CN118286220A - 夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了夫拉平度(Flavopiridol)在制备治疗视网膜病变的药物中的应用。所述的夫拉平度能够通过抑制视网膜的炎症反应和新生血管生成来达到治疗视网膜病变的目的，特别是对高糖或缺氧导致的视网膜病变有积极的治疗效果。本发明提供的夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的新用途能够更有效地解决现有的临床问题，提供更优质的治疗方案，这些改进将有助于降低医疗成本，减轻患者和社会的经济负担，提高医疗资源的利用效率。通过临床转化，这些创新成果能够直接应用于患者，显著提高治疗效果，减少并发症和不良反应，从而改善患者的生活质量。本发明在临床转化方面具有重要意义，有望为医学发展和患者福祉做出积极贡献。

Description

夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种夫拉平度的新用途，特别涉及夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

视网膜病变是一组引起视网膜功能异常的疾病，包括糖尿病视网膜病变(DR)、黄斑变性、视网膜血管阻塞等。其中，糖尿病视网膜病变是最常见的类型之一。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致50岁及以上成年人失明和中度视力损害的第五大原因，已成为工作年龄人群的首位不可逆致盲性疾病。DR的临床病程进展迅速，难以逆转，导致严重的视功能损害和沉重的社会经济负担。按照临床疾病分期，可将DR分为：非增殖性糖尿病视网膜病变NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)两大类。NPDR代表DR的早期阶段，主要特征是血管通透性增加和毛细血管闭塞。在这个阶段，患者往往没有明显的临床症状，但视网膜已经出现了如微动脉瘤、出血和硬渗出等病理性改变。然而，DR的进展并不止步于此。进入PDR这一较晚期阶段，其主要特征是新生血管的形成。这些新生的异常血管非常脆弱，容易破裂出血，进而引发玻璃体出血。这种出血可能会进一步导致牵拉性视网膜脱离，最终造成严重的视力损害。

黄斑变性是一种主要影响45岁以上人群的眼底疾病，通常与年龄增长有关，因此也被称为年龄相关性黄斑变性(AMD)。AMD的主要症状包括视力下降、视物模糊，严重的情况下可能导致失明。黄斑变性分为干性和湿性两种类型。干性黄斑变性发展缓慢，主要影响中央视力，而湿性黄斑变性则可能导致更严重的视力丧失。湿性黄斑变性的特点是视网膜下长出新生血管，这些血管容易渗漏和出血，从而破坏黄斑，损害视力。

视网膜血管阻塞是指视网膜动脉或静脉发生阻塞，包括中央视网膜静脉阻塞(CRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)和视网膜动脉阻塞等。这些病变导致视网膜血液供应受阻，引起视网膜缺血、缺氧和功能障碍。这种病变通常与动脉硬化、高血压等全身性疾病有关，也可由血管炎症、血栓形成、血液成分改变及血流状态改变等因素引起。视网膜血管阻塞的主要症状包括突然和严重的视力丧失、视野缺损、视物变形等。

治疗视网膜病变的方法包括药物治疗、激光治疗和手术治疗等。药物治疗主要包括注射抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)药物和类固醇类药物，用于控制血管渗漏和新生血管形成。激光治疗主要用于黄斑变性和视网膜血管阻塞的治疗，可减轻黄斑区水肿和渗漏，防止新生血管形成。对于严重的病变，如视网膜脱离和玻璃体出血，可能需要进行手术治疗，包括玻璃体切除术和视网膜重建手术。总的来说，视网膜病变是一组常见的眼部疾病，严重影响患者的视力和生活质量。及时诊断和治疗对于预防和延缓病情进展至关重要。

夫拉平度也被称为Flavopiridol、Lapatinib，是一种竞争型的CDK广谱抑制剂，抑制CDK1，CDK2，CDK4的IC50分别为30，170，100nM。夫拉平度的化学名称为2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]苯并吡喃

