CN113907047B - 一种自身抗原表位诱导的eam小鼠模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种自身抗原表位诱导的自身免疫性心肌炎(Experimental Autoimmune Myocarditis，EAM)小鼠模型的建立方法，首次确定了AchR和自身免疫性心肌炎的关系，通过向造模用的小鼠注射AchR‑弗氏完全佐剂溶液、AchR‑弗氏不完全佐剂溶液和免疫辅助强化剂，产生针对心肌细胞M2胆碱能受体的抗体诱发自身免疫性心肌炎，建立的模型具有心肌细胞肥厚、心肌纤维化及心脏功能障碍等特征。同时，以18F‑FDG PET/CT心肌代谢显像为核心，结合心脏超声、心肌组织切片HE染色、心肌Mason染色及心肌组织免疫抗体特染等手段验证该小鼠模型相关的特征性改变。为自身免疫性心肌炎的进一步研究提供新的小鼠模型。

Description

一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法。
背景技术
心肌炎(Myocarditis)是一种心肌炎症细胞浸润和心肌细胞非缺血坏死为特征的炎症性疾病。心肌炎的临床表现差异很大，轻者从无明显临床症状，易被忽视，严重者心肌受损，导致心律失常、心源性休克或猝死。心肌炎的病因可分为感染性因素，如病毒、细菌、寄生虫、衣原体、真菌、原虫等，以及非感染性因素，如自身免疫病、化学和药物的毒素和过敏反应。
近2年，因使用PD-1/PD- L1单抗治疗肿瘤，以及病毒相关性免疫性心肌炎发病率升高，自身免疫性心肌炎受到高度的重视。它们主要是不同病因通过对心肌细胞的直接攻击作用以及破坏心肌细胞释放自身抗原，产生自身抗体形成间接、长期的二次打击。此外，越来越多的基础和临床的研究都表明由心肌炎向心肌病的演变主要是由进展性的自身免疫性攻击造成的。自身免疫引起的心脏免疫环境，从急性炎症阶段到肌病阶段变化，两者之间存在着相当大的认识差，然而这种由自身免疫导致的心功能紊乱及左室重构的机制至今仍不清楚，对于心肌炎发病机制和相关治疗的探索，一直是研究的热点和难点。建立完善免疫性心肌炎模型，对发病机制、药物开发和疾病治疗都有极大的推动作用。
实验性自身免疫性心肌炎(Experimental Autoimmunemyocarditis，EAM)小鼠是研究此类疾病经典的动物模型，其模型的建立为研究工作提供了一个环境可控、样本均一、费用经济的实验环境，为探索自身免疫性心肌炎机理提供了新途径。
目前，实验性自身免疫性心肌炎的种类主要分为由干酪乳杆菌细胞壁成分诱导、心肌自身抗原表位诱导、活化自身免疫细胞诱导及心肌自身抗原诱导的四种EAM模型。1.干酪乳杆菌细胞壁成分诱导的EAM模型是利用干酪乳杆菌细胞壁所含的鼠李糖和NO-乙酰基半乳糖胺可能与小鼠心肌有交叉抗原的原理导致心肌细胞破坏，抗原暴露，从而产生更多的抗心肌抗体。虽然该方法诱导的EAM模型心肌病理改变典型，群体发生率高，具有被广泛应用的潜质，但其发生机制还有待明确，以及干酪乳杆菌细胞壁成分如何引起小鼠不同部位的病理改变尚不清楚。2.心肌自身抗原表位诱导的EAM模型包括将人工合成的心肌肌凝蛋白分子614-627位多肽与等体积弗氏佐剂混合形成乳浊液，于BALB/c小鼠双侧腋下和腹股沟分3次注射，初次免疫后第14天，心肌细胞改变，局部出现炎性细胞浸润；第21天，血清肌钙蛋白-I达高峰，心肌细胞受损与炎症浸润更加严重；第60天，炎症基本消退，呈现间质纤维化。还有报道将重组C蛋白片段(317-647)与等体积弗氏佐剂混合形成乳浊液，于Lewis大鼠双侧后肢足垫区单次注射，免疫后第2周以急性、弥散性炎症浸润为主；第4周以纤维瘢痕形成为主要病理表现；第6周进入扩张型心肌病阶段。这种方法诱导的EAM模型，虽然注射时间短，成模相对较快，但其自身免疫性心肌炎发病程度严重，且免疫后第50天有75%的大鼠死于心衰，剩余存活的几乎均发展为扩张型心肌病，疾病进展较难控制，不利于后续实验研究。3.活化自身免疫细胞诱导的EAM模型包括从肌凝蛋白抗原表位诱导的EAM大鼠体内提取出自身免疫性CD4+T淋巴细胞，将其在体外培养后通过尾静脉输入正常的Lewis大鼠体内，可以引发心肌的持续性炎症反应以及心肌细胞的凋亡，6个月后大鼠出现心室扩张、心肌肥大并伴有大量纤维化。虽然该类造模方法更加科学合理、安全可靠，但是操作较为繁琐，影响因素众多，耗时相对较长，难以得到广泛应用。4.目前国内外较多采用是心肌自身抗原诱导的EAM模型，该类模型的优点是成功率高，死亡率低，模型稳定，病变典型，以严重的心肌破坏和炎性细胞浸润为特征，与人类病毒性心肌炎的病理过程极其相似。心肌自身抗原主要包括心肌肌凝蛋白、心肌C蛋白、ADP/ATP载体蛋白、β肾上腺素能受体、M2胆碱能受体等。有学者从猪心肌中提取并纯化心肌肌凝蛋白，与等体积完全弗氏佐剂混合形成乳浊液，于Lewis大鼠的双侧后肢足垫区多次注射造模，但这一造模过程中心肌肌凝蛋白的提取制备极其复杂，难度较大，限制了该模型的广泛应用。本发明建立的免疫性心肌炎小鼠模型属于自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型，是通过AchRα亚基97-116肽段经与弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）分别乳化后定量定时注射入C57BL/6小鼠，产生针对心肌细胞M2胆碱能受体的抗体，然后续惯注射由THP-1工具细胞诱导发育的树突状细胞，强化AchR抗原引起的自身免疫，进而成模。本方法成模时间适中，模型稳定, 有助于对实验性自身免疫性心肌炎开展进一步研究。
