitio KpnI.

\vskip1.000000\baselineskip

265

\vskip1.000000\baselineskip

Digestión de pREX0010 con XbaI y KpnI y ligamiento de la secuencia anterior produce el vector pREX0013 (Figura 8).

\newpage

Fusión C-terminal

Para el extremo C el extremo 5' formaría un sitio SalI y el extremo 3' un codón de parada más un sitio HindIII.

266

Digestión de pREX0010 con SalI y HindIII y ligamiento de la secuencia anterior produce el vector pREX0014 (Figura 9).

Transformación, selección y expresión se realizan después cuando se describe en el folleto del protocolo del kit de Expresión de Pichia de Invitrogen.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

El péptido proporcionado más abajo se ha mostrado que imita la actividad EPO provocando la dimerización del receptor EPO. El péptido, que es cíclico, no tiene homología con EPO. Para la actividad el péptido tiene que actuar en concierto con otro péptido, es decir, como un dímero, tal como dos copias del receptor se llevan en bastante proximidad cercana para formar un complejo activo. Como con muchos péptidos el dímero de péptido sufre una corta semivida y se beneficiara de la longevidad que la fusión a transferrina proporcionaría. En este ejemplo dos péptidos se modifican por ingeniería en la estructura de transferrina.

267

Como se detalla por Ali et al, un péptido se puede modificar exitosamente por ingeniería en transferrina entre His289 y Gly290. La duplicación inherente a la molécula de transferrina, con los dos dominios que son la imagen uno del otro, significa que es posible modificar por ingeniería un péptido en la región duplicada del dominio C, entre Glu625 y Thr626.

268

Para cada inserción se sintetizan dos cebadores mutagénicos de superposición (véase más adelante). Usando pREX0010 como un molde se realizaron las reacciones con cada cebador mutagénico y un cebador externo de 5' o 3' del ADNc de Tf. 10 Los productos de estas dos reacciones se mezclaron después y se realizó una realización adicional con los cebadores externos para unir los dos productos conjuntamente. El producto de PCR de inserción His289-Gly290 se digirió con XbaI y HpaI para ligamiento en pREX0010 digerido con XbaI/HpaI. El vector resultante después se digirió con HpaI y SalI para ligamiento del producto de PCR de inserción Glu625-Thr626 digerido con HpaI/SalI.

Inserción His289-Gly290 (SEQ ID NO: 28).

269

\vskip1.000000\baselineskip

Inserción Glu625-Thr626 (SEQ ID NO: 29).

270

\newpage

Éstos proporcionaron el plásmido pREX0015 (Figura 10). Transformación, selección y expresión se realizan después como se describe en el folleto del protocolo del kit de expresión de Pichia de Invitrogen.

Los puntos alternativos para la inserción del(de los) péptido(s) mimético de EPO, o cualquier (cualesquiera)
otro(s) péptido(s) son los dos sitios de glicosilación en el dominio C de transferrina en N413 y N611. la ventaja de esto sería que la inserción se logra y se evita la glicosilación, mediante alteración de la secuencia N-X-S/T, en uno y el mismo caso.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Proteínas de fusión entre Tf y los péptidos inhibidores fusogénicos contra RSV se realizan mediante fusión del péptido secuencias a los extremos N- o C-terminal de Tf o mediante la inserción de las secuencias en un bucle de Tf, en la que la Tf se modifica para no unirse a hierro y/o se modifica para prevenir glicosilación. El péptido RSV puede incluir: T786: VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKAOELLENV (SEQID NO: 5) y/o T1584:AVSKVLHLEGEVNKIKS
ALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL (SEQID NO:6).

El péptido T786 tiene un dipéptido RK que podría actuar como un sitio de escisión para la proteasa de levadura Kex2p. Esto daría como resultado un péptido truncado. De acuerdo con lo anterior, este péptido se puede modificar de RK a RE. Otra versión del péptido T786, T112 (VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV, SEQ ID NO: 7), que es más potente que T786 tiene problemas de solubilidad en su forma no fusionada. De acuerdo con lo anterior, una versión de T112 modificada para el RK a RE también se prepara para producir una versión del péptido fusionado a Tf.

