CN114158523A - 一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，包括如下步骤：(1)0‑4周进行高脂饲料喂养，第5周开始‑第7周连续三天分别经兔耳缘静脉同时注射肥大细胞、血小板，24h小时后经耳缘静脉注射牛血清蛋白连续3天，再进行4周高脂饲料喂养；(2)分别于高脂饲养前、第4周末、第7周末、第11周末经兔耳中动脉采血4ml进行甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)及低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoprotein‑C,LDL‑C)水平进行测定。(3)分别于高脂饲养前、第4周末、第7周末、第11周末对各组实验兔的腹主动脉斑块进行二维超声成像、彩色多普勒血流成像(colordopplerflow imaging,CDFI)及病理学检查。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种兔改良腹主动脉粥样斑块模型的建立方法。
背景技术
近来，越来越多的证据表明，肥大细胞(mast cells，MCs)在动脉粥样硬化的形成、进展及斑块稳定性中发挥重要作用。例如通过分泌促炎性细胞因子，促进单核细胞及淋巴细胞等炎症细胞聚集；通过增加胆固醇积聚而促进泡沫细胞形成；通过分泌的中性蛋白酶激活基质金属蛋白酶，影响斑块稳定性等。
动脉粥样硬化被认为是一种累及大中动脉的慢行炎症性疾病，多种免疫细胞在动脉粥样硬化进展中发挥重要作用。20世纪90年代，研究发现在动脉粥样硬化形成的过程中，MCs聚集在动脉内膜及外膜层，初步提出MCs参与动脉粥样硬化进程。随着研究深入，越来越多的证据表明，MCs在动脉粥样硬化中发挥重要作用，。
目前，研究认为MCs通过其表面的趋化因子受体3(chemotacticfactorreceptor3。CCR3)与动脉粥样硬化斑块中表达的嗜酸细胞活化趋化因子CCLl 1结合而向病变部位聚集。另外趋化因子CXCLl、SCF可能在肥大细胞祖细胞向病变血管聚集中发挥一定作用。在血小板的作用下进入病变部位的MCs可进一步促进其他炎症细胞的浸润，促进动脉粥样硬化形成。
在动脉粥样硬化病变部位MCs主要分布于动脉内膜及外膜中。1995年Kovanen等研究发现MCs与不稳定斑块存在潜在的联系，即破裂的冠状动脉粥样硬化斑块中MCs颗粒数量明显增加。而后Bot等研究发现MCs与斑块稳定性存在因果联系，激活ApoE基因敲除小鼠的MCs建立颈动脉粥样硬化模型，病变部位MCs激活后明显增加斑块内出血的发生率，而且斑块中细胞凋亡的比例也明显增多，均提示斑块不稳定。
有研究表明,对实验兔进行外源性球蛋白的注射能够使其产生全身性的免疫反应，使动脉粥样硬化局部的炎症反应和氧化应激更严重，在肥大细胞和血小板对内膜损伤的基础上加速斑块的形成。本实验均选取雄性实验兔，避免了雌激素对内皮细胞的保护作用，抑制斑块形成。
目前，缺乏一种死亡率低的改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法。
发明内容
本发明提供了一种死亡率低的改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法。
为了解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，包括如下步骤：(1)0-4周进行实验兔的高脂饲料喂养，第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射肥大细胞、血小板，24h小时后经耳缘静脉注射牛血清蛋白连续三天，再进行4周高脂饲料喂养(图1)；
(2)分别于高脂饲养前、第4周末、第7周末、第11周末经兔耳中动脉采血4ml进行甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-C,LDL-C)水平进行测定；
(3)分别于高脂饲养前、第4周末、第7末、第11周末对各组实验兔的腹主动脉斑块进行二维超声成像、彩色多普勒血流成像(color doppler flow imaging,CDFI)及病理学检查。
进一步地，在步骤(1)中，所述的实验兔为雄性新西兰大白兔。
进一步地，在步骤(2)中，选取4周龄的雄性新西兰兔，进行4周高脂饲料的高脂喂养，于第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射1ml肥大细胞、0.2ml血小板，24h后经耳缘静脉注射小牛血清白蛋白连续三天，再继续4周的高脂喂养。
更进一步地，在步骤(2)中，高脂饲料配方为：常规兔饲料86.5％，猪油5％，蛋黄粉7.5％，胆固醇1％)。
进一步地，在步骤(2)中，所述的肥大细胞注射量为1.5×107个/ml，小牛血清白蛋白的注射剂量为250mg/kg。
有益效果：本发明缩短造模时间，利用该方法可以降低死亡率，改良后的方法是一种无创的，提高成模率。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明高脂喂养-肥大细胞+血小板、小牛血清白蛋白-高脂喂养法构建兔腹主动脉动脉粥样硬化模型，不仅提高成模率，还可以降低死亡率。