建立EAM小鼠模型后，对模型的特征进行有效和验证和描述为利用此模型开展后续研究非常重要。常见的验证方法包括心肌组织病理学检查，是观测心肌炎症及纤维化程度的首选方法，通常采用HE染色及Masson染色后，在光学显微镜下观察心肌病理改变尤其是肌丝、肌纤维的变化情况。虽然该方法是描述EAM模型的“金指标”，但是该手段是不可逆的，需处死模型动物以取得生物学样本，无法连续观察动物并开展后续研究。现有验证手段还包括心功能检查，通常采用心脏彩超技术检测心率、射血分数等指标，并计算左室短轴缩短率等；对于有的大鼠模型还可插管至左心室腔，连接压力换能器,记录左室压力曲线，获得左室收缩压峰值、左室舒张末压、等容期内左室压力最大变化速率等指标。虽然该方法是了解心肌改变程度和心脏结构改变的重要方法，但是单独的心脏超声检查难以直观反映心肌细胞代谢变化，且须结合各项参数，统计较为繁琐，左心室插管的操作对实验人员的技术水平也提出了较高的要求，还也会对模型鼠造成创伤可能影响后续研究的开展。现有验证方法还包括血清生化指标检测，采用ELISA法检测以IFN-γ为代表的血清炎症介质水平，以及肌酸激酶CK、乳酸脱氢酶LDH等。虽然该方法可以一定程度上反映心肌炎症水平和纤维化程度,但这些指标在体内往往波动较大，容易产生个体差异，指标稳定性难以完全把握。
因此，对于模型特征的准确描述和把握对于建立一个稳定的模型而言至关重要。本发明以树突状细胞作为免疫辅助强化剂，以AchR作为自身免疫抗原建立了一种EAM小鼠模型，并利用18F-FDG PET/CT心肌代谢显像，同时结合心脏超声、心肌组织切片HE染色、心肌Mason染色及心肌组织多免疫抗体特染等手段对模型进行了充分的特征性验证。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服上述现有技术中存在的缺陷，提供一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法；
本发明的另一个目的在于通过连续无创动态检测与心肌组织病理免疫染色验证建立的EAM小鼠模型相关的特征性改变。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法，所述建立方法包括向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液和AchR-弗氏不完全佐剂溶液，续惯注射免疫辅助强化剂，该免疫辅助强化剂是经工具细胞人急性单核细胞白血病细胞THP-1刺激培养的树突状细胞制得的细胞混悬液，以引发C57BL/6小鼠心肌肥大、心肌纤维化以及心脏功能障碍等，建立一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型；
其中，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液是由弗氏完全佐剂（CFA）和AchR肽段溶液乳化合成的；
所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液是由弗氏不完全佐剂（IFA）和AchR肽段溶液乳化合成的；
所述AchR肽段溶液中的溶质为AchRα亚基97-116肽段，溶剂为1×PBS溶液。
进一步地，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液的注射体积为150-250ul；所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液的注射体积为100-150ul。
进一步地，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液中，AchR肽段溶液与弗氏完全佐剂的体积比为1:1，AchR肽段溶液的浓度为150-250ug/ml：
所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液中，AchR肽段溶液与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1，AchR肽段溶液的浓度为350-450ug/ml。
所述树突状细胞是复苏从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，在THP-1专用培养基培养，得到细胞达0.5×106个/ml-2×106个/ml的细胞悬液；将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1-2ml，加入1.5-6µl诱导树突状细胞成熟混合因子A，混匀，培养36-48h；各孔用1×PBS清洗细胞，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1-2mL，和8-30µl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，培养12-36h，得到成熟树突状细胞；