Para producir las construcciones genéticas, las secuencias de péptido se vuelven a traducir en ADN usando desviación de codón para seres humanos, levaduras o cualquier otro organismo según sea apropiado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Se pueden fusionar diversas citoquinas a los extremos N-, C- o N- y C- de Tf. Estas fusiones también se pueden construir usando partes o dominios diferentes de transferrina modificada tal como el dominio N o dominio C. Las proteínas pueden estar fusionadas directamente o usando un péptido de engarce de diversas longitudes. También es posible fusionar toda o parte de la citoquina activa dentro de la estructura de transferrina.

El ADNc para la citoquina de interés, tales como EPO, se puede aislar mediante una diversidad de medios tales como RT-PCR a partir de genotecas de ARNm, de ADNc, mediante la construcción sintética del ADNc de oligonucleótidos de superposición, mediante PCR o mediante otros medios conocidos en la técnica, usando todos procedimientos convencionales. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas se conocen y están disponibles, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 4.703.008, 4.810.643 y 5.908.763 así como bases de datos públicas tales como GenBank. El ADNc se puede confeccionar en los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de manera que se puedan usar engarces de oligonucleótido, para clonación de ADNc en un vector que contiene el ADNc para transferrina. Éste puede estar en el extremo N- o C-, con o sin el uso de una secuencia espaciadora, o insertando el ADNc de la citoquina dentro del ADNc de transferrina. La citoquina, por ejemplo, EPO, y ADNc de Tf se clonan en un vector a partir del cual se clonan en un vector a partir del cual el módulo de expresión completa se escinde después y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura (o cualquier otro sistema de expresión de levadura). La proteína de fusión secretada a partir de la levadura se puede después recoger y purificar del medio y ensayar para evaluar su actividad biológica.

Para la expresión en líneas celulares de mamífero, se adopta un procedimiento similar excepto que el módulo de expresión usado emplea un promotor de mamífero, secuencia guía y terminador. Este módulo de expresión después se escinde y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Se pueden fusionar diversos interferones a los extremos N-, C- o N- y C- de transferrina modificada. Estas fusiones se pueden construir usando diferentes partes o dominios de transferrina tales como el dominio N o dominio C. Las proteínas se pueden fusionar directamente o usando un péptido de engarce de diversas longitudes. También es posible toda o parte del interferón dentro de la estructura de transferrina.

Un ejemplo específico de un interferón que se puede fusionar a Tf es interterón-\beta. El ADNc para el interferón de interés tales como IFN \beta se puede aislar mediante una diversidad de medios tales como RT-PCR de ARNm o ADNc, de genotecas de ADNc, construyendo de manera sintética el ADNc de los oligonucleótidos de superposición, mediante PCR o mediante otros medios conocidos en la técnica, usando todos procedimientos convencionales. Las secuencias de nucleótidos para interferones, tales como IFNa, IFN\beta, y IFNy se conocen y están disponibles, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.326.859 y 4.588.585, en el documento EP 32 134, así como en las bases de datos públicas tales como GenBank. El ADNc se puede confeccionar en los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de manera que los engarces de oligonucleótidos se puedan usar para clonar ADNc en un vector que contiene el ADNc para la transferrina modificada. Esto puede estar en los extremos N-, C- o N- y C- de la secuencia de transferrina, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de IFN \beta (u otro interferón) se clona en un vector a partir del que el módulo de expresión completa se escinde después y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura. La proteína de fusión secretada a partir de levadura después se puede recoger y purificar del medio y ensayarse para detectar su actividad biológica.

Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el módulo de expresión usado emplea un promotor de mamífero, secuencia guía y terminador. Este módulo de expresión después se escinde y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero. IFN fusionados a transferrina tienen una semivida más larga, de este modo, las dosificaciones terapéuticas de las proteínas fusionadas son mucho menores que la de los IFN. Por lo tanto, los interferones fusionados son más eficaces con mucha menos toxicidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Diversos anticuerpos de una sola cadena (SCA) se inventaron originalmente para simplificar la selección y producción de anticuerpo. Sin embargo, prueban que son de valores limitados o no terapéuticos debido a su pequeño tamaño y corta semivida in vivo. Adición de transferrina a SCA incrementa de manera significativa la semivida in vivo de SCA.