-4-酮，化学式为C₂₁H₂₀ClNO₅，CAS No.:131740-09-5，化学结构式如下所示：

目前，夫拉平度主要用于抗肿瘤治疗。作为CDK广谱抑制剂，夫拉平度可以抑制细胞周期进展，使其停在G1期或G2期。夫拉平度作用于多种肿瘤细胞系，具有细胞毒性，IC50为作用于LNCAP的16nM到作用于K562的130nM。夫拉平度也有效抑制糖原合成激酶-3(GSK-3)的活性，IC50为280nm。与其他CDKs相比,夫拉平度抑制CDK7活性时效果稍弱，IC50为875nM。夫拉平度(0.5μM)抑制pSer807/811Rb和pThr199 NPM，而在pThr821 Rb上观察到轻微变化。夫拉平度也降低全部RNA聚合酶II水平及RNA聚合酶II在CTD重复序列在Ser2 Ser5位点磷酸化。

目前，尚未有将夫拉平度用于治疗视网膜病变的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的新用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明首先提出了夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的应用，所述的夫拉平度的结构式如下所示：

其中，优选的，所述的夫拉平度通过抑制视网膜的炎症反应和新生血管生成来达到治疗视网膜病变的目的。

其中，优选的，所述的视网膜病变是由高糖或缺氧导致的视网膜病变。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、提高治疗效果：本发明提供了夫拉平度在制备治疗视网膜病变的药物中的新用途能够更有效地解决现有的临床问题，提供更优质的治疗方案。通过临床转化，这些创新成果能够直接应用于患者，显著提高治疗效果，减少并发症和不良反应，从而改善患者的生活质量。

2、降低医疗成本：本发明的实施可能带来医疗流程的优化、治疗周期的缩短或药物用量的减少等效果。这些改进有助于降低医疗成本，减轻患者和社会的经济负担，提高医疗资源的利用效率。

3、促进医学进步：本发明的临床转化不仅能够推动相关领域的医学发展，还可能为其他疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。通过不断积累临床数据和经验，医学界可以更深入地了解疾病的发病机制和影响因素，为未来的医学研究奠定坚实基础。

4、提升患者满意度：本发明的应用能够改善患者的治疗体验和效果，提高患者对医疗服务的满意度。这有助于增强医患之间的信任和合作，促进医疗服务的持续改进和提升。

总之，本发明在临床转化方面具有重要意义，有望为医学发展和患者福祉做出积极贡献。

附图说明

图1为Flavopiridol对HUVECs的细胞毒性结果；

图2为Flavopiridol抑制炎症相关和血管生成相关mRNA和蛋白的表达；

其中，(A)NLRP3、HIF-1α、VEGFA、ICAM-1、MCP-1、TNF-α和IL-1β在正常对照组、HG组、HG+2μM和HG+5μM组中mRNA表达水平的定量分析；(B)NLRP3、HIF-1α、VEGFA、ICAM-1、MCP-1、TNF-α和IL-1β在正常对照组、HG组、HG+2μM和HG+5μM组中蛋白的表达水平；(C)NLRP3、HIF-1α、VEGFA、ICAM-1、MCP-1、TNF-α和IL-1β在正常对照组、HG组、HG+2μM和HG+5μM组中蛋白的表达水平的定量分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；

图3为VEGFA的免疫荧光染色；

其中，(A)免疫荧光染色VEGFA(红色)、鬼笔环肽(绿色)、细胞核(蓝色)和合并图像，标尺＝50μm；(B)荧光强度定量分析。**P<0.01；***P<0.001；

图4为Flavopiridol抑制高糖诱导HUVECs的迁移；

其中，(A)Transwell实验显示HUVECs的迁移，标尺＝50μm；(B)侵袭细胞的定量分析；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；

图5为Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs的血管生成；

其中，(A)成管实验观察HUVECs血管生成情况，标尺＝50μm；(B)分支长度定量分析；(C)小管数量定量分析；P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001.