进一步地，所述诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/µl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/µl的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/µl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50 mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS。
进一步地，所述诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/µl的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/µl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50 mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS。
进一步地，注射AchR-弗氏完全佐剂溶液、AchR-弗氏不完全佐剂溶液和续惯注射树突状细胞的具体步骤为：
在造模当天向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液，在造模第28-32天向造模用的小鼠注射AchR-弗氏不完全佐剂溶液，在造模第58-62天再向造模用的小鼠次注射AchR-弗氏不完全佐剂溶液。造模第67-70天，通过尾静脉注射树突状细胞液150-200ul，该细胞悬液为无菌1*PBS混悬液包含树突状细胞5×106个-5×107个细胞/ml，此后连续3-4周于相同时间点注射该混悬液。
在一些实施方案中，该建立方法还包括利用连续性的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像、心脏超声检查，以及心肌组织的HE染色、Mason染色和免疫抗体特染等手段验证该小鼠模型相关的特征性改变。为自身免疫性心肌炎的进一步研究提供新的稳定的小鼠模型。
进一步地，该小鼠模型在18F-FDG PET/CT心肌代谢显像中具有SUV mean值的特征性变化，可实现对小鼠的连续动态监测。
进一步地，应用高频探头对小鼠进行心脏超声检查，记录心率、左室短轴缩短率和射血分数等验证该小鼠模型心功能的特征性变化。同时进行了连续性的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像与心功能之间的相关性分析。进一步地，本发明比较了心脏超声检查过程中采用异氟烷并通过Tabletop动物麻醉机麻醉和采用传统的水合氯醛腹腔注射麻醉对C57小鼠心率的影响。本发明采用的麻醉方法可维持C57小鼠心率基本处于正常水平，操作过程无明显波动，避免了传统水合氯醛腹腔注射的麻醉方法使C57小鼠心率较正常大幅增快的影响因素，确保了通过心脏超声的手段描述小鼠模型特征性心功能变化的准确性和稳定性。
进一步地，通过心肌组织的HE染色、Mason染色和多免疫抗体特染等手段对该小鼠模型的病理免疫特征进行验证；所述多免疫抗体特染包括Musk免疫抗体特染和AchR免疫抗体特染。
进一步地，通过横向比较18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean、心功能指标及病理免疫指标（HE、Mason、Musk及AchR），分析该EAM小鼠模型心肌功能性改变与病理免疫性改变之间存在的关联。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明所提供的自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法，创新性地以心肌细胞M2胆碱能受体为靶标，通过体外人工合成AchRα亚基97-116肽段构建自身抗原表位，产生针对心肌细胞的自身免疫抗体，诱发自身免疫性心肌炎。本方法成模时间适中，模型稳定性高, 有助于利用此模型进行后续相关疾病的探索研究。
（2）本发明所提供的自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法，对传统心肌自身抗原表位诱导的EAM模型进行了改良，所用原材料AchRα亚基97-116肽段合成简单、价格低廉，并续惯注射体外由THP-1刺激分化的树突状细胞，注射入小鼠体内的树突状细胞可强化AchR抗原的呈递，直接引起大量CD4+T淋巴细胞在小鼠心肌中浸润，造成严重的EAM，进一步稳定强化了这一自身免反应。区别于传统的心肌自身抗原表位诱导的EAM模型和活化自身免疫细胞诱导的EAM模型，本发明结合了两者的优势，同时克服了两者在原材料获取困难方面的不足，其中由THP-1刺激分化的树突状细胞可在体外大量培育，相比于活化小鼠自身免疫细胞更易获得也更加稳定。
（3）本发明所提供的利用自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型通过18F-FDG PET/CT心肌代谢功能影像学验证，结合心脏超声等相对无创的操作，可对小鼠免疫性心肌改变进行多个时间点、多层次动态观察，直观呈现出自身免疫反应与心功能紊乱及心肌特征性改变间的相关性，确保了建立模型的稳定和完善。