附图说明
图1为本发明的技术路线图
图2本发明的肥大细胞甲苯胺蓝染色图；
图3为本发明的注射肥大细胞+血小板图；
图4为本发明的注射小牛血清蛋白图；
图5为本发明的Esaote MyLab Twice彩色多普勒超声诊断仪图；
图6为本发明浸泡于多聚甲醛溶液中的兔腹主动脉标本图；
图7a为本发明的N组血清图；图7b为本发明S组第4w末血清图；图7c为本发明S组第7w末血清图；图7d为本发明S组的11w末血清图。
图8为本发明的N组图；
图9为本发明的S组第4w末图；
图10为本发明的S组第7w末图；
图11为本发明的S组第11w末图；
图12A为本发明的N组图；图12B为本发明的S组第4w末图；图12C为本发明S组第7w末图；图12D为本发明的S组第11w末图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本发明的一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，包括如下步骤：(1)0-4周进行实验兔的高脂饲料喂养，第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射肥大细胞、血小板，24h小时后经耳缘静脉注射牛血清蛋白连续3天，再进行4周高脂饲料喂养；所述的实验兔为雄性新西兰大白兔。
(2)分别于高脂饲养前、第4周末、第7周末、第11周末经兔耳中动脉采血4ml进行甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-C,LDL-C)水平进行测定；
选取4周龄的雄性新西兰兔，进行4周高脂饲料的高脂喂养，于第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射1ml肥大细胞、0.2ml血小板，24h后经耳缘静脉注射小牛血清白蛋白连续三天，再继续4周的高脂喂养。高脂饲料配方为：常规兔饲料86.5％，猪油5％，蛋黄粉7.5％，胆固醇1％。所述的肥大细胞注射量为1.5×107个/ml，小牛血清白蛋白的注射剂量为250mg/kg。
(3)分别于高脂饲养前、第4周末、第7末、第11周末对各组实验兔的腹主动脉斑块进行二维超声成像、彩色多普勒血流成像(color doppler flow imaging,CDFI)及病理学检查。
试验例1
一、主要试剂耗材与设备
试剂：1640基础培养基：gibco 31800-022，F12基础培养基：gibco 31200-024，1％青链霉素双抗：gibco 1902417，谷氨酰胺：gibco 1894153，胎牛血清：gibco10099-141，0.25％胰酶：gibco 1894145，IL-3：Peprotech 213-13-10，SCF：Peprotec250-03-10；
耗材：6孔细胞培养板(corning)、15ml离心管(corning)、1.5ml离心管(axygen)、各量程吸头(axygen)、0.22μm滤器(millipore)。
设备：Esaote，MyLab Twice彩色多普勒超声：意大利百胜公司；细胞培养箱：
力康生物HF-100；低速离心机、SCILOGEX DMO-412、倒置显微镜：奥林巴斯；CKX41、超净工作台：珠江再鑫；EVL-53、移液器：eppendorff；4℃/-20℃
冰箱：海尔；水浴锅：CFYQYB YLE-1000。
二、实验方法
1.实验动物及分组
1.1实验动物的选取
健康的雄性1月龄新西兰兔60只，平均体重均由昆明医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证SCXK(滇)2015-0004。所有有关实验动物的操作均按照中华人民共和国卫生部制定的第55号令(1998年1月25日发布)中的医学实验动物管理实施细则执行，实验经昆明医科大学伦理委员会批。
1.2实验动物的分组
60只1月龄的雄性新西兰兔随机平均分为两组:实验组(Experiment，E组)、对照组(Normal，N组)每组各30只。
2.肥大细胞培养
2.1诱导药物配制：
(1)IL-3：将10ug IL-3粉末溶解于500ul超纯水中配制成20ug/ml储存液-20备用。
(2)SCF：将10ug SCF粉末溶解于500ul超纯水中配制成20ug/ml储存液-20备用。
2.2、肥大细胞专用培养基配制：
F12诱导培养基：
超净工作台内取84ml DMEM/F12基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入15ml FBS、1ml双抗、0.07％β-巯基乙醇、20ng/ml CSF、30ng/ml IL-3，0.22um过滤器过滤后转移至新的瓶内，盖紧瓶盖。瓶子上标明培养基名称、配制日期、配制人后缠紧封口膜，4度冰箱保存备用。
1640促成熟培养基：