图6为Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs的增殖和迁移；

其中，(A)划痕实验测定HUVECs的增殖和迁移，标尺＝50μm；(B)划痕愈合率的定量分析。***P<0.001；****P<0.0001；

图7为Flavopiridol抑制DR小鼠炎症相关和血管生成相关mRNA的表达；

其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；

图8为Flavopiridol对DR小鼠视网膜形态功能的影响；

其中，(A)视网膜切片H&E染色的代表性图，标尺＝20μm；(B)RGC存活率；**P<0.01；****P<0.0001；

图9为F4/80免疫荧光染色；

其中，(A)F4/80(红色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色合并图，标尺＝20μm；(B)荧光强度定量分析。***P<0.001；****P<0.0001；

图10为Flavopiridol抑制DR小鼠视网膜的炎症反应；

其中，(A)流式细胞术检测CD11b和F4/80细胞；(B)视网膜中CD11b⁺F4/80⁺细胞百分比的定量分析。****P<0.0001；

图11为Flavopiridol抑制OIR小鼠视网膜炎症相关和血管生成相关mRNA的表达；

其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；

图12为视网膜切片H&E染色的代表性图，红色箭头代表新生血管，标尺＝50μm；

图13为Flavopiridol抑制OIR小鼠视网膜的新生血管；

其中，(A)全视网膜铺片的代表性图；(B)新生血管面积百分比的定量分析；(C)无灌注区面积百分比的定量分析；****P<0.0001；

图14为SS-OCTA评估Flavopiridol抑制新生血管的功能；

其中，(A)SS-OCTA 18×18mm的代表性图；(B)平均血管密度百分比的定量分析；(C)视网膜无灌注区面积的定量分析；****P<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1Flavopiridol在治疗视网膜病变中的应用

1实验方法

1.1实验试剂

1.2抗体及药物

1.3细胞培养及实验分组：体外细胞实验选用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)置于含有10％胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)的DMEM培养基中培养。

实验分组：

(1)正常对照组(Control)：将HUVECs在DMEM培养基培养(含葡萄糖5mmol/L)；

(2)高糖模型组(HG)：将HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养；

(3)高糖+给药组(HG+2μM)：将HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养24小时，在加入2μmol/LFlavopiridol继续培养24小时；

(4)高糖+给药组(HG+5μM)：将HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养24小时，在加入5μmol/LFlavopiridol继续培养24小时；

1.4动物建模及实验分组

C57BL/6J小鼠，6-8周龄，体重20-24g，自由进食水，SPF级常规饲养，由北京维通利华公司提供。

糖尿病视网膜病变小鼠模型(DR模型)实验分组：将C57BL/6J雄性小鼠随机分为以下3组

(1)正常对照组(Control)：小鼠连续5天腹腔注射枸橼酸钠缓冲液；

(2)STZ模型组(DR)：小鼠按照50mg/Kg腹腔注射STZ溶液，连续5天，一周后监测血糖，连续两天血糖超过16.7mmol/L即模型建立成功，继续监测小鼠体重及血糖，直至8周处死取材；

(3)STZ+给药组(DR+Flav)：于STZ模型的第4周末给予小鼠右眼玻璃体腔注射20mM(3μl)Flavopirido溶液，对侧眼给予3μl生理盐水玻璃体腔注射，术毕红霉素眼药膏涂眼，返回笼中观察。

氧诱导视网膜病变模型(OIR模型)实验分组：将新生小鼠按笼随机分为以下3组

(1)正常对照组(Control)：新生小鼠在正常氧环境哺乳喂养，直至第17天(P 17)取材；

(2)OIR模型组(OIR)：将新生小鼠先放置于正常氧环境哺乳喂养7天(P7)，然后将小鼠与母鼠一同放置于密闭氧箱中5天，氧浓度维持在75％，于第12天(P 12)将小鼠与母鼠放回至正常氧环境继续哺乳喂养至P17取材；

(3)OIR+给药组(OIR+Flav)：将新生小鼠先放置于正常氧环境哺乳喂养7天(P 7)，然后将小鼠与母鼠一同放置于密闭氧箱中5天，氧浓度维持在75％，于第12天(P 12)给予小鼠右眼玻璃体腔注射20mM(1μl)Flavopirido溶液，对侧眼注射1μl生理盐水，术毕红霉素眼药膏涂眼，返回笼中观察。