（4）本发明所提供的利用自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法，首次在心肌组织中直观地展现出Musk及AchR抗体的分布及表达情况，结合HE、Mason病理染色结果及18F-FDG PET/CT和心脏超声验证，从多维度多层次进一步展示了自身免疫导致的小鼠模型特征性改变，也为进一步探索研究自身免疫性疾病提供了重要的理论依据。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为PET/CT下冠状位锁骨切面下对照组与造模组小鼠的18F-FDG心肌代谢显像；
图2为对照组与造模组小鼠的心肌代谢SUV mean统计分析结果（*代表p<0.05）；
图3为对照组3只实验小鼠中第1只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图4为对照组3只实验小鼠中第2只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图5为对照组3只实验小鼠中第3只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图6为造模组3只实验小鼠中第1只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图7为造模组3只实验小鼠中第2只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图8为造模组3只实验小鼠中第3只实验小鼠的心脏超声检查的结果（图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；
图9为对照组和造模组小鼠的左室短轴缩短率和射血分数对比结果柱状图（**代表 P<0.01，***代表 P<0.001）；
图10为对照组、造模（未注射DC）组、造模组小鼠的心肌组织切片的HE染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；
图11为对照组、造模（未注射DC）组、造模组小鼠的心肌组织切片的Mason染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；
图12为对照组、造模（未注射DC）组、造模组小鼠的心肌Musk抗体免疫组化染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；
图13为对照组、造模（未注射DC）组、造模组小鼠的心肌AchR抗体免疫组化染色结果（均取自200倍光镜下的视野）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、建立模型
所需特殊细胞与试剂：
a、AchRα亚基肽段干粉是商品，购自西安霖肽生物科技有限公司。
b、弗氏完全佐剂（CFA）是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat# F5881。
c、弗氏不完全佐剂（IFA）是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat#F5506。
d、C57BL/6小鼠是商品，购自南京实验动物研究所。
e、人急性单核细胞白血病细胞THP-1购于国家实验细胞资源共享服务平台，细胞资源编号为3111C0001CCC000057。
f、胎牛血清是商品，购自美国Clark生物公司，货号为Cat# FB25015。
g、青链霉素混合液（100×）是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat#10378016。
h、β-巯基还原剂是商品，购自中国索莱宝生物技术有限公司，货号为Cat# M8211。
i、1640基础培养基（RPMI 1640 basic）是商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#12633012。
j、THP-1专用培养基:由终浓度0.15ml/ml胎牛血清、终浓度10µl/ml青链霉素混合液（100×）、终浓度1ul/mlβ-巯基还原剂；余量为1640基础培养基组成。
自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立（造模组）：
1.在造模第1天，进行第一次免疫注射，具体步骤包括：
(1)在无菌EP管中用1ml灭菌1× PBS稀释200ug纯化的肽段，本次配置混合液为10只造模动物的剂量。
(2)将1mL 肽段溶液吸入一个2ml注射器中，并连接注射器到乳化针头连接器的一端，驱散管路内空气。
(3)用移液枪头缓慢吹匀混合弗氏完全佐剂，吹匀过程中避免产生气泡，并将1ml的弗氏完全佐剂吸入到第二个2mL注射器中。排出空气并将注射器连接到乳化针头连接器的另一端，确保所有连接紧密。
(4)先通过连接器快速将肽段溶液推入含有弗氏完全佐剂的注射器中。然后将溶液从一个注射器向前再向后推入另一个注射器，该混合步骤在冰上进行，持续5分钟直到乳液变稠，并且当注射器保持垂直时乳剂中的小气泡不向上移动。
(5)用铝箔包裹注射器和乳化针头连接器，并在4°C环境下冷却30分钟，使乳液更加稠密。
(6)在双蒸水中稀释50mg/ml戊巴比妥钠至1:10,腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠，麻醉C57BL/6小鼠，将麻醉好的C57BL/6小鼠放在恒温加热垫上以防止体温降低。将4°C环境下保存的乳液取出，转移至注射器中，用酒精棉球清洁C57BL/6小鼠双侧肩部及背部两点，每个位点注射等体积乳液，共注射150-250ul。观察C57BL/6小鼠状态，直至全部从麻醉中苏醒。