SCA se puede fusionar a los extremos N-, C- o N- y C- de la transferrina modificada. Estas fusiones también se pueden llevar a cabo usando partes diferentes de dominios de transferrina tales como el dominio N o dominio C. Las proteínas se pueden fusionar directamente o usar un péptido de engarce de diversas longitudes. También es posible fusionar toda o parte de SCA dentro de la estructura de transferrina. En tales casos la proteína de fusión se realiza mediante la inserción de ADNc del SCA dentro del ADNc de transferrina para la producción de la proteína en las células. Un ejemplo específico de un SCA que se puede fusionar a transferrina es anti-TNF (factor de necrosis tumoral). Anti-TNF se ha usado para tratar diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. TNF-SCA se puede fusionar al extremo N- o C- de la transferrina modificada de tal manera que el extremo N codificador de TNF-SCA se une directamente al aminoácido C-terminal de transferrina o el aminoácido C-terminal de TNF-SCA se une directamente al aminoácido N-terminal de transferrina. De manera alternativa, un engarce de péptido se puede insertar para proporcionar más separación entre transferrina y TNF-SCA y permitir más estabilidad espacial a las dos proteínas fusionadas. Varios ejemplos de TNF-SCA se muestran en las Figuras 4A-4B.

Anticuerpos de una sola cadena se producen mediante varios procedimientos que incluyen pero no se limitan a: selección de genotecas de fago, clonación de la región variable de un anticuerpo específico mediante clonación del ADNc del anticuerpo y uso de las regiones constantes flanqueantes como el cebador para clonar la región variable, o mediante síntesis de un oligonucleótido que corresponde a la región variable de cualquier anticuerpo específico. El ADNc se puede confeccionar en los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de manera que los engarces de oligonucleótido se pueden usar, para clonación de ADNc en un vector que contiene el ADNc para transferrina. Éste puede estar en el extremo N- o extremo C o extremos N- y C- con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de la molécula de SCA se clona en un vector a partir del cual el módulo de expresión completo después se escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura. La proteína de fusión secretada de la levadura se puede después recoger y purificar del media y ensayar para evaluar su actividad. Para la expresión en las líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento excepto que el módulo de expresión usado emplea un promotor de mamífero, secuencia guía y terminador. Este módulo de expresión después se escinde y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero. El anticuerpo producido de esta manera se puede
purificar a partir del medio para evaluar su unión a antígeno usando procedimientos inmunológicos convencionales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Las CDR son las regiones variables de anticuerpos que interactúan con antígenos. Éstas usualmente constan de tramos relativamente cortos de péptidos. Anticuerpos normalmente tienen tres CDR en sus cadenas pesadas y tres en sus cadenas ligeras. Una o más de las CDR de un anticuerpo que puede interactuar con antígeno se puede fusionar a transferrina modificada para conferir actividad de unión a antígeno a molécula de transferrina. Las CDR pueden estar fusionadas a los extremos N-, C-, N- y C- o modificarse por ingeniería en la estructura interior de transferrina. Ejemplos de las secuencias de las CDR de anticuerpos anti-TNF se muestran en la TNF-SCA Figura 4A-4B. Los ADNc que corresponden a una o más CDR se pueden fusionar con transferrina modificada para conferir actividad de unión a TNF a transferrina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