1.5组织与细胞的RNA提取

(1)组织样本：将视网膜组织完整剥离，放于1.5ml RNase-Free离心管中，加入1mlTrizol溶液，混匀，冰上静置15分钟；

(2)细胞样本：将六孔板中细胞培养基弃掉，用PBS洗3次，每孔分别加入1mlTrizol溶液，吹打细胞使其脱落，并将含细胞的Trizol裂解液转移至新的1.5ml RNase-Free离心管中；

(3)裂解样本：振荡混匀，室温静置5分钟；

(4)加氯仿：每个样本加入250μl氯仿，振荡，室温静置15分钟；

(5)离心分层：4℃，13000rpm，离心15分钟，吸取400μl上清至新的离心管中；

(6)加异丙醇：加入400μl异丙醇，混匀；

(7)离心沉淀总RNA：4℃，13000rpm，离心20分钟，弃掉上清，留RNA沉淀；

(8)漂洗RNA：加入1ml 70％乙醇，4℃，13000rpm，离心5分钟，弃掉上清；

(9)漂洗RNA：加入1ml无水乙醇，4℃，13000rpm，离心5分钟，弃掉上清；

(10)挥发残留乙醇：瞬时离心10秒，室温使乙醇挥发；

(11)RNA溶液：每管加入10-20μl DEPC水，混匀；

(12)测定RNA浓度：紫外分光光度计测定RNA浓度。

1.6Real-Time PCR

(1)逆转录合成cDNA：按照说明书提供的方法将RNA模板逆转录成cDNA。

反应体系配制如下：

反应程序设置为：37℃15分钟；98℃5分钟；4℃5分钟；紫外分光光度计测定cDNA浓度，用DEPC水稀释cDNA，-20℃冰箱保存。

(2)RT-qPCR：按照说明书提供的方法配制反应体系，如下：

反应程序设置为：

温度时间循环

95℃10分钟1次

95℃10秒40次

60℃30秒

95℃15秒1次

60℃60秒1次

95℃15秒1次

4℃5分钟1次

反应结束后，对溶解曲线数据进行分析并计算。

(3)引物序列由生工生物工程公司合成，具体序列如下：

1.7Western Blot

(1)制胶：根据目标蛋白的分子量，选择7.5％-12.5％的SDS-PAGE下层胶及5％的上层胶，插入相应10孔或15孔蛋白梳，置于室温凝固待用；

(2)电泳：将胶板放置于电泳槽内，倒入电泳液，拔出梳子，分别加样蛋白Marker及蛋白样本。恒压70V电泳30分钟后，将电压调至110V直至电泳结束；

(3)转膜：采用湿转法，PVDF膜用甲醇激活，将蛋白转移至PVDF膜上，恒流300mA，转膜时间根据目标蛋白的分子量设定；

(4)封闭：将PVDF膜置于5％牛奶，室温，摇床，100分钟；

(5)一抗孵育：一抗稀释液配制一抗溶液，4℃,孵育过夜；

(6)洗一抗：TBST洗3次，10分钟/次；

(7)二抗孵育：TBST配制二抗溶液，室温，摇床，孵育90分钟；

(8)洗二抗：TBST洗3次，10分钟/次；

(9)ECL显影：化学发光仪显影并拍照记录，计算目的蛋白与α-Tubulin的相对定量。

1.8免疫荧光染色

(1)组织样本：将麻醉小鼠固定体位，经心脏灌注后，将眼球完整取出，修剪多余组织，将眼球放于眼球固定液中室温固定过夜，进行石蜡包埋切片；60℃拷片1小时，全自动研究染色机对组织切片进行干燥和脱蜡处理；微波加热煮沸ARbuffer 3分钟进行抗原修复，然后转至中低火加热20分钟，室温冷却，蒸馏水洗1次，3分钟；擦干组织周围的水分，用免疫组化笔圈定组织，将切片放置于湿盒内，加入3％H2O2孵育10分钟，PBS洗2次，每次3分钟；5％BSA孵育封闭60分钟，一抗孵育4℃过夜，PBS洗3次，每次5分钟；二抗孵育60分钟，PBS洗3次，每次5分钟；用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜拍照。