超净工作台内取84ml 1640基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入15ml FBS、1ml双抗、0.07％β-巯基乙醇、20ng/ml CSF、30ng/ml IL-3，0.22um过滤器过滤后转移至新的瓶内，盖紧瓶盖。瓶子上标明培养基名称、配制日期、配制人后缠紧封口膜，4度冰箱保存备用。
2.3、肥大细胞培养：
(1)耳缘静脉注射空气栓塞处死乳兔(两周龄)，75％酒精浸泡消毒3min。转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。
(2)剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。
(3)使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞，如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。
(4)使用F12肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆时(约3周)更换为1640促成熟培养基，培养至4-6周时肥大细胞诱导成熟，可以进行肥大细胞注射(图2)。
3.血小板分离
从兔耳中动脉采血4ml加入2％EDTA-Na2抗凝，以200g离心10min，取上层血浆，以1500g离心15min后弃去上清，得到血小板。
4.造模过程
4.1实验组(Experiment，E组)：
(1)第0-4周进行高脂饲料喂养：配方：常规兔饲料86.5％，猪油5％，蛋黄粉7.5％，胆固醇1％，经过高压，熟化，灭菌(江苏协同生物工程有限公司)。
(2)第5-7周肥大细胞、血小板、小牛血清白蛋白注射
肥大细胞注射量为1.5×107个/ml，血小板注射量为0.2ml，分别于兔两根耳缘静脉注射1ml肥大细胞、0.2ml血小板，连续三天注射，24h后经兔耳缘静脉注射小牛血清白蛋白，连续注射三周(图3、图4)。
(3)第8-11周每天给予充足的水和高脂饲料。
4.2对照组(Normal，N组)：
(1)第0-4周进行普通饲料喂养(江苏协同生物工程有限公司)；
(2)第5-7周生理盐水注射；
(3)第8-11周每天给予充足的水和普通饲料。
5.血脂指标的测定
于造模开始前、第4周末、第7周末、第11周末对所有实验兔的血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白-C(low densitylipoprotein-C，LDL-C)水平进行测定。
方法：经兔耳缘中央动脉采集兔全血2ml，注入抗凝管，静置1h后离心10min，转速3000r/min，取血清保存在-20℃条件下，利用全自动生化分析仪进行血脂指标的测定。
6.兔腹主动脉斑块的二维超声及彩色多普勒血流成像
分别于造模开始前、第4周末、第7周末、第11周末观察两组实验兔的斑块模型制备情况行超声评价。仪器：意大利百胜公司Esaote MyLab Twice彩色多普勒超声诊断仪(图5)。9L线阵探头，频率8-12MHz。
二维超声：备皮并充分暴露实验兔的腹部，将探头放置于实验兔腹部正中的皮肤表面，稍施压以排除肠管的干扰。在腹主动脉上至膈肌下至髂动脉分叉的范围内进行扫查：首先横切扫查以观察有无斑块的形成。
彩色及脉冲多普勒成像：发现斑块后，利用彩色多普勒血流成像(color dopplerflow imaging，CDFI)观察斑块处有无充盈缺损及血管狭窄的情况。
7.兔腹主动脉斑块的病理组织学检查及观察
7.1兔腹主动脉标本的取材
处死：利用24号BD静脉留置针于兔耳缘静脉建立静脉通道，用静脉注射过量戊巴比妥钠的方式处死实验兔。
取材：暴露实验兔的腹部，沿腹白线开一个纵行切口，依次取出腹部脏器，分离出实验兔的腹主动脉，截取膈肌以下至髂动脉分叉处的腹主动脉。
固定：立即用生理盐水将腹主动脉标本冲洗干净，并放入4％的多聚甲醛溶液中(图6)。
7.2兔腹主动脉标本的大体油红O染色
(1)从4％的多聚甲醛溶液中取出冲洗干净、完整的兔腹主动脉标本，流水冲洗20min，洗去表面及内部的多聚甲醛溶液，用显微剪纵向剪开，双蒸水浸洗，将腹主动脉平整展开。
(2)取事先配好的油红O储备液(油红O 0.5g，98％异丙醇100ml)60ml，加入蒸馏水至100ml并混合均匀，放置10min后配制成油红O染色液。将标本放置于油红O染色液中进行染色，染色时间为2-4h。
(3)利用70％的乙醇溶液对标本进行浸洗，至底色呈白色，斑块呈红色后取出。
(4)利用蒸馏水洗去残留的乙醇，用4％的多聚甲醛浸泡并放入4℃的冰箱中保存。隔夜后在数码照相机下拍照。
三、实验结果
1.血脂检测
兔血浆总胆固醇(TC)含量(mmol/L，mean±SD)如表1所示：
表1
注：对同一喂养时间不同实验组兔血浆TC含量行方差分析，F为方差值，进一步两两比较，*P＜0.05
对同一喂养时间不同实验组兔血浆总胆固醇(TC)含量行方差分析，总体差异均有统计学意义(P＜0.05)，对各喂养时间兔血浆TC含量进行两两比较，造模开始前均无统计学意义(P＞0.05)，第4w末、第7w末、第11w末差异均有统计学意义(P＜0.05)，第11W周末E组TC含量最高，造模开始前含量最低。表明实验兔均产生了血脂代谢的异常，且随着喂养时间的延长，TC含量逐渐增高。血液标本也由造模开始前的清亮逐渐变为上层有油脂的沉积(图7)。兔血浆甘油三脂(TG)含量(mmol/L，mean±SD)如表2所示：