2.在造模第28至32天，进行第二次免疫注射，具体步骤包括：
(1) 在无菌EP管中用灭菌1× PBS稀释纯化的AchRα亚基97-116肽段，配制浓度为350-450ug/ml。
(2)将肽段溶液吸入一个注射器中，并连接注射器到乳化针头连接器的一端，驱散管路内空气。
(3)用移液枪头缓慢吹匀混合弗氏不完全佐剂，吹匀过程中避免产生气泡，并将与肽段溶液等体积的弗氏不完全佐剂吸入到第二个注射器中。排出空气并将注射器连接到乳化针头连接器的另一端，确保所有连接紧密。
(4)先通过连接器快速将肽段溶液推入含有弗氏不完全佐剂的注射器中。然后将溶液从一个注射器向前再向后推入另一个注射器，该混合步骤在冰上进行，持续5分钟直到乳液变稠，并且当注射器保持垂直时乳剂中的小气泡不向上移动。
(5)用铝箔包裹注射器和乳化针头连接器，并在4°C环境下冷却30分钟，使乳液更加稠密。
(6)在双蒸水中稀释50mg/ml戊巴比妥钠至1:10,腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠，麻醉C57BL/6小鼠，将麻醉好的C57BL/6小鼠放在恒温加热垫上以防止体温降低。将4°C环境下保存的乳液取出，转移至注射器中，用酒精棉球清洁C57BL/6小鼠尾根部、双侧肩部及腰背部进行注射，共注射100-150ul。观C57BL/6小鼠状态，直至全部从麻醉中苏醒。
3.在造模第58至62天，进行第三次免疫注射，具体步骤和注射乳液配制与第二次免疫注射一致。
4. 体外培养成熟的树突状细胞，在造模第67-70天，通过尾静脉注射树突状细胞液，具体步骤包括：
通过尾静脉注射树突状细胞液150-200ul，该细胞悬液为无菌1*PBS混悬液包含树突状细胞5×106个-5×107个细胞/ml，此后连续3-4周于相同时间点注射该混悬液。
（1）复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基的细胞瓶中培养，在37℃且内含5% CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达1×106个/ml细胞悬液时开始刺激分化；
（2）将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1.5ml，加入3µl诱导树突状细胞成熟混合因子A，混匀，培养42h；
（3）各孔用1×PBS清洗细胞3次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1.5mL，和20µl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，恒温培养箱中继续培养24h，得到成熟树突状细胞；
（4）造模第67-70天，通过尾静脉续惯注射树突状细胞液150-200ul，该细胞悬液为无菌1*PBS混悬液包含树突状细胞5×106个细胞/ml，此后连续3-4周于相同时间点注射该混悬液。观察C57BL/6小鼠至第一次免疫注射后第90±5天，动物模型制备成功。
造模（未注射DC）组小鼠模型的建立：
步骤1-3与造模组相同；
造模（未注射DC）组小鼠未续惯注射树突状细胞，其他与造模组保持一致。
对照组小鼠的建立：
与造模组同条件饲养，对照组C57BL/6小鼠经历步骤1-3，但各步骤中注射的混合液均不包含AchR肽段，其他与造模组保持一致。
二、验证 EAM小鼠模型相关的特征性心肌改变
1、18F-FDG PET/CT心肌代谢显像：
1）将所有造模组小鼠和对照组小鼠禁食水12h，放置于安静室温环境内；
2）对造模小鼠进行称重；
3）经口喂食 10%葡萄糖溶液 100μL，然后将小鼠放置于小动物麻醉机麻醉诱导盒中，调节异氟烷浓度为 1.5%，气流速度为 1.5L/min，进行持续麻醉，减少小鼠活动；加热毯温度调节为 37℃，包裹于麻醉诱导盒外部，维持小鼠体温。
4）喂食葡萄糖溶液 1h 后，经小鼠尾静脉注射 100μCi 18F-FDG，体积约75μL，然后继续将小鼠放入小动物麻醉机麻醉诱导盒中继续麻醉，使用电热毯按照上述方式进行保温，减少棕色脂肪摄取。
5）尾静脉注射 18F-FDG 50min 后，将小鼠放置于小动物PET/CT机检查床上，持续麻醉小鼠。
6）关闭检查床舱门，设置CT Scout Scan 定位相扫描条件为：像素组合 2×2，单帧采集时长 2000ms，电压 80kV，电流 0.5mA，床位数 2；设置CT 扫描条件为：像素组合 2×2，总帧数 360，电压 80kV，电流 0.5mA，步进角度 1°，床位数 1，层厚 0.18mm，采集时间约为 5min，矩阵 512×512；设置PET/CT 扫描条件为：床位数 1，总计数 500Kcts，相位数8，重建协议PET-OSEM，算法类型 ListMode，矩阵 140×140，层厚 0.8mm，迭代次数 40；进行 PET/CT显像。
7）获取扫描图像，使用同机 NMSoft-AIWS V1.6 软件进行图像分析，勾画心肌并测定标准化摄取值（Mean Standardized Uptake Value，SUVmean），结果判读由 2 位有经验的核医学科医师双盲法阅片（如图1所示）。
结果可见造模组心肌18F-FDG 代谢明显低于对照组，差异具有统计学意义（如表1、图2所示）。说明 EAM 小鼠存在心肌代谢功能减弱，18F-FDG PET/CT 功能代谢显像可以直观地对结果进行呈现同时是一项无创检测。