(2)细胞样本：弃掉细胞培养基，PBS洗1次，5分钟；4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；0.1％Triton透化30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；5％BSA孵育封闭60分钟，一抗孵育4℃过夜，PBS洗3次，每次5分钟；二抗或Actin-Tracker(鬼笔环肽)孵育60分钟，PBS洗3次，每次5分钟；用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜拍照。

1.9H&E染色

将麻醉小鼠固定体位，经心脏灌注后，将眼球完整取出，修剪多余组织，将眼球放于眼球固定液中室温固定过夜，进行石蜡包埋切片；先将切片进行二甲苯脱蜡；在依次放入75％、85％、无水乙醇中进行水化；用苏木精染液对切片进行染色，然后用自来水漂洗，接着用1％盐酸酒精进行分化，再水冲洗返蓝，最后加入伊红染液，流水冲洗；将染色后的切片依次放入75％乙醇、85％乙醇、无水乙醇、二甲苯中进行透明，中性树脂封片记录拍照。

1.10CCK-8实验

(1)在96孔板中每孔接种5000个HUVECs细胞(100μl/孔)，并设置6个复孔；

(2)按照实验需要，进行培养并给予不同浓度的Flavopirido药物刺激24小时；

(3)每孔加入10ul CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2小时；

(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光值并记录。

1.11划痕实验

(1)将HUVECs细胞以每孔5×104个接种板在6孔板，待细胞长至70％进行给予高糖及给药处理；

(2)用200μl黄枪头比着直尺，垂直在原来的培养基里划痕，每孔一道，枪头要垂直，不能倾斜；

(3)用PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，加入完全培养基，显微镜拍照；

(4)处理后0和24小时对细胞进行观察并拍照。

1.12Transwell实验

(1)取生长状态良好的细胞，消化、离心并用无血清培养基重悬，计数并调整细胞密度；

(2)将Transwell小室放入24孔板中，小室内外分别加入无血清培养基和含血清的培养基；

(3)将调整好密度的细胞悬液加入Transwell小室的上室，注意避免产生气泡，然后将24孔板放入细胞培养箱中培养；

(4)培养12小时后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室内的细胞；

(5)将小室放入4％多聚甲醛中固定细胞，然后用结晶紫染液染色；

(6)将染色后的小室放在显微镜下观察，拍照并记录结果。

1.13血管生成实验

(1)实验前一天将基质胶放于4℃冰箱溶解；

(2)将基质胶均匀铺在48孔板中，放入细胞培养箱中使其凝固，将准备好的细胞悬液加入培养板中，让细胞在基质胶上生长。

(3)将培养板放入细胞培养箱中培养，观察细胞的生长情况；

(4)待血管生成稳定后的4-6小时，将培养板取出，在显微镜下观察血管生成的情况并拍照记录结果。

1.14流式细胞术

将新鲜小鼠视网膜组织，PBS清洗3次；加入IV型胶原酶，室温消化15分钟；终止消化后，用Hank's平衡盐溶液清洗；再用TrypLE Express酶消化视网膜组织15分钟；终止消化后，用Hank's平衡盐溶液清洗；将组织通过70μm细胞过滤器制成单细胞悬液；进行F4/80和CD11b染色，4℃，30分钟；PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次，进行流式细胞仪检测。

1.15全视网膜铺片染色

将麻醉小鼠固定体位，经心脏灌注后，将眼球完整取出，修剪多余组织，将眼球放于4％多聚甲醛固定30分钟；在显微镜下将视网膜完整取出，PBS洗3次，每次5分钟；用0.5％triton X-100透化，4℃过夜，PBS洗3次，每次5分钟；加入异凝集素B4(Isolectin B4，IB4)染液(1:500)，4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5分钟；将视网膜组织置于防脱载玻片上，用剪刀将视网膜剪成四叶草的形状并轻柔铺平展开，滴加抗荧光淬灭剂于视网膜上，盖玻片封片，共聚焦显微镜拍照并记录。