表2
注：对同一喂养时间不同实验组兔血浆TG含量行方差分析，F为方差值,*P＜0.05与造模开始前比*P＜0.05
对同一喂养时间不同实验组兔血浆兔血浆甘油三脂(TG)含量行方差分析，总体差异均有统计学意义(P＜0.05)，对各喂养时间兔血浆TG含量进行两两比较，造模开始前均无统计学意义(P＞0.05)，第4w末、第7w末、第11w末差异均有统计学意义(P＜0.05)，第11W末TG含量最高，造模开始前含量最低。表明实验兔均产生了血脂代谢的异常，且随着喂养时间的延长，TG含量逐渐增高。兔血浆低密度脂蛋白(LDL-C)含量(mmol/L，mean±SD)如表3所示：
表3
注：对同一喂养时间不同实验组兔血浆TG含量行方差分析，F为方差值，进一步两两比较，*P＜0.05
对同一喂养时间不同实验组兔血浆(LDL-C)含量行方差分析，总体差异均有统计学意义(P＜0.05)，对各喂养时间兔血浆LDL-C含量进行两两比较，造模开始前均无统计学意义(P＞0.05)，第4w末、第7w末、第11w末差异均有统计学意义(P＜0.05)，第11W末LDL-C含量最高，表明实验兔均产生了血脂代谢的异常，且随着喂养时间的延长，LDL-C含量逐渐增高。
2.超声结果
N组：管壁光滑，内中膜复合体未见明显增厚；CDFI显示其内血流信号未见明显充盈缺损(图8)
S组高脂喂养4w后可观察到管壁毛躁，内中膜复合体稍增厚，CDFI显示其内血流信号可见充盈缺损(图9)；第7w末可观察到管壁毛糙，内中膜复合体增，CDFI显示其内血流信号可见充盈缺损(图10)；第11w末可观察到管壁毛糙，内中膜复合体明显增厚，形成斑块，CDFI显示其内血流信号可见明显充盈缺损。(图11)
3病理结果
大体油红O染色能够将血管内膜下的脂质染成红色，且红色面积越大，代表斑块的面积越大。N组血管内膜未见明显红色(图12A)，S组第4w末内膜下的脂质可见星点状红色(图12B)，S组第7w末削刮内膜下的脂质可见团块状红色(图12C)，S组第11w末的血管内膜下的脂质基本为红色(图12D)，表明S组11w末大体油红O染色斑块面积比(斑块面积/内膜总面积)是最大的，N组兔腹主动脉斑块的面积比明显小于S组，斑块从无到有，最后成膜后的斑块面积最大。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤：(1)0-4周进行实验兔的高脂饲料喂养，第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射肥大细胞、血小板，24h小时后经耳缘静脉注射牛血清蛋白连续3天，再进行4周高脂饲料喂养；
(2)分别于高脂饲养前、第4周末、第7周末、第11周末经兔耳中动脉采血4ml进行甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平进行测定；
(3)分别于高脂饲养前、第4周末、第7末、第11周末对各组实验兔的腹主动脉斑块进行二维超声成像、彩色多普勒血流成像及病理学检查。
2.根据权利要求1所述的改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的实验兔为雄性新西兰大白兔。
3.根据权利要求2所述的改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，其特征在于：在步骤(2)中，选取4周龄的雄性新西兰兔，进行4周高脂饲料的高脂喂养，于第5周开始-第7周连续三天分别经兔耳缘静脉注射1ml肥大细胞、0.2ml血小板，24h后经耳缘静脉注射小牛血清白蛋白连续三天，再继续4周的高脂喂养。
4.根据权利要求3所述的兔改良腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，其特征在于：在步骤(2)中，高脂饲料配方为：常规兔饲料86.5％，猪油5％，蛋黄粉7.5％，胆固醇1％。
5.根据权利要求2所述的改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的肥大细胞注射量为1.5×107个/ml，小牛血清白蛋白的注射剂量为250mg/kg。
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| 杨寒凝: "炎症介导的靶向超声微泡对兔腹主动脉斑块稳定作用的研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》, no. 2, 15 February 2021 (2021-02-15), pages 20 - 38 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114982719A (zh) | 2022-09-02 |
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