表1.心肌代谢显像SUV值结果
Figure 717098DEST_PATH_IMAGE001
（*代表 P<0.05）
2、验证EAM小鼠模型相关的特征性心功能改变：
1）待测小鼠从饲养室取出后放置于安静室温环境内；
2）记录小鼠信息，对待测小鼠进行称重；
3）操作前麻醉：将小鼠仰卧位固定于小动物麻醉机的麻醉诱导盒中，接Tabletop动物麻醉机，调节异氟烷浓度为 1.5%，气流速度为 1.5L/min，进行持续麻醉，减少小鼠活动；加热毯温度调节为 37℃，包裹于麻醉诱导盒外部，维持小鼠体温。
4）麻醉满意后，小鼠胸部及上腹部脱毛，固定小鼠四肢呈仰卧位于超声操作台上，接麻醉面罩,调节异氟烷浓度为1.5%，气流速度为1.0L/min持续麻醉小鼠，应用高频小动物超声机进行心脏B超检查。
5）左胸前涂少量温热耦合剂，将探头置于左胸前，并指向心底部，调整探头角度，获得左室长轴切面。在左室长轴切面，将M型取样线置于主动脉根部，二尖瓣等位置，获得M型曲线，并进行测量。顺时针转动探头 90°，获得左室短轴切面。在彩色多普勒血流显像下，记录二尖瓣口M型彩色多普勒图像（如图3-图8所示）。
6）观察记录超声心动指标：心率、心输出量、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左室室壁舒张末期厚度等，计算左室短轴缩短率和射血分数，用统计学方法进行分析比较。结果可见造模组小鼠的心率、左室短轴缩短率和射血分数均较对照组小鼠减低。以上结果体现出造模组小鼠的心功能整体下降，心肌收缩由正常快速有力的高幅度收缩变化为较缓慢且幅度减低的收缩，射血效率显著降低（如表2、图9所示）。
表2.心脏超声检查结果
Figure 558540DEST_PATH_IMAGE002
（**代表 P<0.01，***代表 P<0.001）
8）连续性的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像与心功能指标的相关性分析：与对照组相比，自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的心肌代谢功能与结构性功能变化趋势具有一致性，两者呈正相关，随着造模的完成同时出现代谢性和功能性减低，18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean 与心率、左室短轴缩短率和射血分数的近似相关系数k分别为43.82、2.22和2.64（如表3所示）。
表3. 18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean与心功能指标的相关性分析表
Figure 135015DEST_PATH_IMAGE003
注：结果用均数±标准差（x±s）表示，样本比较采用独立样本T检验P<0.001
9）本发明还比较了心脏超声检查过程中采用异氟烷并通过Tabletop动物麻醉机麻醉和采用传统的水合氯醛腹腔注射麻醉对C57小鼠心率的影响。采用异氟烷并通过Tabletop动物麻醉机麻醉小鼠的方法具体实施为诱导麻醉阶段调节异氟烷浓度为 1.5%，气流速度为 1.5L/min，进行持续麻醉，加热毯温度调节为 37℃，包裹于麻醉诱导盒外部，维持小鼠体温。持续麻醉阶段调节异氟烷浓度为1.5%，气流速度为1.0L/min，应用高频小动物超声机进行心脏B超检查。采用传统的水合氯醛腹腔注射的麻醉方法具体实施为使用5%的水合氯醛，根据小鼠体重，按照7ul/g的剂量通过腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态后应用高频小动物超声机进行心脏B超检查。结果可见，传统的水合氯醛腹腔注射的麻醉方法会使C57小鼠心率较正常大幅增快，影响小鼠的基础心率并对模型相关的特征性改变验证产生干扰；而本发明采用的麻醉方法可维持C57小鼠心率基本处于正常水平，操作过程无明显波动，确保了心功能验证的准确性和稳定性。（如表4所示）。
表4.两种麻醉方式下C57小鼠的心率
异氟烷组（10只） 水合氯醛组（10只）
心率 313.6±12.8 417.0±15.3**
（**代表 P<0.01）
3、验证EAM小鼠模型相关的特征性组织病理免疫染色：
（1）心脏组织切片HE染色：
1）取材：将小鼠麻醉取血后使用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，留取小鼠心肌组织；
2）固定：将取下的小鼠心肌组织放置在10%的福尔马林溶液中浸泡过夜；
3）脱水透明：将经过福尔马林溶液固定好的小鼠心肌组织标本使用流动水进行冲洗4小时，再将小鼠的心肌组织放置在70%的乙醇中2小时，再放置在80%的乙醇中浸泡过夜，然后调换至90%的乙醇中2小时，再放置在无水乙醇中1小时，取出后放置在新的无水乙醇中1小时，然后再放置于二甲苯中15分钟，最后取出再放在新的二甲苯15分钟；
4）浸蜡：调节恒温箱温度，使其高于石蜡的熔点3摄氏度，然后将经过脱水的小鼠肺组织完全的浸过石蜡，再放置于恒温箱中4个小时；
5）包埋组织：对将要进行包埋的组织进行处理，把浸过石蜡的组织块移入融化有硬蜡的包埋器之内，等待蜡块的冷却以及固定；