1.16SS-OCTA

将小鼠麻醉后，给予双眼0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉和0.5％复方托吡卡胺散瞳；利用400kHz扫频源光学相干断层扫描血管成像(Swept-source optical coherencetomography angiography，SS-OCTA)捕捉小鼠散瞳后的视网膜血管成像；以小鼠视神经为中心点，采集18mm×18mm的矩形扫描图像；使用SS-OCTA平台的内置软件获取并导出所有原始数据。

1.17统计学分析方法

所有的实验均重复3次以上，用GraphPad Prism 9.0、ImageJ 1.8.0和FlowJo10.9.0进行数据分析和图表制作，数据结果用均数±标准差表示，用ANOVA或t-检验比较分析，以P<0.05为差异具有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001)。

2实验结果

2.1Flavopiridol的毒性检测

我们用CCK8来检测Flavopiridol对HUVECs的细胞毒性，并做了4个药物浓度梯度，分别为2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L和15μmol/L。将Flavopiridol与HUVECs共培养24小时后，进行CCK8检测，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值并计算细胞存活率。实验结果发现当药物浓度为2μmol/L和5μmol/L时，Flavopiridol对HUVECs无明显细胞毒性；而药物浓度增加至10μmol/L和15μmol/L，Flavopiridol对HUVECs的细胞毒性显著，且具有剂量依赖性(图1)。因此，本研究选用2μmol/L和5μmol/L的药物浓度作为后续的实验研究。

2.2Flavopiridol抑制炎症相关和血管生成相关mRNA和蛋白的表达

为了研究Flavopiridol对高糖诱导的HUVECs的作用，我们将高糖模型组的HUVECs分别与2μmol/L和5μmol/L Flavopiridol共培养24小时，然后分别检测DDX58以及炎症相关和血管生成相关的mRNA和蛋白的表达水平(图2)。实验研究发现，Flavopiridol可以明显抑制NLRP3,HIF-1α，VEGFA，ICAM-1，MCP-1，TNF-α和IL-1βmRNA和蛋白的表达水平，其抑制程度未见明显的药物剂量依赖性。

2.3Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs中VEGFA的表达

为了进一步验证Flavopiridol对VEGFA的抑制作用，我们利用免疫荧光染色，观察VEGFA在正常对照组，HG组，HG+2μM和HG+5μM组中的表达量变化(图3)。实验结果显示，Flavopiridol对VEGFA具有明显的抑制作用，且药物浓度为2μmol/L和5μmol/L时，其抑制程度未见明显差异。综合上述实验结果，我们发现Flavopiridol在炎症反应和血管生成方面具备强有效的抑制作用，这也进一步证明Flavopiridol具有治疗视网膜疾病的潜在能力。

2.4Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs的迁移

利用transwell实验研究Flavopiridol对高糖诱导的HUVECs迁移能力的影响(图4)，实验结果发现，HUVECs在高糖环境下细胞迁移的能力较正常对照组显著增强，而Flavopiridol可以有效逆转高糖诱导的HUVECs的迁移，其中药物浓度为2μmol/L和5μmol/L的Flavopiridol均有显著的抑制效果，2μmol/L的抑制效果趋于正常对照组，而5μmol/L则展现出更强的抑制效果。

2.5Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs的血管生成

为了验证Flavopiridol抑制新生血管的功能，我们利用血管生成实验来评估HUVECs的成管情况(图5)。实验结果显示，HG组HUVECs的新生血管的长度及数量较正常对照组明显增加；而经Flavopiridol处理后的HUVECs则血管生成明显被抑制，HG+2μM组的抑制效果趋于正常，而HG+5μM组的抑制效果更强。