La tecnología de fusión de transferrina también se pueden usar para mejorar las propiedades terapéuticas de péptidos que se descubren en diversos sistemas tales como genotecas de despliegue de fago y genotecas de péptidos. Muchos de estos péptidos tienen actividades biológicas sin ninguna homología a natural proteínas o péptidos naturales. Estos péptidos, debido a sus cortas semividas in vivo, son buenos candidatos para fusión a transferrina modificada. Debido a su pequeño tamaño se pueden fusionar a una diversidad de regiones de molécula de transferrina. Además de a los extremos N- y C-, se pueden insertar en diversas regiones dentro de la transferrina que incluyen pero no se limitan a los bucles de cistina. De esta manera la estructura de tres dimensiones del péptido dentro de la transferrina está relativamente rígida. Más de una copia de cada péptido y más de un péptido se pueden fusionar a transferrina modificada. Además, la secuencia de péptidos se puede usar para reemplazar parte de transferrina para conferir actividad terapéutica a transferrina. Ya que la mayoría de estos péptidos son cortos, su ADNc se puede sintetizar con sitios de restricción apropiados para inserción en el ADNc de la transferrina modificada. El ADNc después se puede insertar en un vector que contiene el ADNc de transferrina de tal manera que el péptido se expresa como parte de transferrina molécula fusionada a transferrina molécula. De manera alternativa, los cebadores de PCR se pueden sintetizar para que contengan el péptido de interés y la sección apropiada de transferrina. Usando estos cebadores la amplificación de ADNc de transferrina da como resultado la fusión del péptido al sitio elegido de transferrina. Ejemplos de tales péptidos son los péptidos miméticos de EPO: GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO: 11); DREGCRRGWVGQCKAWFN (SEQ ID NO: 12); y QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY (SEQ ID NO: 30), que no tienen homología con la EPO natural pero actividades biológicas similares ya que activan el receptor de EPO actuando como agonistas. Estos péptidos también necesitan tener conformación específica para su actividad óptima. Los péptidos miméticos de EPO se pueden insertar (o se pueden reemplazar) en uno o más bucles de cistina de transferrina. De esta manera la transferrina puede adquirir actividad EPO. Otros péptidos que se pueden fusionar a transferrina son péptidos con actividad de unión similar a anticuerpos. Estos péptidos pueden unirse a proteínas con afinidad relativamente alta y proporcionar la misma función biológica que los anticuerpos excepto que su semivida in vivo es muy corta. La fusión de estos péptidos a transferrina puede conferir una semivida mucho más larga para estos péptidos sin destruir sus actividades de unión. Estos péptidos se pueden fusionar al extremo N- o C- o ambos o dentro de la molécula de transferrina. El péptidos también se puede reemplazar parte de transferrina. Además más de una copia de péptido o varios péptidos diferentes se pueden usar se pueden usar unidos a una sola molécula de transferrina. Un ejemplo de tal molécula es un péptido que se puede unir a TNF. La unión de este péptido a transferrina proporciona a la transferrina la capacidad de unirse a TNF y actuar de manera similar a anticuerpos anti-TNF. De esta manera se pueden fabricar moléculas de tipo anticuerpo con protocolo de fabricación mucho más fácil y económico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Las proteínas de fusión dirigidas de Tf tienen una combinación de dos o más proteínas o péptidos fusionados a transferrina modificada para que sirvan como una molécula bifuncional. En este caso la transferrina modificada se fusiona a una proteína o péptido para que tenga una nueva actividad biológica y a otra proteína o péptido para dirección. Un ejemplo de tal proteína es una transferrina que contiene una proteína inhibidora tal como endostatina y un péptido de dirección tal como SCA o péptido de unión que puede reconocer tumores. De esta manera la molécula inhibidora se dirige al tumor donde es necesario. El ADNc para la proteína de interés se puede aislar de la genoteca de ADNc o se puede preparar sintéticamente usando varios cebadores de oligonucleótido de superposición usando procedimientos de biología molecular convencionales. Los nucleótidos apropiados se pueden modificar por ingeniería en el ADNc para formar sitios de restricción convenientes y también permitir la unión del ADNc de la proteína a ADNc de transferrina similar al procedimiento descrito para otras fusiones. También un ADNc de proteína o péptido de dirección tales como anticuerpo de una sola cadena o péptidos, tales como señales de localización nuclear, que puedan dirigir proteínas dentro de las células se pueden fusionar a otro extremo o dentro de transferrina. La proteína de interés y el péptido de dirección se clona en un vector, que permite la fusión con el ADNc de transferrina. De esta manera ambos proteínas/péptidos se fusionan a transferrina modificada. El ADNc fusionado después se escinde y se inserta en un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura.