6）切片和展片：用石蜡切片机把浸蜡包埋过的组织块切成厚度约为5μm的薄片。再把蒸馏水滴在准备好的载玻片之上，把切好的切片平铺在水滴之上，载玻片应放置在酒精灯下进行加热，等待切片完全展平之后再将载玻片进行倾斜，除掉多余的水分，同时并摆正载玻片。将展好后的切片放置在64℃的恒温箱中烘烤4个小时，取出后备用；
7）染色以及封片：将展后的切片放置在64℃的恒温箱中烘烤30分钟，然后放在二甲苯中30分钟，拿出后放在新的二甲苯中30min来进行脱蜡；然后放置在无水乙醇中10分钟，拿出后放在新的无水乙醇中10分钟，然后放在95%的乙醇中10分钟，然后放在90%的乙醇中10分钟，80%的乙醇中10分钟，70%的乙醇中10分钟，进行脱水处理；使用蒸馏水浸洗切片3分钟，放置在苏木素的染液中浸染3分钟后，然后使用自来水对切片进行冲洗，接下来使用盐酸酒精进行分色10秒钟，再用自来水进行冲洗；然后使用2%的碳酸氢钠溶液对切片进行反蓝10秒钟，再用自来水进行冲洗；然后置于1%的伊红溶液中浸染2分钟，再使用自来水进行冲洗；放置在95%的酒精中进行脱水处理，再使用二甲苯对切片进行透明，最后滴加中性树脂来封片；
8）观察：将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠心肌组织的病理改变（如图10所示）。与对照组相比，造模（未注射DC）组和造模组均可见心肌细胞排列欠均匀，出现部分细胞形态欠规整，细胞颗粒饱满度下降，细胞间隙增大，有的细胞呈现萎缩和老化。而造模组和造模（未注射DC）组相比，造模组变化程度更大，心肌病理变化更重。
（2）心肌Mason染色：
1）将小鼠麻醉取血后使用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，留取小鼠心肌组织；
2）固定、脱水、浸蜡、包埋及切片脱蜡至蒸馏水等步骤同HE染色；
3）脱蜡冲洗后放置在苏木素的染液中浸染5-10分钟后，然后使用自来水对切片进行冲洗
4）使用盐酸酒精进行分色10秒钟，再用自来水进行冲洗；
5）使用2%的碳酸氢钠溶液对切片进行反蓝10秒钟，再用蒸馏水冲洗；
6）置于丽春红酸性品红液中染 5～8 分钟后蒸馏水冲洗；
7）置于1% 磷钼酸中染 1～3 分钟；
8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液 5 分钟 (如染色效果不佳, 可在冰醋酸内脱色后重染)
9）用自来水速洗后置 60℃温箱中烘干，再使用二甲苯对切片进行透明，最后滴加中性树脂来封片；
10）将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠心肌组织变化（如图11所示）。与对照组相比，造模（未注射DC）组和造模组均可见心肌细胞排列出现紊乱，细胞间隙增大，部分区域出现心肌纤维化表现。同时造模组相比于造模（未注射DC）组细胞排列紊乱程度更大，纤维化表现更重，表明续惯注射DC后在造模过程中发挥了增强免疫的重要作用。
（3）心肌组织免疫抗体特染：
1）烤片：选取各组所需的玻片标本，在玻片赠正面各项关键信息。将玻片插入玻片架中，实验开始前于65℃烤箱内烘烤20min。
2）脱蜡：将烤好的玻片依次浸入二甲苯溶液A 15min-二甲苯溶液B 15min-无水乙醇溶液A 3min-无水乙醇溶液B 3min-95%乙醇溶液3min-75%乙醇溶液3min-50%乙醇溶液3min-1×PBS缓冲溶液A 5min-1×PBS缓冲溶液B 5min-1×PBS缓冲溶液C 5min，完成脱蜡。
3）抗原修复：向高压锅中加入1500ml Tris-EDTA抗原修复液，使用电磁炉加热至沸腾后放入已脱蜡的玻片，盖紧锅盖，待排气阀开始排气后高温高压继续加热3min。待自然冷却至室温后，用自来水冲洗玻片约3min。
4）一抗孵育：用滤纸吸干标本周围的液体，用免疫组化笔在玻片上圈出组织轮廓，在组织表面滴加约100µl内源性过氧化物酶阻断剂以消除过氧化物酶活性，室温反应10min。1×PBS缓冲溶液冲洗3次，每次3min。再滴加约100µl封闭用正常山羊血清工作液封闭，室温反应15min。倾去血清（勿洗），直接在组织标本上滴加配好的一抗工作液约100µl，将标本放入免疫组化湿盒中，于4℃冰箱内过夜孵育。本部分实验使用的抗体Musk浓度为1：1000，AchR浓度为1：100。
5）二抗孵育：1×PBS缓冲溶液冲洗3次，每次3min。擦干后在标本上滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物约100µl，室温反应15min。
6）DAB显色：重PBS缓冲溶液的冲洗步骤。擦干后在标本上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液约100µl，室温反应15min。PBS冲洗后在标本上滴加约100µlDAB工作液，时刻在显微镜下观察显色情况，当出现较明显棕色沉淀物时及时用自来水冲洗10min终止反应。显色时间一般为室温3min左右。
7）复染及反蓝：向玻片上的标本滴加苏木素约100µl，室温反应4min。用自来水冲洗10min后将玻片放入0.2%盐酸酒精中分化约3-5s，再用自来水冲洗1min，将将玻片放入1%氨水中反蓝3min，最后用自来水冲洗10min完成此步骤。
8）脱水与封片：从50%乙醇溶液开始，逆着脱蜡的顺序，依次在各溶液中浸泡标本，每种液体中浸泡3min。最后从二甲苯中取出玻片，通风橱内晾干，使用中性树胶封片，每个中央滴加20µl，用盖玻片小心地盖在组织上方，避免出现气泡，将玻片自然风干，放如标本盒中常温保存。