2.6Flavopiridol抑制高糖诱导的HUVECs增殖和迁移

我们利用划痕实验来评估Flavopiridol对高糖诱导的HUVECs增殖和迁移的影响(图6)。实验结果显示，HG组HUVECs的增殖和迁移能力较正常对照组显著增强，而Flavopiridol能够有效逆转高糖对HUVECs的增殖和迁移。其中，HG+2μM组的抑制效果趋于正常，而HG+5μM组的抑制效果更强，综合上述实验结果，我们发现2μM Flavopiridol的治疗效果最佳。因此，后续体外实验验证的药物浓度为2μM。体外实验的初步探索与研究，我们确定Flavopiridol具有抑制HUVECs增殖、分化和迁移的能力，这也使我们确信Flavopiridol具有抗新生血管的功能，也为后续体内实验的进一步验证和确认提供理论基础。

2.7Flavopiridol抑制DR小鼠视网膜炎症相关和血管生成相关mRNA的表达

经上述的体外实验研究发现，Flavopiridol可以抑制炎症相关和血管生成相关因子。为进一步体内研究，我们首先构建STZ诱导的DR小鼠模型，由于该模型存在一定的局限性，主要体现在模拟PDR阶段的病理表现存在一定的差异。因此，在STZ诱导的DR小鼠模型中，我们侧重于观察DR早期NPDR阶段的病理表现，也更加关注视网膜的炎症反应。利用RT-qPCR技术检测DR小鼠视网膜中炎症相关和血管生成相关的mRNA表型指标(图7)。实验结果显示，NLRP3，HIF-1α，VEGFA，ICAM-1，MCP-1，TNF-α和IL-1βmRNA在DR模型组均显著升高，这也与体外实验的研究结果相一致。同时，Flavopiridol在DR小鼠视网膜中也展示出明显抑制炎症相关和血管生成相关mRNA的作用。

2.8Flavopiridol对DR小鼠视网膜形态功能的影响

为了验证Flavopiridol对DR小鼠视网膜形态功能的影响，我们利用H&E染色来观察视网膜的组织结构和细胞形态，DR+Flav组小鼠于DR4周给予玻璃体腔注射Flavopiridol溶液，于DR 8周取材，切片及染色(图8)。让我们惊喜发现的是Flavopiridol治疗后DR小鼠的视网膜神经节细胞(RGC)数量较DR模型组有明显的增多，我们推测可能是Flavopiridol的抗细胞凋亡作用，也可能Flavopiridol的抗炎作用使RGC的炎性损伤降低。

2.9Flavopiridol抑制DR小鼠视网膜的炎症反应

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，在炎症损伤中发挥重要的作用。我们利用免疫荧光染色技术，用F4/80标记巨噬细胞，观察Flavopiridol对DR小鼠视网膜炎症反应的影响(图9)。实验结果显示，F4/80在DR小鼠视网膜的表达明显增多，而Flavopiridol处理后的视网膜F4/80阳性细胞明显减少。

2.10Flavopiridol抑制DR小鼠视网膜的炎症反应

炎症的一个显著特征是大量的白细胞通过白细胞与内皮细胞相互作用从血液浸润到组织部位。为了进一步验证Flavopiridol能够抑制DR小鼠视网膜的炎症反应及免疫浸润，我们提取新鲜视网膜组织并制作成视网膜单细胞悬液，对CD11b标记的白细胞和F4/80标记的巨噬细胞进行标记(图10)。通过流式细胞数据分析，我们发现DR小鼠视网膜中的CD11b+F4/80+细胞数量较正常对照组明显升高，这也表明在DR发展的过程中会出现免疫浸润的现象，这也是DR发展的一个重要的病理过程。而在Flavopiridol治疗后，DR小鼠视网膜中CD11b+F4/80+细胞数量明显减少，这也意味着Flavopiridol可以通过减轻免疫浸润的方式降低视网膜炎症反应。