Todos los procedimientos anteriores se pueden realizar usando procedimientos convencionales en biología molecular. La proteína de fusión secretada de levadura se puede recoger y purificar del medio y ensayarse para evaluar su actividad biológica y su actividad de dirección usando ensayos bioquímicos y biológicos apropiados. Estas proteínas se pueden preparar en otros sistemas tales como cultivo de tejido de mamífero usando vector y protocolo de transfección apropiados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

El ADNc para la enzima de interés se puede aislar mediante una diversidad de medios tales como RT-PCR de ARNm, genotecas de ADNc, construyendo de manera sintética el ADNc de oligonucleótidos de superposición, mediante PCR o mediante otros medios conocidos en la técnica, todos usando procedimientos convencionales. El ADNc se puede confeccionar en los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de manera que se puedan usar los engarces de oligonucleótido, para la clonación del ADNc en un vector que contiene el ADNc para la transferrina modificada. Puede estar en el extremo N o C con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de la enzima se clona en un vector a partir del cual el módulo de expresión después se excita y se inserta un vector de expresión para permitir la expresión de la proteína de fusión en levadura. La proteína de fusión secretada de la levadura después se recoge y se purifica del medio y se ensaya para evaluar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el módulo de expresión usado emplea un promotor de mamífero, secuencia guía y terminador. Este módulo de expresión se escinde después y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Usando despliegue en fago, péptidos se aíslan de manera específica para un marcador de célula específico en la superficie de, por ejemplo, una célula tumoral. El péptido después se fusiona a los extremos N-, C- o N- y C- de la transferrina modificada para dirigir la fusión a este tipo de célula específico. La proteína de fusión de transferrina de carga después con un ion metálico que se parezca a hierro en sus propiedades de unión a transferrina, pero que es citotóxica, por ejemplo galio o iones radioactivos. Mediante este mecanismo el galio o el ion radiactivo se dirige al tipo de célula.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a los ejemplos anteriores, se entiende que se pueden realizar diversas modificaciones sin salirse del ámbito de las reivindicaciones. De acuerdo con lo anterior, la invención está limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Prior, Christopher P.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Proteínas de fusión modificadas de transferrina

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 5471 0-5001-W

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/315,745

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-08-30

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/334,059

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-11-30

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (51)..(2147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GenBank No. NM_001063, gen y proteína de transferrina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (51)..(107)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

271

272

273

274

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 698

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

275

276

277

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 679

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de transferrina madura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

278

279

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de inmunodeficiencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

281

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

282

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

283

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus sincitial respiratorio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antifusogénico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

284

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de variante de ayuste de lactoferrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

285

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido para mutagénesis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaaaact acgataagag cgataat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatttggaa gcgacgtaac tgactgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: péptido mimético de EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

286

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: péptido mimético de EPO

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias antifusogénicas de VIH

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(108)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias antifusogénicas de VIH para proteínas de fusión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(123)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211>174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína INGAP

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias de INGAP

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(525)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias de INGAP

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias de INGAP para proteínas de fusión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(444)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 441

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(436)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

298

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias miméticas de EPO

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(60)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

299

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencias miméticas de EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

300

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: región de inserción del péptido de transferrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

301

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

302

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencia de ADN de transferrina para región de inserción de péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211>210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: péptido mimético de EPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

305

Claims

1. Una proteína de fusión purificada que comprende a proteína de transferrina (Tf) que muestra glicosilación reducida fusionada a al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que la semivida en suero o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico se incrementa respecto de la semivida en suero o estabilidad en suero de la proteína o péptido terapéutico en un estado no fusionado y en el que dicha proteína de Tf comprende al menos una mutación que reduces o evita la glicosilación.

2. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de Tf contiene una o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido comparado con una secuencia de tipo salvaje que da como resultado una afinidad reducida para un receptor de Tf (TfR).

3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína de Tf no se une a un TfR.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de Tf tiene unión a hierro reducida.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que la proteína de Tf no se une a hierro.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de Tf es lacto transferrina (lactoferrina).

7. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el sitio de glicosilación se selecciona entre el grupo que consiste en un resto de aminoácido que corresponde a aminoácidos N413, N611, o un aminoácido adyacente a o en un sitio de glicosilación N-X-S/T.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 2 ó 3, en la que la Tf comprende al menos una sustitución, supresión o adición de aminoácido en un resto de aminoácido que corresponde a un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458 y Gly 459.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo C-terminal de Tf.

10. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo N-terminal de Tf.

11. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína o péptido terapéutico está insertado en al menos un bucle de la Tf.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de Tf comprende una parte del dominio N de una proteína de Tf, un puente de péptido y una parte del dominio C de una proteína de Tf.

13. La proteína de fusión de la reivindicación 12, en la que el puente de péptido une la proteína o péptido terapéutico a Tf.

14. La proteína de fusión de la reivindicación 12, en la que dicha proteína, péptido o polipéptido terapéutico se inserta entre un dominio N y C de proteína de Tf.

15. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de Tf tiene una región de articulación y al menos una sustitución, supresión o adición de aminoácido en la región de articulación Tf.

16. La proteína de fusión de la reivindicación 15, en la que dicha región de articulación se selecciona entre el grupo que consiste en aproximadamente del resto 94 a aproximadamente del resto 96, aproximadamente del resto 245 a aproximadamente del resto 247, aproximadamente del resto 316 a aproximadamente del resto 318, aproximadamente el resto 425 a aproximadamente del resto 427, aproximadamente del resto 581 a aproximadamente del resto 582 y aproximadamente del resto 652 a aproximadamente del resto 658.

17. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de Tf tiene al menos una sustitución, supresión o adición de aminoácido en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr426, Tyr514, Tyr517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr452, Arg 456, Ala 458 y Gly459.

18. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en la que la proteína o péptido terapéutico reemplaza al menos un bucle.

19. Un ácido nucleico molécula que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1.

20. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 20.

22. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

23. Un procedimiento de expresión de una proteína Tf de fusión que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 21 en condiciones que expresan la proteína de fusión codificada.

24. Un procedimiento de expresión de una proteína Tf de fusión que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 22 en condiciones que expresan la proteína de fusión codificada.

25. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que la proteína de Tf de fusión se expresa en la presencia de un agente que evita la glicosilación.

26. Una célula huésped de la reivindicación 21 o 22, en la que la célula es procariótica o eucariótica.

27. Una célula huésped de la reivindicación 26, en la que la célula es una célula de levadura.

28. Un animal transgénico no humano que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

29. Un procedimiento de producción de una proteína Tf de fusión que comprende aislamiento de una proteína de fusión de un animal transgénico de la reivindicación 28.

30. Un procedimiento de la reivindicación 29, en la que la proteína de Tf de fusión comprende lactoferrina.

31. Un procedimiento de la reivindicación 30, en la que la proteína de fusión se aísla de un fluido biológico del animal transgénico.

32. Un procedimiento de la reivindicación 30, en la que el fluido es suero o leche.

33. Un procedimiento de incremento de la semivida en suero o estabilidad en suero de una proteína o péptido terapéutico, que comprende la expresión de dicha proteína o péptido terapéutico como una proteína de fusión con una proteína de transferrina (Tf), en la que:

dicha proteína de Tf comprende al menos una mutación que reduce o evita la glicosilación;

de manera que la proteína de transferrina (Tf) muestra glicosilación reducida.

\vskip1.000000\baselineskip

34. Una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la que la proteína o péptido terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en hormonas, proteínas de matriz, inmunosupresores, broncodilatadores, agentes cardiovasculares, enzimas, agentes CNS, neurotransmisores, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento, apéptidos antivirales, péptidos inhibidores fusogénicos, citoquinas, Iinfoquinas, monoquinas, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, factores de diferenciación, factores angiogénicos, ligandos receptores, proteínas asociadas a cáncer, antineoplásicos, péptidos virales, péptidos antibióticos, proteínas de sangre, proteínas antagonistas, factores de transcripción, factores antiangiogénicos, proteínas o péptidos antagonistas, antagonistas receptores, anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, y moléculas de adhesión a células.

35. Una proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína terapéutica es un anticuerpo o su fragmento.

36. La proteína de fusión de la reivindicación 35, en la que el anticuerpo o su fragmento comprende al menos una CDR.

37. La proteína de fusión de la reivindicación 35, en la que el anticuerpo o su fragmento es un anticuerpo de una sola cadena.

38. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una citoquina.

39. La proteína de fusión de la reivindicación 38, en la que la citoquina se selecciona entre el grupo que consiste en IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, factor estimulante de colonias de garnulocitos-macrófagos, factor estimulante de colonias de garnulocitos, factor activador de plaquetas, eritropoyetina, TNF\alpha, llinfotoxlna-\alpha, Ilinfotoxina-\beta, Ieucorregulina, factor inhibidor de la migración de macrófagos, neuroleuquina, leptina, IFN\alpha, IFN\beta, IFNy, IFNo, trombospondina 1, THB82, THB83, THB84 y quimioquina.

40. La proteína de fusión de la reivindicación 39, en la que la citoquina es IFN\beta.

41. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una hormona.

\newpage

42. La proteína de fusión de la reivindicación 41, en la que la hormona se selecciona entre el grupo que consiste en proinsulina, insulina, hormona de crecimiento 1, hormona de crecimiento 2, factor de liberación de la hormona de crecimiento, factor de crecimiento I de tipo insulina, factor de crecimiento II de tipo insulina, proteína I de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBP-1), IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, IGFBP-7, cadena \beta de gonadotropina coriónica, cadena \alpha de gonadotropina coriónica, hormona \beta luteinizante, hormona \beta estimuladora de folículos, hormona \beta estimuladora de tiroides, prolactina, pro-opiomelanocortina, corticotrofina (ACTH), \beta-lipotropina, hormona \alpha estimuladora de melanocitos (\alpha-MSH), \gamma-lipotropina, \beta-MSH, \beta-endorfina y péptido de lóbulo intermedio de tipo corticotrofina (CLIP).

43. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es un factor de crecimiento.

44. La proteína de fusión de la reivindicación 43, en la que el factor de crecimiento se selecciona entre el grupo que consiste en factor de crecimiento-\alpha derivado de plaquetas (PDGF-\alpha), PDGF-\beta, hormonas esteroides, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de fibroblasto tales como factor I de crecimiento de fibroblasto (FGF1), FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, angiogenina, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor de crecimiento neurotrófico ciliar, factor de crecimiento-\alpha de transformación (TGF-\alpha), TGF-\beta, factor-\alpha de crecimiento nervioso (NGF-\alpha), NGF-\beta, inhibidor de tejido de metaloproteinasa 1 (TIMP1), TIMP2, TIMP3, TIMP4 y estimulador I de macrófagos.

45. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una proteína de matriz.

46. La proteína de fusión de la reivindicación 45, en la que la proteína de matriz se selecciona entre el grupo que consiste en colágeno I, colágeno II, colágeno III, colágeno IV, colágeno V, colágeno VI, colágeno VII, colágeno VIII, colágeno IX, colágeno X, colágeno XI, y colágeno XII, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMB1, LAMB3, LAMC1, nidógeno, \alpha-tectorina, \beta-tectorina y fibronectina.

47. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una proteína de sangre.

48. La proteína de fusión de la reivindicación 47, en la que la proteína de sangre se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína de suero nativa, un factor de coagulación de sangre, antitrombina 3, antitripsina alfa-1, activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, una inmunoglobulina, factor von Willebrand, fibronectina, fibrinógeno, trombina y hemoglobina.

49. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una enzima.

50. La proteína de fusión de la reivindicación 49, en la que la enzima se selecciona entre el grupo que consiste en un factor de coagulación, una metaloproteínasa de matriz, adenosina desaminasa, una proteína quinasa activada por mitógeno, una quinasa y una fosfatasa.

51. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es un factor de transcripción.

52. La proteína de fusión de la reivindicación 51, en la que el factor de transcripción se selecciona entre el grupo que consiste en Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, NFYB, Hap2, GATA-1, GATA-2, GATA-3, GATA-4, GATA-5, GATA-6, FOG2, Eryf1, TRPS1, NF-E2, NFE3, NF-E4, TFCP2, Oct-1, HOXB2, HOX2H, homólogo sin pelo, MADH1, MADH2, MADH3, MADH4, MADH5, MADH6, MADH7, MADH9, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 y STAT6.

53. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es una proteína asociada a cáncer.

54. La proteína de fusión de la reivindicación 53, en la que la proteína asociada a cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en p16, p53, p63, p73, BRCA1, BRCA2, proteína de interactuación de CTBP, DMBT1, HRAS, NCYM, FGR, myb, raf1, erB2, VAV, c-fos, e-fes, c-jun, MAS1, pim-1, TIF1, c-frns, EGFR, erbA, c-src tirosina quinasa, c-abl, N-ras, K-ras, jun-B, c-myc, RB1, DCC, APC, NF1, NF2, y bcl-2.

55. La proteína de fusión de la reivindicación 34, en la que la proteína o péptido terapéutico es un péptido inhibidor fusógenico.

56. La proteína de fusión de la reivindicación 55, en la que el péptido inhibidor fusógenico se selecciona entre el grupo que consiste en VIH T-20, VIH T-1249, RSV T786, RSV T1584 y RSV T112.

57. La proteína de fusión de la reivindicación 56, que se expresa en la presencia de tunicamicina.

58. La proteína de fusión de reivindicaciones 1-18, en la que la proteína de Tf es lacto transferrina.

59. La proteína de fusión de la reivindicación 4 ó 5, en la que la Tf comprende al menos un aminoácido sustitución, supresión o adición en un resto de aminoácido que corresponde a un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp 63, Gly 65, Asp 392, Tyr 95, Tyr 426, Tyr 188, Tyr 514, Tyr 517, His 249, His 585, Lys 206, His 207 y Arg 632.

60. Una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.

61. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que la mutación es un sitio de glicosilación ligado a N que comprende la secuencia N-X-SfT.

62. La proteína de fusión de la reivindicación 61, en la que la secuencia N-X-SfT secuencia comienza en un aminoácido que corresponde a N413 o N611 de la SEQ ID NO: 3.

63. La proteína de fusión de la reivindicación 61, en la que la proteína de Tf carece de glicosilación ligada a N.

64. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína Tf está sin glicosilar.

65. Una proteína de fusión purificada que comprende una proteína Tf que comprende mutación en un sitio de glicosilación N-X-SfT ligado a N fusionado a al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que la proteína de transferrina muestra glicosilación reducida cuando se compara con una proteína de Tf glicosilada completamente y en la que la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico está aumentada por encima de la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico en un estado no fusionado.

66. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína Tf se modifica en S32 para reducir la O glicosilación.

67. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó 65, en la que la proteína de transferrina es una transferrina humana.

68. La proteína de fusión de la reivindicación 67, en la que la transferrina comprende la SEQ ID NO: 3.

69. La proteína de fusión de las reivindicaciones 1, 15 ó 65, en la que la proteína de transferrina es una variante de corte y empalme de transferrina.

70. La proteína de fusión de las reivindicaciones 1 ó 65, en la que dicha proteína de fusión incrementa la estabilidad in vitro de al menos una proteína o péptido terapéutico.

71. La proteína de fusión de reivindicaciones 1 ó 65, en la que dicha proteína de fusión incrementa la biodisponibilidad de al menos una proteína o péptido terapéutico.

72. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión se une a hierro.

73. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión es capaz de cruzar una barrera sangre cerebro.

74. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó 65, en la que la proteína de Tf se conecta a al menos una proteína o péptido terapéutico por un engarce péptido.

75. La proteína de fusión de la reivindicación 74, en la que dicho engarce es menos de 50 restos de aminoácido.

76. La proteína de fusión de la reivindicación 74, en la que dicho engarce comprende un tramo de poliglicina.

77. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 65, en la que dicha proteína de Tf de fusión muestra unión de carbonato reducida.

78. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó 65, en la que dicha proteína de fusión contiene una o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido comparado con una secuencia de tipo salvaje y no es capaz de cruzar una barrera sangre cerebro.

79. Una composición que comprende una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 34-78.

80. Uso de una proteína de transferrina que muestra glicosilación reducida para incrementar la semivida en suero o estabilidad en suero de una proteína terapéutica, en la que dicha proteína de transferrina está condensada a dicha proteína terapéutica para formar una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 ó 34 a 78.