9）标本观察与统计：于正置光学显微镜下观察并连接电脑软件采集图像（如图12、13所示）。与对照组相比，造模（未注射DC）组和造模组中心肌细胞排列均出现紊乱且程度逐渐增大，细胞间隙亦呈增大趋势，造模后自身免疫相关抗体Musk和AchR的表达水平升高，表明心肌受到免疫攻击，发生免疫性病理改变。同时造模（未注射DC）组和造模组相比，续惯注射DC后Musk及AchR抗体的表达水平进一步提升，心肌变化程度受外源性注射DC影响后更加明显。
、横向分析比较18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean、心脏超声检查及多免疫抗体特染之间的关联性：
横向分析比较对照组和造模组的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean、心功能指标及病理免疫指标（HE、Mason、Musk及AchR），可见随着造模成功后心肌代谢水平及心功能指标的下降，心肌病理免疫变化也呈现明显加重，心肌间隙增宽，肌肉排列紊乱，Musk及AchR等多抗体染色程度加深，免疫浸润增加。表明心肌功能性改变与病理免疫性改变之间存在密切的相关性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种自身抗原表位诱导的EAM小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液、AchR-弗氏不完全佐剂溶液和免疫辅助强化剂；
所述AchR-弗氏完全佐剂溶液是由弗氏完全佐剂和AchR肽段溶液乳化合成；
所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液是由弗氏不完全佐剂和AchR肽段溶液乳化合成；
所述免疫辅助强化剂是由人急性单核细胞白血病细胞THP-1刺激分化的成熟树突状细胞混悬液，
注射AchR-弗氏完全佐剂溶液、AchR-弗氏不完全佐剂溶液和免疫辅助强化剂的具体步骤为：在造模当天向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液，在造模第28-32天向造模用的小鼠注射AchR-弗氏不完全佐剂溶液，在造模第58-62天向造模用的小鼠再次注射AchR-弗氏不完全佐剂溶液，在造模第67-70天注射免疫辅助强化剂，此后连续3-4周于相同时间点注射该免疫辅助强化剂，造模第90±5天，动物模型制备成功。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液中，AchR肽段溶液与弗氏完全佐剂的体积比为1:1，AchR肽段溶液的浓度为150-250ug/ml，注射体积为150-250ul/只；
所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液中，AchR肽段溶液与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1，AchR肽段溶液的浓度为350-450ug/ml，注射体积为100-150ul/只；
所述AchR肽段溶液中的溶质为AchRα亚基97-116肽段，溶剂为1×PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述免疫辅助强化剂，包含由人急性单核细胞白血病细胞THP-1刺激分化的成熟树突状细胞5×106个-5×107个细胞/ml，悬浮于1×PBS溶液中制得的细胞混悬液，注射体积为150-200ul/只/次。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，还包括利用连续性的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像、心脏超声检查，以及心肌组织的HE染色、Mason染色和多免疫抗体特染验证该小鼠模型相关的心肌特征性改变；所述多免疫抗体特染包括Musk免疫抗体特染和AchR免疫抗体特染。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像包括图像解读和SUV mean统计分析，确定EAM小鼠心肌代谢水平的SUV mean范围；
所述心脏超声检查包括对小鼠心率、左室短轴缩短率和射血分数的验证，还包括连续性的18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像与小鼠心率、左室短轴缩短率和射血分数之间的相关性分析。
6.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述心脏超声检查过程中的小鼠麻醉方法为：采用异氟烷并通过小动物麻醉机麻醉小鼠；
诱导麻醉阶段调节异氟烷浓度为 1.5%，麻醉机气流速度为 1.5L/min；
持续麻醉阶段调节异氟烷浓度为1.5%，麻醉机气流速度为1.0L/min；
麻醉持续期间，麻醉诱导盒外部包裹加热毯，加热毯温度调节为 37℃，维持小鼠体温。
7.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，横向分析比较18F-FDG PET/CT心肌代谢功能显像的SUV mean、心脏超声检查及多免疫抗体特染之间的关联性。
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