2.11Flavopiridol抑制OIR小鼠视网膜炎症相关和血管生成相关mRNA的表达

氧诱导视网膜病变(OIR)模型可以模拟PDR阶段的病理改变，有利于发病机制和潜在的治疗方法的研究。新生小鼠及其哺乳的母鼠从出生到P7天一直保持在室内空气中，视网膜血管正常发育。在P7天将小鼠暴露于75％的氧气，这可以显著抑制视网膜血管的生长。当小鼠在P12天时返回到室内空气时，无血管的视网膜变得缺氧，触发正常的血管再生和病理性的新生血管形成。新生血管在P17天时达到顶峰，随后逐渐消退，到P25天时视网膜几乎恢复了正常。为了继续验证Flavopiridol对PDR阶段视网膜新生血管的影响，我们构建了OIR小鼠模型。利用RT-qPCR技术检测OIR小鼠视网膜炎症相关和血管生成相关mRNA的表达水平(图11)。实验结果显示，NLRP3，HIF-1α，VEGFA，ICAM-1，MCP-1，TNF-α和IL-1βmRNA在OIR模型组均显著升高，与DR模型结果相一致。同时，Flavopiridol在OIR小鼠视网膜中也展示出明显抑制炎症相关和血管生成相关mRNA的作用。

2.12Flavopiridol对OIR小鼠视网膜形态功能的影响

为了验证Flavopiridol对OIR小鼠视网膜形态功能的影响，我们利用H&E染色来观察视网膜的组织结构和细胞形态。OIR模型最主要的特征是新生血管生成，因此，有助于我们探索Flavopiridol对视网膜新生血管的作用。我们给予P12天OIR小鼠玻璃体腔注射Flavopiridol溶液，于P17天取材，切片及染色(图12)。H&E染色结果显示，正常对照组小鼠无视网膜新生血管；OIR小鼠视网膜可见明显突出于内界膜的新生血管；而给予Flavopiridol治疗后的小鼠视网膜新生血管数量明显减少，且未观察到突出于内界膜的新生血管，这也说明玻璃体腔注射Flavopiridol可以抑制视网膜新生血管的生成。

2.13Flavopiridol抑制OIR小鼠视网膜的新生血管

为了更全面的评估Flavopiridol对视网膜新生血管的抑制效果，我们分别将正常对照组、OIR组和OIR+Flav组的视网膜进行全视网膜铺片IB4染色，利用共聚焦显微镜拍摄完整视网膜组织图片，并计算各组视网膜新生血管的面积以及视网膜无灌注区的面积(图13)。实验结果显示，正常对照组的视网膜组织形态较好，未见明显的新生血管及无灌注区；OIR组可见视网膜周边部血管区和中央部无灌注区交界处形成大量的新生血管芽；而OIR+Flav组视网膜相较于OIR组是视网膜新生血管及无灌注区明显减少。这也提示我们，Flavopiridol对视网膜新生血管有显著的抑制作用，同时还能一定程度的改善视网膜的无灌注区，这也让我们更加确信Flavopiridol在DR上的治疗潜力。

同时，我们进行了小鼠活体影像学SS-OCTA检测，SS-OCTA是一种基于扫频源光学相干层析的血管成像技术，具有高分辨率、高灵敏度和高穿透深度的特点，能够清晰地显示血管结构和血流状态，可以用于活体成像和组织分析。SS-OCTA可以观察视网膜血管和脉络膜毛细血管的微血管特征，并评估图像特征和视力之间的相关性。在眼科领域，SS-OCTA被广泛应用于诊断和评估各种疾病，如青光眼、糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性等疾病。我们研究发现，经过Flavopiridol治疗后的小鼠，其视网膜新生血管的数量明显减少，同时视网膜的无灌注区面积也相应减少，这充分说明Flavopiridol能够抑制视网膜新生血管的形成。并且，通过观察视网膜的血流情况，我们也发现给予Flavopiridol治疗后，视网膜的血流灌注较OIR模型组有一定程度的恢复。综上，我们验证了Flavopiridol对OIR小鼠视网膜的治疗作用(图14)。

Claims (3)

1.夫拉平度(Flavopiridol)在制备治疗视网膜病变的药物中的应用，所述的夫拉平度(Flavopiridol)的结构式如下所示：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的夫拉平度(Flavopiridol)通过抑制视网膜的炎症反应和新生血管生成来达到治疗视网膜病变的目的。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的视网膜病变是由高糖或缺氧导致的视网膜病变。